DE19727932A1 - Verfahren und Testkit zum Nachweis bösartiger Tumore - Google Patents
Verfahren und Testkit zum Nachweis bösartiger TumoreInfo
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- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur molekularen
Charakterisierung und möglichen Früherkennung bösartiger Tumore
auf der Basis des Nachweises von Mutationen des Bax-Genes sowie
einen Testkit.
Apoptose oder programmierter Zelltod spielt eine entscheidende,
physiologische Rolle in der Regulation von Zellen und Geweben.
Dysregulationen in diesem fein ausbalancierten System von
Aktivatoren und Inhibitoren der Apoptose haben entscheidenden
Anteil in der Entstehung von bösartigen Tumoren. Diese sind
dadurch gekennzeichnet, daß Inaktivatoren der Apoptose
überreguliert und Aktivatoren der Apoptose inaktiviert und/oder
mutiert oder deletiert sind. Daraus ergibt sich, daß die
exakte, molekularbiologische Analyse der Schädigung von
beteiligten Molekülen, wichtige Informationen über die
Pathogenese von malignen Erkrankungen liefert. Darüber hinaus
ermöglicht die Erfassung von Schädigungen in den relevanten
Genen diejenigen zu identifizieren, welche im Rahmen einer
Gentherapie substituiert werden sollten, um eine kausale
Therapie zu ermöglichen. Ein entscheidender Aktivator der
Apoptosevermittlung wird durch das Bax-Protein repräsentiert.
Dieses Molekül gehört zur Familie der bc1-2 verwandten Gene,
welche die Apoptosefähigkeit einer Zelle regulieren. Während
z. B. das Protein bc1-2 zu den Inhibitoren der Apoptose zählt,
wird Bax den Apoptose-fördernden Genen zugerechnet. Die Bax
mRNA wird in drei unterschiedlichen Splicevarianten exprimiert,
Bax-alpha, Bax-beta und zwei Bax-gamma Formen. Von spezieller
Bedeutung zur Induktion des programmierten Zelltodes ist
Bax-alpha. Für das Bax-Gen konnte kürzlich gezeigt werden, daß in
Tumoren des Verdauungstraktes eine spezifische Schädigung der
DNA-Sequenz vorliegt ("frame shift mutation")/Somatic
frameshift mutations in the BAX gene in colon cancers of the
microsatellite mutator phenotype;Rampino-N; Yamaiaoto-H; Ionov-
Y; Li-Y; Sawai-H; Reed-JC; Perucho-M;Science. 1997 Feb. 14;
275(5302): 967-9/.
Die Aufdeckung dieser DNA-Schädigung ist von wesentlicher
Bedeutung nicht nur für die Erklärung der Entstehung von
Tumoren. Daher stellt das Bax-Gen auch ein Kandidatengen dar
für die molekulare Diagnostik von bösartigen Tumoren, welches
im Rahmen von Gentherapiestrategien ersetzt werden sollte, um
die Tumorzelle dem programmierten Zelltod wieder zuzuführen.
Im Rahmen bisheriger Strategien zur molekularen Diagnostik von
malignen Erkrankungen standen Gene im Vordergrund, die entweder
mutiert oder inaktiviert sind (z. B. p16 oder p53). Diese Gene
stehen im Rahmen der Zellzykluskaskade und/oder
Apoptoseinduktion relativ proximal in der Signaltransduktion.
Im Sinne einer Ja- oder Nein-Antwort ist davon ausgegangen
worden, daß durch Substitution dieser Gene es zu einer
Therapie, d. h. zu einem programmierten Zelltod der Tumorzelle
kommt. Es zeigte sich jedoch, daß die Regulation des
programmierten Zelltodes wesentlich komplexer ist, und daß vor
allem distal von den beschriebenen Genen zahlreiche weitere
Regulationsschaltstellen liegen.
Der Neuheitsgrad und die Orginärität unserer Methode leitet
sich von einem anderen konzeptionellen Ansatz ab. Unabhängig
von der Art der therapeutischen Induktion einer Apoptose (z. B.
Pharmaka, Strahlung oder genetisches Molekül) muß das
entsprechende biologisch, chemisch und/oder physikalisch
induzierte Signal mit Hilfe einer Signaltransduktionskaskade
(Moleküle des Zellzyklus und/oder des
Apoptosesignaltransduktionsweges) einem genetisch
determiniertem Effektormolekül zugeführt werden ("final
executer"), welches durch Auslösung metabolischer Prozesse zum
letztendlichen programmierten Zelltod führt. Da Tumorzellen in
mehreren Genen dysreguliert sind ist es entscheidend, so distal
in der Signaltransduktionskaskade die molekulare Diagnostik, am
Effektorgen, anzusetzen. Als ein solcher "final executer" ist
das Apoptose-vermittelnde Bax-Gen beschrieben worden.
Eine weitere Besonderheit unseres Ansatzes leitet sich aus der
Art der Mutationsmöglichkeit im Bax-Gen ab. Die "frame-shift"
Muation in den 8 Guanosinbasen der genetischen Sequenz erlaubt
die Entstehung sowohl von 7 als auch von 9 Guanosinbasen, in
deren Folge es zum Ablesefehler, d. h. zur Nichtexpression eines
funktionstüchtigen Bax-Proteines kommt. Das bedeutet, daß die
im Gegensatz zu anderen Mutationen hier eine Flexibilität im
Sinne einer "Vorwärts- und/oder Rückwärtsmutation" vorliegt,
die erst dann auftritt, wenn die betroffene Zelle unter
Selektionsdruck, z. B. durch therapeutische Ansätze
unterschiedlicher Natur, gerät ("Konzept der Feldkarzinogenese"
Slaughter et al. 1954. Cancer 6: 968-968). Klinisch gesehen
bedeutet daß, das am Anfang einer Therapie eine funktionelles
Bax-Gen vorliegt, während der Therapie sich durch den
Selektionsvorteil der "frame-shift"-Mutanten (keine Apoptose-
Vermittlung) ein klonales Wachstum herausbildet, welches durch
Apoptoseresistenz gekennzeichnet ist. Da Bax transkriptionell
durch p53 aktiviert wird, gilt dieser Mechanismus nicht nur für
chemotherapeutische, sondern auch gentherapeutische Ansätze.
Mutative Veränderungen im Bax-Gen wurden bisher nur in einer
hochspezifischen Gruppe von Tumoren des Verdauungstraktes
nachgewiesen, welche allerdings prozentual nur ca. 10% dieser
Tumorklasse manifestieren.
Der Nachweis dieser "frame-shift Mutationen" (Insertion bzw.
verlust einer Guanosinbase einem Guanosin-Repeat-Trakt des
Bax-Genes) /Rampino-N et.al/ über die enzymatische Vervielfältigung
eines DNA-Fragmentes erbracht, innerhalb dessen sich die zu
untersuchende Zielsequenz befand und einer sich anschließenden
Auftrennung des generierten DNA-Fragmentes in einem
Polyacrylamidgel zur Analyse der Längenabweichung von einem
Bax-Wildtypfragment. Die Visualisierung der mutierten
DNA-Fragmente erfolgte dabei mittels einer radioaktiven Methode auf
einem Röntgenfilm.
Ein solches Verfahren ist aber sehr zeitaufwendig und somit für
eine Routinediagnostik nicht anwendbar. Aufgrund des Einsatzes
radioaktiver Stoffe ist es außerdem sehr gesundheits- und
umweltgefährdend.
Der Erfindung lag deshalb die Aufgabe zugrunde, eine klinisch
nutzbare Nachweismethode zur molekularen Charakterisierung auf
mutative Veränderungen im Bax-Gen zu entwickeln, welches die
Nachteile radioaktiver Methoden vermeidet und für eine
Routinediagnostik eingesetzt werden kann.
Die Erfindung wird gemäß den Ansprüchen realisiert.
Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wird genomische DNA aus
den zu untersuchenden klinischen Proben isoliert, indem die
Probe mit einem Lyse-Bindungspuffer, wie z. B.
Guanidinisothiocyanat, Lithiumchlorid oder Guanidinhydrochlorid
gegebenenfalls in Kombination mit Detergenzien und Alkoholen,
sowie mit einem mineralischen Trägermaterial zur Bindung der
genomischen DNA inkubiert wird. Anschließend wird die
genomische DNA nach Durchführung von Waschschritten vom
Trägermaterial wieder abgelöst.
Als mineralisches Trägermaterial werden vorzugsweise an sich
bekannte Silicamaterialien < 50 nm eingesetzt, besonders
bevorzugt nichtporöses Siliziumdioxyd mit einer Teilchengröße
von 7 nm-1 µm.
In einer bevorzugten Ausführung des Verfahrens wird die unter
Lyse-Bindungspuffer am Trägermaterial fixierte genomische DNA
auf eine Membran aus Polysulfonether mit einer Porengröße von
0,05 bis 1 µm, vorzugsweise von 0,2 µm-0,5 µm, aufgetragen.
Durch einen Zentrifugationsschritt oder eine Vakuumfiltration
wird anschließend das Trägermaterial mit der genomischen DNA
auf der Membran fixiert, durch Zugabe eines Waschpuffers aus
Ethanol, Natriumchlorid und Tris-HCl auf der Membran gewaschen
und mit einem Niedrigsalzpuffer aus Tris-HCl und EDTA eluiert.
Der auf "frame shift" Mutationen zu untersuchenden Guanosin-
Repeat-Trakt innerhalb der kodierenden Region des Bax-Genes
(Sequenzbereich 114-121) wird mit einem Primerpaar enzymatisch
vervielfältigt, wobei einer der Primer mit einer
Fluoreszenzmarkierung versehen ist. Nach der enzymatischen
Vervielfältigung ist somit auch das vervielfältigte DNA-
Fragment mit der Fluoreszenzmarkierung versehen. Das Primerpaar
wird so ausgewählt, daß die Amplifikationslänge zwischen 90 und
120 Basenpaaren beträgt.
Diese ermöglicht nachfolgend eine hochempfindliche
elektrophoretische Auftrennung des amplifizierten
DNA-Fragmentes.
Bevorzugt wird ein Primerpaar der Sequenz:
Primer 1: 5'-TTCATCCAGGATCGAGCAGG-3
Primer 2: 5'-TCCACCAAGAAGCTGAGC-3
eingesetzt.
Primer 1: 5'-TTCATCCAGGATCGAGCAGG-3
Primer 2: 5'-TCCACCAAGAAGCTGAGC-3
eingesetzt.
Als Fluoreszenmarkierungen werden kommerziell verfügbare
Farbstoffe wie z. B. Hex oder Rox (Handelsname) eingesetzt welche
mittels DNA-Sequenzierautomaten detektiert werden können.
Das über die Amplifikationsreaktion generierte DNA-Fragment wird
zur Analyse seiner exakten Länge auf einem Sequenziergel
aufgetrennt und mittels des DNA-Sequenzierautomaten analysiert.
Eine solche Auftrennung ermöglicht den hochsensitiven Nachweis
der exakten Länge. Es können Unterschiede von nur einem
Nukleotid nachgewiesen werden.
Die zu detektierende Abweichungen von einem Basenpaar (Insertion
oder Deletion einer Base) von der Bax-Wildtypsequenz können so
hochspezifisch erkannt werden.
Das erfinderische Verfahren löst in idealer Weise die
aufgeführten Probleme radioaktiver Techniken und gestattet eine
einfache und schnelle Analytik des Bax-Genes und somit eine
molekulare Charakterisierung bösartiger Tumore.
Es ist extrem zeitsparend, einfach in der Durchführung und
gesundheits- und umweltschonend, da es auf die Verwendung
radioaktiver Chemikalien verzichtet.
Zudem können durch Verwendung einer idealen Isolierungstechnik
der genomischen DNA eine Vielzahl von Proben gleichzeitig
analysiert werden. Da DNA-Sequenzierautomaten zur
Standard-Ausstattung von diagnostischen Laboratorien gehören, ermöglicht
die Erfindung schnell und reproduzierbar, Mutationen im Bax-Gen
nachzuweisen.
Die Erfindung ist auch darüber hinaus geeignet nichtinvasiv
gewinnbare Probenmaterialien einer Mutationsuntersuchung im
Bax-Gen zuzuführen, das bedeutet, daß über den Nachweis von
Mutationen im Bax Gen auch eine diagnostische Früherkennung
maligner Veränderungen möglich wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich in diesem
Zusammenhang insbesondere zum frühen Nachweis von Lungentumoren,
wofür als Ausgangsmaterialien zur Isolierung von genomischer DNA
auch nichtinvasiv gewinnbare Ausgangsmaterialien wie Ausatemluft
oder Bronchallavage verwendet werden.
Es basiert dabei insbesondere auf den eigenen neuen
Erkenntnissen eines Nachweises von Insertions- und
Deletionsmutationen innerhalb der beschriebenen Guanosineinheit
des Bax-Gens in nichtkleinzelligen epithelialen Tumoren der
Lunge. So konnte bei Lungentumoren überraschend eine sehr viel
höhere Mutationsfrequenz, als diese für Tumoren des
Verdauungstraktes beschrieben sind, festgestellt werden.
Das Verfahren ist darüber hinaus auch vorteilhaft für die
molekulare Charakterisierung von anderen soliden Tumoren
einsetzbar, indem andere klinische Proben untersucht werden, so
z. B. zum Nachweis von Mammatumoren, Kolontumoren u. a. aus
entsprechenden Gewebeproben oder aus für eine diagnostische
Früherkennung interessanten klinische Ausgangsmaterialien
(Stuhl, Plasma, Blut u. a.).
Dies ist entscheidend für eine mögliche Früherkennung maligner
Veränderungen und für die Planung notwendiger
Therapiemaßnahmen.
Gegenstand der Erfindung ist außerdem ein Testkit für die
Untersuchung klinischer Proben auf Mutationen im Bax-Gen,
welcher alle notwendigen Reagenzien für die Untersuchung von
Mutationen im Bax-Gen enthält. Mittels eines solchen Testkits
kann die DNA-Extraktion aus unterschiedlichsten
Probenmaterialien und die Erzeugung eines fluoreszenzmarkierten
DNA-Fragmentes erreicht werden. Darüberhinaus enthält ein
solcher Testkit auch notwendige Positiv und Negativkontrollen
sowie einen Fragmentlängenstandard.
Der erfindungsgemäße Testkit ist gekennzeichnet durch:
- 1. DNA Extraktionssystem
- 2. Primermix mit einem Hex-markierten Primer
- 3. Kontrollzellinien-DNA zur Amplifikation der Bax-Wildtypsequenz
- 4. Kontrollzellinien-DNA zur Amplifikation von mutiertem Bax
- 5. Fragmentlängenstandard (Rox-markiert) für die exakte Zuordnung der auf dem Sequenziergel aufgetrennten Amplifikate.
Ein solcher Testkit erlaubt damit auch molekularbiologisch
nicht hochspezialisierten Personen die Durchführung einer
Bax-Gen-Diagnostik in einem Laborroutinebetrieb. Das der Erfindung
zu Grunde liegende Verfahren und die Mittel zur Durchführung
dieses Verfahrens ermöglichen es, Mutationen im Bax-Gen
routinemäßig nachzuweisen. Das bedeutet einen entscheidenden
Schritt für den gezielten perspektivischen Einsatz der
Gentherapie zur Behandlung epithelialer Tumoren und zur
möglichen Früherkennung von Tumoren.
Die Erfindung wird nachfolgend an einem Ausführungsbeispiel
dargestellt.
Es werden ca. 1-2 mg Tumorgewebe in einem Lysepuffer unter
Zusatz von Proteinase K bei 60°C für ca. 30 min inkubiert.
Die Lysesuspension wird mit einem Puffer versetzt, welcher ein
mineralisches Trägermaterial, eine chaotrope Komponente
(Guanidinhydrochlorid), ein Detergenz (Triton X-100) und einen
Alkohol (Isopropanol) enthält, und kurz geschüttelt.
Anschließend wird das Gemisch auf eine Zentrifugationssäule mit
einer Membran aus Polysulfonether gegeben und bei
Maximalgeschwindigkeit für 2 min zentrifugiert. Das Zentrifugat
wird verworfen und dann erfolgt die Zugabe von 600 µl einer
Waschlösung (70% Ethanol; NaCl, Tris-HCl) und eine erneute
Zentrifugation für 2 min bei Maximalgeschwindigkeit. Das Filtrat
wird verworfen und der Waschschritt wiederholt. Nach einer
nochmaligen 1 minütige Zentrifugation wird die
Zentrifugationssäule in ein neues Reaktionsgefäß überführt und
mit 100-200 µl eines auf 70°C vorgewärmten Elutionsmittels (10
mM tris-HCl; 0.1 mM EDTA; pH 9.0) inkubiert und für 1 min bei
Maximalgeschwindigkeit zentrifugiert.
Die isolierte genomische DNA aus der Tumorprobe ist
Ausgangsmaterial für die selektive Vervielfältigung des zu
untersuchenden DNA-Abschnittes des Bax-Genes.
Für die Vervielfältigungsreaktion werden 1-5 µl DNA eingesetzt.
Für die enzymatische Vervielfältigungsreaktion wird ein Primer
eingesetzt, welcher mit einer Standard-Fluoreszenzmarkierung
versehen ist (Hex-Markierung). Nach der Vervielfältigungsreaktion
werden 0, 5 µl des erzeugten DNA-Fragmentes mit 2 µl Wasser und 2 µl
Formamid gemischt und für 5 Minuten bei 95°C inkubiert.
Dieser Ansatz wird auf einem 6-10%igem denaturierenden
Polyacrylamid-Sequenziergel aufgetragen und auf einem
Sequenzierautomaten (ABI 373) bei 2500 V, 25 mA und 30 Watt für
2 Stunden aufgetrennt.
Als Kontrollen dienen zwei DNA-Fragmente, welche aus
Tumorzellinien amplifiziert wurden und dabei zum einen den
Bax-Wildtyp und zum anderen sowohl eine Insertionsmutation und auch
eine Deletionsmutation enthalten.
Claims (9)
1. Verfahren zum Nachweis von bösartigen Tumoren
dadurch gekennzeichnet, daß man
genomische DNA aus klinischem Probenmaterialien isoliert und
Insertions-und Deletionsmutationen im humanen Bax-Gen in einem
Guanosin-Repeat-Trakt der Nukleotidregion innerhalb der
kodierenden Region des Gens im Bereich der Nukleotide mit
Guanosinbasen untersucht, indem man diesen DNA-Abschnitt
mittels eines Primerpaares amplifiziert, wobei das Primerpaar
so ausgewählt ist, daß die Amplifikationslänge zwischen 90 und
120 Basenpaaren beträgt und ein Primer mit einem
Fluoreszenzfarbstoff markiert ist, das amplifizierte
DNA-Fragment auf ein Sequenzierungsgel aufträgt, auftrennt und die
Insertionen und Deletionen über die Fragmentlänge nachweist.
2. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß
die genomische DNA aus den zu untersuchenden klinischen Proben,
isoliert wird, indem die Probe mit einem Lyse-Bindungspuffer
sowie mit einem mineralischen Trägermaterial zur Bindung
genomischer DNA inkubiert werden und nach Durchführung von
Waschschritten die genomische DNA vom Trägermaterial wieder
abgelöst wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2,
dadurch gekennzeichnet, daß
als mineralisches Trägermaterial Silicamaterialien < 50 nm,
vorzugsweise nichtporöses Siliziumdioxyd mit einer
Teilchengröße von 7 nm-1 µm verwendet wird.
4. Verfahren nach Anspruch 2 und 3,
dadurch gekennzeichnet, daß
die am Trägermaterial fixierte genomische DNA auf eine Membran
aus Polysulfonether mit einer Porengröße von 0,05 µm bis 1 µm,
vorzugsweise von 0,2 µm-0,5 µm, aufgetragen und durch einen
Zentrifugationsschritt oder eine Vakuumfiltration das
Trägermaterial auf der Membran fixiert, durch Zugabe eines
Waschpuffers auf der Membran gewaschen und mit einem
Niedrigsalzpuffer eluiert wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß
die Insertions- und Deletionsmutationen in einem Guanosin-
Repeat-Trakt der Nukleotidregion mit 8 Guanosinbasen innerhalb
der kodierenden Region des Gens im Bereich der Nukleotide
114-121 untersucht werden.
6. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß
Primerpaare der Sequenz:
Primer 1: 5'-TTCATCCAGGATCGAGCAGG-3
Primer 2: 5'-TCCACCAAGAAGCTGAGC-3
eingesetzt werden.
Primer 1: 5'-TTCATCCAGGATCGAGCAGG-3
Primer 2: 5'-TCCACCAAGAAGCTGAGC-3
eingesetzt werden.
7. Testkit zum Nachweis bösartiger Tumore auf der Basis des
Nachweises von Insertions-und Deletionsmutationen im Bax-Gen
umfassend:
- 1. DNA Extraktionsmodul
- 2. Primermix (mit einem Hex-markiertem Primer)
- 3. Kontrollzellinien-DNA zur Amplifikation der Bax-Wildtypsequenz
- 4. Kontrollzellinien-DNA zur Amplifikation von mutiertem Bax
- 5. Fragmentlängenstandard (Rox-markierte Fragmentleiter).
8. Testkit nach Anspruch 7 zur molekularen Charakterisierung und
Nachweis Nachweis von Lungentumoren unter Verwendung von
Gewebeproben aus der Lunge, Biopsien oder Atemluft.
9. Testkit nach Anspruch 7 zum Nachweis für die molekulare
Charakterisierung von soliden Tumoren vorzugsweise Colon, Mamma
unter Verwendung entsprechender Gewebeproben.
Priority Applications (4)
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---|---|---|---|
DE19727932A DE19727932A1 (de) | 1997-07-01 | 1997-07-01 | Verfahren und Testkit zum Nachweis bösartiger Tumore |
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Publications (1)
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- 1998-07-01 AU AU90610/98A patent/AU9061098A/en not_active Abandoned
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