CN101864489B - 一种富集转基因产品中外源dna的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种富集转基因产品中外源DNA的方法，包括以下步骤：1)对转基因产品进行DNA提取；2)向步骤1)得到的DNA提取液中加入缓冲液和生物素标记的核酸探针，混匀后经过变性、退火冷却至室温；3)向经所述步骤2)获得的溶液中，加入表面标记有链霉亲和素的磁珠，充分混匀后，在磁场中吸附磁珠，用缓冲液清洗磁珠；4)将经所述步骤3)所得的磁珠，置于缓冲液中，加热到80℃以上，保持一段时间后，取上清溶液，获得富集的外源DNA片段。本发明方法可以有效地提高待检测DNA溶液中的外源DNA丰度，能够更准确的检测判断农作物或食品中是否含有微量比例的转基因成分；检测时间快速；不需要特殊试剂材料，价格便宜。

Description

一种富集转基因产品中外源DNA的方法

技术领域

本发明涉及检测样品中是否含有转基因成分的方法，尤其涉及一种基于磁珠-核酸探针平台特异性的富集转基因产品中外源DNA的方法，其能够提高最终用于检测反应的DNA模板中外源DNA丰度。

背景技术

现在实验室中检测样品中是否含有转基因成分，一般是分析样品的DNA中是否含有外源DNA或者分析样品的蛋白中是否含有外源蛋白成分。在分析样品的DNA时，涉及到样品DNA的提取，目的片段扩增(PCR)以及扩增效果的检测(荧光定量PCR实时检测、电泳图谱分析、dHPLC分析等)。

现在使用的转基因生物及产品DNA提取的常规方法分为两大类：一类为液相提取法，包括碱裂解法和酚氯仿抽提法等，通过物理方法或化学试剂破碎样品，释放基因组DNA，再根据萃取和相分离等原理，利用不同的溶剂将DNA和蛋白、多糖及脂质等成分分开；另一类为固相提取法，利用硅胶微球、表面修饰的磁性微球、硅胶柱等吸附DNA，达到分离提取DNA的效果(参考文献：DNA Isolation From Dry andFresh Samples of Polysaccharide-Rich Plants，Plant Molecular BiologyReporter 20：415a-415f，December 2002；PCR-Based Detection ofGenetically Modified Soybean and Maize in Raw and Highly ProcessedFoodstuffs，BioTechniques Vol.31，No.22001；Soybean SeedsSampling and DNA Extraction，CRLVL13/05XP 14 May 2007 andCRLVL05/06XP 18February 2008)。基于这些方法，许多公司推出了相关的商品化试剂盒，如Qiagen，ABI，Takara(相关网址：http://www1.qiagen.com/Products/GenomicDnaStabilizationPurification/AnimalPlantSamples.aspx；http://www.takara.com.cn/？action＝Page&Plat＝product&subclass＝1)。

上述所有的方法提取的都是样品的总DNA，在转基因成分分析时，用上述方法所获得的DNA中外源基因DNA的丰度的高低与样品中的转基因成分的多少相对应，这使得通过PCR扩增检测外源基因和内参基因并比较两者之间的数量关系，可以知道转基因成分在样品中的含量，这也是转基因成分分析定量检测的基础。这种方法存在一个检测极限的问题，因为我们现在所用的检测方法如PCR扩增或荧光定量PCR实时检测，每个检测反应所用的DNA模板量在25～500ng，若检测样品中转基因成分含量较低时，会因为样品中含有的外源DNA拷贝数太少，造成结果的假阴性。解决这一问题的方法，一方面是通过优化PCR反应体系，尽可能提高PCR的检测限；另一方面是从样品制备方面入手，提高最终用于检测反应的DNA模板中外源DNA的丰度。

发明内容

鉴于上述情况，本发明的目的在于提供一种能够提高最终用于检测反应的DNA溶液中外源DNA丰度的，富集转基因生物及产品中外源DNA的方法。

本发明在常规提取基因组DNA的基础上，再将获得的基因组DNA直接或用适当限制性内切酶酶切后，稀释成适当浓度溶液，将生物素标记的目标基因的核酸探针加入到溶液中，待探针和目标基因(外源基因以及内标准基因)杂交后，加入表面包被有链霉亲和素的磁性颗粒，使其形成一个生物素-亲和素系统，此时生物素会和链霉亲和素特异性结合。随后利用磁场快速富集磁性微球，即可将目标基因特异性地提取出来。由此可以将微量的DNA富集起来(见图1)。

本发明提供一种富集转基因产品中外源DNA的方法，其包括以下步骤：

1)对转基因产品进行DNA提取；

2)向步骤1)得到的DNA提取液中加入缓冲液和生物素标记的核酸探针，混匀后经过变性、退火冷却至室温；

3)向经所述步骤2)获得的溶液中，加入表面标记有链霉亲和素的磁珠，充分混匀后，在磁场中吸附磁珠，用缓冲液清洗磁珠；

4)将经所述步骤3)所得的磁珠，置于缓冲液中，加热到80℃以上，保持一段时间后，取上清溶液，获得富集的外源DNA片段。

其中，在步骤1)中，所述产品为植物组织、种子或者其经深加工得到的产品。

在步骤2)中，所述缓冲液为SSPE或SSC缓冲液；所述生物素标记的核酸探针为5’端或3’端标记了生物素的核酸探针，长度为15～45nt，核酸探针的序列和要纯化的外源基因的部分片段完全匹配；所述变性、退火冷却至室温是对样品加热到70℃以上，维持适当的时间，待DNA双链完全解链，再缓慢冷却降温到室温。

在步骤3)中，所述表面标记有链霉亲和素的磁珠指的是表面偶联有链霉亲和素的磁性微球；所述缓冲液为SSPE溶液或SSC溶液。

在步骤4)中，所述缓冲液是指SSPE、SSC、磷酸盐缓冲液或TE溶液。

本发明还提供一种用于转基因成分检测的DNA溶液，该溶液通过使用上述富集转基因生物及产品中外源DNA的方法制备。

本发明进一步提供一种转基因成分检测定量方法，该方法使用上述的用于转基因成分检测的DNA溶液。

更具体地，本发明提供一种富集转基因产品中外源DNA的方法，其包括以下步骤：

1)对待检测产品的DNA进行提取；

所述产品指的是需要判断其中是否含有转基因成分的植物组织、种子或者经过深加工得到的产品；该步骤的DNA提取方法可以采用通用的基因组DNA提取方法如CTAB法、酚氯仿抽提或者商品化试剂盒来实现；所获得的DNA为产品的基因组DNA；

2)向步骤1获得的DNA提取溶液中加入适当的缓冲液和生物素标记的核酸探针，混匀后经过变性、退火冷却至室温；

所述缓冲液包括SSPE、SSC缓冲液等。1×SSPE缓冲液含0.15mol/L NaCl，10mmol/L NaH₂PO₄，1.25mmol/L EDTA，pH7.4；1×SSC缓冲液含0.15mol/L NaCl，15mmol/L柠檬酸钠。

所述生物素标记的核酸探针为5’端或3’端标记了生物素的核酸探针，长度为15～45nt，核酸探针的序列和要纯化的外源基因的部分片段完全匹配。

所述变性、退火指的是对样品加热到70℃以上，维持适当的时间，待DNA双链完全解链，再缓慢冷却降温到室温。

3)在步骤2获得的溶液中，加入适量表面标记有链霉亲和素的磁珠，充分混匀后，在磁场中磁珠被吸附下来，移去上清液，用适当缓冲液清洗磁珠；

所述表面标记有链霉亲和素的磁珠指的是表面偶联有链霉亲和素的磁性微球，可采用的商品化的产品如：promega的

Magnetic Separation Products，dynal的Streptavidin-Coupledbangslab的

Plus等。

所述缓冲液是指合适浓度的SSPE溶液或SSC溶液。

4)将步骤3所得的磁珠，置于适当的缓冲液中，加热到80℃以上，保持一段时间后，取上清溶液，即获得了富集的外源基因DNA片段。

所述适当的缓冲液是指适当浓度的SSPE、SSC、磷酸盐缓冲液或TE溶液。

本发明还提供一种用于转基因成分检测的DNA溶液，其通过使用上述基于磁珠-核酸探针平台特异性富集转基因产品中外源DNA的方法制备。

本发明还提供一种转基因成分检测定量方法，其通过使用上述用于转基因检测的DNA溶液而实现。

本发明的关键点在于：

①生物素标记特异性探针的设计；

②探针与目标基因杂交的溶液成分；

③表面包被链霉亲和素的磁珠与生物素高效结合的实验条件

本发明具有如下有益效果：

1)本发明通过富集分离插入基因组中的外源DNA片段，制备用于转基因检测的DNA溶液。该方法可以有效地提高待检测DNA溶液中的外源DNA丰度，能够更准确的检测判断农作物或食品中是否含有微量比例的转基因成分。在针对一些未获批商业化的转基因作物或产品是否已流入市场的检测和监测中有实用意义。

2)整个检测过程可以在3小时以内完成，检测时间快速；不需要特殊试剂材料，价格便宜；与Real-time PCR相结合可以得到定量的结果；所采用的方法手段均已经在国际上广泛接受或认可；通过改变引物和探针能够检测所有已商品化的转基因作物品种，也可以能够筛查出未经许可的转基因生物品种；同时适用于原材料和深加工品的检测；由于针对的是大豆、玉米、水稻等国际上大宗流通的产品，因此具备认可的标准物质。本发明不仅可以准确、灵敏的在低浓度下检测转基因食品中的CaMV35S、Nos等特异性基因，而且可以在正常PCR无法扩增的浓度下重新富集高浓度的DNA溶液以进行检测，整个过程灵敏性、准确性、重复性好。同时在富集过程中排除PCR抑制物等其他物质的干扰，也就避免了假阴性结果的出现。

附图说明

图1为本发明磁珠-核酸探针平台特异性富集转基因生物及产品中外源DNA的方法的流程示意图；

图2为表示本发明实施例1中待测产品DNA提取溶液PCR检测结果的电泳谱图；其中(M：100bp Marker；1：转基因DNA阳性正对照；2、3：非转基因大豆的阴性对照；4、5：无模板的负对照)；

图3为表示未进行本发明磁珠提取处理的DNA提取溶液极限浓度检测结果的电泳分析图；其中

(1：提取溶液稀释1200倍；2：提取溶液稀释1000倍；3：提取溶液稀释800倍；4：提取溶液稀释500倍；5：提取溶液稀释300倍；6：提取溶液稀释100倍；7：无模板的负对照；M：100bp Marker)；

图4为表示进行本发明磁珠处理后DNA提取溶液PCR检测结果的电泳分析图；其中

(1：稀释1000倍DNA提取溶液经磁珠处理后的DNA溶液；2：稀释5000倍DNA提取溶液经磁珠处理后的DNA溶液；3：稀释1000倍DNA提取溶液；4：稀释5000倍DNA提取溶液；5：非转基因大豆阴性对照；6：无模板的负对照；M：100bp Marker)。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

以孟山都公司出品的转基因大豆(品系：ARG04)为检测对象，以检测该转基因大豆中的外源基因CaMV35S启动子为例：

本实施例中采用的引物：

35S-A(上游引物)：5’-TGGAAAAGGAAGGTGGCT-3’(序列1)

35S-B(下游引物)：5’-CTTGCGAAGGATAGTGGG-3’(序列2)

本实施例中生物素标记的目标基因探针，在检测上游引物与下游引物之间，其序列为：

5’-CCTACAAATGCCATCATTGCG-3’(序列3)

检测的外源目的基因为CaMV 35S启动子，该启动子序列为(序列4)：

tggaaaagga aggtggctcc tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag gccatcgttgaagatgcctc tgccgacagt ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg agcatcgtggaaaaagaaga cgttccaacc acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat atctccactgacgtaaggga tgacgcacaa tcccactatc cttcgcaaga cccttcctct atataaggaagttcatttca tttggagagg acacg

检测过程如下：首先提取转基因大豆的基因组DNA溶液，然后对DNA溶液进行稀释，再对稀释后的DNA溶液进行普通PCR检测，找到普通PCR无法检测到的DNA溶液浓度，实验中当DNA提取液被稀释1000倍后无法在琼脂糖胶上得到可见条带，因此以此浓度以下DNA溶液作为磁性分离实验的对象。针对PCR无法检测浓度的DNA溶液采用磁性分离手段进行基因富集，得到处理后的DNA样品，对此样品再进行PCR扩增，对扩增结果电泳检测，结果发现针对稀释了1000、5000倍的DNA溶液进行磁性分离富集处理后，在琼脂糖胶上可以得到正常PCR得到的可见条带，采用本方法处理后的DNA溶液中外源基因的检测浓度提高了5倍以上。

具体操作步骤如下：

首先要对待检测样品(转基因大豆)进行DNA提取得到DNA提取液：将转基因大豆粉末与配好的缓冲液(10mmol/L Tris-Cl(pH 8.0)；0.1mol/L EDTA(pH 8.0)；0.5％(m/V)SDS；20μg/mg无DNase的胰RNase)混合，分装到1.5mL离心管中，离心(14000r 5min)。取各管上清，加入等体积Tris-酚，离心(8000r 5min)，取上清，重复操作2遍。加入2倍体积无水乙醇沉淀DNA，离心(14000r 5min)，弃上清。加入300μL 70％乙醇洗，离心(8000r 1min)，弃上清，再重复操作1遍，去上清后静置离心管至管内无乙醇后，用100μL无菌水溶解DNA。

然后，对得到的DNA无菌水溶液用生物素标记的目标基因探针标记，采用磁性分离技术来进行浓缩。具体包括下述步骤：首先将生物素标记的目标基因探针溶解在水中，配成100μmol/L待用。取500μLDNA无菌水溶液在80℃水浴放置10min后，立即加入5μL配好的目标基因探针及25μL20×SSC，冷却至室温。取一管链霉亲和素磁珠，插在磁力架上静置至所有磁珠被吸附到磁力架方向，移去上清。用0.5×SSC洗三次，每次200μL，再用100μL 0.5×SSC浸泡磁珠。将冷却的DNA溶液与磁珠混合后常温放置10min。用磁力架吸附磁珠，去上清，用0.2×SSC洗4次，每次300μL，每次洗完后用磁力架吸附磁珠，去上清。用50μL无菌水浸泡磁珠，80℃放置10min后立即取上清，即为富集到的外源DNA溶液。

实验例

1.DNA提取溶液PCR检测：

以实施例1获得的DNA无菌水溶液为模板，进行PCR扩增后电泳分析。图2为表示DNA提取溶液PCR检测结果的电泳分析图：

从图2的PCR检测结果可知，在PCR反应中无其余可扩增基因干扰(4、5负对照无特异条带)，所采用引物有特异性；不会对非转基因大豆的基因进行扩增(2、3无特异条带)；所采用引物可以对转基因大豆目的片段进行扩增(1有特异条带)。

2.极限浓度(PCR反应刚好无法扩增的浓度)的检测：

对实施例1获得的DNA无菌水溶液进行多次稀释后，进行PCR扩增后电泳分析。图3为表示未进行本发明磁珠处理的DNA提取溶液极限浓度检测结果的电泳分析图。

由图3的实验结果可以得到：提取的DNA溶液在稀释1000倍的情况下无法被扩增(2孔无特异条带而3孔有)，即稀释1000倍的浓度为所提取的DNA的极限浓度。

3.磁珠处理后DNA溶液PCR检测：

对普通PCR无法检测到的浓度样品(实施例1的转基因大豆的DNA提取液稀释1000倍和5000倍)进行磁珠提取处理后，进行PCR扩增后电泳分析。图4为表示磁珠处理后DNA溶液PCR检测结果的电泳分析图。

图4结果说明稀释1000倍和5000倍的DNA溶液利用本方法特异性富集外源目的基因后，都可以被扩增(1孔和2孔均有条带)。通过本方法富集后，外源基因丰度提高，可用于转基因产品相关的PCR检测，本方法可有效提高检测的灵敏度达5倍。

序列表

<110>北京大学

<120>一种富集转基因产品中外源DNA的方法

<130>KHP10112272.6

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

tggaaaagga aggtggct                      18

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

cttgcgaagg atagtggg                     18

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

cctacaaatg ccatcattgc g                 21

<210>4

<211>265

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

tggaaaagga aggtggctcc tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg    60

aagatgcctc tgccgacagt ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg    120

aaaaagaaga cgttccaacc acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat atctccactg    180

acgtaaggga tgacgcacaa tcccactatc cttcgcaaga cccttcctct atataaggaa    240

gttcatttca tttggagagg acacg                                          265

Claims (2)

1.一种富集转基因产品中外源DNA的方法，包括以下步骤：

1）对转基因产品进行DNA提取；所述产品为植物组织、种子或者其经深加工得到的产品；

2）向步骤1）得到的DNA提取液中加入缓冲液和生物素标记的核酸探针，混匀后经过变性、退火冷却至室温；

所述缓冲液为：1×SSPE缓冲液或者1×SSC缓冲液；所述SSPE缓冲液的组分为：0.15mol/L NaCl,10mmol/L NaH₂PO₄,1.25mmol/LEDTA,pH7.4；SSC缓冲液的组分为：0.15mol/L NaCl,15mmol/L柠檬酸钠；

所述生物素标记的核酸探针为5’端或3’端标记了生物素的核酸探针，长度为15～45nt，核酸探针的序列和要纯化的外源基因的部分片段完全匹配；

所述变性、退火冷却至室温是对样品加热到70℃以上，维持适当的时间，待DNA双链完全解链，再缓慢冷却降温到室温；

3）向经所述步骤2）获得的溶液中，加入表面标记有链霉亲和素的磁珠，充分混匀后，在磁场中吸附磁珠，用缓冲液清洗磁珠；所述缓冲液为SSPE溶液或0.5倍的SSC溶液；

4）将经所述步骤3）所得的磁珠，置于缓冲液中，加热到80℃以上，保持一段时间后，取上清溶液，获得富集的外源DNA片段；所述缓冲液是指SSPE、SSC、磷酸盐缓冲液或TE溶液。

2.如权利要求1所述的富集转基因产品中外源DNA的方法，其特征在于，在步骤3）中，所述表面标记有链霉亲和素的磁珠指的是表面偶联有链霉亲和素的磁性微球。

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