JPH03503476A

JPH03503476A - 消化方法

Info

Publication number: JPH03503476A
Application number: JP63506081A
Authority: JP
Inventors: スターク，ジョージ・ロバート; マッキンティレー，ピーター
Original assignee: インペリアル　キャンサー　リサーチ　テクノロジー，リミテッド
Priority date: 1987-07-22
Filing date: 1988-07-21
Publication date: 1991-08-08
Also published as: WO1989000577A1; EP0377573A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】りし」本発明は、ハイブリダイゼーションに適した形態のＤＮＡを含む溶液を提供するための、細胞または組織の消化方法に関するものである。

ハイブリダイゼーションに適した形態において細胞ＤＮＡを調製するための先行技術は、細胞の破壊、種々の巨大分子の酵素的消化、無用な細胞成分を除去するため、および多かれ少なかれ純粋となったＤＮＡ溶液を得るための沈澱、分離および溶解の工程を含む複雑な一連の工程に関連する。この処理において使用される試薬は、ハイブリダイゼーションを妨害することもあり、除去されなければならない。このような方法の典型的な例は、Ｂ１１ｎ、　Ｎおよび５ｔａｆｆｏｒｄ、Ｄ、Ｗ、　１９７６゜Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ＋　３　＋　２３０３に見出される。

Ｂｒａｎｄｓｎ＋ａおよびＭｉｌｌｅｒの、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｉ。

ＵＳＡ　；　７７（１１）、　６８５１−６８５５（１９８０）ならびにｗａｇｎｅｒらのＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌ（ｕｍａｎ　Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ　ｉｎ　ＣｅｒｖｉｃａｌＳｗａｂｓ　ｂｙ　Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ旦房注ｔｕ　）ｌｙｂｒｉｄｉ−ｓａｔｉｏｎ、　０ｂｓｔｅｔｒｉｃｓ　ａｎｄ　Ｇｙｎａｅｃｏｌｏｇｙ　　６４＋　７６７ −７７２（１９８４）は、非−分画細胞中のＤＮＡ検出方法を記述しているが、これらの方法は、１０Ｓｌｆａ胞より少ない単一コピー遺伝子の検出のためには、多分、感度が不充分である。Ｂｒａｎｄｓｍａｎ　とＭＨｌｅｒの方法は、ニトロセルロースフィルタ上で行なわれ、細胞の０．５ｆｉ水酸化ナトリウムによる周囲温度における７分間の処理および中性化緩衝液と溶媒による洗浄を含む。

このような方法は、細胞成分を部分的に消化し、ＤＮＡを放出するが、ハイブリダイゼーション試験を妨害しない為に充分な程度にまでは細胞巨大分子を破壊しない。

ここにおいて驚くべきことに、全細胞または組織を、強アルカリ性培地中にて、ＤＮＡを除きすべての巨大分子を実質的に分解するために充分な温度および充分な時間消化することによって、ハイブリダイゼーションにおいて使用するために適したＤＮＡ溶液を簡単に得ることができることを見出した。この技術は、新鮮な、固定および記録材料に適用されるであろう。

従って、本発明は、細胞または組織を、強アルカリ性水溶培地によりハイブリダイゼーションに適当な溶液、例えば清澄な溶液を得るために充分な時間および温度において処理することからなる、細胞または組織から細胞ＤＮＡの溶液を製造する方法を提供するものである。本発明により調製されたＤＮＡ溶液は、適当なフィルタ支持体への直接的な適用により、ハイブリダイゼーションの為に使用されてもよい。別法として、該溶液は、過剰の水酸イオンを中性化した後に、溶液において直接にハイブリダイゼーションにより、またはＤＮＡポリメラーゼ鎖反応による標的配列の酵素的増幅により　（Ｒ，に、５ａｉｋｉらのＮａｔｕｒｅ、　３２４　１６３（１９８６））または類似した方法により分析のために使用されてもよい。

この方法は、先行技術に比べて極めて単純であり、かつ迅速であるという利点を有する。分離工程を有さず、かつ、ＤＮＡの重大な損失が最小であることから、感度の増大においても有用であり、定量的である。

特定の理論に束縛されることを望むことな−く、ＤＮＡは、強アルカリ培地による消化に対し、他の細胞巨大分子より抵抗性であると考えられ、本発明は、このような消化の速度の差異を明らかにする。

本発明の方法は、通常は全（生または固定化）細胞または組織に対して適用されるであろうが、同様に破壊細胞にも適用可能である。処理の単純性および感度の利点は、水酸化物培地中の消化に先立って分離が行なわれた場合には失われる。

所望の消化を達成するために重要なものは水性培地中の水酸イオンの濃度であり、陽イオンの性質は、さほどに臨界的ではない。水酸イオンの濃度、反応の継続時間および反応が行なわれる温度は、都合よく変化させてもよいが、水酸イオンのより低い濃度は、より長時間および／またはより高温度を必要とし、より短時間は、より高濃度の水酸イオンおよび／またはより高温度を用いて達成され得、ならびにより低温度は、より高濃度の水酸イオンおよび／またはより長時間の反応の継続により可能となることが理解されるであろう。

実際的な意味において、反応温度は、凝固点より高く、かつ、反応混合物の沸点または好ましくはそれ以下でなければならない。好適には、該反応は約２０°Ｃないし約９５°Ｃ１より好ましくは約８０°Ｃにて行なわれる。

該水酸イオンの濃度は、好適には約０．１４ないし約１ムより好ましくは約０．２５Ｍないし約０．５Ｍおよび最も好ましくは約０．４豆である。このような濃度は、種々のアルカリ性または塩基性物質を用いて、好ましくはアルカリ金属またはアルカリ土類金属水酸化物、最も好ましくは水酸化ナトリウムを用いて達成される。

反応継続時間は、使用される温度上、および／または水酸イオンの濃度の制限を考慮して選択される。典型的には、継続時間は数分間ないし数時間の範囲、好ましくは５分間ないし１時間の範囲であろう。例えば、２分の１時間の程度、実際的には３０分間の継続時間が都合良いが、約１０分間の反応時間が最良であろう。

本発明の特に好ましい実施態様においては、細胞または組織は、０．４豆の水酸化ナトリウムを用い、約８０°Ｃの温度において、約２分の１時間消化される。

このことは、ハイブリダイゼーションのために適したＤＮＡを変性された形態で含む溶液を提供し、これはハイブリダイゼーションによる分析のためになおも好適である限定された範囲においてのみ、一般的に品位を下げられるであろう。

固定化およびパラフィン埋設組織試料等の記録材料については、消化の前に清浄化しておくことが必要であろう。従って、例えばパラフィン埋設試料については、パラフィンワックスをキシレンおよび次いでエタノール等の溶媒を用いて溶解してもよい。

本発明の方法により作成されるＤＮＡ溶液は、種々の技術によってハイブリダイゼーションの為に使用されてもよい。最も好適には、該ＤＮＡは、ニトロセルロース、または好ましくはＤＮＡが共有的に結合するナイロン膜等の基材に結合される（Ｒｅｅｄ、　Ｋ、Ｃ，およびＭａｎｎ＋　Ｄ、Ａ、＋（１９８６）　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ旦、　Ｒｅｓ、　１３．７２０７−７２２１）。

ＤＮＡを基材に結合した後、慣用のハイブリダイゼーション法が適用されてもよい。該ＤＮＡｔＪ製は単純な一工程法で材料の損失が最小であるため、極めて少量の試料により実施することができ、かつ、外因性細胞破壊物の妨害物が無いことは、わずか１０４個の細胞の試料中の細胞あたり単一コピーのＤＮＡ配列の検出を許容する。このことは、従って、例えば血液試料中のヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）　、肝炎ウィルス等のウィルス性ＤＮＡおよび細胞培養物中のマイコプラズマ汚染を以前可能であったよりも高い感度で検出することを可能とする。

従って、本発明は、細胞または組織を、ハイブリダイゼーションに適したＤＮＡ溶液を調製するために充分な時間および温度をもって強アルカリ性水性培地により処理し、およびハイブリダイゼーション基材を該溶液と、ＤＮＡの該基剤への結合を許容する条件下で接触せしめることからなる細胞ＤＮＡが結合した基材の製造方法をも提供するものである。

ＤＮＡのハイブリダイゼーション基材への結合を許容する条件は、周知である。

好ましくは、該基材は、ナイロン膜であり、この場合に結合が約０．４Ｍ水酸化ナトリウムの存在下で約２０°Ｃにて好適に誘導される。従って、本発明の特に好ましい実施態様においては、ＤＮＡ溶液は、０．４Ｍ水酸化ナトリウムによる８０°Ｃでの約１０分間の細胞の処理により作成され、該溶液は、約２０°Ｃに冷却後、ナイロンハイブリダイゼーション膜に直接に適用され、これは、ＤＮＡの結合後、中性化用緩衝液により洗浄される。次いで、ハイブリダイゼーションは、標準的技術に従って行なわれてもよい。

更に本発明は、細胞を、ハイブリダイゼーションに適したＤＮＡ溶液を調製するために充分な時間および温度をもって強アルカリ性水性培地により処理してＤＮＡの水性溶液を作成し、ならびに、得られたＤＮＡを、検出すべきＤＮＡ配列とハイブリッド化可能な核酸および検出可能な標識を有するプローブと、該検出すべきＤＮＡ配列と該プローブとの間のハイブリダイゼーションを許容する条件下で接触せしめることを含んでなる、細胞中に含有されることが予想されるＤＮＡ配列の検出方法を提供するものである。

特定の実施態様において、第１の工程において調製されるＤＮＡ溶液は、適当な酸または緩衝溶液を用いて中和され、そしてハイブリダイゼーションは、かくして得られた溶液中で導かれる。別の実施態様においては、ハイブリダイゼーション基材を、該溶液と、ＤＮＡが該基材に結合する条件下で接触させ、該基材を洗浄し、該基材をプローブの溶液と接触させることによりハイブリダイゼーションを誘導する。

ハイブリダイゼーション法において使用される条件は、周知であり、本方法は所望により高い、または低い厳密さくｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）をもって使用されてもよい。該プローブおよび標識は、いかなるプローブ／標識の組合せでもよく、多数のものが容易に入手可能である。

本発明の方法のひとつの利点は、外来性細胞破砕物によるハイブリダイゼーションの妨害が最小化または除去されていることである。該ハイブリダイゼーション基材は、ハイブリダイゼーションの前に洗浄してＤＮＡ以外の細胞由来の残渣を除去することができ、従って、該ＤＮＡ結合基材は、任意に第１のプローブの除去後に、更にハイブリダイゼーション実験に再使用する為に適している。

本発明は、添付した図面および以下の実施例を参照して記述されるが、実施例は、本発明の範囲を制限することを意図するものではない。

１　：　０．４Ｎ　ＮａＯＨでの８０°ＣにおりるＨｅｌ、ａＤＮＡたはＢＨＫ　　　の　　＼” ５０ｐｌＯＰＢＳ中のＨｅＬａＤＮＡ　１　ｕｇの試料を、０．５Ｍ　ＮａＯＨを用いて２５０μｆｆｉとし、最終ＮａＯＨ濃度を０．４１’１とした。種々の時間をもって８０℃に加熱した後、二検体試料をスロットプロット複写器を用いてシーンスクリーンプラス（Ｇｅｎｅｓｃｒｅｅｎ　Ｐｌｕｓ）ナイロン膜上に分別し、該フィルタを全）ＩｅＬａゲノムＤＮＡを用いてプローブにかけ、下記のようにオートラジオグラフにがけた。

２．５Ｘ１０’個のＢＨＫクローン９細胞の５０μ１ＯＰＢＳ中の試料を０．５　Ｍ　ＮａＯＨを用いて２５０ｕｆとし、最終ＮａＯＨ濃度を０．４ｈとした。

種々の時間をもって８０°Ｃに加熱した後、二検体試料を上述と同様にシーンスクリーンプラスに分別し、そして該フィルタを全ＢＨＫゲノムＤＮＡを用いてプローブにかけ、下記のようにオートラジオグラフにかけた。

２゛：アルカｉ　での　　ＲＮＡの　　Ｘ”サン力ロマイセス・セラヴイシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒａｖｉｓｉａｅ）由来の全ＲＮＡを、第１図において記述したのと同様にして加水分解し、１ｄｇ当量を各時点について二検体スロットに負荷した。

３ズ：　　　ＢＨＫ　　　　のＣＡＤ’　　−の５０μ２ＯＰＢＳ中に懸濁されたＢＨＫ細胞を、０．５Ｍ　ＮａＯＨを用いて２５０μＪ２とし、最終ＮａＯＨ濃度を０．４Ｍとした。８０°Ｃにて３０分間加熱後、二検体試料を上述と同様にシーンスクリーンプラス上に分別し、該フィルタを、下記のようにして無作為プライム化により標識付けされたｐＣＡＤ　ｅＤＮＡ　（６，５ｋｂ）（Ｓｈｉｇｅｓａｃｌａらの、ルは、釦旦０題、、　５．１７３５−１７４２．　（１９８５））を用いてプローブにかけた。

３し工［田’：　　　　　　　ＢＨＫ　　　　　　　の　　　　　　　　　こ　　゛し　　　　　ＵＣ１Ｌ旦凡人夏検盗５０μ２のＰＢＳ中に懸濁された２、５Ｘ１０’個のＢＨＫ細胞を０．５　Ｍ　ＮａＯＨを用いて２５０ｕｆとし、最終ＮａＯＨ濃度を０．４Ｍとした。８０° Ｃにて３０分間加熱後、二検体試料を上述と同様にシーンスクリーンプラス上に分別し、該フィルタを、下記のようにして無作為プライム化により標識付けしたｐＵｃ１３　ＤＮＡを用いてプローブにかけた。

５゛：感仇　　　のヒ　　　　ウィルス１６の５ｉＨａおよびＣ３３１細胞を、２．５Ｘ１０’個の細胞をもって５０μ２のＰＢＳ中に懸濁し、２５０ｕＡの０．４　Ｍ　ＮａＯＨ中において８０°Ｃにて３０分間加水分解し、次いで二検体試料を上述のようにシーンスクリーンプラス上に分別し、該フィルタを下記のようにして無作為プライム化により標識付けした肝ν１６ＤＮＡを用いてプローブにかけた。

実−施二桝遺」虹、ＬＬ略語：Ｉ　Ｘ５ＳＣ：１５０ｍＭ塩化ナトリウム、　１５ｍ４クエン酸ナトリウム、ｐＨ７，４゜Ｉ　Ｘ５ＳＰＥ：　１５０ｍＭ塩化ナトリウム、　１５ｍＭ　リン酸ナトリウム、ｐＨ７，４゜Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液：０．１％Ｆｉｃｏｌｌ　４００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、０．１％Ｂ　Ｓ　Ａ　（Ｓｉｇｍａ）、０．１％ポリビニルピロリドン（Ｓｉｇｍａ）。

ＳＤＳ　：　　ドデシル硫酸ナトリウムシーンスクリーンプラス膜は、ＮＥＮからのものである。すべての細胞はＤｕｌｂｅｃｃｏの修飾Ｅａｇｌｅｓ培地（Ｅ４）中で成育させた。ＣＣ５３１（Ａｕｅｒｓｐｅｒ、　Ｎ、のＪ、Ｎａｔ、ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ、　３２．１３５−１６４．１９６４）および５ｉＨａ　（Ｆｒｉｅｄｌ、　Ｆ、らのＰｒｏｃ、　Ｓｏｃ、　Ｅｘｐ、　Ｂｉｏｌ、　Ｍｅｄ、１３５．５４３−５４５．１９７０）は、ヒト頚部癌細胞であり、Ｌｉｏｎｅｌ　Ｃｒａｉｏｆｏｒｄ博士から供給を受けた。ＨｅＬａＤＮＡは、プロテナーゼに法（Ｍａｎｉａｔｉｓらの’Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）Ｉａｎｕａｌ’　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２））により調製した。ＢＨＫ細胞は幼シリアハムスター腎細胞である。ＤＮＡプローブ類は、標識ｄ　ＣＴ　Ｐ　（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、　Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して無作為プライム化（Ｆｅｉｎ−ｂｅｒｇおよびＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｅ招＋　６−１３（１９８３））により調製した。ＲＮＡプローブ類は、ＳＰ６プロモータ／ポリメラーゼ系（ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼは、Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃｈからのものである）および標識Ｕ　Ｔ　Ｐ　（４００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、　Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用し、ＭｅｌｔｏｎらのＮｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ、　Ｒｅｓ、　１２．７０３５−７０５６（１９８４）の方法に従って、ＤＮＡ断片をプラスミドｐｓＰ６４またはｐＳＰ６５にサブクローン化した後に調製した。全細胞アルカリ性加水分解およびプロッティングは、次のとおりに行なった：細胞を、通常のプラスチック皿上で融合するまで成育させるか、あるいは洗浄細胞ペレットとして使用した。良好なプローブを使用した単一コピー遺伝子の検出限界は、細胞数５Ｘ１０”個であった。

細胞を、ＰＢＳ中で２回洗浄し、使用前は一２０°Ｃにて保存した。典型的な実験は、ネジ式キャップ付エッペンドルフチューブ中で５０μ！のＰＢＳに再懸濁された細胞試料を含み、これに２００μ！の０．５　Ｍ　Ｎａ１ｌ（を加えて０．４　Ｍ　ＮａＯＨ中の細胞２５０μ！を与えた。この混合物は、８０’Ｃにて３０分間加熱される。

シーンスクリーンプラスフィルタまたはゼータプローブ（ｚｅｔａ、ｐｒｏｂｅ）ナイロン膜の小片および３　ＭＭ（Ｗｈａｔｍａｎ）の小片は、０．４Ｍ水酸化ナトリウム中で湿すことによリブロッティング装置用に調製し、スロットブロックを組込んだ。該清澄ＤＮＡ溶液の１００μ！の分別量を、該スロットプロッタの二検体スロット中に入れた。該溶液を、キャピラリ型スロットプロッタを使用する場合には、（キャピラリ作用または吸収剤タオルを信軌して）キャピラリ作用により流出させる。ウェルを０．４Ｍ　ＮａＯＨ溶液１００μ２によりすすぎ、該装置を分解し、中和するために該フィルタを２５０７の２ＸＳＳＣ中に５分間置いた。該フィルタをプロットし、使用前に室温にて少なくとも１時間乾燥させた。

該フィルタを２ｘｓｓｃにより均一に湿し、適当な容器または厚手のプラスチック袋中に入れた。

プレハイブリダイゼーションは、気泡を除いた後、５０％脱イオンホルムアミド、５　Ｘ５ＳＰＥ、　５　ＸＤｅｎｈａｒｄｔ、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍの切断および変性ニシンまたはサケ精子ＤＮＡ中で４２°Ｃにて少な（とも１５分間行なう。

該プローブを変性することが必要な場合、１　ｍｌのハイブリダイゼーション溶液をそれに添加し、該プローブを６５°Ｃにて１０分間加熱し、フィルタに加える前に氷上にて冷却する。

ハイブリダイゼーションは、標識変性プローブを１１０７ｄｐ／ｍ１まで含む同じ溶液中において、気泡を除いた後、４２°Ｃ（入手可能であれば振とう機上で）にて２−１６時間行なう。プローブを除去し、該フィルタを次のとおりに洗浄した：　　２５０ｄの２ｘｓｓｃ中で室温にて５−１５分間、２５０ｄの２ＸＳＳＣ１１％ＳＯＳ中で６５°Ｃにて３０分間、および最終的に、高度な厳密性が要求される場合には、２５０ｍｆの０．２ＸＳＳＣ１１％ＳＤＳ中で６５°Ｃにて３０分間。過剰な緩衝液は３ＭＭ紙に吸取るが、プローブを取り除き該プロットを再使用しようとする場合には、該フィルタを乾燥させない。オートラジオグラフィのため、該フィルタをプラスチックに包んだ。

該フィルタを再使用する場合には、プローブを１ｍＭＥＤＴＡ　ｐＨ８，ｏ、１％ＳＤＳ中で３０分間煮沸して除去した。

オートラジオグラフィは、増悪スクリーンを用い、線形応答を得るためにプレフラッシュしたコダックＸＡＲ５フィルムを使用して一７０″Ｃにて行なった。

級−来全細胞からプロッティングに適した形態でＤＮＡを調製するための便利なプロトコールを確立するために、標準的アルカリサチンプロット法において使用されていることから０．４　Ｍ　ＮａＯＨを選択し、時間および温度を予備実験において変化させた。８０゛Ｃにおける処理は、３０分間経過後、加水分解物の有意な揮発損失を伴わず、ＤＮＡハイブリダイゼーションシグナルの損失をほとんど生じないことが測定され、従って後の実験のためにこの温度を好適なものとして選択した。

純粋なりＮＡの安定性をＨｅＬａ　Ｄ　Ｎ　Ａを用いて試験し、また細胞加水分解を、数種の細胞系を用いて試験した（第１図）。全細胞中のＤＮＡの加水分解速度は、純粋なりＮＡと同じであるが、ナイロンへの結合の時間経過は、全細胞加水分解物においては他の巨大分子とＤＮＡとの結合についての競合のために初期においてはより低い。予期されたとおり、試験したすべての細胞型におけるＤＮＡの加水分解は、同様な動力学を示した。

加水分解の初期において、検出されるシグナルの多くはＲＮＡによるものであり、この理由からＲＮＡの加水分解の動力学を評価した。第２図は、酵母の全ＲＮＡを使用して０．４　Ｍ　ＮａＯＨ中において８０°Ｃ，５分間の加水分解後、ＲＮＡ−依存性シグナルが実質的に残留しないことを示している。従って、ＤＮＡ配列のコピー数の定量の目的において、フィルタへの核酸の固定後に含まれるＲＮＡ分解酵素工程の必要性を回避するためには、細胞を少なくとも５分間加水分解する必要がある。遺伝子コピー数の定量のために最初に適合された標準条件は、細胞を０．４　Ｍ　Ｎａ０）ｌ中で８０°Ｃにて３０分間加水分解することである。更に反応時間の検討後、最適継続時間１０分間が適合した。

哺乳類、ウィルスおよび細菌起源の遺伝子の検出感度を評価した。単一コピー遺伝子、ＣＡＤは、プレフラッシュしたコダックＸＡＲ５フィルムおよび２個の増悪スクリーンを使用して２４時間のフィルムの露光により、５Ｘ１０３ＢＨＫ細胞において検出可能であった。プローブ中のＣＡＤ　ｃＤＮＡＯ量に対応する６、５ｋｂの配列は、５Ｘ１０３細胞程度の少量において検出可能であり、標的ＤＮＡの３０ｆｇに相当していた。細胞中の興味ある増幅遺伝子は、実際的な限界は未だ決定していないが、１０４個の細胞より少量において確実に検出され得る。

哺乳類細胞により希釈されたプラスミド配列の検出についての感度の限界を、ＢＨＫクローン９．４細胞中に希釈されたｐＵｃ１３　ＤＮＡ　（スロットあたり１０４個細胞）を用いて測定した。２５ｆｇのプラスミドＤＮＡが、ＤＮＡプローブを使用して容易に検出され得、これはＣｈｕｒｃｈおよびＧ１１ｂｅｒｔのＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８１．１９９１−１９９５　（１９８３）に主張されたＲＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーションに関する３ｆｇの低い限界に接近している。

プローブの比活性またはハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を変更することにより、これは改善され得る。スロットあたり約５Ｘ１０’個の細胞を、担体が飽和する前に負荷し得る。従って、５Ｘ１０’個の細胞中に２５ｆｇより少な（存在するか、その配列を含まない１００個の細胞中の６ｋｂの単一コピー遺伝子を伴う約１個の細胞の配列を検出することが可能である。

単に正または負の結果のみを必要とするアッセイに対する非定量的使用について試験を行なった。ＨＰＶ１６の５０個のコピーを含む２種類のし）ｆｆ部癌細胞株、５ｉＨａ細胞を、該方法がウィルス性ＤＮＡの検出に有用であることを示すために使用した。負の対照としては、Ｃ３３１頚部癌細胞を使用した。しかしながら、これらの細胞は）ｌＰＶ１６を保持することが判明し、このことはこの感度の高いアッセイによってのみ検出され、以前には観察されなかった。ウィルスは、−夜の露光により１０Ｓ個の細胞において容易に検出できた。該方法は、当研究室において、培養細胞株のマイコプラズマ感染のアッセイについても使用されている。

捜−鼓この技術の主要な優位点は、純粋なりＮＡを最初に単離する必要を有さない核酸ハイブリダイゼーションによる細胞中のＤＮＡ配列の定量を可能とする点にある。ナイロン膜に対する高感度のハイブリダイゼーションと共に、このことは、極めて少数の細胞中の配列を検出する能力において、ならびに多数の試料を取扱う能力において顕著な改善をもたらす。他の用途を簡単に列挙すると、遺伝子増幅における遺伝子コピー数の分析、組織および細胞株におけるＤＮＡウィルスおよびブローレトロウィルス類の検出、細胞株内およびトランスジェニック（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）動物内のトランスフェクトＤＮＡならびにヒトにおける７’旦Ｘ　−［：　’；　’ｙ　ｌ−ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ム江江肛堕）およヒ家畜におけるバき之ヱ木旦入（旦硅並ｊ垣■諮）等のＤＮＡ−型血中寄生生物等の検出が含まれる。

１呈五１方−ユニホルマリン固定したパラフィン埋設組織の約１　ｃｌａの面積のものの単一の５ないし１０ミクロンの断片（あるいは、この組織の体積に近似した同様な数の断片）を切断し、エッベンドルフチューブに入れた。パラフィンワックスを、キシレン中、次いで無水エタノール中で洗浄することにより組織から除去した。次いで、該組織を０．４Ｍ水酸化ナトリウム中で１時間加水分解した。この時間は、この形態の試料については最適である。次いで、上澄をナイロン膜〔シーンスクリーンプラス〕上にスロットまたはドツトプロットマニホルドを通して滴下し、放射標識ＤＮＡを用いたプローブにかける前に０．４　Ｍ　ＮａＯＨを用いて洗浄し、２ＸＳＳＣ中にてすすいだ。ハイブリダイゼーション、洗浄およびオートラジオグラフィは、実施例１に従って実施した。

＃７にり解吋Ｗ（分）ｐＵｃ［５ＩＨａ　−― 国際調査報告ＩＩＩ彎・Ｃマ＋ａｌＩ＊鱈しＩＩ＾−ｍ＋＋＋Ｉｌｓ＊！−・ＰＣＴ／Ｃ８８８１００５ソ１−＝− 国際調査報告ＰＣＴ／ＣＢ８Ｂ１００５９１ら１頁の続き［相］ＩｎＬ　Ｃ１−’　　　　　　　識別記号　　庁内整理番号１１Ｊ先権主張６１９８８年６月１４日＠イキ＋Ｊス（Ｃ；Ｂ）＠８８１４０２９Ｓ　　明　者　　マツキンティレーアビータ−イギリス国、イーグリーン、ウェルづ特表平３−５０３４７６　（８）２０　ジエー　エヌ、ロンドン　ベスナルウイン　ストリート、シェブトン　ハウス、５３

Claims

【特許請求の範囲】１．細胞または組織を、強アルカリ性水性培地を用いてハイブリダイゼーションに適した溶液を形成する為に充分な時間および温度をもって処理することからなる細胞ＤＮＡ溶液の製造方法。２．該細胞または組織が、全、生、もしくは固定化細胞または組織、あるいは破壊細胞である請求項１に記載の方法。３．該細胞または組織を、約０．１Ｍから約１Ｍまでの水酸イオンを含む水性培地により処理する請求項１または２に記載の方法。４．該細胞または組織を、約０．４Ｍの水酸イオンを含む水性培地により処理する請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。５．該水性培地が、アルカリ金属水酸化物またはアルカリ土類金属水酸化物の溶液である請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。６．該水性培地が、水酸化ナトリウムの溶液である請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。７．２０℃から該反応混合物の沸点までの温度にて行なわれる請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。８．約８０℃の温度にて行なわれる請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。９．該処理を約５から約６０分間継続する請求項１ないし８のいずれか１項に記載の方法。１０．細胞または組織を、０．４Ｍの水酸化ナトリウム溶液を用い、約８０℃にて約１０分間処理することからなる細胞ＤＮＡ溶液の製造方法。１１（ａ）細胞または組織を請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の方法により処理し、（ｂ）ハイブリダイゼーション基材を、形成された該溶液と、ＤＮＡの該基材への結合を許容する条件下で接触させることを含んでなる細胞ＤＮＡが結合された基材の製造方法。１２．該溶液が、該基材との接触前に約２０℃まで冷却される請求項１１に記載の方法。１３（ａ）細胞または組織を請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の方法により処理し、（ｂ）製造された該ＤＮＡを、検出可能な標識を有し、検出すべき該ＤＮＡ配列とハイブリッド化可能な核酸プローブと、該検出すべきＤＮＡ配列と該プローブとのハイブリダイゼーションを許容する条件下で接触させることを含んでなる細胞中のＤＮＡ配列の検出方法。１４．工程（ａ）にて製造されるＤＮＡ溶液が、該ＤＮＡと該プローブとの接触前に中和される請求項１３に記載の方法。１５．工程（ａ）にて製造されるＤＮＡが、該ＤＮＡと該プローブとの接触前にハイブリダイゼーション基材に結合される請求項１３に記載の方法。