CN106282389A - 双重巢式荧光pcr检测转基因大豆das44406的引物和探针组合、方法及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种针对转基因大豆DAS44406的内外源基因的双重巢式荧光定量PCR检测的引物和探针组合。本发明将双重PCR、巢式PCR和荧光定量PCR结合起来，对引物和探针的设计进行了严格的控制，并对检测流程进行了改进，建立了一套双重巢式荧光定量PCR检测体系，该体系能够定性和定量检测转基因大豆DAS44406品系特异性序列和大豆内源基因Lectin，该方法灵敏度相比普通荧光定量PCR提高了1个数量级。本发明的方法具有模板需要量少，灵敏度高，通量高，特异性强等优点；能应用于转基因的快速定量检测，为快速、准确、高通量、定量检测转基因提供新方法。

Description

双重巢式荧光PCR检测转基因大豆DAS44406的引物和探针组 合、方法及试剂盒
技术领域
本发明属于食品质量安全检测技术领域，具体涉及一种双重巢式荧光PCR检测转基因大豆DAS44406的引物和探针组合、方法及试剂盒。
背景技术
自1996年转基因作物开始商业化种植以来，每年都以惊人的速度发展。截止到2014，全球种植转基因作物的国家已达28个，占全球人口的60％，即40亿人。2015年全球转基因作物的种植面积为1.797亿公顷，与1996年的170万公顷相比增加了100倍，而转基因大豆是种植面积最大的转基因作物。中国是大豆和大豆产品净出口国，国内需求量不断增加引起转基因大豆进口量屡创新高。而随着转基因大豆大规模商业化，其安全性也受到国际社会和我国民众的广泛关注，许多国家出台了严格的管理法规，目前全球许多国家和地区对转基因产品实行强制性标识管理制度。2002年，我国农业部发布《农业转基因生物标识管理办法》及卫生部出台《转基因食品卫生管理办法》，规定转基因食品必须强制性的进行转基因标识。正因如此，转基因大豆检测技术的要求也越来越高。
目前，全世界共有31个转基因大豆品系得到监管机构的审批，其中就包括转基因大豆DAS44406。2015年，中国进口大豆8169万吨，转基因大豆占其中绝大部分，且进口国主要为美国和巴西。欧盟转基因标准虽然出台了针对转基因大豆DAS44406的荧光PCR检测方法，此方法具有定量能力，但由于探针的原因导致其检测通量偏低；而用于检测其它的转基因品系的多重PCR虽然提高了检测的通量，但体系内含多对引物，反应不稳定。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种转基因大豆DAS44406的内外源基因的双重巢式荧光PCR检测的引物和探针组合。
本发明的另一个目的在于提供一种转基因大豆DAS44406的内外源基因的双重巢式荧光PCR检测试剂盒。
本发明的再一个目的在于提供一种基于上述检测引物和探针组合和检测试剂盒的转基因大豆DAS44406的内外源基因的双重巢式荧光PCR检测方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明中使用的术语“大豆DAS44406品系特异性序列”指的是大豆DAS44406的品系转基因外源插入片段(外源基因5’插入序列)，例如根据大豆DAS44406品系特异性序列设计的引物和/或探针只能对大豆DAS44406品系进行扩增，对其它品系则不能进行扩增。
本发明第一方面提供了引物和探针组合，包括：引物一、引物二和探针一的组合；和引物三、引物四和探针二的组合；
所述引物一由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2组成，
所述引物二由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4组成，
所述探针一为SEQ ID NO:5，
所述引物三由SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7组成，
所述引物四由SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9组成，
所述探针二为SEQ ID NO:10。
本发明第二方面提供了所述的引物和探针组合在检测或辅助检测转基因大豆DAS44406中的应用。
本发明第三方面提供了一种试剂盒，包括所述的引物和探针组合。
在一优选例中，所述的试剂盒还包括Mix 2和Mix 1，所述Mix 2包括dNTPs、反应缓冲液和MgCl2组成，所述Mix 1包括DNA聚合酶。
在一优选例中，所述Mix 2和Mix 1均来自宝生物工程大连有限公司的货号为RR060A的试剂盒中的试剂。
在一优选例中，还包括基因组DNA提取试剂。
在一优选例中，所述基因组DNA提取试剂来自天根生化科技(北京)有限公司且货号为DP305-02的植物基因组DNA提取试剂盒中的试剂。
在一优选例中，还包括Probe qPCR Mix。
在一优选例中，所述Probe qPCR Mix来自宝生物工程(大连)有限公司的货号为RR391S的试剂盒中的试剂。
在一优选例中，还包括阳性对照和阴性对照。
在一优选例中，所述阳性对照为转基因大豆DAS44406的DNA或含转基因大豆DAS44406的品系特异性序列的质粒DNA，所述阴性对照不含转基因大豆DAS44406的品系特异性序列。
本发明第四方面提供了所述的试剂盒在检测或辅助检测转基因大豆DAS44406中的应用。
本发明第五方面提供了一种检测或辅助检测转基因大豆DAS44406的双重巢式荧光PCR方法，包括使用所述的引物和探针组合或上述任一项所述试剂盒的步骤。
在一优选例中，包括如下步骤：
1)双重巢式荧光PCR扩增：以生物样品含有的DNA为模板与权利要求1所述的引物一和引物三进行第一轮双重PCR反应；然后以第一轮双重PCR反应所得的PCR产物为模板与引物二、引物四、探针一和探针二进行第二轮荧光PCR反应；
2)根据双重巢式荧光PCR扩增的结果判断生物样品是否含有转基因大豆DAS44406的品系特异性序列。
在一优选例中，在步骤1)之前还包括在生物样品中提取DNA的步骤。
在一优选例中，所述在生物样品中提取DNA是采用天根生化科技(北京)有限公司的货号为DP305-02的植物基因组DNA提取试剂盒进行。
在一优选例中，所述双重巢式荧光PCR扩增的第一轮双重PCR反应的反应体系如下：
所述Mix 2包括dNTPs、MgCl2和反应缓冲液。
所述Mix 1包括DNA聚合酶。
所述Mix 2和Mix 1均来自宝生物工程(大连)有限公司的货号为RR060A的试剂盒中的试剂。
在一优选例中，所述双重巢式荧光PCR扩增的第二轮荧光PCR反应的反应体系如下：
所述Probe qPCR Mix来自宝生物工程大连有限公司的货号为RR391S的试剂盒中的试剂。
在一优选例中，所述双重巢式荧光PCR扩增的第一轮双重PCR反应的反应程序如下：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃90s，15个循环；72℃5min；
所述双重巢式荧光PCR扩增的第二轮荧光PCR反应的反应程序如下：95℃预变性1min；95℃15s,60℃1min，40个循环。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明成功将多重PCR、巢式PCR、荧光定量PCR整合到一起，吸收各技术的优点，改进其检测流程，针对转基因大豆DAS44406的内外源基因设计了多条引物、探针进行了大量筛选，综合其特异性、灵敏度、引物与引物之间的作用，以及所使用的各引物、探针与双重荧光PCR扩增试剂盒的适配性，最终筛选出重复性和特异性好、灵敏度高、适用性广且可同时检测转基因大豆DAS44406品系特异性序列和大豆内源基因的引物对和探针组合，同时还开发了同时检测转基因大豆DAS44406品系特异性序列和大豆内源基因Lectin的试剂盒和方法。
(2)模板需要量少。如果利用普通荧光定量PCR对某一样品中多个基因进行定性定量分析时，即如果检测2个基因则需要在6管中都加入模板(以每个基因三个重复计算)，以每管50ng模板来计算则需要300ng模板。而该方法则只需要在第一轮双重PCR时加入50ng模板即可，因为第二轮荧光定量PCR是利用第一轮双重PCR产物稀释物作为模板。这样对于一些痕量的样品具有较大的优势。
(3)灵敏度高。双重巢式荧光定量PCR灵敏度高于普通荧光定量PCR，相比普通荧光定量PCR提高了1个数量级，这对于一些深加工食品的转基因检测具有巨大的优势。
(4)通量高。本发明建立的方法通过一次实验同时对2个基因进行定性定量检测。
(5)特异性强。在本发明的方法中，任何一个基因均需要内外2对引物全部配对才能够扩增，特异性高于普通PCR。
(6)避免假阳性。在本发明的方法中，如果转基因大豆DAS44406品系特异性序列的检测结果显示是阳性，大豆内源基因Lectin的检测结果显示是阴性，则可判断检测结果为假阳性，则可进行复检以得出准确的检测结果。
附图说明
图1是双重巢式荧光PCR检测转基因大豆DAS44406的品系特异性序列和大豆内源基因Lectin的熔融曲线图。其中1代表转基因大豆DAS44406的品系特异性序列的扩增曲线，2代表大豆内源基因Lectin的扩增曲线，3代表阴性对照。
图2是双重巢式荧光PCR灵敏度测试，检测转基因含量分别为100％、10％、1％、0.1％、0.01％和0.001％的样品的大豆内源基因Lectin的扩增曲线图。其中1-6代表其模板依次为转基因含量为100％、10％、1％、0.1％、0.01％和0.001％的样品。
图3是双重巢式荧光PCR灵敏度测试，检测转基因含量分别为100％、10％、1％、0.1％、0.01％和0.001％的样品的转基因大豆DAS44406品系特异性序列的扩增曲线图。其中1-6代表其模板依次为转基因含量为100％、10％、1％、0.1％、0.01％和0.001％的样品。
具体实施方式
除非特殊说明，本发明所用术语具有本发明所属领域中的一般含义。
下面参考具体实施例和附图，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecularcloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供了引物和探针组合及其应用。
引物和探针组合的筛选方法为：针对转基因大豆DAS44406外源基因5’插入序列(如图1所示)和大豆内源基因Lectin，设计不同的引物和探针组合并进行了优化筛选，综合其特异性、灵敏度、配对复合扩增的相互影响、以及不同引物探针组合与荧光PCR扩增试剂盒的适配性，最终筛选出特异性好、重复性好且灵敏度高的如下可同时检测转基因大豆DAS44406品系特异性序列和大豆内源基因的双重巢式荧光PCR的引物对和探针组合。
所述的引物和探针组合的核苷酸序列如表1所示：
表1
其中FAM、ROX为荧光基团，BHQ1、BHQ2为淬灭基团。
上述引物和探针组合由上海生工生物技术有限公司合成。
利用上述引物对和探针可同时针对转基因大豆DAS44406品系特异性序列和大豆内源基因进行双重巢式荧光PCR扩增。
在应用上，上述引物和探针组合可应用于检测或辅助检测转基因大豆DAS44406上；还可以用来制备检测或辅助检测转基因大豆DAS44406的产品。
实施例2
本实施例提供了一种试剂盒及其应用，所述试剂盒包括：
(1)SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：10(来自实施例1)；
(2)dNTPs、MgCl2、10×PCR Buffer反应缓冲液和DNA聚合酶中的至少一种；
(3)基因组DNA提取试剂；
(4)Probe qPCR Mix；
(5)阳性对照和阴性对照。
上述dNTPs、MgCl2、10×PCR Buffer反应缓冲液和DNA聚合酶均来自宝生物工程(大连)有限公司的货号为RR060A的试剂盒中的试剂。
上述基因组DNA提取试剂来自天根生化科技(北京)有限公司且货号为DP305-02的植物基因组DNA提取试剂盒中的试剂。
上述Probe qPCR Mix来自宝生物工程(大连)有限公司的货号为RR391S的试剂盒中的试剂。
实验证明，上述基因组DNA提取试剂、Probe qPCR Mix，以及与SEQ ID NO：1-SEQID NO：10的联合使用，效果非常优越，具体表现为特异性强、重复性好和灵敏度高。
在应用上，上述试剂盒可应用于检测或辅助检测转基因大豆DAS44406DAS44406上；还可以用来制备检测或辅助检测转基因大豆DAS44406的产品。
实施例3
本实施例提供了一种检测或辅助检测转基因大豆DAS44406的方法，例如根据双重巢式荧光PCR扩增的结果判断生物样品是否含有转基因大豆DAS44406的品系特异性序列和/或大豆内源基因Lectin。该方法使用了实施例1的引物和探针组合或实施例2的试剂盒。
上述方法包括如下步骤：
(1)基因组DNA的提取
采用天根生化科技(北京)有限公司的货号为DP305-02的植物基因组DNA提取试剂盒提取生物样品的基因组DNA，提取后取1μL用核酸蛋白分析仪测定提取的基因组DNA的浓度和纯度，用TE将所有样品标定至100ng/μL，保存于-20℃待用。
(2)双重巢式荧光PCR扩增
第一轮双重PCR。反应体系如表2所示。其中，Mix 2内含dNTPs、MgCl2和反应缓冲液；Mix 1内含DNA聚合酶，Mix 2和Mix 1均来自宝生物工程(大连)有限公司的货号为RR060A的试剂盒。第一轮双重PCR反应条件：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃90s，15个循环；72℃5min；具体循环数可以根据实际情况在范围内调整。第一轮双重PCR反应结束后，用ddH2O稀释PCR产物100倍；
表2
成分 体系
第一轮引物 每条引物的终浓度均为0.1μmol/L
Mix 2 25μL
Mix 1 0.25μL
DNA模板 1.0μL(DNA模板的浓度50ng/μL)
超纯水 补足至50μL
表2中第一轮引物为实施例1中的SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：2；以及SEQ ID NO：6-SEQ ID NO：7。
第二轮荧光PCR。以第一轮稀释后的双重PCR产物为模板，采用第二轮引物及探针，进行第二轮荧光PCR。所述第二轮引物及探针为SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：5，以及SEQ IDNO：8-SEQ ID NO：10。反应体系：Probe qPCR Mix10μL，各引物(实施例1中的SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：4，以及SEQ ID NO：8-SEQ ID NO：9)终浓度均为0.4μmol/L，各探针(实施例1中的SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：10)终浓度均为0.2μmol/L，第一轮PCR产物的100倍稀释的稀释物1μL作为模板，ddH2O补足至20μL。其中，Probe qPCR Mix来自宝生物工程(大连)有限公司的货号为RR391S的试剂盒中的试剂。反应程序为：95℃预变性1min；95℃15s,60℃1min，40个循环。
步骤三：双重巢式荧光PCR扩增产物的荧光检测
在每个循环的60℃阶段结束后收集FAM和ROX的荧光信号。
所述双重巢式荧光PCR扩增的结果判断的标准如表3所示：
表3
FAM通道 ROX通道 结果判定
+ + 含有转基因大豆DAS44406品系特异性序列
+ - 可能存在假阳性，需复检
- + 非转基因大豆
- - 非大豆品种
表3中的“+”代表阳性，“-”代表阴性。一般来说，阳性意味着Ct值≤35；阴性意味着Ct值≥40；但在检测过程中，当35＜Ct值＜40时判为结果可疑，需重新检测，如复检Ct值一致的则判为阳性，如复检Ct值≥40则判为阴性。
实施例4
本实施例对实施例1的引物和探针组合、实施例2的试剂盒以及实施例3建立的检测或辅助检测转基因大豆DAS44406的方法进行了有效性验证。
所用的供试材料如下：转基因大豆DAS44406，保存于中国检验检疫科学研究院。
用实施例3建立的检测或辅助检测转基因大豆DAS44406、的方法对上述供试材料进行检测，同时以水为阴性对照。
结果分析：
结果如图1所示，HEX通道下Ct值为25.13，表明该样品中含有转基因大豆DAS44406品系特异性序列，ROX通道下Ct值为25.42，表明该样品中含有大豆成分。说明本发明的基于实施例1的引物和探针组合、实施例2的试剂盒以及实施例3建立的检测或辅助检测转基因大豆DAS44406的方法可以有效检测转基因大豆DAS44406。
实施例5
本实施例对实施例1的引物和探针组合以及实施例3建立的检测或辅助检测转基因大豆DAS44406的方法进行了特异性验证。
所用的供试材料如下：转基因大豆GTS40-3-2，转基因大豆A2704-12，转基因大豆MON89788，转基因大豆A5547-127，转基因大豆DP-356043-5，转基因大豆CV127，转基因大豆MON87708，转基因大豆FG72，转基因大豆DAS44406，转基因大豆DAS68416，转基因大豆MON87701，转基因大豆MON87705，转基因大豆DP-305423-1，转基因大豆MON87769，转基因大豆DAS81419，转基因玉米BT176，转基因玉米MON810，转基因玉米T25，转基因油菜GT73，转基因水稻TT51-5，非转基因大豆。上述供试材料均保存于中国检验检疫科学研究院。
用实施例3建立的检测或辅助检测转基因大豆DAS44406的方法对上述供试材料进行检测。
结果分析：
结果如表4所示，所有的转基因大豆(GTS40-3-2、A2704-12、MON89788、A5547-127、DP-356043-5、CV127、MON87708、FG72、DAS44406、DAS68416、MON87701、MON87705、DP-305423-1、MON87769和DAS81419)和非转基因大豆的大豆内源基因Lectin的结果均为阳性，其余样品(转基因玉米BT176、转基因玉米MON810、转基因玉米T25、转基因油菜GT73和转基因水稻TT51-5)的大豆内源基因Lectin的结果均为阴性；仅有转基因大豆DAS44406的转基因大豆DAS44406品系特异性序列的结果呈阳性，其余样品均为阴性，由表3对比可知，本发明方法测得的转基因大豆DAS44406品系特异性序列的结果与欧盟标准方法一致，这再次表明本发明的基于实施例1的引物对和探针以及实施例2的试剂盒建立的检测或辅助转基因大豆DAS44406的方法可以有效检测转基因大豆DAS44406，而且上述结果也同时表明本研究建立的双重巢式荧光PCR检测方法对大豆内源基因Lectin及转基因大豆DAS44406品系特异性序列均表现高特异性。
表4
实施例6
本实施例对实施例1的引物和探针组合以及实施例3建立的检测或辅助检测转基因大豆DAS44406的方法进行了灵敏度验证。
所用的供试材料如下：实施例5提取的转基因大豆DAS44406的基因组DNA和非转基因大豆的基因组DNA。
将上述转基因大豆DAS44406的基因组DNA和非转基因大豆的基因组DNA按照质量比例配制转基因大豆含量分别为100％、10％、1％、0.1％、0.01％、0.001％的样品，以实施例3的的反应体系和程序进行双重巢式荧光PCR扩增，每个浓度梯度重复3次，以确定本方法检测方法的灵敏度。
如图2和3所示，当模板含量为100％～0.001％时，大豆内源基因Lectin以及转基因大豆DAS44406品系均可观察到扩增曲线，且模板含量与Ct值成比例关系，当模板含量为100％-0.01％时，每个含量的2个基因、3次重复均能顺利扩增，而当模板含量为0.001％时，均无扩增。因此本方法同时检出Lectin内源基因以及DAS44406品系的最低检出限为0.01％。
实施例7
本实施例对实施例1的引物和探针组合以及实施例3建立的检测或辅助检测转基因大豆DAS44406的方法进行了重复性验证。
所用的供试材料如下：实施例6配置成的转基因大豆含量为100％、10％、1％、0.1％的样品，以实施例3的的反应体系和程序进行多次双重巢式荧光PCR扩增，每个浓度梯度重复9次，得到每个靶基因、每种模板量、每个重复次的Ct值，根据这些Ct值计算每个靶基因在每个浓度的9个重复次的标准偏差(SD)和相对标准偏差(RSD)。
结果如表5所示，靶基因为大豆内源基因Lectin的4种含量的9个重复次的Ct值的标准偏差介于0.064～0.072，相对标准偏差介于0.204％～0.295％；靶基因为转基因大豆DAS44406品系特异性序列的4种含量的9个重复次Ct值的标准偏差介于0.050～0.222，相对标准偏差介于0.169％～0.677％，表明本研究建立检测方法具有比较好的可重复性。
表5
表5中靶基因分为DAS44406和Lectin，DAS44406代表转基因大豆DAS44406品系特异性序列，Lectin代表大豆内源基因Lectin，模板量对应转基因大豆含量，Ct值下面的1-9代表9个重复次(9个重复反应)中每次反应的Ct值。
对比例1
实际上，在寻求到本发明的引物和探针组合之前，尝试了非常多的引物和探针组合，在本对比例中只摘取其中之若干进行阐述，其余不予赘述，具体为：
利用实施例1的引物和探针组合以及用Primer Premier 5.0软件设计并选取其中排分靠前的引物和探针组合1-6，用实施例3建立的检测或辅助检测转基因大豆DAS44406的方法对50份进口大豆样品进行了检测，同时用欧盟标准(标准号：qt-eve-gm-015，网站http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/gmomethods/entry？db＝gmometh&id＝qt-eve-gm-015&q＝id％3aQT-eve-gm*)中对这50份大豆样品进行了转基因大豆DAS44406的检测，用《食品中抗草甘膦转基因大豆实时PCR检测方法的建立与应用》中大豆内源基因lectin的检测方法进行检测，检测结果如表6所示。
表6
结果显示：本发明引物和探针组合的检测结果与欧盟标准和已公开的检测方法的检测结果完全一致，这说明本发明引物和探针组合特异性强、灵敏度高且重复性很好，而采用引物设计软件随机选取的若干种引物和探针组合则或多或少的存在特异性不强、灵敏度不高和重复性不好的各种缺陷。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.引物和探针组合，其特征在于，包括：引物一、引物二和探针一的组合；和引物三、引物四和探针二的组合；
所述引物一由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2组成，
所述引物二由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4组成，
所述探针一为SEQ ID NO:5，
所述引物三由SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7组成，
所述引物四由SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9组成，
所述探针二为SEQ ID NO:10。
2.根据权利要求1所述的引物和探针组合在检测或辅助检测转基因大豆DAS44406中的应用。
3.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物和探针组合。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括Mix 2和Mix 1，所述Mix 2包括dNTPs、反应缓冲液和MgCl2，所述Mix 1包括DNA聚合酶；
任选的，所述Mix 2和Mix 1均来自宝生物工程大连有限公司的货号为RR060A的试剂盒中的试剂；
任选的，还包括基因组DNA提取试剂；
任选的，所述基因组DNA提取试剂来自天根生化科技(北京)有限公司的货号为DP305-02的植物基因组DNA提取试剂盒中的试剂；
任选的，还包括Probe qPCR Mix；
任选的，所述Probe qPCR Mix来自宝生物工程(大连)有限公司的货号为RR391S的试剂盒中的试剂；
任选的，还包括阳性对照和阴性对照；
任选的，所述阳性对照为转基因大豆DAS44406的DNA或含转基因大豆DAS44406的品系特异性序列的质粒DNA，所述阴性对照不含转基因大豆DAS44406的品系特异性序列。
5.根据权利要求3或4所述的试剂盒在检测或辅助检测转基因大豆DAS44406中的应用。
6.一种检测或辅助检测转基因大豆DAS44406的双重巢式荧光PCR方法，其特征在于，包括使用权利要求1所述的引物和探针组合或权利要求3-4中任一项所述试剂盒的步骤。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)双重巢式荧光PCR扩增：以生物样品含有的DNA为模板与权利要求1所述的引物一和引物三进行第一轮双重PCR反应；然后以第一轮双重PCR反应所得的PCR产物为模板与引物二、引物四、探针一和探针二进行第二轮荧光PCR反应；
2)根据双重巢式荧光PCR扩增的结果判断生物样品是否含有转基因大豆DAS44406的品系特异性序列。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤1)之前还包括在生物样品中提取DNA的步骤；
任选的，所述在生物样品中提取DNA是采用天根生化科技(北京)有限公司的货号为DP305-02的植物基因组DNA提取试剂盒进行。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述双重巢式荧光PCR扩增的第一轮双重PCR反应的反应体系如下：
所述Mix 2包括dNTPs、MgCl2和反应缓冲液；
所述Mix 1包括DNA聚合酶；
所述Mix 2和Mix 1均来自宝生物工程(大连)有限公司的货号为RR060A的试剂盒中的试剂；
任选的，所述双重巢式荧光PCR扩增的第二轮荧光PCR反应的反应体系如下：
所述Probe qPCR Mix来自宝生物工程大连有限公司的货号为RR391S的试剂盒中的试剂。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述双重巢式荧光PCR扩增的第一轮双重PCR反应的反应程序如下：94℃ 5min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 90s，15个循环；72℃5min；
所述双重巢式荧光PCR扩增的第二轮荧光PCR反应的反应程序如下：95℃预变性1min；95℃15s,60℃1min，40个循环。
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