CN110257477A

CN110257477A - 核酸液相提取及检测方法

Info

Publication number: CN110257477A
Application number: CN201910524277.7A
Authority: CN
Inventors: 钟镐镐
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2011-04-27
Filing date: 2011-04-27
Publication date: 2019-09-20
Also published as: DE112011105191T5; US20140087388A1; DE112011105191B4; US9487820B2; CN103492567A; CA2834113C; WO2012145861A1; JP2014512190A; CA2834113A1

Abstract

本发明涉及核酸液相提取及检测方法。本发明公开了一种从生物样品中提取核酸分析物溶液的方法，包括：将生物样品置于加热容器中；任选地，向该生物样品加入溶解介质；对该生物样品进行高压加热；任选地，对该生物样品进行离心；和获取包含所述核酸分析物的液体。本发明也公开了一种检测核酸分析物的方法，该核酸分析物是用上述提取方法获得的。

Description

核酸液相提取及检测方法

本申请是国际申请日为2011年4月27日的国际申请PCT/CN2011/000746进入中国、申请号为201180049214.2的题为“核酸液相提取及检测方法”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及核酸的提取和检测，更具体地说，本发明涉及利用高压加热从生物样品中液相释放核酸和对其进行检测的方法。

背景技术

基因检测在现代临床医学中的作用越来越重要。基因检测的第一步是从固定或未固定的生物样本中提取核酸。

传统的化学方法，通常先用酶消化细胞或组织，再经有机溶剂抽提，使被分离的核酸经过酒精或异丙醇沉淀，收集并浓缩于水中。整个过程需2-3天。特别是石蜡包埋组织，还需多次二甲苯脱蜡、高浓度蛋白酶长时间消化等步骤，低时效的劣势更为突出。

近些年，国内外研发了多种固相核酸提取试剂盒，原理大多为裂解细胞，释放核酸，核酸吸附于某些颗粒的表面，再进行沉淀或洗脱。这些方法相对缩短了核酸提取的时间，但距离低廉高效、简单易行的目标依旧太远。

随着基因检测不断上升的地位，核酸提取技术与涌现出的基因检测新方法、新技术相比较，一直没有得到同步的创新、突破。能否获得合格的核酸样本，已成为基因检测成败的关键。特别是高度依赖于石蜡包埋组织的基因型分析或诊断。

发明内容

本发明提供了一种从生物样品中提取核酸分析物溶液的方法，包括以下步骤：将该生物样品置于加热容器中；任选地，向该生物样品中加入溶解介质；对该生物样品进行高压加热；任选地，对该生物样品进行离心；和获取包含所述核酸分析物的液体。

本发明的方法特别适用于从福尔马林固定的石蜡包埋组织中提取核酸。该方法通过一步高压加热，同时完成石蜡包埋组织的脱蜡、裂解组织细胞、解交联等，直至液相释放核酸。

本发明还提供了一种对生物样品中的核酸分析物进行检测的方法，包括按照本发明的方法获得所述核酸分析物的溶液，以及对所述核酸分析物进行检测，优选通过聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)进行检测。

本发明的方法操作简单(例如目前常用的核酸提取试剂盒需要20多个步骤)，速度快，成本低，不需要特殊的设备和试剂，简单的操作方法易于掌握，大大地提高了核酸溶液制备和检测的效率。

附图说明

图1A显示了K-ras exon 2的12密码子点突变(G12S)，5’→3’；图1B显示了同一标本的反向测序结果(3’→5’)。箭头表明突变位点。

图2显示了人大肠癌K-ras exon 2的12、13密码子的正常序列。

图3显示了白色念珠菌荧光PCR的结果。其中纵坐标为荧光量，横坐标为PCR循环数，两条曲线为阳性结果。

图4显示了人血清HBV病毒575、241、192bp HBV特异片段的电泳结果。

图5显示的是一幅电泳图，其中：[1]人胃肠道间质瘤石蜡包埋组织；[2]人大肠癌石蜡包埋组织；[3]100bp标记物；[4]人新鲜甲状腺癌组织；[5]培养细胞。

图6显示的是饱和蒸汽温度与压力关系对照表。

具体实施方式

本发明一方面提供了一种从生物样品中提取核酸分析物溶液的方法，包括以下步骤：将该生物样品置于加热容器中；任选地，向该生物样品中加入溶解介质；对该生物样品进行高压加热；任选地，对该生物样品进行离心；和获取包含所述核酸分析物的液体。所述核酸分析物溶液通常可直接用于后续的检测，例如PCR。这大大简化了核酸提取的步骤。

本文所用的术语“核酸分析物”是指待分析的目标核酸分子，包括DNA和RNA。当样品中待分析的核酸为看家基因时，由于其拷贝数较多，因此所获得的溶液中核酸的含量也较高，便于后续的PCR检测。当待分析的核酸拷贝数较低时，可以在采用本发明的方法获得核酸溶液后再进一步进行浓缩，例如通过色谱柱进行浓缩，以提高核酸浓度。

本文所用的术语“任选”表示“可有可无”或“非必需”的含义。“任选地，对样品进行离心”是指可以进行离心，也可以不离心，这可以由本领域技术人员根据情况进行选择。

本文所用的术语“高压”是指比标准大气压更高的压力。例如，在标准大气条件下海平面的气压为一个大气压，大约相当于101.3kPa(千帕)。

本发明中的“高压”可以通过本领域常用的高压设备来实现，例如高压锅、电压力锅、高压蒸汽灭菌锅等。

最常用的高压设备是蒸汽加热设备。本领域公知，高压加热时的温度通常会比常压加热时的温度更高。本领域有多种方法用于估算高压加热时压力与温度之间的对应关系(参见例如图6所示的“饱和蒸汽温度与压力关系对照表”)。可以根据这些方法粗略估算高压加热时的大致温度。例如，蒸汽压力锅的压力为250kPa时，温度大约为127℃。

本发明中的“高压”通常在105kPa以上，例如110kPa、115kPa。常用的蒸汽压力锅的压力上限大约为350kPa。

本发明方法中所采用的“高压”可以在105-350kPa之间，例如110-320kPa，特别是115-250kPa，优选120-200kPa。

不同的生物样本对温度和压力的耐受力是不同的。本领域技术人员可以根据待测样本的性质，通过常规试验优化出最适当的高压温度及时间。例如，当样品易于破碎时(例如肿瘤或病毒样本)，加热压力和时间可以适当降低；当生物样品难于破碎(例如白色念珠菌)时，加热压力和时间可以适当增加。

根据压力和样品的不同，加热时间可以在5-210分钟范围内，例如10-90分钟，特别常用的加热时间是20-60分钟。本领域技术人员可以理解，当加热压力较低并且样品中的核酸难于释放出来时，可以采用更长的加热时间，例如4小时。

例如，当对石蜡包埋组织切片样品进行处理时，典型的加热条件可以是：压力140-170kPa，维持25-45分钟。当对白色念珠菌样品进行处理时，典型的加热条件可以是：压力140-170kPa，维持45-60分钟。

本文所用的术语“生物样品”是指含有核酸的待测生物材料样品，包括来自动物、植物、微生物或人体的生物样品。生物样品可以是新鲜的、冰冻的或固定的各种样品，例如人体组织活检样品、肿瘤样品、福尔马林固定的石蜡包埋组织样品，以及细菌、真菌、病毒、支原体等微生物样品。常见的新鲜的生物样品包括：生物流体样品，例如血液、血清、组织液、尿液、大便、痰液、脑脊液、唾液、眼泪、乳头吸出液和培养的细胞；肿瘤样品，例如从受试者体内取出的病变组织等。典型的固定的生物样品是10％福尔马林固定的石蜡包埋组织。本发明方法特别适合于石蜡包埋组织样品，包括较长期的留档蜡块及切片。

在对生物样品进行加热时，可以将样品放入加热容器中。常用的加热容器包括离心管和试管，例如容量为1.5mL或10mL的带盖离心管，优选在管盖上扎孔，以防高压加热过程中气体膨胀，崩开管盖。也可以将样品放入纱布封口的锥形瓶或烧瓶中，或其它透气的容器中加热。

在高压加热前，视情况，可以向生物样品中加入任选的溶解介质。例如，在对石蜡包埋组织切片进行加热前，可以加入0.1M NaOH溶液例如200μL或1ml，使样本完全浸入液体中。常用的溶解介质包括水、DEPC处理水、生理盐水、碱溶液和缓冲液等。常用的缓冲液包括Tris-盐酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液、甘氨酸-盐酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸钠缓冲溶液和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液等。本领域技术人员可以理解，在生物样品自身已经含有大量液体时(例如脑脊液)，也可以不再额外加入溶解介质。

在高压加热步骤之后，可以任选地对样品进行离心，获取上清液。核酸通常溶于上清液中，可以直接用于后续操作，例如PCR。本领域技术人员可以理解，离心步骤并不是必需的，当核酸溶液不离心对后续实验(例如PCR)没有影响时，也可以不必离心。

在本发明的一个优选实施方式中，包括以下步骤：任选地，将离心管的管盖扎孔；将石蜡包埋组织切片(例如l-2片)置于离心管中，加入纯水或碱溶液(例如NaOH溶液)，使样品浸入液体中；在140-200kPa的压力下加热所述样品25-45分钟；和对所述样品进行离心，获取上清液。可以直接将该上清液用于后续的PCR反应。

本发明另一方面提供了一种对生物样品中的核酸分析物进行检测的方法，包括按照上文所述的方法获得所述核酸分析物的溶液，以及对所述核酸分析物进行检测。在一个特别优选的实施方式中，所述检测通过聚合酶链反应(PCR)进行。

下面将结合实施例对本发明作进一步说明。提供这些实施例是为了帮助理解本发明，不得解释为对本发明的限制。

实施例1人大肠癌K-ras 2exon基因检测

1.准备离心管：用酒精灯烧红的注射器细针头，将1.5ml离心管管盖扎一微小细孔，以防高压过程中气体膨胀，崩开管盖。

2.取材：取人大肠癌石蜡包埋组织切片(5-10μm)1-2片置1.5ml离心管中，加入0.1M NaOH(pH11)溶液500μl，使样本完全浸入液体中。

3.高压：高压加热30-45分钟(利仁牌电压力锅，型号DYG-5B，压力为140-170kPa，限压压力200kPa。

4.PCR：高压完毕后，立即离心(13,000rpm，5分钟)，不需冷却。取上清液1-2μl(或1∶10稀释的上清液1-2μl)，按照试剂说明书进行PCR。

5.电泳：电泳检测PCR产物。如产物量过少，可进行巢式PCR。

6.PCR产物测序结果：见图1A和图1B。

试验结果表明，通过高压加热方法，从石蜡包埋组织样品中获得的核酸样品，完全可以满足PCR产物直接测序的要求。

实施例2人大肠癌(激光微切割肿瘤细胞)K-ras exon2基因检测

取激光微切割的石蜡切片肿瘤细胞若干，按照实施例1的方法进行操作(如细胞很少，减少溶液量)，取上清液用于PCR。PCR产物测序结果见图2。

以上结果表明，本发明的高压加热方法，适用于从微量的细胞中，获得质量可靠的核酸用于基因型分析和诊断。提高微量细胞或组织(例如细针穿刺肿瘤组织)基因型分析和诊断的成功率，对于失去手术机会的肿瘤患者，选择治疗药物，意义重大。

实施例3石蜡包埋组织结核分枝杆菌核酸扩增检测

取疑似结核杆菌感染的石蜡包埋组织切片1-2片，按照与实施例1基本相同的方法进行操作，其中加热时间为20-30分钟，取上清液用于Real time PCR(PCR预混液中增加荧光探针)。

结果表明，用高压加热法，可以从石蜡包埋组织中得到质量合格的细菌DNA，协助临床做出结核分枝杆菌感染的鉴别诊断。

实施例4白色念珠菌基因检测

取疑似白色念珠菌感染的的人体病灶拭子，洗脱于200μl 0.1M NaOH(pH11)溶液中，按照与实施例1基本相同的方法进行操作，其中加热时间为35-50分钟，取上清液用于荧光PCR(PCR预混液中增加荧光探针)。结果见图3。

白色念珠菌属真菌族，大于细菌几倍至几十倍。细胞壁很厚，实验时一般的方法较难裂解包被，因此影响了PCR的灵敏性。近年，真菌感染明显上升，与滥用抗生素引起菌群失调和应用激素、抗癌药物导致免疫低下有关。致病真菌含多种类型，它们的耐药性不同，目前从基因序列区分真菌类型更为准确。

以上结果表明，对于细胞壁较厚且坚的真菌，高压加热法尽显其优越性，可轻松得到质量可靠的核酸，以区分基因序列的方式，直接鉴别真菌的种类。

实施例5人血清HBV病毒检测

取5μl HBV患者的血清，与200μl 0.1M NaOH(pH11)溶液混匀，按照与实施例1基本相同的方法进行操作，其中加热时间为25-40分钟，取上清液用于PCR。电泳结果见图4。

以上结果表明，使用高压加热法，可以从微量血清中得到质量可靠的病毒核酸，用于临床检测。

实施例6新鲜组织、石蜡包埋组织、培养细胞的mRNA检测

1、取材：

a.人胃肠道间质瘤石蜡切片(5-10μm)1-2片

b.人大肠癌石蜡包埋组织(5-10μm)1-2片

c.人新鲜甲状腺癌组织(1/2米粒大小)剪碎

d.培养细胞

将样本分别放入1.5ml离心管中，加入0.1M NaOH(pH11)溶液适量，使样本完全浸入液体中，混匀。

2、高压：加热时间30-45分钟(压力为140-170kPa，限压压力为200kPa。

3、反转录：(提取RNA时，需及时高压并提前准备好反转录预混液)当高压结束，瞬时离心后，打开离心管管盖，迅速将2-5μl上清液进行反转录，以防RNA快速降解。

反转录预混液：1X反转录buffer，0.2mM dNTPs，0.2μg随及引物(或0.2μM特异引物)，50U M-mLV反转录酶，0.01M DTT，加DEPC水至20μl。

42℃60分钟，95℃5分钟。

4、PCR：反转录完毕(可瞬时离心)，取上清液1-5μl，加入至PCR预混液中(含1X PCRbuffer，0.2mMdNTPs，0.4-0.5μM特异引物，加水至25-50μl。)PCR：94℃1分30秒，(94℃30秒55℃30秒72℃20秒，30-35个循环)72℃2分钟。

5、GAPDH mRNA RT-PCR结果(电泳图-226bp)见图5。

以上结果表明，高压加热法，可同时获得质量可靠的DNA与RNA，并可同时用于检测特异的基因序列(DNA)和生物性标志物(mRNA)。

实施例7不同的温度和高压对生物样品释放核酸的影响

1、按照与实施例1相同的方法准备离心管

2、取材

(1)HBV患者血清5μl，与100μ1 0.1M NaOH(pH11)溶液混匀。

(2)HSV患者拭子，洗脱于100μl 0.1M NaOH(pH11)溶液中。

(3)肿瘤患者石蜡包埋组织切片7μM，2片，加入500μl 0.1M NaOH(pH11)溶液。

3、高压锅类型

(1)利仁牌电压力锅，型号DYG-5B

(2)台湾CIRRUS CR-3560CG-M高压灭菌锅

4、方法

分别用利仁牌电压力锅(型号DYG-5B)和台湾CIRRUS CR-3560CG-M高压灭菌锅，以不同的温度，不同的时间，对以上三种生物样本进行高压处理。

5、结果

见表1。实验结果表明，不同的生物样本，对高压时间和压力的耐受力存在差异。

表1

注：“PCR结果”一栏中的“+”表示阳性，“-”表示阴性。

Claims

1.从生物样品中提取核酸分析物溶液的方法，包括以下步骤：

将该生物样品置于加热容器中；

任选地，向该生物样品中加入溶解介质；

对该生物样品进行高压加热；

任选地，对该生物样品进行离心；和

获取包含所述核酸分析物的液体。

2.权利要求1的方法，其中所述的高压为105-350kPa，例如110-320kPa，特别是115-250kPa，优选120-200kPa。

3.以上权利要求之任一项的方法，其中所述高压加热步骤的持续时间为5-210分钟，例如10-90分钟，特别是20-60分钟。

4.以上权利要求之任一项的方法，其中所述生物样品选自由组织活检样品、细胞样品、肿瘤样品和生物流体样品构成的组。

5.以上权利要求之任一项的方法，其中所述生物流体样品选自由血液、血清、组织液、尿液、大便、痰液、脑脊液、唾液、眼泪和乳头吸出液构成的组。

6.以上权利要求之任一项的方法，其中所述生物样品为石蜡包埋组织。

7.以上权利要求之任一项的方法，其中所述溶解介质选自由水、DEPC处理水、生理盐水、碱溶液和缓冲液构成的组。

8.以上权利要求之任一项的方法，包括以下步骤：

任选地，将离心管的管盖扎孔；

将石蜡包埋组织切片置于离心管中，加入纯水或碱溶液，使样品浸入液体中；

在140-200kPa的压力下加热所述样品25-45分钟；和

对所述样品进行离心，获取上清液。

9.对生物样品中的核酸分析物进行检测的方法，包括：

按照以上权利要求之任一项的方法获得所述核酸分析物的溶液；和

对所述核酸分析物进行检测。

10.权利要求9的方法，其中所述检测通过聚合酶链反应进行。