ES2269129T3 - Procedimientos para detectar acidos nucleicos reveladores de cancer. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento in vitro para el cribado de un paciente para cáncer o precáncer, comprendien- do el procedimiento las etapas de: detectar en una muestra de tejido o líquido corporal del paciente que comprende células exfoliadas y residuos celulares, fragmentos de ADN que son mayores que un fragmento de huso apoptótico típico, cuyos fragmentos de ADN se obtienen de células exfoliadas o resi- duos celulares, en el que la presencia de dichos fragmentos en una cantidad superior a un ni- vel predeterminado que se espera o se determina para células no cancerosas o no precance- rosas resulta indicativo de cáncer o de precáncer, y en el que dichos fragmentos son: (a) de longitud superior a aproximadamente 170 pares de bases; o (b) de longitud superior a aproximadamente 500 pares de bases; o (c) de longitud comprendida entre aproximadamente 200 pares de bases y aproxima- damente 3.500 pares de bases; o (d) de longitud comprendida entre aproximadamente 500 pares de bases y aproxima-
Description
Procedimiento para detectar ácidos nucleicos
reveladores de cáncer.
La presente invención se refiere a
procedimientos para la detección precoz del cáncer en pacientes
mediante el cribado de fragmentos de ADN de grandes dimensiones.
Los procedimientos de la invención resultan especialmente útiles en
la detección del cáncer de colon.
Las alteraciones de la integridad genómica con
frecuencia se asocian con enfermedades o con la propensión a
sufrirlas. Por ejemplo, muchos cánceres se cree que surgen a través
de una serie de mutaciones en el ADN genómico, resultando en
inestabilidad genómica en la forma de crecimiento celular
descontrolado. En las células normales, el daño en el ADN genómico
típicamente conduce a la expresión de supresores tumorales, tales
como el regulador del ciclo celular, p53. Por ejemplo, el daño en
el ADN celular resulta en la expresión incrementada de p53, que
detiene el ciclo celular para permitir la reparación del daño. Si el
ADN dañado no puede ser reparado, la célula experimenta apoptosis,
previniendo de esta manera la acumulación de mutaciones adicionales
en las células hijas. Sin embargo, si se produce una mutación en el
mismo gen de p53 (o en otro regulador del ciclo celular), las
células dañadas seguirán el ciclo celular, dando lugar a progenie en
la que no se repararán las mutaciones adicionales del ADN. La
acumulación de estas mutaciones es la característica distintiva de
muchos cánceres.
El proceso de apoptosis resulta importante no
sólo en la regulación del metabolismo celular, sino también en la
inhibición de la oncogénesis. A medida que las células experimentan
apoptosis, el núcleo reduce su tamaño y se fragmenta. El ADN
nuclear resulta digerido en fragmentos de huso que generalmente no
son mayores de aproximadamente 200 pares de bases. A medida que
continúa el proceso, habitualmente a través de múltiples rutas, la
membrana celular se degrada, y el contenido celular resulta
metabolizado. Como resultado, resultan eliminadas las células con
el potencial de entrar en la ruta multietapa que conduce al
cáncer.
Muchos cánceres resultan curables si se detectan
precozmente en su desarrollo. Por ejemplo, los cánceres
colorrectales típicamente se originan en el epitelio colónico, y no
se encuentran extensivamente vascularizados (y por lo tanto no son
invasivos) durante las primeras etapas de su desarrollo. La
transición a un cáncer altamente vascularizado, invasivo y
finalmente metastásico comúnmente tarda diez o más años. Si la
presencia de cáncer se detecta previamente a la vascularización
extensiva, la extirpación quirúrgica típicamente resulta una
curación efectiva. Sin embargo, el cáncer colorrectal con
frecuencia se detecta sólo tras manifestarse los síntomas clínicos,
tales como dolor y heces negras alquitranosas. Generalmente estos
síntomas se presentan únicamente una vez se ha producido la
metástasis. La detección precoz del cáncer colorrectal, por lo
tanto, resulta importante para reducir significativamente su
morbilidad.
morbilidad.
Los procedimientos diagnósticos invasivos, tales
como el examen endoscópico, permiten la identificación, extirpación
y biopsia visual directa de tejido potencialmente canceroso. La
endoscopia resulta cara, incómoda, inherentemente arriesgada, y una
herramienta poco práctica para el diagnóstico precoz.
Los procedimientos de cribado no invasivo
establecidos implican someter a ensayo muestras de heces para la
presencia de sangre fecal oculta o niveles elevados de antígeno
carcinoembrionario, ambos sugestivos de la presencia de cáncer
colorrectal. Además, los últimos avances de la biología molecular
proporcionan procedimientos de gran potencial para detectar la
presencia de un abanico de mutaciones del ADN indicativas de cáncer
colorrectal. La presencia de estas mutaciones puede detectarse en
ADN presente en muestras de heces durante diversas etapas del
cáncer colorrectal. Sin embargo, las heces comprenden células y
residuos celulares del paciente, de microorganismos, y de los
alimentos, resultando en una población heterogénea de células. Esto
provoca que las subpoblaciones específicas pequeñas resulten
difícil de detectar fiablemente.
Existe una necesidad de en la técnica de
procedimientos no invasivos adicionales para el diagnóstico precoz
del cáncer, que detecten características indicativas de la presencia
de cáncer.
La presente invención proporciona procedimientos
para identificar indicios de cáncer en muestras de tejidos o de
líquido corporal mediante la identificación de ADN no apoptótico en
estas muestras. La invención también proporciona procedimientos
para identificar indicios de cáncer o de precáncer en muestras que
contienen células epiteliales exfoliadas. Ahora se admite que el
ADN obtenido de las células normales (no cancerosas) exfoliadas es
diferente del ADN obtenido de cáncer exfoliado o de células
precancerosas. Las células exfoliadas normales típicamente han
experimentado apoptosis, y de esta manera producen células o
residuos celulares (dependiendo de la etapa de apoptosis) que
comprenden ADN que ha sido degradado sustancialmente. Las células
exfoliadas de cáncer o de precáncer típicamente no han
experimentado apoptosis, y estas células o sus residuos, aunque
producen algunos fragmentos muy pequeños como resultado de la
degradación en la muestra, típicamente también contienen una
proporción más alta de fragmentos grandes de ADN (en comparación con
aquellos observados en células o residuos procedentes de células
exfoliadas normales). Las diferencias en la integridad del ADN entre
células normales y anormales es un marcador para la presencia de
cáncer o de precáncer en una muestra que comprende células
exfoliadas.
Las heces son una buena muestra para la
ejemplificación de los procedimientos de la invención. El epitelio
colónico experimenta un proceso continuo de exfoliación. Las células
epiteliales normales experimentan apoptosis y se desprenden hacia
el lumen del colon y sobre las heces en formación. Las células
procedentes de pólipos y tumores también se desprenden sobre las
heces en formación. Sin embargo, las células procedentes de pólipos
o tumores son, por definición, no apoptóticas. Los procedimientos de
la invención aprovechan las diferentes características de células
apoptóticas y no apoptóticas para cribar muestras de pacientes para
indicios de cáncer o de precáncer.
Tal como se ha indicado anteriormente, las
células no cancerosas (normales) experimentan apoptosis a intervalos
regulares, o en respuesta a daños celulares irreparables. Como
resultado de la apoptosis, el ADN de células normales se corta en
fragmentos pequeños con aproximadamente 200 o menos pares de bases,
y típicamente con 180 pares de bases o menos. Por el contrario, el
ADN obtenido de células de cáncer o de precáncer es mucho mayor que
los fragmentos apoptóticos típicos. De esta manera, la presencia de
fragmentos grandes de ADN en una muestra (por ejemplo de epitelio
colónico desprendido) indica que hay o había células en la muestra
(o en el espécimen del que se obtuvo) que han evitado la apoptosis,
y su degradación concurrente de ADN. La presencia de fragmentos
grandes de ADN representa un cribado positivo para cáncer o
precáncer. Por consiguiente, la presente invención proporciona un
procedimiento in vitro para cribar un paciente para cáncer o
precáncer, comprendiendo el procedimiento las etapas de detectar en
una muestra de tejido o líquido corporal del paciente que comprende
células exfoliadas o residuos celulares, fragmentos de ADN que son
de mayor tamaño que un fragmento de huso apoptótico típico, los
cuales se obtienen de células exfoliadas o de residuos celulares, en
los que la presencia de dichos fragmentos en una cantidad superior
a un nivel predeterminado que se espera o que se determina para
células no cancerosas o no precancerosas resulta indicativo de
cáncer o de precáncer, y en el que dichos fragmentos son: (a) de
longitud superior a aproximadamente 170 pares de bases; o (b) de
longitud superior a aproximadamente 500 pares de bases; o (c) de
longitud comprendida entre aproximadamente 200 pares de bases y
aproximadamente 3.500 pares de bases; o (d) de longitud comprendida
entre aproximadamente 500 pares de bases y aproximadamente 2.500
pares de bases; o (e) de longitud comprendida entre aproximadamente
200 pares de bases y aproximadamente 1.000 pares de bases; o (f) de
longitud comprendida entre aproximadamente 200 pares de bases y
aproximadamente 600 pares de bases; o (g) de longitud igual a 1,8 Kb
o más. En los procedimientos preferentes, los pacientes que
presentaban muestras con una proporción elevada de ácidos nucleicos
no apoptóticos según se determinó mediante los procedimientos de la
invención se evaluaron adicionalmente para la presencia de un
tumor, adenoma, u otra lesión cancerosa o precancerosa.
En general, los procedimientos de la invención
comprenden detectar en una muestra biológica, uno o más fragmentos
de ADN de una longitud que no se encontraría sustancialmente
presente en células no cancerosas o en residuos celulares, es
decir, de una longitud mayor que un fragmento de huso apoptótico
típico.
Los procedimientos preferentes de la invención
comprenden amplificar ácidos nucleicos en una muestra representativa
de heces utilizando cebadores humanos específicos, y detectar
amplicones con longitudes superiores a las de un fragmento de huso
apoptótico típico. En una realización altamente preferente, la
amplificación se consigue mediante reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) utilizando cebadores directos e inversos dirigidos
contra fragmentos de ácidos nucleicos humanos específicos, y
espaciados para proporcionar un límite inferior a los amplicones
resultantes. También en una realización altamente preferente, los
cebadores para PCR se dirigen contra secuencias de un oncogén o
supresor tumoral humano. Entre los ácidos nucleicos diana
preferentes para los cebadores de PCR se incluyen p53, Kras, apc,
dcc y otros genes conocidos o que se sospecha que se encuentran
asociados a cáncer, y especialmente a cáncer colorrectal. Los
procedimientos para llevar a cabo la PCR se proporcionan en la
patente U.S. No. 4.683.202. La presencia de un amplicón de longitud
superior a un fragmento de huso apoptótico típico es indicativa de
un ácido nucleico molde en la muestra de esa longitud (o más largo).
Según los procedimientos de la invención estas secuencias largas
representan un cribado positivo, y son indicativas de cáncer o de
precáncer.
Entre las muestras biológicas preferentes se
incluyen heces, pus y orina. El procedimiento de la invención
resulta especialmente útil para la detección de fragmentos grandes
de ADN en muestras que comprenden exfoliados. Los tejidos (por
ejemplo colon, pulmones, vejiga) en los que se exfolian células,
especialmente células epiteliales, son los más preferentes para los
procedimientos de cribado de la invención. En estos tejidos, la
renovación celular continua requiere que las células se desprendan
regularmente tras haber experimentado apoptosis. Las muestras del
exfoliado (tejido o líquido corporal que contiene las células
exfoliadas) comprenden predominantemente ADN apoptótico.
Los procedimientos preferentes de la invención
para la utilización en una muestra de heces comprenden obtener una
muestra representativa de heces. Un procedimiento especialmente
preferente para preparar una muestra de heces se da a conocer en la
patente U.S. No. 5.741.650, y en la patente copropietaria U.S. No.
5.952.178.
En una realización preferente, los
procedimientos de la invención comprenden homogeneizar una muestra
representativa de heces en un solvente con el fin de formar una
mezcla de muestra homogeneizada con una proporción de volumen de
solvente a masa de heces de por lo menos 5 a 1. Una proporción
especialmente preferente de volumen de solvente a masa de heces de
aproximadamente 20:1. Un solvente preferente para preparar las
muestras de heces de acuerdo con al invención es un tampón
fisiológicamente compatible que comprende un detergente y una
proteinasa y opcionalmente un inhibidor de ADNasa, tal como un
tampón que comprende Tris-EDTA-NaCl.
Un tampón preferente es Tris 50 mM, EDTA 150 mM y NaCl 10 mM a pH
9,0. Otro solvente preferente es el isotiocianato de guanidina
(GITC). La provisión de una proporción óptima de volumen de
solvente a masa de heces generalmente incrementa el rendimiento de
ácidos nucleicos de la muestra. Se dan a conocer detalles
adicionales respecto a la preparación de las muestras en la patente
copropietaria U.S. No. 6.268.136.
Los procedimientos preferentes de la invención
comprenden además enriquecer las muestras para el ADN humano. Entre
los procedimientos de enriquecimiento preferentes para la
utilización en la invención se incluyen enriquecer una secuencia
diana humana deseada utilizando una columna de afinidad, captura
específica para una secuencia, o mediante la utilización de
tampones preferentes con preferencia por el aislamiento de ADN
humano. Un procedimiento de enriquecimiento preferente se basa en
la captura de ácidos nucleicos humanos únicos utilizando, por
ejemplo, una columna de afinidad. Posteriormente se proporcionan
detalles de estos procedimientos.
En una realización preferente, los
procedimientos comprenden además la etapa de extraer ADN de la
mezcla de muestra homogeneizada utilizando sondas de ácidos
nucleicos específicas de secuencia. Resultan particularmente
preferentes las sondas que se hibridan a ADN humano. Las sondas
preferentemente se marcan. Entre los marcajes preferentes se
incluyen los marcajes radioactivos, los marcajes fluorescentes, los
marcajes de peso molecular y los marcajes enzimáticos. Son bien
conocidos de la técnica otros marcajes.
En una realización preferente, se utiliza
electroforesis en gel, cromatografía de afinidad o espectrometría
de masas para detectar fragmentos grandes de ADN (fragmentos que
comprenden más de aproximadamente 200 pares de bases). La presencia
de fragmentos grandes de ADN es indicativa de cáncer
colorrectal.
En una realización preferente, las sondas de
captura comprenden ADN, ARN o APN, y se marcan detectablemente
utilizando procedimientos conocidos de la técnica. En una
realización, las sondas se marcan con isótopos radioactivos, tales
como ^{32}P, ^{33}P, ^{35}S, ^{125}I o cualquier otro
isótopo detectable útil para el marcaje de una sonda de
hibridación. En otra realización, las sondas se marcan con moléculas
fluorescentes. En la técnica se conocen numerosos marcajes
fluorescentes, y cualquier sonda fluorescente detectable resulta
útil para la práctica de la invención. Alternativamente, se unen
sondas a grupos que incrementan su peso molecular. Por ejemplo, una
sonda puede unirse directamente a una glucoproteína, o a una perla
de vidrio, o a cualquier compuesto que presente un efecto
detectable sobre el peso molecular de la sonda. En una realización
adicional, las sondas se marcan con un compuesto que resulta
detectable debido a interacciones específicas con un compuesto
adicional. Por ejemplo, las sondas biotiniladas resultan detectables
mediante la interacción con estreptavidina. El grupo estreptavidina
se une a un marcaje detectable, tal como una perla, una etiqueta
fluorescente, o un enzima. En otro ejemplo, las sondas se marcan
con un hapteno o con otro antígeno que resulta reconocido
específicamente por un anticuerpo. El anticuerpo se hace detectable
utilizando procedimientos conocidos de la técnica, incluyendo
isótopos radioactivos, etiquetas fluorescentes y reacciones
enzimáticas. En un ejemplo adicional, las sondas se unen
directamente a un enzima que resulta detectable a través de una
reacción catalizada por un enzima específico, generando un producto
detectable.
Finalmente, la invención permite aproximar la
posición en el colon de una lesión colorrectal basándose en la
cantidad relativa de fragmentos de ADN en una muestra de heces con
una longitud no superior a 200 pares de bases. Este aspecto de la
invención se basa en el hecho de que las propiedades líticas de las
heces son mayores en el colon proximal que en el colon distal. En
el colon proximal, las heces son típicamente líquidas. Por lo
tanto, la lisis celular y los enzimas degradativos del ADN en el
colon presentan un mejor acceso a las células exfoliadas en la
mezcla líquida del colon proximal en comparación con su acceso a las
células exfoliadas desprendidas sobre las heces formadas o en
formación típicas del colon distal. Como consecuencia de las
diferencias entre los ambientes del colon proximal y distal, la
presente invención tiene en cuenta que los fragmentos de ADN
típicos de células exfoliadas en el colon proximal son más pequeños
que los fragmentos de ADN de células exfoliadas en el colon distal.
La figura 1 proporciona un ejemplo de la progresión de los tamaños
del ADN esperados para las células de cáncer o de precáncer
exfoliadas en diferentes regiones del colon. El tamaño de los
fragmentos de ADN de las células no cancerosas o precancerosas es el
mismo en todo el colon debido al hecho de que el ADN de esas
células se degrada principalmente por apoptosis. De esta manera, la
lisis celular y la degradación del ADN desempeñan únicamente papeles
menores en la determinación del tamaño de los fragmentos del ADN de
la mayor parte de las células normales exfoliadas en todo el colon.
Se indica, sin embargo, que las células normales que, por ejemplo,
se separan mecánicamente del colon, experimentan el mismo ciclo
lítico y de degradación que la célula de cáncer o de precáncer
típica. Sin embargo, la contribución de estas células normales no
apoptóticas al nivel global de ADN en la muestra de heces es
pequeña, y se controla mediante el establecimiento de estándares
tal como se enseña
posteriormente.
posteriormente.
Se encuentran contenidos aspectos y ventajas
adicionales de la invención en la descripción detallada siguiente
de la misma.
La figura 1 muestra una representación
esquemática del colon, y la longitud representativa (típica) de los
fragmentos de ADN del ADN obtenido de una célula exfoliada de cáncer
o de precáncer respecto al fragmento representativo (típico) de ADN
apoptótico (normal) para diversas regiones del colon.
La figura 2 es una fotografía de un gel que
muestra los resultados de la amplificación de ADN de Kras (exón 1)
aislado de heces utilizando cebadores directos e inversos separados
por un espacio de aproximadamente 200 pb. La intensidad de banda se
relaciona con la cantidad de producto de 200 pb o más en la muestra.
Los carriles 1 a 4 son los resultados de pacientes con cáncer o con
adenoma, el carril 5 es un control positivo, los carriles 6 a 10
son de pacientes que no presentaban cáncer ni adenoma, los carriles
11 y 12 son controles negativos, y los carriles 13 a 18 son
estándares del peso molecular aproximado indicado en la figura.
La figura 3 es una fotografía de un gel que
muestra resultados de la amplificación de ADN de apc (exón 15)
aislado de heces utilizando cebadores directos e inversos separados
por aproximadamente 200 pb. La intensidad de banda se relaciona con
la cantidad de producto de 200 pb o mayor en la muestra. Los
carriles 1 a 4 son los resultados de pacientes con cáncer o con
adenoma, el carril 5 es un control positivo, los carriles 6 a 10
son de pacientes que no presentaban cáncer ni adenoma, los carriles
11 y 12 son controles negativos; y los carriles 13 a 18 son
estándares del peso molecular aproximado indicado en la figura.
La figura 4 es una fotografía de un gel que
muestra los resultados de la amplificación del ADN de apc (exón 15)
aislado de heces utilizando cebadores directos e inversos separados
por un espacio de aproximadamente 200 pb. La intensidad de banda se
relaciona con la cantidad de producto de 200 pb o más en la muestra.
Los carriles 1 a 4 son lo resultados de pacientes con cáncer o
adenoma, el carril 5 es un control positivo, los carriles 6 a 10
son de pacientes que no presentaban cáncer ni adenoma, los carriles
11 y 12 son controles negativos, y los carriles 13 a 18 son
estándares del peso molecular aproximado indicado en la figura.
La figura 5 es una fotografía de un gel que
muestra los resultados de la amplificación del ADN de apc (exón 15)
aislado de heces utilizando cebadores directos e inversos separados
por aproximadamente 200 pb. La intensidad de banda se relaciona con
la cantidad de producto de 200 pb o más en la muestra. Los carriles
1 a 4 son los resultados de pacientes con cáncer o con adenoma, el
carril 5 es un control positivo, los carriles 6 a 10 son de
pacientes que no presentaban cáncer ni adenoma, los carriles 11 y 12
son controles negativos, y los carriles 13 a 18 son estándares del
peso molecular aproximado indicado en la figura.
La figura 6 es una fotografía de un gel que
muestra los resultados de la amplificación de ADN de p53 (exón 5)
aislado de heces utilizando cebadores directos e inversos separados
por un espacio de aproximadamente 200 pb. La intensidad de banda se
relaciona con la cantidad de producto de 200 pb o más en la muestra.
Los carriles 1 a 4 son los resultados de pacientes con cáncer o con
adenoma, el carril 5 es un control positivo, los carriles 6 a 10
son de pacientes que no presentaban cáncer ni adenoma, los carriles
11 y 12 son controles negativos, y los carriles 13 a 18 son
estándares del peso molecular aproximado indicado en la figura.
La figura 7 es una fotografía de un gel que
muestra los resultados de la amplificación del ADN de p53 (exón 7)
aislado de heces utilizando cebadores directos e inversos separados
por un espacio de aproximadamente 200 pb. La intensidad de banda se
relaciona con la cantidad de producto de 200 pb o más en la muestra.
Los carriles 1 a 4 son los resultados de pacientes con cáncer o con
adenoma, el carril 5 es un control positivo, los carriles 6 a 10
son de pacientes que no presentaban ni cáncer ni adenoma, los
carriles 11 y 12 son controles negativos, y los carriles 13 a 18
son estándares del peso molecular aproximado indicado en la
figura.
La figura 8 es una fotografía de un gel que
muestra la amplificación del ADN de p53 (exón 8) aislado de heces
utilizando cebadores directos e inversos separados por un espacio de
aproximadamente 200 pb.
La intensidad de banda se relaciona con la
cantidad de producto de 200 pb o más en la muestra. Los carriles 1
a 4 son los resultados de pacientes con cáncer o con adenoma, el
carril 5 es un control positivo, los carriles 6 a 10 son de
pacientes que no presentaban ni cáncer ni adenoma, los carriles 11 y
12 son controles negativos, y los carriles 13 a 18 son estándares
del peso molecular aproximado indicado en la figura.
La figura 9 es una fotografía de un gel de los
resultados de la amplificación del ADN de muestras de heces
utilizando cebadores directos e inversos separados por un espacio de
aproximadamente 1,8 Kb. La intensidad de banda muestra la cantidad
de 1,8 Kb o más. Los carriles 1, 8 y 9 son controles negativos, los
carriles 2, 3 y 5 son los resultados de pacientes con cáncer o con
adenoma, los carriles 4, 6 y 7 son los resultados de pacientes que
no presentaban cáncer ni adenoma, y los carriles 10 a 14 son
estándares de peso molecular.
La figura 10 es una fotografía de un gel de los
resultados de la amplificación de ADN de muestras de heces
utilizando cebadores directos e inversos separados por un espacio de
aproximadamente 1,8 Kb. La intensidad de banda muestra la cantidad
de producto de 1,8 Kb o más. Los carriles 1, 8 y 9 son controles
negativos, los carriles 2, 3 y 5 son los resultados de pacientes
con cáncer o con adenoma, los carriles 4, 6 y 7 son los resultados
de pacientes que no presentaban ni cáncer ni adenoma, y los carriles
10 a 14 son estándares de peso molecular.
La figura 11 es una fotografía de un gel de los
resultados de la amplificación del ADN de muestras de heces
utilizando cebadores directos e inversos separados por un espacio de
aproximadamente 1,8 Kb. La intensidad de banda muestra la cantidad
de producto de 1,8 Kb o más. Los carriles 1, 8 y 9 son controles
negativos, los carriles 2, 3 y 5 son los resultados de pacientes
con cáncer o con adenoma, los carriles 4, 6 y 7 son los resultados
de pacientes que no presentaban ni cáncer ni adenoma, y los carriles
10 a 14 son estándares de peso molecular.
Los procedimientos de la invención se basan en
la observación de que las muestras que comprenden células de
pacientes con cáncer o con precáncer contienen una cantidad superior
de fragmentos de ADN de elevado peso molecular (secuencia larga) en
comparación con las muestras correspondientes obtenidas de
individuos que se encuentran libres de cáncer/precáncer. Por
consiguiente, los procedimientos de la invención proporcionar
procedimientos exactos de cribado y diagnósticos para cáncer o
precáncer.
Los procedimientos de la invención resultan
útiles para detectar ácidos nucleicos indicativos de cáncer o
precáncer en cualquier muestra de tejido o de líquido corporal. Por
ejemplo, se utilizan muestras de esputo para detectar la presencia
de ADN de elevado peso molecular (secuencia larga) como marcador de
cáncer. La mayoría de las células exfoliadas en el esputo han
experimentado apoptosis y posterior degradación enzimática
adicional. El ADN predominante de estas células es ADN pequeño
apoptótico. Las células cancerosas producidas por, por ejemplo, los
pulmones, las vías nasales, o la tráquea también se desprenderán
hacia el esputo. Sin embargo, el ADN de estas células, aunque se
expone a procesos enzimáticos, no ha resultado afectado por
apoptosis. Por consiguiente, los fragmentos de las células de
cáncer o de precáncer que se encuentran en el esputo son mayores
que los fragmentos que se espera que produzcan las células
normales.
De manera similar, las células desprendidas por
las lesiones cancerosas o precancerosas en la vejiga o el riñón
producen ADN no apoptótico en la orina, las lesiones cancerosas o
precancerosos en los nódulos linfáticos resultan en fragmentos de
ADN no apoptótico en la linfa, y las células cancerosas y
precancerosas en las mama desprenden células que contiene
fragmentos de ADN no apoptóticos que pueden recolectarse mediante
aspiración. Por consiguiente, los procedimientos de la invención
resultan útiles en cualquier tejido o líquido corporal. Sin
embargo, a fines de ejemplificación de los procedimientos descritos
en la presente memoria, se utilizaron muestras de heces para
predecir la presencia de cáncer o precáncer colorrectal. Las heces
son un espécimen excelente para el análisis debido a la exfoliación
característica de los epitelios colónicos tal como se ha descrito
anteriormente.
Los procedimientos de la invención se ponen en
práctica mediante la detección de la presencia de fragmentos de ADN
con una longitud de secuencia cuya presencia no resultaría esperable
en cantidades significativas en una muestra obtenida de un
individuo sano (es decir, un individuo que no presenta cáncer ni
precáncer). Una cantidad umbral de fragmentos grandes es una
cantidad que excede un nivel predeterminado esperado o determinado
para las células no cancerosas/no precancerosas. El nivel
predeterminado o estándar puede determinarse mediante la detección
de la cantidad de un tamaño particular de fragmento de ADN
(preferentemente fragmentos apoptóticos característicos de células
normales) en una población o subpoblación de pacientes normales. Los
estándares pueden determinarse empíricamente y, tras determinarse,
pueden utilizarse como base para el cribado adicional.
El tamaño de los fragmentos que debe utilizarse
se selecciona basándose en la conveniencia de realizar
individualmente el cribado. Entre los factores que afectan al
tamaño de los fragmentos utilizados en los procedimientos de
cribado o diagnósticos de la invención se incluyen la disponibilidad
y costes de las sondas y cebadores, la diana deseada de
amplificación, el tipo de cáncer para el que se criba, y la muestra
del paciente en la que tiene lugar el cribado. La invención
aprovecha aprovecha el hecho reconocido de que los fragmentos
grandes son más abundantes en las muestras anormales que en las
muestras normales. Por consiguiente, el tamaño preciso de los
fragmentos utilizados en los procedimientos de la invención no
resulta importante. Para cualquier tamaño dado de fragmentos que
deben analizarse, debe determinarse un valor de corte para
distinguir entre las muestras normales y las anormales.
Preferentemente el valor de corte se determina empíricamente
basándose en muestras normal y anormal conocidas, y después se
utiliza en cribados futuros.
Los ejemplos siguientes proporcionan más
detalles sobre los procedimientos de acuerdo con la invención. A
título de ejemplificación, los ejemplos siguientes proporcionan
detalles sobre la utilización del procedimiento de la presente
invención en la detección del cáncer de colon. Por consiguiente,
aunque se ejemplifica de la manera siguiente, la invención no se
encuentra limitada y el experto en la materia apreciará su amplio
abanico de aplicaciones tras la consideración de la misma.
Para el análisis de muestras de heces, los
procedimientos preferentes de la invención comprenden obtener por
lo menos una sección transversal o porción circunferencial de heces
evacuadas tal como se enseña en la patente U.S. No. 5.741.650 y la
patente U.S. copendiente copropietaria No. 5.952.178. Aunque resulta
deseable una porción en sección transversal o una porción
circunferencial de las heces, los procedimientos proporcionados en
la presente invención se llevan a cabo en muestras aleatorias
obtenidas de heces evacuadas, que incluye frotis o raspados. Tras
su obtención, el espécimen de heces se homogeneiza. Un tampón
preferente para la homogeneización es uno que contenga por lo menos
16 mM de ácido etilendiaminatetraacético (EDTA). Sin embargo, tal
como se enseña en la patente U.S. copropietaria No. 6.551.777, se
ha descubierto que la utilización de por lo menos 150 mM de EDTA
mejora grandemente el rendimiento de ácidos nucleicos de las heces.
De esta manera, un tampón preferente para la homogeneización de las
heces comprende solución salina tamponada con fosfato, 20 a 100 mM
de NaCl o de KCl, por lo menos 150 mM de EDTA, y opcionalmente un
detergente (tal como SDS) y una proteinasa (por ejemplo proteinasa
K).
Tras la homogeneización, los ácidos nucleicos
preferentemente se aíslan a partir de la muestra de heces. El
aislamiento o la extracción de los ácidos nucleicos no resulta
necesaria en todos los procedimientos de la invención, debido a que
determinadas técnicas de detección pueden llevarse a cabo
adecuadamente en heces homogeneizadas sin aislamiento de los ácidos
nucleicos. En una realización preferente, sin embargo, las heces
homogeneizadas se centrifugan para crear un sobrenadante que
contiene ácidos nucleicos, proteínas, lípidos y otros residuos
celulares. El sobrenadante se trata con un detergente y con
proteinasa para degradar las proteínas, y los ácidos nucleicos se
extraen con fenol-cloroformo. Los ácidos nucleicos
extraídos seguidamente se precipitan con alcohol. Pueden utilizarse
otras técnicas para aislar los ácidos nucleicos de la muestra. Entre
estas técnicas se incluyen la captura de híbridos, y la
amplificación directamente de las heces homogeneizadas. Los ácidos
nucleicos pueden purificarse y/o aislarse en el grado requerido por
el ensayo de cribado que debe utilizarse. El ADN total se aísla
utilizando técnicas conocidas de la técnica.
Tras el aislamiento del ADN, la muestra
preferentemente se enriquece en los ácidos nucleicos humanos
utilizando sondas de captura específicas de secuencia. El ADN
peletizado se resuspende en un tampón TE. A continuación, se añade
isotiocianato de guanidina (GITC). Se añade a la muestra un exceso
de sondas de captura que reconoce el ADN humano. La muestra se
calienta para desnaturalizar el ADN y después se enfría. Finalmente,
la sonda y el ADN diana se dejan que se hibriden. Se suspenden en
agua perlas magnetizadas recubiertas con estreptavidina y se añaden
a la mezcla. Tras mezclar brevemente, la mezcla se mantiene a
temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos. Tras
completar la unión por afinidad, se aplica un campo magnético a la
muestra para retirar las perlas magnetizadas de aislamiento (tanto
con como sin el complejo hibridado). A continuación, las perlas se
lavan cuatro (4) veces en GITC 1 M/solución Igepal al 0,1% (Sigma,
St. Louis, MO) durante 15 minutos, seguido de dos (2) lavados con
tampón caliente (TE con NaCl 1 M) durante 15 minutos con el fin de
aislar la estreptavidina acomplejada. Finalmente, se añade agua
destilada a las perlas y se calientan para eludir el ADN. A
continuación puede llevarse a cabo la electroforesis en gel del ADN
humano que ha sido capturado.
El tamaño de los fragmentos de ADN humano
obtenido anteriormente puede determinarse mediante numerosos medios.
Por ejemplo, el ADN humano puede separarse utilizando
electroforesis en gel. Se prepara un gel de acrilamida al 5%
utilizando técnicas conocidas de la técnica. Ver Ausubel et
al., Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley &
Sons, 1195, páginas
2-23-2-24. A
continuación, se determina el tamaño de los fragmentos de ADN
humano mediante la comparación con estándares conocidos. Los
fragmentos mayores de aproximadamente 200 pb proporcionan un
cribado positivo. Aunque puede realizarse un diagnóstico basándose
únicamente en el cribado, los pacientes que presentan un cribado
positivo preferentemente se recomienda que se sometan a pruebas de
seguimiento para obtener la confirmación del diagnóstico.
Un medio preferente para determinar la longitud
de los fragmentos de ADN humano es mediante la utilización de PCR.
Los procedimientos para la realización de la PCR son bien conocidos.
En la presente invención, se amplifican los fragmentos de ADN
humano utilizando cebadores específicamente humanos. Un amplicón
mayor de aproximadamente 200 pb producido mediante PCR representa
un cribado positivo. Pueden utilizarse otras reacciones de
amplificación y modificaciones de la PCR, tales como la reacción en
cadena de la ligasa, PCR de fase inversa, Q-PCR y
otros, para producir niveles detectables de amplicón. El amplicón
puede detectarse mediante acoplamiento a un informador (por ejemplo
mediante fluorescencia, isótopos radioactivos, y similares) mediante
secuenciación, mediante electroforesis en gel, mediante
espectrometría de masas, o mediante cualquier otro medio conocido
de la técnica, con la condición de que la longitud, peso, u otra
característica de los amplicones los identifique según su
tamaño.
Los experimentos se llevaron a cabo para
determinar si las características del ADN amplificable en las heces
eran predictivas de cáncer o de precáncer en pacientes de los que se
habían obtenido muestras de heces. En el primer experimento, se
midió la cantidad de ADN amplificable en cada una de varias muestras
de heces utilizando la amplificación por PCR para detectar los
fragmentos de ADN en la muestra de por lo menos 200 pares de bases
de longitud. El segundo experimento determinó la cantidad de
fragmentos largos (de más de 200 pares de bases) en las mismas
muestras, y después determinó las proporciones de productos largos a
cortos.
Se recogieron muestras de heces de 9 pacientes
que se presentaron con síntomas o con un historial médico que
indicaba que debería llevarse a cabo una colonoscopia. Cada muestra
de heces se congeló. Inmediatamente tras proporcionar una muestra
de heces, cada paciente recibió una colonoscopia con el fin de
determinar el estado de enfermedad del paciente. Basándose en los
resultados de la colonoscopia, y posteriormente del análisis
histológico de las muestras de biopsia obtenidas durante la
colonoscopia, los individuos se clasificaron en dos grupos:
normales o anormales. El grupo anormal consistía de pacientes con
cáncer o con un adenoma de por lo menos 1 cm de diámetro. Basándose
en estos resultados, 4 de los 9 pacientes se clasificaron en el
grupo anormal.
Las muestras se cribaron mediante captura
híbrida del ADN humano, y determinación del ADN amplificable de por
lo menos 200 pares de bases. Cada espécimen congelado de heces, con
un peso de entre 7 y 33 gramos, se descongeló y se homogeneizó en
Tris 500 mM, EDTA 16 mM y NaCl 10 mM, pH 9,0, a una proporción
volumen: masa de 3:1. A continuación, las muestras se
homogeneizaron nuevamente en el mismo tampón hasta una proporción
de volumen a masa de 20:1, y se centrifugaron en macroperlas de
vidrio a 2.356 x g. Se recogió el sobrenadante y se trató con SDS y
proteinasa K. Después, se extrajo el ADN con
fenol-cloroformo y se precipitó con alcohol. El
precipitado se suspendió en Tris 10 mM y EDTA 1 mM (1 x TE), pH 7,4.
Finalmente, el ADN se trató con ARNasa.
Se aisló el ADN humano del precipitado mediante
captura híbrida específica de secuencia. Se utilizaron sondas
biotiniladas contra porciones de los genes p53,
K-ras y apc. La sonda de K-ras era
5'-GTGGAGTATTTGATAGTGTATTAACCTTATGTGTGAC-3'
(SEC ID No. 1). Se utilizaron dos sondas de apc:
apc-1309 era
5'-TTCCAGCAGTGTCACAGCACCCTAGAACCAAATCCAG-3'
(SEC ID No. 2) y apc-1378 era
5'-CAGATAGCCCTGGACAAACAATGCCACGAAGCAGAAG-3'
(SEC ID No. 3). Se utilizaron cuatro sondas contra p53, la primera
(hibridante con una porción del exón 5) era
5'-TACTCCCCTGCCCTCAACAAGATGTTTTGCCAACTGG-3'
(SEC ID No. 4), la segunda (hibridante con una porción del exón 7)
era
5'-ATTTCTTCCATACTACTACCCATCGACCTCTCATC-3'
(SEC ID No. 5), la tercera, también hibridante con una porción del
exón 7 era
5'-ATGAGGCCAGTGCGCCTTGGGGAGACCTGTGGCAAGC-3'
(SEC ID No. 6), y finalmente, una sonda contra el exón 8 presentaba
la secuencia
5'-GAAAGGACAAGGGTGGTTGGGAGTAGATGGAGCCTGG-3'
(SEC ID No. 7). Se añadió una alícuota de 10 \mul de cada sonda
(20 pmoles/captura) a una suspensión que contenía 300 \mul de ADN
en presencia de 310 \mul de tampón GITC 6 M durante 2 horas a
temperatura ambiente. Se aislaron complejos híbridos utilizando
perlas recubiertas con estreptavidina (Dynal). Tras el lavado, los
complejos de sonda-perla se suspendieron a 25ºC
durante 1 hora en tampón 0,1 x TE, pH 7,4. A continuación, la
suspensión se calentó durante 4 minutos a 85ºC, y se separaron las
perlas.
A continuación, el ADN capturado se amplificó
mediante PCR, esencialmente tal como se describe en la patente US
No. 4.683.202. Cada muestras se amplificó utilizando cebadores
directo e inverso a través de 7 loci (Kras, exón 1, exón 15 de APC
(tres loci separados), p53, exón 5, p53, exón 7 y p53, exón 8) por
duplicado (para un total de 14 amplificación para cada locus). Se
llevaron a cabo siete PCRs separadas (33 ciclos cada una) por
duplicado utilizando cebadores dirigidos para detectar fragmentos en
la muestra que presentasen 200 pares de bases o más. Se depositó el
ADN amplificado en un gel Nusieve al 4% (FMC Biochemicals) (3%
Nusieve, 1% agarosa) y se tiñó con bromuro de etidio (0,5
\mug/ml). El ADN amplificado resultante se gradó basándose en la
intensidad relativa de los geles teñidos. Los resultados se muestran
en las figuras 2-8. Cada figura representa los
resultados para la totalidad de los 9 pacientes (incluyendo los
estándares) para los siete loci diferentes que se amplificaron. Tal
como se muestra en las figuras, cada muestra de un paciente con
cáncer o con adenoma se detectó en forma de una banda con
intensidad significativamente superior que las bandas asociadas a
muestras de pacientes que no presentaban cáncer ni precáncer. La
totalidad de los pacientes con cáncer/adenoma identificados
mediante colonoscopia se identificaron correctamente mediante la
determinación de la cantidad de ADN amplificable de longitud igual
o superior a 200 pares de bases. Tal como se muestra en las figuras
2 a 8, los resultados fueron los mismos con independencia del locus
amplificado. Por consiguiente, la cantidad de ADN de 200 pb o más
en una muestra fue predictivo del estado de enfermedad del
paciente.
Se llevó a cabo un experimento esencialmente
idéntico al descrito anteriormente en el Ejemplo 1 aunque se
introdujeron cebadores directos e inversos de manera que se
amplificaron fragmentos de aproximadamente 1,8 Kb o más.
Se preparó ADN tal como se ha descrito
anteriormente. Se espaciaron cebadores directos e inversos de manera
que se hibridasen a una distancia aproximada de 1,8 Kb en tres loci
diferentes (Kras exón 1, APC exón 15 y p53 exón 5). Se llevaron a
cabo treinta y tres rondas de amplificación, y el ADN resultante se
corrió en un gel de acrilamida al 5%. Los resultados se muestra en
las figuras 9 a 11. Tal como se muestra en las figuras (que
muestran los resultados de tres experimentos separados para
amplificar y detectar producto "largo"), las muestras de
individuos con cáncer o precáncer produjeron cantidades grandes de
ADN de elevado peso molecular (en este caso, de 1,8 Kb y más);
mientras que las muestras de pacientes que no presentaban cáncer ni
precáncer no produjeron ADN en el intervalo de aproximadamente 1,8
Kb o superior. De esta manera, la presencia de ADN de elevado peso
molecular fue indicativa del estado de enfermedad del paciente.
Se ha descrito la invención en términos de sus
realizaciones preferentes. Las realizaciones alternativas resultan
evidentes para el experto en la materia tras el examen de la
especificación y de las reivindicaciones.
Claims (13)
1. Procedimiento in vitro para el
cribado de un paciente para cáncer o precáncer, comprendiendo el
procedimiento las etapas de:
detectar en una muestra de tejido o líquido
corporal del paciente que comprende células exfoliadas y residuos
celulares, fragmentos de ADN que son mayores que un fragmento de
huso apoptótico típico, cuyos fragmentos de ADN se obtienen de
células exfoliadas o residuos celulares, en el que la presencia de
dichos fragmentos en una cantidad superior a un nivel
predeterminado que se espera o se determina para células no
cancerosas o no precancerosas resulta indicativo de cáncer o de
precáncer, y en el que dichos fragmentos son:
- (a)
- de longitud superior a aproximadamente 170 pares de bases; o
- (b)
- de longitud superior a aproximadamente 500 pares de bases; o
- (c)
- de longitud comprendida entre aproximadamente 200 pares de bases y aproximadamente 3.500 pares de bases; o
- (d)
- de longitud comprendida entre aproximadamente 500 pares de bases y aproximadamente 2.500 pares de bases; o
- (e)
- de longitud comprendida entre aproximadamente 200 pares de bases y aproximadamente 1.000 pares de bases; o
- (f)
- de longitud comprendida entre aproximadamente 200 pares de bases y aproximadamente 600 pares de bases; o
- (g)
- de longitud igual a 1,8 Kb o más.
2. Procedimiento según la reivindicación
1, en el que dicho nivel predeterminado se determina mediante la
detección de la cantidad de fragmentos de ADN en una población o
subpoblación de pacientes normales.
3. Procedimiento según la reivindicación
1 ó 2, en el que dicho intervalo especificado es de 1,8 Kb o
superior, y dicho nivel predeterminado es de cero.
4. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicha muestra se selecciona
de entre el grupo que consiste en heces, pus, orina, esputo, linfa y
aspirado bronquial.
5. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que comprende además la etapa de
enriquecer dicha muestra en ADN humano.
6. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que comprende además la etapa de
aislar ADN humano de dicha muestra.
7. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que comprende cribar dicho paciente
para adenoma o para pólipos o tumores.
8. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicha muestra contiene
células epiteliales exfoliadas.
9. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicho cáncer o precáncer es
un cáncer o precáncer de los pulmones, tracto nasal, tráquea,
vejiga, riñón, nódulos linfáticos o mama.
10. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho cáncer o precáncer es
cáncer o precáncer colorrectal.
11. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dichos fragmentos de ADN se
detectan utilizando una reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
con cebadores directos e inversos.
12. Procedimiento según la reivindicación
11, en el que dicho cebadores se dirigen contra secuencias de
oncogén humano o de supresor tumoral.
13. Procedimiento según la reivindicación
12, en el que dichos cebadores se dirigen hacia p53, Kras, apc ó
dcc.
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