CN102559861B - 沙眼衣原体核酸快速检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明为一种利用荧光PCR技术快速检测沙眼衣原体(CT)和内参照核酸的试剂盒。它采用一对引物扩增CT特异性核酸序列，并通过荧光探针检测CTDNA；同时以人工构建含上述引物序列的DNA模板为内参照，通过上述引物和不同于现有已知生物序列的其它荧光标记的探针检测内参照DNA。本发明通过单管双波长荧光PCR技术同时检测CT和内参核酸的存在，能判断样品是否受到CT感染或者是否存在PCR抑制剂。试剂盒操作简便快速，不仅可避免因自身扩增产物污染引起的假阳性，还能解决样品因PCR抑制剂造成引起假阴性而造成误诊的问题，可广泛应用于性病高危人群CT的快速筛查鉴定。
Description
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种单管双波长荧光PCR快速检测沙眼衣原体(CT)和内参照的试剂盒。
背景技术
性传播疾病(STD)是当今世界上广泛流行的传染病，其中CT感染引起的泌尿生殖道疾病不仅在西方国家是最常见的性传播疾病，而且在我国也呈现逐年增加的趋势，目前已经成为影响我国人民特别是妇女儿童身心健康的主要传染性疾病之一。由于CT病原体感染时常缺乏特异症状，易形成隐匿感染，给临床诊断带来困难；同时衣原体传播时易与其它微生物病原体混合感染，造成诊断和治疗的复杂性。虽然传统的CT诊断方法是作为金标准的病原体培养法，但营活细胞增殖的培养技术操作复杂、技术及设备要求高、耗时、敏感性受标本采集的限制等因素而难以普及。
近年来，随着分子生物学的发展，核酸扩增检测方法尤其是荧光PCR技术在国内常规性病病原体感染诊断中迅速使用，和传统PCR电泳核酸检测方法比较荧光PCR技术具有如下优点：(1)闭管检测消除了传统PCR电泳技术在临床诊断中扩增产物的污染问题，提高了检测准确度；(2)所用的荧光探针提高了检测的特异性和灵敏度；(3)定量范围极宽，样本无需做梯度稀释，可以进行准确的定量检测；(4)操作迅速，无需传统PCR的后处理检测步骤，自动化程度高，等等。
随着PCR检测性病病原体的商业化和广泛应用，逐渐认识到泌尿生殖道拭子、尿液等临床样本中含有众多常规核酸提取方法难以去除的PCR抑制物，它们将导致检测结果为“假阴性”而误诊。罗氏公司COBAS AMPLICOR PCR检测系统采用封闭式共扩增和光密度测定来确定性病病原体DNA和内参DNA的存在，根据文献报道，利用其含内参DNA的CT检测试剂评价尿液和生殖道样本中的PCR抑制作用，结果906例宫颈拭子中有65例出现PCR抑制(7％抑制比例)；51例尿道拭子中有23例出现抑制(45％抑制比例)；175例尿液中有2例出现抑制(1.1％抑制比例)，可知PCR抑制现象在尿道拭子中广泛存在(QuinnTC，et al.J ClinMicrobiol，1996，34(6)：1401-1406)。此外有文献报道，采用和CT扩增片段相同的引物设计内参对照，也建立CT内参PCR-酶联免疫方法检测尿液中CT病原体的方法，通过检测100例尿液样本的结果显示其中23例含有PCR抑制剂，证明CT和内参共扩增的PCR方法能用于评价CTDNA扩增反应中的抑制作用(Betsou F，et al.J Clin Microbiol，2003，41(3)：1274-1276)。此 外，通过检索发现，目前国内针对荧光PCR检测CT的申请或授权专利(ZL20048005196.8、ZL200610018766.8、ZL200610018768.7、2007100797288.8、200710093933.X、200810236989.0、200910164977.6)中均未使用内参照来监控PCR抑制物引起的检测结果假阴性。
发明内容
本发明提供一种单管快速检测沙眼衣原体核酸的试剂盒，其特征在于试剂盒利用双波长荧光PCR技术同时扩增检测CT和内参照DNA，且人工构建的内参照DNA核苷酸序列为SEQ ID NO：1。试剂盒含有PCR缓冲液、荧光探针、Taq酶和内参照、阴性对照和阳性对照、DNA提取液组分。本发明可以用于监控PCR扩增中可能的反应抑制物，通过改进的样本处理方法复检获得正确结果，从而避免检测结果出现假阴性的作用，确定样本是否存在CT感染，适合临床推广使用。
技术方案
1.实时荧光PCR引物探针的设计与合成
通过对GenBank中沙眼衣原体隐蔽性质粒基因序列查询，用Vector NTI、Oligo等软件对各种来源的基因序列进行比对后发现，其序列高度保守并具有很好的同源性，按照TaqMan荧光PCR设计的原则，设计了一对CT特异性引物扩增隐蔽性质粒上的序列保守区域，并用5’端FAM标记的特异性TaqMan水解探针法实时检测。引物和探针核苷酸序列如下：
上游引物为5’-CgTgA CCTTC ATTAT gTCgg Ag-3’，如SEQ ID No：2所示；
下游引物为5’-TCTCT CAAgC AggAC TACAA gCTg-3’，如SEQ ID No：3所示；
CT荧光探针为5’-ACAgC ggTTg CTCgAAgCAC gTg-3’(5’标记FAM，3’标记TAMRA或BHQ-1)，如SEQ ID No：4所示。
本发明采用人工构建的内参照DNA，其序列为SEQ ID No：1，它含有CTPCR扩增的一条引物序列和另一条引物互补序列，并含有位于两者之间、不同于现有公布的已知生物序列的内参探针序列。更具体地，内参DNA和CT PCR扩增片段具有相同的核苷酸序列长度和相近的GC％含量，能保证两者在单管反应体系中具有相同的扩增效率。
内参探针核苷酸序列为5’-TTCAg CgAgC gTggg ACATC Agg-3’(5’标记JOE或HEX，3’标记TAMRA或BHQ-1)，如SEQ ID No：5所示。
通过上述设计，获得的一对引物和探针序列为沙眼衣原体所特异，而内参照DNA人工模板序列不同于包括CT在内的现有已知生物序列，上述寡核苷酸 序列由商业序列合成公司(上海生工生物工程技术服务有限公司等)合成，合成好的寡核苷酸干粉用无菌双蒸水溶解至浓度为25μmol/L，-20℃保存。
2.样本的处理和实时荧光PCR检测
含有上述引物探针和内参照DNA的CT荧光PCR快速检测试剂盒(32Test)，其主要组分如下：
(1)CT PCR缓冲液672μl，主要成分有Tris-HCl(pH8.3)、KCl、明胶、dATP、dGTP、dCTP、dUTP、MgCl2、上下游引物(SEQ ID No：2和3)。
(2)荧光探针96μl，含CT荧光探针(SEQ ID No：4)和内参探针(SEQ ID No：5)。
(3)Taq酶64μl，含Taq DNA聚合酶40U和尿嘧啶-DNA糖基化酶(UNG酶)16U。
(4)内参照DNA 160μl，含105copy/ml内参DNA(SEQ ID NO：1)。
(5)阴性对照200μl，为大肠杆菌培养物，104个菌/ml。
(6)阳性对照200μl，为培养的CT包涵体稀释物，103个包涵体/ml。
(7)DNA提取液1.5ml，主要成分为50mmol/L NaOH、5mM EDTA、1％TritonX-100、1％NP-40。
由上述试剂盒组分CT PCR缓冲液21μl、荧光探针3μl、Taq酶2μl混合后加入模板4μl(含有由样本处理步骤引入的内参DNA)后组成的30μl反应体系，含有Tris-HCl(pH8.3)10mM、KCl 50mM、明胶0.1mg/ml、dATP、dGTP、dCTP、dUTP各0.2-0.4mM、MgCl21.5-5mM、引物各0.2-0.5μM、CT荧光探针和内参探针各0.1-0.5μM、Taq DNA聚合酶1-5U、UNG酶0.1-1U，在多波长荧光PCR仪器上进行扩增反应。
更具体地，上述组分配制成的反应体系中含有Tris-HCl(pH8.3)10mM、KCl 50mM、明胶0.1mg/ml、dATP、dGTP、dCTP、dUTP各0.3mM、MgCl23.5mM、引物各0.35μM、CT荧光探针和内参探针各0.15μM、Taq DNA聚合酶1.25U、UNG酶0.5U，在多波长荧光PCR仪器上进行扩增反应。
上述组分组装成的试剂盒在-20℃保存和运输。
使用方法
本发明试剂盒在临床样本CT检测过程中的使用步骤之一为：
(1)样本处理
取临床采集的拭子样本，加入1ml无菌生理盐水，充分振荡摇匀漂洗，吸取液体转移到1.5ml离心管中。从中吸取样本漂洗液200μl，13,000rpm离心6min后吸弃上清，加入50μl试剂盒DNA提取液、5μl内参，漩涡振荡均匀后于100℃保温10min，最后13,000rpm离心2min、吸取离心上清液作模板用于试剂盒 荧光PCR扩增检测。试剂盒阴性对照和阳性对照处理按样本处理方法进行。
(2)扩增检测
按照待检测样品数n+2，取试剂盒CT PCR缓冲液21μl×(n+2)、荧光探针3μl×(n+2)、Taq酶2μl×(n+2)组分，混匀后每个扩增管分装26μl，分别加入按照样本处理方法处理的试剂盒阴性对照、阳性对照以及上述处理好的n个样本模板各4μl。每个反应扩增管体积为30μl，将上述扩增管放到双通道实时荧光PCR仪器上按照50℃2min、94℃2min后94℃5sec、60℃30sec循环40次的程序运行。运行结束后结果按照下表来判断。
注意：FAM通道荧光值和Ct值表征NDM-1基因检测信号；JOE通道荧光值和Ct值表征内参检测信号。
有益效果
本发明根据上述设计的引物探针和技术方案，通过优化反应体系和扩增条件研制成含有内参照DNA的沙眼衣原体核酸荧光PCR检测试剂盒，其主要特点如下：
(1)内参信号监控结果是否假阴性，可以避免由此造成的误诊；
(2)试剂盒使用了序列特异性且不同荧光标记的CT探针和内参探针，两种信号之间不会相互干扰，保证了检测特异性；
(3)试剂盒闭管检测，操作简便快速，可在2小时内报告检测结果；
(4)扩增体系中的dUTP-UNG酶系统更进一步避免了因扩增产物污染导致的结果假阳性。
试剂盒的上述特点，均为采用内参照DNA和荧光PCR技术组合应用而直接引起。从原理上说，本发明试剂盒在CT病原体临床样本检测中通过对实时荧光PCR扩增两个通道荧光信号的分析，判断CT核酸特异性片段的存在，以及反应体系中是否存在由于抑制物造成的假阴性。作为性病病原体核酸快速检测的手段，本发明的技术方案设计合理，可以广泛应用于性病高危人群中沙眼衣原体感染的快速鉴定。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以通过技术常识对本发明作各种技术性改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
本发明中所涉及的主要试剂说明：
Taq DNA聚合酶、尿嘧啶-DNA糖基化酶(UNG酶)、dNTPs(dATP、dUTP、dCTP、dGTP)均为上海宏谊公司生产，引物探针以及其它化学试剂购自上海生工生物工程技术服务有限公司。QIAamp DNA mini kit购自德国QIAGEN公司。
实施例1：沙眼衣原体核酸快速检测试剂盒的配制
试剂盒中的组分为自行配制，32人份试剂盒各组分配制过程如下：
(1)CT PCR缓冲液672μl，含有Tris-HCl(pH8.3)14.2mM、KCl 71.4mM、明胶0.14mg/ml、dATP、dGTP、dCTP、dUTP各0.43mM、MgCl25mM、上下游引物(SEQ ID No：2和3)各5μM。
(2)荧光探针96μl，含CT荧光探针(SEQ ID No：4)和内参荧光探针(SEQID No：5)各1.5μM。
(3)Taq酶64μl，含Taq DNA聚合酶40U和尿嘧啶-DNA糖基化酶(UNG酶)16U。
(4)内参照DNA 160μl，含105copy/ml内参DNA(SEQ ID NO：1)。
(5)阴性对照200μl，含有104个菌/ml大肠杆菌培养物。
(6)阳性对照200μl，含有103个包涵体/ml CT包涵体稀释物。
(7)DNA提取液1.5ml，主要成分为50mmol/L NaOH、5mM EDTA、1％TritonX-100、1％NP-40。
上述组分组装成的试剂盒在-20℃保存和运输。
实施例2：试剂盒在男性尿道拭子样本沙眼衣原体鉴定中的应用
(1)样本处理
选择本试剂初次检测两个通道均为阴性的男性尿道拭子样本7例，将其按照发明内容中样本处理方法获得的提取物用DNA提取液稀释5倍，用于扩增检测。
(2)扩增检测
按照发明内容中的方法，取试剂盒组分CT PCR缓冲液21μl×9、荧光探针3μl×9、Taq酶2μl×9置于1.5ml离心管，混匀后短暂离心，每个扩增管分装26μl，分别加入按照相同方法处理的试剂盒阴性对照、阳性对照提取物以及上 述稀释处理的7个样品模板各4μl。每个反应扩增管体积为30μl，将上述扩增管放到ROTORGENE实时荧光PCR仪器(澳大利亚Corbett Research公司)上按照50℃2min、94℃2min后94℃5sec、60℃30sec循环40次的程序运行。
(3)检测结果
仪器运行结束后，按照发明内容中的结果判断方法，7个首次检测两个通道信号均为阴性的男性尿道拭子提取物，经过稀释后复检，在JOE通道内参信号均为阳性，表明已经解除了首次扩增体系中存在的PCR抑制物；而在FAM通道，5个结果为阴性、2个结果为阳性，表明复检的这7个样本初次检测结果5个为真阴性、而2个为假阴性(首次漏检比例为28.6％)。
实施例3：试剂盒在女性宫颈拭子沙眼衣原体鉴定中的应用
(1)样本处理
选择本试剂初次检测两个通道均为阴性的女性宫颈拭子样本4例，重新取拭子清洗液各200μl，采用QIAGEN公司QIAamp DNA mini kit按照其说明书处理并进行PCR检测。
(2)扩增检测
按照发明内容中的方法，取试剂盒组分CT PCR缓冲液21μl×6、荧光探针3μl×6、Taq酶2μl×6置于1.5ml离心管，混匀后短暂离心，每个扩增管分装26μl，分别加入按照相同方法处理的试剂盒阴性对照、阳性对照提取物以及上述采用QIAGEN柱法提取试剂盒处理好的4个样品模板各4μl。每个反应扩增管体积为30μl，将上述扩增管放到ABI 7000实时荧光PCR仪器(美国应用生物系统公司)上按照50℃2min、94℃2min后94℃10sec、60℃45sec循环40次的程序运行。
(4)检测结果
仪器运行结束后，按照发明内容中的结果判断方法，4个首次检测两个通道信号均为阴性的女性宫颈拭子，采用QIAGEN柱法提取试剂重新提取复检，在JOE通道(内参信号)均为阳性，表明已经解除了首次扩增体系中存在的PCR抑制物；而在FAM通道(CT信号)，2个结果为阴性、2个结果为阳性，表明复检的这4个样本初次检测结果2个为真阴性、而2个为假阴性(首次漏检比例为50％)。
上述实施例实验结果表明，对于试剂盒首次检测为双阴性的泌尿生殖道样本，采用盒内DNA提取液稀释样本提取物(5倍)或采用离心柱法核酸提取试剂重新提取纯化样本(例如QIAGEN公司QIAamp DNA mini kit)的方法复检，可以有效减少或去除样本PCR抑制物，获得可靠检测结果，减少临床样本中CT的漏检。
Claims (4)
1.一种单管快速检测沙眼衣原体核酸的试剂盒，其特征在于，试剂盒利用荧光PCR技术同时扩增检测沙眼衣原体和内参照DNA，且人工构建的内参照DNA核苷酸序列为SEQ ID No：1，沙眼衣原体引物核苷酸序列分别为SEQ ID No：2和SEQ ID No：3，沙眼衣原体荧光探针核苷酸序列为SEQ ID No：4，内参探针核苷酸序列为SEQ ID No：5，沙眼衣原体荧光探针5’端标记FAM荧光基团，内参探针5’端标记JOE或HEX荧光基团，两种探针3’端均标记TAMRA或BHQ-1荧光淬灭基团。
2.如权利要求1所述的试剂盒，试剂盒含有沙眼衣原体PCR缓冲液、荧光探针、Taq酶、内参照DNA、阴性对照和阳性对照、以及DNA提取液组分；其中荧光探针组分含有沙眼衣原体荧光探针和内参探针。
3.如权利要求1所述的试剂盒，试剂盒组分按照以下浓度配制成的反应液进行扩增：pH8.3的Tris-HCl 10mM，KCl 50mM，明胶0.1mg/ml，dATP、dGTP、dCTP、dUTP各0.2-0.4mM，MgCl21.5-5mM，引物各0.2-0.5μM，沙眼衣原体荧光探针和内参探针各0.1-0.5μM，Taq DNA聚合酶1-5U，UNG酶0.1-1U。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其扩增反应液各成分终浓度为：pH8.3的Tris-HCl10mM，KCl 50mM，明胶0.1mg/ml，dATP、dGTP、dCTP、dUTP各0.3mM，MgCl23.5mM，引物各0.35μM，沙眼衣原体荧光探针和内参探针各0.15μM，Taq DNA聚合酶1.25U，UNG酶0.5U。
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| PB01 | Publication | ||
| DD01 | Delivery of document by public notice |
Addressee: Shanghai Fosun Pharmaceutical (Group) Corporation Document name: Notification of before Expiration of Request of Examination as to Substance |
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| CB02 | Change of applicant information | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 201315 Shanghai city Pudong New Area Kangshi Road No. 17 Applicant after: Shanghai Xingyao Medical Technology Development Co., Ltd. Applicant after: Shanghai Fosun Pharmaceutical (Group) Limited by Share Ltd. Address before: 200233 Yishan Road, Shanghai, No. 1289 Applicant before: Shanghai Fosun Pharmaceutical (Group) Corporation Applicant before: Shanghai Fosun Pharmaceutical (Group) Limited by Share Ltd. |
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| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: APPLICANT; FROM: FUXING MEDICAL SCIENCE -TECHNOLOGY DEVELOPMENT CO., LTD., SHANGHAI TO: SHANGHAI XINGYAO MEDICAL TECHNOLOGY DEVELOPMENT CO., LTD. |
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| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |