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BEREICH DER ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung betrifft Extraktion und Nachweis von Nukleinsäuren, und insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Freisetzung von Nukleinsäuren in der Flüssigphase aus einer biologischen Probe und ihrem Nachweis unter Verwendung einer Erhitzung unter Hochdruck.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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In der modernen klinischen Medizin spielt der Nachweis von Genen eine zunehmend bedeutende Rolle. Der erste Schritt eines Gennachweises beinhaltet Extrahieren von Nukleinsäuren aus einer fixierten oder nicht fixierten biologischen Probe.
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Bei herkömmlichen chemischen Verfahren werden Zellen oder Gewebe meistens zunächst mit Enzymen verdaut und dann mit organischen Lösungsmitteln extrahiert. Die isolierten Nukleinsäuren werden mit Ethanol oder Isopropanol ausgefällt, aufgenommen und in Wasser aufkonzentriert. Der ganze Prozess dauert 2 bis 3 Tage. Besonders bei in Paraffin eingebetteten Geweben sind zusätzlich mehrmaliges Entwachsen in Xylol, langwieriges Verdauen mit hohen Proteasekonzentrationen und dergleichen notwendig, was zu erheblichen Nachteilen durch hohen Zeitaufwand führt.
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In den letzten Jahren wurden im In- und Ausland eine Vielfalt von Extraktionskits für Nukleinsäuren in der Feststoffphase entwickelt. Die meisten dieser Kits beruhen auf dem Prinzip einer Lysis von Zellen zur Freisetzung der Nukleinsäuren, Adsorbieren der Nukleinsäuren auf der Oberfläche gewisser Partikel und dann Ausfällen oder Eluieren. Diese Prozesse führen zu einer relativ kürzeren Extraktionsdauer für die Nukleinsäuren, sind aber noch immer weit von einem kostengünstigen, hocheffizienten und einfachen Zielprozess entfernt.
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Bei zunehmender Bedeutung des Gennachweises hat die Technologie zur Extraktion von Nukleinsäuren im Vergleich zum Aufkommen der neuen Verfahren und Technologien beim Gennachweis keine gleichzeitige Innovation erfahren und Durchbruch erlangt. Die Verfügbarkeit von geeigneten Nukleinsäuren wurde der Schlüssel zum Erfolg für den Gennachweis, speziell bei der Genotypisierung (Genotyping) oder Diagnose, die häufig von in Paraffin eingebettetem Gewebe ausgehen.
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Ein Verfahren zum Extrahieren von DNA aus in Paraffin eingebettetem Gewebe, welches ein Entwachsen des Gewebes in Xylol erfordert, wird von Shi, S. -R. et al. beschrieben (The Journal of Histochemistry & Cytochemistry, Band 50 (8), 1005–1011, 2002).
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Extrahieren von Nukleinsäure-Analytlösungen aus einer biologischen Probe gemäß Anspruch 1 zur Verfügung.
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Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders geeignet zum Extrahieren von Nukleinsäuren aus mit Formalin fixierten in Paraffin eingebetteten Geweben. Bei diesem Verfahren werden das Entwachsen des in Paraffin eingebetteten Gewebes, die Lysis der Gewebezellen und das Aufheben der Vernetzungen gleichzeitig in dem einzigen Hochdruck-Erhitzungsschritt vorgenommen, bis die Nukleinsäuren in der Flüssigphase freigesetzt sind.
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Die vorliegende Erfindung stellt weiter ein Verfahren zum Nachweis eines Nukleinsäure-Analyts in einer biologischen Probe zur Verfügung, das Gewinnen einer Lösung des Nukleinsäure-Analyts gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren und Nachweisen des Nukleinsäure-Analyts, bevorzugt durch eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR, Polymerase Chain Reaction) umfasst.
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Das erfindungsgemäße Verfahren ist einfach (die am häufigsten verwendeten Kits zur Nukleinsäureextraktion erfordern beispielsweise mehr als 20 Schritte), spart Zeit und ist kostengünstig, und es erfordert keine speziellen Gerätschaften und Reagenzien. Das einfache Durchführungsverfahren ist leicht auszuführen, und verbessert die Effizienz bei der Vorbereitung und dem Nachweis einer Nukleinsäurelösung in hohem Maße.
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KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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1A zeigt die Punktmutation am Codon 12 (G12S) von K-ras exon 2, 5' → 3', 1B zeigt die Ergebnisse der Gegenstrang-Sequenzierung für die gleiche Probe (3' → 5'). Die Pfeile geben die Mutationspunkte an.
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2 zeigt die normale Sequenz der Codons 12, 13 von K-ras exon 2 des Darmkrebses beim Menschen.
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3 zeigt das Ergebnis einer Fluoreszenz-PCR für Candida albicans, wobei die vertikale Koordinate die Fluoreszenzstärke darstellt und die horizontale Koordinate die Anzahl der PCR-Durchgänge darstellt. Die beiden Kurven stellen positive Ergebnisse dar.
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4 zeigt die Ergebnisse der Elektrophorese von HBV-spezifischen Fragmentsequenzen 575, 241 und 192 bp des HBV-Virus im menschlichen Serum.
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5 zeigt ein Elektropherogramm: [1] in Paraffin eingebettete Gewebe eines menschlichen gastrointestinalen Stromatumors, [2] in Paraffin eingebettete Gewebe eines menschlichen Darmkrebses, [3] 100 bp Marker, [4] frische Gewebe eines menschlichen Schilddrüsenkrebses, [5] kultivierte Zellen.
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6 zeigt eine Vergleichstabelle zur Erläuterung der Abhängigkeit von Temperatur und Druck des Sattdampfes.
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AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung stellt in einem Aspekt ein Verfahren zum Extrahieren von Nukleinsäure-Analytlösungen aus einer biologischen Probe zur Verfügung, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: Einbringen der biologischen Probe in einen heizbaren Behälter, wahlweise Hinzufügen eines Lösemediums zur biologischen Probe, Hochdruck-Erhitzen der biologischen Probe, wahlweise Zentrifugieren der biologischen Probe, und Gewinnen einer Flüssigkeit, die den Nukleinsäure-Analyt enthält. Üblicherweise kann die Nukleinsäure-Analytlösung direkt für einen anschließenden Nachweis, wie eine PCR, verwendet werden. Dadurch werden die Schritte zur Nukleinsäureextraktion stark vereinfacht.
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Der hier verwendete Ausdruck ”Nukleinsäure-Analyt” ist so zu verstehen, dass er das zu analysierende Zielnukleinsäuremolekül, darunter DNA und RNA, umfasst. Wenn die in der Probe zu analysierende Nukleinsäure ein Haushaltsgen (Housekeeping Gene) ist, weist die auf diese Weise gewonnene Lösung aufgrund der hohen Kopienzahl der Nukleinsäure einen höheren Nukleinsäuregehalt auf, was den nachfolgenden PCR-Nachweis erleichtert. Wenn die Kopienzahl der zu analysierenden Nukleinsäure gering ist, kann die Nukleinsäurelösung weiter konzentriert werden, nachdem sie unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens gewonnen wurde, wie durch eine Aufkonzentrierung in einer Chromatographiesäule, um die Konzentration an Nukleinsäuren zu erhöhen.
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Der hier verwendete Ausdruck ”wahlweise” bedeutet ”frei wählbar” oder ”nicht wesentlich” oder ”optional”. Dabei bedeutet ”wahlweise Zentrifugieren der Probe”, dass ein Zentrifugieren vorgenommen werden kann oder auch nicht, wobei dies von den Fachleuten je nach den Gegebenheiten ausgewählt werden kann.
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Der hier verwendete Ausdruck ”Hochdruck” ist als ein höherer Druck als der Standardatmosphärendruck zu verstehen. Beispielsweise stellt der Luftdruck auf Meereshöhe unter Standardatmosphärenbedingungen einen Atmosphärendruck dar, der ungefähr gleich 101,3 kPa beträgt.
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Der ”Hochdruck” bei der vorliegenden Erfindung kann durch Hochdruckgeräte erreicht werden, die üblicherweise im Fachbereich verwendet werden, wie Druckkochgeräte, elektrische Druckkochgeräte, Autoklaven und dergleichen.
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Die am häufigsten verwendeten Hochdruckgeräte sind Dampferhitzungsgeräte. Es ist im Fachbereich bekannt, dass die Temperatur bei einer Hochdruck-Erhitzung üblicherweise höher liegt als bei einer Erhitzung bei Normaldruck. Es gibt im Fachbereich verschiedene Methoden zum Abschätzen der Abhängigkeit von Druck und Temperatur beim Hochdruck-Erhitzen (siehe z. B. die in 6 gezeigte ”Vergleichstabelle zur Erläuterung der Abhängigkeit von Temperatur und Druck des Sattdampfes”). Gemäß dieser Methoden kann man die ungefähre Temperatur bei der Hochdruck-Erhitzung grob abschätzen. Wenn zum Beispiel der Druck des Dampfdruckkochgeräts 250 kPa beträgt, liegt die Temperatur bei etwa 127°C.
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Der ”Hochdruck” liegt bei der vorliegenden Erfindung bei 105 kPa oder darüber, zum Beispiel 110 kPa, 115 kPa. Die Obergrenze des Drucks des meist verwendeten Dampfdruckkochgeräts beträgt annähernd 350 kPa.
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Der beim Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendete ”Hochdruck” beträgt zwischen 105 und 170 kPa.
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Verschiedene biologische Proben unterscheiden sich voneinander bezüglich ihrer Temperatur- und Drucktoleranz. Die Fachleute können durch routinemäßige Versuche in Abhängigkeit von der Art der zu prüfenden Probe optimierte Hochdrucktemperaturen und -zeitdauern ermitteln. Wenn beispielsweise die Probe leicht aufzulösen ist (zum Beispiel Tumor- oder Virenproben), können der Druck und die Dauer der Erhitzung verringert werden; wenn die biologische Probe schwer aufzulösen ist (z. B. Candida albicans) können der Druck und die Dauer der Erhitzung erhöht werden.
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Wenn beispielsweise eine in Paraffin eingebettete Gewebeschnittprobe zu bearbeiten ist, kann die typische Erhitzungsbedingung lauten: 25 bis 45 Minuten lang Verweilen unter einem Druck von 140 bis 170 kPa. Der hier verwendete Ausdruck ”biologische Probe” ist so zu verstehen, dass Proben davon umfasst sind, die zu prüfende Nukleinsäuren enthalten, darunter biologische Proben von Tieren, Pflanzen, Mikroorganismen oder Menschen. Biologische Proben können verschiedene frische, eingefrorene oder fixierte Proben sein, wie Biopsiegewebeproben, Tumorproben, mit Formalin fixierte in Paraffin eingebettete Gewebeproben sowie Mikroorganismenproben, wie Bakterien, Pilze, Viren, Mycoplasma und dergleichen. Übliche frische biologische Proben umfassen: Proben von biologischen Fluiden, wie Blut, Serum, Gewebsflüssigkeit, Urin, Stuhl, Sputum, Gehirn-Rückenmarksflüssigkeit (Liquor cerebrospinalis), Speichel, Tränenflüssigkeit, Punktionsflüssigkeit aus der Brustwarze und Zellkulturen; Tumorproben, wie erkrankte Gewebe, die einem Patienten entnommen wurden, und dergleichen. Eine typische fixierte biologische Probe ist ein mit 10%-igem Formalin fixiertes in Paraffin eingebettetes Gewebe. Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders geeignet für in Paraffin eingebettete Gewebeproben, darunter lagerfähige Paraffinblöcke und in Archiven aufbewahrte Schnitte.
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Beim Erhitzen von biologischen Proben können die Proben in ein heizbares Gefäß eingesetzt sein. Häufig verwendete Erhitzungsgefäße sind Zentrifugenröhrchen und Zentrifugendeckelröhrchen, beispielsweise Röhrchen von 1,5 mL oder 10 mL. Bevorzugt weist der Deckel des Röhrchens einen Durchbruch auf, so dass ein Abspringen des Deckels aufgrund der Ausdehnung des Gases beim Hochdruck-Erhitzen verhindert wird. Proben können zum Erhitzen auch in einen mit Gaze verschlossenen Erlenmeyerkolben oder Kolben oder andere gasdurchlässige Behälter eingebracht werden.
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Vor dem Hochdruck-Erhitzen kann, wenn nötig, ein wahlfreies Lösemedium zur biologischen Probe zugegeben werden. Zum Beispiel kann vor einem Erhitzen von in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten eine 0,1 M NaOH-Lösung, beispielsweise 200 μl oder 1 ml, in einer Weise zugegeben werden, dass die Proben vollständig von der Flüssigkeit bedeckt sind. Üblicherweise verwendete Lösemedien umfassen Wasser, mit DEPC (Diethylpyrocarbonat) versetztes Wasser, physiologische Kochsalzlösung, Alkalilösung, Pufferlösung und dergleichen. Üblicherweise verwendete Pufferlösungen umfassen Tris-HCl-Puffer, Phosphatpuffer, Essigsäure-Natriumacetat-Puffer, Glycin-HCl-Puffer, Dinatriumhydrogenphosphat-Natriumcitrat-Pufferlösungen und Citronensäure-Natriumcitrat-Pufferlösungen, usw. Die Fachleute werden erkennen, dass, wenn die biologischen Proben an sich schon eine große Menge an Flüssigkeit enthalten (zum Beispiel cerebrospinale Flüssigkeiten), brauchen keine weiteren Lösemedien hinzugefügt werden.
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Nach dem Schritt der Hochdruck-Erhitzung können die Proben wahlweise zentrifugiert werden, um Überstände abzutrennen. Nukleinsäure ist meist im Überstand gelöst und kann direkt für anschließende Arbeitsschritte, wie eine PCR, verwendet werden. Die Fachleute werden erkennen, dass der Zentrifugierschritt nicht unumgänglich ist. Wenn ein Weglassen des Zentrifugierens der Nukleinsäurelösung keinen Einfluss auf nachfolgende Experimente (z. B. PCR) hat, muss das Zentrifugieren nicht notwendig sein.
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In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die folgenden Schritte vorgesehen: wahlweise Perforieren des Deckels des Zentrifugenröhrchens, Einbringen der in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitte (zum Beispiel 1 bis 2 Schnitte) in das Zentrifugenröhrchen und Hinzugeben von reinem Wasser oder Alkalilösung (z. B. NaOH-Lösung) so, dass die Proben von der Flüssigkeit bedeckt sind, 25 bis 45 Minuten lang Erhitzen der Proben unter einem Druck von 140 bis 170 kPa, und Zentrifugieren der Proben, um Überstände abzutrennen. Der Überstand kann direkt in der anschließenden PCR-Umsetzung verwendet werden.
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Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Bereitstellen eines Verfahrens zum Nachweis eines Nukleinsäure-Analyts in einer biologischen Probe, umfassend Gewinnen einer Lösung des Nukleinsäure-Analyts gemäß dem oben beschriebenen Verfahren und Nachweis des Nukleinsäure-Analyts. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird der Nachweis durch eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durchgeführt.
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Die vorliegende Erfindung wird weiter mit Bezug zu den folgenden Beispielen erläutert. Diese Beispiele werden angeführt, um das Verständnis der vorliegenden Erfindung zu erleichtern und sollen nicht als Einschränkung der vorliegenden Erfindung verstanden werden.
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BEISPIELE
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Beispiel 1
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Gennachweis von K-ras exon 2 des Darmkrebses beim Menschen
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- 1. Vorbereiten des Zentrifugenröhrchens: Der Deckel eines Zentrifugenröhrchens von 1,5 ml wurde durch eine feine Nadel, die unter Verwendung eines Alkoholbrenners erhitzt wurde, mit einer kleinen Pore perforiert, so dass ein Abspringen des Deckels aufgrund der Ausdehnung des Gases beim Hochdruckprozess verhindert wird.
- 2. Probennahme: Ein bis zwei Stücke von in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten (5 bis 10 μm) von Darmkrebs eines Menschen wurden in ein Zentrifugenröhrchen von 1,5 ml überführt. Es wurden 500 μl einer 0,1 M NaOH-Lösung (pH 11) hinzugefügt, so dass die Probe vollständig von der Flüssigkeit bedeckt war.
- 3. Hochdruck: Es wurde 30 bis 45 Minuten lang eine Hochdruck-Erhitzung durchgeführt (elektrisches Druckkochgerät der Marke LIREN, Modell DYG-5B, Arbeitsdruck 140 bis 170 kPa, Druckgrenzwert 200 kPa).
- 4. PCR: Es wurde unmittelbar nach Beendigung des Hochdruckprozesses ohne Abkühlung ein Zentrifugierschritt (13.000 UPM, 5 Minuten) durchgeführt. Ein bis zwei Mikroliter des Überstands (oder 1 bis 2 μl einer 1:10 Verdünnung des Überstands) wurden zur PCR-Analyse gemäß den Anweisungen verwendet.
- 5. Elektrophorese: Die PCR-Produkte wurden durch Elektrophorese nachgewiesen. Wenn die Menge an Produkten zu gering ist, kann eine sogenannte verschachtelte PCR (Nested-PCR) vorgenommen werden.
- 6. Ergebnis der Sequenzierung der PCR-Produkte: Siehe 1A und 1B.
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Die Ergebnisse zeigten, dass die durch das Verfahren der Hochdruck-Erhitzung aus der in Paraffin eingebetteten Gewebeprobe gewonnene Nukleinsäureprobe die Erfordernisse für ein direktes Sequenzieren der PCR-Produkte vollkommen erfüllt.
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Beispiel 2
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Gennachweis von K-ras exon 2 des Darmkrebses beim Menschen (Tumorzellen nach Laser-Mikrodissektion)
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Eine gewisse Menge an Tumorzellen nach Laser-Mikrodissektion in Paraffinschnitten wurde gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 behandelt (wenn die Menge an Zellen zu gering ist, kann die Lösungsmenge reduziert werden). Der Überstand wurde für eine PCR verwendet. Die Ergebnisse der Sequenzierung der PCR-Produkte sind in 2 gezeigt.
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Die genannten Ergebnisse zeigten, dass das erfindungsgemäße Hochdruck-Erhitzungsverfahren bei einer geringen Zellmenge anwendbar ist, um Nukleinsäuren in verlässlicher Qualität zu gewinnen, die für eine Genotypisierungsanalyse und -diagnose verwendet werden können. Die Erfolgsrate bei der Genotypisierungsanalyse und -diagnose von kleinen Mengen an Zellen oder Geweben (wie Tumorgewebe nach Feinnadelaspirationsbiopsie) erhöhte sich, was für Krebspatienten von großer Bedeutung ist, die die Gelegenheit für eine chirurgische Behandlung versäumt haben, um Medikamente für eine Behandlung auszuwählen.
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Beispiel 3
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Nukleinsäure-Amplifikationsnachweis von Mycobacterium tuberculosis an in Paraffin eingebetteten Geweben
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Ein bis zwei Stücke von in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten mit Verdacht auf Infektion mit Mycobacterium tuberculosis wurden im Wesentlichen nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 behandelt, wobei die Erhitzungsdauer 20 bis 30 Minuten betrug. Der Überstand wurde für eine Echtzeit-PCR (RT-PCR) verwendet (dem PCR-Vorgemisch wurden Fluoreszenzsonden zugesetzt).
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Die Ergebnisse zeigten, dass Bakterien-DNAs in akzeptabler Qualität von in Paraffin eingebetteten Geweben nach dem Hochdruck-Erhitzungsverfahren gewonnen werden können, was bei der klinischen Identifizierung und Diagnose von Infektionen mit Mycobacterium tuberculosis hilfreich ist.
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Beispiel 4
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Nachweis von HBV-Viren in menschlichem Serum
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Es wurden 5 μl Serum von einem HBV-Patienten mit 200 μl einer 0,1 M NaOH-Lösung (pH 11) vermischt und dann im Wesentlichen nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 behandelt, wobei die Erhitzungsdauer 25 bis 40 Minuten betrug. Der Überstand wurde für eine PCR verwendet. Die Ergebnisse der Elektrophorese sind in 4 gezeigt.
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Die oben genannten Ergebnisse zeigten, dass das Hochdruck-Erhitzungsverfahren verwendet werden kann, um Virus-Nukleinsäuren in verlässlicher Qualität aus Spurenmengen von Serum für klinische Tests zu gewinnen.
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Beispiel 5
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Nachweis von mRNA in frischen Geweben, bei in Paraffin eingebetteten Geweben und Zellkulturen
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- 1. Probennahme:
- a. Paraffinschnitte von einem menschlichen gastrointestinalen Stromatumor (5 bis 10 μm), 1 bis 2 Stücke
- b. in Paraffin eingebettete Gewebe von einem menschlichen Darmkrebs (5 bis 10 μm), 1 bis 2 Stücke
- c. frische Gewebe von einem menschlichen Schilddrüsenkrebs (1/2 Körnung), zerkleinert
- d. Zellkulturen.
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Die Proben wurden in ein Zentrifugenröhrchen von 1,5 ml überführt. Eine geeignete Menge an 0,1 M NaOH-Lösung (pH 11) wurde so zugegeben, dass die Proben vollständig von der Flüssigkeit bedeckt sind. Die erhaltene Lösung wurde gründlich durchmischt.
- 2. Hochdruck: Die Erhitzungsdauer betrug 30 bis 45 Minuten (Arbeitsdruck 140 bis 170 kPa, Druckgrenzwert 200 kPa).
- 3. Reverse Transkription: (bei der RNA-Extraktion waren zeitnahe Hochdruckprozesse notwendig und ein Vorgemisch für die reverse Transkription sollte zuvor vorbereitet werden). Als der Hochdruckprozess beendet war, wurde das Zentrifugenröhrchen nach einem sofortigen Zentrifugieren geöffnet und 2 bis 5 μl Überstand wurden schnell für eine reverse Transkription verwendet, um einen schnellen Abbau der RNA zu vermeiden.
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Vorgemisch für die reverse Transkription: 1× Revers-Transkriptions-Puffer, 0,2 mM dNTPs (Desoxyribonukleosidtriphosphate), 0,2 μg Random-Primer (oder 0,2 μM spezifische Primer), 50 U M-mLV reverse Transkriptase, 0,01 M DTT (Dithiothreitol), DEPC-Wasser bis zu einem Endvolumen von 20 μl aufgefüllt.
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60 Minuten lang bei 42°C, 5 Minuten lang bei 95°C.
- 4. PCR: Nach Beendigung der reversen Transkription (es kann ein sofortiges Zentrifugieren erfolgen) wurden 1 bis 5 μl Überstand zum Vorgemisch für die PCR zugegeben (enthält 1× PCR-Puffer, 0,2 mM dNTPs, 0,4 bis 0,5 μM spezifische Primer, Wasserzusatz bis auf ein Endvolumen von 25 bis 50 μl). PCR: 1 Minute 30 Sekunden lang bei 94°C (30 Sekunden lang bei 94°C, 30 Sekunden lang bei 55°C, 20 Sekunden lang bei 72°C, 30 bis 35 Durchgänge), 2 Minuten lang bei 72°C.
- 5. Die Ergebnisse der RT-PCR von Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) mRNA (Elektropherogramm 226 bp): siehe 5.
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Die oben genannten Ergebnisse zeigten, dass das Hochdruck-Erhitzungsverfahren verwendet werden kann, um gleichzeitig DNA und RNA in verlässlicher Qualität zu gewinnen, und auch für den Nachweis spezifischer Gensequenzfragmente (DNA) und biologischer Marker (mRNA) verwendet werden kann.
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Beispiel 6
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Einfluss von Unterschieden in Temperatur und Hochdruck auf die Freisetzung von Nukleinsäure aus biologischen Proben
- 1. Das Zentrifugenröhrchen wurde gemäß dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 vorbereitet.
- 2. Probennahme
- (1) Es wurden 5 μl Serum von einem HBV-Patienten mit 100 μl einer 0,1 M NaOH-Lösung (pH 11) vermischt.
- (2) Abstriche von HSV-Patienten wurden in 100 μl einer 0,1 M NaOH-Lösung (pH 11) gewaschen.
- (3) Es wurden zwei Stücke von 7 μM in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten von einem Tumorpatienten in 500 μl einer 0,1 M NaOH-Lösung (pH 11) gegeben.
- 3. Typen von Druckkochgeräten
- (1) Elektrisches Druckkochgerät der Marke LIREN, Modell DYG-5B.
- (2) Autoklav Taiwan CIRRUS CR-3560CG-M.
- 4. Verfahrensweise
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Die oben genannten biologischen Proben wurden einer Hochdruckbehandlung mit dem elektrischen Druckkochgerät der Marke LIREN (Modell DYG-5B) bzw. dem Autoklaven Taiwan CIRRUS CR-3560CG-M bei unterschiedlichen Temperaturen über unterschiedlich lange Zeiten unterzogen.
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Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben. Die Versuchsergebnisse zeigten, dass verschiedene biologische Proben sich hinsichtlich der Toleranz gegenüber Dauer und Druck der Hochdruckbehandlung unterschieden. Tabelle 1
| Name der Probe | Druckkochgerät Typ | Dauer Erhitzung (Minuten) | Temperatur Erhitzung (°C) | Ergebnisse PCR |
| HSV II (Herpessimplex-Virus II) | elektrisches Druckkochgerät LIREN | 30 | 115°C | + |
| Abstriche Mensch | | 60 | 115°C | + |
| | | 90 | 115°C | - |
| | | 210 | 115°C | - |
| | | | | |
| | Autoklav | 5 | 130°C | + |
| | | 10 | 130°C | - |
| | | 15 | 130°C | - |
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| HBV (Serum) | elektrisches Druckkochgerät LIREN | 30 | 115°C | + |
| | | 60 | 115°C | + |
| | | 90 | 115°C | + |
| | | 210 | 115°C | + |
| | Autoklav | 5 | 130°C | + |
| | | 10 | 130°C | - |
| | | 15 | 130°C | - |
| | | 120 | 130°C | - |
| | | | | |
| In Paraffin eingebettetes Gewebe (β-Aktin) | elektrisches Druckkochgerät LIREN | 30 | 115°C | + |
| | | 60 | 115°C | + |
| | | 90 | 115°C | + |
| | | 210 | 115°C | - |
| | Autoklav | 5 | 130°C | + |
| | | 10 | 130°C | + |
| | | 15 | 130°C | + |
| | | 30 | 130°C | + |
| | | 120 | 130°C | + |
Anmerkung: In der Spalte ”Ergebnisse PCR” bedeutet ”+” positiv und ”–” bedeutet negativ.
