JP2003310265A - 核酸抽出法 - Google Patents
核酸抽出法Info
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- JP2003310265A JP2003310265A JP2002118733A JP2002118733A JP2003310265A JP 2003310265 A JP2003310265 A JP 2003310265A JP 2002118733 A JP2002118733 A JP 2002118733A JP 2002118733 A JP2002118733 A JP 2002118733A JP 2003310265 A JP2003310265 A JP 2003310265A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】核酸抽出法において、生体試料中の核酸を効率
的かつ簡易的に回収する。 【解決手段】生体試料から核酸を抽出する方法におい
て、生体試料とアルカリ溶液を混合して核酸を抽出し、
抽出された核酸を核酸増幅やハイブリダイゼーション等
の核酸分析に利用できる核酸抽出法と、そのアルカリ溶
液が核酸抽出用として利用される核酸抽出用試薬を提供
する。
的かつ簡易的に回収する。 【解決手段】生体試料から核酸を抽出する方法におい
て、生体試料とアルカリ溶液を混合して核酸を抽出し、
抽出された核酸を核酸増幅やハイブリダイゼーション等
の核酸分析に利用できる核酸抽出法と、そのアルカリ溶
液が核酸抽出用として利用される核酸抽出用試薬を提供
する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、生体試料から核酸を抽
出する方法に関するものである。
出する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術と問題点】核酸を含む生体試料から核酸を
抽出する代表的な方法としては、１）フェノールにより
夾雑物を変性させて沈殿させた後、水相中の核酸を回収
するフェノール-クロロホルム抽出法があり、簡易的な
方法としては、２）イオン交換水で希釈した試料を凍結
融解を繰り返し、アルカリ溶液を添加後、油液分離、加
熱処理を行うアルカリ溶解法、さらには３）細胞あるい
は組織を煮沸するだけの方法が知られている。
抽出する代表的な方法としては、１）フェノールにより
夾雑物を変性させて沈殿させた後、水相中の核酸を回収
するフェノール-クロロホルム抽出法があり、簡易的な
方法としては、２）イオン交換水で希釈した試料を凍結
融解を繰り返し、アルカリ溶液を添加後、油液分離、加
熱処理を行うアルカリ溶解法、さらには３）細胞あるい
は組織を煮沸するだけの方法が知られている。
【０００３】また、４）タンパク質分解酵素、還元剤、
界面活性剤、タンパク変性剤等からなる水溶液で遊離さ
せた核酸をアルコールで沈殿させ、遠心分離で回収する
方法（特開平７−２３６４９９）、５）陽イオン型界面
活性剤を加え、有機層に優先的に溶解する核酸−界面活
性剤複合体を無機塩溶液で沈殿させた後、遠心分離で回
収する方法（特許２７９１３６７号）、６）タンパク質
溶解剤で処理した水溶液に疎水性高分子化合物を含む有
機溶媒を加え、さらに高濃度の無機塩含有水溶液を入れ
て核酸を水層に移行させた後、水相にアルコールを加え
核酸を沈殿させ、遠心分離で回収する方法（特開平１１
−２５３１５８）が提案されている。さらに、最近は、
７）磁性を有するカチオン性固相担体で核酸を捕捉し、
磁気分離・洗浄後、アニオン性物質で核酸を分離する方
法(特開２００１−３５２９７９)等が提案されている。
このように、核酸を含む試料の種類あるいは抽出された
核酸の使用目的により、様々な工夫を凝らした核酸抽出
法が提案されている。
界面活性剤、タンパク変性剤等からなる水溶液で遊離さ
せた核酸をアルコールで沈殿させ、遠心分離で回収する
方法（特開平７−２３６４９９）、５）陽イオン型界面
活性剤を加え、有機層に優先的に溶解する核酸−界面活
性剤複合体を無機塩溶液で沈殿させた後、遠心分離で回
収する方法（特許２７９１３６７号）、６）タンパク質
溶解剤で処理した水溶液に疎水性高分子化合物を含む有
機溶媒を加え、さらに高濃度の無機塩含有水溶液を入れ
て核酸を水層に移行させた後、水相にアルコールを加え
核酸を沈殿させ、遠心分離で回収する方法（特開平１１
−２５３１５８）が提案されている。さらに、最近は、
７）磁性を有するカチオン性固相担体で核酸を捕捉し、
磁気分離・洗浄後、アニオン性物質で核酸を分離する方
法(特開２００１−３５２９７９)等が提案されている。
このように、核酸を含む試料の種類あるいは抽出された
核酸の使用目的により、様々な工夫を凝らした核酸抽出
法が提案されている。
【０００４】さらに、哺乳動物の胚細胞から核酸を抽出
する方法に関しては、８）マウスやウシの数個の胚盤胞
期胚にグアニジンチオシアネートとＮ−サルコシルを含
む抽出液を加えて、洗浄後精製する方法（特開平６−３
１９５４６）、９）ウシの胚の一部を滅菌水に入れ、煮
沸と氷冷処理を繰り返すことで抽出する方法（特開平７
−１８４６９４）がある。また、１０）特開平７−１３
２０８８では、ウシの胚細胞から核酸抽出においては、
具体的な方法は記載されていない。
する方法に関しては、８）マウスやウシの数個の胚盤胞
期胚にグアニジンチオシアネートとＮ−サルコシルを含
む抽出液を加えて、洗浄後精製する方法（特開平６−３
１９５４６）、９）ウシの胚の一部を滅菌水に入れ、煮
沸と氷冷処理を繰り返すことで抽出する方法（特開平７
−１８４６９４）がある。また、１０）特開平７−１３
２０８８では、ウシの胚細胞から核酸抽出においては、
具体的な方法は記載されていない。
【０００５】以上のように、胚細胞を含む生体試料から
核酸を抽出するいずれの場合においても、沈殿、分離、
洗浄、精製等の煩雑な操作が必要であり、簡易的と言わ
れるアルカリ溶解法や煮沸法でも凍結、煮沸等の温度制
御が要求される。さらには、人体に有害な有機溶媒の使
用及び廃棄、また核酸以外の狭雑物が多いあるいは核酸
含量が少ない場合は、コンタミネーションの危険性や各
使用試薬濃度の厳密な調製等の問題点がある。
核酸を抽出するいずれの場合においても、沈殿、分離、
洗浄、精製等の煩雑な操作が必要であり、簡易的と言わ
れるアルカリ溶解法や煮沸法でも凍結、煮沸等の温度制
御が要求される。さらには、人体に有害な有機溶媒の使
用及び廃棄、また核酸以外の狭雑物が多いあるいは核酸
含量が少ない場合は、コンタミネーションの危険性や各
使用試薬濃度の厳密な調製等の問題点がある。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、生体
試料に含まれる核酸を、従来のような煩雑な操作を必要
とせず、簡単に核酸を抽出することができる技術および
試薬を提供することである。
試料に含まれる核酸を、従来のような煩雑な操作を必要
とせず、簡単に核酸を抽出することができる技術および
試薬を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記問題
を解決するために鋭意研究を行った結果、生体試料と適
量のアルカリ溶液を混合することによって核酸が抽出さ
れ、その抽出液をそのまま核酸増幅やハイブリダイゼー
ション等の核酸分析に利用できることを見出し、本発明
を完成させた。
を解決するために鋭意研究を行った結果、生体試料と適
量のアルカリ溶液を混合することによって核酸が抽出さ
れ、その抽出液をそのまま核酸増幅やハイブリダイゼー
ション等の核酸分析に利用できることを見出し、本発明
を完成させた。
【０００８】すなわち、本発明は以下の構成からなる。
（１）核酸を含有する生体試料から該核酸を抽出する方
法において、生体試料とアルカリ溶液を混合することを
特徴とする核酸抽出法。 （２）核酸を含有する生体試料が、哺乳動物由来の胚細
胞であることを特徴とする（１）記載の核酸抽出法。 （３）アルカリ溶液が、ｐＨ９以上であることを特徴と
する（１）から（２）記載の核酸抽出法。 （４）アルカリ溶液が、アルカリ金属水酸化物及び／又
は塩基性有機化合物を成分とする水溶液であることを特
徴とする（３）記載の核酸抽出法。 （５）アルカリ金属水酸化物が、水酸化リチウム、水酸
化ナトリウム、及び水酸化カリウムから選ばれる少なく
とも１種類であることを特徴とする（４）記載の核酸抽
出法。 （６）アルカリ金属水酸化物の濃度が、１０〜２００ｍ
Ｍであることを特徴とする（５）記載の核酸抽出法。 （７）塩基性有機化合物が、メグルミン、エタノールア
ミン及びエチルアミンから選ばれる少なくとも１種類で
あることを特徴とする（４）記載の核酸抽出法。 （８）塩基性有機化合物の濃度が、１０ｍＭ〜２Ｍであ
ることを特徴とする（７）記載の核酸抽出法。 （９）（１）から（４）記載の核酸抽出法に使用する核
酸抽出試薬であって、アルカリ金属水酸化物及び／又は
塩基性有機化合物を成分とする核酸抽出試薬。 （１０）アルカリ金属水酸化物が水酸化リチウム、水酸
化ナトリウム、及び水酸化カリウムから選ばれる少なく
とも１種類である（９）記載の核酸抽出試薬。 （１１）アルカリ金属水酸化物の濃度が、１０〜２００
ｍＭであることを特徴とする（１０）記載の核酸抽出試
薬。 （１２）塩基性有機化合物が、メグルミン、エタノール
アミン及びエチルアミンから選ばれる少なくとも１種類
である（９）記載の核酸抽出試薬。 （１３）塩基性有機化合物の濃度が、１０ｍＭ〜２Ｍで
ある（１２）記載の核酸抽出試薬。 （１４）（１）記載の核酸抽出法で得られた核酸を使用
する核酸増幅法及び核酸分析法。 （１５）（９）から（１３）記載の核酸抽出試薬を含む
核酸増幅試薬キット、又は核酸分析用キット。以下、本
発明を詳細に説明する。
法において、生体試料とアルカリ溶液を混合することを
特徴とする核酸抽出法。 （２）核酸を含有する生体試料が、哺乳動物由来の胚細
胞であることを特徴とする（１）記載の核酸抽出法。 （３）アルカリ溶液が、ｐＨ９以上であることを特徴と
する（１）から（２）記載の核酸抽出法。 （４）アルカリ溶液が、アルカリ金属水酸化物及び／又
は塩基性有機化合物を成分とする水溶液であることを特
徴とする（３）記載の核酸抽出法。 （５）アルカリ金属水酸化物が、水酸化リチウム、水酸
化ナトリウム、及び水酸化カリウムから選ばれる少なく
とも１種類であることを特徴とする（４）記載の核酸抽
出法。 （６）アルカリ金属水酸化物の濃度が、１０〜２００ｍ
Ｍであることを特徴とする（５）記載の核酸抽出法。 （７）塩基性有機化合物が、メグルミン、エタノールア
ミン及びエチルアミンから選ばれる少なくとも１種類で
あることを特徴とする（４）記載の核酸抽出法。 （８）塩基性有機化合物の濃度が、１０ｍＭ〜２Ｍであ
ることを特徴とする（７）記載の核酸抽出法。 （９）（１）から（４）記載の核酸抽出法に使用する核
酸抽出試薬であって、アルカリ金属水酸化物及び／又は
塩基性有機化合物を成分とする核酸抽出試薬。 （１０）アルカリ金属水酸化物が水酸化リチウム、水酸
化ナトリウム、及び水酸化カリウムから選ばれる少なく
とも１種類である（９）記載の核酸抽出試薬。 （１１）アルカリ金属水酸化物の濃度が、１０〜２００
ｍＭであることを特徴とする（１０）記載の核酸抽出試
薬。 （１２）塩基性有機化合物が、メグルミン、エタノール
アミン及びエチルアミンから選ばれる少なくとも１種類
である（９）記載の核酸抽出試薬。 （１３）塩基性有機化合物の濃度が、１０ｍＭ〜２Ｍで
ある（１２）記載の核酸抽出試薬。 （１４）（１）記載の核酸抽出法で得られた核酸を使用
する核酸増幅法及び核酸分析法。 （１５）（９）から（１３）記載の核酸抽出試薬を含む
核酸増幅試薬キット、又は核酸分析用キット。以下、本
発明を詳細に説明する。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明における核酸抽出用の生体
試料としては、牛等の哺乳動物の受精卵からバイオプシ
ーで取り出された細胞の一部すなわち胚試料が使用され
る。
試料としては、牛等の哺乳動物の受精卵からバイオプシ
ーで取り出された細胞の一部すなわち胚試料が使用され
る。
【００１０】本発明で使用されるアルカリ溶液とは、生
体試料から効率良くかつ煩雑な操作なく抽出できれば、
特に限定されない。また、アルカリ溶液のｐＨは、抽出
後の核酸分析等に影響を及ぼさないｐＨであればよく、
ｐＨ９以上が好ましい。より好ましくはｐＨ１１以上、
さらに好ましくはｐＨ１２〜１３であればよい。
体試料から効率良くかつ煩雑な操作なく抽出できれば、
特に限定されない。また、アルカリ溶液のｐＨは、抽出
後の核酸分析等に影響を及ぼさないｐＨであればよく、
ｐＨ９以上が好ましい。より好ましくはｐＨ１１以上、
さらに好ましくはｐＨ１２〜１３であればよい。
【００１１】アルカリ溶液の組成物は、上記ｐＨを維持
するものであれば特に限定されない。アルカリ物質とし
ては、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリ
ウム等のアルカリ金属水酸化物単独、あるいはメグルミ
ン、エチレンアミン等の塩基性有機化合物単独でもよ
く、またリン酸緩衝剤、グッド緩衝剤等のｐＨ緩衝剤あ
るいは塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩類を含
んでいてもよい。アルカリ物質の濃度は、このｐＨの範
囲であれば容易に選択すること可能であるため、特に限
定されないが、例えば水酸化ナトリウムを単独で用いる
場合は、２００ｍＭ以下が好ましい。より好ましくは１
０〜１００ｍＭ、さらに好ましくは２０〜６０ｍＭであ
ればよい。また、メグルミンを単独で用いる場合は、２
Ｍ以下が好ましく、より好ましくは１０ｍＭ〜１Ｍ、さ
らに好ましくは２０〜１００ｍＭであればよい。
するものであれば特に限定されない。アルカリ物質とし
ては、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリ
ウム等のアルカリ金属水酸化物単独、あるいはメグルミ
ン、エチレンアミン等の塩基性有機化合物単独でもよ
く、またリン酸緩衝剤、グッド緩衝剤等のｐＨ緩衝剤あ
るいは塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩類を含
んでいてもよい。アルカリ物質の濃度は、このｐＨの範
囲であれば容易に選択すること可能であるため、特に限
定されないが、例えば水酸化ナトリウムを単独で用いる
場合は、２００ｍＭ以下が好ましい。より好ましくは１
０〜１００ｍＭ、さらに好ましくは２０〜６０ｍＭであ
ればよい。また、メグルミンを単独で用いる場合は、２
Ｍ以下が好ましく、より好ましくは１０ｍＭ〜１Ｍ、さ
らに好ましくは２０〜１００ｍＭであればよい。
【００１２】生体試料とアルカリ溶液を混合する操作
は、予め試料をサンプリングしておき、後からアルカリ
溶液を添加してもよく、またはアルカリ溶液に後から試
料を加えてもよい。
は、予め試料をサンプリングしておき、後からアルカリ
溶液を添加してもよく、またはアルカリ溶液に後から試
料を加えてもよい。
【００１３】また、本発明は、生体試料試料とアルカリ
溶液を混合させるという簡易的な操作により、核酸を抽
出させることを特徴としているが、場合により、混合し
た後に熱処理、あるいはプロテアーゼ等のタンパク質分
解酵素等で処理を行っても特に問題はない。
溶液を混合させるという簡易的な操作により、核酸を抽
出させることを特徴としているが、場合により、混合し
た後に熱処理、あるいはプロテアーゼ等のタンパク質分
解酵素等で処理を行っても特に問題はない。
【００１４】このようにして抽出された核酸試料は、標
的核酸を大量に増幅させることによって高感度な検査を
可能としたＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法等の核酸増幅法、ある
いは核酸の１次構造、すなわち塩基配列の相同性を調べ
たり、相同の塩基配列をもつ核酸を検出したりする方法
であるハイブリダイゼーション法等の公知の核酸分析に
利用できる。そして、本発明の効果は、これら核酸分析
法のうち、核酸増幅法において確認できた。
的核酸を大量に増幅させることによって高感度な検査を
可能としたＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法等の核酸増幅法、ある
いは核酸の１次構造、すなわち塩基配列の相同性を調べ
たり、相同の塩基配列をもつ核酸を検出したりする方法
であるハイブリダイゼーション法等の公知の核酸分析に
利用できる。そして、本発明の効果は、これら核酸分析
法のうち、核酸増幅法において確認できた。
【００１５】代表的な核酸増幅法としてはＰＣＲ法が挙
げられる。ＰＣＲ法は、標的配列の両端の一方のセンス
鎖を認識するオリゴヌクレオチドと、両端の他方のアン
チセンス鎖を認識するオリゴヌクレオチドを２種類のプ
ライマーとして用いた核酸増幅法である。相補的な２本
鎖核酸を熱処理により１本鎖核酸に変性させ、各々の１
本鎖核酸に３’側からプライマーを相補的に結合（アニ
ール）させ、引き続き、鋳型依存性核酸合成酵素により
結合したプライマーからＤＮＡ伸長させる。ここまでの
サイクルを繰り返し行うことによって、標的配列を指数
関数的に増幅することができ、その増幅産物は、電気泳
動法や蛍光性インターカレーター法を用いて検出でき
る。ただし、ＰＣＲ法は各段階で反応温度が異なるた
め、反応の段階に応じて反応温度を制御する必要があ
る。
げられる。ＰＣＲ法は、標的配列の両端の一方のセンス
鎖を認識するオリゴヌクレオチドと、両端の他方のアン
チセンス鎖を認識するオリゴヌクレオチドを２種類のプ
ライマーとして用いた核酸増幅法である。相補的な２本
鎖核酸を熱処理により１本鎖核酸に変性させ、各々の１
本鎖核酸に３’側からプライマーを相補的に結合（アニ
ール）させ、引き続き、鋳型依存性核酸合成酵素により
結合したプライマーからＤＮＡ伸長させる。ここまでの
サイクルを繰り返し行うことによって、標的配列を指数
関数的に増幅することができ、その増幅産物は、電気泳
動法や蛍光性インターカレーター法を用いて検出でき
る。ただし、ＰＣＲ法は各段階で反応温度が異なるた
め、反応の段階に応じて反応温度を制御する必要があ
る。
【００１６】一方、本発明者らが開発した核酸増幅法
に、ＬＡＭＰ（Loop-mediated isothermal AMPlificati
on of DNA）法と呼ばれるループ媒介等温増幅法がある
（WO 00/28082）。ＬＡＭＰ法は、鋳型となるヌクレオ
チドに自身の３'末端をアニールさせて相補鎖合成の起
点とするとともに、このとき形成されるループにアニー
ルするプライマーを組み合わせることにより、等温での
相補鎖合成反応を可能とした核酸増幅法である。また、
ＬＡＭＰ法では、プライマーの３'末端が常に試料に由
来する領域に対してアニールするために、塩基配列の相
補的結合によるチェック機構が繰り返し機能する。その
結果、特異性の高い遺伝子配列の増幅反応を可能とし
た。
に、ＬＡＭＰ（Loop-mediated isothermal AMPlificati
on of DNA）法と呼ばれるループ媒介等温増幅法がある
（WO 00/28082）。ＬＡＭＰ法は、鋳型となるヌクレオ
チドに自身の３'末端をアニールさせて相補鎖合成の起
点とするとともに、このとき形成されるループにアニー
ルするプライマーを組み合わせることにより、等温での
相補鎖合成反応を可能とした核酸増幅法である。また、
ＬＡＭＰ法では、プライマーの３'末端が常に試料に由
来する領域に対してアニールするために、塩基配列の相
補的結合によるチェック機構が繰り返し機能する。その
結果、特異性の高い遺伝子配列の増幅反応を可能とし
た。
【００１７】ＬＡＭＰ法は、計６領域の塩基配列を認識
する少なくとも４種類のオリゴヌクレオチドからなるプ
ライマー（インナープライマーＦ及びＲとアウタープラ
イマーＦ及びＲ）、鎖置換合成活性を有する鋳型依存性
核酸合成酵素、及び基質を用い、熱変性を必要とせず
に、終始等温で速やかに特異性の高い遺伝子増幅反応が
進行することを特徴とする。
する少なくとも４種類のオリゴヌクレオチドからなるプ
ライマー（インナープライマーＦ及びＲとアウタープラ
イマーＦ及びＲ）、鎖置換合成活性を有する鋳型依存性
核酸合成酵素、及び基質を用い、熱変性を必要とせず
に、終始等温で速やかに特異性の高い遺伝子増幅反応が
進行することを特徴とする。
【００１８】そして、ＬＡＭＰ法での核酸増幅は加速度
的かつ効率的に行なわれ、増幅産物もＰＣＲ法同様、電
気泳動法や蛍光性インターカレーター法（特開2001-242
169）を用いて検出できる。また、ＬＡＭＰ法では核酸
の合成により基質が大量に消費され、副生物であるピロ
リン酸が共存するマグネシウムと反応してピロリン酸マ
グネシウムとなり、肉眼でも確認できる程に白濁する。
したがって、この白濁を、反応終了後あるいは反応中の
濁度上昇を経時的に光学的に観察できる測定機器、例え
ば400nmの吸光度変化を通常の分光光度計を用いて確認
することも可能である（WO01/83817）。
的かつ効率的に行なわれ、増幅産物もＰＣＲ法同様、電
気泳動法や蛍光性インターカレーター法（特開2001-242
169）を用いて検出できる。また、ＬＡＭＰ法では核酸
の合成により基質が大量に消費され、副生物であるピロ
リン酸が共存するマグネシウムと反応してピロリン酸マ
グネシウムとなり、肉眼でも確認できる程に白濁する。
したがって、この白濁を、反応終了後あるいは反応中の
濁度上昇を経時的に光学的に観察できる測定機器、例え
ば400nmの吸光度変化を通常の分光光度計を用いて確認
することも可能である（WO01/83817）。
【００１９】本発明の効果は、２つの核酸増幅法すなわ
ちＰＣＲ法とＬＡＭＰ法を用いて、雄牛の特異的塩基配
列から設計された牛胚の性判別用プライマーを使用し
た、雄牛に特異的な性判別塩基配列の増幅を確認するこ
とで達成された。
ちＰＣＲ法とＬＡＭＰ法を用いて、雄牛の特異的塩基配
列から設計された牛胚の性判別用プライマーを使用し
た、雄牛に特異的な性判別塩基配列の増幅を確認するこ
とで達成された。
【００２０】以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説
明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるもので
はない。
明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるもので
はない。
【００２１】
【実施例】実施例１．ＰＣＲ法とＬＡＭＰ法での抽出法
の比較１．核酸増幅法で使用する試料及び試薬の調製 a)核酸抽出 雄牛由来の体細胞から樹立された培養細胞を用いて調製
した、培養細胞懸濁液5μＬに 30mＭ NaOH 溶液20μLを
加えてよく撹拌し、室温で 5分以上放置したものをアル
カリ抽出試料とした。また、対照抽出法として、簡易的
な方法である熱処理法を選定した。すなわち培養細胞懸
濁液 5μＬに10mＭ Tris-HCl（pH 8.0）緩衝液 20μLを
加え、95℃で5分間加温した後、直ちに氷中で急速冷却
した溶液を熱処理試料とした。また、何の処理も行わな
い培養細胞を陰性対照試料とした。
の比較１．核酸増幅法で使用する試料及び試薬の調製 a)核酸抽出 雄牛由来の体細胞から樹立された培養細胞を用いて調製
した、培養細胞懸濁液5μＬに 30mＭ NaOH 溶液20μLを
加えてよく撹拌し、室温で 5分以上放置したものをアル
カリ抽出試料とした。また、対照抽出法として、簡易的
な方法である熱処理法を選定した。すなわち培養細胞懸
濁液 5μＬに10mＭ Tris-HCl（pH 8.0）緩衝液 20μLを
加え、95℃で5分間加温した後、直ちに氷中で急速冷却
した溶液を熱処理試料とした。また、何の処理も行わな
い培養細胞を陰性対照試料とした。
【００２２】b)プライマーの合成
陰山が開発した雄牛由来の白血球ＤＮＡからクローニン
グを行った（特許第２６６４６４６号）、雌牛には存在
しない１５４２塩基対を有する雄牛の特異的塩基配列プ
ラスミドＤＮＡ（S4）から選ばれた塩基配列あるいはそ
れと相補的な配列から選ばれた塩基配列として、以下の
４種類のプライマーを選定した。プライマーは、ＤＮＡ
合成を専門に取り扱う機関に委託し、慣用された方法で
合成された。合成後の精製は、逆相カラムを用いた高速
液体クロマトグラフィーで行なわれた。 インナープライマーＦ：AGCTATGTGGCATGTGGGATCCTTCCCT
GGAAATGTTTAAGTG 配列番号１ インナープライマーＲ：TAAAGCCAGACACAGAGGTCACTTTTGC
TTCTCTTTCCTGCTTC 配列番号２ アウタープライマーＦ：AGCCAAGAAGTGGATGAATC
配列番号３ アウタープライマーＲ：GCAGTGCATTTCCTCCTC
配列番号４
グを行った（特許第２６６４６４６号）、雌牛には存在
しない１５４２塩基対を有する雄牛の特異的塩基配列プ
ラスミドＤＮＡ（S4）から選ばれた塩基配列あるいはそ
れと相補的な配列から選ばれた塩基配列として、以下の
４種類のプライマーを選定した。プライマーは、ＤＮＡ
合成を専門に取り扱う機関に委託し、慣用された方法で
合成された。合成後の精製は、逆相カラムを用いた高速
液体クロマトグラフィーで行なわれた。 インナープライマーＦ：AGCTATGTGGCATGTGGGATCCTTCCCT
GGAAATGTTTAAGTG 配列番号１ インナープライマーＲ：TAAAGCCAGACACAGAGGTCACTTTTGC
TTCTCTTTCCTGCTTC 配列番号２ アウタープライマーＦ：AGCCAAGAAGTGGATGAATC
配列番号３ アウタープライマーＲ：GCAGTGCATTTCCTCCTC
配列番号４
【００２３】C)ＰＣＲ法に用いる試薬組成及び濃度：
・ＰＣＲ反応用緩衝液（Takara）
・基質溶液：dATP、dCTP、dGTP、dTTPの混合溶液で、各
濃度が10mＭ ・プライマー１（アウタープライマーＦと同配列）（配
列番号３）：5pmol／μＬ水溶液 ・プライマー２（アウタープライマーＲと同配列）（配
列番号４）：5pmol／μＬ水溶液 ・ＤＮＡポリメラーゼ：5 U／μＬ rTaq ＤＮＡポリメ
ラーゼ（Takara）・滅菌水
濃度が10mＭ ・プライマー１（アウタープライマーＦと同配列）（配
列番号３）：5pmol／μＬ水溶液 ・プライマー２（アウタープライマーＲと同配列）（配
列番号４）：5pmol／μＬ水溶液 ・ＤＮＡポリメラーゼ：5 U／μＬ rTaq ＤＮＡポリメ
ラーゼ（Takara）・滅菌水
【００２４】d)ＬＡＭＰ法に用いる試薬組成及び濃度：
・10倍濃度の反応用緩衝液：200mＭ Tris-HCl（pH 8.
8）、100mＭ KCl、100mＭ(NH4)2SO4、80mＭ MgSO4、1%
Tween 20 ・基質溶液：dATP、dCTP、dGTP、dTTPの混合溶液で、各
濃度が25mＭ ・Betaine溶液：5Ｍ Betaine ・プライマー混合溶液 インナープライマーＦ（配列番号１）及びＲ（配列番号
２）：各1.6μＭ水溶液 アウタープライマーＦ（配列番号３）及びＲ（配列番号
４）：各0.2μＭ水溶液 ・ＤＮＡポリメラーゼ：8unit／μＬ Bst ＤＮＡポリ
メラーゼ（ラージフラグメント)（New England BioLab
社製） ・滅菌水
8）、100mＭ KCl、100mＭ(NH4)2SO4、80mＭ MgSO4、1%
Tween 20 ・基質溶液：dATP、dCTP、dGTP、dTTPの混合溶液で、各
濃度が25mＭ ・Betaine溶液：5Ｍ Betaine ・プライマー混合溶液 インナープライマーＦ（配列番号１）及びＲ（配列番号
２）：各1.6μＭ水溶液 アウタープライマーＦ（配列番号３）及びＲ（配列番号
４）：各0.2μＭ水溶液 ・ＤＮＡポリメラーゼ：8unit／μＬ Bst ＤＮＡポリ
メラーゼ（ラージフラグメント)（New England BioLab
社製） ・滅菌水
【００２５】２．核酸増幅法による反応
a)ＰＣＲ法による反応
10倍濃度のＰＣＲ反応用緩衝液 5μＬ、基質溶液 1μ
Ｌ、プライマー１及び２各 3μＬ及び rTaq ＤＮＡポリ
メラーゼ 0.5μＬに滅菌水 32.5μＬを加えて混合す
る。この混合溶液 45μＬを 0.2ｍLの専用チューブに分
注し、これに陰性対照試料（無処理）あるいは抽出試料
5μＬ（ 細胞数 200 cell 相当 ）添加したものを試料
溶液とし、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、熱変性
９５℃３０秒（１サイクル目２分）、アニーリング５５
℃３０秒、ポリメラーゼ伸長反応７２℃１分（最終サイ
クル５分）を１サイクルとして計４０サイクル行った。
反応装置は Biometra社製サーマルサイクラーを使用
し、反応終了後の増幅産物 5μＬについて 2%アガロー
スゲルで電気泳動を行った。
Ｌ、プライマー１及び２各 3μＬ及び rTaq ＤＮＡポリ
メラーゼ 0.5μＬに滅菌水 32.5μＬを加えて混合す
る。この混合溶液 45μＬを 0.2ｍLの専用チューブに分
注し、これに陰性対照試料（無処理）あるいは抽出試料
5μＬ（ 細胞数 200 cell 相当 ）添加したものを試料
溶液とし、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、熱変性
９５℃３０秒（１サイクル目２分）、アニーリング５５
℃３０秒、ポリメラーゼ伸長反応７２℃１分（最終サイ
クル５分）を１サイクルとして計４０サイクル行った。
反応装置は Biometra社製サーマルサイクラーを使用
し、反応終了後の増幅産物 5μＬについて 2%アガロー
スゲルで電気泳動を行った。
【００２６】b)ＬＡＭＰ法による反応
10倍濃度反応用緩衝液 2.5μＬ、基質溶液 1.4μＬ、Be
taine溶液 3μＬ、雄特異的プライマー混合溶液 6μＬ
及び BstＤＮＡポリメラーゼ 1μＬに滅菌水 6.1μＬを
加えて混合し、この混合溶液 20μＬを、0.2ｍLの専用
チューブに分注し、これに、陰性対照試料（無処理）あ
るいは核酸抽出試料（ 細胞数 5 cell分 ）を 5μＬ添
加したものを反応溶液とした。各反応試料 25μＬにつ
いて、65℃で１時間ＬＡＭＰ反応を行い、反応終了後の
増幅産物 5μＬについて 2%アガロースゲルで電気泳動
を行った。
taine溶液 3μＬ、雄特異的プライマー混合溶液 6μＬ
及び BstＤＮＡポリメラーゼ 1μＬに滅菌水 6.1μＬを
加えて混合し、この混合溶液 20μＬを、0.2ｍLの専用
チューブに分注し、これに、陰性対照試料（無処理）あ
るいは核酸抽出試料（ 細胞数 5 cell分 ）を 5μＬ添
加したものを反応溶液とした。各反応試料 25μＬにつ
いて、65℃で１時間ＬＡＭＰ反応を行い、反応終了後の
増幅産物 5μＬについて 2%アガロースゲルで電気泳動
を行った。
【００２７】３．ＰＣＲ法とＬＡＭＰ法での抽出法の比
較結果 各増幅法における増幅産物の電気泳動の結果を図１に示
す。その結果，ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法とも、アルカリ抽
出法は熱処理法と同様に増幅の確認ができた。また、Ｐ
ＣＲ法（図１の１及び３）が特定の一本のバンドを示す
のに対し、ＬＡＭＰ法（図１の４及び６）では、微量
（ＰＣＲ法の 200cell に対し ＬＡＭＰ法では 5 cell
）のＤＮＡから、色々なサイズのＤＮＡがラダー状に
大量に増幅することが確認できた。
較結果 各増幅法における増幅産物の電気泳動の結果を図１に示
す。その結果，ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法とも、アルカリ抽
出法は熱処理法と同様に増幅の確認ができた。また、Ｐ
ＣＲ法（図１の１及び３）が特定の一本のバンドを示す
のに対し、ＬＡＭＰ法（図１の４及び６）では、微量
（ＰＣＲ法の 200cell に対し ＬＡＭＰ法では 5 cell
）のＤＮＡから、色々なサイズのＤＮＡがラダー状に
大量に増幅することが確認できた。
【００２８】実施例２．ＬＡＭＰ法によるアルカリ抽出
法と熱処理法との牛の性判別結果の比較１．ＬＡＭＰ法で使用する試料及び試薬の調製 a)核酸抽出 牛受精卵から顕微操作で採取した細胞の一部を 2μL分
注し、30mＭ NaOH 12μLを加えて懸濁し、よく撹拌後、
室温で5分以上放置したものをアルカリ抽出試料とし
た。また、対照抽出法として、実施例１．同様に熱処理
法を選定した。すなわち同細胞の一部を 2μＬ分注し、
10mＭ Tris-HCl（pH 8.0）緩衝液 10μLを加え、95℃で
5分間加温した後、直ちに氷中で急速冷却した溶液を熱
処理試料とした。
法と熱処理法との牛の性判別結果の比較１．ＬＡＭＰ法で使用する試料及び試薬の調製 a)核酸抽出 牛受精卵から顕微操作で採取した細胞の一部を 2μL分
注し、30mＭ NaOH 12μLを加えて懸濁し、よく撹拌後、
室温で5分以上放置したものをアルカリ抽出試料とし
た。また、対照抽出法として、実施例１．同様に熱処理
法を選定した。すなわち同細胞の一部を 2μＬ分注し、
10mＭ Tris-HCl（pH 8.0）緩衝液 10μLを加え、95℃で
5分間加温した後、直ちに氷中で急速冷却した溶液を熱
処理試料とした。
【００２９】b)対照用試料
溶媒対照として、アルカリ抽出用には 30mＭ NaOH、熱
処理用には10mＭ Tris-HCl（pH 8.0）緩衝液をそのまま
用いた。また、陽性対照の鋳型ＤＮＡとして、既出のプ
ラスミドＤＮＡ（S4）の濃度が，その分子量から6,000
コピーになるように，10mＭ Tris-HCl（pH 8.0）緩衝液
で希釈して用いた。
処理用には10mＭ Tris-HCl（pH 8.0）緩衝液をそのまま
用いた。また、陽性対照の鋳型ＤＮＡとして、既出のプ
ラスミドＤＮＡ（S4）の濃度が，その分子量から6,000
コピーになるように，10mＭ Tris-HCl（pH 8.0）緩衝液
で希釈して用いた。
【００３０】C)プライマーの合成：実施例１．に準ず
る。
る。
【００３１】d)ＬＡＭＰ法に用いる試薬組成及び濃度：
実施例１．に準ずる。
実施例１．に準ずる。
【００３２】２．ＬＡＭＰ法による反応
10倍濃度反応用緩衝液 2.5μＬ、基質溶液 1.4μＬ、Be
taine溶液 3μＬ、雄特異的プライマー混合溶液 6μＬ
及びＤＮＡポリメラーゼ 1μＬに滅菌水 6.1μＬを加え
て混合する。この混合溶液 20μＬを、0.2ｍLの専用チ
ューブに分注する。これに、溶媒対照、陽性対照あるい
は核酸抽出試料を 5μＬ添加したものを反応溶液とし、
各反応試料 25μＬについて、65℃でＬＡＭＰ反応を行
い、分光光度計を用いて、30分後の波長650nmでの吸光
度（濁度）を測定した。なお、雌雄判別におけるカット
オフ値（吸光度0.1）は、30分後の吸光度を測定し、反
応溶液のバックグランドを測定した時の収束値の吸光度
（0.05）と、ＰＣＲ法で雄と判別された牛胚試料並びに
陽性対照が確実に越える吸光度領域（0.1）を考慮し設
定した。すなわち、吸光度0.1以上のものを陽性すなわ
ち雄、0.1未満のものを陰性すなわち雌とした。
taine溶液 3μＬ、雄特異的プライマー混合溶液 6μＬ
及びＤＮＡポリメラーゼ 1μＬに滅菌水 6.1μＬを加え
て混合する。この混合溶液 20μＬを、0.2ｍLの専用チ
ューブに分注する。これに、溶媒対照、陽性対照あるい
は核酸抽出試料を 5μＬ添加したものを反応溶液とし、
各反応試料 25μＬについて、65℃でＬＡＭＰ反応を行
い、分光光度計を用いて、30分後の波長650nmでの吸光
度（濁度）を測定した。なお、雌雄判別におけるカット
オフ値（吸光度0.1）は、30分後の吸光度を測定し、反
応溶液のバックグランドを測定した時の収束値の吸光度
（0.05）と、ＰＣＲ法で雄と判別された牛胚試料並びに
陽性対照が確実に越える吸光度領域（0.1）を考慮し設
定した。すなわち、吸光度0.1以上のものを陽性すなわ
ち雄、0.1未満のものを陰性すなわち雌とした。
【００３３】３．ＬＡＭＰ法を使用したアルカリ抽出法
と熱処理との牛の性判別結果の比較 ＬＡＭＰ法における各抽出法での牛の性判別結果の比較
を表１に示す。その結果，各抽出法での差は見られず、
牛胚試料（No.1〜6）では、アルカリ抽出法と熱処理法
のいずれにおいても、No.1、3、5は吸光度0.1以上すな
わち雄、No.2、4、6は吸光度が0.1未満すなわち雌と判
別された。
と熱処理との牛の性判別結果の比較 ＬＡＭＰ法における各抽出法での牛の性判別結果の比較
を表１に示す。その結果，各抽出法での差は見られず、
牛胚試料（No.1〜6）では、アルカリ抽出法と熱処理法
のいずれにおいても、No.1、3、5は吸光度0.1以上すな
わち雄、No.2、4、6は吸光度が0.1未満すなわち雌と判
別された。
【表１】
【００３４】実施例３．アルカリ抽出法によるＬＡＭＰ
法と、ＰＣＲ法との牛の性判別結果の比較１．アルカリ抽出法によるＬＡＭＰ法での性判別結果 実施例２．に準ずる。
法と、ＰＣＲ法との牛の性判別結果の比較１．アルカリ抽出法によるＬＡＭＰ法での性判別結果 実施例２．に準ずる。
【００３５】２．ＰＣＲ法による性判別結果
雄牛の特異的塩基配列プラスミドＤＮＡ（S4）から、陰
山がＰＣＲ用に開発した性判別プライマーを使用して、
得られた性判別結果である。ＰＣＲ反応は、実施例１．
に準じて実施され、反応終了後の増幅産物は，電気泳動
の結果より、雌及び雄に特異的なバンドが検出され、雌
雄を判別する際の確定的診断法である染色体解析と１０
０％の一致率を示すことが確認されている。
山がＰＣＲ用に開発した性判別プライマーを使用して、
得られた性判別結果である。ＰＣＲ反応は、実施例１．
に準じて実施され、反応終了後の増幅産物は，電気泳動
の結果より、雌及び雄に特異的なバンドが検出され、雌
雄を判別する際の確定的診断法である染色体解析と１０
０％の一致率を示すことが確認されている。
【００３６】３．アルカリ抽出法によるＬＡＭＰ法と、
ＰＣＲ法との牛の性判別結果の比較 表２に、各核酸増幅法での牛の判別結果の比較を示す．
その結果，アルカリ抽出によるＬＡＭＰ法では、牛胚試
料 No.2、4、6が雌、No.7、8、9が雄と判別され、ＰＣ
Ｒ法の判別結果との一致率は１００％であった。
ＰＣＲ法との牛の性判別結果の比較 表２に、各核酸増幅法での牛の判別結果の比較を示す．
その結果，アルカリ抽出によるＬＡＭＰ法では、牛胚試
料 No.2、4、6が雌、No.7、8、9が雄と判別され、ＰＣ
Ｒ法の判別結果との一致率は１００％であった。
【表２】
【００３７】
【発明の効果】従来の核酸抽出法は、沈殿、分離、洗
浄、精製等の操作あるいは凍結、煮沸等の温度制御が必
要で煩雑であり、有害な有機溶媒の使用及び廃棄、さら
には核酸以外の狭雑物が多い場合あるいは核酸含量が少
ない場合は、汚染（コンタミネーション）の危険性や各
使用試薬濃度の厳密な調製等の問題点がある。本発明
は、アルカリ溶液を用いて生体試料中の核酸を効率的か
つ簡易的に抽出することができ、抽出された核酸を核酸
増幅やハイブリダイゼーション等の核酸分析に利用でき
る核酸抽出法及び核酸抽出試薬の提供である。
浄、精製等の操作あるいは凍結、煮沸等の温度制御が必
要で煩雑であり、有害な有機溶媒の使用及び廃棄、さら
には核酸以外の狭雑物が多い場合あるいは核酸含量が少
ない場合は、汚染（コンタミネーション）の危険性や各
使用試薬濃度の厳密な調製等の問題点がある。本発明
は、アルカリ溶液を用いて生体試料中の核酸を効率的か
つ簡易的に抽出することができ、抽出された核酸を核酸
増幅やハイブリダイゼーション等の核酸分析に利用でき
る核酸抽出法及び核酸抽出試薬の提供である。
【００３８】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Eiken Kagaku Kabushiki Kaisya
<120> Method for extraction of nucleic acid
<130> P-000468
<160> 4
<210> 1
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<400> 1
agctatgtgg catgtgggat ccttccctgg aaatgtttaa gtg 43
<210> 2
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<400> 2
taaagccaga cacagaggtc acttttgctt ctctttcctg cttc 44
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<400> 3
agccaagaag tggatgaatc 20
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<400> 4
gcagtgcatt tcctcctc 18
【図１】ＰＣＲ法とＬＡＭＰ法での抽出法の比較結果
Ｍ：100塩基毎のサイズマーカー、１：ＰＣＲ法−熱処
理、２：ＰＣＲ法−陰性対照、３：ＰＣＲ法−アルカリ
抽出、４：ＬＡＭＰ法−熱処理、５：ＬＡＭＰ法−陰性
対照、６：ＬＡＭＰ法−アルカリ抽出
理、２：ＰＣＲ法−陰性対照、３：ＰＣＲ法−アルカリ
抽出、４：ＬＡＭＰ法−熱処理、５：ＬＡＭＰ法−陰性
対照、６：ＬＡＭＰ法−アルカリ抽出
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 森 安義
栃木県大田原市下石上1381−３ 栄研化学
株式会社那須工場内
Ｆターム(参考） 2G045 BA13 BB03 BB51 CB01 DA12
DA13 DA14 FB05 GC10
4B024 AA11 CA01 CA11 HA11
4B063 QA20 QQ08 QQ43 QS16 QX01
Claims (15)
- 【請求項１】核酸を含有する生体試料から該核酸を抽出
する方法において、生体試料とアルカリ溶液を混合する
ことを特徴とする核酸抽出法。 - 【請求項２】核酸を含有する生体試料が、哺乳動物由来
の胚細胞であることを特徴とする請求項１記載の核酸抽
出法。 - 【請求項３】アルカリ溶液が、ｐＨ９以上であることを
特徴とする請求項１から２記載の核酸抽出法。 - 【請求項４】アルカリ溶液が、アルカリ金属水酸化物及
び／又は塩基性有機化合物を成分とする水溶液であるこ
とを特徴とする請求項３記載の核酸抽出法。 - 【請求項５】アルカリ金属水酸化物が、水酸化リチウ
ム、水酸化ナトリウム、及び水酸化カリウムから選ばれ
る少なくとも１種類であることを特徴とする請求項４記
載の核酸抽出法。 - 【請求項６】アルカリ金属水酸化物の濃度が、１０〜２
００ｍＭであることを特徴とする請求項５記載の核酸抽
出法。 - 【請求項７】塩基性有機化合物が、メグルミン、エタノ
ールアミン及びエチルアミンから選ばれる少なくとも１
種類であることを特徴とする請求項４記載の核酸抽出
法。 - 【請求項８】塩基性有機化合物の濃度が、１０ｍＭ〜２
Ｍであることを特徴とする請求項７記載の核酸抽出法。 - 【請求項９】請求項１から４記載の核酸抽出法に使用す
る核酸抽出試薬であって、アルカリ金属水酸化物及び／
又は塩基性有機化合物を成分とする核酸抽出試薬。 - 【請求項１０】アルカリ金属水酸化物が、水酸化リチウ
ム、水酸化ナトリウム、及び水酸化カリウムから選ばれ
る少なくとも１種類である請求項９記載の核酸抽出試
薬。 - 【請求項１１】アルカリ金属水酸化物の濃度が、１０〜
２００ｍＭであることを特徴とする請求項１０記載の核
酸抽出試薬。 - 【請求項１２】塩基性有機化合物が、メグルミン、エタ
ノールアミン及びエチルアミンから選ばれる少なくとも
１種類である請求項９記載の核酸抽出試薬。 - 【請求項１３】塩基性有機化合物の濃度が、１０ｍＭ〜
２Ｍである請求項１２記載の核酸抽出試薬。 - 【請求項１４】請求項１記載の核酸抽出法で得られた核
酸を使用する核酸増幅法及び核酸分析法。 - 【請求項１５】請求項９から１３記載の核酸抽出試薬を
含む核酸増幅試薬キット、または核酸分析用キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002118733A JP2003310265A (ja) | 2002-04-22 | 2002-04-22 | 核酸抽出法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002118733A JP2003310265A (ja) | 2002-04-22 | 2002-04-22 | 核酸抽出法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003310265A true JP2003310265A (ja) | 2003-11-05 |
Family
ID=29535489
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002118733A Pending JP2003310265A (ja) | 2002-04-22 | 2002-04-22 | 核酸抽出法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003310265A (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006101818A (ja) * | 2004-10-08 | 2006-04-20 | Eiken Chem Co Ltd | 核酸増幅反応における阻害を回避する方法 |
| JP2011050400A (ja) * | 2010-12-17 | 2011-03-17 | Eiken Chemical Co Ltd | 核酸増幅反応における阻害を回避する方法 |
| US8697400B2 (en) | 2008-12-17 | 2014-04-15 | Shimadzu Corporation | Method for amplification of DNA from blood sample and DNA amplification kit therefor |
| WO2020075695A1 (ja) * | 2018-10-09 | 2020-04-16 | 公益財団法人筑波メディカルセンター | 微生物の検出方法 |
| JP2020058271A (ja) * | 2018-10-09 | 2020-04-16 | 公益財団法人筑波メディカルセンター | 微生物の検出方法 |
| JP2020068725A (ja) * | 2018-10-31 | 2020-05-07 | 公益財団法人筑波メディカルセンター | 試料の前処理方法 |
-
2002
- 2002-04-22 JP JP2002118733A patent/JP2003310265A/ja active Pending
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006101818A (ja) * | 2004-10-08 | 2006-04-20 | Eiken Chem Co Ltd | 核酸増幅反応における阻害を回避する方法 |
| JP4674073B2 (ja) * | 2004-10-08 | 2011-04-20 | 栄研化学株式会社 | 核酸増幅反応における阻害を回避する方法 |
| US8697400B2 (en) | 2008-12-17 | 2014-04-15 | Shimadzu Corporation | Method for amplification of DNA from blood sample and DNA amplification kit therefor |
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| WO2020075695A1 (ja) * | 2018-10-09 | 2020-04-16 | 公益財団法人筑波メディカルセンター | 微生物の検出方法 |
| JP2020058271A (ja) * | 2018-10-09 | 2020-04-16 | 公益財団法人筑波メディカルセンター | 微生物の検出方法 |
| JP7329912B2 (ja) | 2018-10-09 | 2023-08-21 | 公益財団法人筑波メディカルセンター | 微生物の検出方法 |
| JP2020068725A (ja) * | 2018-10-31 | 2020-05-07 | 公益財団法人筑波メディカルセンター | 試料の前処理方法 |
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