DE60029092T2

DE60029092T2 - Verfahren zur detektion von nukleinsäuren, welche auf krebs hinweisen

Info

Publication number: DE60029092T2
Application number: DE60029092T
Authority: DE
Inventors: N. Stanley Bedford LAPIDUS; P. Anthony Milford SHUBER
Original assignee: Exact Sciences Corp
Current assignee: Genzyme Corp
Priority date: 1999-04-09
Filing date: 2000-04-07
Publication date: 2007-02-01
Anticipated expiration: 2020-04-08
Also published as: US20050260638A1; US20130280727A1; US6964846B1; US20090291436A1; DE60029092D1; CA2366778C; AU767983B2; US20100173320A1; ES2269129T3; WO2000061808A9; JP2010187701A; JP4794052B2; EP1169479B1; WO2000061808A3; AU4210500A; ATE331811T1; CA2366778A1; WO2000061808A2; JP2002541824A; EP1169479A2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft Verfahren zur Früherkennung von Krebs bei Patienten durch Untersuchen auf große DNA-Fragmente. Verfahren der Erfindung sind insbesondere beim Nachweis von Colonkrebs brauchbar.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Veränderungen der genomischen Unversehrtheit sind oft mit einer Krankheit oder mit der Neigung zu einer Krankheit verbunden. Beispielsweise glaubt man von vielen Krebsarten, dass sie durch eine Reihe von Mutationen in genomischer DNA, die zu genomischer Instabilität in Form von unkontrolliertem Zellenwachstum führen, entstehen. In normalen Zellen führt eine Beschädigung von genomischer DNA typischerweise zur Expression von Tumor-Suppressoren, wie dem Zellzyklus-Regulator p53. Beispielsweise führt eine Beschädigung von zellulärer DNA zu gesteigerter Expression von p53, der den Zellzyklus anhält, um eine Reparatur des Schadens zu erlauben. Wenn die beschädigte DNA nicht repariert werden kann, unterliegt die Zelle der Apoptose, was die Anhäufung zusätzlicher Mutationen in Tochterzellen verhindert. Wenn es jedoch eine Mutation in dem p53-Gen selbst (oder in einem anderen Zellzyklus-Regulator) gibt, gehen beschädigte Zellen weiter durch den Zellzyklus, was zu Nachkommenschaft führt, in die zusätzliche DNA-Mutationen ungeprüft hineingehen. Es ist die Anhäufung dieser Mutationen, die das Kennzeichen vieler Krebsarten ist.
Der Prozess der Apoptose ist nicht nur bei der Regulierung des zellulären Metabolismus wichtig, sondern auch bei der Hemmung der Onkogenese. Wenn Zellen der Apoptose unterliegen, wird der Kern klein und fragmentiert. Kern-DNA wird zu Spindelfragmenten verdaut, die im Allgemeinen nicht größer als etwa 200 Basenpaare sind. Wenn der Prozess fortschreitet, üblicherweise auf vielen Wegen, löst sich die Zellmembran auf, und die Zellinhalte werden metabolisiert. Als ein Ergeb nis werden Zellen, die das Potenzial haben, den vielschrittigen Weg, der zu Krebs führt, zu beschreiten, beseitigt.
Viele Krebsarten sind heilbar, wenn sie früh in ihrer Entwicklung nachgewiesen werden. Beispielsweise entstehen colorektale Krebsarten typischerweise im Colonepithel und sind während frühen Entwicklungsstadien nicht extensiv mit Gefäßen versorgt (und daher nicht invasiv). Der Übergang zu einem hochgradig mit Gefäßen versorgten, invasiven und schließlich metastasierenden Krebs dauert gewöhnlich 10 Jahre oder länger. Wenn das Vorliegen von Krebs vor der extensiven Versorgung mit Gefäßen nachgewiesen wird, ist eine chirurgische Entfernung typischerweise eine effektive Heilung. Colorektaler Krebs wird jedoch oft erst bei der Manifestation klinischer Symptome, wie Schmerzen und schwarzem Teerstuhl, nachgewiesen. Im Allgemeinen liegen derartige Symptome erst vor, wenn die Krankheit gut ausgebildet ist, und oft nachdem eine Metastase stattgefunden hat. Die Früherkennung von colorektalem Krebs ist daher wichtig, um seine Krankheitshäufigkeit signifikant zu verringern.
Invasive diagnostische Verfahren, wie eine endoskopische Untersuchung, erlauben eine direkte visuelle Identifizierung, Entfernung und Biopsie von möglicherweise kanzerösem Gewebe. Eine Endoskopie ist kostspielig, unbequem, inhärent risikoreich und kein praktisches Werkzeug zur Frühdiagnose.
Etablierte nicht-invasive Untersuchungsverfahren bzw. Screening-Verfahren beinhalten die Prüfung von Stuhlproben auf die Anwesenheit von fäkalem okkultem Blut oder auf erhöhte Gehalte an carzinoembryonalem Antigen, die beide das Vorliegen von colorektalem Krebs nahelegen. Zusätzlich stellen kürzliche Entwicklungen der Molekularbiologie Verfahren von großem Potenzial zum Nachweisen des Vorliegens eines Bereichs von DNA-Mutationen, die auf colorektalen Krebs hinweisen, bereit. Das Vorliegen derartiger Mutationen kann in DNA, die man in Stuhlproben während verschiedener Stadien von colorektalem Krebs findet, nachgewiesen werden. Stuhl weist jedoch Zellen und Zellfragmente von dem Patienten, von Mikroorganismen und von Nahrungsmitteln auf, was zu einer heterogenen Population von Zellen führt. Dies macht es schwierig, kleine spezifische Subpopulationen zuverlässig nachzuweisen.
Es gibt in der Technik einen Bedarf an zusätzlichen nicht-invasiven Verfahren zur Frühdiagnose von Krebs, die charakteristische Merkmale nachweisen, die auf das Vorliegen von Krebs hinweisen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zum Identifizieren von Hinweisen auf Krebs in Gewebe- oder Körperflüssigkeits-Proben durch Identifizieren von nicht-apoptotischer DNA in jenen Proben bereit. Die Erfindung stellt auch Verfahren zum Identifizieren von Hinweisen auf Krebs oder eine Krebs-Vorstufe in Proben, die abgestoßene Epithelzellen enthalten, bereit. Es wurde nun erkannt, dass von abgestoßenen normalen (nicht-kanzerösen) Zellen erhaltene DNA anders ist als DNA, die von abgestoßenen Krebszellen oder Krebs-Vorstufen-Zellen erhalten wurde. Normale abgestoßene Zellen haben typischerweise eine Apoptose durchgemacht und produzieren daher Zellen oder Zellfragmente (abhängig vom Stadium der Apoptose), die DNA aufweisen, die im Wesentlichen abgebaut worden ist. Abgestoßene Krebszellen oder Krebs-Vorstufen-Zellen haben typischerweise keine Apoptose durchgemacht, und derartige Zellen oder ihre Fragmente produzieren zwar einige sehr kleine Fragmente als ein Ergebnis des Abbaus in der Probe, enthalten aber typischerweise auch einen höheren Anteil an großen DNA-Fragmenten (verglichen mit denjenigen, die in Zellen oder Fragmenten von abgestoßenen normalen Zellen beobachtet werden). Der Unterschied in der DNA-Unversehrtheit zwischen normalen und abnormalen Zellen ist ein Marker für das Vorliegen von Krebs oder einer Vorstufe von Krebs in einer Probe, die abgestoßene bzw. abgeschälte Zellen aufweist.
Stuhl ist eine gute Probe zur beispielhaften Darstellung von Verfahren der Erfindung. Das Colonepithel unterliegt einem andauernden Abstoßungsprozess. Normale Epithelzellen unterliegen der Apoptose und werden in das Lumen des Colons und auf den sich bildenden Stuhl abgeschilfert. Zellen von Polypen und Tumoren werden auch auf den sich bildenden Stuhl abgeschilfert. Zellen von Polypen oder Tumoren sind jedoch definitionsgemäß nicht apoptotisch. Verfahren der Erfindung ziehen Vorteile aus den unterschiedlichen charakteristischen Eigenschaften zwischen apoptotischen und nicht-apoptotischen Zellen, um Patientenproben auf Hinweise auf Krebs oder eine Krebs-Vorstufe zu untersuchen.
Wie oben angegeben, unterliegen nicht-kanzeröse (normale) Zellen in regelmäßigen Intervallen oder als Reaktion auf eine irreparable Zell-Beschädigung der Apoptose. Als ein Ergebnis der Apoptose wird DNA von normalen Zellen in kleine Fragmente mit etwa 200 oder weniger Basenpaaren, und typischerweise 180 Basenpaaren oder weniger, gespalten. Im Gegensatz dazu ist DNA, die von Krebszellen oder Krebs-Vorstufen-Zellen erhalten wurde, viel größer als die typischen apoptotischen Fragmente. So ist die Anwesenheit großer DNA-Fragmente in einer Probe (z.B. von abgeschilfertem Colonepithel) ein Hinweis, dass es in der Probe (oder dem Untersuchungsmaterial, von dem sie erhalten wurde) Zellen gibt oder gab, die der Apoptose und dem damit einhergehenden Abbau von DNA entgangen sind. Die Anwesenheit großer DNA-Fragmente stellt einen positiven Screen auf Krebs oder eine Krebs-Vorstufe dar.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein in-vitro-Verfahren zum Untersuchen bzw. Screenen eines Patienten auf Krebs oder eine Krebs-Vorstufe bereit, wobei das Verfahren die Schritte aufweist des Nachweisens in einer Probe von Gewebe oder Körperflüssigkeit des Patienten, die abgestoßene Zellen oder Zellfragmente aufweist, von DNA-Fragmenten, die größer als ein typisches apoptotisches Spindelfragment sind, wobei die DNA-Fragmente von abgestoßenen Zellen oder Zellfragmenten erhalten werden, wobei das Vorhandensein der Fragmente in einer größeren Menge als ein vorbestimmter Gehalt, der für nicht-kanzeröse Zellen oder nicht-präkanzeröse Zellen erwartet oder nachgewiesen wird, auf Krebs oder eine Krebs-Vorstufe hinweist, und wobei die Fragmente (a) größer als etwa 170 Basenpaare lang sind; oder (b) größer als etwa 500 Basenpaare lang sind; oder c) zwischen etwa 200 Basenpaaren und etwa 3500 Basenpaaren lang sind; oder (d) zwischen etwa 500 Basenpaaren und etwa 2500 Basenpaaren lang sind; oder (e) zwischen etwa 200 Basenpaaren und etwa 1000 Basenpaaren lang sind; oder (f) zwischen etwa 200 Basenpaaren und etwa 600 Basenpaaren lang sind; oder (g) 1,8 Kb und länger sind. Bei bevorzugten Verfahren werden Patienten, die Proben mit einem hohen Anteil an nicht-apoptotischen Nucleinsäuren, wie durch Verfahren der Erfindung bestimmt, liefern, weiter auf das Vorliegen eines Tumors, eines Adenoms oder einer anderen kanzerösen oder präkanzerösen Läsion geprüft.
Im Allgemeinen weisen Verfahren der Erfindung das Nachweisen eines DNA-Fragments oder von DNA-Fragmenten einer Länge, die in nicht-kanzerösen Zellen oder nicht-kanzerösen Zellfragmenten im Wesentlichen nicht vorliegen würden, nämlich einer Länge, die größer als ein typisches apoptotisches Spindelfragment ist, in einer biologischen Probe auf.
Bevorzugte Verfahren der Erfindung weisen das Amplifizieren von Nucleinsäuren in einer repräsentativen Stuhlprobe unter Verwendung von human-spezifischen Primern und das Nachweisen von Amplicons mit Längen, die größer als ein typisches apoptotisches Spindelfragment sind, auf. In einer hochgradig bevorzugten Ausführungsform wird die Amplifizierung durch Polymerasekettenreaktion (PCR – polymerase chain reaction) unter Verwendung von Vorwärts- und Rückwärts-Primern (forward and reverse Primern), die gegen human-spezifische Nucleinsäure-Fragmente gerichtet sind und beabstandet sind, um eine Untergrenze für die sich ergebenden Amplicons zu schaffen, ausgeführt. Ebenfalls in einer hochgradig bevorzugten Ausführungsform sind die Primer für die PCR gegen humane Onkogen- oder Tumorsuppressorsequenzen gerichtet. Zu bevorzugten Ziel-Nucleinsäuren für PCR-Primer gehören p53, Kras, apc, dcc und andere Gene, die dafür bekannt sind oder verdächtigt werden, mit Krebs, und insbesondere colorektalem Krebs, in Verbindung zu stehen. Verfahren zur Durchführung der PCR sind in dem US-Patent Nr. 4 683 202 angegeben. Die Anwesenheit eines Amplicons mit einer größeren Länge als der eines typischen apoptotischen Spindelfragments weist auf eine Matrizen-Nucleinsäure jener Länge (oder länger) in der Probe hin. Gemäß Verfahren der Erfindung stellen solche langen Sequenzen einen positiven Screen dar und weisen auf Krebs oder eine Krebs-Vorstufe hin.
Zu bevorzugten biologischen Proben gehören Stuhl, Eiter und Urin. Verfahren der Erfindung sind insbesondere brauchbar zum Nachweis großer DNA-Fragmente in Proben, die Abgestoßenes enthalten. Gewebe (z.B. Colon, Lungen, Blase), in dem Zellen, insbesondere Epithelzellen, abgestoßen werden, sind für Untersuchungsverfahren der Erfindung am meisten bevorzugt. In derartigen Geweben erfordert die andauernde Zellerneuerung, dass Zellen regelmäßig abgeschilfert werden, nachdem sie eine Apoptose durchgemacht haben. Proben des Abgestoßenen (Gewebe oder Körperflüssigkeit, das (die) die abgestoßenen Zellen enthält) weisen vorherrschend apoptotische DNA auf.
Bevorzugte Verfahren der Erfindung zur Verwendung an einer Stuhlprobe weisen das Erhalten einer repräsentativen Stuhlprobe auf. Ein besonders bevorzugtes Verfahren zur Vorbereitung einer Stuhlprobe ist in dem US-Patent Nr. 5 741 650 und in dem US-Patent Nr. 5 952 178 mit gleicher Inhaberschaft offenbart.
In einer bevorzugten Ausführungsform weisen Verfahren der Erfindung das Homogenisieren einer repräsentativen Stuhlprobe in einem Lösungsmittel auf, um ein homogenisiertes Probengemisch mit einem Verhältnis von Lösungsmittelvolumen zu Stuhlmasse von mindestens 5:1 zu bilden. Ein besonders bevorzugtes Verhältnis von Lösungsmittelvolumen zu Stuhlmasse beträgt etwa 20:1. Ein bevorzugtes Lösungsmittel zur Herstellung von Stuhlproben gemäß der Erfindung ist ein physiologisch verträglicher Puffer, der ein Detergens und eine Proteinase und gewünschtenfalls einen DNase-Inhibitor aufweist, wie ein Puffer, der Tris-EDTA-NaCl aufweist. Ein bevorzugter Puffer ist 50 mM Tris, 150 mM EDTA und 10 mM NaCl bei pH 9,0. Ein anderes bevorzugtes Lösungsmittel ist Guanidin-isothiocyanat (GITC). Die Bereitstellung eines optimalen Verhältnisses von Lösungsmittelvolumen zu Stuhlmasse erhöht allgemein die Ausbeute an Nucleinsäure aus der Probe. Weitere Details bezüglich der Probenherstellung sind in dem US-Patent Nr. 6 268 136 mit gleicher Inhaberschaft offenbart.
Bevorzugte Verfahren der Erfindung weisen außerdem das Anreichern der Probe an humaner DNA auf. Bevorzugte Anreichungsverfahren zur Verwendung bei der Erfindung umfassen das Anreichern einer gewünschten humanen Zielsequenz unter Verwendung einer Affinitätssäule, sequenzspezifischem Abfangen oder durch die Verwendung bevorzugter Puffer, die auf eine Isolierung humaner DNA hinlenken. Ein bevorzugtes Anreicherungsverfahren basiert auf dem Abfangen von einzig humanen Nucleinsäuren unter Verwendung, beispielsweise, einer Affinitätssäule. Details derartiger Verfahren sind unten angegeben.
In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die Verfahren außerdem den Schritt des Extrahierens von DNA aus dem homogenisierten Probengemisch unter Verwendung Sequenz-spezifischer Nucleinsäure-Sonden auf. Besonders bevorzugt sind Sonden, die an humane DNA hybridisieren. Die Sonden sind bevorzugt markiert. Zu bevorzugten Markierungen gehören radioaktive Markierungen, fluoreszierende Markierungen, Molekulargewicht-Markierungen und enzymatische Markierungen. Andere Markierungen sind in der Technik wohlbekannt.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden Gelelektrophorese, Affinitätschromatografie oder Massenspektrometrie verwendet, um große DNA-Fragmente (Fragmente, die mehr als etwa 200 Basenpaare aufweisen) nachzuweisen. Die Anwesenheit großer DNA-Fragmente in der Probe weist auf colorektalen Krebs hin.
In einer bevorzugten Ausführungsform weisen Abfangsonden DNA, RNA oder PNA auf und sind unter Verwendung von Verfahren, die in der Technik bekannt sind, nachweisbar markiert. In einer Ausführungsform sind die Sonden mit radioaktiven Isotopen wie ³²P, ³³P, ³⁵S, ¹²⁵I oder irgendeinem anderen nachweisbaren Isotop, das zur Markierung einer Hybridisierungssonde brauchbar ist, markiert. In einer anderen Ausführungsform sind die Sonden mit fluoreszierenden Molekülen markiert. In der Technik sind zahlreiche fluoreszierende Markierungen bekannt, und zur Durchführung der Erfindung ist jede beliebige nachweisbare fluoreszierende Sondenmarkierung brauchbar. Alternativ sind die Sonden an Komponenten gebunden, die ihr Molekulargewicht erhöhen. Beispielsweise kann eine Sonde direkt an ein Glycoprotein oder an ein Glaskügelchen oder an irgendeine Verbindung, die eine nachweisbare Wirkung auf das Molekulargewicht der Sonde hat, gebunden sein. In einer weiteren Ausführungsform sind die Sonden mit einer Verbindung markiert, die wegen speziellen Wechselwirkungen mit einer zusätzlichen Verbindung nachweisbar ist. Beispielsweise sind biotinylierte Sonden über die Wechselwirkung mit Streptavidin nachweisbar. Die Streptavidin-Komponente ist an eine nachweisbare Markierung wie ein Kügelchen, eine fluoreszierende Kennzeichnung oder ein Enzym gebunden. In einem anderen Beispiel sind die Sonden mit einem Hapten oder einem anderen Antigen, das von einem Antikörper spezifisch erkannt wird, markiert. Der Antikörper ist unter Verwendung von in der Technik bekannten Verfahren, wozu radioaktive Isotope, fluoreszierende Kennzeichnungen und Enzymreaktionen gehören, nachweisbar gemacht. In einem weiteren Beispiel sind die Sonden direkt an ein Enzym, das über eine spezifische Enzymkatalysierte Reaktion, die ein nachweisbares Produkt erzeugt, nachweisbar ist, gebunden.
Schließlich erlaubt es einem die Erfindung, auf der Basis der relativen Menge an DNA-Fragmenten in einer Stuhlprobe, die länger als 200 Basenpaare sind, die Position einer colorektalen Läsion im Colon näherungsweise zu bestimmen. Die ser Aspekt der Erfindung stützt sich auf die Tatsache, dass die lytischen Eigenschaften von Stuhl im proximalen Colon größer sind als sie im distalen Colon sind. Im proximalen Colon befindet sich Stuhl typischerweise in flüssiger Form. Daher haben die Zell-Lyse- und die DNA-abbauenden Enzyme im Colon besseren Zugang zu abgestoßenen Zellen in dem flüssigen Gemisch des proximalen Colons im Vergleich zu ihrem Zugang zu abgestoßenen Zellen, die auf gebildeten oder sich bildenden Stuhl abgeschilfert werden, was im distalen Colon typisch ist. Als eine Folge der Unterschiede zwischen den Umgebungen des proximalen und des distalen Colons sieht die vorliegende Erfindung vor, dass typische DNA-Fragmente von Zellen, die in das proximale Colon abgestoßen werden, kleiner sind als DNA-Fragmente von Zellen, die in das distale Colon abgestoßen werden. 1 liefert ein Beispiel der Staffelung von DNA-Größen, die für Krebs- oder Krebs-Vorstufen-Zellen, die in verschiedene Bereiche des Colons abgestoßen werden, erwartet werden. Die Größe von DNA-Fragmenten von nicht-kanzerösen oder präkanzerösen Zellen ist wegen der Tatsache, dass die DNA von jenen Zellen in erster Linie durch Apoptose abgebaut wird, überall im Colon dieselbe. So spielen Zell-Lyse und DNA-Abbau nur geringere Rollen bei der Bestimmung der Größe von DNA-Fragmenten der meisten überall im Colon abgestoßenen normalen Zellen. Es wird jedoch festgestellt, dass normale Zellen, die beispielsweise mechanisch vom Colon abgeschert werden, denselben lytischen und Abbau-Zyklus wie die typische Krebszelle oder Krebs-Vorstufen-Zelle durchmachen. Der Beitrag solcher nicht-apoptotischer normaler Zellen zu dem Gesamtgehalt an DNA in der Stuhlprobe ist jedoch klein und wird durch das Erstellen von Standards, wie sie unten gelehrt werden, beherrscht.
Weitere Aspekte und Vorteile der Erfindung sind in ihrer folgenden genauen Beschreibung enthalten.
Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt eine schematische Darstellung des Colons und die repräsentative (typische) DNA-Fragmentlänge für DNA, die von einer abgestoßenen Krebs- oder Krebs-Vorstufen-Zelle erhalten wurde, gegenüber der repräsentativen (typischen) apoptotischen (normalen) DNA-Fragmentlänge für verschiedene Bereiche des Colons.
2 ist eine Gel-Fotografie, die Ergebnisse der Amplifizierung von Kras (Exon 1)-DNA, die aus Stuhl unter Verwendung von Vorwärts- und Rückwärts-Primern, die etwa 200 bp beabstandet waren, isoliert wurde, zeigt. Die Bandenintensität betrifft die Menge an 200 bp-Produkt oder größer in der Probe. Die Bahnen 1 bis 4 sind Ergebnisse von Patienten mit Krebs oder Adenom, Bahn 5 ist eine positive Kontrolle, die Bahnen 6 bis 10 sind von Patienten, bei denen kein Krebs oder Adenom vorlag, die Bahnen 11 bis 12 sind negative Kontrollen, und die Bahnen 13 bis 18 sind Standardsubstanzen mit dem in der Figur angegebenen angenäherten Molekulargewicht.
3 ist eine Gel-Fotografie, die Ergebnisse der Amplifizierung von apc (Exon 15)-DNA, die aus Stuhl unter Verwendung von Vorwärts- und Rückwärts-Primern, die etwa 200 bp beabstandet waren, isoliert wurde, zeigt. Die Bandenintensität betrifft die Menge an 200 bp-Produkt oder größer in der Probe. Die Bahnen 1 bis 4 sind Ergebnisse von Patienten mit Krebs oder Adenom, Bahn 5 ist eine positive Kontrolle, die Bahnen 6 bis 10 sind von Patienten, bei denen kein Krebs oder Adenom vorlag, die Bahnen 11 bis 12 sind negative Kontrollen, und die Bahnen 13 bis 18 sind Stadardsubstanzen mit dem in der Figur angegebenen angenäherten Molekulargewicht.
4 ist eine Gel-Fotografie, die Ergebnisse der Amplifizierung von apc (Exon 15)-DNA, die aus Stuhl unter Verwendung von Vorwärts- und Rückwärts-Primern, die etwa 200 bp beabstandet waren, isoliert wurde, zeigt. Die Bandenintensität betrifft die Menge an 200 bp-Produkt oder größer in der Probe. Die Bahnen 1 bis 4 sind Ergebnisse von Patienten mit Krebs oder Adenom, Bahn 5 ist eine positive Kontrolle, die Bahnen 6 bis 10 sind von Patienten, bei denen kein Krebs oder Adenom vorlag, die Bahnen 11 bis 12 sind negative Kontrollen, und die Bahnen 13 bis 18 sind Standardsubstanzen mit dem in der Figur angegebenen angenäherten Molekulargewicht.
5 ist eine Gel-Fotografie, die Ergebnisse der Amplifizierung von apc (Exon 15)-DNA, die aus Stuhl unter Verwendung von Vorwärts- und Rückwärts-Primern, die etwa 200 bp beabstandet waren, isoliert wurde, zeigt. Die Bandenintensität betrifft die Menge an 200 bp-Produkt oder größer in der Probe. Die Bahnen 1 bis 4 sind Ergebnisse von Patienten mit Krebs oder Adenom, Bahn 5 ist eine positive Kontrolle, die Bahnen 6 bis 10 sind von Patienten, bei denen kein Krebs oder Adenom vorlag, die Bahnen 11 bis 12 sind negative Kontrollen, und die Bahnen 13 bis 18 sind Standardsubstanzen mit dem in der Figur angegebenen angenäherten Molekulargewicht.
6 ist eine Gel-Fotografie, die Ergebnisse der Amplifizierung von p53 (Exon 5)-DNA, die aus Stuhl unter Verwendung von Vorwärts- und Rückwärts-Primern, die etwa 200 bp beabstandet waren, isoliert wurde, zeigt. Die Bandenintensität betrifft die Menge an 200 bp-Produkt oder größer in der Probe. Die Bahnen 1 bis 4 sind Ergebnisse von Patienten mit Krebs oder Adenom, Bahn 5 ist eine positive Kontrolle, die Bahnen 6 bis 10 sind von Patienten, bei denen kein Krebs oder Adenom vorlag, die Bahnen 11 bis 12 sind negative Kontrollen, und die Bahnen 13 bis 18 sind Standardsubstanzen mit dem in der Figur angegebenen angenäherten Molekulargewicht.
7 ist eine Gel-Fotografie, die Ergebnisse der Amplifizierung von p53 (Exon 7)-DNA, die aus Stuhl unter Verwendung von Vorwärts- und Rückwärts-Primern, die etwa 200 bp beabstandet waren, isoliert wurde, zeigt. Die Bandenintensität betrifft die Menge an 200 bp-Produkt oder größer in der Probe. Die Bahnen 1 bis 4 sind Ergebnisse von Patienten mit Krebs oder Adenom, Bahn 5 ist eine positive Kontrolle, die Bahnen 6 bis 10 sind von Patienten, bei denen kein Krebs oder Adenom vorlag, die Bahnen 11 bis 12 sind negative Kontrollen, und die Bahnen 13 bis 18 sind Standardsubstanzen mit dem in der Figur angegebenen angenäherten Molekulargewicht.
8 ist eine Gel-Fotografie, die Ergebnisse der Amplifizierung von p53 (Exon 8)-DNA, die aus Stuhl unter Verwendung von Vorwärts- und Rückwärts-Primern, die etwa 200 bp beabstandet waren, isoliert wurde, zeigt. Die Bandenintensität betrifft die Menge an 200 bp-Produkt oder größer in der Probe. Die Bahnen 1 bis 4 sind Ergebnisse von Patienten mit Krebs oder Adenom, Bahn 5 ist eine positive Kontrolle, die Bahnen 6 bis 10 sind von Patienten, bei denen kein Krebs oder Adenom vorlag, die Bahnen 11 bis 12 sind negative Kontrollen, und die Bahnen 13 bis 18 sind Standardsubstanzen mit dem in der Figur angegebenen angenäherten Molekulargewicht.
9 ist eine Gel-Fotografie von Ergebnissen der Amplifizierung von DNA aus Stuhlproben unter Verwendung von Vorwärts- und Rückwärts-Primern, die näherungsweise 1,8 Kb beabstandet waren. Die Bandenintensität zeigt die Menge an Produkt mit 1,8 Kb oder größer. Die Bahnen 1, 8 und 9 sind negative Kontrollen, die Bahnen 2, 3 und 5 sind Ergebnisse von Patienten mit Krebs oder Adenom, die Bahnen 4, 6 und 7 sind Ergebnisse von Patienten, bei denen kein Krebs oder Adenom vorlag, und die Bahnen 10 bis 14 sind Molekulargewicht-Standardsubstanzen.
10 ist eine Gel-Fotografie von Ergebnissen der Amplifizierung von DNA aus Stuhlproben unter Verwendung von Vorwärts- und Rückwärts-Primern, die näherungsweise 1,8 Kb beabstandet waren. Die Bandenintensität zeigt die Menge an Produkt mit 1,8 Kb oder größer. Die Bahnen 1, 8 und 9 sind negative Kontrollen, die Bahnen 2, 3 und 5 sind Ergebnisse von Patienten mit Krebs oder Adenom, die Bahnen 4, 6 und 7 sind Ergebnisse von Patienten, bei denen kein Krebs oder Adenom vorlag, und die Bahnen 10 bis 14 sind Molekulargewicht-Standardsubstanzen.
11 ist eine Gel-Fotografie von Ergebnissen der Amplifizierung von DNA aus Stuhlproben unter Verwendung von Vorwärts- und Rückwärts-Primern, die näherungsweise 1,8 Kb beabstandet waren. Die Bandenintensität zeigt die Menge an Produkt mit 1,8 Kb oder größer. Die Bahnen 1, 8 und 9 sind negative Kontrollen, die Bahnen 2, 3 und 5 sind Ergebnisse von Patienten mit Krebs oder Adenom, die Bahnen 4, 6 und 7 sind Ergebnisse von Patienten, bei denen kein Krebs oder Adenom vorlag, und die Bahnen 10 bis 14 sind Molekulargewicht-Standardsubstanzen.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Verfahren der Erfindung basieren auf der Beobachtung, dass Proben, die Zellen von Patienten mit Krebs oder einer Krebs-Vorstufe aufweisen, eine größere Menge an DNA-Fragmenten mit hohem Molekulargewicht (langer Sequenz), verglichen mit entsprechenden Proben, die von Individuen erhalten wurden, die frei von Krebs/einer Krebs-Vorstufe sind, enthalten. Dementsprechend stellen Verfah ren der Erfindung genaue Untersuchungsverfahren und diagnostische Verfahren für Krebs oder Krebs-Vorstufen bereit.
Verfahren der Erfindung sind brauchbar, um in irgendeiner Probe von Gewebe oder Körperflüssigkeit Nucleinsäure-Hinweise auf Krebs oder eine Krebs-Vorstufe nachzuweisen. Beispielsweise werden Sputum-Proben verwendet, um die Anwesenheit von DNA mit hohem Molekulargewicht (langer Sequenz) als Marker für Krebs nachzuweisen. Die Mehrheit der Zellen, die in Sputum bzw. Auswurf abgestoßen werden, haben eine Apoptose und einen nachfolgenden weiteren enzymatischen Abbau durchgemacht. Die vorherrschende DNA aus jenen Zellen ist kleine, apoptotische DNA. Krebszellen, die beispielsweise von den Lungen, den Nasengängen oder der Luftröhre erzeugt werden, werden auch in Sputum abgeschilfert. Die DNA von jenen Zellen wurde jedoch, während sie enzymatischen Prozessen ausgesetzt war, nicht von Apoptose beeinträchtigt. Dementsprechend sind Fragmente von Krebszellen oder Krebs-Vorstufen-Zellen, die man in Sputum findet, größer als Fragmente, von denen man erwartet, dass sie von normalen Zellen erzeugt werden.
In ähnlicher Weise erzeugen Zellen, die von kanzerösen oder präkanzerösen Läsionen in der Blase oder in der Niere abgeschilfert werden, nicht-apoptotische DNA im Urin, führen kanzeröse oder präkanzeröse Läsionen in den Lymphknoten zu nicht-apoptotischen DNA-Fragmenten in Lymphe, und schilfern kanzeröse oder präkanzeröse Zellen in der Brust nicht-apoptotische DNA enthaltende Zellen ab, die durch Absaugen entnommen werden können. Dementsprechend sind Verfahren der Erfindung in jedem beliebigen Gewebe oder jeder beliebigen Körperflüssigkeit brauchbar. Zu Zwecken einer beispielhaften Veranschaulichung der hierin beschriebenen Verfahren wurden jedoch Stuhlproben verwendet, um das Vorliegen von colorektalem Krebs oder einer Vorstufe von colorektalem Krebs vorherzusagen. Stuhl ist wegen der charakteristischen Abstoßung von Colonepithel, wie oben beschrieben, ein hervorragendes Untersuchungsmaterial zur Analyse.
Verfahren der Erfindung werden durchgeführt durch Nachweisen der Anwesenheit von DNA-Fragmenten mit einer Sequenzlänge, von der man nicht erwarten würde, dass sie in einer Probe, die von einem gesunden Individuum (d.h. einem Individuum, das nicht Krebs oder eine Krebs-Vorstufe hat) erhalten wurde, vor handen sein würde. Eine Schwellenmenge an großen Fragmenten ist eine Menge, die einen vorbestimmten Gehalt überschreitet, der für nicht-kanzeröse/nicht-präkanzeröse Zellen erwartet oder bestimmt wird. Der vorbestimmte Gehalt oder Standard kann durch Nachweisen der Menge einer bestimmten DNA-Fragmentgröße (bevorzugt apoptotische Fragmente, die für normale Zellen charakteristisch sind) in einer Population oder Subpopulation normaler Patienten bestimmt werden. Standards können empirisch bestimmt werden und können, einmal bestimmt, als die Basis für weitere Untersuchungen verwendet werden.
Die Größe von zu verwendenden Fragmenten wird nach dem Belieben des Individuums, das die Untersuchung durchführt, gewählt. Faktoren, die die Größe von Fragmenten, die bei Untersuchungsverfahren oder diagnostischen Verfahren der Erfindung verwendet werden, beeinflussen, umfassen die Verfügbarkeit und die Kosten von Sonden und Primern, das gewünschte Amplifikationsziel, die Krebsart, die untersucht wird, und die Patientenprobe, an der die Untersuchung stattfindet. Die Erfindung zieht Vorteile aus der Erkenntnis, dass große Fragmente in abnormalen Proben in größerer Fülle vorhanden sind als in normalen Proben. Dementsprechend ist die genaue Größe von Fragmenten, die in Verfahren der Erfindung verwendet werden, nicht wichtig. Für irgendeine gegebene Größe von zu analysierenden Fragmenten muss eine Abschneidegröße bestimmt werden, um zwischen normalen und abnormalen Proben zu unterscheiden. Bevorzugt wird die Abschneidegröße empirisch auf der Basis bekannter normaler und abnormaler Proben bestimmt und dann in künftigen Untersuchungen verwendet.
Die folgenden Beispiele liefern weitere Details von Verfahren gemäß der Erfindung. Zu Zwecken der beispielhaften Veranschaulichung liefern die folgenden Beispiele Details der Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung beim Nachweis von Colonkrebs. Folglich ist die Erfindung, wenn sie auch in der folgenden Weise beispielhaft veranschaulicht ist, nicht so beschränkt, und der Fachmann wird bei ihrer Betrachtung ihren breiten Anwendungsbereich zu schätzen wissen.
Beispielhaftes Verfahren zum Nachweis von Colonkrebs
Zur Analyse von Stuhlproben weisen bevorzugte Verfahren der Erfindung das Erhalten mindestens eines Querschnitts-Bereichs oder eines Umfangs-Bereichs eines ausgeschiedenen Stuhls auf, wie es in dem US-Patent Nr. 5 741 650 und in dem gleichfalls anhängigen US-Patent Nr. 5 952 178 mit gleicher Inhaberschaft gelehrt wird. Während ein Querschnitts- oder Umfangs-Bereich von Stuhl wünschenswert ist, werden hierin bereitgestellte Verfahren an willkürlichen Proben, die von ausgeschiedenem Stuhl erhalten wurden, die Abstriche oder Abschabsel umfassen, durchführt. Sobald es erhalten wurde, wird das Stuhl-Untersuchungsmaterial homogenisiert. Ein bevorzugter Puffer zur Homogenisierung ist einer, der mindestens 16 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) enthält. Es wurde jedoch entdeckt, dass, wie in dem US-Patent Nr. 6 551 777 mit gleicher Inhaberschaft gelehrt, die Verwendung von mindestens 150 mM EDTA die Ausbeute an Nucleinsäure aus Stuhl stark verbessert. Daher enthält ein bevorzugter Puffer zur Stuhlhomogenisierung Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, 20 bis 100 mM NaCl oder KCl, mindestens 150 mM EDTA, und gewünschtenfalls ein Detergens (wie SDS) und eine Proteinase (z.B. Proteinase K).
Nach der Homogenisierung wird die Nucleinsäure bevorzugt aus der Stuhlprobe isoliert. Eine Isolierung oder Extraktion von Nucleinsäure ist nicht in allen Verfahren der Erfindung erforderlich, da bestimmte Nachweistechniken in passender Weise in homogenisiertem Stuhl ohne Isolierung von Nucleinsäuren durchgeführt werden können. In einer bevorzugten Ausführungsform wird jedoch homogenisierter Stuhl in schnelle Drehung versetzt, um einen Überstand zu erzeugen, der Nucleinsäuren, Proteine, Lipide und andere Zellfragmente enthält. Der Überstand wird mit einem Detergens und Proteinase behandelt, um Protein abzubauen, und die Nucleinsäure wird Phenol-Chloroform-extrahiert. Die extrahierten Nucleinsäuren werden dann mit Alkohol gefällt. Andere Techniken können verwendet werden, um Nucleinsäure aus der Probe zu isolieren. Derartige Techniken umfassen Hybrid-Abfangen und Amplifizierung direkt aus dem homogenisierten Stuhl. Nucleinsäuren können in dem Ausmaß, das der zu verwendende Screening-Assay braucht, gereinigt und/oder isoliert werden. Die Gesamt-DNA wird unter Verwendung von auf dem Gebiet bekannten Techniken isoliert.
Wenn die DNA isoliert ist, wird die Probe bevorzugt unter Verwendung von Sequenz-spezifischen Abfangsonden an humanen Nucleinsäuren angereichert. Pelletisierte DNA wird erneut in TE-Puffer suspendiert. Dann wird Guanidin-isothiocyanat (GITC) zugegeben. Ein Überschuss an Abfangsonden, die auf humane DNA abzielen, wird zu der Probe zugegeben. Die Probe wird erhitzt, um die DNA zu denaturieren, und dann abgekühlt. Schließlich lässt man Sonde und Ziel-DNA hybridisieren. Streptavidin-beschichtete magnetisierte Kügelchen werden in Wasser suspendiert und zu dem Gemisch zugegeben. Nach kurzem Mischen wird das Gemisch näherungsweise 30 min lang bei Raumtemperatur gehalten. Wenn die Affinitäts-Bindung abgeschlossen ist, wird ein magnetisches Feld an der Probe angelegt, um die magnetisierten Isolationskügelchen (sowohl mit als auch ohne hybridisierten Komplex) anzuziehen. Die Kügelchen werden dann vier (4) Mal in 1M GITC/0,1 % Igepal (Sigma, St. Louis, MO)-Lösung 15 min lang gewaschen, gefolgt von zwei (2) Wäschen mit warmem Puffer (TE mit 1M NaCl) für 15 min, um komplexiertes Streptavidin zu isolieren. Schließlich wird zu den Kügelchen destilliertes Wasser gegeben und erhitzt, um die DNA zu eluieren. Dann kann an der humanen DNA, die abgefangen wurde, eine Gelelektrophorese durchgeführt werden.
III. Bestimmung der Fragmentlänge
Die Größe der oben erhaltenen Fragmente humaner DNA kann durch zahlreiche Mittel bestimmt werden. Beispielsweise kann humane DNA unter Verwendung von Gelelektrophorese aufgetrennt werden. Ein 5%iges Acrylamidgel wird unter Verwendung von auf dem Gebiet bekannten Techniken hergestellt. Siehe Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1195, Seiten 2-23-2-24. Die Größe der Fragmente humaner DNA wird dann durch Vergleich mit bekannten Standards bestimmt. Fragmente, die größer als etwa 200 bp sind, liefern einen positiven Screen. Es kann zwar auf der Basis des Screens alleine eine Diagnose erstellt werden, aber bevorzugt wird Patienten, die einen positiven Screen vorlegen, geraten, Nachfolgetests zu suchen, um eine bestätigte Diagnose zu erhalten.
Ein bevorzugtes Mittel zur Bestimmung der Fragmentlänge humaner DNA besteht in der Verwendung von PCR. Verfahren zur Ausführung von PCR sind wohlbe kannt. Bei der vorliegenden Erfindung werden humane DNA-Fragmente unter Verwendung human-spezifischer Primer amplifiziert. Ein durch PCR erzeugtes Amplicon von mehr als etwa 200 bp stellt einen positiven Screen dar. Andere Amplifizierungsreaktionen und PCR-Modifikationen wie Ligasekettenreaktion, Umkehrphasen-PCR (reverse phase PCR), Q-PCR und andere, können verwendet werden, um nachweisbare Amplicon-Gehalte zu erzeugen. Ein Amplicon kann durch Koppeln an einen Reporter (z.B. Fluoreszenzstrahler, Radioisotope und dergleichen), durch Sequenzierung, durch Gelelektrophorese, durch Massenspektrometrie, oder durch irgendein anderes in der Technik bekanntes Mittel nachgewiesen werden, solange die Länge, das Gewicht oder eine andere charakteristische Eigenschaft der Amplicons sie größenmäßig identifiziert.
BEISPIELE
Es wurden Experimente durchgeführt, um zu bestimmen, ob charakteristische Eigenschaften von amplifizierbarer DNA in Stuhl auf Krebs oder eine Krebs-Vorstufe bei Patienten, von denen die Stuhlproben erhalten wurden, schließen lassen. In dem ersten Experiment wurde die Menge an amplifizierbarer DNA in jeder von mehreren Stuhlproben unter Verwendung von PCR-Amplifizierung gemessen, um in der Probe DNA-Fragmente mit einer Länge von mindestens 200 Basenpaaren nachzuweisen. Das zweite Experiment bestimmte die Menge an langen (größer als 200 Basenpaare) Fragmenten in denselben Proben, um dann Verhältnisse von langem Produkt zu kurzem Produkt zu bestimmen.
I. Die Verwendung von amplifizierbarer DNA als ein Marker für Krebs oder eine Krebs-Vorstufe
Stuhlproben wurden von 9 Patienten, die sich mit Symptomen oder einer medizinischen Vorgeschichte, die anzeigte, dass eine Colonspiegelung durchgeführt werden sollte, vorstellten, gesammelt. Jede Stuhlprobe wurde gefroren. Unmittelbar nach dem Liefern einer Stuhlprobe wurde an jedem Patienten eine Colonspiegelung durchgeführt, um den Krankheits-Status des Patienten zu bestimmen. Auf der Basis der Ergebnisse der Colonspiegelung und einer nachfolgenden histologischen Analyse von Biopsie-Proben, die während der Colonspiegelung genommen wurden, wurden die Individuen einer von zwei Gruppen zugeteilt: normal oder abnormal. Die abnormale Gruppe bestand aus Patienten mit Krebs oder mit einem Adenom von mindestens 1 cm Durchmesser. Auf der Basis dieser Ergebnisse wurden vier der neun Patienten der abnormalen Gruppe zugeteilt.
Die Proben wurden untersucht durch Hybrid-Abfang humaner DNA und Bestimmen der Menge an amplifizierbarer DNA mit mindestens 200 Basenpaaren. Jedes gefrorene Stuhl-Untersuchungsmaterial, das von 7 bis 33 g wog, wurde aufgetaut und in 500 mM Tris, 16 mM EDTA und 10 mM NaCl, pH 9,0, mit einem Verhältnis von Volumen: Masse von 3:1 homogenisiert. Die Proben wurden dann erneut in demselben Puffer in einem endgültigen Verhältnis von Volumen: Masse von 20:1 homogenisiert und in Glas-Makrokügelchen bei 2356 × g in schnelle Drehung versetzt. Der Überstand wurde gesammelt und mit SDS und Proteinase k behandelt. Die DNA wurde dann mit Phenol-Chloroform extrahiert und mit Alkohol gefällt. Der Niederschlag wurde in 10 mM Tris und 1 mM EDTA (1 × TE), pH 7,4, suspendiert. Schließlich wurde die DNA mit RNase behandelt.
Humane DNA wurde aus dem Niederschlag durch Sequenz-spezifischen Hybrid-Abfang isoliert. Biotinylierte Sonden gegen Bereiche der p53-, Kras- und apc-Gene wurden verwendet. Die Kras-Sonde war 5'GTGGAGTATTTGATAGTGTATTAACCTTATGTGTGAC3' (SEQ ID NO: 1). Es gab zwei apc-Sonden: apc-1309 war 5'TTCCAGCAGTGTCACAGCACCCTAGAACCAAATCCAG3' (SEQ ID NO: 2), und apc-1378 war 5'CAGATAGCCCTGGACAAACAATGCCACGAAGCAGAAG3' (SEQ ID NO: 3). Es gab vier Sonden gegen p53, die erste (die an einen Bereich von Exon 5 hybridisierte) war 5'TACTCCCCTGCCCTCAACAA-GATGTTTTGCCAACTGG3' (SEQ ID NO: 4), die zweite (die an einen Bereich von Exon 7 hybridisierte) war 5'ATTTCTTCCATACTACTACCCATCGACCTCTCATC3' (SEQ ID NO: 5), die dritte, die auch an einen Bereich von Exon 7 hybridisierte, war 5'ATGAGGCCAGTGCGCCTTGGGGAGACCTGTGGCAAGC3' (SEQ ID NO: 6); und eine Sonde gegen Exon 8 hatte schließlich die Sequenz 5'GAAAGGACAAGGGTGGTTGGGAGTAGATGGAGCCTGG3' (SEQ ID NO: 7). Eine 10 μl Teilmenge jeder Sonde (20 pmol/Abfangreaktion) wurde bei Raumtemperatur für 2 h zu einer Suspension, die 300 μl DNA enthielt, in Anwesenheit von 310 μl 6M GITC-Puffer zugegeben. Hybrid-Komplexe wurden unter Verwendung von Streptavidin-beschichteten Kügelchen (Dynal) isoliert. Nach dem Waschen wurden Sonde-Kügelchen-Komplexe bei 25°C 1 h lang in 0,1 × TE-Puffer, pH 7,4, sus pendiert. Die Suspension wurde dann 4 min lang bei 85°C erhitzt, und die Kügelchen wurden entfernt.
Abgefangene DNA wurde dann unter Verwendung von PCR amplifiziert, im Wesentlichen wie es in dem US-Patent Nr. 4 683 202 beschrieben ist. Jede Probe wurde unter Verwendung von Vorwärts- und Rückwärts-Primern über 7 Orte (Kras, Exon 1, APC, Exon 15 (3 getrennte Orte), p53, Exon 5, p53, Exon 7, und p53, Exon 8) zweifach amplifiziert (für insgesamt 14 Amplifizierungen für jeden Ort). 7 getrennte PCRs (jeweils 33 Zyklen) wurden doppelt durchgeführt, wobei Primer verwendet wurden, die darauf gerichtet waren, Fragmente mit 200 Basenpaaren oder mehr in der Probe nachzuweisen. Amplifizierte DNA wurde auf ein 4%iges Nusieve (FMC Biochemical)-Gel (3% Nusieve, 1 % Agarose) gebracht und mit Ethidiumbromid (0,5 μg/ml) gefärbt. Die sich ergebende amplifizierte DNA wurde auf der Basis der relativen Intensität der gefärbten Gele eingestuft. Die Ergebnisse sind in den 2 bis 8 gezeigt. Jede Figur repräsentiert die Ergebnisse für alle neun Patienten (einschließlich Standards) für die 7 verschiedenen Orte, die amplifiziert wurden. Wie in den Figuren gezeigt ist, wurde jede Probe von einem Patienten mit Krebs oder einem Adenom als eine Bande mit signifikant größerer Intensität als die Banden, die Proben von Patienten, bei denen kein Krebs oder eine Krebs-Vorstufe vorlag, zugeordnet waren, nachgewiesen. Alle vier Krebs-Adenom-Patienten, die unter Verwendung der Colonspiegelung identifiziert wurden, wurden durch Bestimmung der Menge an amplifizierbarer DNA mit einer Länge von 200 Basenpaaren oder mehr korrekt identifiziert. Wie in den 2 bis 8 gezeigt ist, waren die Ergebnisse unabhängig davon, welcher Ort amplifiziert wurde, dieselben. Dementsprechend ließ die Menge an DNA von 200 bp oder mehr in einer Probe auf den Krankheits-Status eines Patienten schließen.
BEISPIEL 2
Es wurde ein Experiment durchgeführt, das im Wesentlichen mit dem oben im Beispiel 1 beschriebenen identisch war, aber die Vorwärts- und Rückwärts-Primer wurden so angebracht, dass Fragmente von etwa 1,8 Kb und darüber amplifiziert wurden.
DNA wurde wie oben beschrieben hergestellt. Vorwärts- und Rückwärts-Primer waren beabstandet, so dass sie näherungsweise 1,8 Kb entfernt an drei unterschiedliche Orte (Kras, Exon 1, APC, Exon 15, und p53, Exon 5) hybridisierten. Es wurden 33 Amplifizierungsrunden durchgeführt, und die sich ergebende DNA wurde auf ein 5%iges Acrylamidgel gebracht. Die Ergebnisse sind in den 9 bis 11 gezeigt. Wie in den Figuren gezeigt ist (die Ergebnisse von drei getrennten Experimenten zum Amplifizieren und Nachweisen von „langem" Produkt zeigen), erzeugten Proben von Individuen mit Krebs oder einer Krebs-Vorstufe große Mengen an DNA mit hohem Molekulargewicht (in diesem Fall 1,8 Kb und darüber); während Proben von Patienten, bei denen kein Krebs oder eine Krebs-Vorstufe vorlag, keine DNA in dem Bereich von etwa 1,8 Kb und höher erzeugten. So wies die Anwesenheit von DNA mit hohem Molekulargewicht auf den Krankheits-Status des Patienten hin.
Die Erfindung wurde in Form ihrer bevorzugten Ausführungsformen beschrieben. Alternative Ausführungsformen sind für den Fachmann bei Prüfung der Beschreibung und der Ansprüche offenkundig.

Claims

In vitro-Verfahren zum Untersuchen eines Patienten auf Krebs oder eine Krebs-Vorstufe, aufweisend die folgenden Schritte: Nachweisen in einer Patientengewebe- oder einer Körperflüssigkeits-Probe, welche abgestoßene Zellen und Zellfragmente aufweist, von DNA-Fragmenten, welche größer als ein typisches apoptotisches Spindelfragment sind und welche aus abgestoßenen Zellen oder Zellfragmenten erhalten werden, wobei das Vorhandensein der Fragmente in einer größeren Menge als ein vorbestimmter Gehalt, welcher für nicht-kanzeröse Zellen oder nicht-präkanzeröse Zellen erwartet oder nachgewiesen wird, auf Krebs oder eine Krebs-Vorstufe hinweist, und wobei die Fragmente: (a) größer als ca. 170 Basenpaare lang sind; oder (b) größer als ca. 500 Basenpaare lang sind; oder (c) zwischen ca. 200 Basenpaare und ca. 3500 Basenpaare lang sind; oder (d) zwischen ca. 500 Basenpaare und ca. 2500 Basenpaare lang sind; oder (e) zwischen ca. 200 Basenpaare und ca. 1000 Basenpaare lang sind; oder (f) zwischen ca. 200 Basenpaare und ca. 600 Basenpaare lang sind; oder (g) 1,8 Kb und länger sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der vorherbestimmte Gehalt bestimmt wird durch Nachweisen einer Menge von DNA-Fragmenten in einer Population oder Subpopulation normaler Patienten.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der spezifizierte Bereich 1,8 Kb oder mehr ist und der vorherbestimmte Gehalt null ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Probe aus der Gruppe gewählt ist, die aus Stuhl, Eiter, Urin, Sputum, Lymphe und Brustaspirat besteht.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, außerdem aufweisend den Schritt des Anreicherns der Probe bezüglich humaner DNA.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, ferner aufweisend den Schritt des Isolierens humaner DNA aus der Probe.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, aufweisend das Untersuchen des Patienten bezüglich Adenoma oder Polypen oder Tumore.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Probe abgestoßene Epithelzellen enthält.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Krebs oder die Krebs-Vorstufe ein Krebs oder eine Krebs-Vorstufe der Lunge, des Nasaltrakts, der Trachea, der Blase, der Niere, der Lymphknoten oder der Brust ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, bei welchem der Krebs oder die Krebs-Vorstufe ein colorektaler Krebs oder eine Krebs-Vorstufe davon ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem die DNA-Fragmente unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung von Forward und Reverse Primern nachgewiesen werden.
Verfahren nach Anspruch 11, bei welchem die Primer gegen humane Oncogensequenzen oder Tumorsuppressorsequenzen gerichtet sind.
Verfahren nach Anspruch 12, bei welchem die Primer gegen p53, Kras, apc oder dcc gerichtet sind.