DE102008061772A1 - Verfahren zur Untersuchung von Nukleinsäure-Populationen - Google Patents

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von Zielmolekülen aus einer Nukleinsäure-Population.

Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von Zielmolekülen aus einer Nukleinsäure-Population.
  • Mit Hilfe der so genannten Next-Generation Sequenziermethoden (NGS) ist es möglich große Abschnitte eines Genoms in hoher Parallelität zu sequenzieren. Da aber die Anzahl der dabei erhaltenen Basen-Information immer noch wesentlich kleiner ist, um damit ein komplexes eukaryotisches Genom, z. B. das Genom von Mensch, Maus oder Ratte, komplett, zumindest in einfacher Sequenzabdeckung zu bestimmen, werden Anreicherungsmethoden verwendet, um die medizinisch/diagnostisch interessanten Teilbereiche dieser Genome mit NGS untersuchen zu können.
  • Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und Methoden zur Verfügung, um eine fokussierte Untersuchung medizinisch relevanter Parameter in einer Vielzahl von Genomen zu ermöglichen.
  • Es existieren Anreicherungsmethoden für gewünschte Zielmoleküle in einer Nukleinsäure-Population auf der Basis einer festen Matrix (z. B. Microarrays, Beads) oder einer flüssigen Matrix (Nukleinsäure-Bibliotheken in Lösung). Darüber hinaus sind auch Anreicherungsmethoden mittels einer großen Anzahl von parallel durchgeführten PCRs bekannt. Derartige Methoden sind z. B. in US 6,013,440 , US 6,632,611 , US 7,214,490 , DE 101 49 947 bzw. US 7,320,862 , WO 2007/057652 , WO 2008/115185 , US 2008/194413 , P. Parameswaran, Nucleic Acid Research, 2007, 35(19), e130, M. Meyer, Nucleic Acid Research, 2007, 35(15), e97, E. Hodges, Nature Genetics, 2007, 39(12): 1522–7, T. Albert, Nature Methods, 2007, 4(11): 903–5, oder D. W. Craig, Nat Methods. 2008 Oct; 5(10): 887–93 beschrieben.
  • Das Ziel der Erfindung ist es, neue Methoden und Anwendungen zur Verfügung zu stellen, um eine effektive Untersuchung medizinisch relevanter genomischer Parameter zu ermöglichen.
  • Ein Gegenstand der Erfindung ist die Untersuchung von Populations-Gemischen von Nukleinsäuren. Die Erfindung betrifft somit Verfahren zur Isolierung von Ziel-Nukleinsäuremolekülen, umfassend die Schritte:
    • (a) Bereitstellen eines Gemisches von mindestens zwei Populationen von Nukleinsäuremolekülen,
    • (b) Inkontaktbringen des Gemisches mit einer Population von Fängermolekülen unter Bedingungen, bei denen Ziel-Nukleinsäuremoleküle aus mindestens einer der Populationen spezifisch an die Fängermoleküle binden können,
    • (c) Abtrennen von nicht an Fängermoleküle gebundenem Material und
    • (d) Isolieren und gegebenenfalls Charakterisieren der isolierten Ziel-Nukleinsäuremoleküle.
  • Bevorzugte Anwendungen der vorliegenden Erfindung sind:
    • 1) Sequenzvergleich
    • 2) Mutations-Analyse
    • 3) SNP-Detektion
    • 4) Exon-Junction Analyse
    • 5) Analyse von Translokationen, insbesondere im Rahmen der Tumordiagnostik
    • 6) Analyse von Variationen in der Kopienzahl und
    • 7) Pathogen-Detektion.
  • Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, aus komplexen Gemischen von Nukleinsäure-Populationen Zielmoleküle, d. h. Subpopulationen von Interesse oder den entsprechenden Anteil von Interesse der Nukleinsäure-Population zu isolieren und diesen für die Sequenzanalyse verfügbar zu machen. Die Zielmoleküle können bekannte und/oder unbekannte Sequenzen enthalten. Die Charakterisierung der Zielmoleküle kann durch konventionelle Sequenziertechnologien (Sanger-Technologie, Kapillarsequenzierung) oder auch durch neueste Hochdurchsatzmethoden (NGS) aber auch durch andere Methoden der Sequenzbestimmung (Pyrosequencing, Mikroarrays, etc.) erfolgen.
  • Überraschenderweise wurde gefunden, dass die Effizienz der Isolierung von Zielmolekülen bzw. Subpopulationen aus komplexen Nukleinsäure-Populationen signifikant gesteigert werden kann, indem die Komplexität der Probe gesteigert wird. Der Zusatz weiterer Nukleinsäure-Populationen erhöht die „Trennschärfe” der Isolierung.
  • Die zu untersuchenden Gemische von Nukleinsäure-Populationen beinhalten mindestens zwei verschiedene Populationen, die sich hinsichtlich ihrer Quelle (z. B. Spezies, Organismus, Individuum) und/oder hinsichtlich ihrer Komplexität bzw. Fragmentgröße unterscheiden. Die Populationen können aus eukaryotischen Spezies, z. B. Säugerspezies wie etwa dem Menschen, oder prokaryotischen Spezies, wie etwa einem Bakterium, oder Gemischen von eukaryotischen oder prokaryotischen Spezies stammen. Die unterschiedlichen Nukleinsäure-Populationen können solche der gleichen Spezies, aber auch solche aus verschiedenen Spezies sein. Die Populationen können auch aus verschiedenen Organismen einer Spezies, z. B. verschiedenen menschlichen Individuen, stammen. Erfindungsgemäß können auch mehr als zwei verschiedene Populationen von Nukleinsäure-Molekülen untersucht werden, z. B. 3, 4, 5, 6 oder noch mehr Populationen.
  • Eine Nukleinsäure-Population besteht in manchen Ausführungsformen aus mindestens 1021 unterschiedlichen Sequenzen, in anderen Ausführungsformen aus mindestens 1018 unterschiedlichen Sequenzen und in manchen Ausführungsformen bis zu 1015 unterschiedlichen Sequenzen, in anderen Ausführungsformen bis zu 1012 unterschiedlichem Sequenzen. Die mittlere Länge einzelner Sequenzen der Population kann typischerweise etwa 20–20000 Nukleotide, z. B. etwa 100–10000 Nukleotide betragen, beispielsweise etwa 100–600 oder etwa 100–400 Nukleotide. In bestimmten Ausführungsformen können typischerweise Populationen großer Fragmente von typischerweise etwa 5000–20000, z. B. etwa 8000–15000 Nukleotiden eingesetzt werden. Die Nukleinsäuren einer Population können doppelsträngige oder einzelsträngige DNA, RNA oder Gemische davon umfassen.
  • Die Nukleinsäure-Populationen sind vorzugsweise unfragmentiert oder durch Fragmentierung chromosomaler oder extrachromosomaler DNA aus einem oder mehreren Organismen, z. B. durch enzymatische Fragmentierung, mechanische Fragmentierung wie etwa durch Ultraschallbehandlung oder andere Methoden erhältlich.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst die Isolierung von Zielmolekülen aus einer Probe, die mindestens zwei verschiedene Nukleinsäure-Populationen enthält.
  • Eine weitere Verbesserung des Verfahrens ist durch konsekutives isolieren von Zielmolekülen in mehreren aufeinander folgenden Zyklen möglich. Hierbei wird die zu untersuchende Probe nacheinander mehrfach mit Fängermolekülen kontaktiert, die jeweils gleich oder verschieden sein können.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren betrifft die Isolierung von Zielmolekülen aus zwei oder mehreren Nukleinsäure-Populationen. Üblicherweise stellen die Zielmoleküle Subpopulationen der zu untersuchenden Nukleinsäure-Populationen dar. Beispielsweise können durch das erfindungsgemäße Verfahren 105 bis 50 × 106 und vorzugsweise 2 × 105 bis 106 verschiedene Zielmoleküle isoliert werden. Die Anzahl der zu isolierenden Zielmoleküle ist korreliert zur Länge der Bereiche der Nukleinsäure-Sequenzen, die durch Fängersonden abgedeckt werden. Typische Bereiche der Nukleinsäure-Sequenzen, die isoliert werden, sind 10 kb bis 100 Mb, bevorzugt 250 kb bis 10 Mb, ganz bevorzugt 500 kb bis 4 Mb.
  • Zur Isolierung der Zielmoleküle werden Fängermoleküle verwendet. Dabei handelt es sich um Nukleinsäuremoleküle, die mit den zu isolierenden Zielmolekülen spezifisch binden, insbesondere durch Hybridisierung in Form eines Nukleinsäuredoppelstrangs. Die Fängermoleküle sind üblicherweise Hybridisierungssonden, die zu den zu isolierenden Zielmolekülen komplementär oder zumindest in Teilbereichen komplementär sind. Erfindungsgemäß können in die Fängersonden auch so genannte Wobble-Basen (u. a. degenerierte Basen, ABasic-Sites, Universelle Basen) eingeführt werden, die zu mehr als einem Nukleinsäure-Fragment komplementär sind. Bei den Hybridisierungssonden kann es sich ebenfalls um Nukleinsäuren, insbesondere DNA- oder RNA-Moleküle, jedoch auch um Nukleinsäureanaloga, wie Peptidnukleinsäuren (PNA), Locked-Nukleinsäuren (LNA) etc. handeln. Die Hybridisierungssonden haben vorzugsweise eine Länge entsprechend 10–100 Nukleotiden und müssen nicht durchgängig aus Bausteinen mit Basen bestehen, d. h. sie können beispielsweise auch abasische Bausteine, Linker, Spacer etc. enthalten.
  • Die Fängermoleküle können bei dem erfindungsgemäßen Verfahren auf einem Array oder auf Partikeln (Beads) immobilisiert sein oder in freier Form, d. h. in Lösung vorliegen.
  • Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäure-Fängermoleküle stellen vorzugsweise eine Population von mindestens 10, in manchen Ausführungsformen von mindestens 1.000, in anderen Ausführungsformen von mindestens 100.000 in anderen Ausführungsformen von mindestens 10.000.000 verschiedenen Nukleinsäuremolekülen dar.
  • Sequenzen von Nukleinsäure-Fängermolekülen können aus Datenbanken abgeleitet werden, welche die Nukleinsäuresequenzen von bereits durchsequenzierten Organismen enthalten. Alternativ können die Sequenzen von Nukleinsäure-Fängermolekülen auch aus bisher noch unbekannten Sequenzen, z. B. Sequenzen, die in den zu untersuchenden Nukleinsäure-Populationen noch nicht bekannt sind, gewählt werden.
  • Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Fängermoleküle können so gewählt werden, dass sie Sequenzen aus einer oder mehreren der zu untersuchenden Populationen von Nukleinsäuremolekülen enthalten. In bestimmten Ausführungsformen können Fängermoleküle gewählt werden, die Zielmoleküle aus nicht allen der zu untersuchenden Nukleinsäure-Populationen erkennen, beispielsweise Fängermoleküle, die nur Zielmoleküle aus einer der zu untersuchenden Nukleinsäure-Population erkennen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung trägt mindestens eine der Nukleinsäuremolekül-Populationen, vorzugsweise zumindest eine Population, welche die zu isolierenden Zielmoleküle enthält, eine Markierung. Markierungen können nachweisbare Gruppen, beispielsweise Farbstoffe, Fluoreszenzmarkierungen oder Partner von bioaffinen Bindepaaren sein, beispielsweise Haptene, die spezifisch an Antikörper binden, Biotin, das spezifisch an Avidin oder Streptavidin bindet, oder Kohlenhydrate, die spezifisch an Lectine binden. Andererseits kann die Markierung auch eine oder mehrere terminale Adapter-Nukleinsäuresequenzen darstellen, die beispielsweise in nachfolgenden Schritten eine Amplifikation ermöglichen.
  • Gegebenenfalls können auch mehrere der zu untersuchenden Nukleinsäure-Populationen Markierungen tragen, wobei vorzugsweise einzelne Nukleinsäure-Populationen verschiedene Markierungen tragen. Somit ist es möglich, dass im Rahmen der Isolierung und gegebenenfalls Charakterisierung der Nukleinsäure-Zielmoleküle diese einer bestimmten Nukleinsäure-Population zugeordnet werden können. Das erfindungsgemäße Verfahren kann einen einzigen Isolierungsschritt oder mehrere Zyklen konsekutiver Isolierung und gegebenenfalls Charakterisierung von Zielmolekülen enthalten. Die Charakterisierung der Zielmoleküle beinhaltet dabei vorzugsweise eine teilweise oder vollständige Sequenzbestimmung der isolierten Nukleinsäure-Zielmoleküle.
  • Im Rahmen einer aus mehreren Zyklen bestehenden Isolierungsprozedur kann zwischen einzelnen Zyklen eine Amplifikation und/oder eine Fragmentierung der Zielmolekül-Population erfolgen.
  • In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird beim Inkontaktbringen der Nukleinsäure-Populationen mit den Fängermolekülen ein DNA-Bindeprotein, insbesondere ein DNA-Bindeprotein mit einer Einzelstrang-DNA-abhängigen ATPase-Aktivität, wie etwa RecA und gegebenenfalls ATP, zugesetzt.
  • Im Folgenden werden bevorzugte Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung im Einzelnen erläutert:
  • Untersuchung von Host-Pathogen Nukleinsäure-Populationen
  • Eine typische Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Untersuchung eines Gemisches von Nukleinsäuren-Populationen eines Wirts, insbesondere eines eukaryotischen Wirts wie etwa eines Säugers, z. B. eines Menschen, und einem oder mehreren Pathogenen (Host-Pathogen-Populations-Gemisch). Hier ermöglicht die vorliegende Erfindung, dass Anteile des Pathogens gezielt aus dem Hintergrund des Wirts isoliert werden und der Sequenzanalyse zugeführt werden.
  • In einer ersten Ausführungsform wird der E. coli Stamm K12 z. B. im Gemisch mit dem pathogenen E. coli Stamm O157 im Verhältnis von 1:1000 (1 ng/1000 ng) zur Isolierung von Teilen der Nukleinsäure-Population von O157 untersucht. Als Fängersonden werden Sonden, die komplementär zu Sequenzen aus E. coli O157 sind, verwendet. Eine Identifizierung des Pathogens kann durch nachgeschaltete Sequenzierung erfolgen.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird der E. coli Stamm K12 z. B. im Gemisch mit humanen genomischer DNA im Verhältnis von 1:750 (2 ng/1500 ng) zur Isolierung von Teilen der Nukleinsäure-Population von E. coli K12 untersucht. Als Fängersonden werden Sonden, die komplementär zu Sequenzen aus E. coli K12 sind, verwendet. Eine Identifizierung der isolierten Nukleinsäure-Population kann durch nachgeschaltete Sequenzierung erfolgen.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird der pathogenen E. coli Stamm O157 z. B. im Gemisch mit humaner genomischer DNA im Verhältnis von 1:750 (2 ng/1500 ng) zur Isolierung von Teilen der pathogenen Nukleinsäure-Population von E. coli O157 untersucht. Als Fängersonden werden Sonden, die komplementär zu Sequenzen aus E. coli O157 sind, verwendet. Eine Identifizierung der isolierten Nukleinsäure-Population kann durch nachgeschaltete Sequenzierung erfolgen.
  • Eine weitere Ausführungsform sieht vor, dass in einem Gemisch der zu untersuchenden Nukleinsäure-Populationen, nebeneinander markierte und unmarkierte Nukleinsäure-Populationen vorliegen. Hierdurch kann die Performance der Isolierung signifikant gesteigert werden. Dies führt z. B. beim Nachweis eines Pathogens im Hintergrund des Wirts zu einer Sensitivitätssteigerung, die dann bei Sequenzanalyse von entscheidendem Vorteil ist.
  • Als Fängersonden-Matrix werden Sonden für das oder die zu untersuchenden Pathogene zur Verfügung gestellt. Das zu untersuchende Probenmaterial, das Nukleinsäure-Populationen des Wirts (z. B. Human) und des Pathogens (z. B. E. coli O157) beinhaltet, wird bei der Probenvorbereitung entsprechend den Protokollen der später verwendeten Sequenziertechnologie vorbereitet und erhält hierbei terminale Markierungen (Adapter-Sequenzen für spätere Amplifikations- bzw. Capturing-Schritte). Diesem komplexen Nukleinsäure-Populationsgemisch wird eine in Länge entsprechende humane Nukleinsäure-Population zugesetzt, die keine solche Markierung beinhaltet. Durch den Zusatz der nicht-markierten Nukleinsäure-Population im Sinne einer kompetitiven Hybridisierung wird erreicht, dass der Hintergrund für das zu analysierende Pathogen reduziert werden kann, da die nicht-markierte Nukleinsäure-Population zwar an der Kontaktierung mit Fängersonden teilnimmt, aber im folgenden Schritt (da ohne entsprechende Markierungs-/Adapter-Sequenzen) nicht bei der Adapter-basierten Amplifikation vervielfältigt wird und auch im folgenden Schritt bei der Sequenzanalyse nicht detektiert wird. Erfindungsgemäß wird die nicht-markierte Nukleinsäure-Population (hier humane genomische DNA) mindestens in gleicher Menge wie das zu untersuchende Probenmaterial, bevorzugt in einem Überschuss von 4–10fach, noch mehr bevorzugt in einem Überschuss von 10–100fach, eingesetzt
  • Untersuchung von Nukleinsäure-Populationen, die bis dato unbekannte Spezies enthalten
  • Eine weitere Anwendung der vorliegenden Erfindung ist der Nachweis von noch bis dato unbekannten Pathogenen aus Nukleinsäure-Populations-Gemischen. So lassen sich Zielmoleküle aus noch unbekannten Pathogenen nachweisen, indem als Fängermoleküle solche Sequenzen verwendet werden, die eine Homologie zu einer bestimmten Klasse von Pathogenen aufweisen (= Common Probes).
  • In einer ersten Ausführungsform wird ein Gemisch von verschiedenen E. coli-Stämmen untersucht. Als Fängersonden werden Sequenzen (Common Probes) gewählt, die möglichst vielen bekannten (und damit auch noch unbekannten Stämmen) gemein sind. Die Isolierung mit nachfolgender Sequenzierung ergibt dann Aufschluss welche E. coli-Stämme im Gemisch vorhanden waren und darüber hinaus auch Information, ob im Gemisch noch bislang unbekannte Stämme repräsentiert waren.
  • In einer weiteren Ausführungsform werden statt Common Probes für eine einzige bestimmte Nukleinsäure-Population, Common Probes für mehrere Nukleinsäure-Populationen gewählt. Durch ein derartiges Vorgehen ist es möglich, in noch wesentlich komplexeren Nukleinsäure-Populationen nach bislang unbekannten Vertretern dieser jeweiligen Klassen zu „fischen”.
  • Dabei kann das menschlichen Microbiom (Gesamtheit aller mikrobiellen Genome in einem menschlichen Organismus; siehe HGMI Human Gut Microbiome Initiative; http://genome.wustl.edu/hgm/HGM_frontpage.cgi) untersucht werden.
  • Im Discovery-Verfahren werden „Common” Fängersonden zur Verfügung gestellt, deren Sequenz nicht nur für einen einzigen, sondern für eine Klasse von Mikroorganismen spezifisch sind. Für jede der Klassen der Mikroorganismen, die gefischt werden sollen, werden jeweils Common Probes zur Verfügung gestellt. Die zu untersuchende Probe wird als komplexes Nukleinsäuregemisch mit den Fängersonden kontaktiert und so die entsprechenden Bereiche der Klassen der Mikroorganismen isoliert. Danach wird durch Sequenzanalyse bestimmt, welche und wie viele Mikroorganismen in der jeweils untersuchten Probe zugegen waren. Der Vergleich mit Sequenz- oder Sequenzierungsdaten bekannter Mikroorganismen (aus Datenbanken) ermöglicht dann im Rückschluss die Identifikation noch bislang unbekannter Mikroorganismen. Sobald eine solcher Mikroorganismus identifiziert wurde, kann in einem folgenden Versuch spezifisch nach diesem Mikroorganismus bzw. dieser speziellen Spezies gefischt werden.
  • Selbstverständlich kann durch Verwendung von Fängersonden, die sequenzspezifisch für eine Vielzahl von Nukleinsäure-Populationen, deren Sequenz bereits bekannt ist, ein solches komplexes Gemisch zielgerichtet untersucht werden. Nach Isolierung der jeweiligen Sequenzabschnitte von Interesse aus der Vielzahl der Nukleinsäure-Populationen wird das Isolat dann einer Sequenzanalyse unterzogen.
  • Profiling von komplexen Nukleinsäure-Populationen
  • Ein weitere Anwendung sieht vor, Individuen anhand ihrer komplexen Nukleinsäure-Populationen zu vergleichen. Solche Vergleiche ermöglichen einen Rückschluss auf Gemeinsamkeiten bzw. Unterschiede zwischen Individuen auf der Basis von komplexen Nukleinsäure-Populationen.
  • Ein Ausführungsbeispiel ist der Vergleich der Nukleinsäure-Populationen des humanen Mikrobioms verschiedener Individuen. Hierbei werden spezifische Fängersonden für Mikroorganismen verwendet, deren Sequenz bereits bekannt ist. Werden möglichst viele Mikroorganismen, idealerweise alle bislang für die zu untersuchenden Individuen bekannten Mikroorganismen, des Mikrobioms durch entsprechende Fängersonden abgebildet, kann jedes Individuums hinsichtlich des Mikrobioms möglichst präzise charakterisiert werden bzw. Unterscheide oder Gemeinsamkeiten bestimmt werden.
  • Ein weiteres Ausführungsbeispiel ist der Vergleich der Nukleinsäure-Populationen von bestimmten Geweben verschiedener Individuen, z. B. humaner Individuen. Bei den Geweben kann es sich z. B. um Tumoren oder gesundes Gewebe, Gewebe spezifischer Herkunft (Hirn, Pankreas, Lunge, Herz, Haut, etc.) handeln. Hierbei werden spezifische Fängersonden für diejenigen Sequenzabschnitte des humanen Genoms verwendet, für die eine detaillierte Analyse gewünscht ist. Nach Kontaktieren der Nukleinsäure-Populationen mit den Fängersonden werden die gewünschten Nukleinsäure-Sequenzen von den Fängersonden gebunden. Nach Abtrennen des nicht-gebundenen Materials, können die gebundene Teile Nukleinsäure-Populationen isoliert und der Sequenzanalyse zugeführt werden.
  • Exon-Junction Analyse
  • Bislang noch wenig verstanden ist das alternative Splicing von komplexen Genomen. Festgestellt werden konnte bislang, dass die meisten Gene dem alternativen Splicing unterliegen, nichtsdestotrotz fehlen noch Hoch-Durchsatzmethoden, um dies im Detail zu untersuchen.
  • Die Analyse von alternativem Splicing mit entsprechenden Microarrays (u. a. Firma Affymetrix, USA) erlaubt lediglich die Detektion von sehr häufig vorkommenden Splice-Formen und auch nur solche Varianten, die zu dem Zeitpunkt bekannt waren, als der entsprechende Microarray angefertigt wurde.
  • Die vorliegende Erfindung löst diese Problem folgendermaßen:
    • – Zurverfügungstellung von RNA, z. B. Gesamt-RNA, der zu untersuchenden Proben,
    • – daraus Herstellen einer paired-End Sequenz-cDNA-Bibliothek mit Adapter-Sequenzen, z. B. mit den für eine NGS-Plattform (454, Illumina, solid) üblichen Adapter-Sequenzen,
    • – Design von spezifischen Fängersonden, wobei die Sonden komplementär zu den 3'- und 5'-terminalen Bereichen der Exons der zu untersuchenden Gene sind,
    • – Kontaktieren der Fängersonden mit der paired-End Sequenz-cDNA-Bibliothek,
    • – Entfernen der nicht an die Fängersonden spezifisch gebundenen Fragmente,
    • – Isolierung der an die Fängersonden gebundenen Fragmente,
    • – Sequenzanalyse der isolierten Fragmente,
    • – Kartierung der Sequenzierungsresultate bezüglich der Exon-Sequenzen (alle möglichen Kombinationen der Exon der jeweiligen zu untersuchenden Gene); hierdurch kann festgestellt werden, welches Exon mit welchem anderen Exons des jeweiligen Gens verbunden ist; dies ist durch die beiden paired-end Sequenz-Reads, die eine definierte Länge (Bibliothek-Größen) überbrücken können, möglich,
    • – gegebenenfalls digitales Auszählen der Exon-Junctions.
  • Hierbei können die Fängersonden an fester Phase oder in flüssiger Phase eingesetzt werden. Ein direkter Vergleich zwischen Individuen wird dadurch möglich, dass gleichzeitig zwei und mehr Nukleinsäure-Populationen, die durch eine entsprechende Markierung unterscheidbar sind, dem oben dargelegten Verfahren unterzogen werden.
  • Analyse von Translokationen für die Tumordiagnostik
  • Eine wesentliche Erscheinungsform von Krebs ist die Translokation in Krebs-assoziierten Genen (http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/Census/). Um diese nachweisen zu können, wird erfindungsgemäß folgendes Vorgehen vorgeschlagen:
    • – Zurverfügungstellung einer Nukleinsäure-Population aus der zu untersuchenden genomischen DNA,
    • – daraus Herstellen einer paired-End Sequenz-Bibliothek mit Adapter-Sequenzen, z. B. mit den für eine NGS-Plattform (454, Illumina, solid) üblichen Adapter-Sequenzen,
    • – Design von spezifischen Fängersonden; die Sonden sind komplementär zu terminalen-Enden der bekannten Translokations-Bruchstellen der zu untersuchenden Gene,
    • – Kontaktieren der Fängersonden mit der paired-End Sequenz-Bibliothek,
    • – Entfernen der nicht spezifisch gebundenen Fragmente,
    • – Isolierung der gebundenen Fragmente,
    • – Sequenzanalyse der gebundenen Fragmente,
    • – Kartierung der Sequenzierungsdaten bezüglich der genomischen Sequenz (mit und ohne Translokations-Ereignis),
    • – Feststellen und Auszählen der Translokationsereignisse für die zu untersuchende Probe.
  • Hierbei können die Fängersonden an fester Phase oder in flüssiger Phase eingesetzt werden. Ein direkter Vergleich zwischen Individuen wird dadurch möglich, dass gleichzeitig zwei und mehr Nukleinsäure-Populationen, z. B. aus dem Genom einer Tumorzelle und einer normalen Zelle, dem oben dargelegten Verfahren unterzogen werden.
  • Idealerweise werden diese Analysen simultan durchgeführt, indem die Nukleinsäure-Populationen von Tumor und Normal-Zustand jeweils mit einer entsprechenden Markierung versehen werden, die eine Zuordnung zur jeweiligen Population (Tumor oder normal) bei der anschließenden Sequenzanalyse zulässt.
  • Analyse von Variationen in der Kopienzahl von Genen
  • Um im Rahmen der CGH-Methode Copy Number Variations (CNVs) zu detektieren, werden bislang vor allem Mikroarrays, die aus langen Oligonukleotiden oder BACs aufgebaut sind, verwendet. Diese Methode ist jedoch hinsichtlich Sensitivität und Robustheit limitiert.
  • Um CNV möglichst hochauflösend nachweisen zu können, wird erfindungsgemäß folgendes Vorgehen vorgeschlagen:
    • – Zurverfügungstellung einer Nukleinsäure-Population der zu untersuchenden genomischen DNA,
    • – daraus Herstellen einer Sequenz-Bibliothek mit Adapter-Sequenzen, z. B. mit den für die NGS-Plattform (454, Illumina, solid) üblichen Adapter-Sequenzen,
    • – Design von spezifischen Fängersonden; die Sonden sind komplementär zu den auf CNV zu untersuchenden Regionen im Genom,
    • – Kontaktieren der Fängersonden mit der Sequenz-Bibliothek,
    • – Entfernen der nicht spezifisch gebundenen Fragmente,
    • – Isolierung der gebundenen Fragmente,
    • – Sequenzanalyse der gebundenen Fragmente,
    • – Kartierung der Sequenzierungsresultate bezüglich der genomischen Sequenz und
    • – Auszählen der Kopien für die zu untersuchende Probe.
  • Wird statt einer zu untersuchenden genomischen Population ein Gemisch aus indexierten Populationen (z. B. mit Barcodes versehen; nach Sequenzierung kann dann der Pool und damit die zugrunde liegende Sequenzinformation dekodiert werden), können Copy Number Variationen direkt aus den Daten der NGS-Sequenzierung abgeleitet werden.
  • Multiplexing
  • Um möglichst viele Nukleinsäure-Populationen parallel zu untersuchen, bietet sich ein so genanntes Multiplexing an. Hierbei wird jede Nukleinsäure-Population durch einen so genannten Code (oder Barcode, Index) markiert. Nach gemeinsamer Sequenzanalyse der Mischung mehrerer Nukleinsäure-Populationen ist es durch die Codierung der einzelnen Populationen möglich, die erhaltenen Sequenzdaten den jeweiligen Populationen zuzuordnen.
  • Literaturbekannt sind Codes (Barcodes), die bei der Probenvorbereitung der jeweiligen Nukleinsäure-Populationen eingeführt werden. Dies erfolgt u. a. durch Einführung der Barcodes im Rahmen von Primer-Sequenzen durch PCR-Schritte.
  • Eine weitere Möglichkeit, Multiplexing durchzuführen, ergibt sich durch eine physische Trennung der zu untersuchenden Abschnitte der jeweiligen Nukleinsäure-Population.
  • Anwendungsbeispiel:
  • Im Rahmen einer Prozessoptimierung sollen für die Entwicklung eines Krebs-Chips verschiedene Prozess-Parameter multiplex untersucht werden. Per Sequenzanalyse sollen 112 Krebsgene untersucht werden. Um die optimalen Versuchsbedingungen für die Selektion der Krebsgene aus der komplexen Nukleinsäure-Population (humane genomische DNA) zu bestimmen, werden für 8 × 14 unterschiedliche Krebsgene spezifische Fängersonden und 8 Patienten-Proben zur Verfügung gestellt. Jeweils 14 Krebsgene stellen eine Experiment-Einheit dar. Diese werden physisch getrennt zur Verfügung gestellt (z. B. 8 individuelle Arrays, 8 individuelle Bead-Bibliotheken, 8 individuelle Fängersonden-Bibliotheken in Lösung). Es werden 8 Experimente durchgeführt, wobei 8 unterschiedliche Prozessparameter (u. a. Puffer-, Elutions-, Temperatur-Bedingungen, Sondenlänge etc.), verwendet werden. Nach Kontaktieren der Proben mit den entsprechenden Fängersonden werden die nicht gebundenen Teile der jeweiligen Nukleinsäure-Populationen (Proben) entfernt und die gebundenen Teile isoliert. Nach der Isolierung der gebundenen Teile der Nukleinsäure-Populationen der 8 separaten Experimente werden die 8 Proben wieder vereinigt und über eine Sequenzanalyse ausgewertet. Durch Korrelation der Sequenzdaten zu den jeweiligen Experimenteinheiten (und damit den jeweilig verwendeten Prozessparametern) kann multiplex, sehr effektiv und rasch ein optimierter Satz an Prozessparametern bestimmt werden.
  • Konsekutive Mehrfach-Isolierung
  • Eine weitere Möglichkeit, die Performance der Isolierung von Nukleinsäure-Sequenzen aus zwei oder mehr komplexen Nukleinsäure-Populationen besteht darin, eine zwei- oder mehrfache Kontaktierung mit Fängersonden durchzuführen. Hierbei werden für einen Isolierungsschritt ein erster Satz an Fängersonden, für einen zweiten Isolierungsschritt ein zweiter Satz und gegebenenfalls für weitere Isolierungsschritte weitere Sätze von Fängersonden zur Kontaktierung der Nukleinsäure-Population verwendet. Die Probe wird erfindungsgemäß zunächst mit dem ersten Satz Fängersonden kontaktiert, die nicht-gebundenen Bestandteile der Nukleinsäure-Populationen entfernt und die gebundenen Bestandteile isoliert. Um die isolierten Nukleinsäuren für einen weiteren Isolierungsschritt verfügbar zu machen, bietet es sich gegebenenfalls an, die isolierten Nukleinsäuren zunächst zu amplifizieren, um ausreichend Material zur Verfügung zu stellen. Die im ersten Schritt isolierten Nukleinsäuren werden dann – gegebenenfalls nach Amplifikation – mit dem zweiten Satz an Fängersonden kontaktiert. Die nicht-gebundenen Bestandteile werden entfernt und die gebundenen Nukleinsäuren isoliert. Sollte noch eine höhere Performance erforderlich sein, können weitere Isolierungsschritte erfolgen, bevor das Isolat dann einer Sequenzanalyse unterzogen wird.
  • Erfindungsgemäß kann der erste, der zweite und weitere Sätze an Fängersonden identisch sein. Darüber hinaus kann es erforderlich sein, dass der erste, zweite und weitere Sätze von Fängersonden unterschiedlich sind. Ebenso sind Mischformen von identischen und unterschiedlichen Sätzen aus Fängersonden möglich.
  • Des Weiteren kann die Performance der Isolierung nach den ersten, zweiten und weiteren Isolierungszyklen durch Sequenzanalyse überwacht werden. Erfindungsgemäß können so viele Isolierungszyklen durchgeführt werden, bis die erforderliche Performance erreicht ist.
  • Ein für die Performance wesentliches Kriterium, nämlich die Homogenität der Isolierung kann erfindungsgemäß über die konsekutive Mehrfach-Isolierung sehr effektiv gesteigert werden. Während in einen ersten Zyklus der Isolierung von Nukleinsäuresequenzen aus Nukleinsäure-Populationen bestimmte Zielsequenzen noch unterrepräsentiert sind und somit eventuell unter die Nachweisgrenze des Sequenzier-Gerätes fallen, können diese durch nach der Amplifikation anschließende zweite (oder entsprechend weitere) Isolierungszyklen in einer höheren Kopienzahl verfügbar gemacht werden. Das heißt, diese vorher nicht analysierbaren Regionen können nach einem oder mehreren weiteren Zyklen jetzt über das Sequenziergerät analysiert werden. Somit stellt das erfindungsgemäße Verfahren eine Methode zu Erhöhung der Sensitivität der Sequenziertechnologie dar.
  • Des Weiteren können Regionen, die hinsichtlich ihrer Repräsentation in einem ersten Isolierungszyklus sehr unterschiedlich waren, durch einen zweiten (oder weiteren) Isolierungszyklus hinsichtlich ihrer Repräsentation effizient homogenisiert werden. Somit stellt das erfindungsgemäße Verfahren eine Methode zur Homogenisierung der Repräsentation von Nukleinsäure-Fragmenten dar.
  • Anwendungsbeispiele:
  • Konsekutive Isolierung humaner Gene (BRCA1, BRCA2, TP53, KRAS) aus einem komplexen Gemisch von Nukleinsäure-Populationen mit unterschiedlichen Fängersonden-Sätzen.
  • Das komplexe Gemisch von Nukleinsäure-Populationen setzt sich aus humaner genomischer DNA, humaner tRNA und Hering-Sperma-DNA zusammen. Die Fängersonden zur Isolierung der humanen Gene BRCA1, BRCA2, TP53 und KRAS werden aus einer Datenbank (NCBI: hg 18) generiert, die die hoch-komplexen Bereiche (high-complexity regions) des humanen Genoms beinhalten. Es werden zwei Sätze (Satz A, Satz B) an Fängersonden für jedes der zu isolierenden Gene BRCA1, BRCA2, TP53 und KRAS generiert. Hierbei unterscheiden sich die Fängersonden von Satz A und B. Das zu untersuchende Gemisch von humaner genomischer DNA, humaner tRNA und Hering-Sperma-DNA wird mit Fängersonden-Satz A kontaktiert, die ungebundenen Bestandteile entfernt und die gebundenen Bestandteile nachfolgend isoliert. Danach werden die isolierten Nukleinsäuren mit Hilfe von PCR amplifiziert und mit dem Fängersonden-Satz B kontaktiert. Die ungebundenen Bestandteile werden entfernt und die gebundenen Bestandteile nachfolgend isoliert. Nach zwei Runden der Isolierung werden die isolierten Nukleinsäuren einer Sequenzanalyse unterzogen.
  • Konsekutive Isolierung humaner Gene (BRCA1, BRCA2, TP53, KRAS) aus einem komplexen Gemisch von Nukleinsäure-Populationen mit identischen Fängersonden-Sätzen.
  • Das komplexe Gemisch von Nukleinsäure-Populationen setzt sich aus humaner genomischer DNA, humaner tRNA und Hering-Sperma-DNA zusammen. Die Fängersonden zur Isolierung der humanen Gene BRCA1, BRCA2, TP53 und KRAS werden aus einer Datenbank (NCBI: hg 18) generiert, die die hoch-komplexen Bereiche (high-complexity regions) des humanen Genoms beinhalten. Es werden zwei Sätze (Satz A, Satz B) an Fängersonden für jedes der zu isolierenden Gene BRCA1, BRCA2, TP53 und KRAS generiert. Hierbei sind die Fängersonden von Satz A und B identisch. Das zu untersuchende Gemisch von humaner genomischer DNA, humaner tRNA und Hering-Sperma-DNA wird mit Fängersonden Satz A kontaktiert, die ungebundenen Bestandteile entfernt, und die gebundenen Bestandteile nachfolgend isoliert. Danach werden die isolierten Nukleinsäuren mit Hilfe von PCR amplifiziert und mit dem Fängersonden-Satz B kontaktiert. Die ungebundenen Bestandteile werden entfernt und die gebundenen Bestandteile nachfolgend isoliert. Nach zwei Runden der Isolierung werden die isolierten Nukleinsäuren einer Sequenzanalyse unterzogen.
  • Erhöhung der Performance durch RecA
  • Die Verwendung von RecA, z. B. thermostabiles RecA, erhältlich bei www.biohelix.com, bei der Kontaktierung eines komplexen Gemisches von Nukleinsäure-Populationen mit den Fängersonden ermöglicht eine Erhöhung der Performance. RecA als DNA-bindendes Protein mit einer ssDNA-abhängigen ATPase-Aktivität bindet zunächst an die Einzelstrang-Fängersonden und unterstützt aktiv die spezifische Bindung an die Zielmoleküle.
  • Anwendungsbeispiel:
  • Kontaktieren der Fängersonden mit RecA in RecA-Puffer. Zufügen von ATP zum Gemisch der Nukleinsäure-Populationen. Anschließend Zufügen des mit ATP-versetzen Gemisches aus Nukleinsäure-Populationen zum RecA/Fängersonden-Gemisch. Inkubation. RecA unterstützt die spezifische Bindung an die Fängersonden. Entfernen der nicht an die Fängersonden gebundenen Teile der Nukleinsäure-Populationen. Isolierung der gebundenen Teile der der Nukleinsäure-Populationen. Sequenzanalyse des Isolates.
  • Isolierung von Nukleinsäure-Populationen für die Sequenzanalyse mit der Roche 454-Sequenzier-Technologie
  • Für die erfolgreiche Sequenzierung mittels eines Roche/454 Sequenzierers muss eine DNA-Probe fragmentiert und modifiziert werden. Insbesondere ist es notwendig, zwei unterschiedliche Adaptoren an die DNA-Fragmentenden zu ligieren und einzelne dieser so gewonnenen Moleküle auf einzelne Beads zu immobilisieren. Diese werden dann in einer Emulsions-PCR amplifiziert, was zu klonalen Beads führt, die eine große Anzahl von Kopien des gleichen DNA Fragmentes tragen und zum Sequenzieren verwendet werden können. Es besteht in den dem Fachmann bekannten Protokollen zur Generierung von DNA-Bibliotheken (siehe z. B.: GS DNA Library Preparation Kit Quick Guide, GS 20 Training Guide Version II, GS emPCR Kit Quick Guide, GS emPCR Kit User's Manual, GS FIX DNA Library Preparation Kit User's Manual, GS FIX Sequencing Method Manual) bei unterschiedlichen Schritten die Möglichkeit, eine Anreicherung gewünschter Sequenzen vorzunehmen.
  • Folgende Schritte werden für die Generierung einer Bibliothek in dem Fachmann bekannten Protokollen durchgeführt:
    • 1. DNA Fragmentierung (Nebulization) oder LMW DNA-Qualitätsbestimmung
    • 2. Fragmentenden-Polishing
    • 3. Adaptorligation
    • 4. Bibliothek-Immobilisierung
    • 5. Auffüll-Reaktion
    • 6. Einzelstrang Template DNA (sstDNA) Bibliothek-Isolierung
    • 7. sstDNA Bibliothek-Qualitätsbestimmung und Quantifizierung.
  • Es können nach, vor oder während einem, mehreren oder allen dieser Schritte sequenzspezifische Anreicherungen vorgenommen werden. Ein besonders bevorzugter Schritt für die Durchführung einer Sequenzanreicherung ist Schritt 6. Hierbei werden selektiv einzelsträngige DNA-Fragmente mit zwei unterschiedlichen Adaptoren A und B aus einem Gemisch von doppelsträngigen Fragmenten mit zufällig verteilten Adaptoren (AA, AB, BB) erhalten. Einer der Adaptoren ist an einem Strang biotinyliert, die Fragmente werden auf Streptavidin-präsentierende Beads gebunden. Durch einen nicht denaturierenden Waschschritt werden Fragmente entfernt, die nur Adaptor ohne Biotin enthalten. In einem darauf folgenden, denaturierenden Waschschritt werden selektiv einzelsträngige Fragmente von den Beads eluiert, die kein Biotin enthalten. Der Biotin enthaltende Gegenstrang bleibt gebunden, ebenso Fragmente, die zwei biotinhaltige Adaptoren tragen.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden gewünschte Sequenzen, wie beschrieben, aus den so erhaltenen Fragmenten angereichert. Optional wird die Probe vorher durch eine dem Fachmann bekannte LMA (Linker Mediated Amplification) vermehrt, bevorzugt durch die Verwendung der beiden Adaptorsequenzen als Primer-Bindungsstellen, wobei einer der beiden Primer biotinyliert sein kann. Nach einer Anreicherung kann die Probe optional erneut amplifiziert werden und erneut, wie beschrieben, dem Protokollschritt 6 unterzogen werden, wodurch wieder eine einzelsträngige Bibliothek mit zwei unterschiedlichen Adaptoren erhalten wird.
  • Es ergibt sich also folgende Abfolge des Protokolls:
    • – gDNA Fragmentation (200–300 bp, 3–5 μg) Entfernung kleiner Fragmente (Beads) Adaptor Ligation (Polishing) sstDNA Bibliothek-Herstellung (Beads)
    • – (opional: Voranreicherung Adaptor PCR)
    • – HybSelect (Sequenz-spezifische Anreicherung) Adaptor PCR nach Anreicherun
    • – Bibliothek Capture + emPCR (Beads) Bibliothek Bead Anreicherung Sequenzierprimer Annealing Next Generation Sequenzierung
  • Verwendung langer Nukleinsäure-Abschnitte
  • Zur Anreicherung von definierten Nukleinsäure-Abschnitte sind Verfahren literaturbekannt, die die zu analysierende Nukleinsäure-Population in kurze (ABI-Solid: < 100 bp, Illumina-Genome Analyzer < 400 bp, Roche-45 < 500 bp) Nukleinsäure-Abschnitte fragmentiert (durch Ultraschall oder Nebulizer). Dies hat vor allem bei kurzen Leseweiten des Sequenziergerätes für die Isolierung der relevanten Nukleinsäure-Bereiche den entscheidenden Nachteil, dass die Kapazität der Fängersondenmatrix (auf Festphase oder in Lösung) schlecht ausgenützt wird.
  • Erfindungsgemäß werden die Nukleinsäure-Populationen in möglichst große Fragmente von z. B. 5–20 kb gespalten, mit diesen großen Fragmenten die Isolierung der Nukleinsäurebereiche durchgeführt und anschließend die großen Fragmente in die für die jeweiligen Sequenzier-Technologie erforderlichen Größen von z. B. 90–500 bp gebracht. Dies hat den entscheidenden Vorteil, dass die Kapazität der Fängersondenmatrix wesentlich besser ausgenutzt wird, d. h. mit der identischen Fängersondenmatrix kann mehr Information/Daten isoliert werden.
  • Anwendungsbeispiel:
  • Die zu analysierenden Nukleinsäure-Populationen werden in ca. 10 kb große Fragmente zerkleinert. Mit dieser Populationen wird die Isolierung der Nukleinsäurebereiche durchgeführt. Nach Isolierung werden die isolierten Nukleinsäure-Zielmoleküle einer Fragmentierung unterzogen, aus der eine Fragmentgröße von ca. 400 bp resultiert. In einem nächsten Schritt wird die Nukleinsäurepopulation mit entsprechenden terminalen Adapter-Sequenzen, z. B. passend für den Illumina Genome Analyzer versehen (siehe Library-Kit Illumina Genome Analyzer). Anschließend wird eine Sequenzanalyse durchgeführt
  • In einer besonderen Ausführungsform werden mehrere Isolierungszyklen mit unterschiedlichen Fragmentgrößen der Nukleinsäure-Populationen durchgeführt.
  • Anwendungsbeispiel:
  • Die zu analysierenden Nukleinsäure-Populationen (z. B. Gemisch von humaner genomischer DNA und tRNA) werden in 2–5 kb große Fragmente zerkleinert. Mit dieser Populationen wird die Isolierung der Nukleinsäurebereiche durchgeführt. Nach Isolierung wird die isolierte Nukleinsäure-Populationen einer Fragmentierung unterzogen, aus der eine Fragmentgröße von 400 bp resultiert. In einem nächsten Schritt wird die Nukleinsäure-Population mit entsprechenden terminalen Adapter-Sequenzen, z. B. passend für den Illumina Genome Analyzer versehen (siehe Library-Kit Illumina Genome Analyzer) versehen. Basierend auf den Adapter-Sequenzer wird eine Amplifikation über PCR durchgeführt, um ausreichend Material für einen weiteren Isolierungszyklus verfügbar zu machen. Dieser Isolierungszyklus wird nun mit einer Fragmentgröße von 400 bp durchgeführt. Nach Isolierung der interessierenden Nukleinsäuresequenzen und einer PCR mit 15-Zyklen basierend auf den Adaptersequenzen wird eine Sequenzanalyse durchgeführt.
  • Abbildungen
  • 1:
    • S6: E. coli Stamm K12 im Gemisch mit humaner genomischer DNA im Verhältnis von 1:750 (2 ng/1500 ng) – Isolierung von Teilen der Nukleinsäure-Population von E. coli K12. Als Fängersonden werden Sonden, die komplementär zu Sequenzen aus E. coli K12 sind, verwendet. Detailidentifizierung der isolierten Nukleinsäure-Population durch nachgeschaltete Sequenzierung
    • S3: E. coli Stamm K12 (2 ng) – Isolierung von Teilen der Nukleinsäure- Population von E. coli K12. Als Fängersonden werden Sonden, die komplementär zu Sequenzen aus E. coli K12 sind, verwendet. Detail-Identifizierung der isolierten Nukleinsäure-Population durch nachgeschaltete Sequenzierung.
    • Vergleich S6 mit S3: Erhöhung der Komplexität der Probe (Zusatz einer weiteren Nukleinsäure-Population) erhöht die Performance der Isolierung (Anreicherung) der gewünschten Nukleinsäure-Bereiche. (S6 und S3: Sequenzanalyse über Illumina Genome Analyzer)
  • 2:
  • E. coli Stamm K12 im Gemisch mit pathogenem E. coli Stamm O157 im Verhältnis von 1:1000 (O157:1 ng/K12:1000 ng) zuzüglich 1500 ng humaner genomischer DNA-Isolierung von Teilen der Nukleinsäure-Population von O157. Als Fängersonden werden Sonden, die komplementär zu Sequenzen aus E. coli O157 sind, verwendet. Detail-Identifizierung des Pathogens durch nachgeschaltete Sequenzierung.
  • Es werden folgende Typen von Fängersonden verwendet:
    – Spezifisch für O157: 7546 Fängersonden
    – Common: 7546 Fängersonden
  • Die Common-Fängersonden sind mehreren E. coli Stämmen (z. B. O157, K12) gemein.
  • 3:
  • Konsekutive Isolierung humaner Gene (BRCA1, BRCA2, TP53, KRAS) aus einem komplexen Gemisch von Nukleinsäure-Populationen mit zwei unterschiedlichen Fängersonden-Sätzen. Es werden zwei konsekutive Isolierungen getätigt. Visualisiert ist die Sequenzanalye von TP53.
  • Oben:
    • – Referenzsequenz: TP53
    • – Fängersonden (Probes) werden zu einer Probe Consensus Sequence zusammengefügt; die so gebildeten Sequenabschnitte sollen aus der Nukleinsäure-Population isoliert werden.
  • Mitte:
    • – Sequenzanalyse des 2. Zyklus der Isolierung von TP53-Sequenzabschnitten (die Reads der Sequenz-Analyse werden auf die aus den Fängersonden gebildeten Probe Consensus Sequence gemapped); eine wesentlich höhere Performance der Isolierung im Vergleich zu Zyklus 1 ist deutlich zu sehen; Fängersonden von Isolierungszyklus 2 waren unterschiedlich zu Fängersonden aus Zyklus 1.
  • Unten:
    • – Sequenzanalyse des 1. Zyklus der Isolierung von TP53-Sequenzabschnitten; eine geringere Performance der Isolierung als in Zyklus 2 ist deutlich zu sehen; Fängersonden von Isolierungszyklus 1 waren unterschiedlich zu Fängersonden aus Zyklus 2
    • (Zyklus 1 und 2: Sequenzanalyse über Illumina Genome Analyzer)
  • 4:
    • Probenvorbereitung für die Anreicherung von DNA-Fragmenten für die nachgeschaltete Sequenzanalyse mittels Roche/454-Sequenzierung.
  • 5:
  • Konsekutive Isolierung humaner Gene (BRCA1, BRCA2, TP53, KRAS) aus einem komplexen Gemisch von Nukleinsäure-Populationen mit zwei identischen Fängersonden-Sätzen. Es werden zwei konsekutive Isolierungen getätigt. Visualisiert ist die Sequenzanalyse von TP53.
  • Oben:
    • – Referenzsequenz: (region of interest): TP53
    • – Fängersonden (Probes) werden zu einer Probe Consensus Sequence zusammengefügt; die so gebildeten Sequenzabschnitte sollen aus der Nukleinsäure-Population isoliert werden
  • Mitte:
    • – Sequenzanalyse des 1. Zyklus der Isolierung von TP53-Sequenzabschnitten (die Reads der Sequenz-Analyse werden auf die Bereiche der Fängersonden gemapped); eine wesentlich höhere Performance der Isolierung im Vergleich zu Zyklus 1 ist deutlich zu sehen; Fängersonden von Isolierungszyklus 2 waren identisch zu Fängersonden aus Zyklus 1
  • Unten:
    • – Sequenzanalyse des 2. Zyklus der Isolierung von TP53-Sequenzabschnitten; eine geringere Performance der Isolierung als in Zyklus 2 ist deutlich zu sehen Fängersonden von Isolierungszyklus 1 waren unterschiedlich zu Fängersonden aus Zyklus 2
    • (Zyklus 1 und 2: Sequenzanalyse über Illumina Genome Analyzer)
    • A: Der Grad der Perfomance-Steigerung ist deutlich anhand der Skala (1. Zyklus: 16, 2. Zyklus: 401) ersichtlich. Die Einheit der Skala ist die so genannte Coverage, die angibt, wie oft die entsprechende Basenposition durch Sequenz-Reads abgedeckt ist.
    • B, D: Der Vergleich zwischen 1. und 2. Zyklus zeigt, dass die Sequenzabdeckung im 2. Zyklus wesentlich homogener ist, somit eine effektive Homogenisierung erzielt wurde.
    • C, F: Der Vergleich zwischen 1. und 2. Zyklus zeigt, dass sehr effektiv Sequenzlücken, die noch im 1. Zyklus vorhanden waren, effektiv geschlossen werden konnten
    • E: Der Vergleich zwischen 1. und 2. Zyklus zeigt, dass die Sensitivität des Sequenzierer gesteigert werden konnte, da im 2. Zyklus Sequenzabschnitte analysiert werden konnten, die im ersten Zyklus unter die Nachweisgrenze des Sequenzierers gefallen sind.
  • 6:
  • Konsekutive Isolierung humaner Gene (BRCA1, BRCA2, TP53, KRAS) aus einem komplexen Gemisch von Nukleinsäure-Populationen mit 2 identischen Fängersonden Sätzen. Es werden 2 konsekutive Isolierungen getätigt. Visualisiert ist die Sequenzanalyse eines Abschnitts von BRCA2 im Detail.
  • Oben:
    • – Referenzsequenz: (region of interest): BRCA2
    • – Fängersonden (Probes) werden zu einer Probe Consensus Sequence zusammengefügt; die so gebildeten Sequenzabschnitte sollen aus der Nukleinsäure-Population isoliert werden
  • Mitte:
    • – Sequenzanalyse des 1. Zyklus der Isolierung von BRCA2-Sequenzabschnitten (die Reads der Sequenz-Analyse werden auf die aus den Fängersonden gemapped); eine wesentlich höhere Performance der Isolierung im Vergleich zu Zyklus 1 ist deutlich zu sehen; Fängersonden von Isolierungs-Zyklus 2 waren identisch zu Fängersonden aus Zyklus 1
  • Unten:
    • – Sequenzanalyse des 2. Zyklus der Isolierung von TP53-Sequenzabschnitten; eine geringere Performance der Isolierung als in Zyklus 2 ist deutlich zu sehen; Fängersonden von Isolierungszyklus 1 waren unterschiedlich zu Fängersonden aus Zyklus 2
    • (Zyklus 1 und 2: Sequenzanalyse über Illumina Genome Analyzer)
    • A, B: Der Vergleich zwischen 1. und 2. Zyklus zeigt, dass sehr effektiv Sequenzlücken, die noch im 1. Zyklus vorhanden waren, effektiv geschlossen werden konnten
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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    • - http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/Census/ [0045]
    • - www.biohelix.com [0064]

Claims (18)

  1. Verfahren zur Isolierung von Ziel-Nukleinsäuremolekülen, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen eines Gemisches von mindestens zwei Populationen von Nukleinsäuremolekülen, (b) Inkontaktbringen des Gemisches mit einer Population von Nukleinsäure-Fängermolekülen unter Bedingungen, bei denen Ziel-Nukleinsäuremoleküle aus mindestens einer der Populationen spezifisch an die Fängermoleküle binden können, (c) Abtrennen von nicht Fängermoleküle gebundenem Material und (d) Isolieren und gegebenenfalls Charakterisieren der isolierten Ziel-Nukleinsäuremoleküle.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens zwei Nukleinsäure-Populationen aus gleichen oder unterschiedlichen Spezies stammen.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens zwei Nukleinsäure-Populationen aus unterschiedlichen Organismen einer Spezies stammen.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Fängermoleküle auf einer festen Phase, z. B. einem Array, auf Partikeln oder auf einer Membran immobilisiert sind.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Fängermoleküle in freier Form vorliegen.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz der Fängermoleküle aus einer Datenbank oder Internet-Datenbank abgeleitet wird, die Nukleinsäure-Sequenzen sequenzierter Organismen enthält.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine der Nukleinsäuremolekül-Populationen eine Markierung trägt.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Nukleinsäure-Populationen eine Markierung tragen, die es erlaubt, nach der Sequenzanalyse die Sequenzdaten einer bestimmten Nukleinsäure-Population zuzuordnen.
  9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierung eine nachweisbare Gruppe umfasst.
  10. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierung eine oder mehrere terminale Adapter-Sequenzen umfasst, die eine Amplifikation der isolierten Zielmoleküle ermöglichen.
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass ein Gemisch von mindestens einer markierten Nukleinsäure-Population und mindestens einer unmarkierten Nukleinsäure-Population untersucht wird.
  12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz der Nukleinsäure-Zielmoleküle in den zu untersuchenden Nukleinsäure-Populationen noch nicht bekannt ist.
  13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass es mehrere aufeinander folgende Isolierungszyklen unter Verwendung gleicher oder unterschiedlicher Fängermoleküle umfasst.
  14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die isolierten Teile der Nukleinsäure-Population einer anschließenden Sequenzbestimmung unterzogen werden.
  15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass nicht alle untersuchten Nukleinsäure-Populationen durch Fängermoleküle repräsentiert werden.
  16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass ein DNA-Bindeprotein, insbesondere ein DNA-Bindeprotein mit einer einzelsträngigen DNA-abhängigen ATPase-Aktivität wie etwa RecA und gegebenenfalls ATP, bei dem Inkontaktbringen zugesetzt werden.
  17. Verwendung des Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16 zur Bestimmung medizinischer, z. B. diagnostischer oder prognostischer Parameter.
  18. Verwendung nach Anspruch 17 zur Untersuchung von alternativem Splicing, zur Untersuchung von Exon-Junctions, zur Untersuchung von Variationen in der Kopienzahl, zur Untersuchung von Translokation in der Tumordiagnostik, zur Untersuchung von Microbiomen oder zum Nachweis von Pathogenen.
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