CN109797181A - 一种镁离子诱导E6-type DNA核酶变构的远程DNA链置换方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子计算领域，尤其涉及DNA链置换技术，具体涉及一种镁离子诱导E6‑type DNA核酶变构的远程DNA链置换方法。本发明在DNA链置换中，立足点与分支迁移域分离，两者在DNA序列设计中不必彼此相邻；利用金属离子诱导DNA链置换，提供了一种新的DNA链置换调控方法。实现了远程DNA链置换，增加了DNA链置换的灵活性。

Description

一种镁离子诱导E6-type DNA核酶变构的远程DNA链置换方法

技术领域

本发明涉及分子计算领域，尤其涉及DNA链置换技术，具体涉及一种镁离子诱导E6-type DNA核酶变构的远程DNA链置换方法。

背景技术

分子计算是一种以生物大分子为存储媒介，通过生物大分子之间的可控生化反应实现信息处理的一种新的计算模式。在分子计算中，DNA计算以DNA分子为媒介，充分利用DNA分子的碱基互补特性及碱基序列的可编程性，实现信息在DNA分子上的存储与处理，当前DNA计算是一种引起广泛关注的分子计算模式。DNA链置换利用DNA分子杂交过程中自由能趋于稳定的规律，以立足点为入口，通过在立足点处的碱基互补，实现对分支迁移域上互补DNA单链的置换，即用长DNA单链，通过立足点的诱导，实现对短DNA单链的替代与置换。目前，链置换技术通过与荧光检测、纳米颗粒、自组装等技术相结合，获得了迅速发展，在DNA计算乃至分子计算中得到了广泛的应用，如用于DNA逻辑门构建、神经网络构造、蛋白质计算、纳米结构、金属离子检测等等。

DNA核酶是一段特定的DNA序列，兼具DNA序列和酶催化的双重特点，作为DNA序列可以存储信息，参与分子计算，同时作为核酶，其又可以在金属离子的作用下，实现变构，通过底物结合臂与底物结合形成双链DNA分子，若底物经过RNA修饰，还可以对结合的RNA修饰底物进行特异性切割，具备酶催化的功能，是一种已获得广泛应用的DNA序列编辑工具。E6-type DNA核酶是一种重要的镁离子依赖的DNA核酶，在镁离子存在的情况下，E6-type DNA核酶的保守域在镁离子的作用下发生变构，形成催化核心，进而通过底物结合臂与底物通过碱基互补形成DNA双链，并对结合的RNA修饰的底物进行切割。在分子计算中，主要基于E6-type DNA核酶的酶催化特点，利用E6-type DNA核酶对RNA修饰底物的切割，实现DNA序列的编辑。目前，E6-type DNA核酶在DNA逻辑门的构造、实现分子器件、金属离子检测等方面得到了广泛应用。

在DNA链置换中，立足点处的DNA序列与分支迁移域处的DNA序列要求碱基排列的连续性，当立足点和分支迁移域之间出现不匹配的DNA片段，使得立足点和分支迁移域之间存在间隔，空间位置相距较远时，链置换的效率会大大降低，直至不再发生链置换，Genot等人于2011年在文献《Remote Toehold:A Mechanism for Flexible Control of DNAHybridization Kinetics》中对此进行了详细的研究。于是在DNA链置换的实现过程中，需要将立足点和分支迁移域设计在一段连续的DNA序列上，即立足点与分支迁移域在DNA序列上必须处于相邻的位置，以保证DNA链置换的发生。这大大限制了链置换技术的应用灵活性以及在复杂问题求解中的应用，同时增加了DNA计算中的DNA编码难度。

发明内容

为克服DNA链置换中立足点与分支迁移域必须在DNA序列上彼此相邻的技术问题，本发明所采用的技术方案为利用镁离子对E6-type DNA核酶保守域序列的作用，通过镁离子诱导E6-type DNA核酶变构，使处于远程分离位置的立足点与分支迁移域彼此接近，进而实现远程DNA链置换。该方法具体包含以下步骤：

步骤1：根据分子计算中链置换的具体应用，将E6-type DNA核酶的底物结合臂t和d分别作为链置换的立足点和分支迁移域，构造DNA片段t和d的DNA碱基序列，其中立足点t和分支迁移域d在E6-type DNA核酶底物结合臂上的位置可以互换；

步骤2：根据立足点t和分支迁移域d的碱基序列，构造参与链置换反应的DNA双链[d,t*Xd*]，其中片段X为1-3个碱基的任意DNA序列，且片段X的3’-端为DNA碱基G(鸟嘌呤)，其余碱基可以根据实际需要进行设计；然后将E6-type DNA核酶与DNA双链[d,t*Xd*]混合，此时由于未加入镁离子，E6-type DNA核酶与DNA双链[d,t*Xd*]不发生链置换反应；

步骤3：加入镁离子，在镁离子的作用下，E6-type DNA核酶实现变构，进而E6-typeDNA核酶上的立足点t与DNA双链[d,t*Xd*]上对应的互补片段t*结合，触发链置换反应，E6-type DNA核酶上的分支迁移域d与DNA双链[d,t*Xd*]上的片段d*互补形成自由能更小的稳定结构，最终将DNA双链[d,t*Xd*]上的DNA片段d被置换出来。

步骤1中，E6-type DNA核酶上的立足点t与分支迁移域d均为可设计部分，可以通过适当的设计以实现特定的分子计算目标，如DNA逻辑门的构造。

本发明的有益效果

1、本发明在DNA链置换中，立足点与分支迁移域分离，两者在DNA序列设计中不必彼此相邻；

2、本发明利用金属离子诱导DNA链置换，提供了一种新的DNA链置换调控方法。

3、本发明实现了远程DNA链置换，增加了DNA链置换的灵活性。

附图说明

为了便于本领域技术人员理解，下面结合附图对本发明作进一步的说明。

下列图示中箭头端对应DNA序列的3’-端,平头端对应DNA序列的5’-端。

图1一种镁离子诱导E6-type DNA核酶变构的远程DNA链置换方法原理图；

图2DNA或门构造方法示意图；

图3一种镁离子诱导E6-type DNA核酶变构的远程DNA链置换方法原理验证，有镁离子PAGE电泳结果；

图4一种镁离子诱导E6-type DNA核酶变构的远程DNA链置换方法原理验证，无镁离子PAGE电泳结果；

图5一种镁离子诱导E6-type DNA核酶变构的远程DNA链置换方法原理验证荧光检测结果；

图6DNA或门PAGE电泳结果；

图7DNA或门荧光检测结果。

具体实施方式

实施例1

下面结合附图和具体的实施方式对本发明作进一步的说明。

如图1所示，E6-type DNA核酶至少由5个DNA序列片段组成：底物结合臂t和d、2个保守域DNA片段(5’-CAGCGAT-3’和5’-CACCCATGT-3’)和1个具有发卡结构的DNA序列片段。上述5个DNA序列片段中，除保守域DNA片段外，其它均为可设计部分，具体碱基排列取决于特定的应用目标。DNA双链[d,t*Xd*]为进行链置换的目标双链，其中t*与d*分别为与E6-type DNA核酶底物结合臂t和d互补的DNA片段。如图1所示，当加入镁离子Mg2+时，E6-typeDNA核酶发生变构，底物结合臂t和d彼此接近，分别构成链置换的立足点t和分支迁移域d。然后立足点t与DNA双链[d,t*Xd*]中的t*通过碱基互补形成双链，在分支迁移作用下，E6-type DNA核酶上的底物结合臂d(此时作为链置换的分支迁移域d)将DNA双链[d,t*Xd*]上的DNA单链d置换出来。在没有镁离子Mg2+的情况下，由于E-type DNA核酶不发生变构，此时尽管底物结合臂t能够与DNA双链[d,t*Xd*]的单链部分t*结合，但是由于E6-tpye DNA核酶上的底物结合臂d处于远程位置，不能够与底物结合臂t形成连续的碱基序列，即不能形成链置换所需要的立足点与分支迁移域的相邻结构，进而不能触发链置换的发生。

一种镁离子诱导E6-type DNA核酶变构的远程DNA链置换方法可以应用于DNA逻辑门的构造。如图2所示构造了DNA逻辑门——或门。当两种E6-type DNA核酶E61和E62其中任一或两者同时与DNA双链[ORd,t1*XORd*Xt2*]混合时，如果加入镁离子Mg2+，在E61或E62均能够将DNA单链Ord从DNA双链[ORd,t1*XORd*Xt2*]中置换出来，形成DNA或门的输出。

本发明的有益效果通过以下实验(实施例)进一步的说明。

以下实施例中所使用的序列(表1)均从上海生工购买，DNA序列经过PAGE纯化，荧光修饰的DNA序列位置为5’-端FAM修饰和3’-端BHQ修饰。实施例中应用的试剂有：EDTA2Na、Tris、冰乙酸、醋酸镁、过硫酸铵、聚丙烯酰胺、N,N'-甲叉双丙烯酰胺、四甲基乙二胺和Stains ALL。镁离子调控远程链置换的反应缓冲液为1×TAE/Mg2+，其中包含1mmoL/LEDTA2Na，40mmoL/L Tris，12.5mmoL/L醋酸镁，20mmoL/L乙酸，pH＝8，远程链置换反应温度为室温(20—28℃)，反应时间为1-2小时。PAGE电泳的40％丙烯酰胺母液配置为：5g N,N'-甲叉双丙烯酰胺和95g丙烯酰胺，在37℃水中溶解后，加去离子水定容至250mL。实施例中序列的浓度经Nanodrop 2000分光光度计(Thermo Fisher Scientific Inc.USA)测定。荧光信号检测在实时荧光PCR仪(AgiLent，G8830A)上应用，其中最大发射波长为564nm，最大吸收波长为550nm，荧光检测条件为1×TAE/Mg2+缓冲液，25℃。荧光值为三次实验的平均值，误差为三次实验的标准误差。

实施例的结果检测采用PAGE凝胶电泳和荧光信号检测两种方式。

表1实施例中用到的DNA单链序列

实施例1DNA远程链置换验证

图3为图1中镁离子存在情况下，E6-type DNA核酶(E60)实现远程链置换的PAGE电泳结果。图3中泳道2-5为DNA片段X为单碱基G的情况，泳道6-9为DNA片段X为两个碱基CG的情况，泳道10-13为DNA片段X为三个碱基TAG的情况。泳道3和4的电泳带说明复合物DNA双链[d,t*Xd*]与[E60,t*Xd*]能够稳定生成，对于含有DNA双链[d,t*Xd*]的溶液，当加入E6-type DNA核酶E60时，E60通过立足点t与DNA序列t*Xd*结合，由于镁离子的作用，E60发生变构，使得位于E60 5’-端的底物结合臂t与其上的3’-端的底物结合臂d在空间上实现接近，构成连续的立足点t与分支迁移域d结构，进而通过链置换的方式与DNA序列[d,t*Xd*]上的互补区域d*相结合，将DNA序列d置换出来，比较泳道3与泳道5，泳道3中的电泳带在泳道5中消失，说明E60通过远程链置换的方式将DNA序列d置换了出来。对于泳道6-9和泳道10-13，通过上述类似的分析，可见在DNA片段x＝CG与TAG的情况下，E60均能在镁离子存在的情况下，实现远程链置换。

图4为图1中没有镁离子情况下，E6-type DNA核酶不能进行远程链置换的PAGE电泳结果。图4中泳道2-5为DNA片段X为单碱基G的情况，泳道6-9为DNA片段X为两个碱基CG的情况，泳道10-13为DNA片段X为三个碱基TAG的情况。在没有镁离子的情况下，对比泳道2与3可知，DNA双链[d,t*Xd*]能够稳定生成。但是对比泳道2与泳道4，E6-type DNA核酶E60由于立足点t与分支迁移域d分别位于E60两端，中间包含至少15个碱基的间隔，在没有镁离子存在的情况下，E60作为DNA序列甚至不能与DNA序列t*Xd*互补形成双链结构。因此，在没有镁离子的情况下，E60不能实现远程链置换(泳道5)。对于泳道6-9和泳道10-13，通过上述类似的分析，可见在DNA片段x＝CG与TAG的情况下，E60在没有镁离子存在的情况下，同样不能实现远程链置换。

图5为镁离子诱导远程链置换的荧光检测结果。在没有镁离子的情况下，情况1、3、5的荧光没有显著变化，说明此时没有发生链置换；在有镁离子的情况下，情况2、4、6的荧光发生了显著的增加，说明此时发生了链置换。有无镁离子的两种情况对比可知，镁离子的存在诱导了E6-type DNA核酶的变构，导致了远程链置换的发生。

由上述图3-图5的实验结果，可见在镁离子存在的情况下，E6-type DNA核酶发生变构，E6-type DNA核酶作为DNA序列能够实现远程链置换，其中立足点t与分支迁移域d之间可以包含15个碱基的间隔；同时在没有镁离子的情况下，E6-type DNA核酶作为DNA序列，由于立足点t与分支迁移域d之间间隔了至少15个碱基，使得E6核酶不能实现远程链置换。因此，由上述结果，可以用镁离子诱导E6-type DNA核酶变构实现远程DNA链置换。

实施例2

DNA或门

如图6所示，在镁离子诱导下，E6-type DNA核酶E61或E62单独与DNA双链[ORd,t1*XORd*Xt2*]混合时(泳道5和泳道6)，E61或E62均能够将DNA单链ORd从双链[ORd,t1*XORd*Xt2*]上置换出来，形成DNA或门的输出；同时，当E61和E62同时与DNA双链[ORd,t1*XORd*Xt2*]混合时(泳道7)，同样能够将DNA单链ORd从双链[ORd,t1*XORd*Xt2*]上置换出来，形成DNA或门的输出。由此可见，在镁离子的诱导下，利用远程链置换实现了DNA或门。图7给出了DNA或门的荧光检测结果。在镁离子作用下，单独加入E61或E62均有显著的荧光信号增加，当E61和E62同时加入时，荧光信号的增加则更为明显。

SEQUENCE LISTING

<110> 沈阳航空航天大学

<120> 一种镁离子诱导E6-type DNA核酶变构的远程DNA链置换方法

<130> 2019.1.28

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

ggagacagcg atccggaacg gcacccatgt aggatgaatg 40

<210> 2

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

aggatgaatg ttt 13

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

cattcatcct cgtctcc 17

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

cattcatcct ccgtctcc 18

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

cattcatcct ctagtctcc 19

<210> 6

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

gcgtgcagcg atagcgtagc tcacccatgt ccttaatctg c 41

<210> 7

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

ccttaatctg cagcgatccg gaacggcacc catgtcgtca ac 42

<210> 8

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

ccttaatctg c 11

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

gttgacgttg gcagattaag gttggcacgc 30

Claims (5)

1.一种镁离子诱导E6-type DNA核酶变构的远程DNA链置换方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

步骤1：将E6-type DNA核酶的底物结合臂t和d分别作为远程链置换的立足点t和分支迁移域d，构造DNA片段t和d的DNA碱基序列；

步骤2：基于DNA片段t和d的碱基序列，构造DNA双链[d,t*xd*]；

步骤3：将DNA双链[d,t*xd*]和E6-type DNA核酶混合，此时由于没有镁离子，E6-typeDNA核酶与DNA双链[d,t*xd*]不发生链置换反应；

步骤4：在步骤3的混合物中加入镁离子Mg2+，E6-type DNA核酶和DNA双链[d,t*xd*]发生链置换反应，置换出DNA单链d。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：立足点t和分支迁移域d彼此处于远程位置，即E6-type DNA核酶作为DNA序列，其上的立足点t和分支迁移域彼此分离，不是连续的DNA序列，在立足点t和分支迁移域d之间存在至少15个碱基的间隔。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：镁离子通过诱导E6-type DNA核酶的变构，使得E6-type DNA核酶上的立足点t和分支迁移域d在空间上相互接近，形成链置换反应所必须的立足点t与分支迁移域的碱基序列连续性。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：通过镁离子实现远程链置换反应，DNA链置换受到镁离子的诱导。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：立足点t与分支迁移域d是对称关系，两者在E6-type DNA核酶底物结合臂上的位置可以互换。