WO2020075695A1 - 微生物の検出方法 - Google Patents

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WO2020075695A1
WO2020075695A1 PCT/JP2019/039590 JP2019039590W WO2020075695A1 WO 2020075695 A1 WO2020075695 A1 WO 2020075695A1 JP 2019039590 W JP2019039590 W JP 2019039590W WO 2020075695 A1 WO2020075695 A1 WO 2020075695A1
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nucleic acid
biological sample
microorganism
acid amplification
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PCT/JP2019/039590
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佳子 上倉
道俊 杉本
泰康 杉本
広道 鈴木
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公益財団法人筑波メディカルセンター
東洋紡株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting a microorganism contained in a biological sample.
  • Detecting a microorganism contained in a biological sample is important in clinical diagnosis and the like, and a method of amplifying the nucleic acid of a microorganism to be detected in the biological sample by PCR or the like, detecting the amplified nucleic acid, and identifying the presence or absence of the microorganism are available.
  • amplification or detection inhibition occurs when nucleic acid amplification is performed without purifying the biological sample, and in most cases, correct measurement results are obtained. Can't get Therefore, when detecting a microorganism contained in a biological sample, it is common to add a pretreatment to the biological sample rather than subjecting the biological sample to detection as it is.
  • Patent Document 1 nucleic acid purification that can almost remove components other than nucleic acid is performed.
  • An object of the present invention is to provide a method for detecting a microorganism in a biological sample without requiring nucleic acid purification. Another object of the present invention is to provide a sample solution for nucleic acid amplification. Another object of the present invention is to provide a method for preparing a sample solution for nucleic acid amplification from a biological sample by a simple pretreatment. Still another object of the present invention is to provide a salt-containing solution for biological sample storage, biological sample transportation, or nucleic acid amplification. Another object is to provide a nucleic acid amplification kit containing the solution.
  • the present inventors mixed a biological sample or a suspension or solution thereof with an alkaline solution to prepare a mixed solution having an appropriate alkali concentration, and detected in this mixed solution.
  • a mixed solution having an appropriate alkali concentration we have found that the nucleic acid can be detected by amplifying it, and have completed the present invention.
  • the representative invention is as follows.
  • a method for detecting a microorganism in a biological sample comprising: The following steps (A) and (C): (A) a step of mixing a biological sample or its suspension or solution with an alkaline solution to prepare a mixed solution having an alkali concentration of 1 to 50 mM; and (C) in the mixed solution prepared in the step (A). A step of amplifying the nucleic acid of the microorganism in Including the method.
  • Item 2 Item 2. The method according to Item 1, wherein the mixed solution has an alkali concentration of 4 to 50 mM.
  • the biological sample or a suspension or solution thereof is an oral scrape, a pharyngeal swab, a nasal swab, a nasopharyngeal swab, a nasal aspirate, a sputum, a bronchial wash, an alveolar wash, a rectal swab, a vaginal secretion.
  • Item 3 The method according to Item 1 or 2, wherein the method is at least one selected from the group consisting of a substance, a cervical mucus, a stool suspension, and a urethral scrape.
  • the alkaline solution is potassium hydroxide aqueous solution, sodium hydroxide aqueous solution, lithium hydroxide aqueous solution, magnesium hydroxide aqueous solution, calcium hydroxide aqueous solution, barium hydroxide aqueous solution, potassium carbonate aqueous solution, sodium carbonate aqueous solution, magnesium carbonate aqueous solution, and calcium carbonate.
  • Item 4. The method according to any one of Items 1 to 3, which is at least one liquid selected from the group consisting of aqueous solutions.
  • Item 5 Item 5.
  • the method according to any one of Items 1 to 4 wherein the suspension or solution of the biological sample contains a salt-containing solution.
  • Item 6 Item 6.
  • the causative microorganisms are influenza virus, RS virus, adenovirus, group A streptococcus, Mycoplasma pneumoniae, pertussis, parapertussis, bronchial septicemia, chlamydia pneumoniae, chlamydia parvum, norovirus, rotavirus, sapovirus, diarrhea adenovirus.
  • the causative microorganisms are influenza virus, RS virus, adenovirus, group A streptococcus, Mycoplasma pneumoniae, pertussis, parapertussis, bronchial septicemia, chlamydia pneumoniae, chlamydia parvum, norovirus, rotavirus, sapovirus, diarrhea adenovirus.
  • step (B) The following step (B): (B) a step of filtering the mixed solution prepared in the step (A) to recover a filtrate, Further includes, Item 8.
  • a sample solution for nucleic acid amplification comprising the mixed solution prepared in the step (A) described in any one of Items 1 to 8 and / or the filtrate recovered in the step (B) described in the Item 8.
  • step (A) (A) a step of mixing a biological sample or its suspension or solution with an alkaline solution to prepare a mixed solution having an alkali concentration of 1 to 50 mM, A method for preparing a sample liquid for nucleic acid amplification, comprising: [Item 11]
  • step (B) (B) a step of filtering the mixed solution prepared in the step (A) to recover a filtrate, Item 11.
  • the method according to Item 10 further comprising:
  • the present invention may further include the inventions represented below.
  • Terminal C Item 10. The sample liquid according to Item 9, wherein the filter used in the filtration in the step (B) has a pore size of 10 ⁇ m to 500 ⁇ m.
  • a sample solution for nucleic acid amplification which comprises a biological sample or a suspension or solution thereof, and which comprises an alkaline solution having an alkali concentration of 1 to 50 mM.
  • a kit for nucleic acid amplification containing the solution according to Item F.
  • the kit of paragraph G further comprising a biological sample collection tool.
  • [Item I] Includes an alkaline solution adjusted to have an alkaline concentration of 1 to 50 mM when a biological sample storage, biological sample transport, or nucleic acid amplification salt-containing solution is mixed with a biological sample or a suspension or dissolution solution thereof Nucleic acid amplification kit.
  • the kit of paragraph I further comprising a biological sampling device.
  • a sample solution for nucleic acid amplification suitable for nucleic acid amplification can be prepared by pretreatment of special equipment required for nucleic acid extraction and purification, reagents such as organic solvents, and simple biological samples that do not require extraction and purification time. Nucleic acid can be detected by amplifying nucleic acid using this sample solution.
  • 5 is a graph showing the results of melting curve analysis in Example 1.
  • the horizontal axis of the graph shows the temperature (° C.), and the vertical axis shows the differential value (d / dt) of the fluorescence signal.
  • CT DNA is a sample solution containing Chlamydia trachomatis DNA
  • NC is a negative control sample solution.
  • 5 is a graph showing the results of melting curve analysis in Example 2.
  • the horizontal axis of the graph shows the temperature (° C.), and the vertical axis shows the differential value (d / dt) of the fluorescence signal.
  • One embodiment of the invention is a method of detecting a microorganism in a biological sample, the method comprising: The following steps (A) and (C): (A) a step of mixing a biological sample or its suspension or solution with an alkaline solution to prepare a mixed solution having an alkali concentration of 1 to 50 mM; and (C) in the mixed solution prepared in the step (A).
  • the biological sample is not particularly limited as long as it is a biological sample that may contain a microorganism to be detected (hereinafter, may be referred to as “detection microorganism”).
  • detection microorganism After collecting a biological sample from a living body, if the biological sample is deteriorated immediately, or if it takes a long time to detect the collected biological sample, the collected biological sample is, for example, derived from a living body (especially, microorganisms in the living body-derived material or For the purpose of diluting, storing, etc., the nucleic acid) can be mixed (for example, dissolved, suspended, etc.) with a liquid and made into a liquid form such as a suspension or a lysate.
  • a biological sample not only a biological sample but also a liquid-form suspension, a lysate and the like can be used as a source of a microorganism to be detected.
  • the biological sample or its suspension or solution is not particularly limited, and examples thereof include animal and plant tissues, body fluids, excrements, cells, bacteria, viruses and the like. More specifically, oral abrasions, pharyngeal swabs, nasal swabs, nasopharyngeal swabs, nasal aspirates, sputum, bronchial lavage fluids, alveolar lavage fluids, rectal swabs, vaginal secretions, cervical mucus, urethra.
  • Preferred biological samples or suspensions or lysates thereof are oral scrapes, pharyngeal swabs, nasal swabs, nasopharyngeal swabs, nasal aspirates, sputum, bronchial washings, alveolar washings, rectal swabs, vaginal secretions.
  • Substance cervical mucus, stool suspension, and urethral scrape, and more preferably at least one oral scrape, pharyngeal swab, nasal swab, nasopharyngeal swab, nasal cavity It is at least one selected from the group consisting of aspirate, sputum, rectal swab, vaginal discharge, cervical mucus, and urethral abrasion.
  • the biological sample is, for example, a sample derived from a human or non-human animal.
  • non-human animals include non-human mammals, such as dogs, cats, mice, rats, guinea pigs, hamsters, rabbits, pigs, cows, sheep, goats, etc., preferably dogs, cats and the like.
  • a human-derived sample is preferable.
  • the method of collecting a sample from a living body is not particularly limited, and a known method can be used depending on the type, size, and purpose of the sample.
  • a sampling method using a sampling tool such as a cotton swab, a swab, a platinum loop, a dropper, a spatula, and a spoon.
  • a liquid suitable for diluting or preserving a biological substance for example, water, a salt-containing liquid (a salt is The liquid contained therein is, for example, physiological saline, physiological salt solution, buffer solution, liquid transport medium, etc.), and preferably a salt-containing liquid
  • a biological substance particularly, a microorganism or a nucleic acid in the biological substance
  • a salt-containing liquid for example, water
  • a salt-containing liquid for example, water, a salt-containing liquid (a salt is The liquid contained therein is, for example, physiological saline, physiological salt solution, buffer solution, liquid transport medium, etc.), and preferably a salt-containing liquid
  • the salts include alkali metal salts or alkaline earth metal salts of acids.
  • the alkali metal salt include sodium chloride, potassium chloride, monopotassium phosphate, disodium hydrogen phosphate, sodium carbonate, sodium hydrogen carbonate, and sodium thioglycolate.
  • the alkaline earth metal salt include calcium
  • a suspension or solution of a biological sample can be prepared, for example, by suspending or dissolving a sample collected from a living body in water or a salt-containing solution, and when large contaminants or foreign substances are observed, It may be removed by centrifugation or the like.
  • liquids suitable for diluting or storing biological substances include sterile water, physiological saline, phosphate buffered saline, balanced salt solutions (for example, Hanks' solution, Dulbecco's phosphate buffer, Earle's balanced salts).
  • UTM medium for example, UTM 360C medium includes Hank's buffer salts, L-cysteine, sucrose, HEPES buffer, amphotericin B, phenol red, bovine serum albumin, gelatin, L-glutamic acid, vancomycin, and coli.
  • eSwab medium may contain sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, magnesium chloride, monopotassium phosphate, disodium hydrogen phosphate, sodium thioglycolate, and distilled water.
  • Uriswab medium, eNAT medium for example, eNAT medium is known to contain a surfactant and a protein denaturing agent, and specifically, guanidine thiocyanate, Tris-EDTA, HEPES, (It is known to contain a surfactant), Unitrans-RT medium, Carrie Blair medium, Amise medium, Stuart medium, modified medium thereof, and the like, but are not limited thereto.
  • Physiological saline, Tris buffer or transport medium is preferred, transport medium is more preferred, and UTM medium, eSwab medium or eNAT medium is even more preferred.
  • the alkaline solution is not particularly limited as long as it is an alkaline solution.
  • the alkaline solution include potassium hydroxide aqueous solution, sodium hydroxide aqueous solution, lithium hydroxide aqueous solution, magnesium hydroxide aqueous solution, calcium hydroxide aqueous solution, barium hydroxide aqueous solution, potassium carbonate aqueous solution, sodium carbonate aqueous solution, magnesium carbonate aqueous solution, calcium carbonate.
  • An aqueous solution may be used, and one kind may be used alone, or two or more kinds may be used in combination.
  • a preferred alkaline solution is at least one liquid selected from the group consisting of an aqueous potassium hydroxide solution, an aqueous sodium hydroxide solution, and an aqueous lithium hydroxide solution.
  • a more preferable alkaline solution is an aqueous potassium hydroxide solution and / or an aqueous sodium hydroxide solution.
  • the alkali concentration is a volume molar concentration (M or mol / L), and the alkaline substance contained in 1 L of the alkaline solution (for example, an alkaline substance such as potassium hydroxide and / or sodium hydroxide as described above).
  • the total amount of can be defined by the molar amount.
  • Step (A) is a step of preparing a mixed solution having an alkali concentration of 1 to 50 mM by mixing the biological sample or its suspension or solution with an alkaline solution.
  • the amount of the biological sample or its suspension or solution and the amount of the alkaline solution used are such that the alkali concentration in the mixed solution after mixing is predetermined.
  • the amount is not particularly limited as long as it is the concentration. Therefore, when using a suspension or solution of a biological sample, the amount and concentration of the alkaline solution to be used may be determined in consideration of their volume, alkaline substance content, and the like.
  • the alkaline concentration of the mixed solution in the step (A) may be, for example, 1 mM or more, 1.5 mM or more, 2 mM or more, 4 mM or more, 5 mM or more, 6 mM or more, 8 mM or more, or 10 mM or more, and for example, 50 mM or less, 49 mM.
  • 48 mM or less, 47 mM or less, 46 mM or less, 45 mM or less, 44 mM or less, 43 mM or less, 42 mM or less, 41 mM or less, 40 mM or less, 38 mM or less, 36 mM or less, 34 mM or less, 32 mM or less, 30 mM or less, 28 mM or less, or 26 mM or less Can be.
  • the alkali concentration is, for example, 1-50 mM, 2-50 mM, 3-50 mM, 4-50 mM, 5-45 mM, 8-45 mM, 8-50 mM, 10-45 mM, 10-50 mM, 15-45 mM, It may be 15 to 50 mM, 20 to 45 mM, 20 to 50 mM, or the like.
  • an alkaline solution having a high alkali concentration and for example, an alkaline solution having an alkali concentration of about 15 to 50 mM, more preferably about 20 to 45 mM may be used.
  • the method for mixing the biological sample or its suspension or solution with the alkaline solution is not particularly limited, but for example, a collecting tool with the biological sample attached, for example, a method of suspending a swab by contacting it with an alkaline solution, prepared in advance Examples thereof include a method of simply mixing a suspension or solution of a biological sample with an alkaline solution.
  • the mixed solution having an alkali concentration of 1 to 50 mM prepared by mixing the biological sample or its suspension or solution with an alkaline solution may be subjected to nucleic acid amplification in the next step (C), or optionally in the step It may be subjected to filtration in (B).
  • the step (B) is a step of collecting the filtrate by filtering the mixed solution prepared in the step (A).
  • the step (B) is not an essential step and can be set arbitrarily. However, depending on the type or state of the biological sample, the state of the collecting tool, etc., the living body or the collecting tool is derived from the mixed solution prepared in the step (A). When a large amount of foreign substances (eg swab fibers, biological cell masses, biological tissue pieces, dust) that are visible to the eye may be contained, which may hinder the subsequent step (C) or the detection step. It is preferable to remove large contaminants in the step (B). Further, in another embodiment, it is preferable that the step (B) is not included.
  • foreign substances eg swab fibers, biological cell masses, biological tissue pieces, dust
  • Filtration of the mixed solution prepared in the step (A) may be performed using a filter material, for example, a filter, preferably a sintered filter.
  • the material of the filter is not particularly limited, and polypropylene, polyethylene (for example, low density polyethylene, high density polyethylene, ultra high molecular weight polyethylene, etc.), polystyrene, polymethylmethacrylate, alumina, zirconia, silicon, silicon tetrafluoroethylene polymer, stainless steel Examples thereof include steel.
  • the filter As a material for the filter, it is preferable to use at least one selected from the group consisting of polypropylene, polyethylene, polystyrene, and polymethylmethacrylate, from the viewpoint of easy molding, and among them, polypropylene or polyethylene is preferable.
  • the pore size of the filter may be, for example, 5 ⁇ m or more, 10 ⁇ m or more, or 15 ⁇ m or more, and may be 1000 ⁇ m or less, 800 ⁇ m or less, 500 ⁇ m or less, or 400 ⁇ m or less. In one embodiment, the pore size is 5 ⁇ m to 800 ⁇ m, preferably 10 ⁇ m to 500 ⁇ m, more preferably 15 ⁇ m to 400 ⁇ m.
  • the sintered filter may be configured by stacking a plurality of filters having different pore diameters, the pore diameter of the filter having the minimum pore diameter is 1 ⁇ m or more, and the pore diameter of the filter having the maximum pore diameter is A filtration filter having a thickness of 500 ⁇ m or less can be used.
  • a sintered filter having a pore size of 100 ⁇ m to 200 ⁇ m and a sintered filter having a pore size of 10 ⁇ m to 500 ⁇ m can be filtered in this order.
  • the filtration is preferably natural filtration from the viewpoint of easy implementation, but may be performed by vacuum filtration, pressure filtration, centrifugal filtration, or the like.
  • the filtrate recovered by filtration in step (B) may be subjected to nucleic acid amplification in the next step (C). Further, after adding an alkaline solution to the filtrate recovered by the filtration in the step (B), centrifugation treatment is performed to obtain a supernatant, which may be used for nucleic acid amplification in the next step (C). .
  • the mixed solution prepared in the step (A) or the filtrate recovered in the step (B) is subjected to, for example, a stirring treatment. , Sonication, heat treatment, enzyme treatment, etc., and may be subjected to a lysis or crushing step.
  • step (C) the lysis or disruption solution prepared by this lysis or disruption step is replaced with the mixed solution prepared in step (A) or the filtrate recovered in step (B), and a nucleic acid amplification sample is obtained. You may use it as a liquid.
  • a centrifugation step may be included for collecting bacteria, but the centrifugation step is not included in an embodiment of the present invention.
  • the stirring treatment is a method of crushing microorganisms by stirring the mixed solution prepared in the step (A) or the filtrate collected in the step (B).
  • the stirring treatment can be performed by inversion mixing, a vortex mixer, a stirrer, or the like.
  • the ultrasonic treatment is a method of disrupting microorganisms by applying ultrasonic waves to the mixed solution prepared in the step (A) or the filtrate recovered in the step (B).
  • an ultrasonic homogenizer can easily break the cell wall, and microorganisms are easily broken.
  • the treatment time is, for example, 10 seconds to 2 minutes, preferably 10 seconds to 1 minute, and may be performed only once or repeated a plurality of times (for example, 2 to 6 times, 2 to 4 times).
  • the heat treatment is a method of lysing the microorganisms by applying heat to the mixed liquid prepared in the step (A) or the filtrate recovered in the step (B).
  • the heating temperature is not particularly limited, but is preferably 80 ° C or higher, more preferably 85 ° C or higher, and further preferably 90 ° C or higher.
  • the heating time is, for example, 10 seconds to 5 minutes, preferably 20 seconds to 4 minutes.
  • the enzyme treatment is a method of lysing a microorganism by adding a cell wall lysing enzyme or the like to the mixed solution prepared in the step (A) or the filtrate collected in the step (B).
  • the enzyme used is not limited, except that it is an enzyme capable of lysing the target microorganism.
  • the enzyme reaction is preferably performed under conditions such as a temperature at which the activity of the enzyme becomes large.
  • one or more treatments may be carried out continuously, or if possible, a plurality of treatments may be combined and carried out simultaneously. Combining a plurality of treatments may be advantageous because they may be more easily lysed or crushed.
  • the step (C) is a step of amplifying the nucleic acid of the microorganism in the mixed solution prepared in the step (A) or in the filtrate recovered in the step (B).
  • the mixed solution prepared in the step (A) and / or the filtrate recovered in the step (B) can be directly used for nucleic acid amplification.
  • various components may be added to the mixed solution and / or the filtrate, and then the nucleic acid may be amplified.
  • the mixed solution and / or the filtrate used for nucleic acid amplification may be referred to as “nucleic acid amplification sample solution”.
  • the sample liquid for nucleic acid amplification used in the nucleic acid amplification step contains the nucleic acid source of the microorganism to be the target of nucleic acid amplification. Therefore, in the sample solution for nucleic acid amplification, an appropriate reagent or the like (eg, DNA polymerase, nucleic acid primer pair, nucleic acid probe (eg, QProbe, TaqmanProbe), etc.) depending on the type of microorganism, the applied nucleic acid amplification method, etc. is appropriately used. It is added and used for nucleic acid amplification.
  • an appropriate reagent or the like eg, DNA polymerase, nucleic acid primer pair, nucleic acid probe (eg, QProbe, TaqmanProbe), etc.
  • the nucleic acid amplification method used for nucleic acid amplification is not particularly limited, and various known methods such as PCR method, SDA method, ICAN method, isothermal amplification method (for example, LAMP method) can be used.
  • the PCR method or the isothermal amplification method is more preferable, and the real-time PCR method or the LAMP method is even more preferable.
  • Conditions such as the temperature of nucleic acid amplification may be appropriately set according to the method of nucleic acid amplification, the type of microorganism to be detected, and the like.
  • the DNA polymerase used in the nucleic acid amplification step of the PCR method or the isothermal amplification method is not particularly limited, but for example, ⁇ -type DNA polymerase such as KOD DNA polymerase, Pfu DNA polymerase; Taq DNA polymerase, Tth DNA polymerase, etc.
  • Pol I type DNA polymerase or the like can be used, and in a specific embodiment, it is preferable to use ⁇ type DNA polymerase or family B DNA polymerase in terms of excellent accuracy.
  • the ⁇ -type DNA polymerase is not particularly limited, but it is more preferable to use KOD DNA polymerase (manufactured by Toyobo) or Pfu DNA polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • the nucleic acid of the microorganism to be detected amplified in the step (C) is subjected to the detection step.
  • the method used for detection is not particularly limited, and conventionally used methods for detecting microorganisms can be applied, for example, agarose gel electrophoresis method, SSCP method, RFLP method, method of detecting nucleic acid using intercalator, base of nucleic acid. Examples include a method of detecting a nucleic acid using a nucleic acid probe that specifically binds to a sequence. More preferred is a method of detecting a nucleic acid using a nucleic acid probe.
  • the nucleic acid probe examples include a TaqMan probe, a quenching probe (Q probe), and MolecularBeacon.
  • the microorganism to be detected can be detected by hybridizing the nucleic acid probe to the nucleic acid and performing melting curve analysis. Other conditions in the detection step may be appropriately set in consideration of the type of microorganism to be detected and the type of probe.
  • the microorganism to be detected is not particularly limited, and examples thereof include, but are not limited to, respiratory infection-causing microorganisms, diarrhea-causing microorganisms, sexually transmitted diseases-causing microorganisms, intestinal infection-causing microorganisms, and the like.
  • the microorganisms to be detected may be a single species or a combination of two or more species. Preferred are respiratory infection-causing microorganisms, diarrhea-causing microorganisms, and sexually transmitted diseases-causing microorganisms.
  • Respiratory infectious disease-causing microorganisms are, for example, influenza virus (for example, influenza A virus, influenza B virus, etc.), RS virus, adenovirus, group A streptococcus, mycoplasma pneumoniae, pertussis, parapertussis, bronchial sepsis, pneumonia. It may be Chlamydia, Aum disease Chlamydia, etc.
  • a preferred respiratory infection causing microorganism is Mycoplasma pneumoniae or B. pertussis.
  • the diarrhea-causing microorganism may be, for example, norovirus, rotavirus, sapovirus, diarrhea adenovirus, or the like.
  • a preferred diarrhea causing microorganism is norovirus or rotavirus.
  • the sexually transmitted disease-causing microorganism may be gonococcus, chlamydia, mycoplasma, ureaplasma, HIV, HPV and the like.
  • a preferred sexually transmitted disease-causing microorganism is Chlamydia or N. gonorrhoeae.
  • Mycoplasma examples include Mycoplasma arginini, Mycoplasma buccale, Mycoplasma faucium, Mycoplasma hominis, Mycoplasma oralea, Mycoplasma oraleplasm salivarium), Mycoplasma fermentans, Mycoplasma lipophilum, Mycoplasma primatum, Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma myoplasma myoplasma synovia genitalium), Mycoplasma pneumoniae (Mycoplasma pneumoniae), Mycoplasma gali And the like Putikamu (Mycoplasma gallisepticum).
  • sample solution for nucleic acid amplification is a nucleic acid amplification sample solution comprising the mixed solution prepared in the step (A) and / or the filtrate recovered in the step (B). This sample solution is prepared by the above step (A) and / or step (B). Further, another embodiment of the present invention is a nucleic acid amplification sample solution which comprises a biological sample or a suspension or solution thereof, and which comprises an alkaline solution having an alkali concentration of 1 to 50 mM.
  • the sample solution of the present invention is suitable for amplification of nucleic acid by PCR method, isothermal amplification method and the like. That is, the nucleic acid of the microorganism to be detected can be amplified in this sample solution.
  • the mixed solution prepared by mixing the suspension or solution of the biological sample with the alkaline solution in the step (A) or the filtrate recovered by filtering the mixed solution in the step (B) is a nucleic acid. It is preferable as a sample solution for amplification. Details of the step (A) and the step (B) in the nucleic acid amplification sample solution are the same as the step (A) and the step (B) in the method for detecting a microorganism in a biological sample.
  • One embodiment of the present invention is a method for preparing a sample solution for nucleic acid amplification, which comprises the following step (A): (A) a step of mixing a biological sample or its suspension or solution with an alkaline solution to prepare a mixed solution having an alkali concentration of 1 to 50 mM, Includes.
  • the method for preparing a sample solution for nucleic acid amplification comprises the following step (B) in addition to the above step (A): (B) a step of filtering the mixed solution prepared in the step (A) to recover a filtrate, Is further included.
  • This preparation method is suitable for preparing a sample solution for nucleic acid amplification. Details of step (A), step (B) and the like in this preparation method are the same as step (A) and step (B) in the method of detecting a microorganism in a biological sample.
  • Salt-containing liquid for biological sample storage, biological sample transport, or nucleic acid amplification is a salt-containing liquid for biological sample storage, biological sample transportation, or nucleic acid amplification, which has an alkali concentration of 1 to 50 mM.
  • This solution can be prepared by adding the alkaline substance as needed to the salt-containing solution described in the method for detecting a microorganism in a biological sample to adjust the alkali concentration to 1 to 50 mM.
  • Nucleic acid amplification and detection in a biological sample can be carried out by a simple operation of mixing the biological sample collected in this liquid. The description of the method for detecting microorganisms in a biological sample can be applied to the details of this liquid.
  • nucleic acid amplification kit containing a biological sample storage, biological sample transport, or nucleic acid amplification salt-containing solution having an alkali concentration of 1 to 50 mM.
  • a salt-containing solution for biological sample storage, biological sample transport, or nucleic acid amplification is mixed with a biological sample or a suspension or solution thereof, an alkali concentration is 1 to 50 mM.
  • kits may further include a biological sampling device (eg, a swab, swab, etc.).
  • the kit may further include additional components that are advantageous for storage of biological samples, amplification or detection of nucleic acids, and the like. The description of the method for detecting a microorganism in a biological sample can be applied to the details of this kit.
  • the present invention will be specifically described below with reference to test examples, but the present invention is not limited to the test examples.
  • the reagents used in the test examples are as follows. KOD Mix: Reagent for PCR containing ⁇ -type polymerase SCT Mix: Reagent containing primer and probe for detection of Chlamydia trachomatis MPN Mix: Reagent containing primer and probe for detection of Mycoplasma pneumoniae IC Mix: Internal control (IC) Including reagents
  • a mixed solution containing a DNA sample, cervical mucus, physiological saline and sodium hydroxide aqueous solution (alkaline concentration 50 mM ; Sometimes referred to as CT) was prepared.
  • a mixture containing cervical mucus, physiological saline and an aqueous solution of sodium hydroxide (alkaline concentration 50 mM; negative control (referred to as NC) is prepared in the same manner except that the DNA sample is not used. There is)).
  • FIG. 1 is a graph showing the change in fluorescence intensity with temperature increase after nucleic acid amplification under the above conditions.
  • the horizontal axis of the graph is temperature (° C.), and the vertical axis is the differential value (d / dt) of the fluorescence signal.
  • CT DNA shows the analysis result of the sample solution containing Chlamydia trachomatis DNA
  • NC shows the analysis result of the negative control sample solution.
  • Chlamydia trachomatis was detected in CT DNA and not detected in NC.
  • Nucleic acid amplification was carried out in the same manner as in Test Example 3 except that a part of the prepared mixed solution was used as a sample solution for nucleic acid amplification (4 ⁇ L) and the reagents were changed to the following. And detection was performed.
  • Each diluted solution was filtered through a sintered filter (made of polyethylene, pore size 20 ⁇ m) and the filtrate was collected.
  • the primers and probes represented by SEQ ID NOs: 4 to 6 used in this test example are a set of primers and probes for detecting GI type norovirus, and the primers and probes represented by SEQ ID NOs: 7 to 9 are GII. It is a set of a primer and a probe for detecting a type norovirus.
  • nucleic acid could be detected without isolation of nucleic acid by a simple pretreatment in which a biological sample was mixed with an alkaline solution at a predetermined alkali concentration. Therefore, an alkaline solution having an appropriate concentration does not change nucleic acids such that nucleic acid amplification or detection is inhibited, and in addition, nucleic acid amplification inhibition by other components derived from a biological sample or transport medium, nucleic acid detection inhibition, And the possibility of suppressing false negatives was suggested.
  • the pretreatment method of the present invention it is possible to easily detect the nucleic acid derived from the microorganism contained in the sample without the need to isolate the nucleic acid, which can greatly contribute to the field of clinical diagnosis.

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Abstract

操作が非常に複雑、操作時間が長い、有機溶媒を使用する、試薬コストが高い欠点を有する核酸精製を必要とすることなく、生体試料中の微生物を検出する方法を提供することを課題とする。 生体試料中の微生物を検出する方法であって、以下の工程（Ａ）及び（Ｃ）： （Ａ）生体試料又はその懸濁液若しくは溶解液とアルカリ性溶液とを混合してアルカリ濃度１～５０ｍＭの混合液を調製する工程、及び （Ｃ）前記工程（Ａ）で調製された混合液中で前記微生物の核酸を増幅する工程、 を包含する、方法。

Description

微生物の検出方法
　本発明は、生体試料に含まれる微生物の検出方法に関する。
　生体試料に含まれる微生物を検出することは臨床診断などにおいて重要であり、生体試料中の検出対象微生物の核酸をＰＣＲ等で増幅し、増幅した核酸を検出し、微生物の存否を特定する方法が行われている。しかし、生体試料中には核酸のほかに様々な生体由来物質が含まれているため、生体試料を精製することなく核酸増幅を実行すると増幅阻害又は検出阻害が生じ、ほとんどの場合、正しい測定結果が得られない。そこで、生体試料中に含まれる微生物を検出する際に、生体試料をそのまま検出に供するのではなく、生体試料に前処理を加えることが一般的である。
　前処理としては、核酸以外の成分をほぼ除去できる核酸精製が行われている（特許文献１）。
特開２０１６－０６７２９１
　しかしながら、核酸精製は、操作が非常に複雑、操作時間が長い、有機溶媒を使用する、試薬コストが高い等の課題があった。本発明は、核酸精製を必要とすることなく、生体試料中の微生物を検出する方法を提供することを１つの目的とする。また、本発明は、核酸増幅用の試料液を提供することを１つの目的とする。さらに、本発明は、簡便な前処理により、生体試料から核酸増幅用の試料液を調製する方法の提供を１つの目的とする。さらにまた、本発明は生体試料保存、生体試料輸送、又は核酸増幅用塩類含有液の提供を１つの目的とする。また、当該液を含む核酸増幅用キットの提供を１つの目的とする。
　本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、生体試料又はその懸濁液若しくは溶解液とアルカリ性溶液とを混合して適切なアルカリ濃度の混合液を調製し、この混合液中で検出対象の微生物の核酸を増幅することによって、該核酸を検出できることを見出し本発明を完成させた。代表的な本発明は以下のとおりである。
［項１］
生体試料中の微生物を検出する方法であって、
以下の工程（Ａ）及び（Ｃ）：
（Ａ）生体試料又はその懸濁液若しくは溶解液とアルカリ性溶液とを混合してアルカリ濃度１～５０ｍＭの混合液を調製する工程、及び
（Ｃ）前記工程（Ａ）で調製された混合液中で前記微生物の核酸を増幅する工程、
を包含する、方法。
［項２］
前記混合液のアルカリ濃度が４～５０ｍＭである、項１に記載の方法。
［項３］
前記生体試料又はその懸濁液若しくは溶解液が、口腔内擦過物、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、鼻咽頭拭い液、鼻腔吸引液、喀痰、気管支洗浄液、肺胞洗浄液、直腸拭い液、膣分泌物、子宮頸管粘液、便懸濁液、及び尿道擦過物からなる群より選択される少なくとも１種である、項１又は２に記載の方法。
［項４］
前記アルカリ性溶液が、水酸化カリウム水溶液、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化リチウム水溶液、水酸化マグネシウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液、水酸化バリウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、炭酸マグネシウム水溶液、及び炭酸カルシウム水溶液からなる群より選択される少なくとも１種の液である、項１～３のいずれかに記載の方法。
［項５］
前記生体試料の懸濁液又は溶解液が塩類含有液を含む、項１～４のいずれかに記載の方法。
［項６］
前記微生物が、呼吸器感染症、下痢症、又は性感染症の原因微生物である、項１～５のいずれかに記載の方法。
［項７］
前記原因微生物が、インフルエンザウイルス、ＲＳウイルス、アデノウイルス、Ａ群溶連菌、肺炎マイコプラズマ、百日咳菌、パラ百日咳菌、気管支敗血症菌、肺炎クラミジア、オウム病クラミジア、ノロウイルス、ロタウイルス、サポウイルス、下痢症アデノウイルス、淋菌、クラミジア、マイコプラズマ、ウレアプラズマ、ＨＩＶ及びＨＰＶからなる群より選択される少なくとも１種の微生物である、項６に記載の方法。
［項８］
以下の工程（Ｂ）：
（Ｂ）前記工程（Ａ）で調製された混合液を濾過して濾液を回収する工程、
をさらに包含し、
前記工程（Ｃ）において混合液に代えて前記工程（Ｂ）で回収された濾液を使用する、項１～７のいずれかに記載の方法。
［項９］
項１～８のいずれかに記載の前記工程（Ａ）で調製された混合液及び／又は項８に記載の前記工程（Ｂ）で回収された濾液からなる、核酸増幅用試料液。
［項１０］
以下の工程（Ａ）：
（Ａ）生体試料又はその懸濁液若しくは溶解液とアルカリ性溶液とを混合してアルカリ濃度１～５０ｍＭの混合液を調製する工程、
を包含する、核酸増幅用試料液の調製方法。
［項１１］
以下の工程（Ｂ）：
（Ｂ）前記工程（Ａ）で調製された混合液を濾過して濾液を回収する工程、
をさらに包含する、項１０に記載の方法。
　また、本発明は下記に代表される発明をさらに含みうる。
［項Ａ］
前記工程（Ｂ）における濾過に使用されるフィルターの孔径が１０μｍ～５００μｍである、項８に記載の方法。
［項Ｂ]
前記工程（Ｃ）における核酸を増幅する工程がＰＣＲ法又は等温増幅法である、項１～８及び項Ａのいずれかに記載の方法。
［項Ｃ］
前記工程（Ｂ）における濾過に使用されるフィルターの孔径が１０μｍ～５００μｍである、項９に記載の試料液。
［項Ｄ］
前記工程（Ｂ）における濾過に使用されるフィルターの孔径が１０μｍ～５００μｍである、項１１に記載の方法。
［項Ｅ］
生体試料又はその懸濁液若しくは溶解液を含有し、アルカリ濃度が１～５０ｍＭであるアルカリ性溶液からなる核酸増幅用試料液。
［項Ｆ］
アルカリ濃度が１～５０ｍＭである生体試料保存、生体試料輸送、又は核酸増幅用塩類含有液。
［項Ｇ］
前記項Ｆに記載の液を含む核酸増幅用キット。
［項Ｈ］
生体試料採取具をさらに含む項Ｇに記載のキット。
［項Ｉ］
生体試料保存、生体試料輸送、又は核酸増幅用塩類含有液と、生体試料又はその懸濁液若しくは溶解液とを混合した場合にアルカリ濃度が１～５０ｍＭとなるように調整されたアルカリ性溶液を含む核酸増幅用キット。
［項Ｊ］
生体試料採取具をさらに含む項Ｉに記載のキット。
　核酸抽出及び精製に要する特殊な機器、有機溶媒等の試薬、抽出及び精製時間を必要とすることのない簡便な生体試料の前処理により、核酸増幅に適した核酸増幅用試料液を調製できる。この試料液を用いて核酸増幅することにより核酸の検出ができる。
実施例１における融解曲線解析の結果を表すグラフである。グラフの横軸は温度（℃）、縦軸は蛍光シグナルの微分値（ｄ／ｄｔ）を示す。また、グラフ中、ＣＴ　ＤＮＡはクラミジア・トラコマチスＤＮＡを加えた試料液、ＮＣは陰性コントロール試料液を示す。 実施例２における融解曲線解析の結果を表すグラフである。グラフの横軸は温度（℃）、縦軸は蛍光シグナルの微分値（ｄ／ｄｔ）を示す。
　以下、上述の代表的な発明を中心に説明する。
［微生物の検出方法］
　本発明の一実施形態は生体試料中の微生物を検出する方法であり、該方法は、
以下の工程（Ａ）及び（Ｃ）：
（Ａ）生体試料又はその懸濁液若しくは溶解液とアルカリ性溶液とを混合してアルカリ濃度１～５０ｍＭの混合液を調製する工程、及び
（Ｃ）前記工程（Ａ）で調製された混合液中で前記微生物の核酸を増幅する工程、
を包含する。
［生体試料］
　本明細書において生体試料は、検出の対象となる微生物（以下、「検出対象微生物」と称することがある。）を含む可能性のある生体由来の試料であれば特に限定されない。
　生体から生体試料を採取後、生体試料が直ちに劣化する場合、採取後検出までに長時間を要する場合などには、採取した生体試料を、例えば生体由来物（特に、生体由来物中の微生物又は核酸）を希釈、保存等する目的で、液体に混合（例えば溶解、懸濁など）し、懸濁物、溶解物などの液状形態とすることもできる。本明細書においては、生体試料だけでなく、この液状形態の懸濁液、溶解液なども検出対象微生物源として使用することができる。
　生体試料又はその懸濁液若しくは溶解液としては特に制限されないが、例えば動植物組織、体液、排泄物、細胞、細菌、ウイルス等が挙げられる。より具体的には、口腔内擦過物、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、鼻咽頭拭い液、鼻腔吸引液、喀痰、気管支洗浄液、肺胞洗浄液、直腸拭い液、膣分泌物、子宮頸管粘液、尿道擦過物、便懸濁液、血液、血漿、血清、血液培養液、尿、唾液、羊水、膿、髄液、胸水、組織切片、皮膚、吐瀉物、糞便、鼓膜切開液、胃洗浄液、腸洗浄液、臓器抽出液、組織抽出液分離培養コロニー、カテーテル洗浄液などが挙げられ、１種単独又は２種以上組み合わせて使用できる。好ましい生体試料又はその懸濁液若しくは溶解液は、口腔内擦過物、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、鼻咽頭拭い液、鼻腔吸引液、喀痰、気管支洗浄液、肺胞洗浄液、直腸拭い液、膣分泌物、子宮頸管粘液、便懸濁液、及び尿道擦過物からなる群から選択される少なくとも１種であり、より好ましくは口腔内擦過物、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、鼻咽頭拭い液、鼻腔吸引液、喀痰、直腸拭い液、膣分泌物、子宮頸管粘液、及び尿道擦過物からなる群から選択される少なくとも１種である。
　また、生体試料は、例えばヒト又は非ヒト動物由来の試料である。非ヒト動物としては非ヒト哺乳動物が挙げられ、例えばイヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギなどであり、好ましくはイヌ、ネコなどである。好ましくはヒト由来の試料である。
　生体からの試料の採取方法は、特に制限されず、試料の種類、大きさ、目的に応じて公知の方法を用いることができる。例えば綿棒、スワブ、白金耳、スポイト、へら、さじなどの採取具を用いた採取方法である。
　前記の液状形態、例えば懸濁液又は溶解液としては、生体由来物（特に、生体由来物中の微生物又は核酸）を希釈又は保存するために適した液体（例えば水、塩類含有液（塩類を含有する液体であり、例えば生理的食塩水、生理的塩類溶液、緩衝液、液体輸送培地など）などであり、好ましくは塩類含有液）を生体試料に混合した液が挙げられる。塩類としては、例えば酸のアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩などが挙げられる。当該アルカリ金属塩としては、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸一カリウム、リン酸水素二ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、チオグリコール酸ナトリウムなどが挙げられる。当該アルカリ土類金属塩としては、例えば塩化カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウムなどが挙げられる。
　生体試料の懸濁液又は溶解液は、例えば生体から採取された試料を水、塩類含有液に懸濁又は溶解することなどにより調製でき、更に、大きな夾雑物又は異物等が認められる場合には遠心分離等で取り除いたものであってもよい。
　生体由来物を希釈又は保存するために適した液体の例としては、滅菌水、生理的食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、平衡塩類溶液（例えばハンクス液、ダルベッコリン酸緩衝液、アール平衡塩溶液、リンガー液、チロード液、イーグル液など）、トリスバッファー、ＴＥバッファー、リン酸バッファー、グッド緩衝液（例えばＨＥＰＥＳバッファー、ＡＣＥＳバッファー、ＰＩＰＥＳバッファー、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓバッファー、ＭＯＰＳバッファー、ＨＥＰＰＳバッファー、ＴＡＰＳバッファーなど）、ＵＴＭ培地（例えば、ＵＴＭ　３６０Ｃ培地は、ハンクス緩衝塩類、Ｌ－システイン、ショ糖、ＨＥＰＥＳ緩衝液、アンフォテリシンＢ、フェノールレッド、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、Ｌ－グルタミン酸、バンコマイシン、及びコリスチンを含むことが公知）、ｅＳｗａｂ培地（ｅＳｗａｂ培地は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、リン酸一カリウム、リン酸水素二ナトリウム、チオグリコール酸ナトリウム、及び蒸留水を含むことが公知）、ウリスワブ培地、ｅＮＡＴ培地（例えば、ｅＮＡＴ培地は界面活性剤及びタンパク質変性剤を含むことが知られており、具体的には、グアニジンチオシアン酸塩（Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ　ｔｈｙｏｃｉａｎａｔｅ）、Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ、ＨＥＰＥＳ、界面活性剤を含むことが公知）、ユニトランズ－ＲＴ培地、キャリー・ブレア培地、アミーズ培地、スチュアート培地、これらの改良培地などが挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは生理食塩水、トリスバッファー又は輸送培地であり、より好ましくは輸送培地であり、より一層好ましくはＵＴＭ培地、ｅＳｗａｂ培地又はｅＮＡＴ培地である。
［アルカリ性溶液］
　本明細書において、アルカリ性溶液はアルカリ性の溶液であれば特に限定されない。アルカリ性溶液としては、例えば水酸化カリウム水溶液、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化リチウム水溶液、水酸化マグネシウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液、水酸化バリウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、炭酸マグネシウム水溶液、炭酸カルシウム水溶液などが挙げられ、１種単独又は２種以上組み合わせて使用できる。好ましいアルカリ性溶液は、水酸化カリウム水溶液、水酸化ナトリウム水溶液、及び水酸化リチウム水溶液からなる群より選択される少なくとも１種の液である。より好ましいアルカリ性溶液は、水酸化カリウム水溶液及び／又は水酸化ナトリウム水溶液である。
　本明細書において、アルカリ濃度は体積モル濃度（Ｍ又はｍｏｌ／Ｌ）であり、アルカリ性溶液１Ｌ中に含まれるアルカリ性物質（例えば、上記のような水酸化カリウム及び／又は水酸化ナトリウムなどのアルカリ性物質の総量）のモル量で規定できる。
［工程（Ａ）］
　工程（Ａ）は、生体試料又はその懸濁液若しくは溶解液とアルカリ性溶液とを混合してアルカリ濃度１～５０ｍＭの混合液を調製する工程である。
　生体試料又はその懸濁液若しくは溶解液と、アルカリ性溶液との混合における、生体試料又はその懸濁液若しくは溶解液の使用量及びアルカリ性溶液の使用量は、混合後の混合液におけるアルカリ濃度が所定の濃度となる量である限り特に限定されない。したがって、生体試料の懸濁液又は溶解液を用いる場合は、それらの体積、アルカリ性物質含有量なども考慮して、アルカリ性溶液の使用量及び濃度を決定すればよい。
　工程（Ａ）における混合液のアルカリ濃度は、例えば１ｍＭ以上、１．５ｍＭ以上、２ｍＭ以上、４ｍＭ以上、５ｍＭ以上、６ｍＭ以上、８ｍＭ以上、又は１０ｍＭ以上であり得、また、例えば５０ｍＭ以下、４９ｍＭ以下、４８ｍＭ以下、４７ｍＭ以下、４６ｍＭ以下、４５ｍＭ以下、４４ｍＭ以下、４３ｍＭ以下、４２ｍＭ以下、４１ｍＭ以下、４０ｍＭ以下、３８ｍＭ以下、３６ｍＭ以下、３４ｍＭ以下、３２ｍＭ以下、３０ｍＭ以下、２８ｍＭ以下、又は２６ｍＭ以下であり得る。
　一実施形態において、アルカリ濃度は、例えば１～５０ｍＭ、２～５０ｍＭ、３～５０ｍＭ、４～５０ｍＭ、５～４５ｍＭ、８～４５ｍＭ、８～５０ｍＭ、１０～４５ｍＭ、１０～５０ｍＭ、１５～４５ｍＭ、１５～５０ｍＭ、２０～４５ｍＭ、２０～５０ｍＭなどとしてもよい。特定の実施形態において、例えば、クラミジア・トラコマチス等を検出するために子宮頸管粘液を生体試料として用いる場合又は肺炎マイコプラズマ等を検出するために咽頭拭い液を生体試料として用いる場合などには、特に限定されないが、高いアルカリ濃度のアルカリ性溶液を用いることが通常好ましく、例えば、１５～５０ｍＭ程度、より好ましくは２０～４５ｍＭ程度のアルカリ濃度のアルカリ性液を用いてもよい。
　生体試料又はその懸濁液若しくは溶解液とアルカリ性溶液とを混合する方法は特に制限されないが、例えば生体試料の付着した採取具、例えばスワブをアルカリ性溶液に接触させて懸濁する方法、予め用意した生体試料の懸濁液若しくは溶解液とアルカリ性溶液とを単に混合する方法などが挙げられる。
　生体試料又はその懸濁液若しくは溶解液とアルカリ性溶液との混合により調製されたアルカリ濃度１～５０ｍＭの混合液は、次の工程（Ｃ）における核酸増幅に供されてもよいし、任意に工程（Ｂ）における濾過に供されてもよい。
［工程（Ｂ）］
　工程（Ｂ）は、前記工程（Ａ）で調製された混合液を濾過して濾液を回収する工程である。工程（Ｂ）は必須工程ではなく任意に設定できる工程であるが、生体試料の種類又は状態、採取具の状態などによっては、工程（Ａ）で調製された混合液中に生体又は採取具由来の目視できる程度の大きな夾雑物（例えばスワブの繊維、生体細胞の塊、生体組織片、ゴミ）が含まれることがあり、これにより後の工程（Ｃ）又は検出工程を阻害するおそれがあるときは、工程（Ｂ）で大きな夾雑物を除去することが好ましい。また、他の実施形態では、工程（Ｂ）は含まないことが好ましい。
　工程（Ａ）で調製された混合液の濾過は濾材、例えばフィルター、好ましくは焼結フィルターを使用して行えばよい。フィルターの素材は特に限定されず、ポリプロピレン、ポリエチレン（例えば低密度ポリエチレン、高密度ポリエチレン、超高分子量ポリエチレンなど）、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、アルミナ、ジルコニア、ケイ素、ケイ素四フッ化エチレン重合体、ステンレス鋼などを挙げることができる。フィルターの素材としては、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレートからなる群より選択される少なくとも１種を使用することが成型が容易である点から好ましく、なかでもポリプロピレン又はポリエチレンが好ましい。
　フィルターの孔径は、例えば５μｍ以上、１０μｍ以上、又は１５μｍ以上であり得、また１０００μｍ以下、８００μｍ以下、５００μｍ以下、又は４００μｍ以下であり得る。一実施形態において、孔径は、５μｍ～８００μｍ、好ましくは１０μｍ～５００μｍ、より好ましくは１５μｍ～４００μｍである。一実施形態においては、焼結フィルターは、その孔径が異なる複数のフィルターを重ねて構成されていてもよく、最小孔径を有するフィルターの孔径が、１μｍ以上であり、最大孔径を有するフィルターの孔径が５００μｍ以下である濾過フィルターを用いることができる。一実施形態において、例えば孔径１００μｍ～２００μｍの焼結フィルター、孔径１０μｍ～５００μｍの焼結フィルターの順に濾過することができる。
　濾過は、簡便に実施する観点から自然濾過が好ましいが、減圧濾過、加圧濾過、遠心濾過などで実施してもよい。
　工程（Ｂ）の濾過により回収された濾液は、次の工程（Ｃ）において核酸増幅に供されてよい。また、工程（Ｂ）の濾過により回収された濾液にアルカリ性溶液を添加した後、遠心分離処理して上清を得、この上清が次の工程（Ｃ）において核酸増幅に供されてもよい。
［溶菌又は破砕工程］
　一実施形態において、検出対象微生物がウイルスより大きな微生物（例えば細菌、真菌など）の場合、前記工程（Ａ）で調製された混合液又は前記工程（Ｂ）で回収された濾液を、例えば撹拌処理、超音波処理、加熱処理、酵素処理などの、溶菌又は破砕工程に供してもよい。この溶菌又は破砕工程によって調製される溶菌又は破砕液を、工程（Ｃ）において、前記工程（Ａ）で調製された混合液又は前記工程（Ｂ）で回収された濾液に代えて核酸増幅用試料液として使用してもよい。
　また、一般的には、集菌のために遠心分離工程を含むことがあるが、本発明の一実施形態では遠心分離工程を含まない。
　撹拌処理は前記工程（Ａ）で調製された混合液又は前記工程（Ｂ）で回収された濾液を撹拌して微生物を破砕する方法である。撹拌処理は、転倒混和、ボルテックスミキサー、撹拌機などにより行うことができる。
　超音波処理は、懸濁液前記工程（Ａ）で調製された混合液又は前記工程（Ｂ）で回収された濾液に超音波を当てることで、微生物を破砕する方法である。例えば、超音波ホモジナイザーは簡便に細胞壁を壊すことができ、微生物が破砕されやすい。処理時間は例えば１０秒間～２分間、好ましくは１０秒間～１分間であり、１回のみでも複数回（例えば２～６回、２～４回等）繰り返してもよい。
　加熱処理は、懸濁液前記工程（Ａ）で調製された混合液又は前記工程（Ｂ）で回収された濾液に熱を加えることで微生物を溶菌させる方法である。加熱温度は特に制限されないが、８０℃以上が好ましく、８５℃以上がより好ましく、９０℃以上がさらに好ましい。加熱時間は例えば１０秒間～５分間、好ましくは２０秒間～４分間である。
　酵素処理は、前記工程（Ａ）で調製された混合液又は前記工程（Ｂ）で回収された濾液に細胞壁溶解酵素等を加えて微生物を溶菌する方法である。使用する酵素は、目的の微生物を溶菌できる酵素であることを除き、制限されない。また、酵素反応は酵素の活性が大きくなる温度等の条件で行うことが好ましい。
　溶菌又は破砕工程では、一つ又は複数の処理を連続して行ってもよいし、可能であれば複数の処理を組み合わせて同時に行ってもよい。複数の処理を組み合わせることで、より溶菌又は破砕されやすくなるので有利な場合がある。
［工程Ｃ］
　工程（Ｃ）は、前記工程（Ａ）で調製された混合液中又は前記工程（Ｂ）で回収された濾液中で前記微生物の核酸を増幅する工程である。
　前記工程（Ａ）で調製された混合液及び／又は前記工程（Ｂ）で回収された濾液は、そのまま核酸増幅に使用できる。また、工程（Ｃ）では、核酸の増幅又は検出を有利にするために、該混合液及び／又は該濾液に各種の成分を添加してから核酸を増幅してもよい。なお、本明細書では、核酸増幅に供される該混合液及び／又は該濾液を「核酸増幅用試料液」と称することがある。
　核酸増幅工程に供される核酸増幅用試料液は核酸増幅の対象となる微生物の核酸源を含む。このため、核酸増幅用試料液には、微生物の種類、適用される核酸増幅方法などに応じた適切な試薬等（例えばＤＮＡポリメラーゼ、核酸プライマー対、核酸プローブ（例えばＱＰｒｏｂｅ、ＴａｑｍａｎＰｒｏｂｅ）等）が適宜添加されて核酸増幅に使用される。
　核酸増幅に用いられる核酸増幅方法は特に限定されず、ＰＣＲ法、ＳＤＡ法、ＩＣＡＮ法、等温増幅法（例えば、ＬＡＭＰ法）など種々の公知の方法を用いることができる。より好ましくはＰＣＲ法又は等温増幅法であり、より一層好ましくはリアルタイムＰＣＲ法又はＬＡＭＰ法である。核酸増幅の温度等の条件は核酸増幅の方法、検出対象微生物の種類などに応じて適宜設定すればよい。
　ＰＣＲ法又は等温増幅法の核酸増幅工程で使用されるＤＮＡポリメラーゼは特に限定されるものではないが、例えばＫＯＤ　ＤＮＡ　ポリメラーゼ、Ｐｆｕ　ＤＮＡ　ポリメラーゼ等のα型ＤＮＡポリメラーゼ；Ｔａｑ　ＤＮＡ　ポリメラーゼ、Ｔｔｈ　ＤＮＡ　ポリメラーゼ等のＰｏｌ　Ｉ型ＤＮＡポリメラーゼ等を用いることができ、特定の実施形態では、α型ＤＮＡポリメラーゼ又はファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを用いることが、正確性に優れる点で好ましい。α型ＤＮＡポリメラーゼとしては特に限定はされないが、ＫＯＤ　ＤＮＡ　ポリメラーゼ（東洋紡製）又はＰｆｕ　ＤＮＡ　ポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いることがさらに好ましい。
［検出工程］
　前記工程（Ｃ）において増幅された検出対象微生物の核酸は検出工程に供される。検出に用いられる方法は特に限定されず微生物検出に従来使用されている方法を適用でき、例えばアガロースゲル電気泳動法、ＳＳＣＰ法、ＲＦＬＰ法、インターカレーターを用いて核酸を検出する方法、核酸の塩基配列に特異的に結合する核酸プローブを用いて核酸を検出する方法などが挙げられる。より好ましくは核酸プローブを用いて核酸を検出する方法である。当該核酸プローブとしては、例えばＴａｑＭａｎプローブ、消光プローブ（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ Ｐｒｏｂｅ;Ｑプローブ）、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｅａｃｏｎなどが挙げられる。核酸プローブを核酸にハイブリダイズさせて融解曲線解析を行うことで検出対象微生物を検出できる。検出工程におけるその他の条件は検出対象微生物の種類、プローブの種類などを考慮して適宜設定すればよい。
［検出対象微生物］
　検出対象微生物については特に限定されず、例えば呼吸器感染症原因微生物、下痢症原因微生物、性感染症原因微生物、腸管感染症原因微生物などが挙げられるが、これらに限定されない。検出対象微生物は１種単独であってもよいし、２種以上の微生物の組み合わせでもよい。好ましくは呼吸器感染症原因微生物、下痢症原因微生物又は性感染症原因微生物である。
　呼吸器感染症原因微生物は、例えばインフルエンザウイルス（例えばＡ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルスなど）、ＲＳウイルス、アデノウイルス、Ａ群溶連菌、肺炎マイコプラズマ、百日咳菌、パラ百日咳菌、気管支敗血症菌、肺炎クラミジア、オウム病クラミジアなどであってよい。好ましい呼吸器感染症原因微生物は、肺炎マイコプラズマ又は百日咳菌である。
　下痢症原因微生物は、例えばノロウイルス、ロタウイルス、サポウイルス、下痢症アデノウイルスなどであってよい。好ましい下痢症原因微生物は、ノロウイルス又はロタウイルスである。
　性感染症原因微生物は、淋菌、クラミジア、マイコプラズマ、ウレアプラズマ、ＨＩＶ、ＨＰＶなどであってよい。好ましい性感染症原因微生物は、クラミジア又は淋菌である。
　マイコプラズマとしては、例えばマイコプラズマ・アルギニニ（Mycoplasma arginini）、マイコプラズマ・ブカーレ（Mycoplasma buccale）、マイコプラズマ・ファウシウム（Mycoplasma faucium）、マイコプラズマ・ホミニス（Mycoplasma hominis）、マイコプラズマ・オラーレ（Mycoplasma orale）、マイコプラズマ・サリバリウム（Mycoplasma salivarium）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Mycoplasma fermentans）、マイコプラズマ・リポフィラム（Mycoplasma lipophilum）、マイコプラズマ・プリマタム（Mycoplasma primatum）、マイコプラズマ・ハイオリニス（Mycoplasma hyorhinis）、マイコプラズマ・シノビアエ（Mycoplasma synoviae）、マイコプラズマ・ゲニタリウム（Mycoplasma genitalium）、マイコプラズマ・ニューモニエ（Mycoplasma pneumoniae；肺炎マイコプラズマ）、マイコプラズマ・ガリセプティカム（Mycoplasma gallisepticum）などが挙げられる。
［核酸増幅用試料液］
　本発明の一実施形態は、前記工程（Ａ）で調製された混合液及び／又は前記工程（Ｂ）で回収された濾液からなる、核酸増幅用試料液である。この試料液は前記の工程（Ａ）及び／又は工程（Ｂ）により調製される。
　また、本発明の別の実施形態は、生体試料又はその懸濁液若しくは溶解液を含有し、アルカリ濃度が１～５０ｍＭであるアルカリ性溶液からなる核酸増幅用試料液である。
　本発明の試料液はＰＣＲ法、等温増幅法などによる核酸の増幅に適している。すなわち、この試料液中で検出対象微生物の核酸を増幅できる。本発明では、工程（Ａ）において生体試料の懸濁液又は溶解液とアルカリ性溶液とを混合して調製された混合液或いは当該混合液を工程（Ｂ）において濾過して回収された濾液が核酸増幅用試料液として好ましい。核酸増幅用試料液における工程（Ａ）、工程（Ｂ）などの詳細は、生体試料中の微生物を検出する方法における工程（Ａ）、工程（Ｂ）などと同じである。
［核酸増幅用試料液の調製方法］
　本発明の一実施形態は、核酸増幅用試料液の調製方法であり、該方法は以下の工程（Ａ）：
（Ａ）生体試料又はその懸濁液若しくは溶解液とアルカリ性溶液とを混合してアルカリ濃度１～５０ｍＭの混合液を調製する工程、
を包含する。
　他の実施形態において、核酸増幅用試料液の調製方法は、前記の工程（Ａ）に加え、以下の工程（Ｂ）：
（Ｂ）前記工程（Ａ）で調製された混合液を濾過して濾液を回収する工程、
をさらに包含する。
　この調製方法は、核酸増幅用試料液の調製に適している。この調製方法における工程（Ａ）、工程（Ｂ）などの詳細は、生体試料中の微生物を検出する方法における工程（Ａ）、工程（Ｂ）などと同じである。
［生体試料保存、生体試料輸送、又は核酸増幅用塩類含有液］
　本発明の一実施形態は、アルカリ濃度が１～５０ｍＭである生体試料保存、生体試料輸送、又は核酸増幅用塩類含有液である。この液は、生体試料中の微生物を検出する方法において説明した前記塩類含有液に前記アルカリ性物質を必要に応じて添加してアルカリ濃度１～５０ｍＭとすることで調製できる。この液中に採取された生体試料を混合する、簡便な操作によって、生体試料中の核酸増幅及び検出を実施できる。この液の詳細には生体試料中の微生物を検出する方法における説明が適用できる。
［核酸増幅用キット］
　本発明の一実施形態は、アルカリ濃度が１～５０ｍＭである生体試料保存、生体試料輸送、又は核酸増幅用塩類含有液を含む核酸増幅用キットである。また、本発明の他の実施形態は、生体試料保存、生体試料輸送、又は核酸増幅用塩類含有液と、生体試料又はその懸濁液若しくは溶解液とを混合した場合にアルカリ濃度が１～５０ｍＭとなるように調整されたアルカリ性溶液を含む核酸増幅用キットである。これらのキットは、生体試料採取具（例えば、綿棒、スワブなど）をさらに含んでもよい。本キットは、生体試料の保存、核酸の増幅又は検出などに有利となる添加成分をさらに含んでもよい。本キットの詳細には生体試料中の微生物を検出する方法における説明が適用できる。
　以下に試験例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は試験例に限定されるものではない。試験例で使用した試薬は次のとおりである。
　ＫＯＤ　Ｍｉｘ：α型ポリメラーゼを含むＰＣＲ用の試薬
　ＳＣＴ　Ｍｉｘ：クラミジア・トラコマチス検出用のプライマー及びプローブを含む試薬
　ＭＰＮ　Ｍｉｘ：肺炎マイコプラズマ検出用のプライマー及びプローブを含む試薬
　ＩＣ　Ｍｉｘ：内部コントロール（ＩＣ）を含む試薬
〔試験例１：クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）の検出〕
（１－１）試料液の調製
　クラミジア・トラコマチス（検出対象微生物）からブーム法で抽出したＤＮＡ試料を１００コピー／μＬで含む生理食塩水を調製した。クラミジア・トラコマチス陰性者の子宮頸管粘液をスワブで採取し、この生理食塩水に懸濁し、疑似生体試料（１ｍｌ）とした。
　調製された懸濁液に、懸濁液と同体積量の１００ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液を添加し、ＤＮＡ試料、子宮頸管粘液、生理食塩水及び水酸化ナトリウム水溶液を含有する混合液（アルカリ濃度５０ｍＭ；ＣＴと称することがある）を調製した。これとは別に、前記ＤＮＡ試料を使用しないことを除いては同様の方法で、子宮頸管粘液、生理食塩水及び水酸化ナトリウム水溶液を含有する混合液（アルカリ濃度５０ｍＭ；陰性コントロール（ＮＣと称することがある））を調製した。
（１－２）核酸増幅及び検出
　調製されたＣＴ及びＮＴのそれぞれ一部を取り、そのまま核酸増幅用の試料液（３μＬ）とし、核酸増幅に供した。つまり、３μＬの試料液のそれぞれに核酸増幅及び検出用の下記試薬を添加し、下記条件でＰＣＲにて核酸増幅を行い、融解曲線解析により核酸検出を行った。核酸増幅及び融解曲線解析には東洋紡製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
（試薬）
　ＫＯＤ　Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）ＳＣＴ、東洋紡製）　３μＬ
　ＳＣＴ　Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）ＳＣＴ、東洋紡製）　４μＬ
（核酸増幅及び融解曲線解析条件）
　９４℃・２分、
　９７℃・１秒－６０℃・３秒－６３℃・６秒（サイクル数６０回）、
　９４℃・３０秒、
　３９℃・３０秒、
　３９℃～７５℃（昇温速度０．０９℃／秒）。
（１－３）結果
　融解曲線解析の結果を図１に示す。図１は、上記の条件で核酸増幅を行い、その後の温度上昇にともなう蛍光強度の変化を表したグラフである。グラフの横軸は温度（℃）、縦軸は蛍光シグナルの微分値（ｄ／ｄｔ）である。グラフ中、ＣＴ　ＤＮＡはクラミジア・トラコマチスＤＮＡを加えた試料液の解析結果を、ＮＣは陰性コントロール試料液の解析結果を示す。図１より明らかなように、ＣＴ　ＤＮＡではクラミジア・トラコマチスが検出され、ＮＣでは検出されなかった。
〔試験例２：クラミジア・トラコマチス陽性試料からの当該微生物検出の確認〕
　他の検出試験でクラミジア・トラコマチス陽性を示した対象者の子宮頸管粘液（生体試料）をスワブ（頭部がナイロン繊維からなるブラシ状綿棒（ＣＯＰＡＮ社製、フロックスワブＴＲ１００））で採取し、生理食塩水（１ｍｌ）に懸濁した。この懸濁液に、懸濁液と同体積量の１００ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液を添加し、子宮頸管粘液、生理食塩水及び水酸化ナトリウム水溶液を含有する混合液（アルカリ濃度５０ｍＭ）を調製した。この混合液の一部を取り、試験例１と同様にして核酸増幅及び検出を行った。結果を図２に示す。クラミジア・トラコマチスの検出が確認できた。
〔試験例３：肺炎マイコプラズマ（Mycoplasma pneumoniae）の検出〕
（３－１）試料液の調製
　肺炎マイコプラズマ（検出対象微生物）からブーム法で抽出したＤＮＡ試料を１０コピー／μＬで含む生理食塩水を調製した。肺炎マイコプラズマ陰性者の咽頭拭い液をスワブで採取し、これを前記生理食塩水に懸濁し、疑似生体試料（１ｍｌ）とした。
　調製された懸濁液に、懸濁液と同体積量の以下のいずれかの液体を添加し、混合液（５コピー／μＬ）を調製した。
　・生理食塩水
　・液体輸送培地（ＵＴＭ３６０Ｃ；コパン社製）
　・１０ｍＭの水酸化カリウム水溶液
　・１００ｍＭの水酸化カリウム水溶液
（３－２）核酸増幅及び検出
　調製された混合液の一部を取り、そのまま核酸増幅用の試料液（３μＬ）とし、試薬及び条件を下記に代えたほかは試験例１と同様にして、核酸増幅及び検出を行った。
（試薬）
　ＫＯＤ　Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）ＭＰＮ、東洋紡製）３μＬ
　ＭＰＮ　Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）ＭＰＮ、東洋紡製）３μＬ
　ＩＣ　Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）ＭＰＮ、東洋紡製）１μＬ
（核酸増幅及び融解曲線解析条件）
　９４℃・２分
　９７℃・１秒－５８℃・３秒－６３℃・６秒（サイクル数６０回）
　９４℃・３０秒
　３９℃・３０秒
　３９℃～７５℃（昇温速度０．０９℃／秒）
　肺炎マイコプラズマのカットオフ値：７．５
　内部コントロールのカットオフ値：１．５
（３－３）結果
　結果を表１に示す。表中、検出対象微生物の核酸を検出できた場合を「＋」、できなかった場合を「－」として示す。生体試料をアルカリ性溶液と混合することで肺炎マイコプラズマの核酸の増幅及び検出が可能であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
〔試験例４：肺炎マイコプラズマ（Mycoplasma pneumoniae）の検出〕
（４－１）試料液の調製
　肺炎マイコプラズマ陰性者の咽頭拭い液をスワブで採取し、１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に懸濁した。調製された懸濁液に、肺炎マイコプラズマ（検出対象微生物）からブーム法で抽出したＤＮＡ試料を含む１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を添加して５コピー／μＬのＤＮＡ濃度とし、疑似生体試料（３ｍｌ）とした。
　調製された液に、該液と同体積量の以下のいずれかの液体を添加し、混合液を調製した。
　・２０ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液
　・１００ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液
（４－２）核酸増幅及び検出
　調製された混合液の一部を取り、そのまま核酸増幅用の試料液（４μＬ）とし、試薬を下記に代えたほかは試験例３と同様にして、核酸増幅及び検出を行った。
（試薬）
　ＫＯＤ　Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）ＭＰＮ、東洋紡製）４μＬ
　ＭＰＮ　Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）ＭＰＮ、東洋紡製）３μＬ
　ＩＣ　Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）ＭＰＮ、東洋紡製）１．３μＬ
（４－３）結果
　結果を表２に示す。なお、サンプル数はそれぞれ８であり、ｎ＝８である。生体試料をアルカリ性溶液と混合することで肺炎マイコプラズマの核酸検出において偽陰性が抑制された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
〔試験例５：肺炎マイコプラズマ（Mycoplasma pneumoniae）の検出〕
（５－１）試料液の調製
　肺炎マイコプラズマ陰性者の咽頭拭い液をスワブで採取し、液体輸送培地（ＵＴＭ３６０Ｃ；コパン社製；１ｍｌ）に懸濁した。調製された懸濁液に、肺炎マイコプラズマ（検出対象微生物）からブーム法で抽出したＤＮＡ試料を含む１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を添加して１０コピー／μＬのＤＮＡ濃度とし、疑似生体試料（１．０１ｍｌ）とした。
　調製された液の２００μＬを取り、５０μＬの２００ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液と混合した（アルカリ濃度４０ｍＭ）。この混合液を次の核酸増幅工程に使用した。
　また、同様にして調製された混合液を焼結フィルター（ポリエチレン製、孔径２０μｍ）で濾過して回収された濾液も核酸増幅工程に使用した。
（５－２）核酸増幅及び検出
　調製された混合液、及び濾液のそれぞれ一部を取り、そのまま核酸増幅用の試料液（４μＬ）とし、試験例４と同様にして、核酸増幅及び検出を行った。
（５－３）結果
　結果を表３に示す。なお、サンプル数はそれぞれ４であり、ｎ＝２である。全サンプル検体のうち、検出対象微生物の核酸を検出できた検体の割合を百分率で示す。その結果、濾過して得られた試料液は検出率１００％であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
〔試験例６：肺炎マイコプラズマ（Mycoplasma pneumoniae）の検出〕
（６－１）試料液の調製
　肺炎マイコプラズマ陰性者の咽頭拭い液をスワブで採取し、１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５；１ｍｌ）に懸濁した。調製された懸濁液に、肺炎マイコプラズマ（検出対象微生物）からブーム法で抽出したＤＮＡ試料を含む１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を添加して２５コピー／μＬのＤＮＡ濃度とし、疑似生体試料（１．０１ｍｌ）とした。
　この試料を以下のいずれかの液で５倍希釈した。
　・滅菌水
　・液体輸送培地（ＵＴＭ３６０Ｃ；コパン社製）
　・液体輸送培地（ＵＴＭ３６０Ｃ；コパン社製）と２００ｍＭの水酸化カリウム水溶液との混合液（培地：ＫＯＨ液の体積比３：１）
　・液体輸送培地（ｅＳｗａｂ；コパン社製）と２００ｍＭの水酸化カリウム水溶液との混合液（培地：ＫＯＨ液の体積比３：１）
　希釈されたそれぞれの液を焼結フィルター（ポリエチレン製、孔径２０μｍ）で濾過して濾液を回収した。
（６－２）核酸増幅及び検出
　回収されたそれぞれの濾液の一部を取り、そのまま核酸増幅用の試料液（４μＬ）とし、試験例４と同様にして、ｎ＝４測定で核酸増幅及び検出を行った。
（６－３）結果
　結果を表４に示す。水酸化カリウム水溶液を使用した試料液の水酸化カリウム濃度は、４０ｍＭである。水酸化カリウム水溶液を使用した試料液では偽陰性を効果的に減らすことが可能であった。輸送培地と水酸化カリウム水溶液の混合液を用いることで良好に検出できた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
〔試験例７：百日咳菌（Bordetella pertussis）の検出〕
（７－１）試料液の調製
　百日咳菌陰性者の鼻腔拭い液をスワブで採取し、生理食塩水（１ｍＬ）に懸濁した。調製された懸濁液に、百日咳菌（検出対象微生物）からブーム法で抽出したＤＮＡ試料を含む１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を添加して１００コピー／μＬのＤＮＡ濃度とし、擬似生体試料（１．０１ｍＬ）とした。
　擬似生体試料の３５μＬを取り、１８０μＬの液体輸送培地（ｅＳｗａｂ；コパン社製）に懸濁した後、４５μＬの２００ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液を混合した。この液（水酸化ナトリウム濃度３６ｍＭ）を焼結フィルター（ポリエチレン製、孔径２０μｍ）で濾過して濾液を回収した。
　これとは別に、１８０μＬの液体輸送培地（ｅＳｗａｂ；コパン社製）と４５μＬの２００ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液を混合して混合液を調製し、この混合液に擬似生体試料の３５μＬを懸濁した。この液（水酸化ナトリウム濃度３６ｍＭ）を焼結フィルター（ポリエチレン製、孔径２０μｍ）で濾過して濾液を回収した。
（７－２）核酸増幅及び検出
　回収されたそれぞれの濾液の一部を取り、そのまま核酸増幅用の試料液とし、核酸増幅に供した（ｎ＝４）。つまり、４μＬの試料液のそれぞれに核酸増幅及び検出用の下記試薬を添加し、下記条件でＰＣＲにて核酸増幅を行い、融解曲線解析により核酸検出を行った。核酸増幅及び融解曲線解析には東洋紡製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
（試薬）
　ＫＯＤ　Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）　４μＬ
　０．５μＭ　ＢＯＲＦプライマー（配列番号１）
　１．５μＭ　ＢＯＲＲプライマー（配列番号２）
　０．３μＭ　ハイブリダイゼーションプローブ（３’末端をＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ標識；配列番号３）
　ＰＰＤ　Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
　ＩＣ　Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１．３μＬ
（核酸増幅及び融解曲線解析条件）
　９４℃・２分、
　９７℃・１秒－５８℃・３秒－６３℃・６秒（サイクル数６０回）、
　９４℃・３０秒、
　３９℃・３０秒、
　３９℃～７５℃（昇温速度０．０９℃／秒）。
　百日咳菌のカットオフ値：５
　内部コントロールのカットオフ値：１．５
（７－３）結果
　ＤＮＡを液体輸送培地に懸濁後にアルカリ性溶液（水酸化カリウム水溶液）を添加した場合も、液体輸送培地とアルカリ性溶液との混合液にＤＮＡを混合した場合も良好に百日咳菌を検出できた（ｎ＝４；検出率１００％）。
〔試験例８：肺炎マイコプラズマ（Mycoplasma pneumoniae）の検出〕
（８－１）試料液の調製
　肺炎マイコプラズマ陰性者の鼻腔拭い液をスワブで採取し、液体輸送培地（ｅＳｗａｂ；コパン社製；１ｍＬ）に懸濁した。調製された懸濁液の一部（３００μＬ）に、体積比３分の１量、つまり０．１ｍＬの２００ｍＭ又は２５０ｍＭ水酸化カリウム水溶液を混合した。混合液の水酸化カリウム濃度は５０ｍＭ又は６２．５ｍＭである。この混合液に、肺炎マイコプラズマ（検出対象微生物）からブーム法で抽出したＤＮＡ試料を含む１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を添加して１５コピー／μＬのＤＮＡ濃度とし、焼結フィルター（ポリエチレン製、孔径２０μｍ）で濾過して濾液を回収した。
（８－２）核酸増幅及び検出
　回収されたそれぞれの濾液の一部を取り、そのまま核酸増幅用の試料液（４μＬ）とし、試験例４と同様にして、核酸増幅及び検出を行った（ｎ＝８）。
（８－３）結果
　試料液における水酸化カリウム濃度が５０ｍＭであると検出対象微生物を確実に検出できたのに対し、同濃度が６２．５ｍＭであると検出結果が陰性となるケース（偽陰性）が発生した（検出率６２．５％）。このような結果から、混合液のアルカリ濃度が５０ｍＭより高くなると検出精度が低下することが明らかとなった。
〔試験例９：ノロウイルスの検出〕
（９－１）試料液の調製
　ノロウイルス陰性者の糞便を約１０％で滅菌水に懸濁した液０．０６ｍＬと、滅菌水０．２４ｍＬ或いは２、５、１０、２０、３０又は７５ｍＭの水酸化カリウム水溶液０．２４ｍＬとを各々混合した。この混合液に不活化されたノロウイルス（NATtrolTM norovirus GＩ positive contorol及びNATtrolTM norovirus GＩＩ positive contorol；３０００コピー／μＬ）を２μＬ添加して得られた液を焼結フィルター（ポリエチレン製、孔径２５０μｍ）で濾過して濾液を回収した。各濾液２００μＬに、上記いずれかの濃度の水酸化カリウム水溶液２００μＬを混合し、得られた混合液を遠心分離（１３，０００Ｇ，３ｍｉｎ）して上清を回収した。この上清中におけるアルカリ濃度はそれぞれ、０、１．８、４．５、９、１８、２７、６７．５ｍＭである。
（９－２）核酸増幅及び検出
　回収されたそれぞれの上清の一部を取り、そのまま核酸増幅用の試料液（４μＬ）とし、核酸増幅に供した。つまり、４μＬの試料液のそれぞれに核酸増幅及び検出用の下記試薬を添加し、下記条件でＰＣＲにて核酸増幅を行い、融解曲線解析により核酸検出を行った。核酸増幅及び融解曲線解析には東洋紡製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）テストベーシックを使用した。なお、東洋紡製ＲｅｖｅｒｔｒａＡｃｅは、逆転写酵素を含む試薬である。そして本試験例で用いた配列番号４～６で示されるプライマー及びプローブは、ＧＩ型ノロウイルスを検出するためのプライマー及びプローブのセットであり、配列番号７～９で示されるプライマー及びプローブは、ＧＩＩ型のノロウイルスを検出するためのプライマー及びプローブのセットである。
　（試薬）
　　０．２Ｕ／μＬのＲｅｖｅｒｔｒａＡｃｅ（東洋紡社）
　　５μＭの配列番号４で示されるプライマー
　　1．５μＭの配列番号５で示されるプライマー
　　０．５μＭの配列番号６で示されるオリゴヌクレオチドプローブ（３’末端をBODIPY-FLで標識）
又は、
　　０．２Ｕ／μＬのＲｅｖｅｒｔｒａＡｃｅ（東洋紡社）
　　１．５μＭの配列番号７で示されるプライマー
　　５μＭの配列番号８で示されるプライマー
　　０．４μＭの配列番号９で示されるオリゴヌクレオチドプローブ（３’末端をBODIPY-FLで標識）
（核酸増幅及び融解曲線解析条件）
　４２℃・２分、
　９７℃・１５秒、
　９７℃・１秒－５２℃・６秒－６８℃・３秒（サイクル数６０回）、
　９４℃・３０秒、
　３９℃・３０秒、
　４０℃～７５℃（昇温速度０．０９℃／秒）。
　Ｇ１又はＧ２のカットオフ値：１０
　内部コントロールのカットオフ値：１．５
（９－３）結果
　この結果を下記の表５に示す。ここで、Ｇ１型ノロウイルス、Ｇ２型ノロウイルスのどちらか1つのみ検出された場合は＋、どちらも検出された場合は、＋＋とした。本試験例のノロウイルス検出では、水酸化カリウム濃度が１．８～２７ｍＭである場合に検出対象微生物を検出でき、なかでも４．５～１８ｍＭの場合に良好な検出ができた。一方、同濃度が０又は６７．５ｍＭであると検出結果が陰性となるケースが発生した。この結果からも、所定のアルカリ濃度範囲となるように混合液を調製することが重要であることが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　考察
　これらの試験例によれば、生体試料を所定のアルカリ濃度でアルカリ性溶液に混合する、簡便な前処理で、核酸を単離することなく、核酸を検出できた。このため、適切な濃度のアルカリ性溶液は、核酸増幅又は検出が阻害される程度の変化を核酸に加えず、加えて、生体試料又は輸送培地由来の他の成分による核酸増幅阻害、核酸検出阻害、及び偽陰性を抑制する可能性が示唆された。
　本発明の前処理方法を用いることで、核酸の単離を要することなく、試料中に含まれる微生物由来の核酸を簡便に検出することができるため、臨床診断の分野に大きく貢献できる。

Claims (11)

  1. 生体試料中の微生物を検出する方法であって、
    以下の工程（Ａ）及び（Ｃ）：
    （Ａ）生体試料又はその懸濁液若しくは溶解液とアルカリ性溶液とを混合してアルカリ濃度１～５０ｍＭの混合液を調製する工程、及び
    （Ｃ）前記工程（Ａ）で調製された混合液中で前記微生物の核酸を増幅する工程、
    を包含する、方法。
  2. 前記混合液のアルカリ濃度が４～５０ｍＭである、請求項１に記載の方法。
  3. 前記生体試料又はその懸濁液若しくは溶解液が、口腔内擦過物、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、鼻咽頭拭い液、鼻腔吸引液、喀痰、気管支洗浄液、肺胞洗浄液、直腸拭い液、膣分泌物、子宮頸管粘液、便懸濁液、及び尿道擦過物からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記アルカリ性溶液が、水酸化カリウム水溶液、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化リチウム水溶液、水酸化マグネシウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液、水酸化バリウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、炭酸マグネシウム水溶液、及び炭酸カルシウム水溶液からなる群より選択される少なくとも１種の液である、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
  5. 前記生体試料の懸濁液又は溶解液が塩類含有液を含む、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
  6. 前記微生物が、呼吸器感染症、下痢症、又は性感染症の原因微生物である、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
  7. 前記原因微生物が、インフルエンザウイルス、ＲＳウイルス、アデノウイルス、Ａ群溶連菌、肺炎マイコプラズマ、百日咳菌、パラ百日咳菌、気管支敗血症菌、肺炎クラミジア、オウム病クラミジア、ノロウイルス、ロタウイルス、サポウイルス、下痢症アデノウイルス、淋菌、クラミジア、マイコプラズマ、ウレアプラズマ、ＨＩＶ及びＨＰＶからなる群より選択される少なくとも１種の微生物である、請求項６に記載の方法。
  8. 以下の工程（Ｂ）：
    （Ｂ）前記工程（Ａ）で調製された混合液を濾過して濾液を回収する工程、
    をさらに包含し、
    前記工程（Ｃ）において混合液に代えて前記工程（Ｂ）で回収された濾液を使用する、請求項１～７のいずれかに記載の方法。
  9. 請求項１～８のいずれかに記載の前記工程（Ａ）で調製された混合液及び／又は請求項８に記載の前記工程（Ｂ）で回収された濾液からなる、核酸増幅用試料液。
  10. 以下の工程（Ａ）：
    （Ａ）生体試料又はその懸濁液若しくは溶解液とアルカリ性溶液とを混合してアルカリ濃度１～５０ｍＭの混合液を調製する工程、
    を包含する、核酸増幅用試料液の調製方法。
  11. 以下の工程（Ｂ）：
    （Ｂ）前記工程（Ａ）で調製された混合液を濾過して濾液を回収する工程、
    をさらに包含する、請求項１０に記載の方法。
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