ES2210239T3 - Metodo para detectar acidos nucleicos de mamiferos aislados en heces y reactivos para el mismo. - Google Patents

Abstract

UN METODO PARA AISLAR ACIDOS NUCLEICOS DE UN ESPECIMEN ORIGEN QUE ES UTILIZADO PARA DETECTAR MUTACIONES ASOCIADAS CON NEOPLASIA GASTROINTESTINAL. EN LA FIGURA SE MUESTRA UN RESULTADO EJEMPLAR OBTENIDO. SE DESCRIBEN TAMBIEN LOS REACTIVOS UTILIZADOS PARA LLEVAR A CABO SEPARACION DE LOS ACIDOS NUCLEICOS.

Description

Método para detectar ácidos nucleicos de mamíferos aislados en heces y reactivos para el mismo.

Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención

La invención se refiere a un método para detectar un ácido nucleico diana en las heces y reactivos útiles para el mismo.

2. Descripción de la técnica relacionada

Cada vez existen más evidencias que implican de forma causal a las mutaciones somáticas en la inducción de cánceres en seres humanos. Estas mutaciones somáticas se pueden acumular en los genomas de células anteriormente normales, después de lo cual, algunas pueden mostrar los fenotipos asociados con el crecimiento maligno. Tales mutaciones oncogénicas pueden incluir diversas alteraciones en la estructura del ADN, incluyendo supresiones, translocaciones y alteraciones en un solo nucleótido. Estas últimas, también conocidas como mutaciones puntuales, pueden intervenir frecuentemente en la carcinogénesis, ya que una diversidad de productos químicos mutagénicos inducen tales mutaciones. Además, tales mutaciones pueden tener lugar espontáneamente como resultado de errores en la replicación del ADN.

Los avances en la tecnología de ADN recombinante han conducido al descubrimiento de genes celulares normales (proto-oncógenos y genes de supresión tumoral) que controlan el crecimiento, desarrollo y diferenciación. En ciertas circunstancias, la regulación de estos genes se altera y puede provocar que las células normales adquieran un comportamiento de crecimiento neoplásico. Hasta el momento, existen más de 40 proto-oncógenos y genes supresores, que caen en distintas categorías dependiendo de sus características funcionales. Éstas incluyen, (1) factores de crecimiento y receptores del factor de crecimiento, (2) mensajeros intracelulares de los caminos de transducción de la señal, por ejemplo, entre el citoplasma y el núcleo, y (3) proteínas reguladoras que influyen en la expresión de los genes y la replicación de ADN.

Las mutaciones puntuales se han implicado directamente en la causa de muchos tumores en seres humanos. Algunos tumores contienen oncógenos de la familia de genes ras, que difieren de sus proto-oncógenos homólogos celulares normales en la presencia de una mutación puntual en una de una cantidad finita de posiciones de estos genes. De forma similar, a menudo se detectan mutaciones puntuales en regiones críticas de los genes de supresión tumoral, tales como p53, en las células tumorales. Estas mutaciones representan cambios cualitativos en el genoma de la célula tumoral que distingue a estas células de las células normales y proporciona una base para el diagnóstico del origen genético del tumor en estudio. La identificación de estas mutaciones que han creado oncógenos activos puede proporcionar indicios diagnósticos y pronósticos del desarrollo del tumor. Por ejemplo, se ha descubierto que diversas mutaciones alteran el codón 12 de los oncógenos ras, provocando la sustitución de la glicina, que está presente normalmente, con un resto aminoacídico alternativo cualquiera. Tales sustituciones de aminoácidos crean un alelo de transformación potente. De esta forma, la presencia de una sustitución de un nucleótido particular puede ser un fuerte determinante del comportamiento de la célula tumoral (por ejemplo, de su velocidad de crecimiento, invasividad, etc). Como resultado, las sondas de ADN de mutaciones oncogénicas son prometedoras como reactivos de diagnóstico en la oncología clínica.

Entre los distintos tipos de neoplasmas, algunos de los que se encuentran el tracto gastrointestinal, están asociados con mutaciones oncogénicas. Esta asociación es particularmente significativa para el cáncer colorrectal. El cáncer colorrectal es la tercera enfermedad maligna más común en el mundo, con 570.000 nuevos casos esperados en 1992. Sólo en los Estados Unidos, más de 60.000 personas morirán de cáncer colorrectal en este mismo año. Aunque los pacientes con la enfermedad avanzada tienen un diagnóstico muy malo, los tumores colorrectales diagnosticados en una etapa anterior a la metástasis se pueden curar normalmente mediante escisión quirúrgica o colonoscópica. Por lo tanto, un método para detectar tumores reseccionables quirúrgicamente podría reducir considerablemente el número de muertes provocadas por esta enfermedad (Winawer, et al., J. National Cancer Institute, 83:243, 1991). La única prueba no invasiva disponible en la actualidad para tal propósito implica analizar la sangre oculta en las heces. Aunque los análisis de sangre en heces pueden tener valor en ciertas circunstancias, su utilidad es controvertida, en parte porque la aparición de hemoglobina en las heces no es específica de la neoplasia (Ransohoff, et al., New England Journal of Medicina, 325:37, 1991; Miller, et al., Int. J. Cancer, 46:761, 1990). Aunque esto ha estimulado los esfuerzos para desarrollar más pruebas no invasivas que puedan detectar neoplasmas de colon y recto de forma más fiable, estos intentos han fracasado. La presente invención aborda esta necesidad.

Sumario de la invención

La presente invención surgió del inesperado descubrimiento de que el ácido nucleico con una secuencia mutante de nucleótidos asociada con la neoplasia gastrointestinal está presente en niveles detectables en heces de pacientes con neoplasia gastrointestinal.

Como consecuencia de este descubrimiento, la presente invención representa un avance significativo sobre técnicas tales como biopsia de tejidos proporcionando un método no invasivo, rápido y preciso para detectar secuencias mutantes de nucleótidos asociadas con la neoplasia gastrointestinal. Basándose en este descubrimiento, ahora es posible detectar otros ácidos nucleicos distintos asociados con otras enfermedades.

Descripción de las figuras

Figura 1. Las mutaciones de genes RAS en las heces se identificaron por hibridación de placa. Los productos PCR que contenían el primer exón de codificación de K-ras se generaron con el ADN extraído de las heces de los pacientes 1, 2 y 10 (Tabla I) y se clonaron en un vector bacteriófago. Los levantamientos de placa se hibridaron con un oligonucleótido específico del Ras de tipo silvestre, un oligonucleótido específico de 12^{val} (sonda mutante 1), y a un oligonucleótido específico de 13^{asp} (sonda mutante 2). El número de placas usadas para la hibridación con los oligonucleótidos mutantes específicos fue cinco veces mayor que las usadas para el oligonucleótido específico de tipo silvestre para conseguir una cantidad estadísticamente significativa de placas de hibridación. Las relaciones de placas en hibridación con la sonda específica de mutante frente a sondas específicas de tipo silvestre fueron de 0,08:1 y 0,04:1 en los pacientes 1 y 2, respectivamente.

Figura 2. las mutaciones en genes RAS se detectaron usando una transferencia de Southern de productos de PCR amplificados. Los productos de PCR que contenían el primer exón de codificación de K-ras se generaron con el ADN extraído de heces y tumores de los pacientes 1, 3, 4 y 11. Los productos de PCR se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa al 2% y se traspasaron a filtros de nylon. Las transferencias se hibridaron en sondas de oligonucleótidos específicos del RAS de tipo silvestre (panel inferior), de la mutación 12^{asp}(panel central), o de la mutación 12^{val} (panel superior). Las muestras de ADN de heces y tumores de los pacientes 3 y 4 contenían una mutación 12^{asp}, mientras que las del paciente 1 contenían una mutación 12^{val}. Ni el ADN de las heces ni el ADN del tumor del paciente 11 contenían una de estas mutaciones.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a un método para detectar ácido nucleico con una secuencia mutante de nucleótidos presente en las heces, en el que la presencia de una secuencia de ácido nucleico alterada se asocia con neoplasia del tracto gastrointestinal.

En su sentido más amplio, la presente invención permite la detección de cualquier secuencia de ácido nucleico diana de importancia diagnóstica o terapéutica, cuando la secuencia de ácido nucleico esté presente en las heces. De esta forma, la secuencia de nucleótidos diana puede ser, por ejemplo, un nucleótido mutante, un polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP), una supresión de nucleótido, o cualquier otra secuencia de ácido nucleico de mamíferos de interés.

En una realización, el método de la invención para mejorar la detectabilidad es aplicable para detectar secuencias mutantes de nucleótidos asociadas con neoplasias benignas así como malignas. En una realización preferida, se detecta la neoplasia del tracto gastrointestinal incluyendo el intestino grueso y delgado, el páncreas y el estómago, aunque el método se puede usar para detectar cualquier secuencia neoplásica mutante de nucleótido, independientemente de su origen, mientras la secuencia sea detectable al estar presente en las heces.

Las neoplasias benignas del intestino delgado incluyen adenomas, leiomiomas, lipomas y angiomas, mientras que las neoplasias benignas del intestino grueso son principalmente pólipos adenomatosos. Las neoplasias malignas del intestino delgado incluyen adenocarcinomas, leiomiosarcomas, linfomas y tumores carcinoides. En el caso del intestino grueso y el colon, el carcinoma colorrectal es la neoplasia maligna más común.

Se conoce que numerosos ácidos nucleicos con secuencias mutantes de nucleótidos que generan un producto genético anormal están asociadas con distintas neoplasias. Entre las secuencias mutantes de nucleótidos más comunes están los oncógenos y los genes de supresión tumoral, tales como MCC, DCC; APC, FAP y p53. La detección del oncógeno K-ras mutante y el gen de supresión tumoral p53 (Vogelstein, Nature, 348:681, 1990) es de especial interés en la presente invención. La información adicional sobre la detección de DCC, MCC, PAC y p53 se puede encontrar en las solicitudes pendientes de Patentes de Estados Unidos con números de serie 460.981, presentada el 4 de enero de 1990; 07/670.611, presentada el 13 de marzo de 1991; 07/741.940 presentada el 8 de agosto de 1991; y 446.584 presentada el 6 de diciembre de 1989; respectivamente, que se incorporan en este documento por referencia.

Para analizar las heces de acuerdo con el método de la invención, es necesario separar el ácido nucleico de mamífero presente en la muestra. Existen dos problemas principales asociados con la preparación de ácido nucleico de mamífero en heces. Primero, el ácido nucleico de mamífero debe liberarse de las células de los mamíferos y separarse de las células bacterianas. Esta etapa se complica adicionalmente por el hecho de que es deseable evitar la liberación de ácido nucleico de las células bacterianas, ya que en las muestras de heces hay un gran exceso de ácido nucleico bacteriano en comparación con ácido nucleico eucariótico. En segundo lugar, una vez que se ha liberado, el ácido nucleico se puede proteger de la concentración relativamente alta de nucleasas presentes en las heces que podrían degradar el ácido nucleico mamífero liberado e impedir por tanto su análisis. En la presente invención, se ha descubierto que estos criterios tan estrictos se pueden satisfacer incubando las heces con un tampón de lisis de heces diseñado especialmente que contiene una alta concentración de tampón de al menos aproximadamente 500 mM, a un pH de al menos aproximadamente 8,0, que contiene un agente quelante tal como EDTA, y una concentración de sal relativamente baja, preferiblemente menor de 10 mM.

La solución tampón para la lisis de las heces minimiza la degradación del ácido nucleico por el pH y las propiedades quelante, lisa células eucarióticas, pero no células bacterianas, y es adecuado para realizar un proceso adicional de purificación y/o concentración del ácido nucleico eucariótico. Después del tratamiento con el tampón de lisis de heces, la muestra se procesa (por ejemplo, por centrifugación) para retirar las bacterias y otros residuos no deseados. Después, la parte no particulada del lisado se incuba con una proteinasa (tal como proteinasa K 0,5 \mug/ml) en SDS (1%) para degradar las nucleasas y otras proteínas. El ácido nucleico de la muestra se puede separar adicionalmente por medios químicos, tal como por extracción fenol/cloroformo, acetato de amonio para separar los péptidos del ácido nucleico, y precipitación con etanol.

Además, se ha descubierto que las heces contienen también inhibidores que se retiran preferiblemente si la secuencia mutante de nucleótidos presente en las heces se va a amplificar, por ejemplo por reacción en cadena de polimerasa (PCR). Uno de estos inhibidores interfiere con la amplificación del ADN por polimerasa Taq. Este inhibidor se puede retirar uniendo el ácido nucleico a una matriz estacionaria en presencia de sales caotrópicas, tales como yoduro sódico 6,0 M o perclorato sódico. Sorprendentemente, se ha descubierto que el vidrio es la matriz preferida para este fin. Algunas versiones de vidrio comerciales especialmente preferidas son Prep-A-Gene^{TM} (Bio-Rad) y Spin-Bind^{TM} (FMC).

El otro inhibidor presente en las heces evita la unión del ácido nucleico al vidrio. Se ha descubierto que este segundo inhibidor se puede retirar uniendo el inhibidor a una resina de intercambio iónico modificada (por ejemplo, Qiagen) en presencia de altas concentraciones de sales tales como al menos aproximadamente 1,0 M. Los especialistas en la técnica pueden concebir distintas maneras en las que el proceso descrito anteriormente para concentrar y/o purificar ADN de mamíferos con muestras de heces se puede modificar, una vez se ha reconocido que se puede obtener ácido nucleico de mamíferos selectivamente a partir de muestras de heces. Alternativamente, los especialistas en la técnica pueden averiguar, sin excesiva experimentación, reactivos y condiciones alternativas que son equivalentes funcionalmente a las descritas en este documento, ahora que se conoce que tales métodos son aplicables en muestras de heces. Tales modificaciones y equivalentes funcionales están incluidas por la presente invención.

Los aminoácidos a los que se hace referencia en este documento se pueden identificar de acuerdo con las siguientes abreviaciones de tres letras a una letra.

Aminoácido	Abreviatura de tres letras	Abreviatura de una letra
L-alanina	Ala	A
L-Arginina	Arg	R
L-Asparagina	Asn	N
L-Ácido aspártico	Asp	D
L-Cisteína	Cys	C
L-Glutamina	Gln	Q
L-Ácido glutámico	Glu	E
L-Glicina	Gli	G
L-Histidina	His	H
L-Isoleucina	Ile	I
L-Leucina	Leu	L
L-Lisina	Lis	K
L-Metionina	Met	M
L-Fenilalanina	Phe	F
L-Prolina	Pro	P
L-Serina	Ser	S
L-Treonina	Thr	T
L-Triptófano	Trp	W
L-Tirosina	Tir	Y
L-Valina	Val	V

Si se desea amplificar la secuencia mutante de nucleótidos antes de la detección, se puede conseguir usando oligonucleótido(s) cebadores para la amplificación. Estos cebadores oligonucleótidos únicos se basan en la identificación de regiones adyacentes contiguas a la secuencia mutante de nucleótidos. Por ejemplo, en el caso de K-ras, estos cebadores oligonucleótidos comprenden secuencias capaces de hibridar con la secuencia adyacente de nucleótidos 5'-TCCTTAAGTACTGACTTATATTTGAACA-3' y/o 5'-TAGCTTAAGATACGTATAATTTTGTTCTAA-3' y secuencias complementarias de las mismas.

Los cebadores que se pueden usar de acuerdo con el método de la invención abarcan oligonucleótidos de longitud suficiente y secuencia apropiada para proporciona una iniciación específica de la polimerización de un número significativo de moléculas de ácido nucleico que contienen el ácido nucleico diana. De esta manera, es posible amplificar selectivamente la secuencia de ácido nucleico diana que contiene el ácido nucleico de interés. Específicamente, el término "cebador", como se usa en este documento, se refiere a una secuencia que comprende dos o más desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, preferiblemente al menos ocho, cuya secuencia es capaz de iniciar la síntesis de un producto de extensión del cebador, que es sustancialmente complementario con una cadena del ácido nucleico diana. El cebador oligonucleótido comprende normalmente 15-22 o más nucleótidos, aunque puede contener menos nucleótidos.

Las condiciones experimentales propicias para la síntesis incluyen la presencia de trifosfatos de nucleósidos y un agente para la polimerización, tal como ADN polimerasa, y una temperatura y pH adecuados. El cebador es preferiblemente monocatenario para obtener la máxima eficacia en la amplificación, pero puede ser bicatenario. Si es bicatenario, el cebador se trata primero para separar sus cadenas antes de usarse para preparar productos de extensión. Preferiblemente, el cebador es un oligodesoxirribonucleótido. El cebador debe ser suficientemente largo para cebar la síntesis de productos de extensión en presencia del agente inductor de la polimerización. La longitud exacta del cebado dependerá de muchos factores, incluyendo temperatura, tampón y composición del nucleótido.

Los cebadores usados de acuerdo con el método de la invención se diseñan para ser "sustancialmente" complementarios a cada cadena de la secuencia mutante de nucleótidos a amplificar. Sustancialmente complementario significa que los cebadores deben ser suficientemente complementarios para permitir que funcione el agente de polimerización. En otras palabras, los cebadores deben tener suficiente complementariedad con las secuencias adyacentes para hibridar con las mismas y permitir la amplificación de la secuencia mutante de nucleótidos. Preferiblemente, el extremo del cebador extendido tiene una complementariedad de pares de bases perfecta con la cadena complementaria adyacente.

Los cebadores oligonucleótidos usados de acuerdo con la invención se emplean en cualquier proceso de amplificación que produce mayores cantidades de ácido nucleico diana. Normalmente, un cebador es el complementario de la cadena negativa (-) de la secuencia mutante de nucleótidos y el otro es el complementario de la cadena positiva (+). Templar los cebadores a ácido nucleico desnaturalizado seguido de extensión con una enzima, tal como el fragmento grande de ADN Polimerasa I (Klenow) o Taq ADN Polimerasa y nucleótidos o ligasas, tiene como resultado las nuevas cadenas - y + sintetizadas que contienen el ácido nucleico. Como estos ácidos nucleicos sintetizados recientemente son también plantillas, repetidos ciclos de desnaturalización, templado de cebador, y extensión tienen como resultado la producción exponencial de la región (es decir, la secuencia mutante de nucleótidos diana) definida por el cebador. El producto de la reacción de amplificación es un ácido nucleico discreto que extremos correspondientes a los extremos de los cebadores específicos empleados. Los especialistas en la técnica conocerán otras metodologías de amplificación que también se pueden utilizar para aumentar el número de copias del ácido nucleico diana.

Los cebadores oligonucleótidos para usar en la invención se pueden preparar usando cualquier método adecuado, tal como métodos convencionales con fosfotriéster y fosfodiéster o realizaciones automatizadas de los mismos. En una de estas realizaciones automatizadas, se usan dietilfosforamiditas como materiales de partida y se pueden sintetizar como se describe en Beaucage, et al., (Tetrahedron Letters, 22:1859-1862, 1981). Un método para sintetizar oligonucleótidos en un soporte sólido modificado se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 4.458.066. Un método de amplificación que se puede usar de acuerdo con esta invención en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) descrita en las Patentes de Estados Unidos Nº 4.683.202 y 4.683.195.

Cualquier ácido nucleico en las heces, en forma purificada o no purificada, se puede utilizar como ácido o ácidos nucleicos de partida, siempre que contenga, o se sospeche que contenga, la secuencia específica de ácido nucleico que contiene el ácido nucleico diana. De esta forma, el proceso puede emplear, por ejemplo, ADN o ARN, incluyendo ARN mensajero, donde el ADN o el ARN pueden ser monocatenarios o bicatenarios. En el caso de que se use el ARN como plantilla, se utilizarían las enzimas y/o las condiciones óptimas para la trascripción inversa de la plantilla a ADN. Además, se puede utilizar un híbrido ADN-ARN que contiene una cadena de cada uno. También se puede emplear una mezcla de ácidos nucleicos, o los ácidos nucleicos producidos en una reacción de amplificación previa usando los mismos o distintos cebadores. La secuencia mutante de nucleótido para amplificar puede ser una fracción de una molécula más grande o puede estar presente inicialmente como una molécula discreta, de forma que la secuencia específica constituye todo el ácido nucleico. No es necesario que la secuencia a amplificar esté presente inicialmente en forma pura; puede ser una parte menor de una mezcla compleja, tal como la contenida en todo el ADN humano.

Cuando la secuencia mutante de nucleótido diana de la muestra contiene dos cadenas, es necesario separar las cadenas del ácido nucleico antes de que se pueda usar como plantilla. La separación de las cadenas se puede efectuar como una etapa distinta o simultáneamente con la síntesis de los primeros productos de extensión. Esta separación de cadenas se puede realizar usando varias de desnaturalización condiciones adecuadas, incluyendo físicas, químicas o enzimáticas; la palabra "desnaturalización" incluye todos estos medios. Un método físico para separar cadenas de ácido nucleico implica calentar el ácido nucleico hasta que se desnaturaliza. La desnaturalización por calor convencional puede implicar temperaturas en el intervalo de aproximadamente 80ºC a 105ºC durante periodos de tiempo en el intervalo de aproximadamente 1 a 10 minutos. La separación de las cadenas también se puede inducir con una enzima de la clase de enzimas conocidas como helicasas o con la enzima RecA, que tiene una actividad helicasa, y en presencia de riboATP, que se sabe que desnaturaliza el ADN. Las condiciones de reacción adecuadas para la separación de cadenas de ácidos nucleicos con helicasas se describe en Kuhn Hoffmann-Berling (CSH-Quantitative Biology, 43:63, 1978) y las técnicas para usar RecA se revisan en C. Radding. (Ann. Rev. Genetics, 16:405-437, 1982).

Si el ácido nucleico que contiene el ácido nucleico diana a amplificar es monocatenario, su complemento se sintetiza añadiendo uno o dos cebadores oligonucleótidos. Si se utiliza un único cebador, un producto de extensión del cebador se sintetiza en presencia del cebador, un agente de polimerización, y los cuatro trifosfatos de nucleósido descritos a continuación. El producto será el complementario de ácido nucleico monocatenario e hibridará con un ácido nucleico monocatenario para formar un duplex de cadenas de longitudes desiguales que después se pueden separar en cadenas sencillas para producir dos cadenas sencillas distintas complementarias. Alternativamente, se pueden añadir dos cebadores al ácido nucleico monocatenario y realizar la reacción como se ha descrito.

Cuando se separan las cadenas complementarias del ácido o ácidos nucleicos, independientemente de si el ácido nucleico original era mono- o bicatenario, las cadenas separadas están listas para usar como plantilla para la síntesis de más cadenas de ácido nucleico. Esta síntesis se realiza en condiciones que permiten que tenga lugar la hibridación de cebadores en plantillas. Generalmente, la síntesis tiene lugar en una solución acuosa tampón, preferiblemente a un pH de 7-9, más preferiblemente aproximadamente 8. Preferiblemente, se añade un exceso molar (para ácido nucleico genómico, normalmente aproximadamente 10^{8}:1 de cebador:plantilla) de los dos cebadores oligonucleótidos al tampón que contiene las cadenas plantilla separadas. Sin embargo, debe apreciarse, que la cantidad de cadena complementaria puede no conocerse si el proceso de la invención se usa en aplicaciones de diagnóstico, de forma que la cantidad de cebador relativa a la cantidad de cadena complementaria no se puede determinar con precisión. Sin embargo, en la práctica, la cantidad de cebador que se añade estará generalmente en exceso molar sobre la cantidad de cadena complementaria (plantilla) cuando la secuencia a amplificar esté contenida en una mezcla de cadenas de ácido nucleico complicados de cadena larga. Se prefiere un gran exceso molar para mejorar la eficacia del proceso.

En algunas realizaciones de amplificación, los sustratos, por ejemplo, los trifosfatos de desoxirribonucleótido dATP, dCTP, dGTP y dTTp se añaden a la mezcla de síntesis, por separado o de manera conjunta con los cebadores, en cantidades adecuadas, y la solución resultante se calienta a aproximadamente 90-100ºC de aproximadamente 1 a 10 minutos, preferiblemente de 1 a 4 minutos. Después de este periodo de calentamiento, la solución se deja enfriar a temperatura ambiente, lo que es preferible para la hibridación. del cebador. A la mezcla fría se le añade un agente apropiado para efectuar la reacción de extensión del cebador (denominado en este documento "agente de polimerización"), y la reacción se deja progresar en las condiciones que se conocen en la técnica. El agente de polimerización se puede añadir también junto con otros reactivos si es estable al calor. Esta reacción de síntesis (o amplificación) puede tener lugar desde temperatura ambiente hasta una temperatura por encima de la cual el agente de polimerización no funcione correctamente. De esta forma, por ejemplo, si se usa ADN polimerasa como agente, la temperatura es generalmente menor de aproximadamente 40ºC. Más convenientemente, la reacción tiene lugar a temperatura ambiente.

El agente de polimerización puede ser cualquier compuesto o sistema que logre la síntesis de los productos de extensión del cebador, incluyendo enzimas. Las enzimas adecuadas para este propósito incluyen, por ejemplo, ADN polimerasa I de E. Coli, Taq polimerasa, ADN polimerasa del fragmento de Klenow de E. Coli, T4 ADN polimerasa, otras ADN polimerasas disponibles, muteínas de polimerasa, transcriptasa inversa, ligasa y otras enzimas, incluyendo enzimas estables al calor (es decir, aquellas enzimas que realizan la extensión del cebador después de someterse a temperaturas suficientemente elevadas para causar desnaturalización). Las enzimas adecuadas facilitarán la combinación de los nucleótidos de la manera apropiada para formar los productos de extensión del cebador que son complementarios a cada cadena mutante nucleótido. Generalmente, la síntesis se iniciará en el extremo 3' de cada cebador y continuará en dirección 5' a lo largo de la cadena plantilla, hasta que la síntesis termine, produciendo moléculas de distintas longitudes. Sin embargo, puede haber agentes de polimerización, que inicien la síntesis en el extremo 5' y continúen en la otra dirección, usando el mismo procedimiento descrito anteriormente. En cualquier caso, el método de la invención no se limita a las realizaciones de amplificación que se describen en este documento.

La nueva cadena mutante nucleótido sintetizada y su cadena de ácido nucleico complementaria formarán una molécula bicatenaria en las condiciones de hibridación descritas anteriormente y este híbrido se usa en las etapas posteriores del proceso. En la siguiente etapa, la nueva molécula bicaternaria sintetizada se somete a condiciones de desnaturalización usando cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente para proporcionar moléculas monocatenarias.

El proceso anterior se repite en las moléculas monocatenarias. Se pueden añadir más agentes de polimerización y cebadores, si es necesario, para que la reacción progrese en las condiciones descritas anteriormente. De nuevo, la síntesis se iniciará en uno de los cebadores oligonucleótidos y continuará por las cadenas sencillas de la plantilla para producir más ácido nucleico. Después de esta etapa, la mitad del producto de extensión consistirá en la secuencia específica de ácido nucleico unida por los dos cebadores.

Las etapas de desnaturalización y síntesis del producto de extensión se pueden repetir las veces que haga falta para amplificar la secuencia mutante nucleótido diana en la medida necesaria para la detección. La cantidad de secuencia mutante nucleótido producida aumentará de forma exponencial.

El producto amplificado se puede detectar analizándolo por transferencia de Southern sin usar sondas radioactivas. En tal proceso, por ejemplo, se amplifica una pequeña muestra de ADN que contiene un nivel muy bajo de secuencia mutante de nucleótido, y se analizar mediante una técnica de transferencia de Southern. El uso de sondas o marcajes no radioactivos se facilita por el alto nivel de la señal amplificada.

Los ácidos nucleicos que tienen una mutación detectados en el método de la invención se pueden evaluar, detectar, clonar, secuencia y similar posteriormente, en solución o después de la unión a un soporte sólido, por cualquier método aplicado convencionalmente a la detección de una secuencia específica de ADN tal como PCR, restricción de oligómero (Saiki, et al., BioTechnology, 3:1008-1012, 1985), análisis con sonda de nucleótido de alelo específico (ASO) (Conner, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:278, 1983), ensayos de ligación de oligonucleótidos (OLA) (Landegren, et al., Science, 241:1077, 1988) y similar. Se han revisado técnicas moleculares para el análisis de ADN (Landegren, et al., Science, 242:229.237, 1988). De esta forma, en una realización preferida en la que la secuencia mutante de nucleótido a detecta es K-ras, se utiliza una sonda de hibridación que es capaz de hibridarse con secuencias mutantes de nucleótidos que comprenden 5'-CCTCGACAACCGCATCCGTT-3', 5'-CCTCGACTACCGCATCCGTT-3' o 5'-CCTCGACCACTGCATCCGTT-3' y secuencias complementarias de las mismas.

En una realización de la invención, se marcan con radiactividad fragmentos de ácido nucleico que contienen las secuencias implicadas o las secuencias de oligonucleótidos de 10-50 pares de bases. Las preparaciones marcadas se usan para sondear ácido nucleico en heces por la técnica de hibridación Southern. Los fragmentos de nucleótidos provenientes de las heces, antes o después de la amplificación, se separan en fragmentos de distintas masas moleculares por electroforesis con gel y se pasan a filtros que los unen con el ácido nucleico. Después de la exposición a la sonda marcada, que hibridará con los fragmentos de nucleótido que contienen las secuencias de ácido nucleico diana, la unión de la sonda radioactiva con los fragmentos de ácido nucleico diana se identifica por auto-radiografía (véase Genetic Engineering, 1, ed. Robert Williamson, Academic Press, (1981), 72-81). Alternativamente, el ácido nucleico de las heces se puede unir directamente a los filtros a los que la sonda radioactiva une selectivamente los ácidos nucleicos con la secuencia de interés y se cuantifica el grado de unión contando directamente las emisiones radioactivas.

Cuando el ácido nucleico diana no se amplifica, la detección con una sonda de hibridación adecuada se puede realizar directamente en el ácido nucleico mamífero separado. En aquellos casos en los que el ácido nucleico está amplificado, la detección con la sonda de hibridación adecuada se realizaría después de la amplificación.

Las sondas de la presente invención se pueden usar para examinar la distribución de los fragmentos específicos detectados, así como el grado cuantitativo (relativo) de unión de la sonda para determinar la frecuencia de secuencias específicas de unión fuerte (hibridación), indicando de esta forma la probabilidad de que un individuo tenga un riesgo bajo o alto de tener una enfermedad neoplásica, tal como carcinoma colorrectal.

En la mayoría de los casos, la sonda se marcará con un átomo o radical inorgánico, normalmente con radionúclidos, pero también quizá con metales pesados. En la práctica, se puede emplear un marcaje radioactivo. Los marcajes radioactivos incluyen ^{32}P, ^{125}I, ^{3}H, ^{14}C o similares. Se puede emplear cualquier marcaje radioactivo que proporcione una señal adecuada y tenga una vida media suficiente. Otros marcajes incluyen ligandos, que pueden servir como miembro específico de unión de pares para un ligando marcado, y similares. Se ha empleado una amplia diversidad de marcajes en inmunoensayos que se pueden emplear fácilmente en el presente ensayo. La selección del marcaje estará gobernada por el efecto del marcaje en la velocidad de hibridación y en la unión de la sonda a la secuencia mutante de nucleótido. Será necesario que el marcaje proporcione una sensibilidad suficiente para detectar la cantidad de secuencia mutante de nucleótido disponible para la hibridación. Otras consideraciones serán la facilidad de síntesis de la sonda, instrumentación fácilmente disponible, capacidad de automatización, conveniencia y similares.

La manera en la que el marcaje se une a la sonda variará dependiendo de la naturaleza del marcaje. Para un marcaje radioactivo, se pueden emplear una amplia diversidad de técnicas. Se emplea comúnmente la translación nick con un ^{32}P-dNTP o hidrólisis de fosfato terminal con alcalina fosfatasa seguido de marcaje con ^{32}P radioactivo que emplean ^{32}P-TNP y polinucleótido kinasa T4. Alternativamente, se pueden sintetizar nucleótidos en los que uno o más de los elementos presentes están sustituidos con un isótopo radioactivo, por ejemplo, hidrógeno con tritio. Si se desea, las cadenas complementarias marcadas se pueden usar como sondas para mejorar la concentración del marcaje hibridado.

Cuando están implicados otros marcajes con radionúclido, se pueden emplear distintos grupos de unión. Un hidroxilo terminal se puede esterificar, con ácidos inorgánicos, por ejemplo, fosfato ^{32}P , o ácidos orgánicos ^{14}C, o también esterificarse para proporcionar grupos de unión al marcaje. Alternativamente, las bases intermedias se pueden sustituir con grupos de unión activables que después pueden unirse al marcaje.

Las enzimas de interés como grupos indicador serán principalmente hidrolasas, particularmente esterasas y glucosidasas, u oxidorreductasas, particularmente peroxidasas. Los compuestos fluorescentes incluyen fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona y similares. Los quimioluminiscentes incluyen luciferina y 2,3-dihidroftalazinadionas (por ejemplo, luminol).

La sonda se puede emplear para hibridarse con una secuencia de nucleótidos fijada a un soporte poroso insoluble en agua. Dependiendo de la fuente de ácido nucleico, la forma en la que el ácido nucleico se fija al soporte puede variar. Los especialistas en la técnica conocen, o pueden descubrir fácilmente, distintos soportes que se pueden usar en el método de la invención.

El ácido nucleico de una muestra de heces se spot o extiende en un filtro para proporcionar una diversidad de porciones individuales. El filtro es un soporte inerte poroso sólido, por ejemplo, nitrocelulosa. Cualquiera de las células presentes en las heces se trata para liberar su ácido nucleico. El lisado y la desnaturalización del ácido nucleico, así como los lavados posteriores, se pueden realizar con una solución apropiada durante un tiempo suficiente para lisar las células y desnaturalizar el ácido nucleico. Para el lisado, se empleará convenientemente lisado químico, como se ha descrito previamente para la solución tampón de lisis de las heces. Otros agentes de desnaturalización incluyen elevadas temperaturas, reactivos orgánicos, por ejemplo, alcoholes, amidas, aminas, ureas, fenoles y sulfóxidos o ciertos iones inorgánicos, por ejemplo tiocianato y perclorato.

Después de la desnaturalización, el filtro se lava en una solución tampón acuosa, tal como Tris, generalmente a un pH de aproximadamente 6 a 8, normalmente 7. Se pueden realizar uno o más lavados, convenientemente usando el mismo procedimiento que el empleado para el lisado y la desnaturalización. Después de realizar el lisado, la desnaturalización y los lavados, el filtro cargado con ácido nucleico se seca a alta temperatura, generalmente de aproximadamente 50ºC a 70ºC. En este procedimiento, el ácido nucleico se fija en posición y se pueden analizar con la sonda cuando sea conveniente.

La pre-hibridación se puede realizar incubando el filtro a una temperatura ligeramente elevada durante un tiempo suficiente con la solución de hibridación sin la sonda para humedecer completamente el filtro. Se pueden emplear distintas soluciones de hibridación, que comprenden de aproximadamente 20% a aproximadamente 60% de volumen, preferiblemente 30%, de un disolvente inerte polar orgánico. Una solución de hibridación común emplea aproximadamente formamida al 50%, cloruro sódico de aproximadamente 0,5 a 1 M, citrato sódico de aproximadamente 0,05 a 0,1 M, dodecilsulfato sódico de aproximadamente 0,05 a 0,2% y cantidades menores de EDTA, ficoll (aproximadamente 300-500 kD), polivinilpirrolidona (aproximadamente 250-500 kD) y albúmina de suero. También se incluirá generalmente en la solución de hibridación de aproximadamente 0,5 a 5 mg/ml de ADN sonicado desnaturalizado, por ejemplo timo de ternera o de esperma de salmón; y opcionalmente de aproximadamente 0,5 a 2% en peso/vol de glicina. También se pueden incluir otros aditivos, tales como sulfato de dextrano de aproximadamente 100 a 1.000 kD y en una cantidad de aproximadamente 8 a 15% en peso de la solución de hibridación.

La técnica de hibridación particular no es esencial para la invención. Otras técnicas de hibridación se describen en Gall y Pardue, Proc. Natl. Acad. Sci. 63:378, 1969; y John, et al. Nature 223:582, 1969. Según se hagan mejoras en las técnicas de hibridación, éstas se pueden aplicar en el método de la invención.

La cantidad de sonda marcada que está presente en la solución de hibridación variará ampliamente, dependiendo de la naturaleza del marcaje, la cantidad de sonda marcada que se puede unir razonablemente al filtro y la rigurosidad de la hibridación. Generalmente, se empleará un exceso sustancial de concentraciones estequiométricas de sonda para mejorar la velocidad de unión de la sonda la ácido nucleico diana fijado.

Se pueden emplear distintos grados de rigurosidad de hibridación. Cuanto más estrictas sean las condiciones se requiere más complementariedad para la hibridación entre la sonda y la secuencia monocatenaria de ácido nucleico diana para la formación del duplex. La severidad se puede controlar con la temperatura, la concentración de sonda, longitud de la sonda, fuerza iónica, tiempo y similares. Convenientemente, la rigurosidad de la hibridación varía cambiando la polaridad de la solución reactiva manipulando la concentración de formamida en el intervalo de 20% a 50%. Las temperaturas empleadas estarán normalmente en el intervalo de aproximadamente 20ºC a 80ºC, normalmente de 30ºC a 75ºC (véase, generalmente, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, ed., Wiley & Sons, 1989).

Después de que el filtro ha entrado en contacto con la solución de hibridación a una temperatura moderada durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que la hibridación tenga lugar, el filtro se introduce en una segunda solución con concentraciones análogas de cloruro sódico, citrato sódico y dodecilsulfato como se proporciona en la solución de hibridación. El tiempo que el filtro se mantiene en la segunda solución puede variar de cinco minutos a tres horas o más. La segunda solución determina la rigurosidad, disolviendo duplex cruzados y secuencias complementarias cortas. Después de aclarar el filtro a temperatura ambiente con una solución de citrato sódico-cloruro sódico diluida, se puede analizar la presencia de duplex en el filtro de acuerdo con la naturaleza del marcaje. Si el marcaje es radioactivo, el filtro se seca y se expone a una película de rayos X.

Los materiales para usar en el ensayo de la invención son especialmente adecuados para la preparación de un kit. Tal kit puede comprender un vehículo dividido en uno o más recipientes tales como viales, tubos y similares, comprendiendo cada uno de los cuales uno de los distintos elementos a usar en el método.

Por ejemplo, uno de los recipientes puede comprender una sonda de hibridación que está marcada o se puede marcar de forma detectable. Un segundo recipiente puede comprender un tampón para la lisis de las heces. El kit puede tener también recipientes que contienen nucleótido(s) para la amplificación de la secuencia de ácido nucleico diana y/o un recipiente que comprende un indicador, tal como una proteína de unión a biotina, tal como avidina o streptavidina, unida a una molécula indicadora, tal como una marcaje enzimático, fluorescente o con radionúclido.

La descripción anterior describe en términos generales la presente invención. Se puede obtener una comprensión más completa en referencia a los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento exclusivamente con propósitos de ilustración y que no pretenden limitar el alcance de la invención.

Ejemplo 1 Detección de ADN neoplásico en muestras de heces

Se realizó un estudio inicial para analizar tumores en veinticuatro pacientes con el fin de detectar la presencia de mutaciones de los genes K-ras en los codones 12 ó 13. Estos casos comprendían una serie consecutiva de pacientes clínicos de los que se pudo tomar muestras de heces antes de la preparación del intestino para colonoscopia o cirugía y que posteriormente se descubrió que tenían un tumor maligno colorrectal (carcinoma) o un tumor benigno (adenoma) de más de 1 cm de diámetro. Los adenomas de este tamaño son los más importantes clínicamente, ya que es mucho más probable que evolucionen a un tumor maligno que otros tumores más pequeños.

El primer exón de los genes K-ras se amplificó con ADN purificado de las secciones crioestáticas de estos tumores (Fearon, et al., Nature 318:377, 1985) usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Para la PCR, el cebador con sentido fue 5'-AGGAATTCATGACTGAATATAAACTTGT-3' y el cebador antisentido fue 5'-ATCGAATTC
TATGCATATTAAAACAAGATT-3'. Estos cebadores incluían posiciones EcoRI en sus extremos 5' para facilitar la clonación. Cada ciclo de PCR consistía en una etapa de desnaturalización a 90ºC durante 30 segundos, seguida de templado a 55ºC durante 30 segundos y extensión a 70ºC durante 45 segundos. Para cada PCR, se usaron 500 ng de AND plantilla y 5 unidades de Taq polimerasa en una reacción de 50 \mul que contenía dNTP 1,5 mM, sulfato de amonio 16,6 mM, Tris 67 mM, pH 8,8 MgCl_{2} 8,67 mM, \beta-mercaptoetanol 10 mM, y dimetilsulfóxido al 10%. En este ejemplo específico, se realizaron 35 ciclos para ADN tumoral y 45 ciclos para ADN de las heces.

Los productos de la PCR se clonaron en masse, y se combinaron para identificar las mutaciones. Los productos de la PCR se purificaron por extracción con fenol-cloroformo y precipitación con etanol. Se escindieron con EcoRI, se purificaron de nuevo y se ligaron aproximadamente 50 ng de ADN a los brazos del vector lambda Zap II (Stratagene) y se envasó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se infectaron células XLI Blue (Stratagene) con bacteriófago y se obtuvieron plásmidos bicatenarios usando un fago auxiliar (Nigro, et al., Nature, 342:705, 1989). Se reunió un mínimo de 100 clones para la secuenciación usando el cebador 5'-ATTCGTCCACAAAATGAT-3'. En este estudio, se descubrió que 9 de los 24 tumores (37%) contenían mutaciones de este exón. Se identificaron tres mutaciones diferentes (codón 12: gli-> val o asp; codón 13:gli->asp). Estos datos eran consistente con estudios previos en tumores similares que mostraban que aproximadamente el 50% contenían mutaciones de los genes Ras, con un 84% de las mutaciones confinadas a los codones 12 ó 13 de K-ras (Vogelstein, et al., N. Engl. J. Med., 319:525, 1988).

Después, se analizaron las heces de los dos primeros pacientes de los nueve. Se evaluaron varios métodos para purificar el ADN, y posteriormente se usó el procedimiento más reproducible. En este procedimiento, se diluyeron aproximadamente 100 mg de heces congeladas a -80ºC con 300 \mul de tampón de lisis (Tris 500 mM, EDTA 50 mM, NaCl 10 mM, pH 9,0) y se agitó vorticialmente, y las partículas y la mayor parte de las bacterias se retiraron por centrifugación (12.000 g, 2 min. 30 segundos). El ADN del sobrenadante se purificó por digestión K con SDS-proteinasa, extracción con fenol cloroformo y precipitación con etanol (Goelz, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 13:118, 1985). Después, el ADN de las heces se purificó por unión a perlas de vidrio (Vogelstein y Gillespie, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:615, 1978) usando una matriz Prepagene (BioRad). Se usaron cinco microlitros de matriz para purificar el ADN de 100 mg de heces, siguiendo las condiciones especificadas por el fabricante. Normalmente, se obtuvieron de 0,5 a 5,0 \mug de ADN.

Después, el primero exón del gen K-ras se amplificó por PCR con este ADN de la misma manera que se ha descrito anteriormente para el ADN de los tumores. Como inicialmente se esperaba que los genes ras mutantes representasen solamente una pequeña parte del total de genes Ras en las heces (en el caso de estar presentes), se usó una técnica de análisis muy sensible para el K-Ras, que implicaba la clonación en un bacteriófago. Esta técnica había demostrado previamente permitir la identificación de una pequeña parte de los genes mutantes p53 en la orina de pacientes con cánceres de vejiga en estado avanzado y revelar la existencia de un gen mutante entre varios miles de genes normales (Sidransky, et al., Science, 252:706, 1991).

Las células SL1 infectadas con bacteriófago que contenían productos PCR se colocaron en placas de L-agar a una densidad de 100-2.000 placas por placa, se pasaron a membranas de nylon e hibridaron con oligonucleótidos específicos de los genes K-ras de tipo silvestre o mutantes. La hibridación se realizó durante una hora a 50ºC en tampón H (cloruro sódico 0,9 M, EDTA 0,005 M, fosfato sódico 0,05 M, pH 7,0, dodecil sulfato sódico al 1% (SDS), leche seca desnatada al 0,5%, formamida al 10% y polietilenglicol 6000 al 6%) que contenía 10^{7}dpm/ml sonda. Los lavados se realizaron a 63ºC en cloruro sódico 450 mM, citrato sódico 18 mM, Tris 1 mM, pH 7,2, SDS al 0,1% durante 15 minutos. Las películas se expusieron durante 1-8 horas a -80ºC con selecciones de intensificación. Los oligonucleótidos usados para la hibridación fueron 5'-GGAGCTGGTGGCGTAGGCAA-3' para el Ras (wt) de tipo silvestre, 5'-GGAGCTGTTGGCGTAGGCAA-3' para el mutante 12^{val}, 5'-GGAGCTGATGGCGTAGGCAA-3' para el mutante 12^{asp} 5'-GGAGCTGGTGACGTAGGCAA-3' para el mutante 13^{asp}. Los oligonucleótidos se marcaron con una actividad específica de aproximadamente 10^{8} dpm/\mug usando polinucleótido kinasa T4.

Sorprendentemente, el análisis de estos descubrimientos mostró que ambos pacientes contenían genes mutantes Ras en el ADN purificado de sus muestras de heces. Los genes mutantes detectados en las heces fueron los mismos que los detectados en los tumores (12^{val} en heces y tumor del paciente 1; 13^{asp} en las heces del paciente 2, Figura 1). Una muestra de heces de control de un paciente sin mutación en el gen Ras de su tumor no contenía mutaciones en ninguna de estas posiciones (Figura 1, paciente 10).

El porcentaje de las placas fago en hibridación con el oligonucleótido específico de mutante en los pacientes 1 y 2 era bastante alto, representando un 8% y 4%, respectivamente, del fago en hibridación con el oligonucleótido específico del gen K-ras de tipo silvestre. Estos descubrimientos inesperados indicaban que se podría usar un ensayo menos sensible pero más simple para identificar genes mutantes en muestras de heces.

Para explorar la posibilidad de usar una técnica más simple y más rápida para detectar una secuencia diana especifica, en este caso los distintos genes K-ras, los productos PCR en bruto se sometieron simplemente a electroforesis en un gel de agarosa y se pasaron a filtro de nylon por el método Southern. Estas transferencias se incubaron con oligonucleótidos marcados que reconocían genes de tipo silvestre o mutantes K-ras. En la Figura 2 se muestran algunos ejemplos de resultados para muestras de tumor y heces. La mutación 12^{val} descubierta en la paciente 1 se observó fácilmente en sus heces usando el ensayo de transferencia de Southern (Figura 2, panel superior). Los oligonucleótidos específicos del mutante 12^{asp} proporcionaron un control negativo (Figura 2, panel central). El oligonucleótido específico de tipo silvestre hibridó con el ADN del tumor y de las heces, como se esperaba (Figura 2, panel inferior). De forma similar, los análisis de transferencia de Southern revelaron que el ADN de tumores y heces de los pacientes 3 y 4 contenían la mutación 12^{asp}, aunque ninguno hibridó con el oligonucleótido específico 12^{val} (Figura 2). La relación de hibridación de mutante con de tipo silvestre en las muestras de heces fue 5-10 veces inferior que en los tumores, de forma coherente con los ensayos de hibridación de placa.

Las heces de los nueve pacientes se analizaron por análisis de transferencia de Southern y se detectaron mutaciones en ocho de ellos (Tabla I). Las mutaciones originadas en tumores benignos (pacientes 2 y 9) así como los tumores malignos fueron detectables en las heces. Tumores de un tamaño de 1,3 cm^{3} dieron lugar a genes detectables en las heces (paciente 2). Además, la posición en el intestino no parecía ser crítica ya que incluso los tumores muy proximales (paciente 9, Ciego; paciente 7, colon ascendente) dieron resultados positivos.

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(Tabla pasa a página siguiente)

1

2

\newpage

Se examinaron seis muestras de heces como controles, tres de pacientes sin neoplasia colorrectal y tres de pacientes con tumores colorrectales que no contenían mutaciones K-ras en los codones 12 ó 13. En los seis casos se observó una fuerte hibridación de los oligonucleótidos de tipo silvestre específicos, pero no con los oligonucleótidos específicos de las mutaciones 12^{val}, 12^{asp} o 13^{asp} (Tabla I, ejemplos en las Figuras 1 y 2).

Los resultados de estos experimentos proporcionan una realización en la que se consiguió una detección satisfactoria de neoplasia y proporciona una base práctica para un nuevo método de detección de presencia de neoplasias, tales como tumores colorrectales, de una forma no invasiva. Este método tendría utilidad en el control de poblaciones de pacientes con diferentes dietas o tratamientos diseñados para minimizar la incidencia de neoplasia. También se podría usar en el diagnóstico de neoplasias de pacientes asintomáticos, especialmente en aquellos de alto riesgo debido a factores hereditarios o medioambientales. Los resultados actuales indican que se puede identificar un porcentaje significativo de cánceres colorrectales y peligrosas lesiones pre-malignas mediante esta estrategia. Adicionalmente, estos descubrimientos indican que también podrían ser detectables en las heces otras secuencias mutantes de nucleótidos, además de K-ras, que están asociadas o indican la existencia de neoplasias intestinales. Tales secuencias incluyen, por ejemplo, los genes de DCC, MCC, FAP y APC en los que se puede encontrar p53.

La descripción anterior describe generalmente la presente invención. Se puede obtener una comprensión más completa por referencia a los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento exclusivamente con propósito de ilustración y no pretenden limitar el alcance de la invención.

Resumen de secuencias

La Secuencia ID Nº 1 es una secuencia de ácido nucleico de un cebador oligonucleótido usado para amplificar una secuencia mutante de ácido nucleico en el método de la presente invención (página 10, línea 3);

La Secuencia ID Nº 2 es una secuencia de ácido nucleico de un cebador oligonucleótido usado para amplificar una secuencia mutante de ácido nucleico en el método de la presente invención (página 10, línea 4);

La Secuencia ID Nº 3 es una secuencia de ácido nucleico de un cebador oligonucleótido usado para amplificar una secuencia mutante de ácido nucleico en el método de la presente invención (página 16, línea 22);

La Secuencia ID Nº 4 es una secuencia de ácido nucleico de un cebador oligonucleótido usado para amplificar una secuencia mutante de ácido nucleico en el método de la presente invención (página 16, línea 23, primera aparición);

La Secuencia ID Nº 5 es una secuencia de ácido nucleico de un cebador oligonucleótido usado para amplificar una secuencia mutante de ácido nucleico en el método de la presente invención (página 16, línea 23, segunda aparición);

La Secuencia ID Nº 6 es una secuencia de ácido nucleico de un oligonucleótido de la secuencia con sentido del primer exón del gen K-ras (página 23, línea 14);

La Secuencia ID Nº 7 es una secuencia de ácido nucleico de un oligonucleótido de la secuencia antisentido del primer exón del gen K-ras (página 23, línea 15);

La Secuencia ID Nº 8 es una secuencia de ácido nucleico de un cebador oligonucleótido usado para amplificar una secuencia mutante de ácido nucleico en el método de la presente invención (página 24, línea 4);

La Secuencia ID Nº 9 es una secuencia de ácido nucleico de un oligonucleótido de Ras de tipo silvestre (página 25, línea 17);

La Secuencia ID Nº 10 es una secuencia de ácido nucleico de un oligonucleótido del mutante Ras 12^{val} (página 25, línea 18);

La Secuencia ID Nº 11 es una secuencia de ácido nucleico de un oligonucleótido del mutante Ras 12^{asp} (página 25, línea 19) y

La Secuencia ID Nº 12 es una secuencia de ácido nucleico de un oligonucleótido del mutante Ras 13^{asp} (página 25, línea 20).

(1) INFORMACIÓN GENERAL

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(i)

SOLICITANTE: Vogelstein, Bert

\hskip3,3cm

Kinzler, Kenneth W.

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: MÉTODO PARA LA DETECCIÓN DE ÁCIDO NUCLEICO DIANA CON ANÁLISIS DE HECES

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS : 12

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(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

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(A)

TITULAR: Spensley Horn Jubas & Lubitz

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(B)

DIRECCIÓN: 1880 Century Park Easy - Suite 500

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(C)

CIUDAD: Los Angeles

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(D)

ESTADO: California

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(E)

PAÍS: U.S.A.

\vskip0.333000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 90067

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(v)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

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(A)

TIPO DE MEDIO: disco floppy

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(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

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(C)

SISTEMA OPERATIVO : PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn Relase #1.0, Version #1.25

\vskip0.666000\baselineskip

(vi)

DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 07/864.910

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 01 Abril 1992

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(C)

CLASIFICACIÓN:

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(viii)

INFORMACIÓN DE REPRESENTANTE/AGENTE

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Wetherell, Jr. pH.D., John W.

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 31.678

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA: PD-1901

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(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: (619) 544-5100

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

FAX: (619) 455-5110

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº:1:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

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(A)

LONGITUD: 28 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_RNA

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(B)

LOCALIZACIÓN: 1..28

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(xi)

DESCIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº:1:

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\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCCTTAAGTA CTGACTTATA TTTGAACA

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº:2:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

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(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_RNA

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(B)

LOCALIZACIÓN: 1..30

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº:2:

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\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAGCTTAAGA TACGTATAAT TTTGTTCTAA

\hfill

30

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº:3:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_RNA

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..20

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº:3:

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\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTCGACAAC CGCATCCGTT

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº:4:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_RNA

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..20

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº:4:

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\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTCGACCAC TGCATCCGTT

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº:5:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_RNA

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..20

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº:5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTCGACCAC TGCATCCGTT

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº:6:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_RNA

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..28

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº:6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGGAATTCAT GACTGAATAT AAACTTGT

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº:7:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_RNA

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..30

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº:7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATCGAATTCT ATGCATATTA AAACAAGATT

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº:8:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_RNA

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..18

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº:8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATTCGTCCAC AAAATGAT

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº:9:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_RNA

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..20

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº:9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGAGCTGGTG GCGTAGGCAA

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº:10:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_RNA

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..20

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº:10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGAGCTGTTG GCGTAGGCAA

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº:11:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_RNA

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..20

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº:11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGAGCTGATG GCGTAGGCAA

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº:12:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_RNA

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..20

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº:12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGAGCTGGTG ACGTAGGCAA

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

Claims (43)

1. Un método para mejorar la detectabilidad de un ácido nucleico diana en un ácido nucleico de un mamífero en una muestra de heces, método que comprende: enriquecer el ácido nucleico diana separando el ácido nucleico de mamífero presente en la muestra de heces de las células bacterianas presentes en la muestra de heces y detectar la presencia del ácido nucleico diana en el ácido nucleico del mamífero.

2. El método de la reivindicación 1 en el que el ácido nucleico diana se amplifica antes de la detección.

3. El método de la reivindicación 2, en el que la amplificación se realiza por medio de oligonucleótido(s) capaces de hibridar con las regiones adyacentes del ácido nucleico diana.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el ácido nucleico diana comprende una mutación, un polimorfismo de longitud de fragmento de restricción, una supresión de ácido nucleico o una sustitución de ácido nucleico.

5. El método de la reivindicación 4, en el que la mutación está asociada con un neoplasma.

6. El método de la reivindicación 5, en el que el neoplasma es del tracto gastrointestinal.

7. El método de la reivindicación 6, en el que el neoplasma se encuentra en el intestino delgado.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en el que el neoplasma es benigno.

9. El método de la reivindicación 8, en el que el neoplasma se selecciona entre el grupo compuesto por adenomas, leiomiomas, lipomas y angiomas.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en el que el neoplasma es maligno.

11. El método de la reivindicación 10, en el que el neoplasma se selecciona entre el grupo compuesto por adenocarcinomas, leiomiosarcomas, linfomas y tumores carcinoides.

12. El método de la reivindicación 6, en el que el neoplasma se encuentra en el intestino grueso.

13. El método de la reivindicación 12, en el que el neoplasma es benigno.

14. El método de la reivindicación 13, en el que el neoplasma es un pólipo adenomatoso.

15. El método de la reivindicación 12, en el que el neoplasma es maligno.

16. El método de la reivindicación 12, en el que el neoplasma es un carcinoma colorrectal.

17. El método de la reivindicación 5, en el que el neoplasma es carcinoma de páncreas.

18. El método de la reivindicación 6, en el que el neoplasma es carcinoma de estómago.

19. El método de la reivindicación 5, en el que el ácido nucleico diana asociado con el neoplasma se selecciona entre el grupo compuesto por un oncógeno y un gen de supresión tumoral.

20. El método de la reivindicación 19, en el que el oncógeno es miembro de la familia ras.

21. El método de la reivindicación 20, en el que el oncógeno es K-ras.

22. El método de la reivindicación 19, en el que el gen de supresión tumoral se selecciona entre el grupo compuesto por p53, DCC, MCC, FAP y APC.

23. El método de la reivindicación 3, en el que la secuencia de nucleótido de la región adyacente con la que el oligonucleótido es capaz de hibridar se selecciona entre el grupo compuesto por

5'-ACAAGTTTATATTCAGTCATGAATTCCT-3'

o

5'-AATCTTGTTTTAATATGCATAGAATTCGAT-3', y

secuencias complementarias de las mismas.

24. El método de la reivindicación 23, en el que el oligonucleótido es

5'-AGGAATTCATGACTGAATATAAACTTGT-3'

o

5'-ATCGAATTCTATGCATATTAAAACAAGATT-3', y

secuencias complementarias de las mismas.

25. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, en el que el ácido nucleico diana se detecta usando una sonda de hibridación de nucleótido.

26. El método de la reivindicación 25, en el que el ácido nucleico diana al que la sonda nucleótido de hibridación es capaz de hibridar se selecciona entre

5'-TTGCCTACGCCAACAGCTCC-3';

5'-TTGCCTACGCCATCAGCTCC-3';

o

5'-TTGCCTACGTCACCAGCTCC-3'; y

secuencias complementarias de las mismas.

27. El método de la reivindicación 26, en el que la sonda nucleótido de hibridación se selecciona entre

5'-GGAGCTGTTGGCGTAGGCAA-3';

5'-GGAGCTGATGGCGTAGGCAA-3';

o

5'-GGAGCTGGTGACGTAGGCAA-3'; y

secuencias complementarias de las mismas

28. Un método para separar ácido nucleico de un mamífero de una muestra de heces que comprende:

(a) retirar las partículas de una muestra de heces en tampón de lisis de heces a una concentración de 500 mM para producir una fracción no particulada; y

(b) separar el ácido nucleico de la fracción no particulada

29. El método de la reivindicación 28, en el que la fracción no particulada se trata para degradar las nucleasas.

30. El método de la reivindicación 29, en el que la fracción tratada no particulada se extrae para concentrar el ácido nucleico.

31. El método de la reivindicación 29, que comprende adicionalmente al menos una de las etapas de unión de ácido nucleico a vidrio en presencia de una sal caotrópica o unión del ácido nucleico a una matriz de intercambio iónico modificada.

32. El método de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 31, en el que el tampón de lisis de heces tiene un pH de aproximadamente 8,0 a aproximadamente 9,0, un agente quelante a una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 200 mM, un tampón a una concentración de 500 mM, y una concentración de sal de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 20 mM.

33. El método de la reivindicación 32, en el que el agente quelante es EDTA.

34. El método de la reivindicación 32, en el que la sal es NaCl.

35. El método de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 34, en el que la materia particulada se retira por centrifugación.

36. El método de la reivindicación 29, en el que las nucleasas se degradan con proteinasa K.

37. El método de la reivindicación 30, en el que la fracción no particulada se extrae con fenol-cloroformo y se precipita con etanol.

38. El uso de un tampón de lisis de heces en cualquiera de las reivindicaciones 1-37, comprendiendo el tampón un tampón a una concentración de 500 mM, un agente quelante a una concentración de 10 mM a 200 mM y una sal a una concentración de 1 mM a 20 mM a un pH de 8,0 a 9,0.

39. El uso de la reivindicación 38, en el que el agente quelante es EDTA.

40. El uso de la reivindicación 38, en el que la sal es NaCl.

41. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 38 a 40 que comprende además Tris a una concentración de 0,1 M a 1 M.

42. El uso de un kit para la detección de un ácido nucleico diana en una muestra de heces, comprendiendo dicho kit medios en compartimentos para recibir uno o más recipientes que comprenden un primer recipiente que contiene una sonda de hibridación, y un segundo recipiente que contiene un tampón de lisis de heces de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 38 a 41.

43. El uso de la reivindicación 42, que comprende adicionalmente un recipiente que contiene un cebador oligonucleótido para la amplificación del ácido nucleico diana.