JP3633932B2 - 糞便試料から単離した哺乳類の核酸を検出する方法、およびその検出用試薬 - Google Patents

糞便試料から単離した哺乳類の核酸を検出する方法、およびその検出用試薬 Download PDF

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Description

発明の背景
1.発明の分野
本発明は、糞便中の標的核酸の検出方法、およびその検出に有用な試薬に関する。
2.関連技術の説明
増加する一団の証拠が、ヒトのガンの誘発における重要な作用原因として身体の突然変異を関連づけている。これら身体の突然変異は以前には正常だった細胞のゲノムに蓄積し、その中のいくつかがその後悪性増殖に関連する表現型を示すのかもしれない。このような腫瘍形成性の突然変異はDNAの構造において多数の異なった型の変化を包含する可能性がある。すなわち、欠失、転座、および単一ヌクレオチドの変化等である。後者はまた点変異ともいわれており、種々の突然変異誘発性の化学薬品がこのような突然変異を誘発するという点で、発ガンに頻繁に介入し得る。さらにこのような突然変異は、DNAの複製におけるミスの結果、自然に発生する可能性もある。
組換えDNA技術の進歩により、増殖、発生、分化を制御する正常な細胞遺伝子（ガン原遺伝子およびガン抑制遺伝子）が発見された。ある状況では、これらの遺伝子による調節が変えられ、これらの遺伝子が正常な細胞に神経形成性の増殖挙動を行わせる。現在のところ、40以上のガン原遺伝子およびガン抑制遺伝子が知られており、これらはその機能特性に応じて種々の種類に分類される。すなわち、（１）増殖因子と増殖因子レセプター、（２）細胞内信号伝達経路（例えば、細胞質と核のと間）のメッセンジャー、および（３）遺伝子発現とDNA複製に影響を与える調節タンパク質などである。
点突然変異は多くのヒトの腫瘍の原因作用に直接関わってきた。いくつかの腫瘍は、ras遺伝子ファミリーのガン遺伝子をもっている。これらのガン遺伝子は、その遺伝子中のある限られた部位の１つに点突然変異が存在するという点で、正常な細胞性対立ガン原遺伝子と異なっている。同様に、p53のようなガン抑制遺伝子の重要な領域での点突然変異が腫瘍細胞の中にしばしば検出される。このような突然変異は、正常な細胞から腫瘍細胞を区別する、腫瘍細胞ゲノムにおける質的変化を表すものであり、かつ研究中の腫瘍の遺伝子的起源を診断するための基礎を提供する。活性なガン原遺伝子を作り出した突然変異の同定は、腫瘍発生の診断や、予後を知る上で重要な手掛かりを提供できる。例えば、多数の突然変異はras遺伝子の12番目のコドンを変え、正常に存在するグリシンをそれに替わる多数のアミノ酸残基のいずれかと置き換えることが発見されている。このようなアミノ酸置換は、強力な形質転換性対立遺伝子を作り出す。こうして、特定のヌクレオチド置換の存在は腫瘍細胞の挙動（例えば増殖率、侵入性など）の強い決定子となりうる。その結果、ガン遺伝子突然変異のDNAプローブは臨床腫瘍学における診断用試薬として有望である。
各種の新生物の中で、胃腸管内に発見される腫瘍の多くはガン遺伝子の突然変異と関連がある。この関連は、結腸直腸ガンにとって特に有意である。結腸直腸ガンは世界で３番目に最も多い悪性腫瘍であり、1992年には新たに57万人の患者が出るものと予測されている。米国だけでも同年中に６万人以上が結腸直腸ガンで死亡するであろう。このガンが進行してしまった患者の予後は極めて悪いが、腫瘍が転移する前であればいかなる段階であれ診断された結腸直腸腫瘍は、外科手術または結腸鏡検査法による１部切除によって通常は治癒可能である。したがって、外科手術によって切除可能な腫瘍を検知する方法は、この病気による死をかなり減らすことができた（Winawerら,J.National Cancer Institute,83:243,1991参照）。この目的に現在利用できる唯一の非侵襲性テストは潜血の有無を調べる糞便テストである。糞便血液テストはある状況では価値があるかもしれないが、このテストの有用性は議論を巻き起こす。糞便中にヘモグロビンが現れることは新生物に特異的なものではないというのが理由の１部である（Ransohoffら,New England Journal of Medicine,325:37,1991;Millerら,Int.J.Cancer,46:761,1990参照）。この議論が直腸および結腸の新生物を検出することのできるより信頼性のある、さらなる非侵襲性テストを開発しようとする努力を刺激したが、このような試みは失敗に終わっている。本発明はこの必要性に取り組むものである。
発明の要約
本発明は、胃腸に新生物をもつ患者から取った糞便検体中には、胃腸の新生物に関連のある突然変異ヌクレオチド配列をもつ核酸が検知可能なレベルで存在するという予期せぬ発見から生まれたものである。
この発見の結果、本発明は胃腸の新生物と関連のある突然変異ヌクレオチド配列を検出するための、非侵襲性で迅速かつ正確な方法を提供することによって、組織生検のような技法に対し有為な進歩を示す。この知見に基づき、他の病状と関連がある種々の他の標的核酸を検出することも今や可能である。
図面の説明
図１。糞便中のRAS遺伝子の突然変異をプラークハイブリッド形成法によって同定した。Ｋ−rasの最初のコーディングエキソンを含むPCR産物は、患者１、２および10（表１参照）の糞便から抽出したDNAより作製し、バクテリオファージベクターにクローン化した。このプラークリフト（lift）を天然型Rasに特異的なオリゴヌクレオチド、12valに特異的なオリゴヌクレオチド（突然変異プローブ１）、および13aspに特異的なオリゴヌクレオチド（突然変異プローブ２）とハイブリダイズさせた。突然変異体特異的オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成のために使用したプラーク数は、統計的に有意な数のバイブッド形成プラークを得るために、天然型特異的オリゴヌクレオチドに対して使用した数より５倍多くした。突然変異特異的プローブと天然型特異的プローブに対するハイブリッド形成プラーク数の比は、患者１および２ではそれぞれ0.08:1と0.04:1であった。
図２。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅産物についてサザンブロット法によるアッセイを行い、RAS遺伝子の突然変異を検出した。Ｋ−rasの最初のコーディングエキソンを含むPCR産物は、患者１、３、４および11の糞便と腫瘍から抽出したDNAより作製した。PCR産物を２％のアガロースゲルを通して電気泳動にかけてからナイロンフィルターに移した。このブロットを天然型RASに特異的なオリゴヌクレオチドプローブ（下段のパネル）、12asp突然変異に特異的なオリゴヌクレオチドプローブ（中段のパネル）または12val突然変異に特異的なオリゴヌクレオチドプローブ（上段のパネル）とハイブリダイズさせた。患者３および４から取った糞便と腫瘍のDNA試料は、12asp突然変異を含有し、患者１から取ったそれは12val突然変異を含有していた。患者11の糞便DNAと腫瘍DNAは両方とも、これらの突然変異のいずれも含有していなかった。
発明の詳細な説明
本発明は糞便中に存在する突然変異ヌクレオチド配列をもつ核酸を検出する方法に関するもので、変化した核酸配列が存在するということは胃腸管における新生物と関連しているのである。
その最も広い意味において、本発明は診断的または治療的に適切な任意の標的核酸配列を、もし該標的配列が糞便中に存在するのであれば、検出することを可能にする。したがって標的ヌクレオチド配列は、例えば突然変異ヌクレオチド、制限断片長多型（RFLP）、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド置換、または興味のある他のいかなる哺乳類核酸配列であってもよい。
１つの態様において、本発明の方法は良性および悪性の新生物に関連する突然変異ヌクレオチド配列の検出に適用できる。好ましい態様においては、大腸および小腸の両方、膵臓および胃を含む胃腸管における新生物が検出される。尤も、本発明の方法は、標的の配列が検出可能なレベルで糞便中に存在しさえすれば、その起源に関わりなくいかなる新生物の突然変異ヌクレオチド配列を検出するのにも使用可能である。
小腸の良性新生物にはアデノーマ（腺腫）、平滑筋腫、脂肪腫、および血管腫が含まれ、他方大腸の良性新生物は主として腺腫様ポリープである。小腸の悪性新生物には腺ガン、平滑筋肉腫、リンパ腫およびカルチノイド（類がん腫）が含まれる。大腸および結腸の場合は、結腸直腸ガンが同定されているもののうち最もよく見られる悪性新生物である。
異常な遺伝子産物を産生する突然変異ヌクレオチド配列をもった数多くの核酸は、種々の新生物に関連していることが知られている。最も一般的な突然変異ヌクレオチド配列にはガン遺伝子とガン抑制遺伝子、例えばMCC、DCC、APC、FAPおよびp53がある。本発明において特に意義があるのは、Ｋ−ras突然変異ガン遺伝子とp53ガン抑制遺伝子の検出である（Vogelstein,Nature,348:681,1990参照）。DCC、MCC、APCおよびp53の検出に関するさらなるサポートが、出願中の複数の米国特許出願の中に見いだされる。それらは、1990年１月４日に出願の460、981号、1991年３月13日出願の07/670、611号、1991年８月８日出願の07/741,940号および1989年12月６日出願の446、584号であり、参照としてここに組み込んでいる。
本発明の方法によって糞便検体を分析するためには、試料中に存在する哺乳類の核酸を分離する必要がある。糞便から哺乳類の核酸を調製するには２つの主要な問題がある。第１は、哺乳類の核酸を哺乳類の細胞から遊離しなければならず、またバクテリアの細胞から分離しなければならないことである。この手段は次の事実によってさらに複雑になる。すなわち、バクテリアの細胞から核酸を放出するのは避けることが望ましいということである。なぜなら糞便検体中では真核細胞の核酸に比べてバクテリアの核酸の方が夥しく過剰だからである。第２は、いったん遊離されると哺乳類の核酸は、糞便内に存在して遊離した哺乳類の核酸を分解し、それにより分析を妨げる比較的高濃度のヌクレアーゼから保護することが可能なことである。本発明では特別に考案した糞便溶解緩衝液で糞便をインキュベートすることによってこのような厳しい規準に対処できることを発見した。この糞便溶解緩衝液は、少なくとも約500mMの高濃度でpHは最低約8.0でさらにEDTA等のキレート化剤を含む緩衝液と、比較的低濃度、好ましくは10mM未満の塩を含む。
糞便溶解緩衝液はそのpHとキレート化特性によって核酸の分解を最少にし、バクテリアの細胞は溶解しないが真核細胞を溶解する。そしてこの緩衝液は、得られた真核細胞核酸を精製および／または濃縮する処理にも適している。糞便溶解緩衝液で処理した後、試料はバクテリアや他の不要な残留物を取り除く処理（例えば遠心分離）にかけられる。次に、溶解物の非微粒子画分をSDS（１％）中でプロテイナーゼ（例えば、0.5μg/mlのプロテイナーゼＫ）とともにインキュベートしてヌクレアーゼやその他のタンパク質を分解する。試料中の核酸は化学的手段でさらに分離することができる。例えば、フェノール／クロロフォルム、酢酸アンモニウムを用いた抽出による核酸からのペプチドの分離や、エタノールを用いた沈殿などである。
さらに、糞便はまた、もし糞便核酸中に存在する突然変異ヌクレオチド配列を例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって増幅するのであれば、除外することが望ましい阻害物質を含有することが分かっている。これら阻害物質の１つは、TaqポリメラーゼによるDNA増幅を阻害する。この阻害物質は、糞便核酸を例えば6.0Mのヨウ化ナトリウムまたは過塩素酸ナトリウム等のカオトロピック塩の存在下で固定マトリックスに結合させることによって除去可能である。驚くべきことに、ガラスがこの目的のための好ましいマトリックスであることが分かった。特に好ましい市販ガラスは、Prep−Ａ−Gene（登録商標）（Bio−Rad製）とSpin−Bind（登録商標）（FMC製）である。
糞便中に存在する他の阻害物質は核酸がガラスに結合するのを妨げる。この第２の阻害物質の除去は少なくとも約1.0Mのような高濃度の塩の存在下で修飾（modified）イオン交換樹脂（たとえばQiagen）にその阻害物質を結合することにより可能である。糞便検体から哺乳類の核酸を選択的に入手できることがいったん認識されたならば、当業者であれば糞便検体由来の哺乳類DNAを濃縮および／または精製する上述のプロセスを変更する種々の方法を考えることができる。または、糞便検体に対してこのような方法が実際に適用できることが公知となった今、当業者は過度の実験を行なうことなく、ここに記述されている試薬や条件に機能的に等しい替りの試薬や条件をみつけ出すことが可能である。このような変更ならびに機能的等価物は、本発明に包含される。
本発明で言及するアミノ酸は以下の３文字または１文字の略語によって同定することができる。
Figure 0003633932
検出前に突然変異ヌクレオチド配列を増幅することが望ましい時は、増幅のためのプライマーであるオリゴヌクレオチドを使ってこの増幅が達成できる。これらユニークなオリゴヌクレオチドプライマーは、突然変異ヌクレオチドと相接するフランキング領域の同定に基づいている。例えば、Ｋ−rasの場合、これらのオリゴヌクレオチドプライマーは、フランキングヌクレオチド配列である５′−TCCTTAAGTACTGACTTATATTTGAACA−３′および／または５′−TAGCTTAAGATACGTATAATTTTGTTCTAA−３′およびこれらに相補的な配列とハイブリッド形成ができる配列を含む。
本発明の方法にしたがって使用できるプライマーは、標的核酸を含有するかなりの数の核酸分子の重合の特異的開始をもたらすのに十分な長さと適切な配列をもつオリゴヌクレオチドを包含する。こうして興味のある核酸を含有する特異的な標的核酸配列を選択的に増幅することが可能となる。特にここで使用しているプライマーという用語は、２個またはそれ以上、好ましくは少なくとも８個のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含む、標的の核酸鎖に対して実質的に相補的な、プライマー伸長産物の合成を開始することがができる配列をいう。オリゴヌクレオチドプライマーは典型的には15〜22個またはそれ以上のヌクレオチドを含有している。尤も、これより少ないヌクレオチドを含有することもある。
合成を促進する実験条件には、ヌクレオシド三リン酸および重合剤（例えばDNAポリメラーゼ）の存在、および適切な温度とpHが含まれる。増幅の効率を最大にするためにはプライマーは１本鎖であることが好ましいが、２本鎖でもよい。もしプライマーが２本鎖であれば、伸長産物の作製に使用する前にまずその鎖を解離する処理を施す。プライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドであることが好ましい。プライマーは重合誘発剤の存在下で伸長産物の合成を開始させるのに十分な長さのものでなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、緩衝液およびヌクレオチド組成などの多くの要素によって決る。
本発明の方法にしたがって使用されるプライマーは、増幅すべき突然変異ヌクレオチド配列の各鎖に「実質的に」相補的であるように設計されている。実質的に相補的であるという意味は、重合剤が機能できる条件下で、各々の鎖でハイブリダイズするのに十分なだけプライマーが相補的でなければならないということである。つまり、プライマーはフランキング配列に対してそれとハイブリダイズするのに十分な相補性をもち、突然変異ヌクレオチド配列の増幅を可能にしなければならない。伸長されるプライマーの末端が相補性フランキング配列に対し、完全な塩基対を成す相補性をもっていることが好ましい。
本発明にしたがって使用されるオリゴヌクレオチドプライマーは、標的核酸の量を増やすいかなる増幅方法においても用いられる。典型的には、片方のプライマーが突然変異ヌクレオチド配列の陰性（−）鎖に相補的であり、他方のプライマーが陽性（＋）の鎖に相補的である。変性した核酸へのプライマーのアニーリング、およびそれに続く酵素、例えばDNAポリメラーゼＩ（クレノウ酵素）またはTapポリメラーゼなどの大きな断片、およびヌクレオチドまたはリガーゼなどによる伸長は、その結果標的核酸を含有する新たに合成されたプラスとマイナスの鎖が生じる。これらの新規合成核酸もまた鋳型となるので、変性、プライマーのアニーリング、および伸長のサイクルの繰り返しは、プライマーによって決定された領域（すなわち、標的の突然変異ヌクレオチド配列）を指数関数的に産生することになる。増幅反応産物は、使用した特定のプライマーの両末端に対応する末端を有する分離した核酸の２本鎖である。当業者は、標的核酸のコピー数を増やすために使用できる他の増幅方法論を知っているであろう。
本発明に使用されるオリゴヌクレオチドプライマーは任意の適切な方法、例えば従来のリン酸トリエステル法、リン酸ジエステル法、またはそれらの自動化された態様を用いて作製可能である。このような自動化された態様の１つにおいては、ジエチルホスホアミダイト（diethylphosphoramidites）を出発物質として使用し、Beaucageら（Tetrahedron Letters,22:1859−1862、1981）の記述にしたがって合成が可能である。修飾された固体担体上にオリゴヌクレオチドを合成する１つの方法は米国特許4,458,066号に記載されている。本発明にしたがって使用できる増幅法の１つは米国特許4,683,202号および4,683,195号に記載されているポリメラーゼ連鎖反応（PCR）である。
精製された形であれ、未精製の形であれ、いかなる糞便検体核酸も、もしそれが標的核酸を含有する特異的核酸配列を含んでいるか、または含んでいると推測されるならば、出発核酸として利用できる。したがって、本発明の方法はDNAまたはRNA（メッセンジャーRNAを含む）を用いることができ、このDNAまたはRNAは１本鎖でも２本鎖でもよい。もしRNAを鋳型として用いる場合には、鋳型をDNAに逆転写するための最適な酵素および／または条件が用いられるであろう。さらに、それぞれの鎖１本を含有するDNA−RNAハイブリッドも使用できる。複数の核酸の混合物もまた使用可能である。または、同一あるいは異なるプライマーを用いてここに記述した先の増幅反応で産生された複数の核酸も同様に利用できる。増幅すべき突然変異ヌクレオチド配列は大きい分子の画分であってもよく、または特異的配列が全核酸を構成するように初めから１個の分子として存在することもできる。増幅すべき配列を初めに純粋な形で存在させる必要はない。それは、ヒトのDNA全体に含まれているような複雑な混合体の小画分であってもよい。
試料中の標的突然変異ヌクレオチド配列が２本鎖を含有している場合は、鋳型として使用に供する前にその核酸鎖を解離する必要がある。鎖の解離は１つの分離した工程として実施することもできるし、またはプライマー伸長産物の合成と同時に行うこともできる。この鎖の解離は、物理的、化学的、または酵素による手段を含む種々の適切な変性条件を用いて達成できる。「変性」という用語は、このようなすべての手段を包含する。核酸鎖を解離する物理的方法の１つは、核酸をそれが変性するまで加熱することである。典型的な熱変性は、温度が約80℃から105℃までの範囲で時間は約１分から10分までの範囲である。鎖の解離は、また、ヘリカーゼ（DNA巻き戻し酵素）として知られているクラス由来の酵素によって、あるいはヘリカーゼ活性をもち、かつリボATPの存在下でDNAを変性させることが知られている酵素RecAによっても引起こすことが可能である。ヘリカーゼを用いた核酸の鎖解離に適した反応条件は、Kuhn Hoffmann−Berling（CSH−Qantitative Biology,43:63,1978）に記述されており、またRecAを使用するための技法についてはC.Radding（Ann.Rev.Genetics,16:405−437,1982）に考察されている。
増幅すべき標的核酸を含有する核酸が１本鎖であれば、１種類または２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを加えてその相補鎖を合成する。もし１種類のプライマーを用いるのであれば、プライマー伸長産物は、プライマー、重合剤および下記に述べる４つのヌクレオシド三リン酸の存在下で合成される。プライマー伸長産物は上記の１本鎖核酸に相補的になるであろう。そして、その産物は１本鎖の核酸とハイブリダイズして長さが不揃いの２本鎖を形成し、これが次に１本鎖に解離されて、２本の解離した相補的１本鎖が産生される。または、２種類のプライマーを１本鎖の核酸に添加して、上記の通りに反応を行ってもよい。
核酸または複数の核酸の相補的２本鎖が解離されると、その核酸がもともと２本鎖であろうが１本鎖であろうが関係なく、解離された鎖はさらなる核酸鎖の合成のための鋳型としてすぐ使用できる。この合成は、プライマーと鋳型とのハイブリッド形成を起こす条件下で実行される。一般に、合成は緩衝化された、好ましくはpHが７〜９、もっとも好ましくはpHが約８の水溶液の中で行われる。過剰のモル数の２種類のオリゴヌクレオチドプライマー（ゲノム核酸について、通常はプライマー：鋳型は約108:1）を、解離された鋳型の鎖を含有する緩衝液に加えるのが望ましい。しかし、もし本発明の方法が診断の目的で使用されるならば、相補鎖の量は分らないであろう。したがって、相補鎖の量に対するプライマーの量をしかと決定できないことが分かる。しかし、実際問題としては、増幅すべき配列が、複雑な長い核酸鎖の混合物に含まれているときは、プライマーの添加量は相補鎖（鋳型）の量よりもモル数が過剰となろう。この方法の効率を上げるためには、大きなモル数の過剰が望ましい。
いくつかの増幅の態様では、基質、例えばデオキシリボヌクレオチド三リン酸、dATP,dCTP,dGTPおよびdTTPを合成混合物に対して単独でまたはプライマーと一緒に十分な量を添加する。得られた溶液を90℃〜100℃になるまで約１分から10分間、好ましくは１分から４分間、加熱する。この加熱時間が過ぎたら、溶液を室温まで冷やす。室温はプライマーとのハイブリッド形成に好ましい。この冷却した混合物に、プライマー伸長反応をもたらすための適当な作用物質（ここで「重合剤」と称しているもの）を添加する。そして、この技術分野で公知の条件下でこの反応を引き起こす。重合剤が熱に対して安定であるならば、他の試薬と一緒に添加することも可能である。この合成（すなわち増幅）反応は、室温から重合剤がこれ以上高温ではもう機能しないという温度までの間で起り得る。したがって、例えばもしDNAポリメラーゼが重合剤として使用されるならば、温度は一般に約40℃以下である。尤も都合のよいことに、この反応は室温で起る。
重合剤はプライマー伸長産物の合成を達成するために機能する化合物または系（酵素を含む）であれば、いかなるものでもよい。この目的に適した酵素には、例えばE.coli DNAポリメラーゼＩ、Taqポリメラーゼ、E.coli DNAポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、T4 DNAポリメラーゼ、ほかに利用可能なDNAポリメラーゼ、ポリメラーゼムテイン、逆転写酵素、リガーゼ、熱安定酵素、（すなわち、変性を起こすのに十分なだけ上昇させた温度に晒された後でプライマー伸長を行う酵素類）を含む他の酵素類がある。適切な酵素はヌクレオチドの結合を適切に促進して各突然変異ヌクレオチド鎖に対して相補的なプライマー伸長産物を形成させるであろう。一般に合成は各プライマーの３′末端から始まって、鋳型鎖に沿って合成が終了するまで５′方向に進み、違った長さの分子を産生する。しかし、上記と同じ方法を用いて５′末端から合成を開始して、反対方向に進む重合剤もあり得る。いずれにしても、本発明の方法はここに述べた増幅の態様に限定されるものではない。
この新しく合成された突然変異ヌクレオチド鎖とその相補核酸鎖は、上記のハイブリッド形成条件下で２本鎖分子を形成するであろう。このハイブリッドを本発明の後の工程で使用する。次の工程でこの新たに合成された２本鎖分子を上記の手順のいずれかを使用して変性条件下に置き、１本鎖分子を得る。
この１本鎖分子に対して上記の増幅プロセスを繰り返す。必要なら、上記の条件下で反応が進むように追加の重合剤、ヌクレオシド、およびプライマーをさらに加えてもよい。再度、各オリゴヌクレオチドプライマーの１端から合成が開始され、鋳型の１本鎖に沿って合成が進みさらに核酸が産生される。この工程の後、伸長産物の半分は２つのプライマーによって限定された特異的核酸配列からなるであろう。
この変性と伸長産物合成の工程は、検出に必要な程度にまで標的突然変異ヌクレオチド配列を増幅するために必要なだけ頻繁に繰返すことができる。産生される突然変異ヌクレオチド配列の量は、指数関数的に累積するであろう。
増幅産物は放射性プローブを使わずにサザンブロット法により分析することにより検出できる。例えば、このようなプロセスでは極めて低レベルの突然変異ヌクレオチド配列を含有しているDNAの少量サンプルが増幅され、サザンブロット法の技法によって分析される。非放射性プローブまたは標識の使用は、高レベルの増幅信号によって容易になる。
本発明の方法によって検出された突然変異をもつ核酸は、溶液中でまたは固体担体に結合した後、特異的DNA配列の検出に通常使われている任意の方法によってさらに評価、検出、クローン化、配列決定等を行うことができる。これらの方法には、PCR法、オリゴマー制限法（Saikiら,Bio/Technology,３:1008−1012,1985）、対立遺伝子−特異的オリゴヌクレオチド（ASO）、プローブ分析法（Connerら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:278、1983）、オリゴヌクレオチド連結反応アッセイ（OLAs）（Landegrenら、Science,241:1077,1988）などがある。DNA分析のための分子技術はすでに考察されている（Landegrenら,Science,242:229−237,1988）。こうして、検出すべき突然変異ヌクレオチド配列がＫ−rasである好ましい態様においては、５′−CCTCGACAACCGCATCCGTT−３′,5′−CCTCGACTACCGCATCCGTT−３′，または５′−CCTCGACCACTGCATCCGTT−３′、およびこれらに相補的な配列を含む突然変異ヌクレオチド配列とハイブリダイズできるハイブリダイゼーションプローブが使用される。
本発明の１つの態様においては、10〜50塩基対からなる介在配列またはオリゴヌクレオチド配列を含有する精製した核酸断片に、放射線で標識をする。標識された調製品はサザンハイブリダイゼーション法によって糞便由来の核酸を釣り上げるために用いる。増幅前または増幅後に糞便由来のヌクレオチド断片をゲル電気泳動にかけて、異なる分子質量の複数の断片に分離し、核酸と結合するフィルターに移す。このフィルターを、標的核酸配列を含有するヌクレオチド断片とハイブリダイズするであろう標識プローブに暴露した後、放射性プローブの標的核酸断片への結合をオートラジオグラフィーによって同定する［Genetic Engineering、１、ed.Robert Williamson,Academic Press,（1981）72−81参照］。または，糞便由来の核酸を、放射性プローブが興味のある特定配列をもつ核酸を選択的にそこに結合して行くフィルターに直接結合することができる。結合の度合いは放射能の放出値を直接計測することによって定量することができる。
標的の核酸を増幅しない場合は、単離した哺乳類核酸に対して適当なハイブリダイゼーションプローブを使用する検出を直接行うことができる。標的の核酸を増幅する場合には、適当なハイブリダイゼーションプローブでの検出は増幅の後で行なう。
本発明のプローブは、検出された特定断片の分布を調べるのに用いることができる。また、特定の強く結合（ハイブリダイズ）している配列の発生を確認するため、プローブの結合の量的（相対的）度合いを調べるためにも用いることでできる。このようにして本発明のプローブは、ある個人の新生物による病気（例えば結腸直腸ガン）に対する危険が小さいか大きいかの可能性を示す。
大抵の場合、プローブは最も一般的には放射性核種およびそればかりでなくおそらく重金属を用いて、原子または無機の基で標識される。放射性標識をもちいるのが好都合である。放射性標識には32P、125I、3H、14Cなどが含まれる。十分な信号を供給し、且つ十分な半減期をもつ放射性標識であればどれでも使用できる。その他の標識には、標識されたリガンド等のための特異的結合対メンバーとしての役割を果たすことのできるリガンドがある。多種多様の標識がイムノアッセイに使われている。本発明におけるアッセイにもそれらは容易に使用できる。標識の選択は、プローブの突然変異ヌクレオチド配列へのハイブリッド形成と結合の率に対する標識の効果によって決定されるであろう。標識はハイブリッド形成に利用された突然変異ヌクレオチド配列の量を検出するのに十分な感度を提供する必要があろう。他に考慮することは、プローブの合成の容易さ、器具類の入手の容易さ、自動化能力、便利さ、などであろう。
標識をプローブに結合する方法は標識の性質によって変わるであろう。放射性標識については、多様な技術が使用できる。一般に用いられているのは32P−dNTPを使ったニックトランスレーションか、またはアルカリ性ホスファターゼを用いて末端リン酸の加水分解を行なった後、32P−NTPとT4ポリヌクレオチドオチドキナーゼを使用して、放射性32Pで標識することである。あるいは、存在する１つまたはそれ以上の元素を放射性アイソトープで置換する（例えば水素をトリチウムで置換する）場合にもヌクレオチドを合成することが可能である。所望であれば、ハイブリッドを形成する標識の濃度を高めるため、プローブとして相補的標識鎖を用いることもできる。
他の放射性核種の標識が関与する場合は、各種の連結基（linking group）を使用できる。末端水酸基を32Pホスフェートなどの無機酸、または14C有機酸などでエステル化して、標識に連結基を提供することができる。あるいは、中間塩基を活性化可能な連結基で置換してからそれを標識に連結させることも可能である。
リポーター基として興味のある酵素は主として加水分解酵素、特にエステラーゼとグリコシダーゼ、または酸化還元酵素、特にペルオキシダーゼであろう。蛍光性化合物についてはフルオレセインとその誘導体、ローダミンとその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン等がある。化学発光剤にはルシフェリン（発光素）と２、３−ジヒドロフタラジンジオン（例えばルミノール）がある。
本発明のプローブは、水に不溶性の多孔性担体に固定したヌクレオチド配列とのハイブリッド形成にも使用できる。核酸の起源に応じて、その担体に核酸を固定する方法は異なる。当業者であれば本発明の方法に使用できる異なる担体を知っているか、または容易に見出すことができる。
糞便検体由来の核酸をフィルターに点在させるか広げるかして、複数の個別の部分を設ける。フィルターは不活性な多孔性固体担体、例えばニトロセルロースである。糞便中に存在する哺乳類細胞はすべて、その核酸を遊離するよう処置を施す。核酸の溶解、変性ならびにその後の洗浄については、適切な溶液を用いて、細胞を溶解して核酸を変性させるのに十分な時間を費やせば達成できる。溶解については、糞便溶解緩衝液のところで先に述べたように化学的溶解法が便利に利用できる。他の変性因子としては、温度を上げること、有機試薬、例えばアルコール、アミド、アミン、尿素、フェノール、およびスルホキシド、またはある種の無機イオン、例えばチオシアネートおよびペルクロレートなどが含まれる。
変性後、フィルターを水性緩衝化溶液（例えばトリス）中で一般にはpHが約６〜８、通常はpH7で洗浄する。洗浄は、溶解と変性のために行なったのと同じ操作を都合よく用いて、１回またはそれ以上行うことができる。溶解、変性、洗浄が完了した後、核酸を点在させたフィルターを、一般的には約50℃から70℃までの高温で、乾燥させる。この操作のもとで、核酸はその場に固定され、都合のよいときにプローブで分析できる。
プレ−ハイブリッド形成を以下のようにして行うことができる。すなわち、フィルターを軽く上昇させた温度で、十分時間をかけて、プローブなしのハイブリッド形成溶液と共にインキュベートし、フィルターを完全に濡らすことにより達成できる。種々のハイブリッド形成溶液が利用できるが、これらは不活性極性有機溶剤を20〜60容量％、好ましくは30容量％含むものである。よく使用されるハイブリッド形成溶液は約50％のホルムアミド、約0.5〜1Mの塩化ナトリウム、約0.05〜0.1Mのクエン酸ナトリウム、約0.05〜0.2％のドデシル硫酸ナトリウム、およびそれぞれ少量のEDTA、フィコール（約300〜500kD）、ポリビニルピロリドン（約250〜500kD）および血清アルブミンを用いる。さらにハイブリッド形成溶液の中に含有されるものとしては、一般に、約0.5−5mg/mlの超音波で処理した変性DNA、例えばコウシの胸腺またはサケの精液であり、また場合により約0.5−２重量／容量％のグリシンがある。他の添加物も含有させてよい。例えば、約100−1,000kDのデキストラン硫酸をハイブリッド形成溶液の約８〜15重量％の量で加える。
本発明にとって、特別なハイブリッド形成技術は不可欠ではない。他のハイブリッド形成技術がGallおよびPardue,Proc.Natl.Acad.Sci.63:378、1969およびJohnら,Nature,223:582,1969に記述されている。ハイブリッド形成技術に種々の改良がなされるにつれ、それらをどんどん本発明の方法に適用することが可能である。
ハイブリッド形成溶液中に存在する標識プローブの量は、標識の性質、フィルターに合理的に結合できる標識プローブの量、およびハイブリッド形成の厳密度（stringency）によって大幅に変動する。一般的には、固定した標的核酸へのプローブの結合率を高めるために、プローブの化学量論的濃度を実質的に越えて用いられるだろう。
ハイブリッド形成の厳密度を様々な度合にすることが可能である。条件が厳しければ厳しいほど、プローブと１本鎖標的核酸配列の間の、２本鎖となるためのハイブリッド形成に要求される相補性が大きくなる。厳密度は、温度、プローブ密度、プローブの長さ、イオン強度、時間などによって制御できる。ホルムアミドの濃度を20％〜50％の範囲で操作することによって、反応溶液の極性を変えて、ハイブリッド形成の厳密度を変えるのが便利である。用いる温度は普通約20℃〜80℃で、通常は30℃〜75℃であろう（Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel,ed.,Wiley ＆ Sons,1989を全般的に参照）。
フィルターをハイブリッド形成が起こるに十分な時間穏当な温度でハイブリッド形成溶液に接触させた後、このフィルターを第２の溶液に導入する。この溶液は、ハイブリッド形成溶液のそれらと類似の塩化ナトリウム濃度、クエン酸ナトリウム濃度、およびドデシル硫酸ナトリウム濃度を有する。フィルターを第２溶液中に保持する時間は５分から３時間、またはそれ以上に及んでもよい。この第２溶液は、厳密度、溶解性交差２本鎖（dissolving cross duplexes）および短い相補配列を決定する。該フィルターをクエン酸ナトリウム−塩化ナトリウムの希釈液を使って室温で洗浄した後、標識の性質にしたがって２本鎖の有無を調べることが可能となる。標識が放射性の場合は、フィルターを乾燥してＸ線フィルムに暴露する。
本発明のアッセイに使用する材料はキットの作製に理想的にかなっている。このようなキットはきっちりと区切ったスペースの中に１つまたはそれ以上の容器手段、例えばバイアル、試験管等が納まるように区切られているキャリアー手段を含み、各容器手段は本発明の方法に使用される別々の要素の１つを含む。
例えば、容器手段の１つは検出可能なように標識されているかまたはそのように標識され得るハイブリダイゼーションプローブを含有していてもよい。第２の容器手段は糞便溶解緩衝液を含有していてもよい。このキットはまた標的の核酸配列の増幅用ヌクレオチドを含有する容器手段および／またはリポーター手段を含有する容器を有してもよい。リポーター手段とは、例えばビオチン結合タンパク質等、リポーター分子に結合しているアビジンまたはストレプトアビジン等、酵素的、蛍光性、または放射性核種の標識などを含む。
上述の開示は本発明を全般的に説明するものである。以下に記述する特定の実施例を参照するといっそう完璧な理解が得られるであろう。これらの実施例はただ説明の目的でここに提示したものであり、何ら本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１
糞便検体からの新生物DNAの検出
最初の検討は、コドン12又は13におけるＫ−ras遺伝子突然変異の存在について、24人の患者からの腫瘍を分析するために行った。これらケースは、連続組の臨床患者を含み、結腸鏡検査のための腸試料の採取又は外科手術前に彼らから糞便サンプルを得ることができた。その後、彼らに直径が1cmより大きい悪性結腸直腸腫瘍（癌腫）又は良性腫瘍（腺腫）のいずれかがあることが見出された。この大きさの腺腫は、それより小さな腫瘍よりも悪性に進行し易いので、臨床的に最も重要である。
これら腫瘍の低温切片から精製したDNAから、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いてＫ−ras遺伝子の第１エクソンを増幅した（フィーロン（Fearon）ら,Nature,318:377,1985）。PCR用のセンスプライマーは5'−AGGAATTCATGACTGAATATAAACTTGT−3'であり、アンチセンスプライマーは5'−ATCGAATTCTATGCATATTAAAACAAGATT−3'であった。これらプライマーは、クローニングを容易にするためにそれらの5'末端においてEcoR I部位を含んだ。PCRの各サイクルは、95℃で30分間の変性工程、その後の55℃で30分間のアニーリング工程及び70℃で45分間の延長工程からなるものであった。各PCRについて、500ng鋳型DNA及び５ユニットTaqポリメラーゼを、1.5mM dNTP、16.6mM硫酸アンモニウム、67mMトリス（pH8.8）、8,67mM MgCl2、10mMβ−メルカプトエタノール、及び10％ジメチルスルホキシドを含有する50μｌ反応液中で用いた。この具体例では、腫瘍DNAについては35サイクルを行い、糞便DNAについては45サイクルを行った。
このPCR産物をまとめてクローン化し、突然変異を同定するためにプールした。フェノール−クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によってPCR産物を精製した。それらをEcoR Iで切断し、再精製し、そして約50ngのDNAをラムダZap IIベクターアーム（ストラタジェン（Stratagene））に連結して、メーカーの説明書に従ってパッケージした。XL Iブルー細胞（ストラタジェン）を、バクテリオファージ、及びヘルパーファージを用いて得られた二本鎖プラスミドに感染させた（ニグロ（Nigro）ら,Nature,342:705,1989）。最小の100クローンを、プライマー5'−ATTCGTCCACAAAATGAT−3'を用いる配列分析のためのプールした。この検討で、24個の腫瘍のうち９個（37％）が、このエクソンの突然変異を含んでいることが見出された。３つの異なる突然変異（コドン12:gly→val又はasp;コドン13:gly→asp）を同定した。これらデータは、約50％がRas遺伝子突然変異を含有し、その突然変異の84％がＫ−rasのコドン12又は13に限られていることを示した類似の腫瘍における前の検討結果（ボゲイシュタイン（Vogeistein）ら,N.Engl.J.Med.,319:525,1988）と一致している。
次に、この９人の患者のうち最初の２人の患者からの糞便を分析した。DNAを精製する幾つかの方法を評価して、最も再現性の高い操作をその後に用いた。この操作では、−80℃で凍結した約100mgの糞便を300μｌの溶解緩衝液（500mMトリス、50mM EDTA、10mM NaCl,pH9.0）で希釈し、渦動させ、そして粒子と殆どの細菌を遠心分離（12,000g、２分30秒）によって除去した。上澄み液中のDNAを、SDS−プロテイナーゼＫ消化、フェノール−クロロホルム抽出、及びエタノール沈殿により精製した（ジョイズ（Goeiz）ら,Biochem.Biophys.Res.Commun.,13:118,1985）。次いで、糞便からのDNAを、プリパジェン（Prepagene）マトリックス（バイオラッド（BioRad））を用いてガラスビーズに結合させることによって更に精製した（ボゲイシュタインとギレスピー（Gillespie）,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76:615,1978）。メーカーにより詳細に記載された条件に従い、５マイクロリッターのマトリックスを用いて100mgの糞便からDNAを精製した。典型的には、0.5〜5.0μｇのDNAが得られた。
次いで、Ｋ−ras遺伝子の第１エキソンを、腫瘍からのDNAについて上記したのと同じようにしてこのDNAからPCR増幅した。最初、突然変異型Ras遺伝子は（少しでも存在しているとして）糞便中の全Ras遺伝子のうちの小さな画分に相当するに過ぎないと考えていたので、バクテリオファージ内でのクローニングを含むＫ−rasについての非常に敏感な分析技術を用いた。この技術は、進行した膀胱癌患者の尿中の突然変異型p53遺伝子の小さな画分を同定でき、そして数千の正常遺伝子の中のただ１つの突然変異型遺伝子の存在を明らかにできることが以前に示されていた（シドランスキー（Sidransky）ら,Science,252:706,1991）。
PCR産物を含有するバクテリオファージに感染したSL1細胞をプレート当たり100〜2,000プラークの密度でＬ−アガー上にプレートし、ナイロン膜上に移し、そして野生型又は突然変異型Ｋ−ras遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは、107dpm/mlプローブを含有する緩衝液Ｈ（0.9M塩化ナトリウム、0.005M EDTA、0.05Mリン酸ナトリウム（pH7.0）、１％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、0.5％脱脂粉乳、10％ホルムアミド及び６％ポリエチレングリコール6000）中で50℃で１時間行った。450mM塩化ナトリウム、18mMクエン酸ナトリウム、1mMトリス（pH7.2）、0.1％SDS中、63℃で15分間洗浄した。フィルムを−80℃で１〜８時間、増感スクリーンで露光した。ハイブリダイゼーションに用いたオリゴヌクレオチドは、野生型（wt）Rasについては5'−GGAGCTGGTGGCGTAGGCAA−3'であり、12val突然変異体については5'−GGAGCTGTTGGCGTAGGCAA−3'であり、12asp突然変異体については5'−GGAGCTGATGGCGTAGGCAA−3'であり、そして13asp突然変異体については5'−GGAGCTGGTGACGTAGGCAA−3'であった。オリゴヌクレオチドは、T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて約108dpm/μｇの比活性に標識した。
これら結果を解析すると、驚いたことに、いずれの患者も彼らの糞便サンプルから精製したDNA中に突然変異型Ras遺伝子を含有していることが分かった。糞便中に検出された突然変異型遺伝子は腫瘍中に検出されたものと同じであった（患者１の糞便と腫瘍中の12val;患者２の糞便中の13asp,図１）。その腫瘍中にRas遺伝子突然変異がない患者からのコントロール糞便サンプルは、これら位置のいずれにおいても突然変異を含まなかった（図1,患者10）。
患者１及び２において突然変異体特異的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするファージプラークの画分は、それぞれ、野生型Ｋ−ras遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするファージの８％及び４％に相当し、随分高いものであった。これら意外な結果は、糞便サンプル中の突然変異型遺伝子を同定するのにより感度が低くて簡単なアッセイを用いることができることを示した。
特異的な標的配列、この場合は種々のＫ−ras遺伝子を検出するのにもっと簡単で迅速な方法が使える可能性を探るために、粗PCR産物をアガロースゲルによる電気泳動に簡単に付してサザーンの方法によってナイロンフィルターに移した。次いで、これらブロットを、野生型又は突然変異型Ｋ−ras遺伝子を認識する放射標識オリゴヌクレオチドと共にインキュベートした。この結果の例を、対にした腫瘍と糞便サンプルをついて図２に示す。サザーンブロットアッセイを用いて、患者１に見出された12val突然変異が彼女の糞便中に容易に認められた（図２、上方パネル）。12asp突然変異体に特異的なオリゴヌクレオチドは、負のコントロールを提供した（図２、中間パネル）。野生型特異的オリゴヌクレオチドは、予測通り、腫瘍及び糞便両方からのDNAとハイブリダイズした（図２、下方パネル）。同じく、サザーンブロット分析により、患者３及び４からの腫瘍及び糞便のDNAは12asp突然変異を含有するが、どちらも12val特異的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズしないことが明らかになった（図２）。この糞便サンプル中での野生型ハイブリダイゼーションに対する突然変異体の比率は、腫瘍中でのものよりも５〜10倍低かった。これはプラークハイブリダイゼーションアッセイと一致する。
９人の患者全てからの糞便をサザーンブロット分析により分析してそれらのうち８人に突然変異が検出された（表１）。良性腫瘍（患者２及び９）並びに悪性腫瘍内で生じる突然変異が糞便中で検出可能であった。1.3cm3しかない腫瘍が、糞便中における検出可能な突然変異型遺伝子のもとになった（患者２）。更に、非常に近位の腫瘍（患者9,盲腸；患者7,上行結腸）でさえ正の結果を示したので、腸内での位置は臨界的であるようには見えなかった。
Figure 0003633932
Figure 0003633932
コントロールとして、６個の糞便サンプル、つまり結腸直腸新生物を有さない患者からの３サンプル及びコドン12にも13にもＫ−ras突然変異を含有しない結腸直腸腫瘍を有する患者からの３サンプルを検査した。６ケース全てで、12val、12asp又は13asp突然変異に特異的なオリゴヌクレオチドに対してではなく、野生型特異的オリゴヌクレオチドに対して強いハイブリダイゼーションが認められた（表1,図１及び２の例）。
これら実験の結果は、新生物をうまく検出できる態様を提供しかつ直腸結腸腫瘍の如き新生物の存在を非観血的様式で検出する新規なアプローチのための実用的基礎を提供するものである。このアプローチは、新生物の発生率を最小にするためにデザインされた異なる食事又は治療に関して患者集団を追跡するに際して有用性があろう。それは、新生物の存在について無症候性患者、特に遺伝的又は環境的因子に基づいて危険性のある患者をスクリーニングするのにも用いることができよう。現結果は、初期結腸直腸癌及び危険な前悪性病巣の有意な画分がこの戦略によって同定され得ることを示している。更に、これら結果は、Ｋ−rasのほかに胃腸の新生物に関連する又はそれを示す他の突然変異ヌクレオチド配列も糞便検体中で検出可能であろうことを示している。かかる配列には、例えば、p53が見出され得るDCC、MCC、FAP及びAPCの遺伝子が含まれる。
以上の開示内容は本発明を概略的に説明するものである。より完全な理解は、以下の具体例を参照することによって得ることができる。これら具体例は、説明のためだけにここに示したものであって、本発明の範囲を限定しようとするものではない。
配列のまとめ
配列番号:1は、本発明の方法において突然変異型核酸配列を増幅するのに用いたオリゴヌクレオチドプライマーの核酸配列（第10頁第６行）であり；
配列番号:2は、本発明の方法において突然変異型核酸配列を増幅するのに用いたオリゴヌクレオチドプライマーの核酸配列（第10頁第７行）であり；
配列番号:3は、本発明の方法において突然変異型核酸配列を増幅するのに用いたオリゴヌクレオチドプライマーの核酸配列（第17頁第21行）であり；
配列番号:4は、本発明の方法において突然変異型核酸配列を増幅するのに用いたオリゴヌクレオチドプライマーの核酸配列（第17頁第22行、最初に記載したもの）であり；
配列番号:5は、本発明の方法において突然変異型核酸配列を増幅するのに用いたオリゴヌクレオチドプライマーの核酸配列（第17頁第23行、２番目に記載したもの）であり；
配列番号:6は、Ｋ−ras遺伝子の第１エクソンのセンス配列のためのオリゴヌクレオチドの核酸配列（第25頁第14行）であり；
配列番号:7は、Ｋ−ras遺伝子の第１エクソンのアンチセンス配列のためのオリゴヌクレオチドの核酸配列（第25頁第16行）であり；
配列番号:8は、本発明の方法において突然変異型核酸配列を増幅するのに用いたオリゴヌクレオチドプライマーの核酸配列（第26頁第13行）であり；
配列番号:9は、野生型Rasのためのオリゴヌクレオチドの核酸配列（第28頁第14行）であり；
配列番号:10は、Ras12val突然変異体のためのオリゴヌクレオチドの核酸配列（第28頁第16行）であり；
配列番号:11は、Ras12asp突然変異体のためのオリゴヌクレオチドの核酸配列（第28頁第17行）であり；そして
配列番号:12は、Ras13asp突然変異体のためのオリゴヌクレオチドの核酸配列（第28頁第19行）である。
配列表
（２）配列番号:1の情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ:28塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／キー:misc_RNA
（Ｂ）存在位置:1..28
（xi）配列：配列番号:1:
Figure 0003633932
（２）配列番号:2の情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ:30塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／キー:misc_RNA
（Ｂ）存在位置:1..30
（xi）配列：配列番号:2:
Figure 0003633932
（２）配列番号:3の情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ:20塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／キー:misc_RNA
（Ｂ）存在位置:1..20
（xi）配列：配列番号:3:
Figure 0003633932
（２）配列番号:4の情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ:20塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／キー:misc_RNA
（Ｂ）存在位置:1..20
（xi）配列：配列番号:4:
Figure 0003633932
（２）配列番号:5の情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ:20塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／キー:misc_RNA
（Ｂ）存在位置:1..20
（xi）配列：配列番号:5:
Figure 0003633932
（２）配列番号:6の情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ:28塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／キー:misc_RNA
（Ｂ）存在位置:1..28
（xi）配列：配列番号:6:
Figure 0003633932
（２）配列番号:7の情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ:30塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／キー:misc_RNA
（Ｂ）存在位置:1..30
（xi）配列：配列番号:7:
Figure 0003633932
（２）配列番号:8の情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ:18塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／キー:misc_RNA
（Ｂ）存在位置:1..18
（xi）配列：配列番号:8:
Figure 0003633932
（２）配列番号:9の情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ:20塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／キー:misc_RNA
（Ｂ）存在位置:1..20
（xi）配列：配列番号:9:
Figure 0003633932
（２）配列番号:10の情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ:20塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／キー:misc_RNA
（Ｂ）存在位置:1..20
（xi）配列：配列番号:10:
Figure 0003633932
（２）配列番号:11の情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ:20塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／キー:misc_RNA
（Ｂ）存在位置:1..20
（xi）配列：配列番号:11:
Figure 0003633932
（２）配列番号:12の情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ:20塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／キー:misc_RNA
（Ｂ）存在位置:1..20
（xi）配列：配列番号:12:
Figure 0003633932

Claims (12)

  1. 糞便検体から哺乳動物の核酸を分離する方法であって、
    （ａ）約8.0〜約9.0のpHで約10mM〜約200mMの濃度のキ レート剤、約1mM〜約20mMの濃度の塩、及び少なくとも 約500mMの濃度の緩衝液を含む糞便溶解緩衝液中で糞便検体から粒形物を除いて非粒子画分を生成させ：そして
    （ｂ）該非粒子画分から核酸を分離する
    ことを含む方法。
  2. 非粒子画分を処理してヌクレアーゼを分解する、請求項１記載の方法。
  3. 処理した非粒子画分を抽出して核酸を濃縮する、請求項２記載の方法。
  4. カオトロピック塩の存在下で核酸をガラスに結合させるか又は核酸を修飾したイオン交換マトリックスに結合させる工程の少なくとも１を更に含む、請求 項２記載の方法。
  5. 糞便溶解緩衝液が、約8.0〜約9.0のpH、約10mM〜約200mMの濃度のキレート剤、及び約1mM〜約20mMの塩濃度を有する、請求項１記載の方法。
  6. 粒形物を遠心分離によって除く、請求項１ 記載の方法。
  7. 約8.0〜約9.0のpHで約10mM〜約200mMの濃度のキレート剤、約1mM〜約20mMの濃度の塩、及び少なくとも約500mMの濃度の緩衝液を含む糞便溶解緩衝液。
  8. キレート剤がEDTAである、請求項７記載の緩衝液。
  9. 塩がNaClである、請求項７記載の緩衝液。
  10. 緩衝液が約500mM〜約1Mの濃度のトリスである、請求項７記載の緩衝液。
  11. 糞便検体からの標的核酸の検出に有用なキットであって、ハイブリダイゼーションプローブを含有する第１容器並びに約8.0〜約9.0のpHで約10mM〜約20 0mMの濃度のキレート剤、約1mM〜約20mMの濃度の塩、及 び少なくとも約500mMの濃度の緩衝液を含む糞便溶解緩衝液を含有する第２容器を含む１又は２以上の容器をその中に厳重に閉じ込めるように区分されたキャリヤー手段を含むキット。
  12. 更に標的核酸の増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーを含有する容器を含む、請求項11記 載のキット。
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