CN103952396A - 一种基于质粒库的无引物基因合成方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种基于质粒库的无引物基因合成方法，该方法通过构建一个包含有16384（4⁷，7bp的四个碱基的任意组合序列）个质粒的质粒库，从已构建好的含有7个bp的质粒出发，将选定目标基因按照每82bp进行划分，通过酶切酶连操作依次进行四种抗性基因Kana、cam、gem、spc的重构，得到若干82bp的质粒，然后再把这些82bp质粒组装合成长片段基因。本发明构建好含有16384（4⁷，7bp的四个碱基的任意组合序列）个质粒的质粒库后，无需任何引物，能合成各种目标基因。本发明操作简单，突变率极低，无需测序，成本低，筛选量少，有利于构建突变体文库，可以实现溶液操作，便于实现自动化。

Description

一种基于质粒库的无引物基因合成方法

技术领域

本发明涉及一种基因合成方法，是一种基于质粒库的无引物基因合成方法，属于基因工程技术领域。 

背景技术

近年来合成生物学的研究进展非常快，特别是基因合成技术。全基因合成是依照某一蛋白质的基因序列，设计合成相互重叠的单链寡核苷酸，再通过重叠延伸PCR法拼接出全长，基因合成无需模板，是获取基因的手段之一。通过全基因合成实现基因的分子改造和人工组建正成为一种实验室常规手段。因此，建立一种能够在相对低廉和短时间内准确和高效地设计和合成长片段基因的方法十分重要。 

随着合成生物学的研究越来越流行，特别是基因合成方法技术的研究。到目前为止，基因合成的方法都必须依赖于化学合成的寡核苷酸引物，据研究报道全基因合成的方法主要有以下三种：一是DNA的化学合成方法，即利用DNA合成仪器直接合成单链的DNA片段，化学法在保证合成质量的前提下，合成的DNA片段长度一股不超过90bp，所以化学合成方法主要用于合成寡核苷酸。二是PCR介导的合成方法，如重叠延伸PCR、TBIO法、PTDS法。PCR介导的方法由于需要PCR，这样就会导致对引物引进的错误进行积累和放大化，所以相对来说碱基的错误率比较高，据目前报道的PCR介导的合成方法错误率比较高，尤其对于合成大于2kb以上的DNA由于错误率高，所以为了得到正确的克隆，需要做多次克隆和测序的重复工作，这样成本会很高，周期也会加长；而且PCR介导的需要DNA高温聚合酶，dNTP等试剂，成本相对较高。三是非PCR介导的DNA合成方法，即直接通过体外或者体内的酶切酶连等操作将化学合成的DNA片段组装起来，如DNA的固相合成技术。非PCR介导的合成方法，目前报道的主要是一种DNA的固相合成技术，如Sloning技术，这种技术虽然错误率是很低，但是由于在合成的时候引物需要经过特殊的修饰，引物合成的成本比较高，而且权衡成本的考虑，每次只能增加3个碱基，这样合成大基因周期会比较长，所以不太实用。 

基因合成技术将会在越来越多的领域得到应用，并且发挥巨大的作用，但是合成基因中碱基的高错误率与昂贵的成本限制了全基因合成方法的应用，有必要导找新的基因合成方法来解决现有技术存在的问题，使基因合成技术得到更广泛的应用。 

发明内容

本发明提出了一种无引物的基因合成方法平台技术，这种基因合成方法打破了一直以来依赖于引物的基因合成技术。该方法主要通过构建一个包含有16384(4⁷，7bp的四个碱基的任意组合序列)个质粒的库，再用该库合成一系列相关的基因，主要是利用抗性基因重构的遗传筛选机制，从已构建好的含有7个bp的质粒出发，通过酶切酶连操作依次进行重构，通过四种抗性基因的重构，得到若干82bp的质粒，然后再把这些82bp组装合成长片段基因。主要步骤包括：载体的改造；16384(4⁷)个质粒的库的构建；82bp DNA片段的合成；多个82bp左右的DNA片段的组装合成长片段基因。 

具体做法如下： 

1)、构建抗性基因重构载体pNew(构建过程见图1)。 

a)、构建线性载体骨架pNew 

以商品化的pet23a、pet28b、pDEST32和利用PCR、套叠PCR、无酶克隆等常规技术构建的载体RNALIC质粒，用常规方法构建pNew的载体，以ori-PF／ori-PR(序列见表1)、pet23a质粒为模板，通过PCR扩增得到线性载体骨架，在反向引物ori-PR中引进限制性内切酶BseRI的识别位点，命名为pNew(1.9kb)(序列列表对应为NO1)。 

b)、构建线性载体骨架5SGCK 

设计5Spc-PF／5Spc-PR(序列见表1)为两对引物，以质粒RNALIC为模板，通过PCR扩增得到5Spc片段(656bp)(序列列表对应为NO2)，扩增好的5Spc片段5’和3’端分别带上了限制性酶切位点BsgI和Xba1；设计5Gem-PF／5Gem-PR(序列见表1)为两对引物，以pDEST32为模板，通过PCR扩增得到5Gem片段(535bp)(序列列表对应为NO3)，扩增好的5Gem片段3’端带上了限制性酶切位点BglII；设计5Cam-PF／5Cam-PR(序列见表1)为两对引物，以pDEST32为模板，通过PCR扩增得到5Cam片段(371bp)(序列列表对应为NO4)，扩增好的5Cam片段3’端带上了限制性酶切位点XhoI；设计5Kana-PF／5Kana-PR(序列见表1)为两对引物，以pet28b为模板，通过PCR扩增得到5Kana片段(556bp)(序列列表对应为NO5)，扩增好的5Kana片段3’端带上了限制性酶切位点XmaI；设计Amp-PF／Amp-PR(序列见表1)为两对引物，以pet23a为模板，通过PCR扩增得到Amp盒式结构(969bp)(序列列表对应为NO6)；每个片段之间都引入了18-20bp的同源序列，再把这几个片段通过5Spc-PF和Amp-PR引物逐次做重叠延伸PCR(Overlap Extension PCR)得到一个大片段，命名为5SGCK(3kb)(序列列表对应为NO7)。 

c)、构建线性载体骨架3KCGS 

设计3Kana-PF／3Kana-PR(序列见表1)为两对引物，以pet28b为模板，通过PCR扩增得到3Kana片段(531bp)(序列列表对应为NO8)，扩增好的3Kana片段5’端带上了限制性酶切位点AgeI；设计3Cam-PF／3Cam-PR(序列见表1)为两对引物，以pDEST32为模板，通过PCR扩增得到3Cam片段(566bp)(序列列表对应为NO9)，扩增好的3Cam片段5’端带上了限制性酶切位点SalI；设计3Gem-PF／3Gem-PR(序列见表1)为两对引物，以pDEST32为模板，通过PCR扩增得到3Gem片段(279bp)(序列列表对应为NOl0)，扩增好的3Gem片段5’端带上了限制性酶切位点BamHI；设计3Spc-PF／3Spc-PR(序列见表1)为两对引物，以RNALIC为模板，通过PCR扩增得到3Spc片段(387bp)(序列列表对应为NO11)，扩增好的3Spc片段5’端带上了限制性酶切位点SpeI；每个片段之间都引入了18-20bp的同源序列，再把这几个片段通过3Kana-PF和3Spc-PR引物逐次做重叠延伸PCR(O)verlap Extension PCR)得到一个大片段，命名为3KCGS(1.7kb)(序列列表对应为NO12)。 

d)、无酶克隆组装pNew载体质粒 

再通过无酶克隆的方式(Zhu D，Zhong X，TanR，Chen L，Huang G，Li J，et a1.High-throughput cloning of human liver complesc openreading frames using homologousrecombination in Escherichia coli.[J]AnalBiochcm.2010；397(2)：162-7)把3个片段：线性载体骨架pNew、5SGCK、3KCGS克隆到一个完整的载体上。经过限制性内切酶酶切和测序鉴定得到正确的pNew载体质粒(序列列表对应为NO13)，命名为pNew载体质粒(构建过程见图1)。 

表1载体pNew构建中使用的引物 

2)、用以构建好的pNew载体，用常规方法构建4⁷(16384)种质粒库，包含有7bp四种碱基对序列的任一质粒。 

3)、选择目标基因，将目的基因划分成若干个82bp的DNA片段，依次重构Kana、cam、gem、spc抗性基因，再通过Kana、cam、gem、spo四种中抗生素对应的去筛选重组子。 

先选择确定目标基因X，将需要合成的目标基因的DNA序列按照每82bp进行划分为G1、G2、G3、G4、G5……多个小片段，每个片段之间有3个碱基的重复。 

根据分好的G1、G2等小片段的序列分别在建好的7bp质粒库找对应的质粒，每个82bp的片段需要16个7bp的质粒。 

将一一对应的质粒分别先用BsgI、AgeI和BseRI、XmaI在37℃酶切3h，然后在65℃处理10min进行混合，然后再取5ul和solution I1∶1混合，16℃连接1h后转化大肠杆菌感受态细胞，通过重构kana抗性基因，最后在加有kana抗生素的LB培养基中培养过夜，就可以得到正确的重组子，抽质粒得到12bp的质粒。然后再通过相应的酶切，通过同样的步骤，依次重构cam、gem、spc抗性基因，用相应的抗生素进行遗传筛选，最后得到82bp的DNA片段。由于起始质粒是正确的库质粒，而整个过程只是进行了酶切酶连的操作，不会引入突变，所以通过抗性基因这种遗传因素筛选的重组子就是正确的，无需测序，分别命名为XG1、XG2、XG3、XG4、XG5……。 

4)、多个82bp的DNA片段组装成大片段基因。 

要合成大于82bp以上的DNA片段，需要用步骤3的XG1、XG2、XG3、XG4、XG5……质粒作为供体质粒，再另加切好的受体载体质粒puc-Kana(这个载体是通过PCR、套叠PCR、无酶克隆等常规方法构建备用的)做金门克隆反应(Golden Gate Clone)(Engler，C.，R.Kandzia， and S.Marillonnet，A one pot，one step，precision cloning method with high throughput capability.PLoS One，2008.3(11)：p.e3647)，这样就合成了与目标基因序列一致的合成基因，具体过程见图3。 

合成的82bp的DNA片段XGl、XG2、XG3、XG4、XG5……质粒是壮观霉素抗性的，而实验室构建的金门克隆受体载体puc-Kana是kana抗性，与供体质粒的抗性不一样，而且受体载体puc-Kana有gfp表达盒式结构，所以受体质粒转化大肠杆菌菌落也是发光的，所以最后转化所得重组子可以通过Kana抗性的正筛选作用和gf1p的负筛选作用，这样可以使后期筛选重组子的工作进一步的简洁化和效率化。将PCR鉴定正确的重组子送测序，就可以得到正确的完整的DNA序列，由于在后期的金门克隆反应中只涉及到酶切连接反应，所以只要合成的小片段DNA是正确的，就不会突变，这样准确率很高。 

如果目的基因比较大，可以进行第二轮金门克隆反应以达到合成较大的基因序列的目的基因。 

本发明的DNA合成方法具有以下优势： 

(1)目前唯一不需要利用订制引物(一股实验室合成引物都是从相关的公司中订购)和自我合成引物(有些实验室如果有合成仪器，可以自己合成引物)的基因合成方法，成本低。只要建好7bp A、T.G、C全排列的载体基因资源库载(16384种)就可以达到一劳永逸的效果，以后合成基因都可以不用再合成引物，成本低。 

(2)突变率极其低，由于整个合成过程是从质粒出发，只是经过酶切酶连等操作，没有常规DNA合成方法中引物引进的突变，而且没有经过PCR过程，所以突变率极低，甚至为零。 

(3)整个过程都是进行的酶切酶连操作，没有引进PCR等操作，而且利用抗性重构的原理，用重构的相应抗生素进行遗传筛选，准确率高，无需测序，成本低。 

(4)可以合成特殊的基因序列，如高度重复序列，Poy A等Poly序列，可以用于研究一些复杂结构或一些调控序列的机理，由于该方法是从质粒出发，酶切酶连，不需要PCR，可以合成PCR方法不能合成的高度重复序列。 

(5)操作简单，酶切产物可以直接连接转化，无需纯化。由于是通过抗性基因这个遗传因素来筛选，在加入相应抗生素后，只有连接上的才能重构出完整的对应抗性基因，才能生长起来，而一些没有酶切的质粒或者连接错误的产物由于不能得到完整的抗性基因，不能在加有抗生素的培养基中生长。 

(6)可以实现溶液操作，由于筛选的是用抗性基因筛选，不需要涂平板等操作，故可 以进行溶液操作，从而就可以实现自动化操作。 

(7)有利于构建突变体文库，对于做定点诱变和定向进化效率非常高，筛选工作量比现有的构建突变体库的方法可以降低至2-3个数量级 

附图说明

图1为载体pNew的构建过程。以商品化载体pet23a质粒为骨架，改造载体，通过PCR，重叠延伸PCR和无酶克隆等操作构建载体pNew。 

图2为利用重构抗性基因合成82bp片段的过程。质粒分别用AgeI、BsgI和XmaI、BseRI酶切，然后再用T4连接酶16℃连接处理，重构Kana抗性基因，转化后得到12bp片段质粒。再依次重构Cam、Gem、Spc抗性基因，四轮重构后得到82bp片段的质粒。 

图3为以82bp供体质粒和puc-Kana受体载体做金门克隆反应的原理和流程图。 

具体实施方式

下面以实施例对本发明进一步说明 

实施例1：利用本发明，合成鸡(G gallus)来源的抗生物素蛋白(avidin)基因。 

1、通过PCR、套叠PCR、无酶克隆等常规方法构建载体puc-Kana备用。 

2、先将目标基因avidin的碱基序列(438rnt)序列分成6个小段，每个小段分别命名为AV1、AV2、……AV6，前5段各为82nt，第6段为42nt，再在已经构建好的16384个7bp的质粒库中找对应的质粒，每个82nt的片段需要16个质粒，42nt的片段需要8个质粒。 

3、分别将找出的每组16个质粒，两个为一组，分别命名为Ai＼B1，A2\B2……A8\B8，每组质粒(An\Bn)有2bp的重叠供连接用，An质粒和Bn质粒分别按照以下体系和程序反应。 

An组和Bn组都在37℃条件下反应3h。 

4、将上述酶切产物分别以对应的An＼Bn混合，65℃热失活10min后，分别取5ul加T4Liagse16℃连接30min后分别转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，通过重构得到完整的Kana表达盒，转化产物分别接种在加有卡纳抗生素的LB培养基中培养12-16h，然后用常规方法抽提质粒，分别命名为KA1、KA2……KA8，这些质粒都含有12bp片段。 

5、将KA1、KA2……KA8质粒还是将其两两分组，分别用(SalI、BsgI)和(XhoI、BseRI)组合切，重构Cam表达盒，用氯霉素抗生素进行筛选。体系和程序和步骤3类似，再重复步骤4后，就可以得到含有22bp片段的质粒。重复上述步骤，再重构Gem和Spc抗性基因，用相对应的抗生素进行筛选，经过四轮重构后，最后得到含有82bp目的基因的质粒。分别为AV1、AV2、……AV5，AV6只有62bp，只需要重构3轮。 

6、将正确的质粒AV1、AV2、……AV6和载体puc-Kana按照以下本系和程序反应 

反应体系： 

反应完后取5ul直接转化大肠杆菌感受态细胞，涂LB+kana的平板，37℃培养过夜，挑取不发光的菌落进行PGR和质粒大小鉴定，再送去测序，就可以得到正确的全长的avdin的基因序列。 

Claims (3)

1.一种基于质粒库的无引物基因合成方法，其特征在于该方法通过构建一个包含有7bp的A、T、C、G四个碱基的任意组合序列的16384（4⁷ ）个质粒的质粒库，从已构建好的含有7个bp的质粒出发，将选定的目标基因按照每82bp进行划分，通过酶切酶连操作依次进行Kana、cam、gem、spc四种抗性基因的重构，得到若干含82bp的质粒， 然后再把这些82bp质粒组装合成长片段基因。

2.根据权利要求1所述的一种基于质粒库的无引物基因合成方法，其特征在于具体做法如下：

1）、构建抗性基因重构载体pNew

a)、构建线性载体骨架pNew，

b)、构建线性载体骨架5SGCK，

c)、构建线性载体骨架3KCGS，

d)、无酶克隆组装pNew载体质粒，

通过无酶克隆的方式把3个片段：线性载体骨架pNew、5SGCK、3KCGS克隆到一个完整的载体上，经过限制性内切酶酶切和测序鉴定得到正确的pNew载体质粒；

2）、用已构建好的pNew载体，用常规方法构建4⁷ (16384)种质粒库，包含有7bp四种碱基对序列的任一质粒；

3）、选择目标基因，将目的基因DNA序列按照每82bp进行划分为G1、G2、G3、G4、G5……多个小片段，每个片段之间有3个碱基的重复，依次重构Kana、cam、gem、spc抗性基因，筛选重组子XG1、XG2、XG3、XG4、XG5……；

4）、多个82bp的DNA片段组装成大片段基因

用步骤3的XG1、XG2、XG3、XG4、XG5……质粒作为供体质粒，再用切好的受体载体质粒puc-Kana做金门克隆反应，这样就合成了与目标基因序列一致的合成基因。

3.根据权利要求1所述的一种基于质粒库的无引物基因合成方法，其特征在于当目的基因较大时可以再进行第二轮或多轮金门克隆反应以达到合成较大的基因序列的目的基因。