CN107868838A - 用于检测转基因大豆的引物和探针组合、检测方法及试剂盒 - Google Patents

用于检测转基因大豆的引物和探针组合、检测方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了引物对和探针组合，本发明还提供了所述的引物对和探针组合在同时检测或辅助检测转基因大豆DAS81419及大豆内源基因中的应用；本发明同时还提供了含有该引物对和探针组合的试剂盒及应用，以及基于引物对和探针组合或试剂盒的检测转基因大豆DAS81419及大豆内源基因的方法。经实验证明，本发明的引物对和探针组合特异性好、灵敏度高、检测效率高，且基于该引物对和探针组合建立的转基因大豆DAS81419和大豆内源基因的双重荧光PCR方法高通量、灵敏、准确和快速，为同时检测转基因大豆DAS81419提供了更有效的方法。

Description

用于检测转基因大豆的引物和探针组合、检测方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测领域，特别涉及检测转基因大豆DAS81419和大豆内源基因的双重荧光PCR方法。
背景技术
2015年是转基因作物商业化20周年，全球转基因作物种植面积高达1.797亿公顷，比1996年商业化初期增长了100余倍，已成为现代农业史上采用最为迅速的作物技术。目前商业化种植的转基因作物主要有大豆、玉米、棉花、油菜等，其中全球种植面积最大的为转基因大豆，约占全球转基因作物总面积的一半。虽然我国还没有批准任何转基因大豆品系进行商业化种植，但我国已经成为转基因大豆的使用与消费大国，产品越来越多地进入了我国的食品生产与消费链，2015年转基因大豆的进口总量已达到8000万吨。
转基因大豆DAS81419是由美国陶氏益农研发的一种转基因大豆品系，含有两个抗虫基因Cry1Ac、Cry1F和一个抗除草剂基因pat，2014年美国和加拿大批准环境释放作为食品和饲料应用，但目前还没有获得我国转基因生物安全证书。2015年，中国进口大豆8169万吨，是全世界最大的大豆进口国，其中大部分为转基因大豆，主要来源于美国和巴西。然而，目前我国没有建立用于检测转基因大豆DAS81419的国家标准和出入境检验检疫行业标准，这不利于口岸实验室开展非法转基因品系的把关检测。因此，建立转基因大豆DAS81419的检测方法具有相当的意义。
目前，国内外针对转基因大豆的检测方法多采用单重荧光PCR技术，该技术在特异性、灵敏度、重现性等方面具有较大的优势，成为该领域的主要技术之一，但国内针对转基因大豆DAS81419品系的检测鲜有报道，而且目前还没有能同时检测转基因大豆DAS81419和大豆内源基因的多重荧光定量PCR技术的方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种灵敏、准确、高效且能同时检测检测转基因大豆DAS81419和大豆内源基因的双重荧光PCR方法，本发明还提供了用于该方法的特异性好、灵敏度高、检测效率高和适用范围广的引物对和探针组合，以及含有该引物对和探针组合的试剂盒及其应用。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：
引物对和探针组合，其特征在于，所述引物对和探针组合包括第一组引物对、第二组引物对、第一探针和第二探针，所述第一组引物对包含SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，所述第一探针与所述第一组引物对相对应，所述第一探针包含SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；所述第二组引物对包含SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，所述第二探针与所述第二组引物对相对应，所述第二探针包含SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。
另一方面，本发明提供了所述的引物对和探针组合在检测或辅助检测转基因大豆DAS81419和大豆内源基因，或制备检测或辅助检测转基因大豆DAS81419和大豆内源基因的产品中的应用。
本发明还提供了一种用于对转基因大豆进行检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物对和探针组合。
优选地，所述试剂盒还包括：
荧光定量PCR扩增试剂，所述荧光定量PCR扩增试剂包括dNTPs、Mg2+、PCR反应缓冲液和Taq DNA聚合酶，所述dNTPs、Mg2+、PCR反应缓冲液和Taq DNA聚合酶均来源于Takara公司的货号为RR390A的试剂盒中所包含的试剂；
所述试剂盒还包括DNA提取试剂，所述DNA提取试剂包括来自达安基因的货号为DA-Z146的核酸提取试剂、Promega公司的货号为A1120的Wizard Genomic DNApurification kit或TaKaRa公司的货号为9781的MiniBEST Plant Genomic DNAExtraction Kit中所包含的试剂；
所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。
需要说明的是，这里所提到的“所述试剂盒还包括DNA提取试剂”指的是，本发明的试剂盒中还包含DNA提取试剂盒中的相应成分或试剂，DNA提取试剂盒可以根据需要独立地存在或者包含在本发明的试剂盒内。
另一方面，本发明提供所述的试剂盒在检测或辅助检测转基因大豆DAS81419和大豆内源基因，或制备检测或辅助检测转基因大豆DAS81419和大豆内源基因的产品中的应用。
另一方面，本发明提供一种检测或辅助检测转基因大豆DAS81419和大豆内源基因的双重荧光PCR方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1)双重荧光PCR扩增
以生物样品含有的DNA为模板利用所述的引物对和探针组合或所述试剂盒进行双重荧光PCR扩增；
2)根据双重荧光PCR扩增的结果判断生物样品是否为转基因大豆DAS81419，同时判断样品是否含有大豆成分，或生物样品是否含有转基因大豆DAS81419和/或大豆成分的品系特异性基因成分。
优选地，在步骤1)之前还包括在生物样品中提取DNA的步骤；
所述在生物样品中提取DNA是采用达安基因的货号为DA-Z146的核酸提取试剂盒、Promega公司的货号为A1120的Wizard Genomic DNA purification kit或TaKaRa公司的货号为9781的MiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit进行的；
所述双重荧光PCR扩增的结果判断的标准为：在HEX通道下，当Ct值≤35为阳性，代表生物样品中含有转基因大豆DAS81419成分；当Ct值≥40或无Ct值为阴性，代表生物样品中未含有转基因大豆DAS81419成分；当35＜Ct值＜40时判为结果可疑，需重新检测，如复检Ct值一致的则判为阳性，代表生物样品中含有微量的转基因大豆DAS81419成分，如复检Ct值≥40则判为阴性，代表生物样品中未含有转基因大豆DAS81419成分。在ROX通道下，当Ct值≤35为阳性，代表生物样品中含有大豆成分；当Ct值≥40或无Ct值为阴性，代表生物样品中未含有大豆成分；当35＜Ct值＜40时判为结果可疑，需重新检测，如复检Ct值一致的则判为阳性，代表生物样品中含有微量的大豆成分，如复检Ct值≥40则判为阴性，代表生物样品中未含有大豆成分。
优选地，所述双重荧光PCR扩增的反应体系如下：
Probes Master 2×conc 10μL
SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5中所示引物10μmol/L，0.4～0.6μL
SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6中所示探针10μmol/L，0.05～0.3μL
DNA模板 1～2μL
ddH2O 补足至20μL；
所述Probes Master 2×conc来源于Takara公司的货号为RR390A的试剂盒。
优选地，所述双重荧光PCR扩增的反应体系如下：所述SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5中所示引物的用量均为0.5μL，所述SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.6中所示探针的用量分别为0.2μL和0.1μL；
所述双重荧光PCR扩增反应条件：95℃3min；95℃、5～10s，60℃、25～60s，40循环。
本发明的生物样品为转基因作物或含有转基因成分的加工品如食品等。
本发明的有益效果包括：
(1)目前现有技术中对转基因大豆的检测都是通过在两个试剂管中分别进行大豆内源基因的检测和目标转基因大豆品系的检测，这种检测方式由于是在不同试剂管中分别对两种靶目标进行的检测，容易出现假阴性。
而本发明意外发现了特异性好、灵敏度高、适用性广且可以在同一个试剂管中同时检测转基因大豆DAS81419和大豆内源基因lectin的引物对和探针组合。
(2)本发明在前述引物对和探针组合的基础上建立了转基因大豆DAS81419和大豆内源基因lectin的双重荧光PCR检测方法，可同时对转基因大豆DAS81419和大豆内源基因lectin进行定性和定量检测，且特异性好、通量高、快速，提高了检测效率，为转基因大豆DAS81419和大豆内源基因lectin的同时检测提供了更有效的方法。
此外，本发明的方法能在检测转基因大豆DAS81419的同时，也能检测样品中是否含有大豆成分。
附图说明
图1是本发明实施例4中利用引物对和探针组合同时检测转基因大豆DAS81419和大豆内源基因的双重荧光PCR方法的特异性验证结果。其中1为转基因大豆DAS81419扩增曲线，2为大豆内源基因扩增曲线，3阴性对照。
图2和图3是本发明实施例6中利用引物对和探针组合同时检测转基因大豆DAS81419和大豆内源基因的双重荧光PCR方法的灵敏度验证结果。其中，图2中的1～6分别对应浓度为100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL和.0.001ng/μL的转基因大豆DAS81419的双重荧光PCR反应结果。
图3中的1～6分别对应浓度为100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL和.0.001ng/μL的大豆内源基因lectin的双重荧光PCR反应结果。
具体实施方式
除非特殊说明，本发明所用术语具有本发明所属领域中的一般含义。
下面参考具体实施例和附图，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecularcloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供了用于对转基因大豆DAS81419进行检测的引物对和探针组合及其应用，引物对和探针组合包括两组引物对和两个探针。
所述的引物对和探针组合的核苷酸序列如下：
第一引物对：
DAS41819-F:5’-AGCACTTATTGGTACTTGTCCTA-3’(SEQ ID NO.1)
DAS41819-R:5’-GTCAAACATGCTAAGCGACT-3’(SEQ ID NO.2)
第一探针：
DAS41819-T:5’-HEX-ATCTTGAAGCAAGTTCCGCTCA-BHQ1-3’(SEQ ID NO.3)
第二引物对：
Lec-F:5’-CCAGCTTCGCCGCTTCCTTC-3’(SEQ ID NO.4)
Lec-R:5’-GAAGGCAAGCCCATCTGCAAGCC-3’(SEQ ID NO.5)
第二探针：
Lec-T:5’-ROX-CTTCACCTTCTATGCCCCTGACAC-BHQ2-3’(SEQ ID NO.6)
其中HEX、ROX为荧光基团，BHQ1、BHQ2为淬灭基团。
上述引物对和探针由上海生工生物技术有限公司合成。
利用上述引物对和探针可同时针对转基因大豆DAS81419和大豆内源基因lectin进行双重荧光PCR扩增。
在应用上，上述引物对和探针组合可应用于检测或辅助检测转基因大豆DAS81419和大豆内源基因lectin上；还可以用来制备检测或辅助检测含有转基因大豆DAS81419和大豆内源基因lectin的产品。
两组引物对的筛选：
在找到本发明的引物对和探针之前，本发明针对转基因大豆DAS81419外源基因5’端插入位点的两端序列和大豆内源基因lectin，设计出了大量不同的引物和探针组合，都无法高效地对两种基因进行同时PCR扩增，直到获得上述引物对和探针组合，发现其特异性好、重复性好且灵敏度高，并且可在单一检测管中同时检测转基因大豆DAS81419和大豆内源基因lectin的双重荧光PCR：
实施例2
本实施例提供了一种试剂盒及其应用，所述试剂盒包括：
(1)SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQID NO.6中所示的DNA序列(来自实施例1)；
(2)dNTPs、Mg2+、PCR反应缓冲液、Taq DNA聚合酶。
上述dNTPs、Mg2+、PCR反应缓冲液、Taq DNA聚合酶优选来源于TaKaRa公司的货号为RR060A的试剂盒。
本实施例中的试剂盒进一步优选包括DNA提取试剂或试剂盒，所述DNA提取试剂盒优选包括来自达安基因的货号为DA-Z146的核酸提取试剂盒、Promega公司的货号为A1120的Wizard Genomic DNA purification kit或TaKaRa公司的货号为9781的MiniBEST PlantGenomic DNA Extraction Kit中所包含的试剂。
本实施例中的试剂盒进一步优选包括阳性对照和阴性对照。
实验证明，上述DNA提取试剂盒、TaKaRa公司的货号为RR060A的试剂盒，以及与SEQID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6的联合使用，效果更加优越，具体表现在特异性强、重复性好和灵敏度高。
在应用上，上述试剂盒可应用于检测或辅助检测转基因大豆DAS81419和大豆内源基因lectin上；还可以用来制备检测或辅助检测包含转基因大豆DAS81419和大豆内源基因lectin的产品。
实施例3
本实施例提供了一种检测或辅助检测转基因大豆DAS81419和大豆内源基因lectin的方法，例如根据双重荧光PCR扩增的结果判断生物样品是否为转基因大豆DAS81419和大豆内源基因lectin，或生物样品是否含有转基因大豆DAS81419和大豆内源基因lectin的品系特异性基因成分；该方法使用了实施例1的引物对和探针组合或实施例2的试剂盒。
上述方法包括如下步骤：
步骤一：双重荧光PCR扩增
以生物样品的DNA为模板，采用引物对和探针进行双重荧光PCR扩增，同时设置去离子水为阴性对照。
双重荧光PCR扩增反应体系如表1所示。其中，Probes Master 2×conc(包含有dNTP，Mg2+，Taq酶等)(来自Takara公司的货号为RR390A的试剂盒)10μL，10μmol/L的实施例1的引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5各0.4～0.6μL，10μmol/L的实施例1的探针SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6各0.05～0.3μL，DNA模板1～2μL(浓度100～300ng/μL)，超纯水补至20μL。
优选的，上述引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5的添加量均为0.5μL、探针SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6的添加量分别为0.2μL和0.1μL。
双重荧光PCR扩增反应条件：95℃3min；95℃、5～10s，60℃、25～60s，40循环。
步骤三：双重荧光PCR扩增产物的荧光检测
在每个循环的60℃阶段结束后收集FAM和HEX的荧光信号。
所述双重荧光PCR扩增的结果判断的标准为：
在HEX通道下，当Ct值≤35为阳性，代表生物样品中含有转基因大豆DAS81419成分；当Ct值≥40或无Ct值为阴性，代表生物样品中未含有转基因大豆DAS81419成分；当35＜Ct值＜40时判为结果可疑，需重新检测，如复检Ct值一致的则判为阳性，代表生物样品中含有微量的转基因大豆DAS81419成分，如复检Ct值≥40则判为阴性，代表生物样品中未含有转基因大豆DAS81419成分。在ROX通道下，当Ct值≤35为阳性，代表生物样品中含有大豆成分；当Ct值≥40或无Ct值为阴性，代表生物样品中未含有大豆成分；当35＜Ct值＜40时判为结果可疑，需重新检测，如复检Ct值一致的则判为阳性，代表生物样品中含有微量的大豆成分，如复检Ct值≥40则判为阴性，代表生物样品中未含有大豆成分。
——如下，需要将不同通道阳性检出的意义明确表述。
双重PCR检测结果的具体判定情况如下：
表1结果判定
结果只可能有3种，(1)检出DAS81419和lectin；(2)检出lectin但未检出DAS81419；(3)未检出DAS81419和lectin。因为只能是含有大豆成分，才会可能有转基因大豆DAS81419，若出现检出DAS81419未检测出lectin则说明是假阳性。此外，本发明的引物和探针组合能够判断假阴性，比如，在已知被检产品含有大豆成分的情况下(或者可以在被检品中添加少量预定品类的大豆成分)，如果未检出DAS81419和lectin，则说明反应体系出错，为假阴性。
如果生物样品还未提取DNA，上述方法步骤(1)双重荧光PCR扩增之前还可以包括使用来自达安基因的货号为DA-Z146的核酸提取试剂盒、Promega公司的货号为A1120的Wizard Genomic DNA purification kit或TaKaRa公司的货号为9781的MiniBEST PlantGenomic DNA Extraction Kit按照试剂盒说明书对生物样品中的DNA进行提取的步骤。
实施例4
本实施例对实施例3建立的检测或辅助检测转基因大豆DAS81419和大豆内源基因的方法进行了有效性验证，所用的供试材料如下：转基因大豆DAS81419粉末，以上标准物质购自American Oil Chemists Society(AOCS，深圳远扬生物技术公司代理)。
步骤一：基因组DNA的提取
各取转基因大豆DAS81419粉末10mg于1.5mL离心管内，采用试剂盒法(MiniBESTPlant Genomic DNA Extraction Kit，TaKaRa：9781)提取基因组DNA，最终DNA的定容体积为50μL。
步骤二：双重荧光PCR扩增
以转基因大豆DAS81419提取的基因组DNA混合液为模板，进行双重荧光PCR扩增，同时设置去离子水为阴性对照。
双重荧光PCR扩增反应体系：Probes Master 2×conc(包含有dNTP，Mg2+，Taq酶等)(来自Takara公司的货号为RR390A的试剂盒)10μL，10μmol/L的实施例1的引物SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5中所示DNA序列各0.5μL，10μmol/L的实施例1的探针SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6中所示DNA序列分别为0.2μL和0.1μL，DNA模板1μL(浓度100～300ng/μL)，超纯水补至20μL。
双重荧光PCR扩增反应条件：95℃3min；95℃、5s，60℃、60s，40循环。
步骤三：双重荧光PCR扩增产物的荧光检测
在每个循环的60℃阶段结束后收集FAM和HEX的荧光信号。
结果分析：
结果由 1可知，HEX通道下Ct值为24.51，表明该样品中含有转基因大豆DAS81419，ROX通道下Ct值为24.13，表明该样品中含有大豆成分。说明本发明的基于实施例1的引物对和探针以及实施例2的试剂盒建立的检测或辅助转基因大豆DAS81419的方法可以有效检测转基因大豆DAS81419及大豆成分。
实施例5
本实施例对实施例1的引物对和探针组合进行了特异性验证，所用的供试材料如下：转基因大豆GTS40-3-2、A2704-12、MON89788、A5547-127、DP-356043-5、CV127、MON87708、FG72、DAS44406、DAS68416、MON87701、MON87705、DP-305423-1、MON87769、DAS81419，转基因玉米BT176、MON810、T25，转基因油菜GT73，转基因水稻TT51-5，非转基因大豆，上述样品均保存于中国检验检疫科学研究院。
步骤一：基因组DNA的提取
采用实施例4的步骤一的基因组DNA的提取方法分别提取转基因大豆GTS40-3-2、A2704-12、MON89788、A5547-127、DP-356043-5、CV127、MON87708、FG72、DAS44406、DAS68416、MON87701、MON87705、DP-305423-1、MON87769、DAS81419，转基因玉米BT176、MON810、T25，转基因油菜GT73，转基因水稻TT51-5，非转基因大豆的基因组DNA。
步骤二：双重荧光PCR扩增
分别以步骤一的各转基因大豆的基因组DNA为模板，进行双重荧光PCR扩增，双重荧光PCR扩增的方法同实施例4的步骤二。
步骤三：双重荧光PCR扩增产物的荧光检测
在每个循环的60℃阶段结束后收集FAM和HEX的荧光信号。
结果分析：
结果如表1所示，结果符合预期，说明本方法特异性好。
实施例6
本实施例对实施例1的引物对和探针组合进行了灵敏度验证，所用的供试材料如下：转基因大豆DAS81419，以上标准物质购自American Oil Chemists Society(AOCS，深圳远扬生物技术公司代理)。。
步骤一：基因组DNA的提取
基因组DNA的提取方法见实施例4的步骤一。测试核酸浓度后将提取的基因组DNA混合，再用去离子水进行梯度稀释，分别得到浓度为100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL和.0.001ng/μL的基因组DNA。
步骤二：双重荧光PCR扩增
采用步骤一的不同浓度的转基因大豆DAS81419基因组DNA为模板，进行双重荧光PCR扩增，双重荧光PCR扩增的方法同实施例4的步骤二。每个稀释度作3个重复，并设去离子水为阴性对照。
步骤三：双重荧光PCR扩增产物的荧光检测
在每个循环的60℃阶段结束后收集HEX和ROX的荧光信号。
结果分析：
结果如图2，3所示，图2,3中的1～6分别对应浓度为100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL和.0.001ng/μL的转基因大豆DAS81419的双重荧光PCR反应结果，由此可知其检测低限可达0.01ng/μL。
实施例7
本实施例中，利用实施例1的引物对和探针组合及方法对20份进口大豆样品进行了检测，同时用欧盟标准(标准号：qt-eve-gm-014，网站http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/gmomethods/search？db＝gmometh&q＝id％3AQT-eve-gm*)中对这20份大豆样品进行了转基因大豆DAS81419的检测，用《食品中抗草甘膦转基因大豆实时PCR检测方法的建立与应用》中大豆内源基因lectin的检测方法进行检测，统计了检测结果和检测所需的时间，结果见表3。结果显示：20份样品lectin基因均为阳性，20份样品中仅1份样品检出DAS81419阳性，本方法和欧盟方法检出率一致，但检测时间本方法要比传统方法快1倍，所需试剂耗材费用要少一半，而且本发明的方法能有效指示PCR反应的假阴性。
实施例8
实际上，在寻求到本发明的引物和探针组合之前，尝试了非常多的引物和探针组合，为了与本发明的引物和探针组合作比对，在本实施例中只摘取其中之若干进行阐述，其余不予赘述，具体为：
利用实施例1的引物和探针组合，并且另外设计了六组引物和探针组合1-6，用实施例3建立的检测或辅助检测转基因大豆DAS:81419的方法对50份进口大豆样品进行了检测，同时用欧盟标准(标准号：qt-eve-gm-014，网站http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/gmomethods/search？db＝gmometh&q＝id％3AQT-eve-gm*)中对这50份大豆样品进行了转基因大豆DAS81419的检测，用《食品中抗草甘膦转基因大豆实时PCR检测方法的建立与应用》中大豆内源基因lectin的检测方法进行检测，检测结果如表6所示。
表
结果显示：本发明引物和探针组合的检测结果与欧盟标准和已公开的检测方法的检测结果完全一致，这说明本发明引物和探针组合特异性强、灵敏度高且重复性很好，而采用引物设计软件随机选取的若干种引物和探针组合则或多或少的存在特异性不强、灵敏度不高和重复性不好的各种缺陷，并且本方法在能实现多重扩增的情况下，保证良好的特异性和灵敏度度。
虽然上面结合本发明的优选实施例对本发明的原理进行了详细的描述，本领域技术人员应该理解，上述实施例仅仅是对本发明的示意性实现方式的解释，并非对本发明包含范围的限定。实施例中的细节并不构成对本发明范围的限制，在不背离本发明的精神和范围的情况下，任何基于本发明技术方案的等效变换、简单替换等显而易见的改变，均落在本发明保护范围之内。

Claims (9)

1.引物对和探针组合，其特征在于，所述引物对和探针组合包括第一组引物对、第二组引物对、第一探针和第二探针，所述第一组引物对包含SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，所述第一探针与所述第一组引物对相对应，所述第一探针包含SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；所述第二组引物对包含SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，所述第二探针与所述第二组引物对相对应，所述第二探针包含SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的引物对和探针组合在检测或辅助检测转基因大豆DAS81419和大豆内源基因，或制备检测或辅助检测转基因大豆DAS81419和大豆内源基因的产品中的应用。
3.一种用于对转基因大豆进行检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物对和探针组合。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：
荧光定量PCR扩增试剂，所述荧光定量PCR扩增试剂包括dNTPs、Mg2+、PCR反应缓冲液和Taq DNA聚合酶，所述dNTPs、Mg2+、PCR反应缓冲液和Taq DNA聚合酶均来源于Takara公司的货号为RR390A的试剂盒中所包含的试剂；
所述试剂盒还包括DNA提取试剂，所述DNA提取试剂包括来自达安基因的货号为DA-Z146的核酸提取试剂、Promega公司的货号为A1120的Wizard Genomic DNA purificationkit或TaKaRa公司的货号为9781的MiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit中所包含的试剂；
所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。
5.权利要求3或4所述的试剂盒在检测或辅助检测转基因大豆DAS81419和大豆内源基因，或制备检测或辅助检测转基因大豆DAS81419和大豆内源基因的产品中的应用。
6.一种检测或辅助检测转基因大豆DAS81419和大豆内源基因的双重荧光PCR方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1)双重荧光PCR扩增
以生物样品含有的DNA为模板利用权利要求1所述的引物对和探针组合或权利要求3-4中任一项所述试剂盒进行双重荧光PCR扩增；
2)根据双重荧光PCR扩增的结果判断生物样品是否为转基因大豆DAS81419，同时判断样品是否含有大豆成分，或生物样品是否含有转基因大豆DAS81419和/或大豆成分的品系特异性基因成分。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤1)之前还包括在生物样品中提取DNA的步骤；
所述在生物样品中提取DNA是采用达安基因的货号为DA-Z146的核酸提取试剂盒、Promega公司的货号为A1120的Wizard Genomic DNA purification kit或TaKaRa公司的货号为9781的MiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit进行的。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述双重荧光PCR扩增的反应体系如下：
所述Probes Master 2×conc来源于Takara公司的货号为RR390A的试剂盒。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述双重荧光PCR扩增的反应体系如下：所述SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5中所示引物的用量均为0.5μL，所述SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6中所示探针的用量分别为0.2μL和0.1μL；
所述双重荧光PCR扩增反应条件：95℃3min；95℃、5～10s，60℃、25～60s，40循环。
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