JP2023529314A - Ｄｎａのメチル化を保存するための組成物および方法 - Google Patents

Ｄｎａのメチル化を保存するための組成物および方法 Download PDF

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サンフォード ディー． マーコウィッツ，
ヘレン モイノヴァ，
ジョセフ レディー，
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Abstract

本開示は、一定期間にわたりＤＮＡメチル化パターンを保存するための保存溶液のための方法を提供する。本開示は、そのような保存溶液中で保存されるメチル化ＤＮＡを使用する方法も提供する。一部の実施形態では、本開示は、メチル化ＤＮＡ配列を含む生体試料；およびメタノールとｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ｔｒｉｓ）を含む保存溶液を含む組成物であって、メチル化ＤＮＡ配列のメチル化パターンが保存される、組成物を提供する。

Description

関連出願
本出願は、２０２０年５月２７日に出願された米国仮特許出願第６３／０３０，４０７号、および２０２１年４月８日に出願された米国仮特許出願第６３／１７２，２７９号に基づく優先権の利益を主張しており、その出願は、参照により本明細書に完全に組み込まれている。
資金
本発明は、国立衛生研究所により与えられた助成金ＣＡ１５２７５６の下での政府支援を受けて行われた。政府は本発明に一定の権利を有する。
背景
シトシンメチル化は、真核生物のゲノムのＤＮＡにおいて「第５の塩基」であると称されることが多い。ＤＮＡシトシンメチル化の変更されたパターンは、付随物、バイオマーカー、および時には様々な異形成、新生物およびがんを含む複数のヒト疾患状態の原因となる要素として認識される。しかし、ＤＮＡポリヌクレオチド配列は長期間室温で安定である一方で、メチル化パターンは、長期間室温で保存された場合、元のメチル化パターンから逸脱する傾向がより高い。このように、ＤＮＡメチル化パターンを長期間保存するための新たな保存条件に対する必要性が存在する。
開示の概要
一部の実施形態では、本開示は、メチル化ＤＮＡ配列を含む生体試料；およびメタノールとｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ｔｒｉｓ）を含む保存溶液を含む組成物であって、メチル化ＤＮＡ配列のメチル化パターンが保存される、組成物を提供する。特定の実施形態では、ｔｒｉｓは、７．０～９．０のｐＨを有する。特定の実施形態では、ｔｒｉｓは、７．０～８．０のｐＨを有する。特定の実施形態では、ｔｒｉｓは、７．５～８．５のｐＨを有する。特定の実施形態では、ｔｒｉｓは、７．５～８．０のｐＨを有する。特定の実施形態では、ｔｒｉｓは、１ｍＭ～２５０ｍＭの濃度で存在する。特定の実施形態では、ｔｒｉｓは、１ｍＭ～１００ｍＭの濃度で存在する。特定の実施形態では、ｔｒｉｓは、５ｍＭ～５０ｍＭの濃度で存在する。特定の実施形態では、ｔｒｉｓは、５ｍＭ～２０ｍＭの濃度で存在する。特定の実施形態では、ｔｒｉｓは、２０ｍＭ～２５０ｍＭの濃度で存在する。特定の実施形態では、ｔｒｉｓは、２０ｍＭ～１００ｍＭの濃度で存在する。特定の実施形態では、ｔｒｉｓは、３０ｍＭ～７０ｍＭの濃度で存在する。特定の実施形態では、ｔｒｉｓは、３０ｍＭ～５０ｍＭの濃度で存在する。特定の実施形態では、ｔｒｉｓは、１０ｍＭの濃度で存在する。特定の実施形態では、ｔｒｉｓは、５０ｍＭの濃度で存在する。特定の実施形態では、保存溶液は、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）をさらに含む。特定の実施形態では、ＢＨＴは、１～５００ｐｐｍの量で存在する。特定の実施形態では、ＢＨＴは、２０～２００ｐｐｍの量で存在する。特定の実施形態では、ＢＨＴは、２５～１００ｐｐｍの量で存在する。一部の実施形態では、本開示は、生体試料および保存溶液を含む組成物であって、生体試料は、メチル化ＤＮＡ配列を含み、保存溶液は、メタノールおよびＢＨＴを含み、組成物は、生体試料のメチル化パターンを保存する、組成物を提供する。特定の実施形態では、ＢＨＴは、１～５００ｐｐｍの量で存在する。特定の実施形態では、ＢＨＴは、２０～２００ｐｐｍの量で存在する。特定の実施形態では、ＢＨＴは、２５～１００ｐｐｍの量で存在する。一部の実施形態では、メチル化パターンは、少なくとも２週間保存される。一部の実施形態では、メチル化パターンは、少なくとも３週間保存される。一部の実施形態では、メチル化パターンが室温で保存される。一部の実施形態では、保存溶液中の生体試料のメチル化パターンは、保存前の生体試料におけるメチル化パターンと比較して、少なくとも６０％保存される。一部の実施形態では、保存溶液中の生体試料のメチル化パターンは、保存前の生体試料におけるメチル化パターンと比較して、少なくとも６５％保存される。一部の実施形態では、保存溶液中の生体試料のメチル化パターンは、保存前の生体試料におけるメチル化パターンと比較して、少なくとも７０％保存される。一部の実施形態では、保存溶液中の生体試料のメチル化パターンは、保存前の生体試料におけるメチル化パターンと比較して、少なくとも７５％保存される。一部の実施形態では、保存溶液中の生体試料のメチル化パターンは、保存前の生体試料におけるメチル化パターンと比較して、少なくとも８０％保存される。一部の実施形態では、保存溶液中の生体試料のメチル化パターンは、保存前の生体試料におけるメチル化パターンと比較して、少なくとも８５％保存される。一部の実施形態では、保存溶液中の生体試料のメチル化パターンは、保存前の生体試料におけるメチル化パターンと比較して、少なくとも９０％保存される。一部の実施形態では、保存溶液中の生体試料のメチル化パターンは、保存前の生体試料におけるメチル化パターンと比較して、少なくとも９５％保存される。一部の実施形態では、試料がヒト生体試料である。一部の実施形態では、生体試料は、胃腸管、気道消化管、気道、尿生殖器管、または体液のいずれかに由来する試料である。特定のこのような実施形態では、体液は、血液、尿、痰、唾液、便、胆汁、膵液、鼻汁、涙、精液、膣分泌物、脳脊髄液、胸膜液、腹水、胃液、心膜液、汗、リンパ液、嚢胞液、膵嚢胞液、滑液、関節液、月経液、子宮内膜洗浄液、胸部吸込物、または羊水のうちのいずれかである。一部の実施形態では、生体試料は、食道、胃、結腸、小腸、膵臓、肝臓、口腔、中咽頭、気管、気管支樹、肺、または乳房のいずれかに由来する試料である。一部の実施形態では、生体試料が食道生体試料である。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび１００％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された１０％から１００％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された１０～９５％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された１０～９０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された１５～９０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された２０～９０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された２５～９０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された３０～９０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された３０～８５％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された３０～８０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された３５～８０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された３５～７５％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された３５～７０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された３０～７０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された４０～７０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された４０～６５％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された４０～６０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された４０～５５％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された４５～５５％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された５０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび１００％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された１０％～１００％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された１０～９５％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された１０～９０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された１５～９０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された２０～９０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された２５～９０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された３０～９０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された３０～８５％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された３０～８０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された３５～８０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された３５～７５％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された３５～７０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された３０～７０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された４０～７０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された４０～６５％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された４０～６０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された４０～５５％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された４５～５５％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された５０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび１００％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された１０％～１００％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された１０～９５％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された１０～９０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された１５～９０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された２０～９０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された２５～９０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された３０～９０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された３０～８５％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された３０～８０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された３５～８０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された３５～７５％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された３５～７０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された３０～７０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された４０～７０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された４０～６５％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された４０～６０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された４０～５５％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された４５～５５％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された５０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液がｔｒｉｓおよび１００％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された１０％から１００％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された１０～９５％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された１０～９０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された１５～９０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された２０～９０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された２５～９０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された３０～９０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された３０～８５％のメタノールから本質的に



なる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された３０～８０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された３５～８０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された３５～７５％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された３５～７０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された３０～７０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された４０～７０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された４０～６５％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された４０～６０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された４０～５５％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された４５～５５％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された５０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび１００％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された１０％～１００％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された１０～９５％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された１０～９０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された１５～９０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された２０～９０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された２５～９０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された３０～９０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された３０～８５％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された３０～８０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された３５～８０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された３５～７５％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された３５～７０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された３０～７０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された４０～７０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された４０～６５％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された４０～６０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された４０～５５％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された４５～５５％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された５０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび１００％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された１０％～１００％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された１０～９５％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された１０～９０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された１５～９０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された２０～９０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された２５～９０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された３０～９０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された３０～８５％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された３０～８０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された３５～８０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された３５～７５％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された３５～７０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された３０～７０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された４０～７０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された４０～６５％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された４０～６０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された４０～５５％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された４５～５５％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された５０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび１００％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された１０％～１００％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された１０～９５％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された１０～９０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された１５～９０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された２０～９０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された２５～９０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された３０～９０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された３０～８５％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された３０～８０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された３５～８０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された３５～７５％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された３５～７０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された３０～７０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された４０～７０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された４０～６５％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された４０～６０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された４０～５５％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された４５～５５％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された５０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび１００％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された１０％～１００％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された１０～９５％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された１０～９０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された１５～９０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された２０～９０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された２５～９０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された３０～９０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された３０～８５％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された３０～８０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された３５～８０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された３５～７５％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された３５～７０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された３０～７０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された４０～７０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された４０～６５％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された４０～６０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された４０～５５％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された４５～５５％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された５０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび１００％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された１０％～１００％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された１０～９５％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された１０～９０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された１５～９０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された２０～９０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された２５～９０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された３０～９０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された３０～８５％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された３０～８０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された３５～８０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された３５～７５％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された３



５～７０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された３０～７０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された４０～７０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された４０～６５％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された４０～６０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された４０～５５％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された４５～５５％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された５０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、メタノールは、過酸化物を含まないかまたは０．００１％未満もしくはそれに等しいレベルの過酸化物を含む。一部の実施形態では、水は、蒸留、または限外濾過、または逆浸透によって精製されている。一部の実施形態では、水がＤＮＡｓｅおよび／またはＲＮＡｓｅ活性を有さない。一部の実施形態では、メチル化ＤＮＡ配列は、ビメンチン、ＣＣＮＡ１、Ｕｐ１０、Ｕｐ３５－１、Ｕｐ３５－２、ＦＥＲ１Ｌ４、ＶＡＶ３、ＤＯＣＫ１０、ＡＤＣＹ１、ＢＭＰ３、ＣＤ１Ｄ、ＥＬＭＯ１、ＥＬＯＶＬ２、ＬＲＲＣ４、ＮＤＲＧ４、ＳＦＭＢＴ２、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＴＳＰＹＬ５、ＺＮＦ５６８、ＺＮＦ５６９、ＺＮＦ６１０、ＺＮＦ６７１、ＺＮＦ６８２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＤＩＯ３、およびＨＵＮＫ遺伝子のヌクレオチド配列のいずれかと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリヌクレオチド配列、またはそのいずれかの断片および／もしくは相補体を含む。一部の実施形態では、メチル化ＤＮＡ配列は、配列番号１～４５のいずれか１つと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリヌクレオチド配列、またはそのいずれかの断片および／もしくは相補体を含む。一部の実施形態では、メチル化ＤＮＡパターンは、室温（２３℃）で保存された場合に、組成物中で少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、１０時間、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、２週間、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１年、１８カ月または２年の間保存される。一部の実施形態では、メチル化ＤＮＡパターンは、４℃で保存された場合に、組成物中で少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、１０時間、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、２週間、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１年、１８カ月または２年の間保存される。一部の実施形態では、メチル化ＤＮＡパターンは、－３０℃から５０℃の間の範囲の温度で保存された場合に、組成物中で少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、１０時間、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、２週間、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１年、１８カ月または２年の間保存される。一部の実施形態では、メチル化ＤＮＡパターンは、－３０℃から３０℃の間の範囲の温度で保存された場合に、組成物中で少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、１０時間、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、２週間、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１年、１８カ月または２年の間保存される。一部の実施形態では、メチル化ＤＮＡパターンは、－１０℃から３０℃の間の範囲の温度で保存された場合に、組成物中で少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、１０時間、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、２週間、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１年、１８カ月または２年の間保存される。
一部の実施形態では、本開示は、生体試料中のメチル化ＤＮＡ分子のメチル化パターンを保存する方法であって、生体試料を保存溶液で処置するステップを含み、保存溶液がメタノールおよびｔｒｉｓを含む、方法を提供する。特定の実施形態では、ｔｒｉｓは、７．０～９．０のｐＨを有する。特定の実施形態では、ｔｒｉｓは、７．０～８．０のｐＨを有する。特定の実施形態では、ｔｒｉｓは、７．５～８．５のｐＨを有する。特定の実施形態では、ｔｒｉｓは、７．５～８．０のｐＨを有する。特定の実施形態では、ｔｒｉｓは、１ｍＭ～２５０ｍＭの濃度で存在する。特定の実施形態では、ｔｒｉｓは、１ｍＭ～１００ｍＭの濃度で存在する。特定の実施形態では、ｔｒｉｓは、５ｍＭ～５０ｍＭの濃度で存在する。特定の実施形態では、ｔｒｉｓは、５ｍＭ～２０ｍＭの濃度で存在する。特定の実施形態では、ｔｒｉｓは、２０ｍＭ～２５０ｍＭの濃度で存在する。特定の実施形態では、ｔｒｉｓは、２０ｍＭ～１００ｍＭの濃度で存在する。特定の実施形態では、ｔｒｉｓは、３０ｍＭ～７０ｍＭの濃度で存在する。特定の実施形態では、ｔｒｉｓは、３０ｍＭ～５０ｍＭの濃度で存在する。特定の実施形態では、ｔｒｉｓは、１０ｍＭの濃度で存在する。特定の実施形態では、ｔｒｉｓは、５０ｍＭの濃度で存在する。特定の実施形態では、保存溶液は、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）をさらに含む。特定の実施形態では、ＢＨＴは、１～５００ｐｐｍの量で存在する。特定の実施形態では、ＢＨＴは、２０～２００ｐｐｍの量で存在する。特定の実施形態では、ＢＨＴは、２５～１００ｐｐｍの量で存在する。一部の実施形態では、本開示は、生体試料中のメチル化ＤＮＡ分子のメチル化パターンを保存する方法であって、生体試料を保存溶液で処置するステップを含み、保存溶液がメタノールおよびＢＨＴを含む、方法を提供する。特定のこのような実施形態では、ＢＨＴは、１～５００ｐｐｍの量で存在する。ある特定の実施形態では、ＢＨＴは、２０～２００ｐｐｍの量で存在する。ある特定の実施形態では、ＢＨＴは、２５～１００ｐｐｍの量で存在する。一部の実施形態では、メチル化パターンが室温で保存される。一部の実施形態では、メチル化パターンが少なくとも２週間保存される。一部の実施形態では、保存溶液中の生体試料のメチル化パターンは、保存前の生体試料におけるメチル化パターンと比較して、少なくとも６０％保存される。一部の実施形態では、保存溶液中の生体試料のメチル化パターンは、保存前の生体試料におけるメチル化パターンと比較して、少なくとも６５％保存される。一部の実施形態では、保存溶液中の生体試料のメチル化パターンは、保存前の生体試料におけるメチル化パターンと比較して、少なくとも７０％保存される。一部の実施形態では、保存溶液中の生体試料のメチル化パターンは、保存前の生体試料におけるメチル化パターンと比較して、少なくとも７５％保存される。一部の実施形態では、保存溶液中の生体試料のメチル化パターンは、保存前の生体試料におけるメチル化パターンと比較して、少なくとも８０％保存される。一部の実施形態では、保存溶液中の生体試料のメチル化パターンは、保存前の生体試料におけるメチル化パターンと比較して、少なくとも８５％保存される。一部の実施形態では、保存溶液中の生体試料のメチル化パターンは、保存前の生体試料におけるメチル化パターンと比較して、少なくとも９０％保存される。一部の実施形態では、保存溶液中の生体試料のメチル化パターンは、保存前の生体試料におけるメチル化パターンと比較して、少なくとも９５％保存される。一部の実施形態では、生体試料が保存溶液中に保存される。一部の実施形態では、試料がヒトの組織または体液に由来する。一部の実施形態では、試料は、胃腸管、気道消化管、気道、尿生殖器管、または体液のいずれかに由来する。特定のこのような実施形態では、体液は、血液、尿、痰、唾液、便、胆汁、膵液、鼻汁、涙、精液、膣分泌物、脳脊髄液、胸膜液、腹水、胃液、心膜液、汗、リンパ液、嚢胞液、膵嚢胞液、滑液、関節液、月経液、子宮内膜洗浄液、胸部吸込物、または羊水のうちのいずれかである。一部の実施形態では、試料は、食道、胃、結腸、小腸、膵臓、肝臓、口腔、中咽頭、気管、気管支樹、肺、または乳房のいずれかに由来する。一部の実施形態では、試料が食道試料である。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび１００％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された１０％から１００％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された１０～９５％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された１０～９０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された１５～９０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された２０～９０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された２５～９０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された３０～９０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された３０～８５％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された３０～８０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された３５～８０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された３５～７５％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された３５～７０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された３０～７０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された４０～７０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された４０～６５％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された４０～６０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された４０～５５％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された４５～５５％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された５０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび１００％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された１０％～１００％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された１０～９５％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された１０～９０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された１５～９０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された２０～９０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された２５～９０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された３０～９０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された３０～８５％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された３０～８０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された３５～８０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された３５～７５％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された３５～７０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された３０～７０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された４０～７０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された４０～６５％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された４０～６０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された４０～５５％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された４５～５５％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された５０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび１００％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された１０％～１００％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された１０～９５％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された１０～９０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された１５～９０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された２０～９０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された２５～９０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された３０～９０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された３０～８５％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された３０～８０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された３５～８０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された３５～７５％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された３５～７０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された３０～７０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された４０～７０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された４０～６５％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された４０～６０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された４０～５５％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された４５～５５％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された５０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液がｔｒｉｓおよび１００％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された１０％から１００％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された１０～９５％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された１０～９０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された１５～９０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された２０～９０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された２５～９０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された３０～９０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された３０～８５％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された３０～８



０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された３５～８０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された３５～７５％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された３５～７０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された３０～７０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された４０～７０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された４０～６５％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された４０～６０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された４０～５５％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された４５～５５％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された５０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび１００％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された１０％～１００％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された１０～９５％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された１０～９０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された１５～９０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された２０～９０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された２５～９０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された３０～９０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された３０～８５％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された３０～８０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された３５～８０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された３５～７５％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された３５～７０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された３０～７０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された４０～７０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された４０～６５％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された４０～６０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された４０～５５％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された４５～５５％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された５０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび１００％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された１０％～１００％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された１０～９５％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された１０～９０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された１５～９０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された２０～９０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された２５～９０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された３０～９０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された３０～８５％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された３０～８０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された３５～８０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された３５～７５％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された３５～７０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された３０～７０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された４０～７０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された４０～６５％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された４０～６０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された４０～５５％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された４５～５５％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された５０％のメタノールから本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび１００％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された１０％～１００％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された１０～９５％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された１０～９０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された１５～９０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された２０～９０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された２５～９０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された３０～９０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された３０～８５％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された３０～８０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された３５～８０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された３５～７５％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された３５～７０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された３０～７０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された４０～７０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された４０～６５％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された４０～６０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された４０～５５％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された４５～５５％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび水と混合された５０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび１００％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された１０％～１００％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された１０～９５％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された１０～９０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された１５～９０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された２０～９０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された２５～９０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された３０～９０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された３０～８５％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された３０～８０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された３５～８０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された３５～７５％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された３５～７０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された３０～７０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された４０～７０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された４０～６５％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された４０～６０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された４０～５５％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された４５～５５％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ＢＨＴおよび水と混合された５０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび１００％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された１０％～１００％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された１０～９５％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された１０～９０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された１５～９０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された２０～９０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された２５～９０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された３０～９０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された３０～８５％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された３０～８０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された３５～８０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された３５～７５％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された３５～７０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、



ＢＨＴおよび水と混合された３０～７０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された４０～７０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された４０～６５％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された４０～６０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された４０～５５％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された４５～５５％のメタノールからなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓ、ＢＨＴおよび水と混合された５０％のメタノールからなる。一部の実施形態では、メタノールは、過酸化物を含まないかまたは０．００１％未満もしくはそれに等しいレベルの過酸化物を含む。一部の実施形態では、水は、蒸留、または限外濾過、または逆浸透によって精製されている。一部の実施形態では、水がＤＮＡｓｅおよび／またはＲＮＡｓｅ活性を有さない。一部の実施形態では、本開示は、ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｓｈｉｅｌｄで処置および／または保存される生体試料のＤＮＡメチル化パターンを保存する方法を提供する。一部の実施形態では、ＤＮＡメチル化のパターンは、ビメンチン遺伝子の差次的にメチル化されたドメインまたはＣＣＮＡ１遺伝子の差次的にメチル化されたドメイン内でアッセイされる。一部の実施形態では、ビメンチンの差次的にメチル化されたドメインは、ｃｈｒ１０：１７，２７０，８３８－１７，２７１，７１７に対応する配列番号１～５、または配列番号１８のいずれか１つと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるヌクレオチド配列、またはその相補体および／もしくは断片を含む。一部の実施形態では、ビメンチンの差次的にメチル化されたドメインは、配列番号１～５のいずれか１つと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるヌクレオチド配列、その相補体、またはその断片を含む。一部の実施形態では、ＣＣＮＡ１の差次的にメチル化されたドメインは、配列番号６または７と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるヌクレオチド配列、その相補体、またはその断片を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡメチル化のパターンは、Ｕｐ１０、Ｕｐ３５－１および／またはＵｐ３５－２ヌクレオチド配列の差次的にメチル化されたドメイン内でアッセイされる。一部の実施形態では、Ｕｐ１０の差次的にメチル化されたドメインは、配列番号８～１１のいずれか１つと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるヌクレオチド配列、その相補体、またはその断片を含む。一部の実施形態では、Ｕｐ３５－１の差次的にメチル化されたドメインは、配列番号１２～１５のいずれか１つと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるヌクレオチド配列、その相補体、またはその断片を含む。一部の実施形態では、Ｕｐ３５－２の差次的にメチル化されたドメインは、配列番号１２～１３および１６～１７のいずれか１つと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるヌクレオチド配列、その相補体、またはその断片を含む。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列、相補体、または断片は、長さが少なくとも２０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ＤＮＡメチル化のパターンは、ビメンチン、ＣＣＮＡ１、ＦＥＲ１Ｌ４、ＶＡＶ３、ＤＯＣＫ１０、ＡＤＣＹ１、ＢＭＰ３、ＣＤ１Ｄ、ＥＬＭＯ１、ＥＬＯＶＬ２、ＬＲＲＣ４、ＮＤＲＧ４、ＳＦＭＢＴ２、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＴＳＰＹＬ５、ＺＮＦ５６８、ＺＮＦ５６９、ＺＮＦ６１０、ＺＮＦ６７１、ＺＮＦ６８２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＤＩＯ３、および／もしくはＨＵＮＫ遺伝子のヌクレオチド配列のいずれかと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるヌクレオチド配列、またはそのいずれかの断片および／もしくは相補体を含むＤＮＡ分子と関連する差次的にメチル化されたドメイン内でアッセイされる。一部の実施形態では、差次的にメチル化されたドメインは、遺伝子座標：
Figure 2023529314000001
Figure 2023529314000002
Figure 2023529314000003
 によって特定されるヌクレオチド配列のいずれかと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるヌクレオチド配列、その相補体、またはその断片を含むＤＮＡ分子と関連する。一部の実施形態では、ＡＤＣＹ１の差次的にメチル化されたドメインは、配列番号１９と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるヌクレオチド配列、その相補体、またはその断片を含む。一部の実施形態では、ＢＭＰ３の差次的にメチル化されたドメインは、配列番号２０もしくは２１と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるヌクレオチド配列、その相補体、またはその断片を含む。一部の実施形態では、ＣＤ１Ｄの差次的にメチル化されたドメインは、配列番号２２と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるヌクレオチド配列、その相補体、またはその断片を含む。一部の実施形態では、ＣＤＫＮ２Ａの差次的にメチル化されたドメインは、配列番号２３もしくは２４と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるヌクレオチド配列、その相補体、またはその断片を含む。一部の実施形態では、ＤＩＯ３の差次的にメチル化されたドメインは、配列番号２５と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるヌクレオチド配列、その相補体、またはその断片を含む。一部の実施形態では、ＤＯＣＫ１０の差次的にメチル化されたドメインは、配列番号２６と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるヌクレオチド配列、その相補体、またはその断片を含む。一部の実施形態では、ＥＬＭＯ１の差次的にメチル化されたドメインは、配列番号２７と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるヌクレオチド配列、その相補体、またはその断片を含む。一部の実施形態では、ＥＬＯＶ１２の差次的にメチル化されたドメインは、配列番号２８と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるヌクレオチド配列、その相補体、またはその断片を含む。一部の実施形態では、ＦＥＲ１Ｌ４の差次的にメチル化されたドメインは、配列番号２９と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるヌクレオチド配列、その相補体、またはその断片を含む。一部の実施形態では、ＨＵＮＫの差次的にメチル化されたドメインは、配列番号３０と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるヌクレオチド配列、その相補体、またはその断片を含む。一部の実施形態では、ＬＲＲＣ４の差次的にメチル化されたドメインは、配列番号３１と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるヌクレオチド配列、その相補体、またはその断片を含む。一部の実施形態では、ＮＤＲＧ４の差次的にメチル化されたドメインは、配列番号３２と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるヌクレオチド配列、その相補体、またはその断片を含む。一部の実施形態では、ＳＦＭＢＴ２の差次的にメチル化されたドメインは、配列番号３３、３４、３５もしくは３６のいずれか一つと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるヌクレオチド配列、その相補体、またはその断片を含む。一部の実施形態では、ＳＴ８Ｓ１Ａ１の差次的にメチル化されたドメインは、配列番号３７と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるヌクレオチド配列、その相補体、またはその断片を含む。一部の実施形態では、ＴＳＰＹＬ５の差次的にメチル化されたドメインは、配列番号３８と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるヌクレオチド配列、その相補体、またはその断片を含む。一部の実施形態では、ＶＡＶ３の差次的にメチル化されたドメインは、配列番号３９と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるヌクレオチド配列、その相補体、またはその断片を含む。一部の実施形態では、ＺＮＦ５６８の差次的にメチル化されたドメインは、配列番号４０もしくは４１と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるヌクレオチド配列、その相補体、またはその断片を含む。一部の実施形態では、ＺＮＦ５６９の差次的にメチル化されたドメインは、配列番号４２と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるヌクレオチド配列、その相補体、またはその断片を含む。一部の実施形態では、ＺＮＦ６１０の差次的にメチル化されたドメインは、配列番号４３と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるヌクレオチド配列、その相補体、またはその断片を含む。一部の実施形態では、ＺＮＦ６７１の差次的にメチル化されたドメインは、配列番号４４と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるヌクレオチド配列、その相補体、またはその断片を含む。一部の実施形態では、ＺＮＦ６８２の差次的にメチル化されたドメインは、配列番号４５と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるヌクレオチド配列、その相補体、またはその断片を含む。一部の実施形態では、そのようなヌクレオチド配列、相補体、またはそのような断片は、長さが少なくとも２０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ＤＮＡメチル化のパターンは、ＤＮＡの、シトシン塩基をウラシルに変換する亜硫酸水素塩化合物による処理を含むステップによってアッセイされる。一部の実施形態では、メチル化ＤＮＡパターンは、室温（２３℃）で保存された場合に、組成物中で少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、１０時間、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、２週間、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１年、１８カ月または２年の間保存される。一部の実施形態では、メチル化ＤＮＡパターンは、４℃で保存された場合に、組成物中で少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、１０時間、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、２週間、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１年、１８カ月または２年の間保存される。一部の実施形態では、メチル化ＤＮＡパターンは、－３０℃から５０℃の間の範囲の温度で、組成物中で少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、１０時間、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、２週間、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１年、１８カ月または２年の間保存される。一部の実施形態では、メチル化ＤＮＡパターンは、－３０℃から３０℃の間の範囲の温度で、組成物中で少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、１０時間、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、２週間、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１年、１８カ月または２年の間保存される。一部の実施形態では、メチル化ＤＮＡパターンは、－２０℃から５０℃の間の範囲の温度で、組成物中で少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、１０時間、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、２週間、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１年、１８カ月または２年の間保存される。一部の実施形態では、メチル化ＤＮＡパターンは、－２０℃から３０℃の間の範囲の温度で、組成物中で少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、１０時間、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、２週間、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１年、１８カ月または２年の間



保存される。一部の実施形態では、メチル化ＤＮＡパターンは、－１０℃から３０℃の間の範囲の温度で、組成物中で少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、１０時間、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、２週間、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１年、１８カ月または２年の間保存される。
本発明は、ＤＮＡメチル化アッセイの正確さを増加させる方法であって、対象から試料を得るステップと；試料を保存溶液（例えば、本明細書に開示された保存溶液）で処置するステップと；試料をアッセイして目的の核酸配列におけるＤＮＡメチル化パターンを決定するステップとを含み、保存溶液による処置がメチル化アッセイの正確さを増加させる、方法をさらに提供する。前述の方法の特定のこのような実施形態では、誤診の割合が低減される。ある特定の実施形態では、試料は食道試料である。ある特定のこのような実施形態では、試料は、食道を、細胞ブラシまたはバルーンと接触させることにより得られる。ある特定の実施形態では、目的の核酸配列は、ビメンチン遺伝子またはＣＣＮＡ１遺伝子、またはその断片である。
図１：実験Ｄ、Ｅ、およびＦからの表示した保存剤中で固定された試料から回収したＤＮＡ量。
図２：実験Ｄからの様々な緩衝剤中で固定された細胞におけるＶＩＭメチル化レベルアッセイの結果。「ＶＩＭ」はビメンチンに相当する。
図３：実験Ｄからの様々な緩衝剤中で固定された細胞におけるＣＣＮＡ１メチル化レベルアッセイの結果。
図４：実験Ｅからの様々な緩衝剤中で固定された細胞におけるＶＩＭメチル化レベルアッセイの結果。「ＶＩＭ」はビメンチンに相当する。
図５：実験Ｅからの様々な緩衝剤中で固定された細胞におけるＣＣＮＡ１メチル化レベルアッセイの結果。
図６：実験Ｆからの様々な緩衝剤中で固定された細胞におけるＶＩＭメチル化レベルアッセイの結果。「ＶＩＭ」はビメンチンに相当する。
図７：実験Ｆからの様々な緩衝剤中で固定された細胞におけるＣＣＮＡ１メチル化レベルアッセイの結果。
図８：実験Ｄ、Ｅ、およびＦからの様々な緩衝剤中で固定された細胞におけるＶＩＭメチル化レベルアッセイの結果。「ＶＩＭ」はビメンチンに相当する。
図９：実験Ｄ、Ｅ、およびＦからの様々な緩衝剤中で固定された細胞におけるＣＣＮＡ１メチル化レベルアッセイの結果。
図１０：実験ＥおよびＦからの様々な緩衝剤中で固定された細胞におけるＶＩＭメチル化レベルアッセイの結果。「ＶＩＭ」はビメンチンに相当する。
図１１：実験ＥおよびＦからの様々な緩衝剤中で固定された細胞におけるＣＣＮＡ１メチル化レベルアッセイの結果。
図１２：実験Ｇからの表示した保存剤中で固定された試料から回収したＤＮＡ量。
図１３：実験Ｈからの表示した保存剤中で固定された試料から回収したＤＮＡ量。
図１４：０日間対３日間実験Ｉからの表示した保存剤中で固定された試料から回収したＤＮＡ量。
図１５：実験Ａ～Ｉからの表示した保存剤中で固定された試料から回収した正規化したＤＮＡ量。
図１６：実験Ｇにおいてライブラリーを配列決定した後に得られたＶＩＭ遺伝子座に対して整列させたリードの合計。「ＶＩＭ」はビメンチンに相当する。
図１７：実験Ｇにおいてライブラリーを配列決定した後に得られたＣＣＮＡ１遺伝子座に対して整列させたリードの合計。
図１８：実験Ｇからの様々な緩衝剤中で固定された細胞におけるＶＩＭメチル化レベルアッセイの結果。「ＶＩＭ」はビメンチンに相当する。
図１９：実験Ｇからの様々な緩衝剤中で固定された細胞におけるＣＣＮＡ１メチル化レベルアッセイの結果。
図２０：実験Ｈにおいてライブラリーを配列決定した後に得られたＶＩＭ遺伝子座に対して整列させたリードの合計。「ＶＩＭ」はビメンチンに相当する。
図２１：実験Ｈにおいてライブラリーを配列決定した後に得られたＣＣＮＡ１遺伝子座に対して整列させたリードの合計。
図２２：実験Ｈからの様々な緩衝剤中で固定された細胞におけるＶＩＭメチル化レベルアッセイの結果。「ＶＩＭ」はビメンチンに相当する。
図２３：実験Ｈからの様々な緩衝剤中で固定された細胞におけるＣＣＮＡ１メチル化レベルアッセイの結果。
図２４：実験Ｈからの反復された５０％メタノール試料で固定された細胞におけるＣＣＮＡ１メチル化レベルアッセイの結果。
図２５：実験Ｉにおいてライブラリーを配列決定した後に得られたＶＩＭ遺伝子座に対して整列させたリードの合計。「ＶＩＭ」はビメンチンに相当する。
図２６：実験Ｉにおいてライブラリーを配列決定した後に得られたＣＣＮＡ１遺伝子座に対して整列させたリードの合計。
図２７：実験Ｊからの表示した保存剤中で固定された試料から回収したＤＮＡ量。
図２８：実験Ｋからの表示した保存剤中で固定された試料から回収したＤＮＡ量。
図２９：実験Ｊにおいてライブラリーを配列決定した後に得られたＶＩＭ遺伝子座に対して整列させたリードの合計。「ＶＩＭ」はビメンチンに相当する。
図３０：実験Ｊにおいてライブラリーを配列決定した後に得られたＣＣＮＡ１遺伝子座に対して整列させたリードの合計。
図３１：実験Ｊからの様々な緩衝剤中で固定された細胞におけるＶＩＭメチル化レベルアッセイの結果。「ＶＩＭ」はビメンチンに相当する。
図３２：実験Ｊからの様々な緩衝剤中で固定された細胞におけるＣＣＮＡ１メチル化レベルアッセイの結果。
図３３：実験Ｋにおいてライブラリーを配列決定した後に得られたＶＩＭ遺伝子座に対して整列させたリードの合計。「ＶＩＭ」はビメンチンに相当する。
図３４：実験Ｋにおいてライブラリーを配列決定した後に得られたＣＣＮＡ１遺伝子座に対して整列させたリードの合計。
図３５：実験Ｋからの様々な緩衝剤中で固定された細胞におけるＶＩＭメチル化レベルアッセイの結果。「ＶＩＭ」はビメンチンに相当する。
図３６：実験Ｋからの様々な緩衝剤中で固定された細胞におけるＣＣＮＡ１メチル化レベルアッセイの結果。
図３７：実験Ｌからの表示した保存剤中で固定された試料から回収したＤＮＡ量。
図３８：実験Ｌにおいてライブラリーを配列決定した後に得られたＶＩＭ遺伝子座に対して整列させたリードの合計。「ＶＩＭ」はビメンチンに相当する。
図３９：実験Ｌにおいてライブラリーを配列決定した後に得られたＣＣＮＡ１遺伝子座に対して整列させたリードの合計。
図４０：実験Ｌからの様々な緩衝剤中で固定された細胞におけるＶＩＭメチル化レベルアッセイの結果。「ＶＩＭ」はビメンチンに相当する。
図４１：実験Ｌからの様々な緩衝剤中で固定された細胞におけるＣＣＮＡ１メチル化レベルアッセイの結果。
発明の詳細な説明
一般に、新生物は、染色体不安定性、マイクロサテライト不安定性、およびＣｐＧアイランドメチル化形質（ＣＩＭＰ）と呼ばれる少なくとも３つの異なる経路のうちの１つを通じて発症する可能性がある。一部の重複はあるが、これらの経路は幾分異なる生物学的挙動を呈する傾向がある。腫瘍または異形成発症の経路、関与する標的遺伝子、および遺伝子不安定性の根底にある機構を理解することにより、異なるタイプの新生物または異形成を検出し処置する戦略を実行することが可能である。
ある特定の標的遺伝子は、その標的遺伝子の５’隣接またはプロモーター領域でのＣｐＧアイランドの差次的メチル化によりサイレンシングまたは不活化されることがある。ＣｐＧアイランドはＤＮＡ配列中のシトシン－グアノシン残基のクラスターであり、この残基は、本発明者らのゲノム中の約半分の遺伝子の５’隣接領域またはプロモーター領域で顕著に表される。本開示は、ある特定の保存溶液が、他の溶液と比較して試料中のＤＮＡメチル化パターンを驚くほどに保存するという認識に少なくとも部分的に基づく。
Ａ．定義
便宜上、明細書、実施例、および添付されている特許請求の範囲で用いられるある特定の用語がここに集められている。他に定義されていなければ、本明細書で使用される専門用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。
本明細書に記載されている方法および材料に類似するかまたは等価である方法および材料を本発明の実行または試験において使用することが可能であるが、適切な方法および材料は下に記載されている。材料、方法および実施例は説明的なものにすぎず、限定的であることを意図していない。本明細書で言及される公報、特許および他の文書はすべて参照によりその全体が組み込まれる。
本明細書に記載されている本発明のそれぞれの実施形態は、単独でとってもよく、本発明の１つまたは複数の他の実施形態と組み合わせてとってもよい。
本明細書全体を通じて、単語「含む（comprise）」または「含む（comprises）」もしくは「含む（comprising）」などの変形は、述べられている整数または整数の群を含むが、他のいかなる整数または整数の群も排除しないことを意味すると理解される。
冠詞「１つの（a）」および「１つの（an）」は、本明細書では、冠詞の文法的目的語の１つまたは１つよりも多く（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。例として、「１つの要素（an element）」とは１つの要素または１つよりも多い要素を意味する。
用語「約」または「およそ」は、当業者によって決定された特定の値の許容される誤差範囲内（その値が測定または決定される方法に部分的に依存することになる）、すなわち測定系の限界を意味する。例えば、「約」は、当技術分野で実践されるごとに、１または１を超える標準偏差以内を意味し得る。代わりに、「約」は、所与の値を最大２０％、最大１５％、最大１０％、最大５％、もしくは最大１％を超えるかまたはそれを下回る範囲を意味し得る。
用語「アデノーマ」は、本明細書では、上皮組織の任意の前がん性新生物または良性腫瘍、例えば、胃腸管、膵臓、および／または膀胱の前がん性新生物を記述するために使用される。
本明細書の用語「血液由来画分」とは、全血の成分（単数または複数）を指す。全血は液体部分（すなわち、血漿）および固体部分（すなわち、血液細胞）を含む。血液の液体および固体部分はそれぞれ複数の成分、例えば、血漿中の異なるタンパク質または固体部分中の異なる細胞型で構成されている。これらの成分の１つまたはこれらの成分のいずれかの混合物は、そのような画分が全血で見出される１つまたは複数の成分を失っている限り、血液由来画分である。
用語「食道」は、口腔の背部から、縦隔の後部を下に通過して横隔膜を通って胃にまでまたがる消化器系の上部を包含することが意図されている。
用語「食道がん」は、本明細書では、食道の任意のがん性新生物を指すために使用される。
本明細書で使用される「バレット食道」とは、食道の下部の細胞の異常な変化（化生）を指す。バレットは食道での腸上皮化生の所見により特徴付けられる。
食道の「擦過物」は、本明細書で言及されるように、当技術分野で公知のあらゆる手段を使用して得ることができる。一部の実施形態では、擦過物は、食道を、ブラシ、細胞ブラシ、スポンジ、バルーン、または食道と接触して食道試料を得るあらゆるその他のデバイスもしくは物質と接触させることにより得られる。
「細胞」、「宿主細胞」または「組換え宿主細胞」は、本明細書では互換的に使用される用語である。このような用語は、特定の対象細胞に加えて、そのような細胞の後代または生じ得る後代も指すと理解される。突然変異または環境の影響のためにある特定の改変が次の世代で起こることがあるので、そのような後代は、実際には親細胞と同一ではない場合があるが、それでも本明細書で使用される用語の範囲内に含まれる。
用語「化合物」、「試験化合物」、「薬剤」、および「分子」は、本明細書では互換的に使用され、ペプチド、核酸、炭水化物、小有機分子、天然産物抽出ライブラリー、および任意の他の分子（化学物質、金属、および有機金属化合物を含むがこれらに限定されない）を含むがこれらに限定されないことが意図されている。
本明細書の用語「化合物変換ＤＮＡ」は、ＤＮＡ中の非メチル化Ｃ塩基を異なるヌクレオチド塩基に変換する化学化合物で処理されているまたはこれと反応させているＤＮＡを指す。例えば、１つのそのような化合物は亜硫酸水素ナトリウムであり、これは非メチル化ＣをＵに変換する。変換感受性シトシンを含有するＤＮＡが亜硫酸水素ナトリウムで処理される場合、化合物変換ＤＮＡはＣに代わってＵを含有することになる。亜硫酸水素ナトリウムで処理されるＤＮＡがメチルシトシンのみを含有する場合、化合物変換ＤＮＡはメチルシトシンに代わってウラシルを含有することはない。
本明細書で使用される用語「脱メチル化剤」とは、薬剤で処理するとメチル化により発現停止されていた標的遺伝子の活性および／または遺伝子発現を回復させる薬剤を指す。そのような薬剤の例は、５－アザシチジンおよび５－アザ－２’－デオキシシチジンを限定せずに含む。
用語「検出」は、本明細書では、生体試料中のマーカー、またはマーカーの変化（例えば、マーカーのメチル化状態の変化などの）を観察する任意のプロセスを指すために使用され、マーカーまたはマーカーの変化が実際に検出されるかどうかは関係がない。他の実施形態では、たとえマーカーが存在しないまたは感度のレベルより下であると判定されようとも、マーカーまたはマーカーの変化について試料を探索する行為が「検出」である。検出は定量的、半定量的または非定量的観察でもよい。
用語「差次的にメチル化されたヌクレオチド配列」または「差次的にメチル化されたドメイン」は、がん組織もしくは細胞株ではメチル化されているが正常組織もしくは細胞株ではメチル化されていないことが分かっているゲノム遺伝子座／標的遺伝子の領域を指すか、または正常組織もしくは細胞株においてメチル化されているよりもがん組織もしくは細胞株においてメチル化されている程度が低いことが分かっているゲノム遺伝子座／標的遺伝子の領域を指す。
本明細書で使用される用語「新生物」とは、組織の異常な成長を指す。本明細書で使用される場合、用語「新生物」はがん性および非がん性腫瘍、ならびにバレット食道（本明細書では化生と呼ばれる場合もある）および異形成のあるバレット食道を指すために使用してもよい。一部の実施形態では、異形成のあるバレット食道は高悪性度の異形成のあるバレット食道である。一部の実施形態では、異形成のあるバレット食道は低悪性度の異形成のあるバレット食道である。一部の実施形態では、新生物はがん（例えば、食道腺癌）である。
「胃腸新生物」とは、上部および下部胃腸管の新生物を指す。当技術分野で一般に理解されるように、上部胃腸管は食道、胃、および十二指腸を含み、下部胃腸管は小腸の残りの部分および大腸のすべてを含む。
用語「健康な」、「正常な」、および「非新生物の」は、本明細書では互換的に使用されて、新生物などの疾患状態を欠く（少なくとも検出限界まで）対象または特定の細胞もしくは組織を指す。
「相同性」または「同一性」または「類似性」とは、２つのペプチド間のまたは２つの核酸分子間の配列類似性を指す。相同性および同一性はそれぞれ、比較を目的に整列させてもよいそれぞれの配列での位置を比較することにより判定することが可能である。比較される配列中の等価の位置が同じ塩基またはアミノ酸により占められている場合、分子はその位置で同一であり、等価な部位が同じまたは類似するアミノ酸残基（例えば、立体的および／または電子的性質が類似している）により占められる場合、分子はその位置で相同である（類似している）と呼ぶことが可能である。相同性／類似性または同一性の百分率としての表現とは、比較される配列により共有される位置での同一のまたは類似するアミノ酸の数の関数を指す。「関係のない」または「非相同性」である配列は、一部の実施形態では、本発明の配列と４０％未満の同一性、特定の実施形態では、２５％未満の同一性を共有する。２つの配列を比較する際に、残基（アミノ酸または核酸）が存在しないことまたは余分な残基が存在することも同一性および相同性／類似性を減らす。
用語「相同性」は、類似する機能またはモチーフを有する遺伝子またはタンパク質を同定するために使用される配列類似性の数学的基礎の比較を記述する。本発明の核酸およびタンパク質配列は、公表されているデータベースに対して検索を実施して、例えば、他のファミリーのメンバー、関連する配列または相同体を同定するための「クエリー配列」として使用してもよい。そのような検索は、Altschulら、（１９９０年）J Mol. Biol.２１５巻：４０３～１０頁のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実施することが可能である。本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得るために、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索をＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて実施することが可能である。本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るために、ＢＬＡＳＴタンパク質検索をＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実施することが可能である。比較目的でギャップドアライメントを得るため、Altschulら、（１９９７年）Nucleic Acids Res.２５巻（１７号）：３３８９～３４０２頁に記載される通りにギャップドＢＬＡＳＴを利用することが可能である。ＢＬＡＳＴおよびギャップドＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを使用することが可能である。www.ncbi.nlm.nih.gov.を参照されたい。
本明細書で使用される場合、「同一性」は、配列マッチングを最大にするように、すなわち、ギャップおよび挿入を考慮に入れて配列を整列させた場合、２つまたはそれよりも多い配列において対応する位置での同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の百分率を意味する。同一性は、（Computational Molecular Biology、Lesk, A. M.編、Oxford University Press、New York、１９８８年；Biocomputing: Informatics and Genome Projects、Smith, D. W.編、Academic Press、New York、１９９３年；Computer Analysis of Sequence Data、第Ｉ部、Griffin, A. M.、およびGriffin, H. G.編、Humana Press、New Jersey、１９９４年；Sequence Analysis in Molecular Biology、von Heinje, G.、Academic Press、１９８７年；ならびにSequence Analysis Primer、Gribskov, M.およびDevereux, J.編、M Stockton Press、New York、１９９１年；ならびにCarillo, H.、およびLipman, D.、SIAM J. Applied Math.、４８巻：１０７３頁、１９８８年）に記載される方法を含むがこれらに限定されない公知の方法により容易に計算することが可能である。同一性を判定する方法は、試験されている配列間に最大の合致を与えるように設計されている。さらに、同一性を判定する方法は、公に利用可能なコンピュータプログラムに体系化されている。２つの配列間の同一性を判定するコンピュータプログラム法は、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux, J.ら、Nucleic Acids Research １２巻（１号）：３８７頁（１９８４年））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Altschul, S. F.ら、J. Molec. Biol. ２１５巻：４０３～４１０頁（１９９０年）およびAltschulら、Nuc. Acids Res.２５巻：３３８９～３４０２頁（１９９７年））を含むがこれらに限定されない。ＢＬＡＳＴ ＸプログラムはＮＣＢＩおよび他の出典から公に利用可能である（BLAST Manual、Altschul, S.ら、NCBI NLM NIH Bethesda、Md.２０８９４；Altschul, S.ら、J. Mol. Biol. ２１５巻：４０３～４１０頁（１９９０年））。周知のスミスウォターマンアルゴリズムを使用して同一性を判定してもよい。
用語「含む（including）」は、語句「含むが限定されない」を意味するように本明細書では使用され、この語句と互換的に使用される。
ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸に関して本明細書で使用される用語「単離された」とは、天然には存在しない形態の分子を指す。さらに、「単離された核酸」は、断片として天然には存在しておらず、天然の状態で見出されないと予想される核酸断片を含むことが意図されている。
本明細書の用語「メチル化特異的ＰＣＲ」（「ＭＳＰ」）とは、化合物変換鋳型配列の増幅が実施されるポリメラーゼ連鎖反応を指す。２セットのプライマーがＭＳＰにおいて使用するために設計される。それぞれのセットのプライマーはフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む。一部の実施形態では、１セットのプライマーは、メチル化特異的プライマーと呼ばれ、ＤＮＡ内のＣｐＧジヌクレオチドのＣ塩基がメチル化されていれば化合物変換鋳型配列を増幅させることになる。一部の実施形態では、別のセットのプライマーは、非メチル化特異的プライマーまたは非メチル化配列のためのプライマーなどと呼ばれ、ＤＮＡ内のＣｐＧジヌクレオチドのＣ塩基がメチル化されていなければ化合物変換鋳型配列を増幅させることになる。
本明細書で使用される場合、用語「核酸」とは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、および、必要に応じて、リボ核酸（ＲＮＡ）などのポリヌクレオチドを指す。この用語は、等価物として、ヌクレオチドアナログから作られるＲＮＡまたはＤＮＡのアナログ、ならびに記載されている実施形態に適用可能である場合は、一本鎖（センスまたはアンチセンスなどの）および二本鎖ポリヌクレオチドを含むとも理解されるべきである。
２つのＤＮＡ領域間の関係を記述する場合の「作動可能に連結している」とは、２つのＤＮＡ領域が互いに機能的に関係していることを意味するだけである。例えば、プロモーターまたは他の転写調節配列は、それがコード配列の転写を制御している場合にはコード配列に作動可能に連結している。
用語「または」は、本明細書では、文脈が他の方法で明白に示していなければ、用語「および／または」を意味するように使用され、この用語と互換的に使用される。
用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、本明細書では互換的に使用される。
「試料」は、分子マーカーもしくは、例えば、メチル化状態などの分子マーカーの変化の検出のために得たもしくは調製した任意の材料、または分子マーカーもしくは分子マーカーの変化の検出を目的に検出試薬もしくは検出デバイスと接触させる任意の材料を含む。
本明細書で使用される場合、「試料を得ること」は、アッセイを受ける対象から試料を直接回収すること、または（例えば、本明細書中に記載される保存溶液のいずれかにおいて）保存され後になってアッセイを受ける対象から試料を直接回収することを含む。代わりに、試料は第２当事者を介して得てもよい。すなわち、試料は、その試料を回収した、または他の方法でその試料を得た別の個人から、例えば、発送を介して得てもよい。
「保存溶液」は、一定の期間を通してＤＮＡ分子におけるメチル化パターンを保存する任意の溶液である。保存溶液は、「保存剤」と本明細書において称されてもよい。
「対象」とは、目的の任意の生物、一般的には、マウスなどの哺乳動物対象、特定の実施形態では、ヒト対象である。
本明細書で使用される場合、用語「特異的にハイブリダイズする」とは、一部の実施形態では、本発明の核酸プローブ／プライマーが、標的遺伝子以外の細胞内核酸（例えば、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡ）への１５％未満、１０％未満、または５％未満のバックグランドハイブリダイゼーションを有するように、標的配列の少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０もしくは１００連続するヌクレオチド、またはそれと相補的な配列、またはその天然に存在する突然変異体にハイブリダイズする能力を指す。種々のハイブリダイゼーション条件を使用して特定のハイブリダイゼーションを検出してもよく、厳密性は主にハイブリダイゼーションアッセイの洗浄段階により判定される。一般に、高温および低塩分濃度は高厳密性を与え、低温および高塩分濃度は低厳密性を与える。低厳密性ハイブリダイゼーションは、例えば、５０℃、約２．０×ＳＳＣでの洗浄により達成され、高厳密性は５０℃、約０．２×ＳＳＣで達成される。厳密性についてのさらなる説明は本明細書中で提供される。
ポリペプチドに適用される場合、用語「実質的な配列同一性」とは、２つのペプチド配列が、例えば、デフォルトギャップを使用するプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴにより最適に整列される場合、少なくとも９０パーセント配列同一性、一部の実施形態では、少なくとも９５パーセント配列同一性、または少なくとも９９パーセント配列同一性またはそれよりも多くを共有することを意味する。一部の実施形態では、同一ではない残基位置が保存的アミノ酸置換により異なる。例えば、電荷または極性などの類似する化学的特性を有するアミノ酸の置換はタンパク質の特性に影響を及ぼす可能性はない。例は、アスパラギンの代わりのグルタミンまたはアスパラギン酸の代わりのグルタミン酸を含む。
本明細書で使用される用語「Ｕｐ１０」とは、配列番号８の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むヌクレオチド配列を指す。本明細書で使用される用語「Ｕｐ１０」とは、配列番号９の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むヌクレオチド配列も指す。本明細書で使用される用語「Ｕｐ１０」とは、配列番号１０の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むヌクレオチド配列も指す。本明細書で使用される用語「Ｕｐ１０」とは、配列番号１１の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むヌクレオチド配列も指す。
本明細書で使用される用語「Ｕｐ３５－１」とは、配列番号１２の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むヌクレオチド配列を指す。本明細書で使用される用語「Ｕｐ３５－１」とは、配列番号１３の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むヌクレオチド配列も指す。本明細書で使用される用語「Ｕｐ３５－１」とは、配列番号１４の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むヌクレオチド配列も指す。本明細書で使用される用語「Ｕｐ３５－１」とは、配列番号１５の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むヌクレオチド配列も指す。
本明細書で使用される用語「Ｕｐ３５－２」とは、配列番号１２の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むヌクレオチド配列を指す。本明細書で使用される用語「Ｕｐ３５－２」とは、配列番号１３の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むヌクレオチド配列も指す。本明細書で使用される用語「Ｕｐ３５－２」とは、配列番号１６の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むヌクレオチド配列も指す。本明細書で使用される用語「Ｕｐ３５－２」とは、配列番号１７の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むヌクレオチド配列も指す。
Ｂ．保存溶液
一部の実施形態では、本開示は、細胞試料中のＤＮＡメチル化パターンを保存するための保存溶液を提供する。
一部の実施形態では、溶液は有機溶媒を含む。一部の実施形態では、有機溶媒は、メタノール、エタノール、イソプロパノール、またはクロロホルムのいずれか１つまたはその組合せである。一部の実施形態では、保存溶液はメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液はエタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液はイソプロパノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液はクロロホルムを含む。一部の実施形態では、保存溶液は水で希釈される。一部の実施形態では、保存溶液は、本明細書中に開示される有機溶媒のいずれかおよび水を含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９７％の有機溶媒を含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％または３％未満の水を含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに９５％の有機溶媒および５％の水を含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに約９０％の有機溶媒および約１０％の水を含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに約８５％の有機溶媒および約１５％の水を含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに約８０％の有機溶媒および約２０％の水を含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに約７５％の有機溶媒および約２５％の水を含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに約７０％の有機溶媒および３０％の水を含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに約６５％の有機溶媒および約３５％の水を含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに約６０％の有機溶媒および約４０％の水を含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに約５５％の有機溶媒および約４５％の水を含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに約５０％の有機溶媒および約５０％の水を含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに約４５％の有機溶媒および約５５％の水を含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに約４０％の有機溶媒および約６０％の水を含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに約３５％の有機溶媒および約６５％の水を含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに約３０％の有機溶媒および約７０％の水を含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに約２５％の有機溶媒および約７５％の水を含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに約２０％の有機溶媒および約８０％の水を含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに約１５％の有機溶媒および約８５％の水を含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに約１０％の有機溶媒および約９０％の水を含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに９５％の有機溶媒および５％の水から本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに約９０％の有機溶媒および約１０％の水から本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに約８５％の有機溶媒および約１５％の水から本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに約８０％の有機溶媒および約２０％の水から本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに約７５％の有機溶媒および約２５％の水から本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに約７０％の有機溶媒および３０％の水から本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに約６５％の有機溶媒および約３５％の水から本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに約６０％の有機溶媒および約４０％の水から本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに約５５％の有機溶媒および約４５％の水から本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに約５０％の有機溶媒および約５０％の水から本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに約４５％の有機溶媒および約５５％の水から本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに約４０％の有機溶媒および約６０％の水から本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに約３５％の有機溶媒および約６５％の水から本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに約３０％の有機溶媒および約７０％の水から本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに約２５％の有機溶媒および約７５％の水から本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに約２０％の有機溶媒および約８０％の水から本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに約１５％の有機溶媒および約８５％の水から本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに約１０％の有機溶媒および約９０％の水から本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに９５％の有機溶媒および５％の水からなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに約９０％の有機溶媒および約１０％の水からなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに約８５％の有機溶媒および約１５％の水からなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに約８０％の有機溶媒および約２０％の水からなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに約７５％の有機溶媒および約２５％の水からなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに約７０％の有機溶媒および３０％の水からなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに約６５％の有機溶媒および約３５％の水からなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに約６０％の有機溶媒および約４０％の水からなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに約５５％の有機溶媒および約４５％の水からなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに約５０％の有機溶媒および約５０％の水からなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに約４５％の有機溶媒および約５５％の水からなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに約４０％の有機溶媒および約６０％の水からなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに約３５％の有機溶媒および約６５％の水からなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに約３０％の有機溶媒および約７０％の水からなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに約２５％の有機溶媒および約７５％の水からなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに約２０％の有機溶媒および約８０％の水からなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに約１５％の有機溶媒および約８５％の水からなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに約１０％の有機溶媒および約９０％の水からなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに１０～９０％の有機溶媒を含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに２０～８０％の有機溶媒を含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに２５～７５％の有機溶媒を含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに３０～７０％の有機溶媒を含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに３５～６５％の有機溶媒を含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに４０～６０％の有機溶媒を含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに４５～５５％の有機溶媒を含む。前述のある特定の実施形態では、保存溶液は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含まない。
一部の実施形態では、保存溶液はｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびにメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液はメタノールベースの緩衝剤である。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに１００％のメタノールを含む。一部の実施形態では、メタノールは過酸化物を含まない。一部の実施形態では、メタノールはＰｅｒｏｘｉｄｅ－Ｆｒｅｅ／Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｍｅｔｈａｎｏｌ（Ｆｉｓｈｅｒ ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ）である。一部の実施形態では、メタノールは超純水メタノールである。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴと、メタノールと別の液体との混合物を含む。一部の実施形態では、他の液体は水である。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９７％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、または３％未満の水を含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、９５％のメタノールおよび５％の水を含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、約９０％のメタノールおよび約１０％の水を含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、約８５％のメタノールおよび約１５％の水を含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、約８０％のメタノールおよび約２０％の水を含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、約７５％のメタノールおよび約２５％の水を含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、約７０％のメタノールおよび３０％の水を含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、約６５％のメタノールおよび約３５％の水を含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、約６０％のメタノールおよび約４０％の水を含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、約５５％のメタノールおよび約４５％の水を含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、約５０％のメタノールおよび約５０％の水を含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、約４５％のメタノールおよび約５５％の水を含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、約４０％のメタノールおよび約６０％の水を含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、約３５％のメタノールおよび約６５％の水を含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、約３０％のメタノールおよび約７０％の水を含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、約２５％のメタノールおよび約７５％の水を含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、約２０％のメタノールおよび約８０％の水を含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、約１５％のメタノールおよび約８５％の水を含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、約１０％のメタノールおよび約９０％の水を含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、９５％のメタノールおよび５％の水から本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、約９０％のメタノールおよび約１０％の水から本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、約８５％のメタノールおよび約１５％の水から本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、約８０％のメタノールおよび約２０％の水から本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、約７５％のメタノールおよび約２５％の水から本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、約７０％のメタノールおよび３０％の水から本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、約６５％のメタノールおよび約３５％の水から本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、約６０％のメタノールおよび約４０％の水から本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、約５５％のメタノールおよび約４５％の水から本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、約５０％のメタノールおよび約５０％の水から本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、約４５％のメタノールおよび約５５％の水から本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、約４０％のメタノールおよび約６０％の水から本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、約３５％のメタノールおよび約６５％の水から本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、約３０％のメタノールおよび約７０％の水から本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、約２５％のメタノールおよび約７５％の水から本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、約２０％のメタノールおよび約８０％の水から本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、約１５％のメタノールおよび約８５％の水から本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、約１０％のメタノールおよび約９０％の水から本質的になる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、９５％のメタノールおよび５％の水からなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、約９０％のメタノールおよび約１０％の水からなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、約８５％のメタノールおよび約１５％の水からなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、約８０％のメタノールおよび約２０％の水からなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、約７５％のメタノールおよび約２５％の水からなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、約７０％のメタノールおよび３０％の水からなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、約６５％のメタノールおよび約３５％の水からなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、約６０％のメタノールおよび約４０％の水からなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、約５５％のメタノールおよび約４５％の水からなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、約５０％のメタノールおよび約５０％の水からなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、約４５％のメタノールおよび約５５％の水からなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、約４０％のメタノールおよび約６０％の水からなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、約３５％のメタノールおよび約６５％の水からなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、約３０％のメタノールおよび約７０％の水からなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、約２５％のメタノールおよび約７５％の水からなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、約２０％のメタノールおよび約８０％の水からなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、約１５％のメタノールおよび約８５％の水からなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、約１０％のメタノールおよび約９０％の水からなる。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに１０～９０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに２０～８０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに２５～７５％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに３０～７０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに３５～６５％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに４０～６０％のメタノールを含む。一部の実施形態では、保存溶液は、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴ、ならびに４５～５５％のメタノールを含む。一部の実施形態では、水は蒸留によって精製されている。一部の実施形態では、水は限外濾過によって精製されている。一部の実施形態では、水は逆浸透によって精製されている。一部の実施形態では、水はＤＮａｓｅおよび／またはＤＮａｓｅ活性を有さない。一部の実施形態では、水はＲＮａｓｅおよび／またはＲＮａｓｅ活性を有さない。一部の実施形態では、水はＵｌｔｒａＰｕｒｅ（商標） ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ Ｗａｔｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。前述のある特定の実施形態では、保存溶液は、ＥＤＴＡを含まない。
ある特定の実施形態では、ｔｒｉｓは、約１ｍＭ～約２５０ｍＭの濃度で保存溶液中に存在する。一部の実施形態では、ｔｒｉｓは、約１ｍＭ～約１００ｍＭの濃度で保存溶液中に存在する。一部の実施形態では、ｔｒｉｓは、約１ｍＭ～約９０ｍＭの濃度で保存溶液中に存在する。一部の実施形態では、ｔｒｉｓは、約１ｍＭ～約８０ｍＭの濃度で保存溶液中に存在する。一部の実施形態では、ｔｒｉｓは、約１ｍＭ～約７０ｍＭの濃度で保存溶液中に存在する。一部の実施形態では、ｔｒｉｓは、約１ｍＭ～約６０ｍＭの濃度で保存溶液中に存在する。一部の実施形態では、ｔｒｉｓは、約１ｍＭ～約５０ｍＭの濃度で保存溶液中に存在する。一部の実施形態では、ｔｒｉｓは、約１ｍＭ～約４０ｍＭの濃度で保存溶液中に存在する。一部の実施形態では、ｔｒｉｓは、約１ｍＭ～約３０ｍＭの濃度で保存溶液中に存在する。一部の実施形態では、ｔｒｉｓは、約１ｍＭ～約２０ｍＭの濃度で保存溶液中に存在する。一部の実施形態では、ｔｒｉｓは、約５ｍＭ～約２０ｍＭの濃度で保存溶液中に存在する。ある特定の実施形態では、ｔｒｉｓは、約５ｍＭ～約５０ｍＭの濃度で保存溶液中に存在する。一部の実施形態では、ｔｒｉｓは、約１０ｍＭ～約２０ｍＭの濃度で保存溶液中に存在する。ある特定の実施形態では、ｔｒｉｓは、約２０ｍＭ～約２５０ｍＭの濃度で保存溶液中に存在する。ある特定の実施形態では、ｔｒｉｓは、約２０ｍＭ～約１００ｍＭの濃度で保存溶液中に存在する。ある特定の実施形態では、ｔｒｉｓは、約３０ｍＭ～約７０ｍＭの濃度で保存溶液中に存在する。ある特定の実施形態では、ｔｒｉｓは、約３０ｍＭ～約５０ｍＭの濃度で保存溶液中に存在する。一部の実施形態では、ｔｒｉｓは、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１１ｍＭ、約１２ｍＭ、約１３ｍＭ、約１４ｍＭ、約１５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１７ｍＭ、約１８ｍＭ、約１９ｍＭ、または約２０ｍＭの濃度で保存溶液中に存在する。一部の実施形態では、ｔｒｉｓは、約１０ｍＭの濃度で保存溶液中に存在する。ある特定の実施形態では、ｔｒｉｓは、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、または約７５ｍＭの濃度で保存溶液中に存在する。ある特定の実施形態では、ｔｒｉｓは、約５０ｍＭの濃度で保存溶液中に存在する。
一部の実施形態では、ＢＨＴは、約１ｐｐｍ（例えば、ｍｇ／ｍＬ）～約５００ｐｐｍ（例えば、ｍｇ／ｍＬ）の濃度で保存溶液中に存在する。一部の実施形態では、ＢＨＴは、約１ｐｐｍ～約４５０ｐｐｍの濃度で保存溶液中に存在する。一部の実施形態では、ＢＨＴは、約１ｐｐｍ～約４００ｐｐｍの濃度で保存溶液中に存在する。一部の実施形態では、ＢＨＴは、約１ｐｐｍ～約３５０ｐｐｍの濃度で保存溶液中に存在する。一部の実施形態では、ＢＨＴは、約１ｐｐｍ～約３００ｐｐｍの濃度で保存溶液中に存在する。一部の実施形態では、ＢＨＴは、約１ｐｐｍ～約２５０ｐｐｍの濃度で保存溶液中に存在する。一部の実施形態では、ＢＨＴは、約１ｐｐｍ～約２００ｐｐｍの濃度で保存溶液中に存在する。一部の実施形態では、ＢＨＴは、約１ｐｐｍ～約１５０ｐｐｍの濃度で保存溶液中に存在する。一部の実施形態では、ＢＨＴは、約１０ｐｐｍ～約２００ｐｐｍの濃度で保存溶液中に存在する。一部の実施形態では、ＢＨＴは、約２０ｐｐｍ～約２００ｐｐｍの濃度で保存溶液中に存在する。一部の実施形態では、ＢＨＴは、約２０ｐｐｍ～約１５０ｐｐｍの濃度で保存溶液中に存在する。一部の実施形態では、ＢＨＴは、約２０ｐｐｍ～約１２５ｐｐｍの濃度で保存溶液中に存在する。一部の実施形態では、ＢＨＴは、約２０ｐｐｍ～約１００ｐｐｍの濃度で保存溶液中に存在する。一部の実施形態では、ＢＨＴは、約２５ｐｐｍ～約１００ｐｐｍの濃度で保存溶液中に存在する。
一部の実施形態では、保存溶液は洗浄剤を含む。一部の実施形態では、保存溶液はカオトロピック試薬を含む。一部の実施形態では、カオトロピック試薬は尿素を含む。一部の実施形態では、カオトロピック試薬はグアニジンである。
一部の実施形態では、保存溶液は金属イオン（例えば、カルシウム、鉄、マグネシウム、または亜鉛）を含まない。一部の実施形態では、保存溶液はカルシウムを含まない。一部の実施形態では、保存溶液はマグネシウムを含まない。一部の実施形態では、保存溶液は亜鉛を含まない。一部の実施形態では、保存溶液は鉄を含まない。
一部の実施形態では、保存溶液は中性ｐＨである。一部の実施形態では、保存溶液は酸性ｐＨではない。一部の実施形態では、保存溶液は５～９の間のｐＨである。一部の実施形態では、保存溶液は５．５を超えるｐＨを有する。一部の実施形態では、保存溶液は６～９の間のｐＨである。一部の実施形態では、保存溶液は７～９の間のｐＨである。一部の実施形態では、保存溶液は７～８の間のｐＨである。一部の実施形態では、保存溶液は７．４～７．５の間のｐＨである。一部の実施形態では、保存溶液は６～８の間のｐＨである。一部の実施形態では、保存溶液は６．２～７．８の間のｐＨである。一部の実施形態では、保存溶液は６．５～７．５の間のｐＨである。一部の実施形態では、保存溶液は６．８～７．２の間のｐＨである。一部の実施形態では、ｐＨは７．０である。一部の実施形態では、ｐＨは７．１である。一部の実施形態では、ｐＨは７．２である。一部の実施形態では、ｐＨは７．３である。一部の実施形態では、ｐＨは７．４である。一部の実施形態では、ｐＨは７．５である。一部の実施形態では、ｐＨは７．６である。一部の実施形態では、ｐＨは８．０である。一部の実施形態では、保存溶液は生理学的ｐＨである。
一部の実施形態では、保存溶液は過酸化物を含まない。一部の実施形態では、保存溶液は、０．１％、０．０５％、０．０１％、０．００５％または０．００１％未満の過酸化物を含む。
一部の実施形態では、本明細書中に開示される保存溶液のいずれかは、生体試料中の標的ＤＮＡ配列／標的遺伝子におけるメチル化パターンを、室温（２３℃）で、少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、１０時間、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、２週間、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ
月、１０カ月、１１カ月、１年、１８カ月または２年の間保存することが可能である。一部の実施形態では、本明細書中に開示される保存溶液のいずれかは、生体試料中の標的ＤＮＡ配列／標的遺伝子におけるＤＮＡメチル化パターンを、４℃で、少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、１０時間、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、２週間、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１年、１８カ月または２年の間保存することが可能である。一部の実施形態では、本明細書中に開示される保存溶液のいずれかは、生体試料中の標的ＤＮＡ配列／標的遺伝子におけるＤＮＡメチル化パターンを、－１０℃で、少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、１０時間、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、２週間、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１年、１８カ月または２年の間保存することが可能である。ある特定の実施形態では、保存溶液は、５０℃未満の温度で維持される。ある特定の実施形態では、保存溶液は、４５℃未満の温度で維持される。ある特定の実施形態では、保存溶液は、４０℃未満の温度で維持される。ある特定の実施形態では、保存溶液は、３７℃未満の温度で維持される。ある特定の実施形態では、保存溶液は、３５℃未満の温度で維持される。ある特定の実施形態では、保存溶液は、３０℃未満の温度で維持される。ある特定の実施形態では、保存溶液は、２５℃未満の温度で維持される。
一部の実施形態では、本明細書中に開示される保存溶液のいずれかは、対象から得た生体試料中の標的ＤＮＡ配列／標的遺伝子におけるＤＮＡメチル化パターンを保存する。一部の実施形態では、生体試料中の標的ＤＮＡ配列／標的遺伝子の複製の少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の標的ＤＮＡ配列／標的遺伝子において保存されたメチル化パターンは、参照標的ＤＮＡ配列と関連するメチル化パターン（例えば、参照の差次的にメチル化されたドメイン）と比べた場合、本明細書中に開示される保存溶液のいずれか中で、一定期間（例えば、２１日間）後に、同じかまたはほとんど同じメチル化パターンを有する。一部の実施形態では、一定期間保存溶液中に保存される標的ＤＮＡ配列／標的遺伝子は、一定期間（例えば、２１日間）保存溶液中に保存されていたＤＮＡ分子の標的配列が参照標的ＤＮＡ配列のメチル化パターン（例えば、参照の差次的にメチル化されたドメイン）と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同じであるメチル化パターンを有する場合、参照標的ＤＮＡ分子のほとんど同じメチル化パターンを有すると考えられる。一部の実施形態では、参照標的ＤＮＡ分子または参照標的ＤＮＡ配列は、メチル化パターンが参照細胞（例えば、健康な対照細胞）に対して以前に決定されたＤＮＡ分子／配列である。一部の実施形態では、参照標的ＤＮＡ分子または参照標的ＤＮＡ配列は、メチル化パターンが、対象からの試料の単離後に試料中で決定されたＤＮＡ分子／配列である。一部の実施形態では、参照標的ＤＮＡ配列のメチル化パターンは、対象から参照標的ＤＮＡ配列を含む試料を得た後に、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、１８時間、または１日を超える間の参照標的ＤＮＡ配列の保存前に、決定される。好ましい実施形態では、参照標的ＤＮＡ配列／分子は、保存される標的ＤＮＡ配列／分子が比較される細胞型と同じ細胞型（例えば、食道新生物細胞）に由来する。
一部の実施形態では、保存溶液中に保存されたＤＮＡ分子の差次的にメチル化されたドメインのメチル化パターンは、参照ＤＮＡ分子の参照の差次的にメチル化されたドメインにおいてメチル化されることが公知のＣｐＧの少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％が、一定期間（例えば、２１日間）後に保存されたＤＮＡ分子の差次的にメチル化されたドメインにおいてメチル化されている場合に、保存されると考えられる。一部の実施形態では、本明細書中に開示される保存溶液のいずれか中で一定期間（例えば、２１日間）保存された試料中のＤＮＡ分子の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％が、保存されたメチル化パターンを有する。
Ｃ．標的遺伝子
一部の実施形態では、本明細書に記載されている保存溶液のいずれかを使用して、本明細書中に開示される標的遺伝子のいずれかのメチル化パターンを保存することができる。本明細書で使用される用語「標的遺伝子」は、特定の遺伝子、ならびにその相補体および／または断片と関連する全ての非コードおよびコード領域を含む。例えば、用語「標的遺伝子」は、いずれかの特定の遺伝子のコード領域の上流の調節配列を含む。一部の実施形態では、標的遺伝子は、目的の特定の遺伝子（例えば、ビメンチンまたはＣＣＮＡ１）のプロモーター、リプレッサー、エンハンサー、サイレンサー、イントロン、およびエクソンを含む。特定の実施形態では、標的遺伝子は、ＣｐＧアイランドが本発明者らのゲノム中の約半分の遺伝子の５’隣接領域またはプロモーター領域で顕著に表されるため、その標的遺伝子の５’隣接またはプロモーター領域を含む。一部の実施形態では、標的遺伝子のメチル化パターンは、目的の特定の遺伝子の断片に対して、例えば、その標的遺伝子の５’隣接またはプロモーター領域の一部に対して決定されるにすぎない。特定の実施形態では、用語「標的遺伝子」とは、遺伝子の差次的にメチル化されたドメインを指す。
一部の実施形態では、標的遺伝子は、ビメンチン、ＣＣＮＡ１、ＦＥＲ１Ｌ４、ＶＡＶ３、ＤＯＣＫ１０、ＡＤＣＹ１、ＢＭＰ３、ＣＤ１Ｄ、ＥＬＭＯ１、ＥＬＯＶＬ２、ＬＲＲＣ４、ＮＤＲＧ４、ＳＦＭＢＴ２、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＴＳＰＹＬ５、ＺＮＦ５６８、ＺＮＦ５６９、ＺＮＦ６１０、ＺＮＦ６７１、ＺＮＦ６８２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＤＩＯ３、ＨＵＮＫ、Ｕｐ３５－１、Ｕｐ３５－２もしくはＵｐ１０、またはその断片および／もしくは相補体のいずれか１つまたは複数である。一部の実施形態では、標的遺伝子は、差次的メチル化を、例えば、これらに限定されないが、食道の異形成または新生物のような組織の異形成または新生物を識別または検出するために使用することができる遺伝子であってもよい。他のゲノムの遺伝子座の差次的にメチル化されたドメイン（ＤＭＲ）の例を表１に表す：
Figure 2023529314000004
Figure 2023529314000005
一部の実施形態では、標的遺伝子は、表１に開示されるヌクレオチド配列のいずれかと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるヌクレオチド配列、またはそのいずれかの断片および／もしくは相補体を含む。
一部の実施形態では、標的遺伝子は、ビメンチン遺伝子の少なくとも一部を含む。一部の実施形態では、標的遺伝子は、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるヌクレオチド配列、またはその断片および／もしくは相補体を含む。一部の実施形態では、標的遺伝子は、配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるヌクレオチド配列、またはその断片および／もしくは相補体を含む。一部の実施形態では、標的遺伝子は、配列番号３のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるヌクレオチド配列、またはその断片および／もしくは相補体を含む。一部の実施形態では、標的遺伝子は、配列番号４のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるヌクレオチド配列、またはその断片および／もしくは相補体を含む。一部の実施形態では、標的遺伝子は、配列番号５のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるヌクレオチド配列、またはその断片および／もしくは相補体を含む。一部の実施形態では、標的遺伝子は、配列番号１８のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるヌクレオチド配列、またはその断片および／もしくは相補体を含む。一部の実施形態では、標的遺伝子は、米国特許第９，５８０，７５４号（その特許は参照により本明細書に完全に組み込まれている）に開示されるビメンチンヌクレオチド配列のいずれか１つのヌクレオチド配列、またはその断片および／もしくは相補体を含む。
一部の実施形態では、標的遺伝子は、Ｈｇ１９座標：ｃｈｒ１０：１７，２７０，８３８～１７，２７１，３４７に対応するヌクレオチド配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるビメンチンヌクレオチド配列、またはそのいずれかの断片および／もしくは相補体を含む。一部の実施形態では、標的遺伝子は、Ｈｇ１９座標：ｃｈｒ１０：１７，２７０，８３８～１７，２７１，７１７に対応するヌクレオチド配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるビメンチンヌクレオチド配列、またはそのいずれかの断片および／もしくは相補体を含む。
一部の実施形態では、標的遺伝子は、Ｈｇ１９座標：ｃｈｒ１０：１７２７１４４２～１７２７１５４７に対応するヌクレオチド配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるビメンチンヌクレオチド配列、またはそのいずれかの断片および／もしくは相補体を含む。一部の実施形態では、標的遺伝子は、配列番号５のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるビメンチンヌクレオチド配列、またはそのいずれかの断片および／もしくは相補体を含む。
一部の実施形態では、標的遺伝子は、Ｈｇ１９座標ｃｈｒ１３：３７００５８０５～３７００６１９４に対応するヌクレオチド配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるＣＣＮＡ１ヌクレオチド配列、またはその断片および／もしくは相補体を含む。一部の実施形態では、標的遺伝子は、Ｈｇ１９座標ｃｈｒ１３：３７００５８５６～３７００６０３１に対応するヌクレオチド配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるＣＣＮＡ１ヌクレオチド配列、またはその断片および／もしくは相補体を含む。一部の実施形態では、標的遺伝子は、配列番号６のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるＣＣＮＡ１ヌクレオチド配列、またはその断片および／もしくは相補体を含む。一部の実施形態では、標的遺伝子は、配列番号７のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるＣＣＮＡ１ヌクレオチド配列、またはその断片および／もしくは相補体を含む。
一部の実施形態では、標的遺伝子は、配列番号８のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるＵｐ１０ヌクレオチド配列、またはその断片および／もしくは相補体を含む。一部の実施形態では、標的遺伝子は、配列番号９のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるＵｐ１０ヌクレオチド配列、またはその断片および／もしくは相補体を含む。一部の実施形態では、標的遺伝子は、配列番号１０のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるＵｐ１０ヌクレオチド配列、またはその断片および／もしくは相補体を含む。一部の実施形態では、標的遺伝子は配列番号１１のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるＵｐ１０ヌクレオチド配列、またはその断片および／もしくは相補体を含む。
一部の実施形態では、標的遺伝子は、配列番号１２のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるＵｐ３５－１ヌクレオチド配列、またはその断片および／もしくは相補体を含む。一部の実施形態では、標的遺伝子は、配列番号１３のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるＵｐ３５－１ヌクレオチド配列、またはその断片および／もしくは相補体を含む。一部の実施形態では、標的遺伝子は、配列番号１４のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるＵｐ３５－１ヌクレオチド配列、またはその断片および／もしくは相補体を含む。一部の実施形態では、標的遺伝子は、配列番号１５のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるＵｐ３５－１ヌクレオチド配列、またはその断片および／もしくは相補体を含む。
一部の実施形態では、標的遺伝子は、配列番号１２のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるＵｐ３５－２ヌクレオチド配列、またはその断片および／もしくは相補体を含む。一部の実施形態では、標的遺伝子は、配列番号１３のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるＵｐ３５－２ヌクレオチド配列、またはその断片および／もしくは相補体を含む。一部の実施形態では、標的遺伝子は、配列番号１６のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるＵｐ３５－２ヌクレオチド配列、またはその断片および／もしくは相補体を含む。一部の実施形態では、標的遺伝子は、配列番号１７のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるＵｐ３５－２ヌクレオチド配列、またはその断片および／もしくは相補体を含む。
一部の実施形態では、標的遺伝子は、配列番号１９のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるＡＤＣＹ１ヌクレオチド配列、またはその断片および／もしくは相補体を含む。
一部の実施形態では、標的遺伝子は、配列番号２０のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるＢＭＰ３ヌクレオチド配列、またはその断片および／もしくは相補体を含む。一部の実施形態では、標的遺伝子は、配列番号２１のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるＢＭＰ３ヌクレオチド配列、またはその断片および／もしくは相補体を含む。
一部の実施形態では、標的遺伝子は、配列番号２２のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるＣＤ１Ｄヌクレオチド配列、またはその断片および／もしくは相補体を含む。
一部の実施形態では、標的遺伝子は、配列番号２３のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるＣＤＫＮ２Ａヌクレオチド配列、またはその断片および／もしくは相補体を含む。一部の実施形態では、標的遺伝子は、配列番号２４のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるＣＤＫＮ２Ａヌクレオチド配列、またはその断片および／もしくは相補体を含む。
一部の実施形態では、標的遺伝子は、配列番号２５のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるＤＩＯ３ヌクレオチド配列、またはその断片および／もしくは相補体を含む。
一部の実施形態では、標的遺伝子は、配列番号２６のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるＤＯＣＫ１０ヌクレオチド配列、またはその断片および／もしくは相補体を含む。
一部の実施形態では、標的遺伝子は、配列番号２７のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるＥＬＭＯ１ヌクレオチド配列、またはその断片および／もしくは相補体を含む。
一部の実施形態では、標的遺伝子は、配列番号２８のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるＥＬＯＶＬ２ヌクレオチド配列、またはその断片および／もしくは相補体を含む。
一部の実施形態では、標的遺伝子は、配列番号２９のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるＦＥＲ１Ｌ４ヌクレオチド配列、またはその断片および／もしくは相補体を含む。
一部の実施形態では、標的遺伝子は、配列番号３０のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるＨＵＮＫヌクレオチド配列、またはその断片および／もしくは相補体を含む。
一部の実施形態では、標的遺伝子は、配列番号３１のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるＬＲＲＣ４ヌクレオチド配列、またはその断片および／もしくは相補体を含む。
一部の実施形態では、標的遺伝子は、配列番号３２のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるＮＤＲＧ４ヌクレオチド配列、またはその断片および／もしくは相補体を含む。
一部の実施形態では、標的遺伝子は、配列番号３３のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるＳＦＭＢＴ２ヌクレオチド配列、またはその断片および／もしくは相補体を含む。一部の実施形態では、標的遺伝子は、列番号３４のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるＳＦＭＢＴ２ヌクレオチド配列、またはその断片および／もしくは相補体を含む。一部の実施形態では、標的遺伝子は、配列番号３５のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるＳＦＭＢＴ２ヌクレオチド配列、またはその断片および／もしくは相補体を含む。一部の実施形態では、標的遺伝子は、配列番号３６のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるＳＦＭＢＴ２ヌクレオチド配列、またはその断片および／もしくは相補体を含む。
一部の実施形態では、標的遺伝子は、配列番号３７のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるＳＴ８Ｓ１Ａ１ヌクレオチド配列、またはその断片および／もしくは相補体を含む。
一部の実施形態では、標的遺伝子は、配列番号３８のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるＴＳＰＹＬ５ヌクレオチド配列、またはその断片および／もしくは相補体を含む。
一部の実施形態では、標的遺伝子は、配列番号３９のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるＶＡＶ３ヌクレオチド配列、またはその断片および／もしくは相補体を含む。
一部の実施形態では、標的遺伝子は、配列番号４０のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるＺＮＦ５６８ヌクレオチド配列、またはその断片および／もしくは相補体を含む。一部の実施形態では、標的遺伝子は、配列番号４１のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるＺＮＦ５６８ヌクレオチド配列、またはその断片および／もしくは相補体を含む。
一部の実施形態では、標的遺伝子は、配列番号４２のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるＺＮＦ５６９ヌクレオチド配列、またはその断片および／もしくは相補体を含む。
一部の実施形態では、標的遺伝子は、配列番号４３のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるＺＮＦ６１０ヌクレオチド配列、またはその断片および／もしくは相補体を含む。
一部の実施形態では、標的遺伝子は、配列番号４４のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるＺＮＦ６７１ヌクレオチド配列、またはその断片および／もしくは相補体を含む。
一部の実施形態では、標的遺伝子は、配列番号４５のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるＺＮＦ６８２ヌクレオチド配列、またはその断片および／もしくは相補体を含む。
一部の実施形態では、本明細書中に開示される標的遺伝子断片のいずれかは、長さが少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、７００、８００、９００、または１０００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、断片は、長さが少なくとも２０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、本明細書中に開示される標的遺伝子断片のいずれかは、長さが１０～１０００ヌクレオチドの間、１０～５００ヌクレオチドの間、１０～２５０ヌクレオチドの間、１０～２００ヌクレオチドの間、１０～１５０ヌクレオチドの間、１０～１００ヌクレオチドの間、１０～５０ヌクレオチドの間、１０～２５ヌクレオチドの間、１０～２０ヌクレオチドの間、２５～５０ヌクレオチドの間、５０～７５ヌクレオチドの間、２５～１００ヌクレオチドの間、５０～１００ヌクレオチドの間、５０～１５０ヌクレオチドの間、１００～２００ヌクレオチドの間、５０～２５０ヌクレオチドの間、または１００～２５０ヌクレオチドの間である。
Ｄ．生体試料
一部の実施形態では、本明細書に記載されている保存溶液のいずれかは、本明細書中に開示される生体試料のいずれかを保存する際に使用するためのものである。試料は、事実上目的の任意の生体材料、例えば対象からとられる細胞の集合であってよい。例えば、試料は、対象からの体液試料、対象からの組織試料、対象からの固体もしくは半固体の試料、対象に由来する材料の一次細胞培養もしくは組織培養、細胞系からの細胞、または細胞もしくは組織培養からの培地もしくは他の細胞外材料、または異種移植（第２の対象、例えば免疫不全マウスにおいて培養された、第１の対象、例えばヒトからのがんの試料を意味する）であってよい。本明細書で用いる用語「試料」は、対象から直接的に得られる生体材料（一次試料と記載されることがある）、ならびに一次試料の任意の操作された形態または部分を包含するものである。試料は、生体材料を外因性液体と接触させ、接触させた生体材料の一部分を含有する洗浄液の生成をもたらすことによって得ることもできる。さらに、用語「試料」は、それが１つまたは複数の添加剤、例えば保存剤、キレーター、抗凝固因子等と混合された後の一次試料を包含するものである。一部の実施形態では、試料は、細胞擦過および／またはバルーンによって得られる。一部の実施形態では、試料は、対象の胃食道接合部から得られる。
ある特定の実施形態では、体液試料は血液試料である。この場合には、用語「試料」は、患者から直接的に得られる血液だけでなく、血液の画分、例えば血漿、血清、細胞画分（例えば、血小板、赤血球およびリンパ球）、タンパク質調製物、核酸調製物等も包含するものである。一部の実施形態では、体液は、胃に由来することができ、例えば、胃分泌、酸逆流または嘔吐であってよい。他の実施形態では、体液は、膵臓または膀胱によって分泌される液であってよい。他の実施形態では、体液は、唾液、唾または食道洗液であってよい。ある特定の実施形態では、組織試料は、胃腸管の粘膜からとられる生検である。他の実施形態では、組織試料は、例えば対象の食道からの擦過物である。
一部の実施形態では、生体試料は、胃腸管、気道消化管、気道、尿生殖器管、または体液のいずれかに由来する試料である。ある特定のこのような実施形態では、体液は、血液、尿、痰、唾液、便、胆汁、膵液、鼻汁、涙、精液、膣分泌物、脳脊髄液、胸膜液、腹水、胃液、心膜液、汗、リンパ液、嚢胞液、膵嚢胞液、滑液、関節液、月経液、子宮内膜洗浄液（ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｗａｓｈｉｎｇ）、胸部吸込物（ｂｒｅａｓｔ ａｓｐｉｒａｔｅ）、または羊水のうちのいずれかである。一部の実施形態では、生体試料は、食道、胃、結腸、小腸、膵臓、肝臓、口腔、中咽頭、気管、気管支樹、肺、または乳房のいずれかに由来する試料である。
一部の実施形態では、生体試料は、対象由来の細胞、組織、または器官の少なくとも一部である。一部の実施形態では、試料は胃腸管由来の組織試料である。一部の実施形態では、試料は上部胃腸管由来の組織試料である。一部の実施形態では、試料は下部胃腸管由来の組織試料である。一部の実施形態では、試料は食道由来の細胞または組織試料である。一部の実施形態では、試料は胃由来の細胞または組織試料である。一部の実施形態では、試料は腸由来の細胞または組織試料である。一部の実施形態では、試料は結腸由来の細胞または組織試料である。
一部の実施形態では、試料は、以下の細胞型：膀胱（ｕｒｉｎａｒｙ ｂｌａｄｄｅｒ）、膵臓上皮、膵α細胞、膵β細胞、膵臓内皮、骨髄リンパ芽球、骨髄Ｂリンパ芽球、骨髄マクロファージ、骨髄赤芽球、骨髄樹状、骨髄脂肪細胞、骨髄骨細胞、骨髄軟骨細胞、前骨髄芽球、骨髄巨核芽球、膀胱（ｂｌａｄｄｅｒ）、脳Ｂリンパ球、脳神経膠、ニューロン、脳星状細胞、神経外胚葉、脳マクロファージ、脳ミクログリア、脳上皮、心筋細胞、皮質ニューロン、脳線維芽細胞、乳房上皮、結腸上皮、結腸Ｂリンパ球、食道上皮、乳腺上皮、乳腺筋上皮、乳腺線維芽細胞、結腸腸細胞、子宮頚部上皮、卵巣上皮、卵巣線維芽細胞、乳房管上皮、舌上皮、扁桃樹状、扁桃Ｂリンパ球、末梢血リンパ芽球、末梢血Ｔリンパ芽球、末梢血皮膚Ｔリンパ球、末梢血ナチュラルキラー、末梢血Ｂリンパ芽球、末梢血単球、末梢血骨髄芽球、末梢血単芽球、末梢血前骨髄芽球、末梢血マクロファージ、末梢血好塩基球、肝臓内皮、肝臓マスト、肝臓上皮、肝臓Ｂリンパ球、脾臓内皮、脾臓上皮、脾臓Ｂリンパ球、肝細胞、肝臓Ａｌｅｘａｎｄｅｒ、肝臓線維芽細胞、肺上皮、気管支上皮、肺線維芽細胞、肺Ｂリンパ球、肺Ｓｃｈｗａｎｎ、肺扁平上皮、肺マクロファージ、肺骨芽細胞、神経内分泌、肺胞、胃上皮、および胃線維芽細胞のいずれか１つまたは複数の細胞を含む。
一部の実施形態では、試料は、１つまたは複数の新生細胞を含む。一部の実施形態では、試料は、１つまたは複数の異形成細胞を含む。一部の実施形態では、試料は、１つまたは複数のがん細胞を含む。一部の実施形態では、試料は、１つまたは複数のがん細胞を含み、がん細胞は、以下のがんのいずれか１つまたは複数に関連する：急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質癌腫、小児副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連がん、カポジ肉腫（軟部組織肉腫）、ＡＩＤＳ関連リンパ腫（リンパ腫）、ＣＮＳ原発リンパ腫（リンパ腫）、肛門がん、虫垂がん、消化管カルチノイド腫瘍、星状細胞腫、脳がん、非定型奇形腫様／横紋筋肉腫様腫瘍、皮膚がん、基底細胞癌、胆管がん、膀胱がん、小児膀胱がん、骨がん、ユーイング肉腫および骨肉腫および悪性線維性組織球腫、脳腫瘍、乳がん、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、カルチノイド腫瘍、噴門がん、ＣＮＳ原発リンパ腫、子宮頸がん、胆管細胞癌、胆管がん、脊索腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄増殖性腫瘍、結腸がん、結腸直腸がん、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）、子宮内膜がん、子宮がん、上衣腫、食道がん、鼻腔神経芽細胞腫、頭頚部がん、ユーイング肉腫、骨がん、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、眼のがん、小児眼内黒色腫、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫、卵管がん、骨の線維性組織球腫、悪性腫瘍、および骨肉腫、胆嚢がん、胃がん、消化管カルチノイド腫瘍、卵巣がん、精巣がん、妊娠性絨毛性疾患、ヘアリー細胞白血病、頭頚部がん、心臓腫瘍、肝臓がん、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、眼内黒色腫、島細胞腫瘍、膵神経内分泌腫瘍、カポジ肉腫、軟部組織肉腫、腎がん、ランゲルハンス細胞組織球症、咽頭がん、白血病、口唇および口腔がん、肺がん（非小細胞および小細胞）、リンパ腫、男性乳がん、骨の悪性線維性組織球腫および骨肉腫。黒色腫、皮膚がん、メルケル細胞癌、中皮腫、転移性がん、潜在性原発の転移性扁平頚部がん、ＮＵＴ遺伝子変化を有する正中線路癌、口腔がん（ｍｏｕｔｈ ｃａｎｃｅｒ）、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性腫瘍、骨髄性白血病（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、慢性（ＣＭＬ）、骨髄性白血病（ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、急性（ＡＭＬ）、骨髄増殖性腫瘍、鼻腔および副鼻腔がん、上咽頭がん、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、口腔がん、口唇および口腔がんならびに中咽頭がん、骨肉腫および骨の悪性線維性組織球腫、卵巣がん、膵臓がん、乳頭腫、傍神経節腫、副鼻腔および鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、妊娠および乳がん、中枢神経系（ＣＮＳ）原発リンパ腫、原発腹膜がん、前立腺がん、直腸がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫、小児横紋筋肉腫、小児血管腫瘍、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、骨肉腫、軟部組織肉腫、子宮肉腫、セザリー症候群、小細胞肺がん、小腸がん、軟部組織肉腫、皮膚の扁平細胞癌、潜在性原発の転移性扁平頚部がん、胃がん、Ｔ細胞リンパ腫、精巣がん、咽頭がん、上咽頭がん、中咽頭がん、下咽頭がん、胸腺腫および胸腺癌、甲状腺がん、腎盂および尿管の移行上皮がん、尿道がん、子宮がん、子宮内膜がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、および／またはウィルムス腫瘍。特定の実施形態では、試料は、１つまたは複数の食道がん細胞を含む。一部の実施形態では、試料は、１つまたは複数の結腸がん細胞を含む。一部の実施形態では、試料は、１つまたは複数のバレット食道細胞を含む。
一部の実施形態では、試料は、本明細書中に開示される新生物のいずれか（例えば、食道腺癌）、本明細書中に開示されるがんのいずれか、または本明細書中に開示される異形成のいずれか（例えば、バレット食道）を有することが疑われる対象由来の細胞および／または組織を含む。この代わりに、対象はルーチンのスクリーニングを受けていてもよく、そのような異形成または新生物を有することが必ずしも疑われていなくてもよい。
対象は、一部の実施形態では、ヒト対象である。他の実施形態では、対象は非ヒト動物である。
ある特定の実施形態では、生体材料の別個の部分を得ることなく、生物体において本明細書に記載されるバイオマーカー（例えば、ＤＮＡメチル化またはタンパク質発現レベル）を直接的に検出することが可能であるかもしれない。このような場合には、用語「試料」は、検出工程に含まれる試薬またはデバイスと接触させた生体材料の部分を包含するものである。
ある特定の実施形態では、目的の標的遺伝子を含むＤＮＡは、体液試料から得られる。体液の例は、血液、唾液、唾または食道洗液である。他の体液を使用することもできる。それらは対象から容易に得ることができ、複数の疾患についてスクリーニングするために使用することができるので、血液または血液由来の画分は特に有益であり得る。血液由来の画分は、血液、血清、血漿または他の画分を含むことができる。例えば、細胞画分は、５ｍｌの全血を室温および重力の８００倍で１０分の間遠心分離することにより、「バフィーコート」（すなわち、白血球強化血液部分）として調製することができる。赤血球は最も急速に沈殿し、遠心管の中に一番下の画分として存在する。バフィーコートは、赤血球の上に薄いクリーム状の白色の層として存在する。血液の血漿部分は、バフィーコートの上の層を形成する。血液からの画分は、様々な他の方法で単離することもできる。１つの方法は、細胞の特定のサイズまたは密度について強化するために遠心分離で使用した勾配から１つまたは複数の画分をとることによる。
一部の実施形態では、ＤＮＡは試料から単離される。一部の実施形態では、用語「生体試料」または「試料」は、対象由来の細胞試料または組織試料または体液試料または便試料から単離されるＤＮＡを指すために使用される。そのような試料からのＤＮＡの単離の手順は、当業者に周知である。一般的に、そのようなＤＮＡ単離手順は、例えば、試料中に存在する任意の細胞の洗浄剤を使用した溶解を含む。細胞溶解の後、タンパク質は、一般的に様々なプロテアーゼを使用してＤＮＡから取り出される。ＲＮＡは、ＲＮａｓｅを使用して取り出される。ＤＮＡは、次に一般的にフェノールで抽出され、アルコール中で沈殿させられ、水溶液に溶解される。
Ｅ．使用方法
一部の実施形態では、本開示は、本明細書中に開示される生体試料のいずれかにおいて、本明細書中に開示される標的遺伝子のいずれか（またはその断片）のＤＮＡメチル化パターンを保存する方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、本明細書中に開示される生体試料のいずれかを、本明細書に記載されている保存溶液のいずれかに投与するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、本明細書中に開示される生体試料のいずれかを、本明細書に記載されている保存溶液のいずれかと混合するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、本明細書中に開示される生体試料のいずれかを、本明細書に記載されている保存溶液のいずれかで処置するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、本明細書中に開示される生体試料のいずれかを、本明細書に記載されている保存溶液のいずれか中で保存するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、試料を保存溶液中に、少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、１０時間、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、２週間、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１年、１８カ月または２年の間保存するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、試料を保存溶液中に、－３０℃から５０℃の範囲の温度で保存するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、試料を保存溶液中に、－２０℃から４０℃の範囲の温度で保存するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、試料を保存溶液中に、－１０℃から３０℃の範囲の温度で保存するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、試料を保存溶液中に、０℃から２５℃の範囲の温度で保存するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、試料を保存溶液中に、４℃から２５℃の範囲の温度で保存するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、試料を保存溶液中に、－１０℃から１０℃の範囲の温度で保存するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、試料を保存溶液中に、１５℃から２５℃の範囲の温度で保存するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、試料を保存溶液中に、室温で保存するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、試料を保存溶液中に、２３℃で少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、１０時間、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、２週間、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１年、１８カ月または２年の間保存するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、試料を保存溶液中に、４０℃で少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、１０時間、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、２週間、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１年、１８カ月または２年の間保存するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、試料を保存溶液中に、５０℃で少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、１０時間、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、２週間、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１年、１８カ月または２年の間保存するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、試料を保存溶液中に、４℃で少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、１０時間、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、２週間、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１年、１８カ月または２年の間保存するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、試料を保存溶液中に、-１０℃で少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、１０時間、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、２週間、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１年、１８カ月または２年の間保存するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、試料を保存溶液中に、-３０℃で少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、１０時間、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、２週間、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１年、１８カ月または２年の間保存するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、試料を保存溶液中に、-３０℃から５０℃の間の範囲の温度で少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、１０時間、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、２週間、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１年、１８カ月または２年の間保存するステップを含む。
一部の実施形態では、保存試料は、容器内に保存される。一部の実施形態では、容器はバイアルである。一部の実施形態では、容器はガラス製である。一部の実施形態では、容器はプラスチック製である。一部の実施形態では、容器はポリプロピレン製である。一部の実施形態では、容器はポリスチレン製である。一部の実施形態では、容器は、少なくとも５ｍｌ、１０ｍｌ、１５ｍｌ、２０ｍｌ、２５ｍｌ、３０ｍｌ、３５ｍｌ、４０ｍｌ、５０ｍｌ、７５ｍｌまたは１００ｍｌの体積を保持することが可能である。一部の実施形態では、容器は遠心バイアルである。一部の実施形態では、試料がバルーンによって収集される場合（例えば、食道試料を得る場合）、遠心バイアルは、バルーンおよびバイアルに添加された試料を完全に覆うことが可能である。一部の実施形態では、試料がバルーンによって収集される場合（例えば、食道試料を得る場合）、遠心バイアルは、６０％～７０％満たされたバルーンおよびバイアルに添加された試料を完全に覆うことが可能である。特定の実施形態では、遠心バイアルは、自立式の３０ｍｌポリプロピレン管（例えば、Ｅｖｅｒｇｒｅｅｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃを参照されたい）である。
一部の実施形態では、本開示は、本明細書中に開示される容器のいずれか、および本明細書中に開示される保存溶液のいずれかを含むキットを提供する。一部の実施形態では、キットは、容器および保存溶液を使用するための使用説明書をさらに含む。一部の実施形態では、キットは、対象から試料を得るための機器（例えば、バルーン）をさらに含む。特定の実施形態では、キットは、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴならびに５０：５０のメタノール：水を含む保存溶液を含む。さらなる実施形態では、キットは、ｔｒｉｓおよび／またはＢＨＴならびに５０：５０のメタノール：水を含む保存溶液を含み、キットは、３０ｍｌのポリプロピレン遠心バイアルである容器をさらに含む。
一部の実施形態では、本明細書中に開示される試料のいずれかが、本明細書中に開示される保存溶液のいずれかを含む本明細書中に開示される容器のいずれかに添加されると、その後、容器はパッケージ内に配置される。一部の実施形態では、パッケージは封筒または箱である。一部の実施形態では、箱は段ボール箱である。一部の実施形態では、パッケージは宛名シールを含む。一部の実施形態では、箱は、試料を分析するために別の場所に輸送される。
一部の実施形態では、本明細書に記載されている保存溶液のいずれか中に保存された試料のいずれかは、本明細書中に開示される方法のいずれかにおいて使用することができる。一部の実施形態では、メチル化ＤＮＡを含む試料は、差次的にメチル化されたヌクレオチド配列を検出するためのアッセイにおいて使用することができる。ある特定の実施形態では、本出願は、差次的にメチル化されたヌクレオチド配列（例えば、ビメンチンおよび／またはＣＣＮＡ１）を検出するためのアッセイを提供する。したがって、一部の実施形態では、差次的にメチル化されたヌクレオチド配列は、そのメチル化状態においては、本明細書に記載されている様々な方法および本出願の教示を考慮すれば当業者の視野の中に十分ある方法を使用した検出のための標的の役割をすることができる。
ある特定の態様では、メチル化ヌクレオチド配列（例えば、ビメンチンおよび／またはＣＣＮＡ１）を検出するためのそのような方法は、メチル化Ｃ（すなわち、５ｍＣ）ではなく非メチル化Ｃを異なるヌクレオチド塩基に変換する化合物によるゲノムＤＮＡの処理に基づく。１つのそのような化合物は、５ｍＣではなくＣをＵに変換する亜硫酸水素ナトリウム（本明細書では単に「亜硫酸水素塩」とも呼ばれる）である。ＤＮＡの亜硫酸水素塩処理のための方法が、当技術分野で公知である（Hermanら、１９９６年、Proc Natl Acad Sci USA、９３巻：９８２１～６頁；HermanおよびBaylin、１９９８年、Current Protocols in Human Genetics、N. E. A. Dracopoli編、John Wiley & Sons、２巻：１０．６．１～１０．６．１０；米国特許第５，７８６，１４６号）。例示すると、非メチル化Ｃヌクレオチドを含有するＤＮＡ分子を亜硫酸水素ナトリウムで処理して化合物変換ＤＮＡになるとき、そのＤＮＡの配列が変化する（Ｃ→Ｕ）。変換されたヌクレオチド配列におけるＵの検出は、非メチル化Ｃを示す。
化合物変換ヌクレオチド配列に存在する異なるヌクレオチド塩基（例えば、Ｕ）は、様々な方法でその後検出することができる。特定の実施形態では、本開示は、「メチル化感受性ＰＣＲ」（ＭＳＰ）を使用して化合物変換ＤＮＡ配列中のＵを検出する方法を提供する（例えば、Hermanら、１９９６年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、９３巻：９８２１～９８２６頁；米国特許第６，２６５，１７１号；米国特許第６，０１７，７０４号；米国特許第６，２００，７５６号を参照）。ＭＳＰでは、ＤＮＡの中のＣｐＧジヌクレオチドにおけるＣ塩基がメチル化されるならば、１セットのプライマー（すなわち、フォワードおよびリバースプライマーを含む）が化合物変換鋳型配列を増幅する。このプライマーセットは、「メチル化特異的プライマー」と呼ばれる。５’隣接配列の中のＣｐＧジヌクレオチドにおけるＣ塩基がメチル化されないならば、別のプライマーセットが化合物変換鋳型配列を増幅する。このプライマーセットは、「非メチル化特異的プライマー」と呼ばれる。
ＭＳＰでは、反応は、対象の試料からの化合物変換ＤＮＡを使用する。メチル化ＤＮＡのためのアッセイでは、メチル化特異的プライマーが使用される。ＤＮＡの標的配列のＣｐＧジヌクレオチドの中のＣがメチル化される場合には、ポリメラーゼの存在下でメチル化特異的プライマーが化合物変換鋳型配列を増幅し、ＭＳＰ生成物が生成される。ＤＮＡの標的配列のＣｐＧジヌクレオチドの中のＣがメチル化されない場合には、ポリメラーゼの存在下でメチル化特異的プライマーは化合物変換鋳型配列を増幅せず、ＭＳＰ生成物は生成されない。一部の実施形態では、本明細書に開示される亜硫酸水素塩で変換されたメチル化配列のいずれも、特定の適応症のためのマーカーとして使用される。
一部の実施形態では、非メチル化ＤＮＡの検出のために対照反応を実行することも、有益である。反応は、対象の試料からの化合物変換ＤＮＡを使用し、非メチル化特異的プライマーが使用される。ＤＮＡの標的配列のＣｐＧジヌクレオチドの中のＣがメチル化されない場合には、ポリメラーゼの存在下で非メチル化特異的プライマーが化合物変換鋳型配列を増幅し、ＭＳＰ生成物が生成される。ＤＮＡの標的配列のＣｐＧジヌクレオチドの中のＣがメチル化される場合には、ポリメラーゼの存在下で非メチル化特異的プライマーは化合物変換鋳型配列を増幅せず、ＭＳＰ生成物は生成されない。生体試料は、メチル化特異的プライマーによるシグナルを生成する新生物細胞と、非メチル化特異的プライマーによるシグナルを生成する正常な細胞性エレメントの両方の混合物をしばしば含有することに留意する。非メチル化特異的シグナルは対照反応としてしばしば有用であるが、この場合、メチル化特異的プライマーを使用した反応に由来する陽性シグナルによって示される通りに新生物の不在を暗示していない。
ＭＳＰ反応のためのプライマーは、化合物変換鋳型配列に由来する。本明細書において、「由来する」は、プライマーの配列が、ＭＳＰ反応においてプライマーが化合物変換鋳型配列を増幅するように選択されることを意味する。各プライマーは、長さが少なくとも８ヌクレオチドである一本鎖ＤＮＡ断片を含む。一部の実施形態では、プライマーは長さが５０ヌクレオチド未満であり、または、一部の実施形態では、長さが１５から３５ヌクレオチドである。化合物変換鋳型配列は、亜硫酸水素ナトリウムで処理される二本鎖ＤＮＡのワトソン鎖またはクリック鎖であってよいので、プライマー配列はワトソンまたはクリックの化合物変換鋳型配列のいずれがＭＳＰにおいて増幅させるために選択されるかに依存する。ワトソンまたはクリック鎖のいずれかを、増幅させるために選択することができる。
化合物変換鋳型配列、したがってＭＳＰ反応の生成物は、一部の実施形態では、長さが２０から３０００ヌクレオチドの間である。他の実施形態では、ＭＳＰ反応の生成物は、長さが２０から２００ヌクレオチドの間である。他の実施形態では、ＭＳＰ反応の生成物は、長さが２０から１００ヌクレオチドの間である。他の実施形態では、ＭＳＰ反応の生成物は、長さが３０から２００ヌクレオチドの間である。他の実施形態では、ＭＳＰ反応の生成物は、長さが５０から１０００ヌクレオチドの間である。他の実施形態では、ＭＳＰ反応の生成物は、長さが５０から１００ヌクレオチドの間である。他の実施形態では、ＭＳＰ反応の生成物は、長さが５０から２００ヌクレオチドの間である。他の実施形態では、ＭＳＰ反応の生成物は、長さが５０から５００ヌクレオチドの間である。他の実施形態では、ＭＳＰ反応の生成物は、長さが８０から１５０ヌクレオチドの間である。一部の実施形態では、ＭＳＰ反応の生成物は、長さが少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０または２５０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、メチル化特異的プライマーは、非メチル化特異的プライマーによって生成されたＭＳＰ生成物と異なる長さのＭＳＰ生成物をもたらす。
ＭＳＰ生成物が反応アッセイにおいて生成されたかどうか判定するために、様々な方法を使用することができる。ＭＳＰ生成物が反応において生成されたかどうか判定する１つの方法は、アガロースゲル電気泳動によって反応の一部を分析することである。例えば、０．６から２．０％のアガロースの水平アガロースゲルを作製し、ＭＳＰ反応混合物の一部を、アガロースゲルを通して電気泳動にかける。電気泳動の後、アガロースゲルを臭化エチジウムで染色する。紫外線で照射の間にゲルを眺めるとき、ＭＳＰ生成物は可視的である。標準化サイズのマーカーとの比較によって、ＭＳＰ生成物が正しい予想サイズであるかどうか判定される。
生成物がＭＳＰ反応において作製されるかどうか判定するために、他の方法を使用することができる。１つのそのような方法は、「リアルタイムＰＣＲ」と呼ばれる。リアルタイムＰＣＲは、蛍光計（すなわち、蛍光を測定する機器）を組み込むサーマルサイクラー（すなわち、ＰＣＲ反応が起こるために必要な温度変化を提供する機器）を利用する。リアルタイムＰＣＲ反応混合物は、生成物へのその組込みを数量化することができ、その数量化が鋳型におけるその配列のコピー数を示す試薬も含有する。１つのそのような試薬は、二本鎖ＤＮＡに優先的に結合し、その蛍光が二本鎖ＤＮＡの結合によって大いに強化される、ＳＹＢＲグリーンＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．；Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎ）と呼ばれる蛍光色素である。ＰＣＲ反応をＳＹＢＲグリーンＩの存在下で実行するとき、結果として生じるＤＮＡ生成物はＳＹＢＲグリーンＩおよび蛍光に結合する。蛍光が検出され、蛍光計で数量化される。そのような技術は、ＰＣＲ反応における生成物の量の数量化のために特に有益である。さらに、ＰＣＲ反応からの生成物は、ＴａｑＭａｎプローブおよび分子ビーコンを含む生成物にハイブリダイズする様々なプローブを用いて、「リアルタイムＰＣＲ」において定量化することができる。定量化は絶対ベースであってよいか、または構成的にメチル化されたＤＮＡ標準に相対的であってよいか、または非メチル化ＤＮＡ標準に相対的であってもよい。１つの場合には、メチル化由来生成物対非メチル化由来生成物の比を構築することができる。
本開示によるＤＮＡのメチル化を検出するための方法はＭＳＰに限定されず、ＤＮＡメチル化を検出するための任意のアッセイを包含することができる。ＤＮＡのメチル化を検出する別の例示的方法は、「メチル化感受性」制限エンドヌクレアーゼを使用することによる。そのような方法は、対象から単離されたゲノムＤＮＡをメチル化感受性の制限エンドヌクレアーゼで処理し、制限エンドヌクレアーゼ処理ＤＮＡを次にＰＣＲ反応における鋳型として使用することを含む。本明細書では、認識配列の中のＣ塩基がメチル化されていないならば、メチル化感受性の制限エンドヌクレアーゼはＤＮＡの中の特異的配列を認識し、切断する。制限エンドヌクレアーゼの認識配列の中のＣ塩基がメチル化されているならば、ＤＮＡは切断されない。そのようなメチル化感受性の制限エンドヌクレアーゼの例には、ＨｐａＩＩ、ＳｍａＩ、ＳａｃＩＩ、ＥａｇＩ、ＢｓｔＵＩおよびＢｓｓＨＩＩが限定されずに含まれる。この技術では、メチル化感受性の制限エンドヌクレアーゼのための認識配列は、鋳型ＤＮＡの中の、ＰＣＲ反応のために使用されるフォワードおよびリバースプライマーの間に位置する。メチル化感受性の制限エンドヌクレアーゼ認識配列の中のＣ塩基がメチル化されていない場合には、エンドヌクレアーゼはＤＮＡ鋳型を切断し、ＤＮＡがＰＣＲ反応において鋳型として使用されるときにＰＣＲ生成物は形成されない。メチル化感受性の制限エンドヌクレアーゼ認識配列の中のＣ塩基がメチル化される場合には、エンドヌクレアーゼはＤＮＡ鋳型を切断せず、ＤＮＡがＰＣＲ反応において鋳型として使用されるときにＰＣＲ生成物が形成される。したがって、Ｃ塩基のメチル化は、ＰＣＲ生成物の不在または存在によって判定することができる（Kaneら、１９９７年、Cancer Res、５７巻：８０８～１１頁）。特定の実施形態では、この技術において、亜硫酸水素ナトリウムは使用されない。
ＤＮＡのメチル化を検出するさらに別の例示的方法は、改変ＭＳＰと呼ばれ、この方法は、化合物変換鋳型配列がＣｐＧジヌクレオチドまたはＵｐＧジヌクレオチドを含有するかどうかによって、ＭＳＰ反応の生成物が制限エンドヌクレアーゼによる消化に感受性であるように設計され、選択されるプライマーを利用する。
ＤＮＡのメチル化を検出するためのさらに他の方法には、ＭＳ－ＳｎｕＰＥ方法が含まれる。この方法は、化合物変換鋳型がＣｐＧジヌクレオチドまたはＵｐＧジヌクレオチドを含有するかどうかによって使用されるプライマーが生成物を生成する、プライマー伸長反応における鋳型として化合物変換ＤＮＡを使用する（例えば、Gonzalgoら、１９９７年、Nucleic Acids Res.、２５巻：２５２９～３１頁を参照）。
ＤＮＡのメチル化を検出する別の例示的な方法は、ＣＯＢＲＡ（すなわち、組み合わせた亜硫酸水素塩制限分析）と呼ばれる。この方法はＤＮＡメチル化検出のために日常的に使用され、当技術分野で周知である（例えば、Xiongら、１９９７年、Nucleic Acids Res、２５巻：２５３２～４頁を参照）。この技術では、認識配列の中のＣ塩基がメチル化されているならば、メチル化感受性の制限エンドヌクレアーゼはＤＮＡの中の特異的配列を認識し、切断する。制限エンドヌクレアーゼの認識配列の中のＣ塩基がメチル化されていないならば、ＤＮＡは切断されない。一部の実施形態では、本方法はメチル化感受性の制限エンドヌクレアーゼを利用する。
ＤＮＡのメチル化を検出する別の例示的な方法は、メチル化鋳型に由来する配列にハイブリダイズするプローブを含むアレイへの、化合物変換ＤＮＡのハイブリダイゼーションを必要とする。
ＤＮＡのメチル化を検出する別の例示的な方法は、メチル化ＤＮＡに結合する抗体またはメチル化ＤＮＡに結合する他のタンパク質によるメチル化ＤＮＡの沈殿、および、次に、沈殿中のＤＮＡ配列の検出を含む。ＤＮＡの検出は、ＰＣＲに基づく方法によって、アレイへのハイブリダイゼーションによって、または当業者に公知である他の方法によって実行することができる。
ＤＮＡのメチル化を検出する別の例示的方法は、亜硫酸水素塩で変換されたＤＮＡに関して実行される定量的対立遺伝子特異的リアルタイム標的およびシグナル増幅（ＱｕＡＲＴＳ）（例えば、Zou et al., 2012, Clin. Chem., 58:375-83を参照されたい）によるものである。
ＤＮＡのメチル化を検出する別の例示的方法は、メチル化によって改変されたＤＮＡ塩基を直接的に検出することができる単一分子リアルタイムシーケンシング（ＳＭＲＴ）およびＤＮＡのナノポアベースのシーケンシング（例えば、Beaulerier et al., Nat Rev Genet, 2019, 20:157-172.を参照されたい）によるものである。ＳＭＲＴは、一部の例では、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＰａｃＢｉｏ）によって製造された機器（例えば、https://www.pacb.com/smrt-science/smrt-sequencing/epigenetics/を参照されたい）で実行することができる。
メチル化ＤＮＡを検出する別の例示的な方法は、メチル化および非メチル化鋳型に由来する変換されたＤＮＡを増幅するメチル化に無関係なＰＣＲプライマーを使用した、亜硫酸水素塩で変換されたＤＮＡの標的領域の増幅を含む亜硫酸水素塩配列決定である。メチル化に無関係なプライマーは、メチル化に無関係でありかつ亜硫酸水素塩に特異的であるように、すなわち亜硫酸水素塩で変換された標的ＤＮＡだけを増幅し、非変換標的配列を増幅しないように、しばしば設計される。一部の実施形態では、増幅されたＤＮＡは、次に、元の鋳型の中の各シトシン塩基を、メチル化の存在（シトシンの保持）またはメチル化の不在（チミジンへの変換）について各ＤＮＡ配列リードの中で評価することを可能にする次世代配列決定方法によって特徴付けることができる。チミジンに変換されることに対してシトシンがシトシンとして保存されるＤＮＡリードのパーセントによって、元の鋳型における各シトシン塩基のメチル化のパーセントを次に計算することができる。同様に、個々のＤＮＡリードにおいて領域をメチル化または非メチル化として評価するための規則を判定し（すなわち、領域を「メチル化された」に分類する領域中のメチル化のためのカットオフを判定し）、次に、その領域がメチル化されたことが認められるＤＮＡリードのパーセントを判定することによって、目的領域にわたるメチル化のパーセントを評価することができる。
ある特定の実施形態では、本開示は、化合物変換鋳型配列がＣｐＧジヌクレオチドまたはＵｐＧジヌクレオチドを含有するかを判定するために、ＭＳＰ反応からもたらされる生成物を直接的に配列決定することを含む方法を提供する。ＰＣＲ生成物を直接的に配列決定することなどの分子生物学技術は、当技術分野で周知である。
一部の実施形態では、ＤＮＡのメチル化は、全ＤＮＡの百分率として測定することができる。高レベルのメチル化は、１～１００％のメチル化、例えば、１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％のメチル化であってよい。低レベルのメチル化は、０％～０．９９％のメチル化、例えば、０％、０．１％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％であってよい。少なくとも一部の正常組織、例えば、正常な食道試料は、いかなる検出可能なメチル化も有しないかもしれない。
一部の実施形態では、本明細書中に開示される保存溶液のいずれか中で保存されたメチル化ＤＮＡは、例えば、腫瘍サプレッサー遺伝子として機能することができるポリペプチドをコードしてもよい。したがって、本出願は、試料中のそのようなポリペプチドを検出するための方法をさらに提供する。一部の実施形態では、本開示は、患者が疾患状態を有するかまたは有しないかを判定するためにそのようなポリペプチドをアッセイすることによる検出方法を提供する。さらに、そのような疾患状態は、そのようなポリペプチドの低下したレベルによって特徴付けることができる。ある特定の実施形態では、本開示は、そのようなポリペプチドを検出することによって患者ががんを有する可能性があるかまたはないかを判定するための方法を提供する。さらなる実施形態では、本開示は、患者が再発を起こしているかどうかを判定するための、または患者のがんが処置に応答しているかどうかを判定するための方法を提供する。
必要に応じて、そのような方法は、試料中のタンパク質の定量的測定を得ることを含む。この明細書を考慮すると、当業者は、タンパク質の存在を検出し、必要に応じて定量化するために用いることができる広範囲の技術を認識する。一部の実施形態では、タンパク質は抗体で検出される。多くの実施形態では、抗体に基づく検出アッセイは、対応するエピトープを有するタンパク質に抗体が結合する機会を有するように、試料および抗体を接触させることを含む。多くの実施形態では、抗体に基づく検出アッセイは、抗体－エピトープ複合体の存在を検出し、それによって対応するエピトープを有するタンパク質の存在の検出を達成するための系も一般的に含む。抗体は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降、ウエスタンブロットを含む、様々な検出技術において使用することができる。タンパク質を同定するための抗体非依存性技術を用いることもできる。例えば、質量分析は、特に液体クロマトグラフィーと一緒に、試料中の多数のタンパク質の検出および数量化を許す。タンパク質を同定するために二次元ゲル電気泳動を使用することもでき、質量分析または他の検出技術、例えばＮ末端タンパク質配列決定と併用することができる。目的のタンパク質のための特異的結合を有するＲＮＡアプタマーを生成して、検出試薬として使用することもできる。試料は、用いる検出系と一貫している方法で一般的に調製するべきである。例えば、タンパク質検出系において使用される試料は、プロテアーゼの不在下で一般的に調製するべきである。同様に、核酸検出系において使用される試料は、ヌクレアーゼの不在下で一般的に調製するべきである。多くの場合には、抗体に基づく検出系で使用するための試料は、実質的な調製ステップに付されない。例えば、唾液および血液がそうであるように、尿を直接的に使用することができるが、ある特定の実施形態では、血液は、血漿および血清などの画分に分離される。
ある特定の実施形態では、本開示の方法は、本明細書に開示される保存溶液のいずれかにおいて保存される試料のいずれかにおいて、ｍＲＮＡなどの発現される核酸の存在を検出することを含む。必要に応じて、本方法は、試料中の発現される核酸の定量的測定を得ることを含む。この明細書を考慮すると、当業者は、核酸の存在を検出し、必要に応じて定量化するために用いることができる広範囲の技術を認識する。核酸検出系は、試料の精製された核酸画分を調製し、その試料を直接検出アッセイまたは増幅工程とそれに続く検出アッセイに付すことを一般的に含む。増幅は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素（ＲＴ）および共役ＲＴ－ＰＣＲによって達成することができる。核酸の検出は、目的の核酸にハイブリダイズするプローブによって精製された核酸画分を探索することによって一般的に達成され、多くの場合には、検出は増幅を同様に含む。ノーザンブロット、ドットブロット、マイクロアレイ、定量的ＰＣＲおよび定量的ＲＴ－ＰＣＲの全ては、試料中の核酸を検出するための周知の方法である。
ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書中に開示される保存試料のいずれか中で保存された試料のいずれかに由来する核酸のいずれかに特異的に結合する核酸プローブを提供する。一部の実施形態では、本開示は、本明細書中に開示される保存試料のいずれか中で保存された試料のいずれかに由来するＤＮＡ（必要に応じて、亜硫酸水素塩などの試薬で前処理されてもよい）から増幅された核酸に特異的に結合する核酸プローブを提供する。そのようなプローブは、例えば、蛍光性部分、放射性核種、酵素または親和性タグ、例えばビオチン部分で標識されてもよい。例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）系は、プローブが溶液中に遊離しているときに蛍光性シグナルがクエンチされ、プローブがより大きな核酸に組み込まれるときに明るいような方法で標識される核酸プローブを用いる。
がんを検出および／または診断するために、メチル化ＤＮＡ（例えば、本明細書に記載されている保存溶液のいずれか中で保存されたメチル化ＤＮＡ）、またはメチル化ＤＮＡのアンプリコン（または、例えば、亜硫酸水素塩で前処理されたＤＮＡのアンプリコン）に向けられるモノクローナル抗体を使用した免疫シンチグラフィを使用することができる。例えば、９９テクネチウム、１１１インジウム、１２５ヨウ素で標識されたメチル化された標的遺伝子（またはその亜硫酸水素塩で変換されたアンプリコン）に対するモノクローナル抗体を、そのような画像化のために効果的に使用することができる。当業者に明らかであるように、投与される放射性同位体の量は放射性同位体に依存する。当業者は、活性部分として使用される所与の放射性核種の比活性およびエネルギーに基づいて、投与される画像化剤の量を容易に製剤化することができる。一般的に、画像化剤の１用量につき０．１～１００ミリキューリー、１～１０ミリキューリーまたはしばしば２～５ミリキューリーが投与される。したがって、放射性部分にコンジュゲートされる標的化部分を含む画像化剤として有益な本発明による組成物は、０．１～１００ミリキューリー、一部の実施形態では１～１０ミリキューリー、一部の実施形態では２～５ミリキューリー、一部の実施形態では１～５ミリキューリーを含む。
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に開示される標的遺伝子、またはその断片もしくは相補体のいずれかのメチル化状態を検出するのに有益なデバイスを提供する。一部の実施形態では、本開示は、本明細書に開示される標的遺伝子、またはその断片もしくは相補体のメチル化状態を検出するのに有益な構成要素を含むキットを提供する。一部の実施形態では、キットは、対象から食道試料を収集するための嚥下可能なバルーンを含む。一部の実施形態では、キットは、本明細書に完全に組み込まれる、公開された米国出願２０１６／３１７１３２に開示される嚥下可能なバルーンデバイスのいずれかを含む。一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載される標的遺伝子のいずれかを増幅するためのプライマー、および本明細書に開示される方法のいずれかを実行するための説明書を含むキットを提供する。一部の実施形態では、キットは亜硫酸水素塩をさらに含む。一部の実施形態では、キットは、対象から試料を収集するのに好適な物体をさらに含む（例えば、ブラシおよびまたはバルーン）。一部の実施形態では、本開示は、本明細書に開示される治療剤のいずれか、および本明細書に開示される治療方法のいずれかを実行するための説明書を含むキットを提供する。
様々なアッセイフォーマットを使用することができるが、本開示に照らして、本明細書に明示的に記載されないものが、それにもかかわらず当技術分野の通常の技術の範囲内にあると考えられる。アッセイフォーマットは、そのような状態をタンパク質発現レベル、ヌクレオチド配列のメチル化状態、腫瘍抑制活性で近似させることができ、多くの異なる形態で生成することができる。多くの実施形態では、本開示は、無細胞系を含むアッセイおよびインタクトな細胞を利用する細胞に基づくアッセイを提供する。
一部の実施形態では、本開示は、対象からの試料中の標的遺伝子が参照標的遺伝子よりもメチル化されているかどうかを判定することによって、新生物（例えば、食道がん）または異形成（例えば、バレット食道）を有する対象を診断する方法を提供する。一部の実施形態では、対象は、標的遺伝子が参照標的遺伝子と比較して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％多くメチル化されている場合、新生物または異形成を有することが判定される。一部の実施形態では、参照標的遺伝子は、健康な対照対象に由来する。
一部の実施形態では、本開示は、内視鏡などの処置または診断手法を受ける対象を選択するための方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、食道異形成（例えば、バレット食道）または新生物（例えば、食道がん）を保有するリスクの増加した対象を同定することによって、内視鏡を受ける対象を選択するための方法を提供する。
診断に加えて、異形成または新生物（例えば、上部胃腸管の）を有することが知られていない対象からの試料中のマーカーのアッセイは、対象にとって予後診断であり得る（すなわち、疾患の可能な経過を示す）。実例を示すと、上部胃腸管の異形成または新生物を起こす素因を有する対象は、メチル化ヌクレオチド配列を有する可能性がある。対象からの試料中のメチル化された標的遺伝子（例えば、ビメンチンおよび／またはＣＣＮＡ１）のアッセイは、例えば対象の上部胃腸管の新生物または異形成に対して特に有効である特定の療法または複数の療法を選択するために、または有効でない可能性がある療法を除外するために使用することもできる。
がんを有するかまたは有していたことが知られている対象からの試料中のメチル化された標的遺伝子（例えば、ビメンチンおよび／またはＣＣＮＡ１）のアッセイも、有益である。例えば、本方法は、ある特定の対象のために療法が有効であるかどうかを同定するために使用することができる。１つまたは複数の試料を以下の療法の前におよびその後に同じ対象からとり、本明細書中に開示される保存溶液のいずれか中に保存し、標的遺伝子のメチル化パターンをアッセイする。療法の前にとられた試料において標的遺伝子がメチル化されており、療法の後に存在しない（または、より低いレベルである）との知見は、療法が有効で、変更する必要がないことを示している可能性がある。療法の前にとられた試料および療法の後にとられた試料において標的遺伝子がメチル化されている場合には、対象においてがんが低減される可能性を増加させるために療法を変更することが望ましいかもしれない。したがって、本方法は、療法への患者の応答を判定するために使用される、より侵襲性の手法を実行する必要性を不要にすることができる。
進行がん患者では、療法の後にがんは頻繁に再発する。この場合および他の場合には、本発明のアッセイは、本明細書中に開示される標的遺伝子のいずれかに位置する遺伝子のサイレンシングに関連するがんの状態を経時的にモニタリングするのに有益である。一部の実施形態では、がんが進行している対象では、第１の試料をとるときに一部または全ての試料においてＤＮＡメチル化がなく、その後、第２の試料をとるときに１つまたは複数の試料において出現することがある。一部の実施形態では、がんが退行している対象では、第１の試料をとるときにＤＮＡメチル化が１つまたはいくつかの試料に存在し、その後、第２の試料をとるときにこれらの試料の一部または全部において存在しないことがある。
本明細書に記載の方法は、正確さおよびＤＮＡメチル化アッセイの正確さの増加を助ける。ある特定の実施形態では、本発明は、ＤＮＡメチル化アッセイの正確さを増加させる方法であって、対象から試料を得るステップと；試料を保存溶液（例えば、本明細書に開示された保存溶液）で処置するステップと；試料をアッセイして目的の核酸配列におけるＤＮＡメチル化パターンを決定するステップとを含み、保存溶液による処置がメチル化アッセイの正確さを増加させる、方法を提供する。前述の方法のある特定の実施形態では、誤診の割合が低減される。ある特定の実施形態では、試料は食道試料である。特定のこのような実施形態では、試料は、食道を、細胞ブラシまたはバルーンと接触させることにより得られる。前述の方法のある特定の実施形態では、目的の核酸配列は、ビメンチン遺伝子またはＣＣＮＡ１遺伝子、またはその断片である。
例示
本発明をここで一般的に説明したが、さらに以下の実施例を参照してより容易に理解される。しかしながらこのような実施例は、本発明のある特定の態様および実施形態を単に例示するために記載され、本発明を限定するものではない。
（実施例１）
これらの研究は、Moinova et al. Science translational medicine. 2018;10(424)の公開された研究において特定されているビメンチン（ＶＩＭ）遺伝子座およびＣＣＮＡ１（ＣＣＮＡ１）遺伝子座におけるＤＮＡメチル化のアッセイに関する。Ｈ１９７５（非小肺がん細胞系、完全にメチル化陰性のＶＩＭおよびＣＣＮＡ１、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－５９０８（商標）から入手可能）およびＳＫＧＴ４（食道がん細胞系、完全にメチル化陽性のＶＩＭおよびＣＣＮＡ１、Ｓｉｇｍａから入手可能、カタログ番号１１０１２００１－１ＶＬ、ＥＣＡＣＣに由来する）を使用して、標的量のメチル化細胞および非メチル化細胞を含有する開始ミックスを作成した。両細胞系を、推奨される細胞培養ガイドラインに従って、１０％のＦＢＳを補充したＲＰＭＩ培地中で成長させた。
実験０日目に、細胞をＴｒｉｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ酵素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１２６０４０１３）を用いて回収し、スピンダウンさせてトリプシンを除去し、計数し、標準的な成長培地中で１×１０６細胞／ｍｌとなるように再懸濁させた。１％のメチル細胞系ミックスを作成するために、１部の１×１０６細胞／ｍｌのＳＫＧＴ４細胞を９９部の１×１０６細胞／ｍｌのＨ１９７５と混合させた。０．５％のメチルミックスを作製するために、１％のミックスを、等体積の１％のミックスと１×１０６細胞／ｍｌのＨ１９７５非メチル化細胞系とを混合することによって、１：２に希釈した。純粋なＨ１９７５は０％のメチル細胞系に相当する。
実験ごとに個々の試料を作成するために、２ｍｌの細胞ミックス（合計２×１０６個の細胞）を、各実験の実験計画に従って、１５ｍｌまたは５０ｍｌのコニカルチューブ中にアリコートした。１５ｍｌのコニカルチューブを小体積の緩衝剤固定に使用し、５０ｍｌのコニカルチューブを大体積の実験に使用した（実験概要を参照されたい）。２つの独立した複製を各実験の各条件に対して使用した。
細胞アリコートを１２００ｒｐｍで３分間スピンダウンさせた。培地を除去した後、細胞を固定緩衝剤中に再懸濁させた（各実験において使用した緩衝剤体積については実験概要を参照されたい）。一部の実験では、医療用シリコーンバルーンを、バルーンを細胞を含む緩衝剤中に落とすことによって、細胞と緩衝剤とのミックスに添加した。次いで、試料を、表示した温度で表示した期間（実験概要を参照されたい）、それぞれの緩衝剤中でインキュベートした。
所要のインキュベーション時間後に、細胞をスピンダウンさせ、固定緩衝剤を除去し、細胞ペレットを、２０μｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを含む１８０μｌの緩衝剤ＡＴＬ中に再懸濁させた。ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号／ＩＤ：６９５０６）を使用して、ＤＮＡ抽出を行った。
細胞を溶解した固定緩衝剤（ＤＮＡ／ＲＮＡ ｓｈｉｅｌｄ）の場合には、プロテイナーゼＫをスピンステップなしで溶解緩衝剤に直接添加した。プロテイナーゼＫ、およびその後のキット試薬（緩衝剤ＡＬおよびエタノール）の量を比例的に増加させ、非溶解保存剤と共に使用される２００μｌの緩衝剤ＡＴＬと比較して、５倍多くの固定溶解緩衝剤が存在するという事実を説明した。
使用される保存剤にかかわらず、カラム洗浄ステップとＤＮＡ溶出ステップは同一であった。ＤＮＡを１００μｌのキットの溶出緩衝剤中でカラムから溶出させた。１μｌのＤＮＡを使用し、Ｑｕｂｉｔを使用してＤＮＡ濃度を定量した。
ＰＣＲごとに５０ｎｇの出発ＤＮＡインプットを目的として亜硫酸水素変換を設定した。例えば、ＶＩＭに対して４回の複製ＰＣＲ、およびＣＣＮＡに対して４回の複製ＰＣＲを行う場合、亜硫酸水素変換におけるＤＮＡの総量は５０×８＝４００ｎｇのＤＮＡであった。
Moinova et al.に公開された方法の通りに、亜硫酸水素変換、ＰＣＲ、ライブラリー調製、および配列決定を実施した。
Figure 2023529314000006
Figure 2023529314000007
Figure 2023529314000008
試験した緩衝剤調製物：
ＮＡＰ緩衝剤（Preservation of RNA and DNA from mammal samples under field conditions. Camacho-Sanchez M1,Burraco P,Gomez-Mestre I,Leonard JA. Mol Ecol Resour.2013 Jul;13(4):663-73. doi: 10.1111/1755-0998.12108. Epub 2013 Apr 26）
ＮＡＰ緩衝剤は、０．０１９Ｍのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）二水素二ナトリウム二水和物、０．０１８Ｍのクエン酸ナトリウム三ナトリウム塩二水和物（ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ ｄｉｈｙｄｒａｔｅ）、３．８Ｍの硫酸アンモニウムからなり、Ｈ２ＳＯ４でｐＨ５．２に調整した。
ＥＤＴＡ、クエン酸ナトリウム三ナトリウム塩二水和物、および硫酸アンモニウムならびにおよそ７００ｍＬの水をメスフラスコ中で組み合わせることによって、ＮＡＰ緩衝剤を調製した。溶液を、硫酸アンモニウムが完全に溶解するまで、およそ１時間、低熱から中熱で撹拌した。次いで、溶液を室温に冷却し、次いで、Ｈ２ＳＯ４（約２００～４００μｌを必要とし、ｐＨを測定しながら滴下添加する）でｐＨを５．２に調整し、濾過し、室温で保存するか、または冷蔵で保った。
５０％のメタノール
５００ｍｌの過酸化物を含まないメタノールと５００ｍｌのＵｌｔｒａＰｕｒｅ ＤＮＡｓｅ／ＲＮａｓｅを含まない蒸留水を合わせた。
５０％のメタノール／１６ｍＭのＥＤＴＡ
５００ｍｌの過酸化物を含まないメタノールと３２ｍＭのＥＤＴＡ ５００ｍｌを合わせた。
３２ｍＭのＥＤＴＡを作製するために、０．５ＭのＥＤＴＡ ３２ｍｌ（３２４５０４－５００ＭＬ ＥＤＴＡ、５００ｍＭの溶液、ｐＨ８．０、ＵＬＴＲＯＬ Ｇｒａｄｅ－ＣＡＳ ６０－００－４－Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）をＵｌｔｒａＰｕｒｅというＤＮＡｓｅ／ＲＮａｓｅを含まない蒸留水で５００ｍｌに希釈した。
５０％のメタノール／ＴＥ（１０ｍＭのｔｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ）
５００ｍｌの過酸化物を含まないメタノール；５０ｍｌの２０×ＴＥ（ｐＨ７．５、ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅを含まない）；および４５０ｍｌのＵｌｔｒａＰｕｒｅというＤＮＡｓｅ／ＲＮａｓｅを含まない蒸留水を合わせた。最終条件：５０％のメタノール、１０ｍＭのｔｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４
５０％のメタノール／ＴＥ／プラス２５ｍｇ／ＬのＢＨＴ
１００ｍｌを作製するために、２５μｌのＢＨＴストックを５０％のメタノール／ＴＥ １００ｍｌ（上記を参照されたい）に添加した。
１ｇのＢＨＴ（Ｓｉｇｍａ カタログ番号Ｂ１３７８－１００Ｇ）を１００％のメタノール１０ｍｌに溶解させることによって、１００ｇ／ＬのＢＨＴストックを調製した。４℃で保存した。
５０％のメタノール／ＴＥ／プラス１００ｍｇ／ＬのＢＨＴ
１００ｍｌを作製するために、１００μｌのＢＨＴストックを５０％のメタノール／ＴＥ １００ｍｌ（上記を参照されたい）に添加した。
１ｇのＢＨＴ（Ｓｉｇｍａ カタログ番号Ｂ１３７８－１００Ｇ）を１００％のメタノール １０ｍｌに溶解させることによって、１００ｇ／ＬのＢＨＴストックを調製した。４℃で保存した。
５０％のメタノール／１０ｍＭのＴｒｉｓ
５００ｍｌの過酸化物を含まないメタノール；１ＭのＴｒｉｓ １０ｍｌ（ｐＨ８、ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅを含まない、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ カタログ番号ＡＭ９８５５Ｇ）；および４９０ｍｌのＵｌｔｒａＰｕｒｅというＤＮＡｓｅ／ＲＮａｓｅを含まない蒸留水を合わせた。調製後に緩衝剤のｐＨをチェックし、それが７．５より高いが８．０以下であることを確認した。室温で保存した。
５０％のメタノール／１０ｍＭのＴｒｉｓ／プラス２５ｍｇ／ＬのＢＨＴ
１００ｍｌを作製するために、２５μｌのＢＨＴストックを５０％のメタノール／１０ｍＭのＴｒｉｓ １００ｍｌ（上記を参照されたい）に添加した。調製後に緩衝剤のｐＨをチェックし、それが７．５より高いが８．０以下であることを確認した。室温で保存した。
１ｇのＢＨＴ（Ｓｉｇｍａ カタログ番号Ｂ１３７８－１００Ｇ）を１００％のメタノール １０ｍｌに溶解させることによって、１００ｇ／ＬのＢＨＴストックを調製した。４℃で保存した。
５０％のメタノール／１０ｍＭのＴｒｉｓ／プラス１００ｍｇ／ＬのＢＨＴ
１００ｍｌを作製するために、１００μｌのＢＨＴストックを５０％のメタノール／１０ｍＭのＴｒｉｓ １００ｍｌ（上記を参照されたい）に添加した。調製後に緩衝剤のｐＨをチェックし、それが７．５より高いが８．０以下であることを確認した。室温で保存した。
１ｇのＢＨＴ（Ｓｉｇｍａ カタログ番号Ｂ１３７８－１００Ｇ）を１００％のメタノール １０ｍｌに溶解させることによって、１００ｇ／ＬのＢＨＴストックを調製した。４℃で保存した。
図１は、表示した保存剤中で固定された試料から回収したＤＮＡ量を提供する。この図は、実験Ｄ、Ｅ、およびＦにおいて処理された試料由来のｎｇでの総ＤＮＡ収量の概要である。０日の時点（白抜きの記号）、および２１日の時点（黒塗りの記号）で採取した試料に関して、実験Ｄ（丸）、実験Ｅ（三角）および実験Ｆ（菱形）に関する値を示す。この図では、５０％のＭｅＯＨは、５０％のメタノールであり；５０％のＭｅＯＨ／１０ｍＭのＴｒｉｓは５０％のメタノール／１０ｍＭのＴｒｉｓであり；５０％のＭｅＯＨ／１０ｍＭのＴｒｉｓ ＢＨＴ１００は、５０％のメタノール／１０ｍＭのＴｒｉｓ＋１００ｍｇ／ＬのＢＨＴであり；５０％のＭｅＯＨ／１０ｍＭのＴｒｉｓ ＢＨＴ２５は、５０％のメタノール／１０ｍＭのＴｒｉｓ＋２５ｍｇ／ＬのＢＨＴであり；５０％のＭｅＯＨ－ＥＤＴＡは、５０％のメタノール／１６ｍＭのＥＤＴＡであり；５０％のＭｅＯＨ－ＴＥは、５０％のメタノール／ＴＥであり；５０％のＭｅＯＨ－ＴＥ ＢＨＴ１００は、５０％のメタノール／ＴＥ＋１００ｍｇ／ＬのＢＨＴであり；５０％のＭｅＯＨ－ＴＥ ＢＨＴ２５は、５０％のメタノール／ＴＥ＋２５ｍｇ／ＬのＢＨＴであり；凍結とは、いずれの緩衝剤も添加せずに－８０℃で凍結された細胞ペレットを指し；ＮＡＰは、上記のようなＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ緩衝剤を指し；ＮＡＰ洗浄とは、ＤＮＡ抽出のための緩衝剤ＡＴＬを添加する前にＰＢＳで洗浄した、ＮＡＰ緩衝剤中で固定された細胞を指し；Ｓｈｉｅｌｄは、Ｚｙｍｏ ＲｅｓｅａｒｃｈからのＤＮＡ／ＲＮＡ ｓｈｉｅｌｄ緩衝剤を指す。
図１のデータは、凍結細胞からと比較して、２１日間のインキュベーション後に細胞から回収されるＤＮＡ量が少ないために、ＮＡＰ緩衝剤が作用していないことを示す。ＴＥを含有するメタノール緩衝剤も、２１日後のＤＮＡ回収量が低下した。メタノール／Ｔｒｉｓ緩衝剤中で２１日間インキュベートした細胞は、ＤＮＡ収量に関して凍結細胞に最も近かった。ＢＨＴの緩衝剤への添加は、使用した濃度にかかわらず、ＤＮＡ収量への効果を有さないようであった。Ｓｈｉｅｌｄ緩衝剤中でインキュベートした細胞は、凍結細胞よりも低いＤＮＡ収量を有した。
図２および３は、実験Ｄからの様々な緩衝剤中で固定された細胞におけるメチル化レベルアッセイの結果を提供する。ＶＩＭおよびＣＣＮＡ１のメチル化の結果は、それぞれ、図２および３に示される。これらの図では、ミックス比は、それぞれ、０％（白抜きの丸）、０．５％（四角）および１％（黒塗りの丸）のメチル化された細胞系を含むインプット細胞系ミックスを指す。メチル化シグナルの出力（フラクション）はＹ軸上に示されているが、Ｘ軸には様々な緩衝剤が表示されている。図２および３では、５０％のＭｅは、５０％のメタノールであり；５０％のＭｅ－ＥＤＴＡは、５０％のメタノール／１６ｍＭのＥＤＴＡであり；凍結とは、いずれの緩衝剤も添加せずに－８０℃で凍結された細胞ペレットを指し；ＮＡＰは、上記のＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ緩衝剤を指し；ＮＡＰ洗浄とは、ＤＮＡ抽出のための緩衝剤ＡＴＬを添加する前にＰＢＳで洗浄した、ＮＡＰ緩衝剤中で固定された細胞を指し；Ｓｈｉｅｌｄは、Ｚｙｍｏ ＲｅｓｅａｒｃｈからのＤＮＡ／ＲＮＡ ｓｈｉｅｌｄ緩衝剤を指す。
図２および３のデータは、緩衝剤中でのインキュベーションの２１日目に、凍結された細胞に対して緩衝剤中でインキュベートされた細胞においてメチル化シグナルが多少増加し、この増加が、分析されたマーカーおよび使用された緩衝剤に応じて変化したことを示す。ＶＩＭ（図２）では、５０％のメタノールが凍結（保存剤なし）試料に最も近い働きをした。ＥＤＴＡの５０％のメタノールへの追加によって、緩衝剤中で２１日間インキュベートした細胞において人為的なＶｉｍのメチル化が増加した。
図４および５は、実験Ｅからの様々な緩衝剤中で固定された細胞におけるメチル化レベルアッセイの結果を提供する。ＶＩＭおよびＣＣＮＡ１のメチル化の結果は、それぞれ、図４および５に示される。これらの図では、ミックス比は、それぞれ、０％（白抜きの丸）、０．５％（四角）および１％（黒塗りの丸）のメチル化された細胞系を含むインプット細胞系ミックスを指す。メチル化シグナルの出力（フラクション）はＹ軸上に示されているが、Ｘ軸には様々な緩衝剤が表示されている。図４および５では、５０％のＭｅは、５０％のメタノールであり；５０％のＭｅ－ＴＥは、５０％のメタノール／ＴＥであり；５０％のＭｅ－ＴＥ ＢＨＴ１００は、５０％のメタノール／ＴＥ＋１００ｍｇ／ＬのＢＨＴであり；５０％のＭｅ－ＴＥ ＢＨＴ２５は、５０％のメタノール／ＴＥ＋２５ｍｇ／ＬのＢＨＴであり；凍結とは、いずれの緩衝剤も添加せずに－８０℃で凍結された細胞ペレットを指す。
図４および５のデータは、２１日目に、メチル化シグナルが多少増加し、この増加が、分析されたマーカーおよび使用された緩衝剤に応じて変化したことを示す。ＶＩＭ（図４）では、５０％のメタノールおよびメタノール－ＴＥ緩衝剤は、凍結試料中で観察されたアウトプットよりも高いシグナルをもたらす。ＣＣＮＡ１（図５）では、ＴＥを含んだ緩衝剤はすべて、シグナルに関して特に有害な作用を示し、これは、これらの緩衝剤配合物において見られる特に低いＤＮＡ収量に関連している（図１参照）。図５では、ｔｒｉｓおよびＥＤＴＡを含む５０％のメタノール中でインキュベートした２１日目の試料のＣＣＮＡ１に関するデータの非存在、ならびにｔｒｉｓおよびＥＤＴＡおよび１００ｍｇ／ＬのＢＨＴを含む５０％のメタノール中でインキュベートした２１日目の試料に関するデータの低減は、いずれの場合も、これらの緩衝剤条件下でインキュベートした試料から得られたＣＣＮＡ１に対して整列させたリードの顕著な低減を反映している。
図６および７は、実験Ｆからの様々な緩衝剤中で固定された細胞におけるメチル化レベルアッセイの結果を提供する。ＶＩＭおよびＣＣＮＡ１のメチル化の結果は、それぞれ、図６および７に示される。これらの図では、ミックス比は、それぞれ、０％（白抜きの丸）、０．５％（四角）および１％（黒塗りの丸）のメチル化された細胞系を含むインプット細胞系ミックスを指す。メチル化シグナルの出力（フラクション）はＹ軸上に示されているが、Ｘ軸には様々な緩衝剤が表示されている。図６および７では、５０％のＭｅは、５０％のメタノールであり；５０％のＭｅ－ＴＥは、５０％のメタノール／ＴＥであり；５０％のＭｅ－ＴＥ ＢＨＴ１００は、５０％のメタノール／ＴＥ＋１００ｍｇ／ＬのＢＨＴであり；５０％のＭｅ－ＴＥ ＢＨＴ２５は、５０％のメタノール／ＴＥ＋２５ｍｇ／ＬのＢＨＴであり；５０％のＭｅ－Ｔｒｉｓは、５０％のメタノール／１０ｍＭのＴｒｉｓであり；５０％のＭｅ－Ｔｒｉｓ ＢＨＴ１００は、５０％のメタノール／１０ｍＭのＴｒｉｓ＋１００ｍｇ／ＬのＢＨＴであり；５０％のＭｅ－Ｔｒｉｓ ＢＨＴ２５は、５０％のメタノール／１０ｍＭのＴｒｉｓ＋２５ｍｇ／ＬのＢＨＴであり；凍結とは、いずれの緩衝剤も添加せずに－８０℃で凍結された細胞ペレットを指す。
図６および７のデータは、２１日目に、ＢＨＴを含むかまたは含まない５０％のＭｅＯＨ－Ｔｒｉｓ緩衝剤が、ＶＩＭ（図６）およびＣＣＮＡ１（図７）の両方に関して、ＤＮＡメチル化の忠実度を維持する際に凍結試料に最も近い働きをした。ＢＨＴの存在は、メチル化シグナルの大きさに影響を及ぼさないようであったが、その変動を減少させた可能性がある。このデータによって、ＥＤＴＡを含有する（すなわち、ＴＥを含有する）すべての緩衝剤がＤＮＡメチル化のより大きな増加を示したことが確認された。これらの結果は、実験ＤおよびＥにおいても見られた（図２～５）。
図８および９は、実験Ｄ、Ｅ、およびＦからの様々な緩衝剤中で固定された細胞におけるメチル化レベルアッセイの結果を提供する。ＶＩＭおよびＣＣＮＡ１のメチル化の結果は、それぞれ、図８および９に示される。これらの図における結果は、メタノールを、実験Ｄ、Ｅ、およびＦからのメタノール－ＴＥを含有する緩衝剤と比較するためのデータを特異的に抽出し、比較を容易にするために同じグラフ上にこれらを並べて表示する。これらの図では、ミックス比は、それぞれ、０％（白抜きの丸）、０．５％（四角）および１％（黒塗りの丸）のメチル化された細胞系を含むインプット細胞系ミックスを指す。メチル化シグナルの出力（フラクション）はＹ軸上に示されているが、Ｘ軸には様々な緩衝剤が表示されている。図８および９では、５０％のＭｅは、５０％のメタノールであり；５０％のＭｅ－ＴＥは、５０％のメタノール／ＴＥであり；５０％のＭｅ－Ｔｒｉｓは、５０％のメタノール／１０ｍＭのＴｒｉｓであり；凍結とは、いずれの緩衝剤も添加せずに－８０℃で凍結された細胞ペレットを指す。
図８および９のデータは、ＥＤＴＡを含む（すなわち、ＴＥを含有する）すべての緩衝剤が２１日間のインキュベーション後に細胞のメチル化のより大きな増加を示すという所見を強調する。
図１０および１１は、実験ＥおよびＦからの様々な緩衝剤中で固定された細胞におけるメチル化レベルアッセイの結果を提供する。ＶＩＭおよびＣＣＮＡ１のメチル化の結果は、それぞれ、図１０および１１に示される。これらの図における結果は、メタノールを、実験ＥおよびＦからのメタノール－ＴＥを含有する緩衝剤と比較するためのデータを特異的に抽出し、比較を容易にするために同じグラフ上にこれらを並べて表示する。これらの図では、ミックス比は、それぞれ、０％（白抜きの丸）、０．５％（四角）および１％（黒塗りの丸）のメチル化された細胞系を含むインプット細胞系ミックスを指す。メチル化シグナルの出力（フラクション）はＹ軸上に示されているが、Ｘ軸には様々な緩衝剤が表示されている。図１０および１１では、５０％のＭｅは、５０％のメタノールであり；５０％のＭｅ－ＴＥは、５０％のメタノール／ＴＥであり；５０％のＭｅ－ＴＥ ＢＨＴ１００は、５０％のメタノール／ＴＥ＋１００ｍｇ／ＬのＢＨＴであり；５０％のＭｅ－ＴＥ ＢＨＴ２５は、５０％のメタノール／ＴＥ＋２５ｍｇ／ＬのＢＨＴであり；凍結とは、いずれの緩衝剤も添加せずに－８０℃で凍結された細胞ペレットを指す。
図１０および１１のデータは、ＥＤＴＡを含む（すなわち、ＴＥを含有する）すべての緩衝剤が２１日間のインキュベーション後にＤＮＡメチル化のより大きな増加をもたらし、高濃度または低濃度のいずれかでＢＨＴを添加しても、メチル化シグナルのＥＤＴＡに関連する増加を妨害しないという所見を強調する。
上記および図１～１０において示されたデータは、様々な緩衝剤中で２１日間インキュベートした試料におけるＤＮＡ収量が、ＢＨＴを含むか含まないかにかかわらず、ＥＤＴＡを含まない、メタノールとＴｒｉｓから構成される配合物により最大化されることを示す。さらに、ＤＮＡメチル化のマークは、ＢＨＴを含むか含まないかにかかわらず、ＥＤＴＡを含まない、メタノールとＴｒｉｓから構成される緩衝剤配合物と共に室温で２１日間インキュベートした試料中で完全に保存された。改良された緩衝剤製剤は、輸送および保存中の生体試料中のＤＮＡおよびＤＮＡメチル化のマークの安定性を増加させ、それによって、ＤＮＡメチル化を測定することに基づくバイオマーカーアッセイの正確性を改善することができる。
図１２は、実験Ｇで処理した試料からのｎｇでの総ＤＮＡ収量の概要を提供する。ｎｇでのＤＮＡ量をＹ軸上に表示し、一方、Ｘ軸はこの実験で試験した緩衝剤を示す。白抜きの丸は０日目の時点で採取した試料を示し、一方、四角は表示した緩衝剤中での２１日間のインキュベーション後に処理したＤＮＡをマークするために使用される。図１２では、凍結とは、いずれの緩衝剤も添加せずに－８０℃で凍結された細胞ペレットを指し、５０％のＭｅＯＨは、５０％のメタノールであり；５０％のＭｅＯＨ／１０ｍＭのＴｒｉｓは、５０％のメタノール／１０ｍＭのＴｒｉｓであり；５０％のＭｅＯＨ／１０ｍＭのＴｒｉｓ ＢＨＴ１００は、５０％のメタノール／１０ｍＭのＴｒｉｓ＋１００ｍｇ／ＬのＢＨＴであり；５０％のＭｅＯＨ／１０ｍＭのＴｒｉｓ ＢＨＴ２５は、５０％のメタノール／１０ｍＭのＴｒｉｓ＋２５ｍｇ／ＬのＢＨＴである。
図１２は、Ｔｒｉｓ緩衝剤を添加せずに５０％のメタノール中で固定された細胞、または保存緩衝剤を添加せずに凍結した細胞中と比較して、メタノール／Ｔｒｉｓ含有緩衝剤中で、２１日間のインキュベーション後に改善されたＤＮＡ収量を示す。ＢＨＴのメタノール／Ｔｒｉｓ製剤への添加は、ＢＨＴを含まないメタノール／Ｔｒｉｓ製剤に対する緩衝剤特性を変更しない。
図１３は、実験Ｈで処理した試料からのｎｇでの総ＤＮＡ収量の概要を提供する。ｎｇでのＤＮＡ量をＹ軸上に表示し、一方、Ｘ軸はこの実験で試験した緩衝剤を示す。白抜きの丸は０日目の時点で採取した試料を示し、一方、三角は表示した緩衝剤中での２１日間のインキュベーション後に処理したＤＮＡをマークするために使用され、菱形は表示した緩衝剤中で２２日間のインキュベーション後に採取した試料を示す。白抜きの三角および菱形は、緩衝剤のみと共に、それぞれ、２１または２２日間インキュベートした細胞を指すが、黒塗りの三角および菱形は、医療用シリコーンバルーンの存在下で緩衝剤中でインキュベートした試料を示す。図１３では、凍結とは、いずれの緩衝剤も添加せずに－８０℃で凍結された細胞ペレットを指し、ＭｅＯＨは、５０％のメタノールであり；ＭｅＯＨ／１０ｍＭのＴｒｉｓは、５０％のメタノール／１０ｍＭのＴｒｉｓであり；ＭｅＯＨ／１０ｍＭのＴｒｉｓ ＢＨＴ１００は、５０％のメタノール／１０ｍＭのＴｒｉｓ＋１００ｍｇ／ＬのＢＨＴである。この実験は、より多くの２０ｍＬ体積の緩衝剤中で固定された細胞を含む５０ｍＬのチューブ中で行った。
図１３は、Ｔｒｉｓ緩衝剤を添加せずに５０％のメタノール中で固定された細胞、または保存緩衝剤を添加せずに凍結した細胞中と比較して、メタノール／Ｔｒｉｓ含有緩衝剤中で２１日間のインキュベーション後に増加したＤＮＡ収量を示す。この実験は、医療用シリコーンバルーンを細胞と緩衝剤との混合物中に添加することのＤＮＡ収量への効果がなかったことをさらに示す。ＤＮＡ収量の可変性は、実験手順の変更、およびバルーンを覆うために必要とされる、より多量な体積の緩衝剤を収容するためのより大きなチューブへの切替えに起因する可能性が高かった。さらなる実験は、大きな体積の取扱いに起因する可変性を低下させる技法を対象とした。
図１４は、実験Ｉで処理した試料からのｎｇでの総ＤＮＡ収量の概要を提供する。ｎｇでのＤＮＡ量をＹ軸上に表示し、一方、Ｘ軸はこの実験で試験した緩衝剤を示す。白抜きの丸は０日目の時点で採取した試料を示し、一方、四角は表示した緩衝剤中での３日間のインキュベーション後に処理したＤＮＡをマークするために使用される。図１４では、凍結とは、いずれの緩衝剤も添加せずに－８０℃で凍結された細胞ペレットを指し、ＭｅＯＨは、５０％のメタノールであり；ＭｅＯＨ／１０ｍＭのＴｒｉｓは、５０％のメタノール／１０ｍＭのＴｒｉｓであり；ＭｅＯＨ／１０ｍＭのＴｒｉｓ ＢＨＴ１００は、５０％のメタノール／１０ｍＭのＴｒｉｓ＋１００ｍｇ／ＬのＢＨＴである。この実験は、より多くの２０ｍＬ体積の緩衝剤中で固定された細胞を含む５０ｍＬのチューブ中で行った。
図１４は、Ｔｒｉｓ緩衝剤を添加せずに５０％のメタノール中で固定された細胞、または保存緩衝剤を添加せずに凍結した細胞中と比較して、メタノール／Ｔｒｉｓ含有緩衝剤中で、３日間のみのインキュベーション後にＤＮＡ収量の増加が得られたことを示す。本研究の可変性は、実験Ｈで開始したより大きい緩衝剤体積中でインキュベートした試料の取扱いのやっかいな性質を反映する傾向にある。
図１５は、実験Ａ～Ｉで処理した試料からの総ＤＮＡ収量の概要を提供する。ＤＮＡ量は、各実験における凍結試料の０日目の時点での中央値に対して正規化し、Ｙ軸上に表示し、一方、Ｘ軸は様々な実験において試験した緩衝剤を示す。白抜きの丸は０日目の時点で採取した試料を示し；白抜きの四角は表示した緩衝剤中で３日間のインキュベーション後に処理したＤＮＡに相当し；黒塗りの丸は表示した緩衝剤中で７日間のインキュベーション後に処理したＤＮＡに相当し；黒塗りの三角は表示した緩衝剤中で１４日間のインキュベーション後に処理したＤＮＡに相当し；黒塗りの菱形は表示した緩衝剤中で２１日間のインキュベーション後に処理したＤＮＡに相当する。この図では、４０％のＭｅＯＨは、４０％のメタノールであり；５０％のＭｅＯＨは、５０％のメタノールであり；６０％のＭｅＯＨは、６０％のメタノールであり；５０％のＭｅＯＨ／１０ｍＭのＴｒｉｓは、５０％のメタノール／１０ｍＭのＴｒｉｓであり；５０％のＭｅＯＨ／１０ｍＭのＴｒｉｓ ＢＨＴ１００は、５０％のメタノール／１０ｍＭのＴｒｉｓ＋１００ｍｇ／ＬのＢＨＴであり；５０％のＭｅＯＨ／１０ｍＭのＴｒｉｓ ＢＨＴ２５は、５０％のメタノール／１０ｍＭのＴｒｉｓ＋２５ｍｇ／ＬのＢＨＴであり；５０％のＭｅＯＨ－ＥＤＴＡは、５０％のメタノール／１６ｍＭのＥＤＴＡであり；５０％のＭｅＯＨ－ＴＥは、５０％のメタノール／ＴＥであり；５０％のＭｅＯＨ－ＴＥ ＢＨＴ１００は、５０％のメタノール／ＴＥ＋１００ｍｇ／ＬのＢＨＴであり；５０％のＭｅＯＨ－ＴＥ ＢＨＴ２５は、５０％のメタノール／ＴＥ＋２５ｍｇ／ＬのＢＨＴであり；凍結とは、いずれの緩衝剤も添加せずに－８０℃で凍結された細胞ペレットを指し；Ｃｙｔｏｌｙｔは、市販の固定剤ＣｙｔｏＬｙｔ（Ｈｏｌｏｇｉｃから）を指し；Ｃｙｔｏｌｙｔ ４ｄｅｇは、室温の代わりに４℃のＣｙｔｏＬｙｔ中でインキュベートした細胞を指し；Ｓｈｉｅｌｄは、Ｚｙｍｏ ＲｅｓｅａｒｃｈからのＤＮＡ／ＲＮＡ ｓｈｉｅｌｄ緩衝剤を指す。
図１５は、Ｔｒｉｓ緩衝剤を添加せずに５０％のメタノール中で固定された細胞、または保存緩衝剤を添加せずに凍結した細胞中と比較して、複数の実験において、メタノール／Ｔｒｉｓ含有緩衝剤中で、２１日間のインキュベーション後のＤＮＡ収量の増加に対する再現可能な傾向を示し、単独、またはＴｒｉｓとの組合せのいずれかでＥＤＴＡを含有するすべての緩衝剤中でのＤＮＡ回収量の減少も示す。
上記データは、ＢＨＴを含むかまたは含まないかにかかわらず、メタノールとｔｒｉｓを含有する緩衝剤が、３～２１日間これらの緩衝剤中で細胞をインキュベートすることによって決定した場合に、メタノールと水のみの緩衝剤と比較して、ＤＮＡ収量を増加させることを実証した。これらの効果は、３日間程度の短いインキュベーションにおいて明らかである。医療用シリコーンバルーンを緩衝剤中に添加することによってＤＮＡ収量は変更されない。
図１６および１７は、実験Ｇにおいてライブラリーを配列決定した後に得られる整列させたリードの合計を提供する。図１６および１７それぞれのＶＩＭまたはＣＣＮＡ１遺伝子座に対して整列させたリードの数をＹ軸上に表示し、一方、Ｘ軸はこの実験において試験した緩衝剤を示す。丸は、０％のメチル細胞系インプットを有する試料を示す。四角は、０．５％のメチル化細胞系を有するインプット試料を示し、三角は、１％のメチル化細胞系インプットを有する試料を示す。白抜きの記号は、０日目の時点で採取した試料を示し、一方、黒塗りの記号は、表示した緩衝剤中での２１日間のインキュベーション後に処理した試料をマークするために使用される。１００００リード（臨床アッセイにおいて診断に役立つと考えられる試料に必要とされる最小数）に相当する参照線が、可視化を容易にするためにグラフを横切って引かれている。この図では、凍結とは、いずれの緩衝剤も添加せずに－８０℃で凍結された細胞ペレットを指し、５０％のＭｅＯＨは、５０％のメタノールであり；５０％のＭｅＯＨ／１０ｍＭのＴｒｉｓは、５０％のメタノール／１０ｍＭのＴｒｉｓであり；５０％のＭｅＯＨ／１０ｍＭのＴｒｉｓ ＢＨＴ１００は、５０％のメタノール／１０ｍＭのＴｒｉｓ＋１００ｍｇ／ＬのＢＨＴであり；５０％のＭｅＯＨ／１０ｍＭのＴｒｉｓ ＢＨＴ２５は、５０％のメタノール／１０ｍＭのＴｒｉｓ＋２５ｍｇ／ＬのＢＨＴである。
図１７は、ＴｒｉｓまたはＴｒｉｓとＢＨＴを補充した５０％のメタノール緩衝剤中ではなく、５０％のメタノール緩衝剤（赤色の矢印）中で２１日間固定された細胞において特異的にＣＣＮＡ１マーカーに関する分析可能なリードの予期せぬ損失を示す。このタイプの損失は、５０％のメタノール中で固定された細胞を研究する一部ではあるがすべてではない実験においてそうであるように、確率的要素のものを有する。
図１８および１９は、実験Ｇにおいて、それぞれＶＩＭおよびＣＣＮＡに関するメチル化レベルアッセイの結果を提供する。メチル化シグナル（フラクション）をＹ軸上にプロットする。丸は、０％のメチル細胞系インプットを有する試料を示す。四角は、０．５％のメチル化細胞系を有するインプット試料を示し、三角は、１％のメチル化細胞系インプットを有する試料を示す。白抜きの記号は、０日目の時点で採取した試料を示し、一方、黒塗りの記号は、表示した緩衝剤中での２１日間のインキュベーション後に処理した試料をマークするために使用される。これらの図では、凍結とは、いずれの緩衝剤も添加せずに－８０℃で凍結された細胞ペレットを指し；５０％のＭｅＯＨは、５０％のメタノールであり；５０％のＭｅＯＨ／１０ｍＭのＴｒｉｓは、５０％のメタノール／１０ｍＭのＴｒｉｓであり；５０％のＭｅＯＨ／１０ｍＭのＴｒｉｓ ＢＨＴ１００は、５０％のメタノール／１０ｍＭのＴｒｉｓ＋１００ｍｇ／ＬのＢＨＴであり；５０％のＭｅＯＨ／１０ｍＭのＴｒｉｓ ＢＨＴ２５は、５０％のメタノール／１０ｍＭのＴｒｉｓ＋２５ｍｇ／ＬのＢＨＴである。
図１８は、ＢＨＴをさらに添加するかまたは添加しないかにかかわらず、１０ｍＭのＴｒｉｓを補充した緩衝剤中ではなく、５０％のメタノール緩衝剤中での２１日間のインキュベーション後にＶＩＭメチル化シグナルの顕著な人為的増加を示す。図１９は、２１日目の５０％のメタノール緩衝剤中でのＣＣＮＡ１メチル化が幅広い可変性を示し、いくつかの試料は顕著なメチル化の増加を示し、その他は完全なシグナルの崩壊を示し、これは、図１６および１７において観察される分析のリードの数が非常に少ないことに起因すると考えられ、結果として「全か無かの」効果を有することを示す。
まとめると、実験Ｇは、ＤＮＡ収量が、５０％のメタノールのみの中でインキュベートした細胞と比較して、ＢＨＴを含むかまたは含まないかにかかわらず、５０％のメタノールとＴｒｉｓ中でインキュベートした細胞においてかなり増加するという以前の研究の結果を再現した。５０％のメタノールのみの緩衝剤中での細胞のインキュベーションによって、２１日目までにＶＩＭに対するＤＮＡメチル化の人為的な増加が生じる。これは、ＢＨＴの添加を含むかまたは含まないかにかかわらず、５０％のメタノールとｔｒｉｓを含有する緩衝剤中で妨げられる。さらに、５０％のメタノール中での細胞のインキュベーションは、ＣＣＮＡ１、特にメチル化されたＣＣＮＡ１に関して得ることができるＤＮＡ配列決定リードの顕著な低減に関連した。小さな試料のリードにおいてメチル化されたＤＮＡリードを捕捉するための障害の発生と一致して、これは、人為的に増加したＣＣＮＡ１ ＤＮＡメチル化を示すか、またはいずれのＣＣＮＡ１ ＤＮＡメチル化もほとんど示さないかのいずれかとして試料をアッセイする「全か無かの」現象に関連した。これは、ＢＨＴの添加を含むかまたは含まないかにかかわらず、５０％のメタノールとＴｒｉｓを含有する緩衝剤中で妨げられる。最後に、５０％のメタノールと１０ｎＭのＴｒｉｓ、または５０％のメタノールと１０ｍＭのＴｒｉｓと２５ｍｇ／ＬのＢＨＴ、または５０％のメタノールと１０ｍＭのＴｒｉｓと１００ｍｇ／ＬのＢＨＴを含有する緩衝剤はすべて、本質的に同じ挙動であった。
図２０および２１は、実験Ｈにおいてライブラリーを配列決定した後に得られる整列させたリードの合計を提供する。図２０および２１それぞれのＶＩＭまたはＣＣＮＡ１遺伝子座に対して整列させたリードの数をＹ軸上に表示し、一方、Ｘ軸はこの実験において試験した緩衝剤を示す。アスタリスクは、０日目の０％のメチル細胞系インプットを有する試料を示す。黒塗りの三角はまた、０日目の１％のメチル化細胞系を有するインプット試料を示し；白抜きの丸は、インキュベーション中にバルーンを添加せずに、２１日目に０％のメチル化細胞系インプットを有する試料を示し；白抜きの四角は、インキュベーション中にバルーンを添加せずに、２１日目に０．５％のメチル化細胞系インプットを有する試料を示し；白抜きの菱形は、インキュベーション中にバルーンを添加せずに、２１日目に１％のメチル化細胞系インプットを有する試料を示し；黒塗りの丸は、インキュベーション中にバルーンを添加して、２１日目に０％のメチル化細胞系インプットを有する試料を示し；黒塗りの四角は、インキュベーション中にバルーンを添加して、２１日目に０．５％のメチル化細胞系インプットを有する試料を示し；黒塗りの菱形は、インキュベーション中にバルーンを添加して、２１日目に１％のメチル化細胞系インプットを有する試料を示す。１００００リード（臨床アッセイにおいて診断に役立つと考えられる試料に必要とされる最小数）に相当する参照線が、可視化を容易にするためにグラフを横切って引かれている。これらの図では、凍結とは、いずれの緩衝剤も添加せずに－８０℃で凍結された細胞ペレットを指し；５０％のＭｅＯＨは、５０％のメタノールであり；５０％のＭｅＯＨ／１０ｍＭのＴｒｉｓは、５０％のメタノール／１０ｍＭのＴｒｉｓであり；５０％のＭｅＯＨ／１０ｍＭのＴｒｉｓ ＢＨＴ１００は、５０％のメタノール／１０ｍＭのＴｒｉｓ＋１００ｍｇ／ＬのＢＨＴであり；５０％のＭｅＯＨ／１０ｍＭのＴｒｉｓ ＢＨＴ２５は、５０％のメタノール／１０ｍＭのＴｒｉｓ＋２５ｍｇ／ＬのＢＨＴである。
図２１は、ＴｒｉｓおよびまたはＢＨＴを補充した５０％のメタノール緩衝剤中ではなく、５０％のメタノール緩衝剤（赤色の矢印）中で２１日間固定された細胞において特異的にＣＣＮＡ１マーカーに関する分析可能なＤＮＡリードの予期せぬ損失を示す。これは、５０％のメタノール中で固定された細胞を分析する実験Ｇにおいて認められたのと同様の損失を再現した。これらの試料の反復ＰＣＲ増幅および分析に関して、ＤＮＡリードの損失を５０％のメタノール中でインキュベートした試料について再度明らかにした（図２４を参照されたい）。
図２２および２３は、実験Ｈにおいて、それぞれＶＩＭおよびＣＣＮＡに関するメチル化レベルアッセイの結果を提供する。メチル化シグナル（フラクション）をＹ軸上にプロットする。アスタリスクは、０日目に０％のメチル細胞系インプットを有する試料を示す。黒塗りの三角はまた、０日目の１％のメチル化細胞系を有するインプット試料を示し；白抜きの丸は、インキュベーション中にバルーンを添加せずに、２１日目に０％のメチル化細胞系インプットを有する試料を示し；白抜きの四角は、インキュベーション中にバルーンを添加せずに、２１日目に０．５％のメチル化細胞系インプットを有する試料を示し；白抜きの菱形は、インキュベーション中にバルーンを添加せずに、２１日目に１％のメチル化細胞系インプットを有する試料を示し；黒塗りの丸は、インキュベーション中にバルーンを添加して、２１日目に０％のメチル化細胞系インプットを有する試料を示し；黒塗りの四角は、インキュベーション中にバルーンを添加して、２１日目に０．５％のメチル化細胞系インプットを有する試料を示し；黒塗りの菱形は、インキュベーション中にバルーンを添加して、２１日目に１％のメチル化細胞系インプットを有する試料を示す。これらの図では、凍結とは、いずれの緩衝剤も添加せずに－８０℃で凍結された細胞ペレットを指し；５０％のＭｅＯＨは、５０％のメタノールであり；５０％のＭｅＯＨ／１０ｍＭのＴｒｉｓは、５０％のメタノール／１０ｍＭのＴｒｉｓであり；５０％のＭｅＯＨ／１０ｍＭのＴｒｉｓ ＢＨＴ１００は、５０％のメタノール／１０ｍＭのＴｒｉｓ＋１００ｍｇ／ＬのＢＨＴである。この実験は、より多くの２０ｍＬ体積の緩衝剤中で固定された細胞を含む５０ｍＬのチューブ中で行った。
図２２および２３は、これらの試料における可変性の顕著な増加と一緒に、５０％のメタノール緩衝剤（赤色の矢印）中での２１日間のインキュベーション後に、それぞれ、ＶＩＭおよびＣＣＮＡ１のメチル化シグナルの人為的な増加を示す。両方の効果は、１０ｍＭのＴｒｉｓを補充した緩衝剤中ではほとんど明らかではなかった。この実験では、ＢＨＴの存在は、２１日の時点でのメチル化シグナルを、凍結試料において観察されるものにさらにより近付けた。インキュベーション中のバルーンの存在は、メチル化シグナルへの効果を有さなかった。
図２４は、実験ＨにおいてＣＣＮＡについてアッセイした反復された５０％のメタノール試料に対するメチル化レベルアッセイの結果を提供する。メチル化シグナル（フラクション）をＹ軸上にプロットする。丸は、実験Ｈからの元々増幅の不十分な試料におけるＣＣＮＡ１アッセイの最初の試みを示す。四角は、同じ試料の亜硫酸水素塩処理およびＰＣＲの独立した繰返しを示す。この図では、５０％のＭｅＯＨは、５０％のメタノールである。
図２４は、５０％のメタノール緩衝剤中でインキュベートしたいくつかの試料におけるＣＣＮＡ１アッセイの大きな可変性および失敗が異なる日に実施された独立したアッセイにおいて繰り返されたことを示す。よって、これは、最初の試み中に起こった何らかの実験台の要因に起因するものではなかった。
実験Ｈからの上記データは、５０％のメタノールのみの緩衝剤中でのインキュベーションが、Ｔｒｉｓを含有する５０％のメタノール（ＢＨＴを含むかまたは含まないかにかかわらず）中でインキュベートした試料と比較して、はるかに少ないＤＮＡ収量をもたらしたことを実証する。さらに、５０％のメタノールのみの緩衝剤中でのインキュベーションは、Ｔｒｉｓを含有する５０％のメタノール（ＢＨＴを含むかまたは含まないかにかかわらず）中でインキュベートした試料と比較して、ＣＣＮＡ１ ＤＮＡメチル化のアッセイのはるかに高い可変性をもたらした。さらに、５０％のメタノールとｔｒｉｓと２５ｍｇ／ＬのＢＨＴを含む緩衝剤は、５０％のメタノールと１００ｍｇ／ＬのＢＨＴを含む緩衝剤と同様に実施した。最後に、医療用シリコーンバルーンをインキュベーション緩衝剤中に添加しても、ＤＮＡ収量にもＤＮＡメチル化のアッセイにも効果は観察されなかった。
図２５および２６は、実験Ｉにおいてライブラリーを配列決定した後に得られる整列させたリードの合計を提供する。図２５および２６それぞれのＶＩＭまたはＣＣＮＡ１遺伝子座に対して整列させたリードの数をＹ軸上に表示し、一方、Ｘ軸はこの実験において試験した緩衝剤を示す。白抜きの丸は０日目に０％のメチル細胞系インプットを有する試料を示す。白抜きの四角は０日目に０．５％のメチル化細胞系を有するインプット試料を示し；白抜きの三角はまた、０日目に１％のメチル化細胞系を有するインプット試料を示し；黒塗りの丸は３日目に０％のメチル化細胞系インプットを有する試料を示し；黒塗りの四角は３日目に０．５％のメチル化細胞系インプットを有する試料を示し；黒塗りの三角は３日目に１％のメチル化細胞系インプットを有する試料を示す。１００００リード（臨床アッセイにおいて診断に役立つと考えられる試料に必要とされる最小数）に相当する参照線が、可視化を容易にするためにグラフを横切って引かれている。これらの図では、凍結とは、いずれの緩衝剤も添加せずに－８０℃で凍結された細胞ペレットを指し；５０％のＭｅＯＨは、５０％のメタノールであり；５０％のＭｅＯＨ／１０ｍＭのＴｒｉｓは、５０％のメタノール／１０ｍＭのＴｒｉｓであり；５０％のＭｅＯＨ／１０ｍＭのＴｒｉｓ ＢＨＴ１００は、５０％のメタノール／１０ｍＭのＴｒｉｓ＋１００ｍｇ／ＬのＢＨＴである。この実験は、より多くの２０ｍＬ体積の緩衝剤中で固定された細胞を含む５０ｍＬのコニカルチューブ中で行った。
図２６は、Ｔｒｉｓを補充した５０％のメタノール緩衝剤（ＢＨＴを添加したかまたは添加していないかにかかわらず）中ではなく、５０％のメタノール緩衝剤（赤色の矢印）中で３日間固定された細胞において特異的にＣＣＮＡ１マーカーに関する分析可能なリードの減少を示す。これは、２１日間固定された細胞において、実験Ｈで認められた効果を再現した。しかし、これは、５０％のメタノール中で固定された細胞を分析するすべての実験において見られた訳ではないため、効果についての確率的要素が存在した。
図２７は、実験Ｊにおいて表示した保存剤中で固定された試料から回収したＤＮＡ量を示す。この図は、実験Ｊにおいて処理された試料からの総ＤＮＡ収量の概要である。この実験は、インキュベーション中にシリコーンバルーンを添加したか添加していないかにかかわらず、より多くの２０ｍＬ体積の緩衝剤中で固定された細胞を含む５０ｍＬのコニカルチューブ中で行った。ｎｇでのＤＮＡ量をＹ軸上に表示し、一方、Ｘ軸はこの実験で試験した緩衝剤を示す。白抜きの丸は０日目の時点で採取した試料を示し；白抜きの四角は、インキュベーション中にバルーンを添加せずに、表示した緩衝剤中で３日間のインキュベーション後に処理したＤＮＡに相当し；黒塗りの四角は、バルーンの存在下で、表示した緩衝剤中で３日間のインキュベーション後に処理したＤＮＡに相当し；白抜きの三角は、インキュベーション中にバルーンを添加せずに、表示した緩衝剤中で２１日間のインキュベーション後に処理したＤＮＡに相当し；黒塗りの三角は、バルーンの存在下で、表示した緩衝剤中で２１日間のインキュベーション後に処理したＤＮＡに相当する。この図では、凍結とは、いずれの緩衝剤も添加せずに－８０℃で凍結された細胞ペレットを指し；ＭｅＯＨは、５０％のメタノールであり；ＭｅＯＨ／１０ｍＭのＴｒｉｓは、５０％のメタノール／１０ｍＭのＴｒｉｓであり；ＭｅＯＨ／１０ｍＭのＴｒｉｓ ＢＨＴ１００は、５０％のメタノール／１０ｍＭのＴｒｉｓ＋１００ｍｇ／ＬのＢＨＴである。
図２７は、５０％のメタノール緩衝剤中のＤＮＡ回収量が、再度、０日目と比較して、３日目、および２１日目においてより低かったことを示す（実験ＨおよびＩの３日目と２１日目に観察されたのと同じ効果）。メタノールとＴｒｉｓを含有する緩衝剤中で固定された細胞からのＤＮＡ収量は、０日目と比較して増加した。
図２８は、実験Ｋにおいて表示した保存剤中で固定された試料から回収したＤＮＡ量を示す。この図は、実験Ｋにおいて処理された試料からの総ＤＮＡ収量の概要である。この実験は、より多くの２０ｍＬ体積の緩衝剤中で固定された細胞を含む５０ｍＬのコニカルチューブ中で行った。この実験では、細胞をある範囲の温度で１週間異なる緩衝剤中でインキュベートし、その後、乾燥剤中で、室温でさらに２週間、合計２２日間緩衝剤中でインキュベーションを続けた。試料の半分がインキュベーション中に緩衝剤に添加された医療用シリコーンバルーンを有するが、他の半分はバルーンを添加されなかった。室温でおよそ１時間緩衝剤中でインキュベートした試料の０日目の時点を比較のために使用する。ｎｇでのＤＮＡ量をＹ軸上に表示し、一方、Ｘ軸はこの実験で試験した緩衝剤を示す。白抜きの丸は、いずれの保存緩衝剤も添加せずに－８０℃で凍結された細胞を示す。白抜きの四角は、バルーンを用いずに、５０％のメタノール／１０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝剤中でインキュベートした試料に相当し；黒塗りの四角は、バルーンの存在下で５０％のメタノール／１０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝剤中でインキュベートした試料に相当し；白抜きの三角は、バルーンを用いずに、１００ｍｇ／ＬのＢＨＴ緩衝剤を含む５０％のメタノール／１０ｍＭのＴｒｉｓ中でインキュベートした試料に相当し；黒塗りの三角は、バルーンの存在下で、１００ｍｇ／ＬのＢＨＴ緩衝剤を含む５０％のメタノール／１０ｍＭのＴｒｉｓ中でインキュベートした試料に相当する。インキュベーション温度は、Ｘ軸上に示される。－８０℃は、保存緩衝剤を添加せずに細胞ペレットを冷凍する標準的なコンパレーター条件を指す（白抜きの丸）。室温（ＲＴ）は、室温でインキュベートした試料を示す。
図２８は、－８０℃で凍結した細胞ペレットからのＤＮＡ回収量と比較して、－２０℃～５０℃の範囲のすべての温度にわたり、５０％のメタノールとＴｒｉｓまたは５０％のメタノールとＴｒｉｓとＢＨＴのいずれか中でインキュベートした細胞においてＤＮＡ収量が増強され、増強の大きさは、細胞が第１週中にインキュベートされた温度が増加するにつれて増加することを示す。さらなる観察は、ＢＨＴを添加するかまたは添加しないかにかかわらず、５０％のメタノールとＴｒｉｓを含有する緩衝剤が、－２０℃～＋５０℃の範囲の温度にわたり１週間のインキュベーション後に光学的に透明なままであることである。
図２９および３０は、実験Ｊにおいてライブラリーを配列決定した後に得られる整列させたリードの合計を提供する。図２９および３０それぞれのＶＩＭまたはＣＣＮＡ１遺伝子座に対して整列させたリードの数をＹ軸上に表示し、一方、Ｘ軸はこの実験において試験した緩衝剤を示す。白抜きの丸は、０日目の試料を示す。白抜きの四角は、バルーンを用いずに３日間インキュベートした試料を示し；黒塗りの四角は、バルーンの存在下での３日間のインキュベーション後の試料を示す。白抜きの三角は、追加のバルーンを用いずに２１日間インキュベートした試料を示し；黒塗りの四角は、バルーンを用いて２１日間のインキュベートした試料を示す。１００００リード（臨床アッセイにおいて診断に役立つと考えられる試料に必要とされる最小数）に相当する参照線が、可視化を容易にするためにグラフを横切って引かれている。これらの図では、凍結とは、いずれの緩衝剤も添加せずに－８０℃で凍結された細胞ペレットを指し；５０％のＭｅＯＨは、５０％のメタノールであり；５０％のＭｅＯＨ／１０ｍＭのＴｒｉｓは、５０％のメタノール／１０ｍＭのＴｒｉｓであり；５０％のＭｅＯＨ／１０ｍＭのＴｒｉｓ ＢＨＴ１００は、５０％のメタノール／１０ｍＭのＴｒｉｓ＋１００ｍｇ／ＬのＢＨＴである。この実験は、より多くの２０ｍＬ体積の緩衝剤中で固定された細胞を含む５０ｍＬのコニカルチューブ中で行った。
図３０は、Ｔｒｉｓを補充した５０％のメタノール緩衝剤（ＢＨＴを添加したかまたは添加していないかにかかわらず）中ではなく、５０％のメタノール緩衝剤（赤色の矢印）中で３日間または２１日間固定された細胞において特異的にＣＣＮＡ１マーカーに関する分析可能なリードの減少を示す。これは、２１日間固定された細胞において実験Ｈで、および３日間固定された細胞において実験Ｉで認められた効果を再現した。５０％のメタノール中で固定された試料も２１日目の分析可能なＶＩＭリードの減少を示すが、３日目には示さない（図２９）。しかし、これは、５０％のメタノール中で固定された細胞を分析するすべての実験において見られた訳ではないため、効果についての確率的要素が存在した。
図３１および３２は、実験Ｊにおいて、それぞれＶＩＭおよびＣＣＮＡに関するメチル化レベルアッセイの結果を提供する。メチル化シグナル（フラクション）をＹ軸上にプロットする。白抜きの丸は、０％のメチル細胞系インプットを有する試料を示す。白抜きの四角は、０．５％のメチル化細胞系インプットを有する試料を示し；黒塗りの菱形は、１％のメチル化細胞系インプットを有する試料を示す。これらの図では、凍結とは、いずれの緩衝剤も添加せずに－８０℃で凍結された細胞ペレットを指し；５０％のＭｅＯＨは、５０％のメタノールであり；５０％のＭｅＯＨ／１０ｍＭのＴｒｉｓは、５０％のメタノール／１０ｍＭのＴｒｉｓであり；５０％のＭｅＯＨ／１０ｍＭのＴｒｉｓ ＢＨＴ１００は、５０％のメタノール／１０ｍＭのＴｒｉｓ＋１００ｍｇ／ＬのＢＨＴである。この実験は、より多くの２０ｍＬ体積の緩衝剤中で固定された細胞を含む５０ｍＬのチューブ中で行った。
図３１および３２は、これらの試料における可変性の顕著な増加と一緒に、５０％のメタノール緩衝剤（赤色の矢印）中での３および２１日間のインキュベーション後に、それぞれ、ＶＩＭおよびＣＣＮＡ１のメチル化シグナルの人為的な増加を示す。両方の効果は、１０ｍＭのＴｒｉｓを補充した緩衝剤中ではほとんど明らかではなかった。この実験では、ＢＨＴの存在は、３および２１日の時点でのＣＣＮＡ１に関するメチル化シグナルを、凍結試料において観察されるものにさらにより近付けた。インキュベーション中のバルーンの存在は、メチル化シグナルへの効果を有さなかった。
まとめると、実験Ｊは、非緩衝の５０％のメタノールが、３日間程度の短い細胞とのインキュベーションにおけるＤＮＡ収量の損失に関連したことを示す。この効果は、Ｔｒｉｓの添加により実質的に妨げられる。実験Ｊは、非緩衝の５０％のメタノールが、３日間程度の短い細胞とのインキュベーションにおけるＶｉｍおよびＣＣＮＡ１遺伝子座でのＤＮＡメチル化の人為的な増加を生じたことを示す。この効果は、Ｔｒｉｓの添加により実質的に妨げられ、ＴｒｉｓとＢＨＴの両方の添加によりさらなる改善が認められる。
図３３および３４は、実験Ｋにおいてライブラリーを配列決定した後に得られる整列させたリードの合計を提供する。図３３および３４それぞれのＶＩＭまたはＣＣＮＡ１遺伝子座に対して整列させたリードの数をＹ軸上に表示し、一方、Ｘ軸はこの実験において試験した緩衝剤を示す。白抜きの丸は、０日目の試料を示す。白抜きの四角は、－２０℃で７日間インキュベートし、その後室温で２週間のインキュベーションを行った試料を示す。黒塗りの菱形は、４℃で７日間インキュベートし、その後室温で２週間のインキュベーションを行った試料を示す。白抜きの三角は、室温で２１日間インキュベートした試料を示す。逆さまの黒塗りの三角は、３７℃で７日間インキュベートし、その後室温で２週間のインキュベーションを行った試料を示す。黒塗りの星型は、５０℃で７日間インキュベートし、その後室温で２週間のインキュベーションを行った試料を示す。黒塗りの四角は、保存緩衝剤を添加せずに、－８０℃で３週間保った急速冷凍した試料を示す。１００００リード（臨床アッセイにおいて診断に役立つと考えられる試料に必要とされる最小数）に相当する参照線が、可視化を容易にするためにグラフを横切って引かれている。これらの図では、凍結とは、いずれの緩衝剤も添加せずに－８０℃で凍結された細胞ペレットを指し；５０％のＭｅＯＨ／１０ｍＭのＴｒｉｓは、５０％のメタノール／１０ｍＭのＴｒｉｓであり；５０％のＭｅＯＨ／１０ｍＭのＴｒｉｓ ＢＨＴ１００は、５０％のメタノール／１０ｍＭのＴｒｉｓ＋１００ｍｇ／ＬのＢＨＴである。この実験は、より多くの２０ｍＬ体積の緩衝剤中で固定された細胞を含む５０ｍＬのコニカルチューブ中で行った。
図３３および３４は、Ｔｒｉｓを補充した５０％のメタノール緩衝剤（ＢＨＴを添加したかまたは添加していないかにかかわらず）中で、２１日間後のＶＩＭまたはＣＣＮＡ１マーカーに関する分析可能なリードについて明らかな変動を示さない。これは、室温でのインキュベーションによる実験ＨおよびＪで認められた効果を再現し、異なる温度でのインキュベーションが、急速凍結した試料と比較して、緩衝メタノール中での細胞のインキュベーション後に、ＶＩＭまたはＣＣＮＡに関する分析可能なリードの数に関して明らかな効果を示さなかったことを示した。あるいは、実験Ｊと比較して記載すると、実験Ｋの結果は、Ｔｒｉｓの５０％のメタノールへの添加によって、メタノールベースの緩衝剤中でインキュベートした細胞試料から調製したＤＮＡの亜硫酸水素塩配列決定アッセイにおけるリード数の崩壊が保護され、この保護は、５０℃程度の高温で緩衝剤中でインキュベートした細胞まで拡大することを示す。
図３５および３６は、実験Ｋにおいて、それぞれＶＩＭおよびＣＣＮＡに関するメチル化レベルアッセイの結果を提供する。メチル化シグナル（フラクション）をＹ軸上にプロットする。白抜きの丸は、０日目の試料を示す。白抜きの四角は、－２０℃で７日間インキュベートし、その後室温で２週間のインキュベーションを行った試料を示す。黒塗りの菱形は、４℃で７日間インキュベートし、その後室温で２週間のインキュベーションを行った試料を示す。白抜きの三角は、室温で２１日間インキュベートした試料を示し、逆さまの黒塗りの三角は、３７℃で７日間インキュベートし、その後室温で２週間のインキュベーションを行った試料を示す。黒塗りの星型は、５０℃で７日間インキュベートし、その後室温で２週間のインキュベーションを行った試料を示す。黒塗りの四角は、保存緩衝剤を添加せずに、－８０℃で３週間保った急速冷凍した試料を示す。これらの図では、凍結とは、いずれの緩衝剤も添加せずに－８０℃で凍結された細胞ペレットを指し；５０％のＭｅＯＨ／１０ｍＭのＴｒｉｓは、５０％のメタノール／１０ｍＭのＴｒｉｓであり；５０％のＭｅＯＨ／１０ｍＭのＴｒｉｓ ＢＨＴ１００は、５０％のメタノール／１０ｍＭのＴｒｉｓ＋１００ｍｇ／ＬのＢＨＴである。この実験は、より多くの２０ｍＬ体積の緩衝剤中で固定された細胞を含む５０ｍＬのチューブ中で行った。
図３５および３６は、急速冷凍された試料と比較して、Ｔｒｉｓ、またはＴｒｉｓ－ＢＨＴを補充した５０％のメタノール緩衝剤中での３７℃および５０℃でのインキュベーション後に、それぞれ、ＶＩＭおよびＣＣＮＡ１のメチル化シグナルの人為的な増加を示す。インキュベーション中のバルーンの存在は、メチル化シグナルへの効果を有さなかった。
図３７は、実験Ｌにおいて３０％～７０％にまたがる範囲（３０％、４０％、５０％、６０％、７０％）で１０ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍｇ／ＬのＢＨＴおよびメタノールを含有する表示した保存剤中で固定された試料から回収されたＤＮＡ量を示す。この図は、実験Ｌにおいて処理された試料からの総ＤＮＡ収量の概要である。この実験は、より多くの２０ｍＬ体積の緩衝剤中で固定された細胞を含む５０ｍＬのコニカルチューブ中で行った。この実験では、様々な緩衝剤中の細胞を、表示した緩衝剤中で１時間（０日目）、３日間、または２１日間インキュベートした。凍結された保存剤なしの対照をのぞき、３日目と２１日目の試料のすべては、インキュベーション中に緩衝剤に添加された医療用シリコーンバルーンを有した。室温でおよそ１時間緩衝剤中でインキュベートした試料の０日目の時点を比較のために使用する。ｎｇでのＤＮＡ量をＹ軸上に表示し、一方、Ｘ軸はこの実験で試験した緩衝剤を示す。白抜きの丸は、１時間（０日目）インキュベートした細胞を示す。白抜きの四角は、３日間インキュベートした試料に相当する。黒塗りの丸は、２１日間インキュベートした試料に相当する。
図３７は、－８０℃で凍結した細胞ペレットからのＤＮＡ回収量と比較して、ＤＮＡ収量は一定範囲のメタノール濃度でインキュベートした細胞において増強され、すべてのメタノール緩衝剤中で２１日間に匹敵する収量であった。３０％のメタノール中では、２１日目に増加が観察されたが、３日間のインキュベーション後には観察されなかった。４０％および５０％のメタノールでは、ＤＮＡ回収量の時間に依存する増加が存在し、３日後に収量が増加し、２１日後にはさらに増加した。６０％またはそれより高い割合のメタノール濃度では、ＤＮＡ回収の収量は、わずか１時間程度のインキュベーション（０日目の条件）後に増加したが、その後、インキュベーション期間がより長くなるとわずかに減少したようであった。
図３８および３９は、実験Ｌにおいてライブラリーを配列決定した後に得られる整列させたリードの合計を提供する。図３８および３９それぞれのＶＩＭまたはＣＣＮＡ１遺伝子座に対して整列させたリードの数をＹ軸上に表示し、一方、Ｘ軸はこの実験において試験した緩衝剤を示す。白抜きの丸は、０日目の試料を示す。白抜きの四角は、３日間インキュベートした試料を示す。黒塗りの丸は、２１日間インキュベートした試料を示す。１００００リード（臨床アッセイにおいて診断に役立つと考えられる試料に必要とされる最小数）に相当する参照線が、可視化を容易にするためにグラフを横切って引かれている。これらの図では、凍結とは、いずれの緩衝剤も添加せずに－８０℃で凍結された細胞ペレットを指し；３０％のＭｅＯＨ／１０ｍＭのＴｒｉｓ ＢＨＴ１００は、３０％のメタノール／１０ｍＭのＴｒｉｓ＋１００ｍｇ／ＬのＢＨＴであり；４０％のＭｅＯＨ／１０ｍＭのＴｒｉｓ ＢＨＴ１００は、４０％のメタノール／１０ｍＭのＴｒｉｓ＋１００ｍｇ／ＬのＢＨＴであり；５０％のＭｅＯＨ／１０ｍＭのＴｒｉｓ ＢＨＴ１００は、５０％のメタノール／１０ｍＭのＴｒｉｓ＋１００ｍｇ／ＬのＢＨＴであり；６０％のＭｅＯＨ／１０ｍＭのＴｒｉｓ ＢＨＴ１００は、６０％のメタノール／１０ｍＭのＴｒｉｓ＋１００ｍｇ／ＬのＢＨＴであり；７０％のＭｅＯＨ／１０ｍＭのＴｒｉｓ ＢＨＴ１００は、７０％のメタノール／１０ｍＭのＴｒｉｓ＋１００ｍｇ／ＬのＢＨＴである。この実験は、より多くの２０ｍＬ体積の緩衝剤中で固定された細胞を含む５０ｍＬのコニカルチューブ中で行った。
図３８および３９は、メタノール濃度を３０～５０％の範囲で保った場合に、ＴｒｉｓおよびＢＨＴを補充したメタノール緩衝剤中で３または２１日後のＶＩＭまたはＣＣＮＡ１マーカーに関する分析可能なリードについて明らかな変動を示さない。６０または７０％のより高いメタノール濃度では、可変性は増加し、分析可能なリードの数は穏やかに減少する。
図４０および４１は、実験Ｌにおいて、それぞれＶＩＭおよびＣＣＮＡに関するメチル化レベルアッセイの結果を提供する。メチル化シグナル（フラクション）をＹ軸上にプロットする。白抜きの丸は、３０％のＭｅＯＨ／１０ｍＭのＴｒｉｓ＋１００ｍｇ／ＬのＢＨＴ中で固定された試料を示す。白抜きの四角は、４０％のＭｅＯＨ／１０ｍＭのＴｒｉｓ＋１００ｍｇ／ＬのＢＨＴ中で固定された試料を示す。黒塗りの丸は、５０％のＭｅＯＨ／１０ｍＭのＴｒｉｓ＋１００ｍｇ／ＬのＢＨＴ中で固定された試料を示す。白抜きの菱形は、６０％のＭｅＯＨ／１０ｍＭのＴｒｉｓ＋１００ｍｇ／ＬのＢＨＴ中で固定された試料を示す。黒塗りの菱形は、７０％のＭｅＯＨ／１０ｍＭのＴｒｉｓ＋１００ｍｇ／ＬのＢＨＴ中で固定された試料を示す。白抜きの三角は、保存緩衝剤を添加せずに－８０℃で保ったことを示す。この実験は、より多くの２０ｍＬ体積の緩衝剤中で固定された細胞を含む５０ｍＬのチューブ中で行った。凍結された保存剤なしの対照をのぞき、３日目と２１日目の試料のすべては、インキュベーション中に緩衝剤に添加された医療用シリコーンバルーンを有した。
図４０および４１は、メチル化シグナルが、３または２１日間のインキュベーション後に、３０％～７０％のメタノール濃度の範囲にわたり、ＴｒｉｓおよびＢＨＴから構成されるメタノールベースの緩衝剤中で安定なままであることを示す。
まとめると、実験Ｌは、上記実験と比較して、細胞をＢＨＴを含むＴｒｉｓ緩衝メタノール中でインキュベートした場合に、Ｔｒｉｓ緩衝メタノールが、ＤＮＡ収量の改善およびＤＮＡメチル化マークの保存に関連し、これらの効果が３０％～７０％のメタノール濃度にまたがる緩衝剤中で観察されることを実証する。
配列表：
Figure 2023529314000009
Figure 2023529314000010
Figure 2023529314000011
Figure 2023529314000012
Figure 2023529314000013
Figure 2023529314000014
Figure 2023529314000015
Figure 2023529314000016
Figure 2023529314000017

Claims (104)

  1. メチル化ＤＮＡ配列を含む生体試料；および
    メタノールとｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ｔｒｉｓ）を含む保存溶液を含む組成物であって、
    前記メチル化ＤＮＡ配列のメチル化パターンが保存される、組成物。
  2. 前記ｔｒｉｓが、７．０～９．０のｐＨを有する、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記ｔｒｉｓが、７．５～８．５のｐＨを有する、請求項１に記載の組成物。
  4. 前記ｔｒｉｓが、７．５～８．０のｐＨを有する、請求項１に記載の組成物。
  5. 前記ｔｒｉｓが、１ｍＭ～２５０ｍＭの濃度で存在する、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
  6. 前記ｔｒｉｓが、１ｍＭ～１００ｍＭの濃度で存在する、請求項５に記載の組成物。
  7. 前記ｔｒｉｓが、５ｍＭ～５０ｍＭの濃度で存在する、請求項５に記載の組成物。
  8. 前記ｔｒｉｓが、５ｍＭ～２０ｍＭの濃度で存在する、請求項５に記載の組成物。
  9. 前記ｔｒｉｓが、２０ｍＭ～２５０ｍＭの濃度で存在する、請求項５に記載の組成物。
  10. 前記ｔｒｉｓが、２０ｍＭ～１００ｍＭの濃度で存在する、請求項５に記載の組成物。
  11. 前記ｔｒｉｓが、３０ｍＭ～７０ｍＭの濃度で存在する、請求項５に記載の組成物。
  12. 前記ｔｒｉｓが、３０ｍＭ～５０ｍＭの濃度で存在する、請求項５に記載の組成物。
  13. 前記ｔｒｉｓが、１０ｍＭの濃度で存在する、請求項５に記載の組成物。
  14. 前記ｔｒｉｓが、５０ｍＭの濃度で存在する、請求項５に記載の組成物。
  15. 前記保存溶液が、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）をさらに含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の組成物。
  16. 前記ＢＨＴが、１～５００ｐｐｍの量で存在する、請求項１５に記載の組成物。
  17. 前記ＢＨＴが、２０～２００ｐｐｍの量で存在する、請求項１６に記載の組成物。
  18. 前記ＢＨＴが、２５～１００ｐｐｍの量で存在する、請求項１６に記載の組成物。
  19. 生体試料および保存溶液を含む組成物であって、前記生体試料が、メチル化ＤＮＡ配列を含み、前記保存溶液が、メタノールおよびＢＨＴを含み、前記組成物が、前記生体試料のメチル化パターンを保存する、組成物。
  20. 前記ＢＨＴが、１～５００ｐｐｍの量で存在する、請求項１９に記載の組成物。
  21. 前記ＢＨＴが、２０～２００ｐｐｍの量で存在する、請求項１９に記載の組成物。
  22. 前記ＢＨＴが、２５～１００ｐｐｍの量で存在する、請求項１９に記載の組成物。
  23. エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含まない、請求項１から２２のいずれか一項に記載の組成物。
  24. 前記メチル化パターンが、少なくとも２週間保存される、請求項１から２３のいずれか一項に記載の組成物。
  25. 前記メチル化パターンが、少なくとも３週間保存される、請求項１から２３のいずれか一項に記載の組成物。
  26. 前記メチル化パターンが室温で保存される、請求項１から２５のいずれか一項に記載の組成物。
  27. 前記保存溶液中の前記生体試料の前記メチル化パターンが、保存前の前記生体試料における前記メチル化パターンと比較して、少なくとも６５％保存される、請求項１から２６のいずれか一項に記載の組成物。
  28. 前記試料がヒト生体試料である、請求項１から２７のいずれか一項に記載の組成物。
  29. 前記生体試料が、胃腸管、気道消化管、気道、尿生殖器管、または体液のいずれかに由来する試料である、請求項１から２８のいずれか一項に記載の組成物。
  30. 前記体液が、血液、尿、痰、唾液、便、胆汁、膵液、鼻汁、涙、精液、膣分泌物、脳脊髄液、胸膜液、腹水、胃液、心膜液、汗、リンパ液、嚢胞液、膵嚢胞液、滑液、関節液、月経液、子宮内膜洗浄液、胸部吸込物、または羊水のうちのいずれかである、請求項２９に記載の組成物。
  31. 前記生体試料が、食道、胃、結腸、小腸、膵臓、肝臓、口腔、中咽頭、気管、気管支樹、肺、または乳房のいずれかに由来する試料である、請求項１から２８のいずれか一項に記載の組成物。
  32. 前記生体試料が食道生体試料である、請求項３１に記載の組成物。
  33. 前記メタノールが１００％メタノールを含む、請求項１から３２のいずれか一項に記載の組成物。
  34. 前記メタノールが、水と混合された１０％から１００％のメタノールを含む、請求項１から３２のいずれか一項に記載の組成物。
  35. 前記メタノールが、水と混合された１０～９０％のメタノールを含む、請求項１から３２のいずれか一項に記載の組成物。
  36. 前記メタノールが、水と混合された２０～９０％のメタノールを含む、請求項１から３２のいずれか一項に記載の組成物。
  37. 前記メタノールが、水と混合された３０～９０％のメタノールを含む、請求項１から３２のいずれか一項に記載の組成物。
  38. 前記メタノールが、水と混合された３０～８０％のメタノールを含む、請求項１から３２のいずれか一項に記載の組成物。
  39. 前記メタノールが、水と混合された３０～７０％のメタノールを含む、請求項１から３２のいずれか一項に記載の組成物。
  40. 前記メタノールが、水と混合された４０～６０％のメタノールを含む、請求項１から３２のいずれか一項に記載の組成物。
  41. 前記メタノールが、過酸化物を含まないかまたは０．００１％未満もしくはそれに等しいレベルの過酸化物を含む、請求項３３から４０のいずれか一項に記載の組成物。
  42. 前記水が、蒸留、または限外濾過、または逆浸透によって精製される、請求項３４から４１のいずれか一項に記載の組成物。
  43. 前記水が、ＤＮＡｓｅおよび／またはＲＮＡｓｅ活性を有さない、請求項３４から４２のいずれか一項に記載の組成物。
  44. 前記メチル化ＤＮＡ配列が、ビメンチンもしくはＣＣＮＡ１遺伝子のヌクレオチド配列のいずれかと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるポリヌクレオチド配列、またはそのいずれかの断片および／もしくは相補体を含む、請求項１から４３のいずれか一項に記載の組成物。
  45. 前記メチル化ＤＮＡパターンが、室温（２３℃）で保存された場合に、前記組成物中で少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、１０時間、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、２週間、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１年、１８カ月または２年の間保存される、請求項１から４４のいずれか一項に記載の組成物。
  46. 前記メチル化ＤＮＡパターンが、４℃で保存された場合に、前記組成物中で少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、１０時間、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、２週間、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１年、１８カ月または２年の間保存される、請求項１から４４のいずれか一項に記載の組成物。
  47. 前記メチル化ＤＮＡパターンが、－３０℃から５０℃の間の範囲の温度で保存された場合に、前記組成物中で少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、１０時間、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、２週間、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１年、１８カ月または２年の間保存される、請求項１から４４のいずれか一項に記載の組成物。
  48. 前記メチル化ＤＮＡパターンが、－３０℃から３０℃の間の範囲の温度で保存された場合に、前記組成物中で少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、１０時間、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、２週間、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１年、１８カ月または２年の間保存される、請求項１から４４のいずれか一項に記載の組成物。
  49. 前記メチル化ＤＮＡパターンが、－１０℃から３０℃の間の範囲の温度で保存された場合に、前記組成物中で少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、１０時間、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、２週間、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１年、１８カ月または２年の間保存される、請求項１から４４のいずれか一項に記載の組成物。
  50. 生体試料中のメチル化ＤＮＡ分子のメチル化パターンを保存する方法であって、前記生体試料を保存溶液で処置するステップを含み、前記保存溶液がメタノールおよびｔｒｉｓを含み、前記メチル化パターンが室温で保存される、方法。
  51. 前記ｔｒｉｓが、７．０～９．０のｐＨを有する、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記ｔｒｉｓが、７．５～８．５のｐＨを有する、請求項５０に記載の方法。
  53. 前記ｔｒｉｓが、７．５～８．０のｐＨを有する、請求項５０に記載の方法。
  54. 前記ｔｒｉｓが、１ｍＭ～２５０ｍＭの濃度で存在する、請求項５０から５３のいずれか一項に記載の方法。
  55. 前記ｔｒｉｓが、１ｍＭ～１００ｍＭの濃度で存在する、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記ｔｒｉｓが、５ｍＭ～５０ｍＭの濃度で存在する、請求項５４に記載の方法。
  57. 前記ｔｒｉｓが、５ｍＭ～２０ｍＭの濃度で存在する、請求項５４に記載の方法。
  58. 前記ｔｒｉｓが、２０ｍＭ～２５０ｍＭの濃度で存在する、請求項５４に記載の方法。
  59. 前記ｔｒｉｓが、２０ｍＭ～１００ｍＭの濃度で存在する、請求項５４に記載の方法。
  60. 前記ｔｒｉｓが、３０ｍＭ～７０ｍＭの濃度で存在する、請求項５４に記載の方法。
  61. 前記ｔｒｉｓが、３０ｍＭ～５０ｍＭの濃度で存在する、請求項５４に記載の方法。
  62. 前記ｔｒｉｓが、１０ｍＭの濃度で存在する、請求項５４に記載の方法。
  63. 前記ｔｒｉｓが、５０ｍＭの濃度で存在する、請求項５４に記載の方法。
  64. 前記保存溶液が、ＢＨＴをさらに含む、請求項５０から６３のいずれか一項に記載の方法。
  65. 前記ＢＨＴが、１～５００ｐｐｍの量で存在する、請求項６４に記載の方法。
  66. 前記ＢＨＴが、２０～２００ｐｐｍの量で存在する、請求項６４に記載の方法。
  67. 前記ＢＨＴが、２５～１００ｐｐｍの量で存在する、請求項６４に記載の方法。
  68. 生体試料中のメチル化ＤＮＡ分子のメチル化パターンを保存する方法であって、前記生体試料を保存溶液で処置するステップを含み、前記保存溶液がメタノールおよびＢＴＨを含み、前記メチル化パターンが室温で保存される、方法。
  69. 前記ＢＨＴが、１～５００ｐｐｍの量で存在する、請求項６８に記載の方法。
  70. 前記ＢＨＴが、２０～２００ｐｐｍの量で存在する、請求項６８に記載の方法。
  71. 前記ＢＨＴが、２５～１００ｐｐｍの量で存在する、請求項６８に記載の方法。
  72. 前記保存溶液が、ＥＤＴＡを含まない、請求項５０から７１のいずれか一項に記載の方法。
  73. 前記メチル化パターンが、少なくとも２週間保存される、請求項５０から７２のいずれか一項に記載の方法。
  74. 前記メチル化パターンが、少なくとも３週間保存される、請求項７３に記載の方法。
  75. 前記保存溶液中の前記生体試料の前記メチル化パターンが、保存前の前記生体試料における前記メチル化パターンと比較して、少なくとも６５％保存される、請求項５０から７４のいずれか一項に記載の方法。
  76. 前記生体試料が前記保存溶液中で保存される、請求項５０から７５のいずれか一項に記載の方法。
  77. 前記試料がヒト組織または体液に由来する、請求項５０から７６のいずれか一項に記載の方法。
  78. 前記生体試料が、胃腸管、気道消化管、気道、尿生殖器管、または体液のいずれかに由来する試料である、請求項５０から７７のいずれか一項に記載の方法。
  79. 前記体液が、血液、尿、痰、唾液、便、胆汁、膵液、鼻汁、涙、精液、膣分泌物、脳脊髄液、胸膜液、腹水、胃液、心膜液、汗、リンパ液、嚢胞液、膵嚢胞液、滑液、関節液、月経液、子宮内膜洗浄液、胸部吸込物、または羊水のうちのいずれかである、請求項７８に記載の方法。
  80. 前記生体試料が、食道、胃、結腸、小腸、膵臓、肝臓、口腔、中咽頭、気管、気管支樹、肺、または乳房のいずれかに由来する試料である、請求項５０から７７のいずれか一項に記載の方法。
  81. 前記試料が食道試料である、請求項５０に記載の方法。
  82. 前記メタノールが１００％メタノールを含む、請求項５０から８１のいずれか一項に記載の方法。
  83. 前記メタノールが、水と混合された１０％から１００％のメタノールを含む、請求項５０から８１のいずれか一項に記載の方法。
  84. 前記メタノールが、水と混合された１０～９０％のメタノールを含む、請求項５０から８１のいずれか一項に記載の方法。
  85. 前記メタノールが、水と混合された２０～９０％のメタノールを含む、請求項５０から８１のいずれか一項に記載の方法。
  86. 前記メタノールが、水と混合された３０～９０％のメタノールを含む、請求項５０から８１のいずれか一項に記載の方法。
  87. 前記メタノールが、水と混合された３０～８０％のメタノールを含む、請求項５０から８１のいずれか一項に記載の方法。
  88. 前記メタノールが、水と混合された３０～７０％のメタノールを含む、請求項５０から８１のいずれか一項に記載の方法。
  89. 前記メタノールが、水と混合された４０～６０％のメタノールを含む、請求項５０から８１のいずれか一項に記載の方法。
  90. 前記メタノールが、過酸化物を含まないかまたは０．００１％未満もしくはそれに等しいレベルの過酸化物を含む、請求項５０から８９のいずれか一項に記載の方法。
  91. 前記水が、蒸留、または限外濾過、または逆浸透によって精製される、請求項８３から９０のいずれか一項に記載の方法。
  92. 前記水が、ＤＮＡｓｅおよび／またはＲＮＡｓｅ活性を有さない、請求項８３から９０のいずれか一項に記載の方法。
  93. ＤＮＡメチル化の前記パターンが、ビメンチン遺伝子の差次的にメチル化されたドメインまたはＣＣＮＡ１遺伝子の差次的にメチル化されたドメイン内でアッセイされる、請求項５０から９２のいずれか一項に記載の方法。
  94. ビメンチンの前記差次的にメチル化されたドメインが、配列番号１～５もしくは配列番号１８のいずれか１つと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるヌクレオチド配列またはその相補体および／もしくは断片を含む、請求項９３に記載の方法。
  95. ビメンチンの前記差次的にメチル化されたドメインが、配列番号１～５のいずれか１つと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるヌクレオチド配列、その相補体、またはその断片を含む、請求項９３に記載の方法。
  96. ＣＣＮＡ１の前記差次的にメチル化されたドメインが、配列番号６または７と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるヌクレオチド配列、その相補体、またはその断片を含む、請求項９３に記載の方法。
  97. 前記ヌクレオチド配列、前記相補体、または前記断片が、少なくとも２０ヌクレオチド長である、請求項９４から９６のいずれか一項に記載の方法。
  98. ＤＮＡメチル化の前記パターンが、前記ビメンチンもしくはＣＣＮＡ１遺伝子の前記ヌクレオチド配列のいずれかと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一であるヌクレオチド配列、またはそのいずれかの断片および／もしくは相補体を含むＤＮＡ分子と関連する差次的にメチル化されたドメイン内でアッセイされる、請求項５０から９２のいずれか一項に記載の方法。
  99. ＤＮＡメチル化の前記パターンが、前記ＤＮＡの、シトシン塩基をウラシルに変換する亜硫酸水素塩化合物による処理を含むステップによってアッセイされる、請求項５０から９８のいずれか一項に記載の方法。
  100. 前記メチル化ＤＮＡパターンが、室温（２３℃）で保存された場合に、前記組成物中で少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、１０時間、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、２週間、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１年、１８カ月または２年の間保存される、請求項５０から９９のいずれか一項に記載の方法。
  101. 前記メチル化ＤＮＡパターンが、４℃で保存された場合に、前記組成物中で少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、１０時間、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、２週間、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１年、１８カ月または２年の間保存される、請求項５０から９９のいずれか一項に記載の方法。
  102. 前記メチル化ＤＮＡパターンが、－３０℃から５０℃の間の範囲の温度で、前記組成物中で少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、１０時間、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、２週間、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１年、１８カ月または２年の間保存される、請求項５０から９９のいずれか一項に記載の方法。
  103. 前記メチル化ＤＮＡパターンが、－３０℃から３０℃の間の範囲の温度で、前記組成物中で少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、１０時間、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、２週間、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１年、１８カ月または２年の間保存される、請求項５０から９９のいずれか一項に記載の方法。
  104. 前記メチル化ＤＮＡパターンが、－１０℃から３０℃の間の範囲の温度で、前記組成物中で少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、１０時間、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、２週間、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１年、１８カ月または２年の間保存される、請求項５０から９９のいずれか一項に記載の方法。
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