CN107974505A - hTERT基因作为内参基因在利用qPCR直接检测血浆中cfDNA含量中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种hTERT基因作为内参基因在利用qPCR直接检测血浆中cfDNA含量中的用途，本发明通过检测DNA中看家基因或稳定出现的某些非编码重复序列，达到cfDNA定量的目的。进行qPCR之前，血浆用备好的缓冲液和蛋白酶K处理，以去掉蛋白质，在反应混合物中加入一种用于困难模板扩增的特殊聚合酶(velocity polymerase)，该酶每10S可延伸l kb碱基，血浆1：40稀释后，不需其他处理，直接加入反应体系进行qPCR测定血浆cfDNA浓度，通过扩增两种长度的靶序列对cfDNA定量。本发明可以有效的去除掉由于PCR及测序引入的错误突变，降低检测的背景噪音。对于0.1％的检测限，其灵敏度可以达到90％以上，特异度高达99.9％。

Description

hTERT基因作为内参基因在利用qPCR直接检测血浆中cfDNA含 量中的用途
技术领域
本发明涉及hTERT基因的用途，尤其是hTERT基因作为内参基因在利用qPCR直接检测血浆中cfDNA含量中的用途。
背景技术
近年来，端粒酶和癌症的发生及发展关系，是癌症研究领域的热点之一。体细胞的复制大多数受端粒损耗的限制，但肿瘤细胞能通过端粒酶逆转录酶(hTERE)维持端粒长度。有研究表明端粒酶活性和hTERE的表达有很强的相关性，并且hTERE是端粒酶激活的关键性因素，在大多数的肿瘤细胞中，hTERE的表达主要表现在转录水平上的上调，经对hTERE启动子序列缺失的分析，hTERT启动子核心区域，在转录起始位点上游约181bp的范围，含有多个转录因子结合位点，如sp1，c2myc，p53，mad1等；瞬时表达分析发现，在端粒酶阳性的肿瘤细胞中，hTERT核心启动子被明显激活，而在端粒酶阴性的正常细胞中，则明显受到抑制，这表明hTERT启动子具有潜在的肿瘤靶向的特异性。
巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对(而非一对)PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物(因为他们在第一次PCR扩增片段的内部)结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异。
现有技术包括qPCR法、bDNA技术法、荧光染料法，各有优势，但不能反应血浆游离DNA的真实水平，或操作不易。
发明内容
本发明要解决的问题是，提供一种hTERT基因作为内参基因在利用qPCR直接检测血浆中cfDNA含量中的用途，能够精确定量未经提取的血浆中的游离DNA含量，通过直接检测血浆中cfDNA含量，来评估样品在后续检测中的风险，预估后续检测效果，并做出更加合理、可行的检测方案，以减少在未知情况下对样品的浪费，以及后续检测过程中部分成本。
为了解决上述问题，本发明所采用的方案是：提供一种hTERT基因作为内参基因在利用qPCR直接检测血浆中cfDNA含量中的用途。
具体地说，包括以下步骤：
(1)选取hTERT基因为内参基因；
(2)采用巢式PCR法扩增制作标准品
标准品设计：选取人类基因组hTERT序列片段做模板，hTERT碱基序列定位于5p15.33，外重引物343bp，2647-2989，内重引物326bp，2662-2989，GenBank assessionnumber AF015950，应用Primer5分析软件进行设计
引物设计：选取人类基因组hTERT序列片段做模板，hTERT碱基序列定位于5p15.33，引物160bp，2647-2802)，应用Primer5分析软件进行设计
P1hTERT-up：5’-GCGTTTGTGGATGATTCT-3’ SEQ ID NO:5
P2hTERT-down:5’-CAAGACCCAAAGAGTTGC-3’ SEQ ID NO:6。
本发明的有益效果是：通过检测DNA中看家基因或稳定出现的某些非编码重复序列，达到cfDNA定量的目的。进行qPCR之前，血浆用备好的缓冲液和蛋白酶K处理，以去掉蛋白质，在反应混合物中加入一种用于困难模板扩增的特殊聚合酶(velocity polymerase)，该酶每10S可延伸l kb碱基，血浆1：40稀释后，不需其他处理，直接加入反应体系进行qPCR测定血浆cfDNA浓度，通过扩增两种长度的靶序列对cfDNA定量。本发明可以有效的去除掉由于PCR及测序引入的错误突变，降低检测的背景噪音。对于0.1％的检测限，其灵敏度可以达到90％以上，特异度高达99.9％。
附图说明
图1为各对照样本的初始浓度对比。
图2为各待测样本的初始浓度对比。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步详细说明:
1待测血浆制备与稀释：从血液中分离得到血浆后，加入蛋白酶(PK)进行消化；然后取消化后的血浆按1：40的比例稀释
2配制qPCR反应体系
mix(包含10×PCRbuffer2μl、SYBR Green饱和性染料1μl、5U/μl Taq DNApolymerase0.2μl、15mMMgCl22μl、10mM dNTP0.5μl和ddH2O7.3μl，其中10×PCRbuffer包含10-40mMTris-Cl、50-200mM氯化钾、0-5.0mM二硫苏糖醇(DTT)、0-l.0mM乙二胺四乙酸二钠钙(EDTA)、0-20vol％乙基苯基聚乙二醇(Nonidet)P-40、0-2.0vol％吐温20(Tween20)、30-70vol％甘油和稳定剂(pH7.0-10.0))
3设置qPCR反应程序
4分析定量数据：确认标准品及文库扩增效率在90～110％；
5计算待测物浓度：采用绝对定量方法，通过452bp的DNA标准品计算出文库的浓度。
下面对本发明进行进一步详细说明：
本发明选取了来自天津肿瘤医院的癌症患者21例，使用Streck专用采血管取患者全血各10ml进行检测，其中肺癌样品9例，结直肠癌样品3例，卵巢癌样品2例，乳腺癌样品3例，胃癌样品2例，黑色素瘤样品1例，肝癌样品1例；男性9例，女性12例；年龄45-61岁，平均年龄52岁；按世界卫生组织(WHO)肿瘤分期标准：Ⅰ期3例、Ⅱ期5例、Ⅲ期8例、Ⅳ期5例.并随机选择健康体检者12例进行对照。
1、样本制备
将21例患者和12例健康人的全血于1600g、10min做第一次离心处理，离心条件为4℃；将离心得到的上层血浆转移至2ml离心管中，16000g、5min第二次离心，离心条件为4℃；小心吸取上层血浆，不要吸到管底沉淀物。取得到的血浆10ul，稀释到400ul待用，其余血浆置于-20℃冻存。
2、制备反应体系
按照下表准备反应体系(Mix)，并备好96孔板
并按照下列排布表将反应体系和待测血浆加入到96孔板中
注：(-)为空白对照
3、设置反应程序
按照下列程序进行反应
4结果分析：
从荧光定量的荧光曲线(图1，图2)初步判断：自合标准品梯度效果比较理想
合成模拟公式；判断扩增效率；
其中Y＝Average Cp，X＝Lg(Conc),R2为判定系数，E为扩增效率
5计算初始浓度
以模拟公式Y＝-3.4223+13.925进行计算，其中，判定系数为0.999794，扩增效率为96％对照组初始浓度
各待测样品的初始浓度
对照组样本的cfDNA未提取浓度平均值为4.73ng/ml，提取后浓度平均值为2.63ng/ml
待测样本的cfDNA未提取浓度平均值为8.88ng/ml，待测样本的提取后浓度平均值为5.0ng/ml。
由此可知，本发明更能说明血浆中的游离DNA含量水平，也可以看出，血浆中的游离DNA浓度跟个体的病例状况有一定的相关性
综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。
序列表
<110> 中源协和基因科技有限公司
<120> hTERT基因作为内参基因在利用qPCR直接检测血浆中cfDNA含量中的用途
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 1
gcgtttggtg gatgatttct 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 2
caagacccca aagagtttgc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 3
tttcttgttg gtgacacctc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 4
caagacccca aagagtttgc 20
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 5
gcgtttgtgg atgattct 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 6
caagacccaa agagttgc 18

Claims (2)

1.hTERT基因作为内参基因在利用qPCR直接检测血浆中cfDNA含量中的用途。
2.根据权利要求1所述hTERT基因作为内参基因在利用qPCR直接检测血浆中cfDNA含量中的用途，其特征在于，包括以下步骤：
(1)选取hTERT基因为内参基因；
(2)采用巢式PCR法扩增制作标准品
标准品设计：选取人类基因组hTERT序列片段做模板，hTERT碱基序列定位于5p15.33，外重引物343bp，2647-2989，内重引物326bp，2662-2989，GenBank assession numberAF015950，应用Primer5分析软件进行设计
引物设计：选取人类基因组hTERT序列片段做模板，hTERT碱基序列定位于5p 15.33，引物160bp，2647-2802)，应用Primer5分析软件进行设计
P1 hTERT-up：5’-GCGTTTGTGGATGATTCT-3’SEQ ID NO:5
P2 hTERT-down:5’-CAAGACCCAAAGAGTTGC-3’SEQ ID NO:6。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108913682A (zh) * 2018-07-05 2018-11-30 上海奥测医疗科技有限公司 一种制备cfDNA参考品的方法
CN109321645A (zh) * 2018-10-23 2019-02-12 深圳市慧思基因科技有限公司 一种端粒酶催化蛋白亚单位hTERT活性的检测方法

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