CN110129311B - 一种无立足点和分支迁移域的dna链置换新方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及DNA链置换技术，提出了一种无立足点和分支迁移域的DNA链置换新方法。将DNA双链[DNA1,DNA2]与DNA单链DNA3混合，DNA3中片段1*和9*与DNA1中的互补片段1和9在碱基互补作用下，促使DNA1形成发卡结构，进而DNA2从DNA1上脱落，形成DNA3对DNA2的链置换。该DNA链置换过程中，置换链DNA3与被置换链DNA2之间在碱基排列上无任何依赖关系，实现了一种不需要立足点和分支迁移域的DNA链置换新方法。该方法可以用于替代目前依赖立足点的DNA链置换方法，可广泛应用于生物计算，基因编辑以及纳米技术。
Description
技术领域
本发明涉及DNA计算领域，尤其涉及DNA链置换技术。
背景技术
作为一种新型的计算模型，DNA计算的研究与应用得到了广泛的关注。近年来，随着DNA链置换技术在DNA计算中的应用，相继实现了基于DNA链置换的DNA逻辑门、DNA电路、DNA纳米计算设备，DNA计算逐渐由理论研究进入了实用化研究阶段。
DNA链置换是利用DNA分子杂交过程中的自由能最终趋于稳定的特性，通过在DNA模板链上设计立足点(toehold)和分支迁移域(branch migration domain)，触发或控制DNA链置换反应，即用较长的DNA置换链与DNA模板链上的立足点先行杂交，然后在分支迁移作用下，通过对DNA模板链上的分支迁移域上杂交的DNA被置换链进行置换与取代的过程(张成,马丽娜,董亚非,et al.自组装DNA链置换分子逻辑计算模型[J].科学通报,2012,57(31)：2909-2915)。直观上看，DNA链置换就是在DNA置换链存在的情况下，通过DNA分子的杂交反应，将DNA模板链上杂交的DNA被置换链进行置换取代的过程，过程的结果是DNA被置换链由双链杂交状态变为游离状态。
目前在DNA链置换的方法设计中，要求必须在DNA模板链上预先设计立足点与分支迁移域，且立足点与分支迁移域之间不能存在太多的碱基序列片段间隔(Genot A J,ZhangD Y,Bath J,et al.Remote Toehold：A Mechanism for Flexible Control of DNAHybridization Kinetics[J].Journal of the American Chemical Society,2011,133(7)：2177-2182)。但无论是否在立足点和分支迁移域之间存在碱基序列片段间隔，在DNA链置换中，立足点与分支迁移域均必须设计在DNA模板链上，且由于在DNA置换链、DNA模板链、DNA被置换链之间发生分支迁移过程，使得DNA置换链的碱基排列必须要与DNA模板链上的立足点和分支迁移域构成碱基互补关系，同时DNA被置换链的碱基排列必须与DNA模板链的分支迁移域的碱基排列构成碱基互补关系。上述在DNA模板链、DNA置换链和DNA被置换链之间的立足点与分支迁移域处的碱基排列依赖关系，使得在DNA链置换的应用中，立足点的设计成为关键，而立足点处的DNA片段长度一般仅为3-6个碱基(姚莉娜,田桂花,叶盟盟,etal.DN A链置换技术的研究现状与展望[J].郑州轻工业学院学报(自然科学版),2014(1)：15-21)，这大大增加了DNA链置换中DNA置换链、DNA模板链、DNA被置换链在碱基排列上的依赖耦合度，极大的增加了DNA序列设计难度，限制了DNA链置换的应用。
发明内容
针对DNA链置换中的立足点与分支迁移域对DNA链置换应用的限制问题，本发明所采用的技术方案为提供一种无立足点和分支迁移域的DNA链置换新方法。该方法在DNA模板链上设计发卡结构，以DNA模板链的5’-端与3’-端DNA片段作为DNA置换链的杂交结合域，对杂交在DNA模板链上的DNA被置换链进行置换取代。
本发明涉及以下的具体技术方案：
首先，设计DNA模板链DNA1、DNA被置换链DNA2和DNA置换链DNA3(图1)，具体包含以下步骤：
步骤1：在DNA模板链DNA1上，设计发卡结构：发卡茎部对应为DNA1上DNA片段4和其互补DNA片段4*，发卡环部对应DNA1上DNA片段5和6；
步骤2：为保证DNA被置换链DNA2与DNA模板链DNA1的稳定杂交，在DNA模板链DNA1上设计DNA片段7；
步骤3：DNA模板链DNA1的5’-端和3’-端设计DNA片段1、2、3和8、9，其中DNA片段2、3、8作为冗余DNA片段，可用于其它功能设计，DNA片段1和9作为DNA置换链DNA3的杂交结合域，其中DNA片段1和9各自的碱基序列不少于5个碱基；
步骤4：根据DNA1中的DNA片段64*7的碱基排列，设计DNA被置换链DNA2，其中DNA片段6*47*为DNA片段64*7的碱基互补序列，DNA2两端的DNA片段10和11作为冗余DNA序列，可用于其它功能设计；
步骤5：根据DNA1的DNA片段1和9的碱基排列，设计DNA置换链DNA3，其中DNA置换链DNA3的DNA片段1*和9*分别为DNA片段1和9的碱基互补序列，DNA片段x作为冗余DNA序列，可用于其它功能设计，且碱基序列不多于5个碱基；
其次，经过上述步骤的DNA片段设计，得到DNA链置换的模板链DNA1、DNA被置换链DNA2和DNA置换链DNA3。将DNA1与DNA2退火杂交，得到DNA双链[DNA1,DNA2]；加入DNA3后，DNA3的DNA片段1*和9*分别与DNA1的DNA片段1和9通过碱基互补实现杂交结合；在DNA3作用下，DNA1发生变构，形成发卡结构，DNA3从DNA1上脱落，完成DNA链置换。该DNA链置换过程中，DNA置换链DNA3与DNA被置换链DNA2之间在碱基上无任何依赖关系，实现了一种没有立足点与分支迁移域的DNA链置换方法。
本发明与现有技术方法相比具有以下优点：
1、在DNA链置换中，DNA模板链不需要设计立足点和分支迁移域；
2、在DNA链置换中，DNA置换链和DNA被置换链在碱基排列上没有依赖关系，实现了DNA置换链和DNA被置换在DNA序列设计上的解耦合；
3、在DNA置换链、DNA模板链、DNA置换链之间不发生分支迁移过程。
该DNA链置换新方法可以用于替代目前依赖立足点和分支迁移域的DNA链置换方法，可广泛应用于DNA计算，DNA电路以及DNA纳米技术。
附图说明
下列图示中箭头端对应DNA序列的3’-端,平头端对应DNA序列的5’-端。
图1 DNA链置换新方法原理示意图；
图2 DNA链置换新方法原理验证PAGE电泳结果；
图3 DNA片段10长度变异对比分析PAGE电泳结果；
图4 DNA片段7长度变异对比分析PAGE电泳结果；
图5 DNA片段1与1*长度变异对比分析PAGE电泳结果1；
图6 DNA片段1与1*长度变异对比分析PAGE电泳结果2；
图7 DNA片段冗余性验证PAGE电泳结果；
图8 DNA模板链片段碱基序列随机变异PAGE电泳结果；
图中泳道编号上部标注泳道内的反应物名称，泳道编号下部为反应物的摩尔浓度比。DNA双链用方括号表示，括号内为组成双链的对应DNA单链，“+”表示反应物的混合。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。
实施例中的DNA序列购自上海生工，其中DNA序列经过PAGE纯化，实施例中的DNA分子序列见表1。
实施例中应用的试剂为：EDTA2Na、Tris、冰乙酸、醋酸镁、过硫酸铵、聚丙烯酰胺、N,N'-甲叉双丙烯酰胺、四甲基乙二胺和Stains aLL。1×TAE/Mg2+缓冲液：40mmoL/L Tris，20mmoL/L乙酸，1mmoL/L EDTA2Na，12.5mmoL/L醋酸镁,pH＝8.0。浓度为40％的丙烯酰胺母液：190g丙烯酰胺和10g N,N'-甲叉双丙烯酰胺，37℃水溶后,加去离子水定容至500mL。所有DNA链经Nanodrop 2000分光光度计(Thermo Fisher Scientific Inc.USA)进行浓度测定。荧光信号采用实时荧光PCR仪(AgiLent，G8830A)检测，最大吸收波长为550nm，最大发射波长为564nm。实施例中的DNA双链[DNA1,DNA2]经退火(95℃4分钟，65℃30分钟，50℃30分钟，37℃30分钟，22℃30分钟，20℃保存)生成，然后加入DNA置换链DNA3，25℃下经过2小时的常温链置换反应，链置换反应缓冲液为1×TAE/Mg2+缓冲液。
实施例的结果采用PAGE凝胶电泳方式进行检测。
表1 实施例中用到的DNA序列
实施例1 DNA链置换新方法原理验证
根据图1中DNA链置换的设计方法，图2给出该DNA链置换新方法的PAGE检测结果。图2中的DNA序列DNA1-1、DNA2-1、DNA3-1分别对应图1中设计方法的DNA模板链DNA1、DNA被置换链DNA2、DNA置换链DNA3。首先，由泳道4中的电泳带分布，可以看到DNA模板链与DNA被置换链能够稳定形成DNA双链[DNA1-1,DNA2-1]。同时，泳道9中电泳带为DNA双链[DNA1-1,DNA3-1]，作为确认链置换结果的参照对比电泳带。泳道5-8分别为不同摩尔浓度比下DNA链置换的结果。由泳道5-8的电泳带，可以看到，对于DNA模板链与DNA被置换链[DNA1-1,DNA2-1]，在添加DNA置换链DNA3-1后，均能够将DNA被置换链DNA2-1置换出来，形成明显的电泳带[DNA1-1,DNA3-1]。其中在泳道5-7中，可以明显看到置换出来的DNA被置换链[DNA2-1]的电泳带。该实例说明了本发明提供的DNA链置换新方法的有效性及可实施性。
实施例2 DNA被置换链DNA片段长度变异对比分析
图3为图1中DNA被置换链DNA2上冗余DNA片段10的长度变异对DNA链置换影响的对比分析。本实施例中，DNA被置换链DNA2-2-016、DNA2-2-116、DNA2-2-316在DNA片段10的长度分别为0、1、2。由泳道7与泳道9的对比可知，在添加DNA置换连DNA2-2-016时，双链[DNA1-2,DNA2-2-016]没有形成，因此，泳道8中对应DNA被置换链DNA2-2-016的电泳带不是由于DNA3-2的链置换而形成的，是源自没有与DNA模板链DNA1-2杂交的游离的DNA2-2-016因此在case 3-1中未发生DNA链置换。由泳道5的电泳带可知，DNA双链[DNA1-2,DNA2-2-116]能够稳定形成，对应于泳道6中的电泳带分布可知，在添加DNA置换链[DNA3-2]后，双链[DNA1-2,DNA2-2-116]中的DNA被置换链DNA2-2-116被置换出，形成泳道6中的最下部的电泳带，因此在case 2-1中发生了DNA链置换。由泳道3与泳道4的电泳带分布可知，在DNA置换链[DNA3-2]存在的情况下，DNA双链[DNA1-2,DNA2-2-316]中的DNA被置换链DNA2-2-316被置换出，形成泳道4中的上部电泳带[DNA1-2,DNA3-2]，因此在case 1-1中发生了DNA链置换。
图4为图1中DNA被置换链DNA2上冗余DNA片段7的长度变异对DNA链置换影响的对比分析。本实施例中，DNA被置换链DNA2-2-018、DNA2-2-118、DNA2-2-318在DNA片段10的长度分别为0、1、3，在DNA片段7的长度均为8，与此相对，图2中的DNA被置换链DNA2-2-016、DNA2-2-116、DNA2-2-316在DNA片段7处的长度为6。由泳道5与泳道6(case 2-2)以及泳道7与泳道8(case3-2)可知实现了DNA置换链DNA3-2对DNA被置换链DNA2-2-118及DNA2-2-018的置换，尤其是在泳道8中，可以明显看到被置换出来的DNA被置换链DNA2-2-018的电泳带。但是由泳道4(case 1-2)中最上部电泳带与泳道9中最上部电泳带的对比可知，case1-2中未实现DNA链置换。
由图3与图4的PAGE电泳结果可知，在case 1-1、case 2-1、case2-2、case 3-2中均实现了DNA链置换，说明DNA被置换链DNA2的DNA片段10与DNA片段7存在冗余性，可以用于其它功能设计，验证了该方法的通用性。
实施例3 DNA模板链与DNA置换链序列长度变异对比分析
在实施例2的基础上，对DNA模板链与DNA置换链进行长度变异对比分析。
分别对应于图3和图4，图5和图6对DNA模板链DNA1在DNA片段1处的碱基序列进行了延长，相应的对DNA置换链DNA3在DNA片段1*处的碱基序列进行了延长。与实施例2中的DNA模板链DNA1-2相比，本实施例中DNA模板链DNA1-3在DNA1-2的5’-端延长了4个碱基的长度，DNA置换链DNA3-3在DNA3-2的3’-端延长了4个碱基的长度。
类似于实施例2中的泳道分析，由图5case 3-1泳道8的电泳带可知，DNA模板链DNA1-3没有与DNA2-2-016形成稳定的DNA双链，故在泳道9中未发生DNA链置换。而图5中case 1-1和图5中case 2-1两种情况下均实现了DNA链置换。图6中的三种情况下均实现了DNA链置换。
实施例4 DNA片段冗余性验证
图7中泳道3和泳道4对DNA模板链与DNA被置换链的双链电泳带，通过与泳道1中DNA模板链电泳带的对比，可知DNA双链[DNA1-4,DNA2-4-36]与[DNA1-4,DNA2-4-37]均能够稳定形成。图7中泳道4和泳道5为DNA模板链与DNA置换链杂交后的电泳带，用于DNA链置换结果的参照对比。泳道7-10为加入DNA置换链后的反应结果。由泳道7-10中上部电泳带与泳道5和泳道6中电泳带的对比，可知，在四种情况下均实现了DNA链置换，同时在泳道7-10的下部可以明显看到被置换出的DNA被置换链的电泳带。
实施例5 DNA模板链序列变异结果对比分析
在实施例4基础上，对DNA模板链进行序列变异对比分析。实施例5中DNA模板链DNA1-5在除与DNA置换链DNA3-4-T93和DNA3-4-T102的杂交结合域外的DNA片段处进行随机变异。由泳道1的电泳带分布可知，DNA模板链与DNA被置换链能够形成稳定的DNA双链。泳道2和泳道3为DNA模板链与DNA置换链杂交后的电泳带，用于DNA链置换结果的参照对比。泳道4-7为加入DNA置换链后的反应结果。由泳道4-7中上部电泳带与泳道2和泳道3中电泳带的对比，可知，在四种情况下均实现了DNA链置换，同时在泳道4-7的下部可以明显看到被置换出的DNA被置换链的电泳带。
Claims (3)
1.一种无立足点和分支迁移域的DNA链置换新方法，其特征在于，该方法包含以下步骤：
步骤1：设计具有发卡结构的DNA序列，作为DNA链置换中结合DNA被置换链的DNA模板链；
步骤2：根据步骤1中DNA模板链的发卡结构茎部和环部的碱基排列，设计互补的DNA序列，作为DNA链置换的DNA被置换链；
步骤3：根据步骤1中DNA模板链5’-端和3-’端的DNA序列片段，设计DNA链置换中的DNA置换链；
步骤1中，DNA链置换中的DNA模板链具有发卡结构；发卡结构茎部的DNA片段长度不小于3个碱基，环部的DNA片段长度不小于2个碱基；
步骤2中的DNA被置换链的碱基排列只与DNA模板链的茎部和环部的DNA序列片段存在碱基互补关系；
步骤3中的DNA置换链的碱基排列只与DNA模板链的5’-端和3’-端的DNA序列片段存在碱基互补关系；
步骤3中的DNA置换链的碱基排列设计与步骤2中的DNA被置换链的碱基排列不存在依赖关系。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：DNA链置换中不需要设计立足点和分支迁移域。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在DNA置换链将DNA被置换链从DNA模板链上置换出来的过程中，DNA置换链、DNA模板链、DNA被置换链之间不发生分支迁移过程。
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