KR102554477B1 - 질병 활성도의 특징을 규명하는 전신 홍반성 낭창(sle) 질병 활성도 면역 지수를 위한 생체지표 - Google Patents

질병 활성도의 특징을 규명하는 전신 홍반성 낭창(sle) 질병 활성도 면역 지수를 위한 생체지표 Download PDF

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Abstract

본 발명은 전신 홍반성 낭창 환자(SLE)에서의 질병 활성도를 특징 규명하는 방법을 포함하는데, 상기 방법은 상기 환자에게서 혈액, 혈청, 혈장 또는 소변 시료와 연관된 데이터 집합을 획득하되 상기 데이터 집합이 (b) 내지 (g) 각각에서 혈액, 혈청, 혈장 또는 소변 시료; 최소한 하나의 본래의 혈청 또는 혈장 매개체 생체지표; 최소한 하나의 적응성 혈청 또는 혈장 매개체; 최소한 하나의 케모카인/부착 분자 생체지표; 최소한 하나의 용해성 TNF 상과 생체지표; 상기 염증성 매개체 생체지표 SCF; 최소한 하나의 SLE-연관 자가항체 특이성 생체지표의 수치를 나타내는 데이터를 포함하는 것인 단계; 및 루푸스 질병 활성도 면역 지수(LDAII) 점수를 계산하는 단계를 포함한다.

Description

질병 활성도의 특징을 규명하는 전신 홍반성 낭창(SLE) 질병 활성도 면역 지수를 위한 생체지표
발명의 기술분야
본 발명은 일반적으로 전신 홍반성 낭창(SLE)에서 질병 활성도의 특징을 규명하는 루푸스 질병 활성도 면역 지수를 계산하기 위한 생체지표의 분야에 관한 것이다.
연방보조금지원 연구의 성명
해당사항 없음.
서열 목록 참조
해당사항 없음.
본 발명의 범위를 제한하지 않으면서, 본 발명의 배경이 전신 홍반성 낭창(SLE)과 관련하여 기술된다.
미국 인구 중 상당한 비율이 SLE를 비롯한 전신 자가면역 질환으로 고통받고 있다. 최근 인구-기반 연구가 73/100,000명 유병률을 반영하는 한편(1, 2), 미국 루푸스 재단은 일상적인 임상 진료 중 잠재적 SLE 환자의 수가 무려 470/100,000명에 이르는 것으로 예측한다. SLE는 일련의 임상적 증상을 제공하고; 질병 분류는 미국 류마티스학 대학(ACR) 기준 11개 중 4개에 부합하는지 여부에 따라 결정된다(3, 4). 병을 앓고 있는 환자의 90% 이상이 15세에서 45세까지의 여성이다. 소수인종 집단에서 그리고 사회경제학적 지위가 더 낮은 층에서 유병률이 더 높다(5). 지속적으로 활성인 임상적 질병과 그것의 치료가 환자를 중추신경계, 폐, 심혈관계 및 신장 손상(9~12), 루푸스 신장염, 및 말기 신장병(11, 13)을 비롯한 장기 손상(6-8)의 위험에 놓이게 한다. 악화/완화되는 질병 및 임상적 활성 또는 휴지기 질병을 앓는 환자들은 각각이 임상적 질병 활성(flare)(14, 15)의 위험에 처한다.
SLE는 특히 젊은 여성과 소수인종에서 유의미한 질병의 발병률과 조기 사망률을 유발하는 임상학적 및 혈청학적 이질성 전신 자가면역 질환이다. 병리학적 자가항체와 만성 염증의 형태인 면역 조절장애가 넓은 범위의 임상학적 징후, 예컨대 피부 발진, 관절염 및 치명적인 신장 및/또는 중추신경계 손상에 기여한다. 수많은 항핵 자가항체(ANA) 특이성이 SLE 환자에게 축적됨이 확인된 바 있고; 하이드록시클로로퀸의 사용이 자가항체 축적을 없앨 수 있고, 임상적 질병 활성도를 상쇄할 수 있다. 조기 개입이 SLE 치료에 매력적인 접근법이다. 하지만, SLE 질병 활성도에서의 병리학적 기전에 대한 우리의 이해가 불충분하다. 이와 같은 지식의 격차를 메운다면 질병 활성도 증가 및 영구적인 장기 손상의 위험에 처한 개인을 식별하고, 조기 개입을 위한 기회의 창을 정의하고 경로-표적 치료의 개발을 촉진하는 우리의 능력이 향상될 것이다.
높은 질병 활성도의 조짐 및 징후가 그것의 발생 후 포착되기에, 조직 및 장기 손상을 예방하기 위한 인지 및 조기 치료가 어렵다. 검증된 임상적 질병 활성도 기구(16~18)와 개선된 치료 전략에도 불구하고, 지속적으로 활성인 질병이 SLE 환자들에게 부담으로 존재한다(19). 영구적 장기 손상(24, 25), 예컨대 신장 손상(26)뿐만 아니라 활성 질환을 관리하기 위해 필요한 치료, 특히 스테로이드(20~23)와 연관된 질병의 발병률 및 조기 사망률의 증가가 비용을 추가로 상승시킨다. 이와 더불어, 질병 활성도를 관리하기 위해 필요한 스테로이드(23) 및 기타 면역-억제제(27)의 장기적인 사용이 질병의 발병률의 증가와 연관된다. 임상적 질병을 적극적으로 관리하지 못하는 무능성이 반응적 치료에 대한 의료적 돌봄을 제한함으로써, 말기 장기 손상(6~8)을 방지하고 SLE(29)의 병리학적 및 사회경제학적 부담을 감소시키기 위해 스테로이드를 줄이는 면역 변형제제(28)를 추가하거나 또는 늘리는 적극적 전략이 배제된다.
SLE에서 현재 생체지표가 영구적 장기 손상을 예상하는 데 제한적으로 활용된다. 비록 항-dsDNA, 항-스플라이세오솜 및 항-Ro/SSA와 같은 SLE-연관 자가항체 특이성이 SLE 환자에게서 축적된다고 해도, 그것의 존재만으로 진행 중인 활성 질환 및 영구적 장기 손상으로의 진행을 예측할 수 없다. ANA는 기타 전신 류마티스 질병을 앓는 환자 그리고 SLE가 발생하지 않은 건강한 개인, 예컨대 SLE 환자의 일부 병이 없는 가족 구성원과 최대 14%의 일반 집단 구성원에서 확보된 혈청에서 또한 발견된다. 개인이 ANA-양성임에도 건강을 유지할 수 있기 때문에, ANA 양성이 SLE의 유일한 병리학적 동인일 가능성은 없다. ANA 양성 뿐만 아니라, 용해성 매개체에 의해 유발되는 다양한 면역 경로의 조절장애가 임상적 질병의 발달에 기여할 수 있다. 단 하나의 요인 또는 기전으로 SLE 병리발생 발병기전의 복잡성 및 이질성을 충분히 설명할 수는 없을 것이고; 따라서 조기 질병 발병기전의 메커니즘을 설명하고 SLE 분류를 예측하는 독특한 매개변수를 구분 짓기 위해 다변수, 종적 접근법이 정당화된다.
예컨대 제일 처음 FDA에 의해 승인되어 50년이 넘은 SLE 약인 벨리무맙(30)을 비롯한 수많은 지시된 면역 경로 치료의 임상실험에도 불구하고, 이들 연구들 대다수가 실패하는데, 부분적으로는 주어진 환자에서 조절장애가 일어난 면역 경로의 이해 부족에 기인한다. 임상적 질병 활성도에 대한 대리(surrogate) 종점으로서 면역의 영향을 받는 생체표지 필요성이 점점 더 커지고 있다. 입증된 SLE 임상적 질병 활성도 측정치가 일상 진료에서 사용되는 것이 행정적 부담으로 인해 제한된다(31). 입증된 질병 활성도 도구, 예컨대 현재 사용되는 혼성 전신 홍반성 낭창 질병 활성도 지수(hSLEDAI)(32, 33)와 영국 제도 루푸스 평가 그룹(BILAG) 지수(17)는 노동집약적이고, 이와 같은 임상적 기구가 최신데이터로 갱신되면서(34), 지속적이고 전문적인 훈련을 요구한다. 임상적 질병 활성도를 평가할 때 담당의사의 경험에만 의존하는 것은 예기치 않은 변동성과 부정적 결과의 위험을 내포한다(31, 35).
SLE의 임상적 이질성이 하기의 과학적 전제의 기초가 된다: 이질성 면역 조절장애가 임상적 질병 활성도의 기초가 된다. 본 발명의 발명가들은 이전에 환자가 조직 손상으로 고통 받고, 임상적 후유증을 얻고, 그럼으로써 궁극적으로는 질병 분류에 도달하면서, 임상적 SLE의 시작에 앞서 예기효과(feed-forward) 메커니즘에서 증폭되는 면역 조절장애를 보임을 밝힌 바 있다(36, 37). 본 발명의 발명가들은 또한 다중 SLE-연관 자가항체(AutoAbs)와 장애조절이 일어난 염증 및 조절 면역 경로의 축적을 기술하였다(36, 37). 하지만, 오늘날까지 SLE의 면역 메커니즘에 영향을 받는 질병 관리 검정의 부족은 동시의 또는 미래의 임상적 질병 활성도 중 하나를 위한 보편적 대리물로서 작용하는 개별적으로 면역 경로에 영향을 받는 생체지표에서 기인하는 것이 아니다(38).
따라서, 분류된 SLE를 앓는 환자에서 질병 활성도 및 진행을 검출, 추적 및 평가하기 위한 새로운 방법이 여전히 필요하다.
일 구현예에서, 본 발명은 전신 홍반성 낭창(SLE) 환자에서 질병 활성도를 특징 규명하기 위한 방법을 포함하는데, 상기 방법은 (a) 상기 환자에게서 혈액, 혈청, 혈장 또는 소변 시료와 연관된 데이터 집합을 획득하되, 상기 데이터 집합이 (b) 내지 (g) 각각으로부터 상기 혈액, 혈청, 혈장 또는 소변 시료의 하나 이상의 생체지표의 수치를 나타내는 데이터를 포함하는 단계; (b) IL-1α, IL-1β, IL-1RA, IFN-α, IL-12p70, IL-6 및 IL-23p19에서 선택된 최소한 하나의 본래의 혈청 또는 혈장 매개체 생체지표의 단백질 발현의 존재 여부 또는 그것의 양에 대해 상기 데이터 집합을 평가하는 단계; (c) IL-2, IFN-γ, IL-5, IL-13, IL-17A, IL-21, IL-10 및 TGF-β에서 선택된 최소한 하나의 적응성 혈청 또는 혈장 매개체 생체지표의 단백질 발현의 존재 여부 또는 그것의 양에 대해 상기 데이터 집합을 평가하는 단계; (d) IL-8/CXCL8, IP-10/CXCL10, MIG/CXCL9, MIP-1α/CCL3, MIP-1β/CCL4, MCP-1/CCL2, MCP-3/CCL7 및 ICAM-1에서 선택된 최소한 하나의 케모카인/부착 분자 생체지표 존재 여부 또는 그것의 양에 대해 상기 데이터 집합을 평가하는 단계; (e) TNFRI, TNFRII, TRAIL, TWEAK, CD40L/CD154, BLyS 및 APRIL에서 선택된 최소한 하나의 용해성 TNF 상과 생체지표의 존재 여부 또는 그것의 양에 대해 상기 데이터 집합을 평가하는 단계; (f) 염증성 매개체 생체지표 줄기세포인자(SCF)의 존재 여부 또는 그것의 양에 대해 상기 데이터 집합을 평가하는 단계; (g) dsDNA, 염색질, RiboP, Ro/SSA, La/SSB, Sm, SmRNP 및 RNP에서 선택된 최소한 하나의 SLE-연관 자가항체 특이성 생체지표의 존재 여부 또는 그것의 양에 대해 상기 데이터 집합을 평가하는 단계; 및 (h) 루푸스 질병 활성도 면역 지수(LDAII) 점수를 계산하는 단계를 포함한다. 일 양태에서, 최소한 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 또는 39개 생체지표가 상기 LDAII의 계산에 사용된다. 또 다른 양태에서, 상기 데이터 집합이 로그 전환되고; 표준화되고; 표준화된 데이터 집합에서 자가항체 특이성에 대한 스피어만 r 상관에 의해 가중치를 부여 받고, 용해성 단백질 표지의 총합이 LDAII 점수와 같다. 또 다른 양태에서, 상기 최소한 하나의 면역측정법의 수행이 하기를 포함한다: 제1 시료를 획득하되, 제1 시료가 단백질 표지를 포함하는 것인 단계; 제1 시료를 구별되는 다양한 시약과 접촉시키는 단계; 상기 시약과 표지 사이에 다수의 구별되는 복합체를 생성하는 단계; 및 상기 복합체를 검출하여 상기 데이터를 생성하는 단계. 또 다른 양태에서, 상기 최소한 하나의 면역측정법이 멀티플렉스 측정법을 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 LDAII가 SLE의 중등도 또는 진행의 수준을 혈청학적(dsDNA 결합 및 낮은 보체) 활성(SA) 또는 혈청학적 휴지기(SQ)인 임상적 활성(CA) 또는 임상적 휴지기(CQ) 질병으로 나눈다. 또 다른 양태에서, 상기 LDAII 점수가 활성 및 저활성 루푸스 질병 활성도를 구별한다. 또 다른 양태에서, 상기 방법이, 상기 환자가 분류된 SLE로의 이행에 대한 예후를 갖는다고 결정한 후 임상적 질병 분류에 도달하기에 앞서, 상기 환자에게 치료를 시행하는 단계를 추가로 포함하되, 상기 치료가 하기 중 최소한 하나를 포함한다: 하이드록시클로로퀸(HCQ), 벨리무맙, 비스테로이드성 항염증 약물, 스테로이드, 또는 질병 변형 항류마티즘 약물(DMARD).
또 다른 구현예에서, 본 발명이 환자에게서 전신 홍반성 낭창(SLE) 임상적 질병의 질병 활성도 및 진행을 평가하는 방법을 포함하되, 상기 방법이 상기 환자에게서 혈액, 혈청, 혈장 또는 소변 시료를 획득하는 단계; 상기 환자의 시료에 최소한 하나의 면역측정법을 수행하여 (1) 내지 (6) 각각에서 최소한 하나의 생체지표를 포함하는 데이터 집합을 생성하는 단계: (1) IL-1α, IL-1β, IL-1RA, IFN-α, IL-12p70, IL-6 및 IL-23p19에서 선택된 최소한 하나의 본래 혈청 또는 혈장 매개체 생체지표의 단백질 발현의 존재 여부 또는 그것의 양에 대해 상기 데이터 집합을 평가; (2) IL-2, IFN-γ, IL-5, IL-13, IL-17A, IL-21, IL-10 및 TGF-β에서 선택된 최소한 하나의 적응성 혈청 또는 혈장 매개체 생체지표의 단백질 발현의 존재 여부 또는 그것의 양에 대해 상기 데이터 집합을 평가; (3) IL-8/CXCL8, IP-10/CXCL10, MIG/CXCL9, MIP-1α/CCL3, MIP-1β/CCL4, MCP-1/CCL2, MCP-3/CCL7 및 ICAM-1에서 선택된 최소한 하나의 케모카인/부착 분자 생체지표의 존재 여부 또는 그것의 양에 대해 상기 데이터 집합을 평가; (4) TNFRI, TNFRII, TRAIL, TWEAK, CD40L/CD154, BLyS 및 APRIL에서 선택된 최소한 하나의 용해성 TNF 상과 생체지표의 존재 여부 또는 그것의 양에 대해 상기 데이터 집합을 평가; (5) 염증성 매개체 생체지표 SCF의 존재 여부 또는 그것의 양에 대해 상기 데이터 집합을 평가; 및 (6) dsDNA, 염색질, RiboP, Ro/SSA, La/SSB, Sm, SmRNP 및 RNP에서 선택된 최소한 하나의 SLE-연관 자가항체 특이성 생체지표의 존재 여부 또는 그것의 양에 대해 상기 데이터 집합을 평가; 및 LDAII 점수를 계산하는 단계를 포함한다. 일 양태에서, 최소한 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 또는 39개 생체지표가 LDAII의 계산에 사용된다. 또 다른 양태에서, 상기 데이터 집합이 로그 전환되고; 표준화되고; 표준화된 데이터 집합에서 자가항체 특이성에 대한 스피어만 r 상관에 의해 가중치를 부여 받고, 상기 용해성 단백질 표지의 총합이 루푸스 질병 활성도 면역 지수(LDAII) 점수와 같다. 또 다른 양태에서, 상기 최소한 하나의 면역측정법의 수행이 하기를 포함한다: 제1 시료를 획득하되, 제1 시료가 상기 단백질 표지를 포함하는 단계; 제1 시료를 다수의 구별되는 시약과 접촉시키는 단계; 상기 시약과 표지 사이에 다수의 구별되는 복합체를 생성하는 단계; 및 상기 복합체를 검출하여 상기 데이터를 생성하는 단계. 또 다른 양태에서, 상기 최소한 하나의 면역측정법이 멀티플렉스 측정법을 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 LDAII가 SLE의 중등도 또는 진행의 수준을 혈청학적(dsDNA 결합 및 낮은 보체) 활성(SA)이거나 혈청학적 휴지기(SQ)인 임상적 활성(CA) 또는 임상적 휴지기(CQ) 질병으로 나눈다. 또 다른 양태에서, LDAII 점수가 활성 및 저활성 루푸스 질병 활성도를 구별한다. 또 다른 양태에서, 상기 방법이 상기 환자가 분류된 SLE로의 이행에 대한 예후를 가짐을 결정한 후 임상적 질병에 도달하기에 앞서 상기 SLE 환자에게 치료를 시행하되, 상기 치료가 하기 중 최소한 하나를 추가로 포함한다: 하이드록시클로로퀸(HCQ), 벨리무맙, 비스테로이드성 항염증 약물, 스테로이드 또는 질병 변형 항류마티즘 약물(DMARD). 또 다른 양태에서, 상기 시료와 연관된 제1 데이터 집합을 획득하는 단계가 상기 시료를 획득 및 가공하여 실험적으로 제1 데이터 집합을 결정하는 단계를 포함하거나, 또는 상기 시료와 연관된 제1 데이터 집합을 획득하는 단계가 상기 시료를 가공하여 실험적으로 제1 데이터 집합을 결정한 제3자에게서 제1 데이터 집합을 받는 단계를 포함한다. 또 다른 양태에서, SCF, TNFRII 및 MCP-1 생체지표의 증가가 신장 관여를 보여준다.
또 다른 구현예에서, 본 발명이 개체에서 일련의 생체지표의 발현 수준을 측정함으로써 루푸스 질병 활성도 면역 지수(LDAII)를 계산하는 방법을 포함하는데, 상기 방법이 생리학적 시료에서 면역측정법에 의해 일련의 생체지표 측정치를 결정하되, 상기 생체지표가 펩타이드, 단백질, 펩타이드를 품은 번역후 변형, 단백질을 품은 번역후 변형, 또는 이들의 조합물이고; 상기 생리학적 시료가 전혈, 혈액 혈장, 혈액 혈청, 또는 이들의 조합물이며; 상기 일련의 생체지표가 하기에서 선택되는 생체지표의 각 범주 중 최소한 하나에서 선택된 측정치의 데이터 집합을 포함하는 단계: IL-1α, IL-1β, IL-1RA, IFN-α, IL-12p70, IL-6 및 IL-23p19에서 선택된 최소한 하나의 본래 혈청 또는 혈장 매개체 생체지표 데이터 집합의 단백질 발현의 존재 여부 또는 그것의 양; IL-2, IFN-γ, IL-5, IL-13, IL-17A, IL-21, IL-10 및 TGF-β에서 선택된 최소한 하나의 적응성 혈청 또는 혈장 매개체 생체지표 데이터 집합의 단백질 발현의 존재 여부 또는 그것의 양; IL-8/CXCL8, IP-10/CXCL10, MIG/CXCL9, MIP-1α/CCL3, MIP-1β/CCL4, MCP-1/CCL2, MCP-3/CCL7 및 ICAM-1에서 선택된 최소한 하나의 케모카인/부착 분자 생체지표 데이터 집합의 존재 여부 또는 그것의 양; TNFRI, TNFRII, TRAIL, TWEAK, CD40L/CD154, BLyS 및 APRIL에서 선택된 최소한 하나의 용해성 TNF 상과 생체지표 데이터 집합의 존재 여부 또는 그것의 양; 염증성 매개체 생체지표 SCF의 존재 여부 또는 그것의 양; 및 dsDNA, 염색질, RiboP, Ro/SSA, La/SSB, Sm, SmRNP 및 RNP에서 선택된 최소한 하나의 SLE-연관 자가항체 특이성 생체지표 데이터 집합의 존재 여부 또는 그것의 양; 및 LDAII 점수를 계산하는 단계를 포함하고, 그럼으로써 데이터 집합이 로그 전환되고; 표준화되고; 표준화된 데이터 집합에서 자가항체 특이성에 대한 스피어만 r 상관에 의해 가중치를 부여 받고, 상기 용해성 단백질 표지의 총합이 LDAII 점수와 같다. 또 다른 양태에서, 상기 방법이 분류 체계에서 일련의 생체지표 측정치를 사용하여 상기 개체에서 전신 홍반성 낭창(SLE)의 존재 또는 발달과 관련된 시료를 혈청학적(dsDNA 결합 및 낮은 보체) 활성(SA)이거나 혈청학적 휴지기(SQ)인 임상적 활성(CA) 또는 임상적 휴지기(CQ) 질병으로 분류하되, 상기 분류 체계가 피셔의 정확 검정, 맨-휘트니 검정, 크루스칼-왈리스 검정, 던의 다중비교를 포함한 크루스칼-왈리스 검정, 스피어만 순위 상관 또는 이것의 조합물로 이루어진 군에서 선택된 분류 및 회귀 트리를 포함하는 머신 러닝 시스템인 단계; 및 루푸스 질병 활성도 면역 지수(LDAII)를 계산하되, 상기 LDAII 점수가 활성 SLE와 저활성 SLE 질병 활성(저활성 임상적 질병(SLEDAI < 4) 사이에서 구별되는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 방법이 건강한 대조군과 비교하여 임상학적 및 혈청학적 휴지기(CQSQ) SLE 환차를 구별하는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 방법이 최소한 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 또는 39개 생체지표 중 일정 양이 LDAII의 계산에 사용되는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 면역측정법이 다중 면역측정법이다. 또 다른 양태에서, 상기 LDAII가 하기와 같이 추가로 계산되었다: 상기 개체에 대한 농도 생체지표가 결정 및 로그-전환되고, 상기 개체 시료에 대해 결정된 각각의 로그-전환된 용해성 매개체 수치가 하기와 같이 표준화되고: (관측값)-(모든 SLE 환자 및 건강한 대조군 방문자의 평균값)/(모든 SLE 환자 및 건강한 대조군 방문자의 표준 편차); 건강한 대조군(스피어만 r)과 비교하여 상기 SLE 환자에서 평가된 각 용해성 매개체에 대한 하나 이상의 자가항체(AutoAb) 특이성 사이의 연관성을 검증하는 선형 회귀 모델에서 스피어만 상관계수를 생성하고; 상기 개체의 용해성 매개체 수치의 값 및 각각의 스피어만 상관계수(스피어만 r)에 의해 가중치가 부여된(곱셈이 된) 값을 전환 및 표준화하고; 및 각 참여 방문자에 대해 4개 이상의 용해성 매개체 각각에 대한 로그 전환되고, 표준화되어 가중치가 부여된 값을 모두 더해 LDAII를 계산한다. 또 다른 양태에서, LDAII의 증가가 하기 중 최소한 하나를 나타낸다: SLE 질병 진행, 자가면역 질병 활성도의 증가, 또는 장기 손상.
본 발명의 특성 및 장점을 좀 더 온전하게 이해하기 위해, 하기에 설명된 바와 같이, 첨부된 도면과 함께 본 발명의 상세한 설명에 대한 언급이 이루어진다:
도 1a 및 1b는 활성 질병을 앓는 SLE 환자에서 hSLEDAI 증가와 AutoAb 특이성의 수의 증가를 보여준다. (도 1a) 저활성 질병(hSLEDAI < 4; n=132) 및 활성(hSLEDAI ≥ 4; n=179) 질병을 갖는 SLE 환자 방문자에서 혼성 SLEDAI(SLEDAI-2K에 의해 정의된 바와 같이 단백뇨를 갖는 SELENA-SLEDAI); 비결합(unpaired) t-검정에 의한 평균 ± SEM, p<0.0001. (도 1b) 건강한 대조군(대조군; n=48)에 비해, 저활성 또는 활성 질병을 앓는 SLE 환자에서 SLE-연관 AutoAb 특이성(dsDNA, 염색질, Ro/SSA, La/SSB, Sm, SmRNP 및 RNP에 대한 항체)의 개수. 수치가 평균± SEM으로 제시된다. 던의 다중비교를 포함한 크루스칼-왈리스 검정에 의한 ** p<0.01; **** p<0.0001.
도 2a~2i가 SLE 저활성 질병 대 활성 질병 및 대조군에서 변경된 용해성 매개체를 보여준다. 대응하는 대조군(n=48) 대비, 저활성(n=132) 질병 활성도를 가진 SLE 환자에게서 방문 중 획득된 혈장 시료가 활성 질병(n=179)을 갖는 SLE 환자에게서 방문 중 획득된 시료와 비교되었다. 검토된 인자에는 하기가 포함된다: (도 2a) IFN-α, (도 2b) IP-10, (도 2c) IL-6, (도 2d) IL-1α, (도 2e) IL-8, (도 2f) IL-21, (도 2g) BLyS, (도 2h) IL-10 및 (도 2I) 총 TGF-β. 수치가 평균 ± SEM으로 제시된다. 던의 다중비교를 포함한 크루스칼-왈리스 검정에 의한 * p<0.05; ** p<0.01, *** p<0.001, *** p<0.0001.
도 3a~3d가 질병 활성도/AutoAb 양성을 갖는 변경된 IFN-연관 매개체를 보여준다. AutoAb 음성(Neg)/저활성 질병 활성도(Low) 시료(n=56)를 갖는 SLE 환자 방문자가 AutoAb Neg/활성 질병(활성; n=52), AutoAb 양성(Pos)/Low(n=76) 및 AutoAb Pos/활성 시료에 비교되었다. SLE 환자 시료가 또한 대응되는 대조군 시료(n=48)에 비교되었다. 검토된 인자에는 하기가 포함된다: (도 3a) IFN-α, (도 3b) IFN-γ, (도 3c) IP-10 및 (도 3d) MIG. 수치가 평균± SEM으로 제시된다. 던의 다중비교를 포함한 크루스칼-왈리스 검정에 의한 * p<0.05; ** p<0.01, *** p<0.001, *** p<0.0001. 사례(SLE 환자 그룹)가 맨-휘트니 검정에 의해 대조군에 비교되었다.
도 4a~4d가 질병 활성도/AutoAb 양성을 갖는 변형된 TNF 상과 매개체를 보여준다. AutoAb 음성(Neg)/저활성 질병 활성도(Low) 시료(n=56)를 갖는 SLE 환자 방문자가 AutoAb Neg/활성 질병(활성; n=52), AutoAb 양성(Pos)/Low(n=76) 및 AutoAb Pos/활성 시료에 비교되었다. SLE 환자 시료가 또한 대응되는 대조군 시료(n=48)에 비교되었다. 검토된 인자에는 하기가 포함된다: (도 4a) BLyS, (도 4b) APRIL, (도 4c) TRAIL 및 (도 4d) TNFRII. 수치가 평균± SEM으로 제시된다. 던의 다중비교를 포함한 크루스칼-왈리스 검정에 의한 * p<0.05; ** p<0.01, **** p<0.0001. 사례(SLE 환자 그룹)가 맨-휘트니 검정에 의해 대조군에 비교되었다.
도 5a~5d가 질병 활성도/AutoAb 양성을 가진 변경된 본래 및 적응성 매개체를 보여준다. AutoAb 음성(Neg)/저활성 질병 활성도(Low) 시료(n=56)를 가진 SLE 환자 방문자가 AutoAb Neg/활성 질병(활성; n=52), AutoAb 양성(Pos)/Low(n=76) 및 AutoAb Pos/활성 시료에 비교되었다. SLE 환자 시료가 또한 대응되는 대조군 시료(n=48)에 비교되었다. 검토된 인자에는 하기가 포함된다: (도 5a) IL-1a, (도 5b) IL-6, (도 5c) IL-2 및 (도 5d) IL-21. 수치가 평균± SEM으로 제시되고; 던의 다중비교를 포함한 크루스칼-왈리스 검정에 의한 * p<0.05; ** p<0.01, **** p<0.0001. 사례(SLE 환자 그룹)가 맨-휘트니 검정에 의해 대조군에 비교되었다.
도 6a~6d가 질병 활성도/AutoAb 양성을 가진 변경된 염증 및 조절 매개체를 보여준다. AutoAb 음성(Neg)/저활성 질병 활성도(Low) 시료(n=56) SLE 환자 방문자가 AutoAb Neg/활성 질병(활성; n=52), AutoAb 양성(Pos)/Low(n=76) 및 AutoAb Pos/활성 시료에 비교되었다. SLE 환자 시료가 또한 대응되는 대조군 시료(n=48)에 비교되었다. 검토된 인자에는 하기가 포함된다: (도 6a) SCF, (도 6b) IL-8, (도 6c) IL-10 및 (도 6d) 총 TGF-β 수치가 평균± SEM으로 제시된다. 던의 다중비교를 포함한 크루스칼-왈리스 검정에 의한 * p<0.05; ** p<0.01, *** p<0.001, *** p<0.0001. 사례(SLE 환자 그룹)가 맨-휘트니 검정에 의해 대조군에 비교되었다.
도 7a 및 7b는 루푸스 질병 활성도 면역 지수(LDAII)가 대조군 대비 저활성 및 활성 질병을 앓는 SLE 환자를 구별함을 보여준다. (도 7a) 대조군 대비 저활성 또는 활성 질병을 앓는 SLE 환자에 대한 LDAII가 계산되었다. LDAII가 평균 ± SEM으로 표현되었고; 던의 다중비교를 포함한 크루스칼-왈리스 검정에 의한 * p<0.05; ** p<0.01, *** p<0.0001. (도 7b) 대조군과 SLE 환자(저활성 또는 활성 질병)를 구별하기 위한 곡선하면적(AUC)a. 교차비b가 활성 루푸스로 양성 LDAII 점수를 가질 가능성을 기반으로 계산되었고; p-값c, 특이성, 민감도, 음성 예측도(NPV) 및 양성 예측도(PPV)가 피셔의 정확 검정에 의해 계산되었다.
도 8a~8f는 루푸스 질병 활성도 면역 지수(LDAII)가 대조군 대비 임상학적 및 혈청학적 활성 질병 또는 휴지기 질병을 않는 SLE 환자를 구별함을 보여준다.(도 8a)대조군 대비, 임상학적 및 혈청학적 휴지기(CQSQ; n=73) 또는 임상학적 및 혈청학적 활성(CASA; n=115) 질병을 앓는 SLE 환자에 대한 LDAII가 계산되었다. LDAII가 평균 ± SEM으로 표시된다; 던의 다중비교를 포함한 크루스칼-왈리스 검정에 의한 * p<0.05; ** p<0.01, *** p<0.0001. (도 8b)대조군과 SLE 환자(저활성 또는 활성 질병)를 구별하기 위한 곡선하면적(AUC)a. 교차비b가 활성 루푸스의 양성 LDAII 점수를 가질 가능성을 기반으로 계산되었고; p-값c, 특이성, 민감도, 음성 예측도(NPV) 및 양성 예측도(PPV)가 피셔의 정확 검정에 의해 계산되었다. 구별되는 인자들, 예컨대 IL-6(도 8c), IL-8(도 8d) 및 IP-10(도 8e)의 혈장 수치 뿐만 아니라 AutoAb 특이성(도 8f)의 수가 또한 결정되었다. 수치가 평균± SEM으로 제시된다; 던의 다중비교를 포함한 크루스칼-왈리스 검정에 의한 * p<0.05; ** p<0.01, *** p<0.001, **** p<0.0001.
도 9a~9e는 루푸스 질병 활성도 면역 지수(LDAII)가 저활성 질병 활성도와 비교하여 신장 또는 비-신장, 활성 질병을 앓는 SLE 환자를 구별함을 보여준다.(도 9a) 저활성 질병 활성도를 갖는 SLE 환자 방문자(n=132) 대비, 신장(n=24) 또는 비-신장(n=155) 활성 질병을 앓는 SLE 환자 방문자에 대해 LDAII이 계산되었다. LDAII이 평균 ± SEM으로 표시된다; 던의 다중비교를 포함한 크루스칼-왈리스 검정에 의한 * p <0.05; ** p<0.01, *** p<0.0001. (도 9b) 신장 징후가 있는 SLE 환자의 구별을 위한 곡선하면적(AUC)a. 활성 루푸스 및 신장 징후을 갖는 양성 LDAII 점수를 가질 가능성을 기반으로 교차비b가 계산되었다; p-값c, 특이성, 민감도, 음성 예측도(NPV) 및 양성 예측도(PPV)가 피셔의 정확 검정에 의해 계산되었다. 구별되는 인자들, 예컨대 SCF(도 9c), TNFRII(도 9d) 및 AutoAb 특이성의 개수(도 9e)의 혈장 수치 역시 결정되었다. 수치가 평균 ± SEM으로 제시된다; 던의 다중비교를 포함한 크루스칼-왈리스 검정에 의한 * p<0.05; ** p<0.01, *** p<0.001.
본 발명의 다양한 구현예의 실현 및 사용이 하기에서 자세히 논의되는 동안, 본 발명이 넓은 범위의 구체적 문맥에서 구현될 수 있는 여러 적용가능한 발명의 개념을 제공함이 이해되어야 한다. 본원에 논의된 구체적 구현예는 단지 본 발명을 실현하고 사용하기 위한 구체적인 방법을 예시하는 것으로, 본 발명의 범위를 정하지 않는다.
본 발명의 이해를 돕기 위해, 수많은 용어가 하기에 정의된다. 본원에 정의된 용어들은 본 발명과 관련한 당해기술의 숙련가에 의해 일반적으로 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다. "a", "an" 및 "the"와 같은 용어가 단수 개체만을 가리키는 것으로 의도되지 않았고, 묘사를 위해 사용될 수 있는 구체적인 예들의 일반적인 부류를 포함한다. 본원의 용어는 본 발명의 구체적인 구현예를 기술하기 위해 사용되었으나, 그것의 용도가, 청구항에 서술된 경우를 제외하고, 본 발명을 제한하지는 않는다.
본 발명은 오클라호마 루푸스 코호트의 전신 홍반성 낭창(루푸스)(SLE) 환자에게서 연속으로 수집한 혈장 시료를 활용하여 수치를 비교하고 대응되는 건강한 대조군과 비교하여 저활성 또는 활성 질병을 앓는 SLE 환자에서 다중 면역 경로에서 유래된 자가항체 및 면역 매개체 사이의 시간적 관계를 결정하였다. 본 발명은 임상적 질병 활성도에 관한 것으로 면역발병기전의 잠재적 기전을 밝히고, 그것으로 인해 면역 매개체의 조절장애가 자가항체 축적과 함께 또는 그것과는 독립적으로 발생함을 밝힌다. 더 나아가, 본 발명은 임상적 질병 활성도에 관한 것으로 루푸스 환자의 면역을 평가하기에 신뢰할 만하고 민감한 도구의 설계 및 검증을 포함한다. 본 발명은 류마티스학 소개 및 유망한 임상전 개입 연구에 등록을 필요로 하는 고위험 환자를 식별하고, 뿐만 아니라 조직 손상을 방지 또는 지연하기 위한 신규한 치료 전략의 발달을 고지하기 위해 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "데이터 집합"은 바람직한 조건 하에서 시료(또는 시료의 군집)의 평가에서 생성된 수치 값의 집합을 가리킨다. 데이터 집합의 값은, 예를 들어 시료, 예컨대 환자 시료에서 실험적으로 측정치를 획득하고, 이러한 측정치에서 데이터 집합을 수립함으로써 획득될 수 있다. 대안적으로, 데이터 집합은 데이터 집합이 저장된 바 있는 데이터베이스 또는 서버, 또는 심지어 서비스 제공자, 예컨대 내부 또는 제3자 실험실에서 획득될 수 있다.
본 발명의 문맥에서 본원에 사용된 용어 "질병"은 예컨대 예를 들어, SLE를 유발하는 기능부전의 또는 부정확하게 기능하는 면역 체계에서 징후로 나타나는 임의의 장애, 질환, 아픔 또는 가벼운 질병을 가리킨다.
본원에 사용된 용어 "시료"는 개체에서 단리된 임의의 생물학적 시료를 가르키는데, 여기에는, 비제한적으로, 단일 세포 또는 다중 세포, 세포의 파편, 체액의 부분표본(aliquot), 전혈, 혈소판, 혈청, 혈장, 적혈구, 백혈구, 내피 세포, 조직 생검, 활액, 림프액, 복수 및 간질액 또는 세포외액이 포함될 수 있다. 용어 "시료"는 또한 세포 사이의 공간의 액체, 예컨대 치은구액, 골수, 뇌척수액, 타액, 점액, 가래, 정액, 땀, 소변 또는 임의의 기타 체액을 아우른다.
본원에 사용된 용어 "혈액 시료"는 전혈 또는 그것의 임의의 부분, 예컨대 혈액 세포, 적혈구, 백혈구 또는 류코사이트, 혈소판, 혈청 및 혈장을 가리킨다. 시료는 예컨대 비제한적으로, 정맥천자, 분비, 사정, 마사지, 생검, 침 흡입술, 위 세척, 긁어내기, 외과적 절개, 또는 개입 또는 당해기술에 알려진 기타 방법에 의해 개체에서 획득될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "개체" 또는 "환자"는 일반적으로 포유류를 가리키는데, 여기에는 비제한적으로, 성별이나 연령과 관계 없이, 인간, 비인간 유인원, 개, 고양이, 생쥐, 래트, 소, 말 및 돼지가 포함된다. 개체는 자가면역 및/또는 염증성 질병을 가진 것으로 사전에 진단받은 바 있거나 또는 식별된 바 있고, 상기 자가면역 및/또는 염증성 질병에 대한 치료차원의 개입을 이미 받은 바 있거나 또는 받고 있는 중인 것일 수 있다. 하지만 개체는 또한 자가면역 및/또는 염증성 질병을 가진 것으로 사전에 진단되지 않은 환자, 예를 들면 자가면역 및/또는 염증성 질병에 대해 하나 이상의 증상 또는 위험 인자를 보이는 개체, 또는 자가면역 및/또는 염증성 질병에 대한 증상 또는 위험 인자를 보이지 않는 개체, 또는 자가면역 및/또는 염증성 질병에 대해 무증상을 보이는 개체를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 어구 "혈청 또는 혈장 매개체 생체지표(들)"은 하기 생체지표들 중 하나 이상을 가리킨다: IL-1α, IL-1β, IL-1RA, IFN-α, IL-15, IL-12p70, IL-6 및 IL-23p19. 이와 같은 생체지표는 RNA 또는 단백질 수치에서 측정될 수 있고, 시료, 예를 들어, 포유류, 예를 들면, 인간 환자에게서 얻은 혈액, 혈청, 혈장 및/또는 소변 시료에서 획득될 수 있다. 본원에 사용된 모든 생체지표의 축약형은 당해기술의 숙련가에게 잘 알려져 있어서, 예를 들어, IL-1은 인터루킨-1이다. 상기 축약형은 예를 들어, www.genecards.org에 있는 단백질에 대응될 수 있다.
본원에 사용된 어구 "적응성 혈청 또는 혈장 매개체 생체지표(들)"은 하기 생체지표 중 하나 이상을 가리킨다: IL-2, IFN-γ, IL-4, IL-5, IL-13, IL-17A, IL-21, IL-10 및 TGF-β. 이와 같은 생체지표는 RNA 또는 단백질 수치에서 측정될 수 있고, 시료, 예를 들어, 포유류, 예를 들면, 인간 환자에게서 얻은 혈액, 혈청, 혈장 및/또는 소변 시료에서 획득될 수 있다.
본원에 사용된 어구 "케모카인 생체지표(들)"은 하기 생체지표 중 하나 이상을 가리킨다: IL-8/CXCL8, IP-10/CXCL10, MIG/CXCL9, MIP-1α/CCL3, MIP-1β/CCL4, MCP-1/CCL2 및 MCP-3/CCL7. 이와 같은 생체지표는 시료, 예를 들어, 포유류, 예를 들면, 인간 환자에게서 얻은 혈액, 혈청, 혈장 및/또는 소변 시료에서 측정될 수 있다.
본원에 사용된 어구 "용해성 TNF 상과 생체지표(들)"은 하기의 생체지표 중 하나 이상을 가리킨다: TNF-α, TNFRI, TNFRII, Fas, CD40L/CD154, BlyS 및 APRIL 또는 종양 괴사 인자 리간드 상과 구성원 13(TNFSF13). 이와 같은 생체지표는 RNA 또는 단백질 수치에서 측정되고, 시료, 예를 들어, 포유류, 예를 들면, 인간 환자에게서 얻은 혈액, 혈청, 혈장 및/또는 소변 시료에서 획득될 수 있다.
본원에 사용된 어구 "염증성 매개체 생체지표(들)"은 하기 생체지표 중 하나 이상을 가리킨다: 줄기세포 인자(SCF), 플라스미노겐 활성화인자 억제제 1(PAI-1) 및 레시스틴. 이와 같은 생체지표는 RNA 또는 단백질 수치에서 측정될 수 있고, 시료, 예를 들어, 포유류, 예를 들면, 인간 환자에게서 얻은 혈액, 혈청, 혈장 및/또는 소변 시료에서 획득될 수 있다.
본원에 사용된 어구 "SLE-연관 자가항체 특이성 생체지표(들)"은 하기 표적에 대항하는 자가항체인 하기 생체지표의 하나 이상을 가리킨다: dsDNA, 염색질, RiboP, Ro/SSA, La/SSB, Sm, SmRNP 및 RNP로, 이들 모두는 SLE 기술의 숙련가에게 잘 알려져 있다. 이와 같은 생체지표는 RNA 또는 단백질 수치에서 측정될 수 있고, 시료, 예를 들어, 포유류, 예를 들면, 인간 환자에게서 얻은 혈액, 혈청, 혈장 및/또는 소변 시료에서 획득될 수 있다.
본원에 사용된 "건강한 대조군"은 SLE의 임상적 증거가 없어 SLE 환자가 아닌 건강한 대조군을 가리킨다.
본 발명은 SLEDAI-2K에 의해 정의된 바와 같이,혼성-SLEDAI(hSLEDAI)으로 알려진, 단백뇨를 가진, 루푸스 국립 평가에서의 에스트로겐 안전성-전신 홍반성 낭창 질병 활성도 지수(SELENA-SLEDAI)에 의해 정의된 임상적 질병 활성도와 연관된 SLE 환자의 치료를 식별하고 변경하는 방법을 포함한다. SLE의 임상적 징후가 그것이 발생한 후 hSLEDAI에서의 질병 활성도에 기여하기 때문에, 본 발명은 상기 개체가 SLE 환자를 영구적 장기 손상 및 조기 사망률의 위험에 처하게 하는 질병 활성도에 기여할 수 있는 생체지표를 보이고 있는지 여부를 결정하기 위해 사용된다.
SLE 분류에 대한 ACR 기준에 따라, 환자가 질병 분류(진단), 예컨대: 협부발진, 원반형 발진, 광민감도, 구강 궤양, 관절염, 장막염(능막염 또는 심막염), 신장 장애(단백뇨 또는 세포 원주), 신경학적 장애(발작 또는 정신병), 혈액학적 장애(울혈성 빈혈, 백혈구 감소증, 림프구 감소증 또는 혈소판 감소증), 면역학적 장애(항-DNA, 항-Sm, 또는 항-포스포리피드 항체) 및 양성 ANA(HEp-2 IIF 분석)에 도달하기 위해서는 SLE에 대한 최소한 4개의 ACR 기준에 부합해야 한다.당해기술의 숙련가에게 알려진 기타 기준 역시 사용될 수 있는데, 예를 들어, SLE의 분류를 위한 전신 루푸스 국제 협력 클리닉(SLICC) 규칙을 사용하여, 상기 환자가 최소한 4개의 기준, 예컨대 최소한 하나의 임상적 기준 및 하나의 면역학적 기준을 충족시키거나, 또는 상기 환자가 항핵 항체 또는 항-이중 가닥 DNA 항체의 존재 하에 생검에 의해 입증된 루푸스 신장염을 앓고 있어야 한다.
생체지표 검출. 단백질 발현을 평가하기 위해 사용될 수 있는 다양한 방법들이 있다. 그와 같은 한 접근법은 항체의 사용으로 단백질 식별을 사용하는 것이다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 넓게는 임의의 면역학적 결합 제제, 예컨대 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE 항체, 또는 이들의 아분류, 또는 그것의 결합 파편, 예컨대 단일사슬 파편을 가리킨다. 일반적으로, IgG 및/또는 IgM이 생리학적인 상황에서 가장 일반적인 항체이기 때문에 그리고 실험실의 환경에서 일반적으로 쉽게 만들어지기 때문에 이들이 사용된다. 본원에 사용된 용어 "항체 파편"은 항원-결합 구역을 갖는 임의의 항체-유사 분자를 가리키고, 항체 파편, 예컨대 Fab', Fab, F(ab')2, 단일 도메인 항체(DAB), Fv, scFv(단일 사슬 Fv) 등을 포함한다. 다양한 항체-기반 구성체 및 파편을 제조하고 사용하는 기법이 당해기술에 잘 알려져 있다. 항체, 즉, 다중클론 및 단클론 모두를 제조하고 특징을 규명하는 수단 또한 당해기술에 잘 알려져 있다. (예를 들어, Antibodies: Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 참조; 관련 부분이 본원에 참조로 편입됨).
본 발명에 따르면, 면역검출 방법의 예들이 제공된다. 일부 면역검출에는 효소-결합 면역흡수 분석법(ELISA), 방사선면역측정법(RIA), 면역방사계측 분석, 플루오로면역측정법, 화학발광 분석법, 생체발광 분석법 및 웨스턴 블롯 등이 포함된다. 여러 유용한 면역검출 방법의 단계들이 과학 문헌인 Current Protocols in Immunology, Wiley & Sons Press, 2017에 기술된 바 있고, 관련 부분은 본원에 참조로 편입되었다.
일반적으로, 면역결합 방법은 관련 폴리펩타이드를 함유하는 것으로 의심되는 시료를 획득하는 단계와 면역복합체의 형성을 허용하기에 효과적인 조건 하에서 상기 시료를 제1 항체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 항원 검출과 관련하여, 분석되는 생물학적 시료가 항원, 예컨대, 예를 들면 조직 단면 또는 표본, 균질화된 조직 추출물, 심지어 생물학적 유체를 함유하는 것으로 의심되는 임의의 시료일 수 있다.
효과적인 조건 하에서 면역복합체(1차 면역 복합체)의 형성을 허용하기에 충분한 시간 동안, 상기의 선택된 시료를 항체와 접촉시키는 단계는 일반적으로 단순히 상기 항체 조성물을 상기 시료에 첨가하고, 상기 항체가 존재하는 임의 항원과 면역복합체를 형성, 즉, 임의의 항원에 결합되기에 충분히 긴 시간 동안 상기 혼합물을 배양하는 문제이다. 이 시간 후, 시료-항체 조성물, 예컨대 조직 단면, ELISA 플레이트, 점 블롯 또는 웨스턴 블롯이 일반적으로 세정되어 임의의 비특이적으로 결합된 항체 종이 제거되고, 이로써 상기 1차 면역복합체 내에서 특이적으로 결합된 항체들만이 검출될 수 있다.
일반적으로, 면역복합체 형성의 검출은 당해기술에 잘 알려져 있으며, 수많은 접근법의 응용을 통해 달성될 수 있다. 이와 같은 방법은 일반적으로 라벨 또는 표지, 예컨대 방사선활성, 형광, 생물학적 및 효소적 태그 중 임의의 것의 검출을 기반으로 한다. 그와 같은 라벨의 용도와 관련된 특허에는 미국 특허 제3,817,837호; 제3,850,752호; 제3,939,350호; 제3,996,345호; 제4,277,437호; 제4,275,149호 및 제4,366,241호가 포함되고, 각각은 본원에 참조로 편입되었다. 물론, 누군가는 당해기술에 알려진 대로, 2차 결합 리간드, 예컨대 제2 항체 및/또는 비오틴/아비딘 리간드 결합 배열의 사용을 통해 추가적인 이점을 찾을 수 있을지도 모른다.
항체, 또는 그것의 결합 파편이 검출에 활용될 수 있고, 그 자체가 검출가능한 라벨에 연결될 수도 있는데, 누군가가 그러고 나서 단순히 상기 라벨을 검출함으로써, 상기 조성물 중 1차 면역복합체의 양이 결정될 수 있다. 대안적으로, 상기 1차 면역복합체 내에서 결합된 제1 항체가 상기 항체에 대한 결합 친화도를 갖는 제2 결합 리간드에 의해 검출될 수도 있다. 이와 같은 경우에, 제2 결합 리간드가 검출가능한 라벨에 연결될 수도 있다. 제2 결합 리간드는 종종 그 자체로 항체이기 때문에, 그것이 "2차" 항체라 불릴 수도 있다. 효과적인 조건 하에서 2차 면역복합체의 형성을 허용하기에 충분한 시간 동안, 1차 면역복합체가 표지된 2차 결합 리간드 또는 항체와 접촉된다. 이어서, 2차 면역복합체가 일반적으로 세척되어 임의의 비특이적으로 결합된 라벨이 붙은 2차 항체 또는 리간드가 제거되고, 그 후 2차 면역복합체에 남은 라벨이 검출된다.
추가적인 방법은 2단계 방법에 의한 1차 면역복합체의 검출을 포함한다. 상기 항체에 결합 친화도를 갖는 제2 결합 리간드, 예컨대 항체가 앞서 기술된 바와 같이 2차 면역복합체를 형성하는 데 사용된다. 세정 후, 다시 효과적인 조건 하에서 면역복합체(3차 면역복합체)의 형성을 허용하기에 충분한 시간 동안 2차 면역복합체가 제2 항체에 결합 친화도를 갖는 제3 결합 리간드 또는 항체와 접촉된다. 제3 리간드 또는 항체가 검출가능한 라벨에 연결되어, 그렇게 형성된 3차 면역복합체의 검출을 가능하게 한다. 이와 같은 체계가, 원한다면, 신호 증폭을 가능하게 할 수 있다.
면역검출의 한 방법은 두 가지 상이한 항체를 사용한다. 1단계 비오틴화, 단클론 또는 다중클론 항체가 표적 항원(들)을 검출하는 데 사용되고, 2단계 항체가 이어서 복합체가 된 비오틴에 부착된 비오틴을 검출하는 데 사용된다. 이와 같은 방법에서, 검정대상 시료는 1단계 항체를 함유한 용액에서 우선 배양된다. 만약 표적 항원이 존재한다면, 항체 중 일부가 상기 항원에 결합되어 비오틴화 항체/항원 복합체를 형성한다. 상기 항체/항원 복합체가 이어서 일련의 스트렙타비딘(또는 아비딘), 비오틴화 DNA, 및/또는 상호보완적 비오틴화 DNA 용액에서의 배양에 의해 증폭되는데, 각 단계에서 추가적인 비오틴 자리를 상기 항체/항원 복합체에 첨가한다. 상기 시료가 비오틴 대신 제2 단계 항체를 함유한 용액에서 배양되는 시점인 적합한 수준의 증폭이 달성될 때까지, 상기 증폭 단계가 반복된다. 이와 같은 2단계 항체는, 예를 들면 색소원 기질을 사용하는 효소염색학(histoenzymology)에 의해 항체/항원 복합체의 존재여부를 검출하는 데 사용될 수 있는 효소로 표지된다. 적합한 증폭으로, 육안으로 보이는 컨쥬게이트가 생성될 수 있다.
또 다른 알려진 면역검출법은 면역-PCR(폴리머라아제 연쇄반응) 방법을 이용한다. PCR법은 비오틴화 DNA로의 배양까지는 Cantor 법과 유사하지만, 여러 차례의 스트렙타비딘 및 비오틴화 DNA 배양을 사용하는 대신, 상기 DNA/비오틴/스트렙타비딘/항체 복합체가 상기 항체를 방출시키는 낮은 pH 또는 고염 완충용액으로 세정된다. 이어서, 생성된 세정 용액이 적절한 통제로 적합한 프라이머로 PCR 반응을 수행하는 데 사용된다. 최소한 이론적으로는, PCR의 큰 증폭능력 및 특이성이 단일 항원 분자를 검출하는 데 활용될 수 있다.
앞서 상세히 기술된 바와 같이, 면역측정법은 핵심적으로 결합 분석이다. 어떤 면역측정법은 당해기술의 알려진 다양한 유형의 ELISA 및 RIA이다. 하지만, 검출이 그와 같은 기법에 국한되지 않으며, 웨스턴 블롯팅, 점 블롯팅, FACS 분석 등이 역시 사용될 수 있음이 쉽게 이해될 것이다.
ELISA의 일 예로, 본 발명의 항체가 단백질 친화도를 보이는 선택된 표면, 예컨대 폴리스타이렌 마이크로티터 플레이트의 웰 상에 고정된다. 그러고 나서, 항원, 예컨대 임상적 시료를 함유한다고 의심되는 검사 조성물이 상기 웰에 첨가된다. 결합과 비특이적으로 결합된 면역복합체를 제거하기 위한 세정 후, 상기 결합된 항원이 검출될 수 있다. 검출은 일반적으로 검출가능한 라벨에 연결된 또 다른 항체의 첨가에 의해 달성된다. 이와 같은 유형의 ELISA는 단순 "샌드위치 ELISA"이다. 검출은 또한 제2 항체의 첨가와 그 후 상기 제2 항체에 결합 친화도를 갖는 제3 항체의 첨가에 의해 달성될 수 있는데, 상기 제3 항체는 검출가능한 라벨에 연결된다.
또 다른 ELISA의 예시에서, 항원을 함유하는 것으로 의심되는 시료가 웰 표면에 고정되고, 이어서 본 발명의 항-ORF 메시지 및 항-ORF 번역된 생성물 항체와 접촉된다. 결합 및, 비특이적으로 결합된 면역복합체를 제거하기 위한 세정 후, 상기 결합된 항-ORF 메시지와 항-ORF 번역된 생성물 항체가 검출된다. 최초 항-ORF 메시지와 항-ORF 번역된 생성물 항체가 검출가능한 라벨에 연결되면, 상기 면역복합체가 직접적으로 검출될 수 있다. 다시, 상기 면역복합체는 상기 제1 항-ORF 메시지와 항-ORF 번역된 생성물 항체에 결합 친화도를 갖는 제2 항체를 사용하여 검출될 수 있는데, 제2 항체는 검출가능한 라벨에 연결된다.
항원이 고정되는 또 다른 유형의 ELISA는 검출에서 항체 경쟁의 사용을 수반한다. 이와 같은 ELISA에서, 항원에 대항하는 라벨이 붙은 항체가 웰에 첨가되어 결합이 허용되고, 그들의 라벨에 의해 검출된다. 그러고 나서, 코팅된 웰로 배양하면서 미지의 시료를 항원에 대항하는 라벨이 붙은 항체와 혼합함으로써, 상기 시료 중 항원의 양이 결정된다. 상기 시료 중 항원의 존재가 상기 웰에 결합을 위해 활용가능한 항원에 대항하는 항체의 양을 줄이는 데 역할을 하고, 따라서 궁극의 신호를 감소시킨다. 이것은 또한 상기 라벨이 붙지 않은 항체가 항원-코팅된 웰에 결합될 경우, 미지의 시료 중 항원에 대한 항체를 검출하기에 적합하고, 또한 이것은 상기 라벨이 붙은 항체와 결합하는 데 활용가능한 항원의 양을 감소시킨다.
본원에 사용된 어구 "면역복합체(항원/항체) 형성을 허용하는 데 효과적인 조건 하에서"는 항원 및/또는 항체를 용액, 예컨대 BSA, 소 감마 글로불린(BGG) 또는 인산염 완충식염수(PBS)/트윈을 희석하는 단계를 또한 포함할 수 있는데, 항체 또는 그것의 결합 파편이 상기 항체의 특이적 표적인 항원과 상호작용하는 조건을 가리킨다. 이와 같이 첨가된 제제는 또한 비특이적 배경의 감소에 일조하는 경향이 있다. "적합한" 조건이란 효과적인 결합을 허용하기에 충분한 온도에서 그리고 충분한 시간 동안 배양이 이루어지는 것이다. 배양 단계는 전형적으로 약 1 내지 2 내지 4시간쯤 동안 바람직하게는 25℃ 내지 27℃의 온도에서 이루어지고, 또는 약 4℃쯤에서 밤새 이루어질 수 있다.
생체지표 발현을 평가하는 또 다른 항체-기반 접근법은 형광-활성화 세포 선별법(FACS), 특수화된 유동세포 분석법이다. 이것은 생물학적 세포들의 이질적 혼합물을, 한 번에 세포 1개씩, 각 세포의 특이적 광산란 및 형광 특징을 기반으로, 2개 이상의 용기에 선별하는 방법을 제공한다. 이것이 개별 세포에서 형광 신호의 빠르고, 객관적이며 정량적인 기록을 제공할 뿐만 아니라 특별히 관심대상인 세포의 물리적 분리를 제공한다. 세포 현탁액이 액체의 좁고 빠르게 흐르는 스트림의 중심부로 흡수된다. 이와 같은 흐름은 세포들이 그들의 직경에 따라 크게 분리되도록 처리된다. 진동 메커니즘으로 인해 세포 스트림이 개별 방울로 진입된다. 상기 시스템은 방울 당 둘 이상의 세포가 진입되는 확률이 낮도록 조절된다. 상기 스트림이 방울로 진입되기 직전에, 상기 흐름이 각 세포의 관심대상인 형광 특성이 측정되는 형광 측정소를 통과한다. 상기 스트림이 방울로 진입하는 자리에 전기충전 고리가 놓인다. 바로 이전의 형광강도 측정을 기반으로 전하가 배치되고, 반대 전하가 스트림에서 탈출함으로써 작은 방울에 갇힌다. 전하를 띤 방울이 이어서 그것의 전하를 기반으로, 방울들을 용기로 방향을 바꿔주는 정전 편향 시스템을 통해, 추락한다. 일부 시스템에서, 상기 전하는 스트림에 직접적으로 적용되고, 방울 분리로 인해 스트림과 동일한 부호의 전하가 유지된다. 그러고 나서, 방울이 분리된 후 상기 스트림이 중성으로 되돌려진다. FACS를 사용하는 일반적인 방식은 세포 상에서 또는 내부에서 표적에 결합됨으로써, 소정의 표적을 갖는 세포를 식별하는 형광 라벨이 붙은 항체를 이용하는 것이다. 이와 같은 기법은 형광 활성도의 양이 표적의 양과 상관관계가 있어서, 형광의 상대적 양을, 그리고 그럼으로써 상기 표적의 상대적 양을 기반으로 분류할 수 있게 하는 경우, 정량적으로 사용될 수 있다.
비드-기반의 xMAP 기술이 또한 현재 청구된 발명과 함께 면역학적 검출에 적용될 수 있다. 이와 같은 기술은 발달된 유체, 광학 및 디지털 신호 가공을 전용 미세구체 기법과 조합하여 다중 분석 능력을 실현시킨다. xMAP 기술은 가요성있는 개방된 구조 설계를 특징으로 하므로, 다양한 생체분석을 빠르게, 비용을 절감하며, 정확하게 수행하도록 구성될 수 있다.
형광으로 코딩된 미소구체가 최대 500개의 구별되는 세트에 배열된다. 각 비드 세트는 특정 생체분석에 특이적인 시약(예를 들어, 항체)로 코팅되어, 시료에서 특이적 분석물, 예컨대 본 출원의 생체지표의 포획 및 검출을 가능하게 한다. xMAP 멀티플렉스 분석기 내에서, 광원이 각 미소구체를 식별하는 내부 염료와, 또한 상기 분석 중에 포획된 임의의 리포터 염료를 여기시킨다. 각 비드 세트에서 여러 판독이 이루어지고, 이것이 결과를 검증한다. 이와 같은 과정을 사용하면, xMAP 기술이 단일 시료 내에서, 빠르고 정밀하게, 최대 500개의 고유한 생체분석을 다중화(multiplexing)할 수 있다. 상이한 크기 및 색 강도의 조합을 사용하여 개별 미소구체를 식별하는 기타 흐름세포측정 미소구체-기반 분석과 달리, xMAP 기술은 전용 염색 과정을 통해 적색 및 적외선 형광단에 의해 내부적으로 염색된 5.6 마이크론 크기의 미소구체를 사용하여 각각의 개별 미소구체를 식별하는 데 사용되는 500개의 고유한 염료 혼합물을 형성한다.
xMAP의 장점 중 일부에는 다중화(비용과 노동력을 감소), 더 적은 시료 및 더 낮은 비용으로 더 많은 데이터의 생성, 고체 평면형 어레이보다 더 빠르고 더 재현가능한 결과 및 1~500개 분석물의 집중된 및 유연한 다중화가 포함되어, 다양한 응용을 충족시킨다.
핵산 검출. 단백질 발현을 검출하기 위한 기타 구현예에서, 유전자 전사를 위한 분석을 수행할 수 있다. 예를 들어, 단백질 발현을 검출하는 간접적인 방법은 상기 단백질이 만들어지는 mRNA 전사체를 검출하는 것이다.
핵산의 증폭. 여러 mRNA가 비교적 적게 존재하기 때문에, 핵산 증폭이 발현 평가 능력을 상당히 향상시킨다. 일반적 개념은 관심대상 구역 옆에 쌍을 이룬 프라이머를 사용하여 핵산이 증폭될 수 있다는 것이다. 본원에 사용된 용어 "프라이머"는 템플레이트-의존 과정에서 발생기 핵산의 합성을 준비시킬 수 있는 임의의 핵산을 가리킨다. 전형적으로, 프라이머는 10개 내지 20개 및/또는 30개 염기쌍의 길이를 갖는 올리고뉴클레오타이드이지만, 더 긴 서열이 활용될 수 있다. 프라이머가 이중 가닥 및/또는 단일-가닥 형태로 제공될 수 있으나, 단일 가닥 형태가 종종 사용된다.
선택된 유전자에 상응하는 핵산에 선택적으로 혼성화되도록 설계된 프라이머 쌍이 선택적 혼성화를 허용하는 조건 하에서 템플레이트 핵산과 접촉된다. 원하는 적용에 따라서, 상기 프라이머에 완전히 상호보완적인 서열로의 혼성화만을 허용하는 상당히 엄격한 혼성화 조건이 선택될 수 있다. 기타 구현예에서, 프라이머 서열과 하나 이상의 불일치를 함유한 핵산의 증폭을 허용하는 덜 엄격한 조건 하에서 혼성화가 발생할 수도 있다. 일단 혼성이 되면, 상기 템플레이트-프라이머 복합체가 템플레이트-의존 핵산 합성을 촉진하는 하나 이상의 효소와 접촉된다. "주기"라고도 물리는 수차례의 증폭이 충분한 양의 증폭 생성물이 생성될 때까지 수행된다.
상기 증폭 생성물이 검출되거나 또는 정량화될 수 있다. 어떤 응용에서는, 상기 검출이 시각적 방법에 의해 수행될 수 있다. 대안적으로, 상기 검출은 화학발광, 편입된 방사선라벨 또는 형광 라벨의 방사선활성 신티그램촬영을 통한, 또는 심지어 전기 및/또는 열 충격 신호를 사용하는 시스템을 통한 상기 생성물의 간접적 식별을 수반할 수 있다.
수많은 템플레이트-의존 과정은 주어진 템플레이트 시료에 존재하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 증폭하는데 활용가능하다. 잘 알려진 증폭 방법 중 하나가 본원에 참조로 전체가 편입된 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호에 상세히 기술된 폴리머라아제 연쇄반응(PCR)이다.
역위 전사효소-PCR 증폭 절차가 수행되어 증폭된 mRNA의 양을 정량화할 수 있다. RNA를 cDNA로 역위전사하는 방법이 잘 알려져 있다(Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2001 참조). 역위 전사를 위한 대안적 방법은 열안정성 DNA 폴리머라아제를 활용한다. 이와 같은 방법이 WO 90/07641에 기술되어 있다. 폴리머라아제 연쇄반응 방법이 당해기술에 잘 알려져 있다. RT-PCR의 대표적인 방법이 미국 특허 제5,882,864호에 기술되어 있다. 표준 PCR는 일반적으로 한 쌍의 프라이머를 사용하여 특정 서열을 증폭시키는 한편, 다중-PCR(MPCR)은 다중쌍의 프라이머를 사용하여 여러 서열을 동시에 증폭시킨다. 단일 시험관에 여러 PCR 프라이머의 존재가 여러 문제, 예컨대 잘못 준비된 PCR 생성물의 형성의 증가와 "다이머" Taq 폴리머라아제 첨가제를 유발할 수 있는데, 이것이 앰플리콘 사이의 경쟁을 감소시키고, MPCR 동안 더 긴 DNA 파편의 증폭 차별을 감소시킨다. MPCR 생성물이 검증을 위한 유전자-특이적 프로브와 추가로 혼성될 수 있다. 이론적으로, 필요한 만큼 수많은 프라이머를 사용할 수 있어야 한다. 하지만, MPCR 중 유발된 부작용(프라이머 다이머, 잘못 준비된 PCR 생성물 등) 때문에, MPCR 반응에 사용될 수 있는 프라이머의 수에 제한(20 미만)이 있다. 유럽 출원 제 0 364 255호를 참조할 수 있고, 관련 부분이 본원에 참조로 편입되었다.
증폭을 위한 또 다른 방법이, 전체가 본원에 참조로 편입된 유럽특허출원 제320 308호에 개시된 리가아제 연쇄반응("LCR")이다. 미국 특허 제4,883,750호가 표적 서열에 대한 결합 프로브 쌍을 위한 LCR과 유사한 방법을 기술한다.미국 특허 제5,912,148호에 개시된 PCR과 올리고뉴클레오타이드 리가아제 분석(OLA)을 기반으로 한 방법이 또한 사용될 수 있다. 본 발명의 실행에 사용될 수 있는 표적 핵산 서열의 증폭을 위한 대안적 방법이 미국 특허 제5,843,650호, 제5,846,709호, 제5,846,783호, 제5,849,546호, 제5,849,497호, 제5,849,547호, 제5,858,652호, 5,866,366, 5,916,776, 5,922,574, 5,928,905, 5,928,906, 5,932,451, 5,935,825, 5,939,291 및 제5,942,391호, GB 특허출원 제2 202 328호 및 PCT 출원 제PCT/US89/01025호에 개시되어 있고, 이것에서 각각의 관련 부분은 본원에 참조로 편입되었다.
핵산의 검출. 임의의 증폭 이후, 템플레이트 및/또는 과잉 프라이머에서 증폭 생성물을 분리하는 것이 바람직할 수 있다. 일 구현예에서, 증폭 생성물은 표준 방법을 사용하여 아가로오스, 아가로오스-아크릴아마이드 또는 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에 의해 분리된다(Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2001). 분리된 증폭 생성물이 추가적인 조작을 위해 상기 겔에서 잘라지거나 또는 용출될 수도 있다. 녹는점이 낮은 아가로오스 겔을 사용하여, 겔을 가열하고, 이어서 핵산을 추출함으로써 분리된 띠가 제거될 수 있다. 핵산의 분리 역시 당해기술에 알려진 색층분석(chromatographic) 기법에 의해 유발될 수도 있다. 본 발명의 실행에 사용될 수 있는 여러 종류의 색층분석, 예컨대 흡착, 분할, 이온교환, 수산화인회석, 분자체, 역상, 컬럼, 종이, 박막 및 HPLC를 비롯한 기체 색층분석이 존재한다.
특정 구현예에서, 증폭 생성물이 시각화된다. 전형적인 시각화 방법은 브롬화 에티듐으로 겔 염색과 UV 광선 아래서 띠의 시각화를 수반한다. 대안적으로, 증폭 생성물이 방사선 라벨 또는 플루오로측정 라벨이 붙은 뉴클레오타이드로 통합적으로 라벨이 붙어, 상기 분리된 증폭 생성물이 x선 촬영에 노출되거나 또는 적절한 여기스펙트럼 하에서 시각화될 수 있다.
일 구현예에서, 증폭 생성물의 분리 후, 라벨이 붙은 핵산 프로브가 증폭된 표지 서열과 접촉하게 된다. 프로브는 바람직하게는 발색단에 컨쥬게이트되지만, 방사선라벨이 붙을 수도 있다. 또 다른 구현예에서, 프로브가 결합 파트너, 예컨대 항체 또는 비오틴, 또는 검출가능한 모이어티를 운반하는 또 다른 결합 파트너에 컨쥬게이트된다.
특정 구현예에서, 검출이 서던 블롯팅과 라벨이 붙은 프로브와의 혼성화에 의해 이루어진다. 서던 블롯팅에 수반되는 기법이 당해기술의 숙련가에게 잘 알려져 있다(Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2001 참조). 앞서 언급된 것의 일 예가 본원에 참조로 편입된 미국 특허 제5,279,721호에 기술되었는데, 이것은 자동화된 전기영동 및 핵산의 이동을 위한 장치 및 방법을 개시한다. 상기의 장치는 겔의 외부 조작 없이 전기영동 및 블롯팅을 가능하게 하고, 본 발명에 따른 방법들을 수행하는 데 이상적으로 적합하다.
본 발명의 실행에 사용될 수 있는 기타 핵산 검출 방법이 미국 특허 제5,840,873호, 제5,843,640호, 제5,843,651호, 제5,846,708호, 제5,846,717호, 제5,846,726호, 제5,846,729호, 제5,849,487호, 제5,853,990호, 제5,853,992호, 제5,853,993호, 제5,856,092호, 제5,861,244호, 제5,863,732호, 제5,863,753호, 제5,866,331호, 제5,905,024호, 제5,910,407호, 제5,912,124호, 제5,912,145호, 제5,919,630호, 제5,925,517호, 제5,928,862호, 제5,928,869호, 제5,929,227호, 제5,932,413호 및 제5,935,791에 개시되었고, 이들 각자가 본원에 참조로 편입되었다.
핵산 어레이. 마이크로어레이는, 실질적으로 평면형 기재, 예를 들어, 바이오칩의 표면에 공간적으로 분산되고 안정적으로 연관된 다수의 중합체 분자를 포함한다. 폴리뉴클레오타이드의 마이크로어레이가 개발된 바 있고, 다양한 응용분야, 예컨대 선별검사 및 DNA 시퀀싱에 효용이 있다. 특히 마이크로어레이가 효용이 있는 하나의 분야는 유전자 발현 분석이다.
마이크로어레이로 유전자 발현 분석 시, 일련의 "프로브" 올리고뉴클레오타이드가 관심대상 핵산 시료, 즉, 표적, 예컨대 특정 조직유형에서 유래된 polyA mRNA와 접촉된다. 접촉은 혼성화 조건 하에서 수행되고, 결합되지 않은 핵산은 제거된다. 혼성된 핵산의 결과적인 패턴이 시험대상 시료의 유전적 프로파일과 관련된 정보를 제공한다. 마이크로어레이 상에서 유전자 발현 분석의 방법들이 정성적 및 정량적 정보 모두를 제공할 수 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 다양한 종류의 상이한 어레이가 당해기술에 알려져 있다. 표적 핵산과의 특이적 혼성화를 시퀀싱할 수 있는 어레이의 프로브 분자들은 폴리뉴클레오타이드 또는 혼성화 유사체 또는 이것의 모방체(mimetics), 예컨대: 포스포디에스테르 연결이 치환 연결, 예컨대 포스포로티오에이트, 메틸리미노, 메틸포스포네이트, 포스포르아미데이트, 구아니딘 등과 치환된 바 있는 핵산; 리보오스 하위단위가 예를 들어, 헥소오즈 포스포디에스테르로 치환된 바 있는 핵산; 펩타이드 핵산 등일 수 있다. 상기 프로브의 길이는 일반적으로 10 내지 1,000개 범위의 뉴클레오타이드로, 일부 구현예에서, 상기 프로브는 올리고뉴클레오타이드이고 보통 15 내지 150개 범위의 뉴클레오타이드이고, 좀 더 일반적으로 15 내지 100개의 뉴클레오타이드의 길이이고, 기타 구현예에서, 프로브는 보통 150 내지 1,000개의 뉴클레오타이드의 길이로 더 길고, 여기서 폴리뉴클레오타이드 프로브가 단일 가닥이거나 이중 가닥일 수 있으나, 보통은 단일 가닥이고, cDNA에서 증폭된 PCR 파편일 수 있다.
상기 기재의 표면 상의 프로브 분자는 분석되기 위해 선택된 유전자에 상응하고, 양성 혼성화 사건이 상기 표적 핵산 시료가 유래된 생리학적 원천에서 특정 유전자의 발현과 상관관계가 있도록 상기 어레이 상에 알려진 위치에 위치된다. 프로브 분자가 안정적으로 연관되는 기재는 다양한 물질, 예컨대 플라스틱, 세라믹, 금속, 겔, 막, 유리 등으로 제작될 수 있다. 어레이는 임의의 편리한 방법, 예컨대 프로브를 수행하고 이어서 이들을 지지체의 표면과 연관시키거나 또는 지지체 위에서 직접적으로 프로브를 키우는 방법으로, 생성될 수 있다. 어레이 생산을 위한 수많은 상이한 어레이 구성 및 방법이 당해기술의 숙련가에게 알려져 있고, 미국 특허 제5,445,934호, 제5,532,128호, 제5,556,752호, 제5,242,974호, 제5,384,261호, 제5,405,783호, 제5,412,087호, 제5,424,186호, 제5,429,807호, 제5,436,327호, 제5,472,672호, 제5,527,681호, 제5,529,756호, 제5,545,531호, 제5,554,501호, 제5,561,071호, 제5,571,639호, 제5,593,839호, 제5,599,695호, 제5,624,711호, 제5,658,734호, 제5,700,637호 및 제6,004,755호에 개시되었으며, 이들 중 관련 부분이 본원에 참조로 편입되었다.
비혼성화된 라벨이 붙은 핵산이 검출 단계에서 신호를 방출할 수 있는 혼성화 이후에, 비혼성화된 라벨이 붙은 핵산이 지지체 표면에서 제거되는 세정 단계가 활용되어, 상기 기재 표면 상에 혼성화된 핵산의 무늬를 생성한다. 다양한 세정 용액 및 그들의 사용에 대한 프로토콜이 당해기술의 숙련가에게 알려져 있어서 사용될 수 있다. 표적 핵산 상의 라벨이 직접적으로 검출가능하지 않은 경우, 그런 경우, 이제 결합된 표적을 포함하는 어레이를 활용될 신호 생성 시스템의 기타 구성원(들)과 접촉시킨다. 예를 들어, 표적 상의 라벨이 비오틴인 경우, 이어서 어레이를 특정 결합 구성원 쌍 사이의 결합이 발생하기에 충분한 조건 하에서 스트렙타비딘-형광 컨쥬게이트와 접촉시킨다. 접촉 후, 상기 신호 생성 시스템의 임의의 비결합 구성원은 그 후 예를 들어, 세정에 의해 제거된다. 활용된 특정 세정 조건은 반드시 활용되는 신호 생성 시스템의 특정 속성에 따라 달라지고, 활용되는 특정 신호 생성 시스템에 익숙한 당해기술의 숙련가에게 알려져 있다. 라벨이 붙은 핵산의 수득된 혼성화 패턴(들)이 다양한 방식으로, 핵산의 특정 라벨을 기반으로 검출법이 선택되는 측정 방식으로, 시각화 또는 검출될 수 있는데, 여기서 대표적인 검출 수단에는 섬광 계수, 자기방사법, 형광 측정법, 열량 측정법, 발광 측정 등이 포함된다.
검출 또는 시각화에 앞서, 혼성화 사건을 잘못 일치시킴으로써 패턴 상에 거짓된 양성 신호를 생성할 가능성을 줄이고자 한다면, 엔도뉴클레아제가 이중가닥 DNA를 제외하고 단일 가닥 DNA를 분해시키기에 충분한 조건 하에서 혼성된 표적/프로브 복합체의 어레이가 엔도뉴클레아제로 처리될 것이다. 다양한 종류의 상이한 엔도뉴클레아제가 알려져 있고 사용될 수 있는데, 여기서 그와 같은 뉴클레아제에는 녹두(mung bean) 뉴클레아제, S1 뉴클레아제 등이 포함된다. 표적 핵산이 직접적으로 검출가능한 라벨로 표지되지 않는 분석, 예를 들어, 비오틴화 표적 핵산을 활용한 분석에서 그와 같은 처리가 활용될 경우, 일반적으로 어레이와, 신호 생성 시스템의 기타 구성원(들) 예를 들어, 형광-스트렙타비딘 컨쥬게이트와의 접촉에 앞서, 엔도뉴클레아제 처리가 수행될 것이다. 앞서 기술된 바와 같이 엔도뉴클레아제 처리는 프로브의 3' 종단에서 실질적으로 온전한 혼성화를 갖는 종단-라벨 표적/프로브 복합체만이 혼성화 패턴으로 검출되는 것을 보장한다. 앞서 기술된 바와 같이, 혼성화 및 임의의 세정 단계(들) 및/또는 추후 처리 이후, 수득된 혼성화 패턴이 검출된다. 혼성화 패턴을 검출 또는 시각화할 때, 표지의 강도 또는 신호 값이 검출될 뿐만 아니라 정량화되는데, 이것은 혼성화 패턴에서 어레이 상의 특정 지점에 혼성화된 각 종단표지 표적의 계수 또는 상기 표적의 복사 수의 절대 값을 획득하기 위해, 혼성화의 각 지점에서의 신호가 측정되고, 이미 수를 알고 있는 종단-라벨 표적 핵산에 의해 발산되는 신호에 사용하는 단위 값에 비교된다.
RNA 시퀀싱. 전체 전사체 엽총 시퀀싱(WTSS)이라고도 불리는 RNA-seq(RNA 시퀀싱)은 때가 되면 주어진 순간에 게놈에서의 RNA 존재와 정량에 대한 정보를 드러내기 위해 차세대 시퀀싱(NGS)의 능력을 활용하는 기술이다. 세포의 전사체는 역동적이고; 이것은 정적 게놈과 상반되게, 계속 변화한다. 차세대 시퀀싱의 최근 전개는 DNA 서열의 염기 범위의 증가를 비롯하여 더 높은 시료 처리량을 가능하게 한다. 이것은 세포에서 RNA 전사체의 시퀀싱을 용이하게 하여, 대안적인 유전자 스플라이스드 전사체, 전사후 변화, 유전자 융합, 돌연변이/SNP 및 유전자 발현의 변화를 볼 수 있는 능력을 제공한다. mRNA 전사체와 더불어, RNA-Seq는 총 RNA, 작은 RNA, 예컨대 miRNA, tRNA 및 리보솜 프로파일링을 포함하는 RNA의 상이한 군집을 검토할 수 있다. RNA-Seq는 또한 엑손/인트론 경계를 결정하고 사전에 주석이 달린 5' 및 3' 유전자 경계를 검증 또는 수정하기 위해 사용될 수 있다. 현재 진행 중인 RNA-Seq 연구에는 감염 중 세포 경로 변경 및 암 연구에서 유전자 발현 수치 변화의 관찰이 포함된다. NGS에 앞서, 사전에 발현 마이크로어레이를 활용해 전사체 및 유전자 발현 연구가 이루어졌는데, 이와 같은 연구는 표적 서열에서 일치를 탐침하는 수천 개의 DNA 서열을 함유하여, 발현될 모든 전사체의 프로파일이 활용되도록 제작되었다. 이들 연구는 나중에 유전자 발현의 연속 분석법(SAGE)으로 수행되었다.
SLE에 대한 치료. 따라서, 본 발명은 특정 생체지표의 검출과, 이어서 SLE의 치료에서의 변화를 고민하는데, 여기에는 지시된 경우 표준 치료법의 사용이 포함될 수 있다. 일반적으로, SLE의 치료는 높은 질병 활성도를 치료하고 염증 증가 및 면역복합체 형성/증착/보체 활성화의 증가와 연관될 수 있는 장기 손상을 최소화하려고 노력하는 단계를 수반한다. 근본적인 치료에는 코르티코스테로이드 및/또는 항-말라리아 약물이 포함될 수 있다. 특정 유형의 루푸스 신장염, 예컨대 분산된 증식성 사구체신염이 여러 차례의 세포독성 약물을 필요로 한다. 이러한 약물에는, 가장 일반적으로, 사이클로포스파마이드와 마이코페놀에이트가 포함된다. 하이드록시클로로퀸(HCQ)이 1955년 FDA에 의해 루푸스에 대한 약물로 승인받았다. 기타 질병에 대해 승인된 일부 약물이 SLE에 대한 "비승인(off-label)" 약물로 사용된다. 벨리무맙(Benlysta)이 자가항체-양성 루푸스 환자에게서 보이는 높은 질병 활성도에 대한 치료제로 사용될 수 있다.
SLE의 다양한 증상 및 장기 시스템 관여 때문에, SLE를 성공적으로 치료하기 위해서는 개인의 질병의 중등도가 반드시 평가되어야 한다. 때때로, 경증 또는 완화된(remittent) 질병은 하이드록시클로로퀸 단독으로 최소한도로 안전하게 치료될 수도 있다. 필요한 경우, 비스테로이드성 항-염증성 약물과 저용량 스테로이드가 또한 사용될 수도 있다. 하이드록시클로로퀸(HCQ)은 체질상, 피부 및 관절 징후에 사용되는 FDA-승인 항말라리아제이다. 하이드록시클로로퀸은 상대적으로 부작용이 적고, SLE를 앓는 사람들 중에서 생존율을 개선하며, 안정적인 SLE 환자에서 HCQ의 중단이 캐나다의 루푸스 환자들에게서 질병 활성(flare)의 증가를 초래했다는 증거가 존재한다. 질병 변형 항류마티스 약물(DMARD)이 종종 SLE에 비승인 약물로 사용되어 질병 활성도를 감소시키고 스테로이드 사용의 필요성을 낮춘다. 일반적으로 사용되는 DMARD는 메토트렉세이트와 아자티오프린이다. 좀 더 심각한 경우에, 면역계를 공격적으로 억제하는 의약품(주로 고용량 코르티코스테로이드와 주요 면역억제제)이 질병을 통제하고 손상을 방지하기 위해 사용된다. 중증 사구체신염 뿐만 아니라, 기타 치명적이거나 장기손상을 불러오는 합병증, 예컨대 혈관염과 루푸스 뇌염의 경우, 사이클로포스파마이드가 사용된다. 또한 루푸스 신장염의 치료에 마이코페놀산이 사용되는데, 이와 같은 징후에 대한 약물로 FDA로부터 승인받지는 못했다.
복용량에 따라, 스테로이드를 필요로 하는 사람이 몸통비만, 자색선, 버섯 증후군(buffalo hump) 및 기타 연관 증상의 쿠싱 증후군을 앓을 수도 있다. 이들은 큰 최초용량이 감소된다면 진정될 테지만, 적은 용량이라도 장기적으로 사용되면 혈압 상승, 글루코오스 불내성(예컨대 대사성 증후군 및/또는 당뇨), 골다공증, 불면증, 무혈성 괴사 및 백내장이 초래될 수 있다.
SLE에 대해 적극적으로 검사되고 있는 수많은 신규한 면역억제 약물. 코르티코스테로이드가 그렇듯이 면역계를 비특이적으로 억제하기보다, 이들은 개별 유형의 면역 세포의 반응을 표적으로 삼는다. 특히 기준선 상승 질병 활성도 및 자가항체의 존재를 갖는 환자에게서, 루푸스 치료 및 SLE 질병 활성도의 감소를 위해, 벨리무맙, 즉 B-림프구 자극 인자(BlyS 또는 BAFF)에 대항하는 인간화된 단클론 항체가 FDA에 의해 승인받았다. 추가적 약물, 예컨대 아마타셉트, 에프라투지맙, 에타네르셉트 및 기타 약물이 SLE 환자에게서 적극적으로 연구 중이고, 이들 약물 중 일부는 이미 류마티스 관절염 또는 기타 장애의 치료를 위해 FDA승인을 받았다. SLE를 앓는 사람들 중 높은 비율이 다양한 강도의 만성 통증으로 고통받기 때문에, 비처방 약물(주로 비스테로이드성 항염증 약물)이 효과적인 경감을 제공하지 않는 경우, 더 강력한 처방 진통제(통증 완화제)가 사용될 수 있다. 강력한 NSAID, 예컨대 인도메타신 및 디클로페낙은 신부전 및 심부전의 위험을 증가시키기 때문에 SLE 환자에게 비교적 사용이 금지된다.
중등도 통증은 전형적으로 순한 처방 아편계 약물, 예컨대 덱스트로프로폭시펜과 코코다몰로 치료된다. 중등도 내지 중증 만성 통증은 더 강한 오피오이드, 예컨대 하이드로코돈 또는 지효성(longer-acting continuous-release) 오피오이드, 예컨대 옥시코돈, MS 콘틴 또는 메타돈으로 치료된다. 펜타닐(duragesic) 경피 패치가 또한 지효성 및 사용의 편이성 때문에 합병증으로 인한 만성 통증에 치료방법으로 널리 사용된다. 오피오이드가 장기간 동안 사용될 경우, 약물 내성, 화학 의존성 및 중독이 발생할 수 있다. 아편 중독이 전형적인 근심거리는 아닌데, 질환이 완전히 사라질 가능성이 없기 때문이다. 따라서, 오피오이드를 이용한 평생의 치료가 모든 장기적 오피오이드 요법이 그렇듯 주기적인 적정(titration)을 동반하면서, 만성 통증 증상에 상당히 일반적이다.
정맥내 면역글로불린이 장기 관련, 즉 혈관염이 있는 SLE를 통제하는 데 사용될 수 있다. 이들의 작용기전이 밝혀지지 않았으나, 이들이 항체 생성을 감소시키거나 또는 체내에서 면역복합체의 제거를 촉진하는 것으로 여겨진다. 면역억제제 및 코르티고스테로이드와는 달리, IVIG는 면역계를 억압하지 않기 때문에, 이들 약물로 인한 심각한 감염의 위험은 덜 하다.
햇볕 피하기가 SLE 환자의 삶에서 주요한 변화로, 햇볕이 SLE 질병을 악화시킨다고 알려져 있고, 심한 피로가 몸을 쇠약하게 만든다. 이러한 두 가지 문제로 환자가 장시간 동안 집에만 머물게 될 수 있다. SLE와 관련이 없는 약물은 상기 질병을 악화시키지 않는다고 알려진 경우에만, 처방되어야 한다. 직업적으로 실리카, 살충제 및 수은에 노출될 경우에도, 질병이 악화될 수 있다.
신장 이식이 루푸스 신장염의 합병증 중 하나인 말기 신장 질병에 대한 치료의 선택지이지만, 이식된 신장에서 완전한 질병의 재발이 최대 환자의 30%에서 일반적으로 일어난다.
항인지질 증후군은 또한 뇌에서 신경성 루푸스 증상의 시작과 관련이 있다. 상기 질병의 형태에서, 원인은 루푸스와는 사뭇 다르다: 혈전증(혈전 또는 "끈적거리는 혈액")이 혈관에서 형성되는데, 이것이 혈류 내부에서 움직일 경우 치명적일 수 있음이 입증되었다. 만약 혈전증이 뇌로 이동할 경우, 뇌로 가는 혈액 공급을 차단함으로써 잠재적으로 뇌졸중을 유발할 수 있다. 이와 같은 장애가 환자에게서 의심된다면, 조기 발견을 위해 보통 뇌 스캔이 요구된다. 이와 같은 스캔이 뇌에서 혈액 공급이 충분하지 않았던 국부적 영역을 보여준다. 이들 환자에 대한 치료 계획은 항응고를 필요로 한다. 종종, 이와 같은 목적으로 저용량의 아스피린이 처방되지만, 혈전증이 관련된 경우에, 항응고제, 예컨대 와르파린이 사용된다.
약제학적 제형 및 전달. 치료적 적용의 변화가 고려된다. 의도된 적용에 적합한 형태로 약제학적 조성물을 제조하는 것이 필요할 것이다. 일반적으로, 이것은 사람 또는 동물에 해로울 수 있는 기타 불순물 뿐만 아니라 필수적으로 발열물질이 없는 조성물을 제조하는 것을 수반한다.
일반적으로, 전달 벡터를 안정적이게 하고 표적 세포에 의한 흡수를 허용하기 위해 적절한 염과 완충용액이 활용된다. 재조합 세포가 환자에게 투입될 경우, 또한 완충용액이 활용된다. 본 발명의 수성 조성물은 약제학적으로 허용가능한 운반체 또는 수성 매질에 용해되거나 또는 분산되는, 세포에 대한 유효량의 벡터를 포함한다. 그와 같은 조성물은 접종원이라고도 불린다.
본원에 사용된 어구 "약제학적으로" 또는 "약제학적으로 허용가능한"은 동물 또는 사람에게 투여됐을 때, 역반응, 알러지 반응 또는 기타 뜻밖의 반응을 일으키지 않는 분자 개체 및 조성물을 가리킨다. 본원에 사용된 "약제학적으로 허용가능한 운반체"에는 임의의 모든 용매, 분산매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등이 포함된다. 약제학적으로 활성인 성분을 위한 그와 같은 매질 및 제제의 사용이 당해기술에 잘 알려져 있다. 지금까지, 종래의 매질 또는 제제가 본 발명의 벡터 또는 세포와 양립될 수 없는 경우가 아니라면, 치료용 조성물에 이것의 사용이 고려된다. 보충 활성 성분 또한 상기 조성물에 혼입될 수 있다.
본 발명의 활성 조성물에는 고전적인 약제학적 제제가 포함될 수 있다. 본 발명에 따른 이들 조성물의 투여는 표적 조직이 특정 경로를 통해 접근가능한, 모든 일반 경로를 통해 이루어진다. 이와 같은 경로에는 경구, 비강내, 볼내, 직장내, 질내 또는 국소적 경로가 포함된다. 대안적으로, 정위(orthotopic), 피부내, 피부하, 근육내, 복강내 또는 정맥내 주입에 의해 투여가 이루어질 수도 있다. 이와 같은 조성물은 정상적으로 약제학적으로 허용가능한 조성물로 투여된다. 활성 화합물이 비경구적으로 또는 복강내로 투여될 수도 있다. 유기 염기 또는 약동학적으로 허용가능한 염 같은 활성 화합물의 용액이 계면활성제, 예컨대 하이드록시프로필셀룰로오스와 적절히 섞인 물에서 제조될 수 있다. 분산액이 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 혼합물 및 오일에서 제조될 수도 있다. 평범한 보관 및 사용 조건 하에, 이러한 제제는 미생물의 성장을 막기 위해 방부제를 함유한다.
주입용으로 적합한 약제학적 형태에는 멸균 수성용액 또는 분산액 및, 멸균 주입가능 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말이 포함된다. 모든 경우에, 제형은 멸균상태여야 하고, 주사기 사용이 용이하도록 유동성이 있어야 한다. 제조 및 보관의 조건 한에서 안정적이어야 하고, 미생물, 예컨대 세균과 곰팡이의 오염작용에 대항하여 보존되어야 한다. 상기 운반체는 예를 들어 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적절한 혼합물 및 식물성 기름을 함유한 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 예를 들면, 레시틴과 같은 코팅제의 사용에 의해, 분산의 경우 필수 입도의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해, 적합한 유동성이 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르비산, 티메로살 등에 의해 실현될 수 있다. 여러 경우에, 등장성 제제, 예를 들면, 설탕 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 흡수를 지연시키는 제제 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 상기 조성물에 사용함으로써, 주입가능한 조성물의 장기 흡수가 실현될 수 있다.
상기 활성 화합물을 필요한 양만큼, 필요에 따라, 앞서 열거한 다양한 기타 성분을 포함한 적절한 용매에 혼입하고, 이어서 여과멸균을 수행함으로써, 멸균 주입가능 용액이 제조된다. 일반적으로, 분산액은 상기 다양한 멸균 활성 성분을, 앞서 열거된 것들 중 기본 분산 매질과 필수 기타 성분을 함유한 멸균 비히클에 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주입가능 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 앞서 멸균여과된 용액에서 활성 성분과 추가적인 필요 성분의 분말을 생성하는 진공건조 및 냉동건조 기법이다.
본원에 사용된 어구 "약제학적으로 허용가능한 운반체"는 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 가리킨다. 약제학적 활성 성분을 위해 그와 같은 매질과 제제를 사용하는 것이 당해기술에 잘 알려져 있다. 지금까지 어떤 종래의 매질 또는 제제가 상기 활성 성분과 양립하지 못하는 경우가 아니라면, 치료용 조성물에 그것의 사용이 고려된다. 조성물에 보충 활성 성분이 또한 혼입될 수 있다.
경구 투여의 경우, 본 발명의 폴리펩타이드가 부형제와 혼입되어, 삼킬 수 없는 구강 세정제 및 치마제(dentifrices)의 형태로 사용될 수 있다. 구강 세정제는 활성 성분을 필요량 만큼, 적절한 용매, 예컨대 소듐보레이트 용액(도벨 용액)에 혼입하여 제조될 수 있다. 대안적으로, 활성 성분이 소듐 보레이트, 글리세린 및 중탄산칼륨을 함유한 소독용 세척제에 혼입될 수 있다. 활성 성분이 치마제, 예컨대: 겔, 페이스트, 분말 및 슬러리에 분산될 수도 있다. 활성 성분이 물, 결합제, 연마재, 풍미제, 발포제 및 습윤제를 포함할 수 있는 페이스트 치마제에 치료차원의 유효량만큼 첨가될 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 조성물이 중성 또는 염의 형태로 제형화될 수 있다. 약제학적으로-허용가능한 염에는 산 부가염(단백질의 유리 아미노기로 형성됨)이 포함되고, 무기산, 예컨대 예를 들면, 염산 또는 인산 또는 유기산 예컨대 아세트산, 옥살산, 타르타르산 만델산 등으로 형성된다. 유리 카르복실기로 형성된 염 역시 무기 염기, 예컨대, 예를 들면, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화철 및, 유기 염기, 예컨대 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등에서 유래될 수 있다. 제형화 시, 용액이 제형에 어울리는 방식으로, 그리고 치료차원에서 유효량만큼 투여된다. 제형은 다양한 복용 형태, 예컨대 주입가능 용액, 약물 방출 캡슐 등으로 쉽게 투여된다. 수성 용액으로 비경구 투여되는 경우, 예를 들면, 필요한 경우, 용액이 적절히 완충되어야 하고, 액체 희석제가 충분한 식염수나 글루코오스로 우선 등장성이 되어야 한다. 이와 관련하여, 활용 가능한 멸균 수성 매질이 본 개시의 측면에서 당해기술의 숙련가에게 알려져 있다. 예를 들면, 한 가지 용량이 등장성 NaCl 용액 1 ml에 용해되고, 대량피하주사 유액 1,000 ml에 첨가하거나 또는 제안된 주입 위치에 주입될 수 있는데, (예를 들면, "Remington's Pharmaceutical Sciences," 15th Ed., 1035-1038 및 1570-1580 참조), 관련 부분이 본원에 참조로 편입되었다. 대상 개체의 상황에 따라, 용량의 일부 가변성이 반드시 발생한다. 어떤 경우라도, 투여의 책임이 있는 사람이 개별 개체에게 알맞은 용량을 결정한다. 더불어, 사람에게 투여할 경우, 제제는 멸균성, 발열원성, 일반적 안정성 및 FDA의 생물학적 표준청(Office of Biologics standards)이 요구하는 순도 표준에 부합해야 한다.
키트. 본원에 기술된 적용부문에 사용하기 위해, 키트 역시 본 발명의 범위 내에 존재한다. 그와 같은 키트는 유리병, 시험관 등의 하나 이상의 용기를 수용하도록 분할된 운반체, 패키지 또는 용기를 포함할 수 있고, 이들 용기 각각은 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 별도의 요소들 중 하나, 특히 브라이트 억제제(Bright inhibitor)를 포함한다. 본 발명의 키트는 전형적으로 앞서 기술된 용기를 포함하고, 상업적인 최종사용자의 입장에서 바람직한 물질들, 예컨대 완충용액, 희석제, 충진재 및 사용지침서가 포함된 포장삽입물을 포함하는 하나 이상의 기타 용기를 포함한다. 추가적으로, 조성물이 특정 치료를 위한 적용에 사용됨을 보여주는 라벨이 용기에 제공될 수 있고, 또한 앞서 기술된 것과 마찬가지로, 라벨이 체내 또는 체외 용도 여부에 대한 지시를 보여줄 수 있다. 지시사항 및/또는 기타 정보가 키트와 함께 포함된 삽입물에 포함될 수도 있다. 특히, 본 발명에 따른 키트에 앞서 논의된 생체지표의 수치를 평가하기 위한 시약과 함께 하나 이상의 SLE 치료제 및/또는 ANA 검사 및/또는 항-ENA용 시약과 더불어 동일한 것을 평가하기 위한 대조군의 집합체가 고려된다.
루푸스 질병 활성도 측정치 중 현재 생체지표는 상승된 임상적 질병 활성도를 반영하기 위한 제한적인 유용성을 갖는다. 이것은 임상적 질병 활성도의 가장 빠른 측정치도 아니고, 가장 유용한 정보를 제공하는 측정치도 아니다. SLE-연관 자가항체 특이성, 예컨대 항-dsDNA, 항-스플라이세오솜 및 항-Ro/SSA가 분류되기 몇 년 전에 SLE 환자에 축적되지만, 그들의 존재는 임상적 질병 활성도 및 영구적 장기 손상에 대한 위험도를 반영하기에 충분하지 않다. ANA는 다른 전신 류마티스 질병 환자 및, SLE이 생기지 않은 건강한 개인, 예컨대 SLE 환자의 병을 앓지 않는 가족 구성원의 일부 및 일반 인구의 최대 14%에서 확보한 혈청에서 발견된다. 개인이 ANA-양성임에도 건강 상태를 유지하기 때문에, ANA 양성이 SLE의 유일한 병리학적 동인으로 볼 수 없다. ANA 양성과 더불어, 용해성 매개체에 의해 유도된 다양한 면역 경로의 조절장애가 임상적 질병 활성도에 기여할 수도 있다.
실시예. 본 발명의 다양한 양태를 추가로 묘사하기 위해 하기 실시예가 포함된다. 이후에 따라오는 본 실시예에서 개시된 기법들이 본 발명가에 의해 본 발명의 실행에서 제대로 기능하는 것으로 밝혀진 기법 및/또는 조성물을 나타냄을 당해기술의 숙련가에 의해 마땅히 이해될 것이고, 따라서 발명의 실행을 위해 바람직한 방식을 구성하는 것으로 간주될 수 있다. 하지만, 당해기술의 숙련가가 본 개시의 측면에서 개시되는 구체적인 구현예에서 여러 변화가 있을 수 있으며 본 발명의 원리 및 범위에서 벗어나지 않으면서 유사한 결과를 여전히 획득할 수 있음을 이해해야 한다.
SLE는 면역 조절장애에 의해 특징지어지는 복잡한 자가면역 질병이다. 변경된 질병 활성도의 관련 매개체를 추적하기 위한 종합적이지만 비용효율적인 도구가 질병 관리를 개선하고 장기 손상을 방지하는 데 도움을 줄 것이다. 본 실시예의 목적은 저활성 루푸스 질병 활성도와 활성을 구별하기 위한 실용적인 생체측정의 중요한 구성성분을 식별하는 것이었다.
본 발명은 SLE 질병 활성도의 변화로 조절장애가 일어날 수 있는 특정 면역 매개체, 예컨대 SLE-연관 자가항체 특이성 및, 염증 및 조절 용해성 매개체 경로의 식별을 포함한다. 다중 접근법을 사용하여, 저활성 질병 활성도(hSLEDAI <4) 또는 활성(hSLEDAI≥4) 질병 활성도를 갖고 방문을 하는 SLE 환자는, 대응되는 건강한 대조군(HC)과 비교하여, 자가항체 특이성 및 염증 및 조절 매개체의 혈장 수치의 축적에서 질병 활성도에 의존한 변화를 입증하였다. 이와 같은 결과로 임상적 질병 활성도에서의 변화와 함께 면역 변경을 반영하는 조합된 루푸스 질병 활성도 면역 지수(LDAII)의 개발이 가능하게 되었다.
인종, 성별 및 연령 별로 대응되는 건강한 대조군(HC)(n=48) 뿐만 아니라, 저활성 임상적 질병(전신 홍반성 낭창 질병 활성도 지수(SLEDAI) < 4, 범위 0~3, n=132) 또는 좀더 높은 활성 질병(SLEDAI ≥ 4, 범위 4~30, n=179)의 분류된 SLE를 앓는 환자 198명에서 직접 만나서 확보한 311개 혈장 시료에서 SLE-연결 면역 매개체와 자가항체를 평가하였다. 32개 용해성 매개체와 SLE-연관 자가항체 특이성, 예컨대 dsDNA, 염색질, Ro/SSA, La/SSB, Sm, SmRNP 및 RNP를 다중 비드-기반 분석 또는 샌드위치 ELISA(BLyS, APRlL, 및 TGF-β)에 의해 평가하였다. 자가항체의 존재와 연계하여 임상적 질병 활성도 수치 전반에 걸쳐 용해성 매개체 수치를 비교하였다.
저활성(low) 질병 또는 활성 질병을 앓는 환자는 연령, 민족성 및 성별 별로 유사하였다. 다중 비교(본페로니 교정 p<0.0018)을 위한 조정 후, IL-6, IL-1α, IP-10 및 IL-8은 유의미하게 SLEDAI 점수(스피어만 r=0.179~0.253)와 상관관계가 있었으나, 22/32개 용해성 매개체가 SLE-연관 자가항체, 예컨대 SCF, IFN-α, IFN-γ, IL-17A, IL-10, MIG, MIP-1β, TNFRII 및 BlyS 뿐만 아니라, 앞서 열거된 것들의 축적된 수와 유의미하게 상관관계가 있었다(r=0.318 [IL-17A]-0.468[IP-10]). 조절 매개체 IL-10은 저활성 질병 활성도를 갖는 환자에서 획득한 시료에서 가장 높았고(p<0.05), 염증 매개체는 축적된 자가항체 특이성을 갖는 활성 질병 시료에서 가장 높았다(p<0.001). 본 발명의 발명가들은 이와 같은 결과를 통합하여, 각 개인에서 SLE-연관 자가항체의 수에 의해 가중치가 부여된 정규화된(임상 사례 대 대조군) 용해성 매개체 수치(n=32)를 활용하여 계산된 루푸스 질병 활성도 면역 지수(LDAII)를 수립하였다. LDAII가 혈청학적(dsDNA 결합 및 낮은 보체) 활성(SA) 또는 휴지기(SQ)(p<0.0001)인 임상적 활성(CA) 질병 대 휴지기(CQ) 질병을 앓는 환자를 구별하였고, 이로써 IL-6, IL-8 및 IP-10 수치(p≤0.0006) 뿐만 아니라 축적된 자가항체(p<0.0001)의 수가 가장 유의미하게 변경되었다. 이와 더불어, LDAII는 임상학적 및 혈청학적 휴지기(CQSQ) SLE 환자와 건강한 대조군을 구별할 수 있었다(p=0.019). 마침내 LDAII가 환자의 SLEDAI 점수와 유의미한 상관관계가 있었고(p<0.0001) 신장 관여 환자를 식별하였는데(p=0.002), 그들에게서 SCF, TNFRII 및 MCP-1이 또한 가장 유의미하게 변경되었다(p≤0.005).
연구 집단, 임상적 데이터 및 시료 수집. 헬싱키 선언을 준수하여 연구를 수행하였고, 본 연구는 오클라호마 의학연구 재단의 기관 감사 위원회 및 오클라호마 대학 보건과학센터의 승인을 받았다. 오클라호마 루푸스 코호트의, 적절히 동의를 받은 SLE 환자(4가지 이상의 ACR 분류 기준에 부합함(39)) 198명 및, 오클라호마 면역 코호트의 인종 및 성별에 대응되는 건강한 개인(대조군 또는 Ctl) 48명에서 희석되지 않은 혈장 및 혈청 시료를 확보하였다, 표 1. 시료를 OMRF의 CAP-인증 생체시료 저장소인 오클라호마 류마티스 질병 연구 센터(ORDRCC)에서 -80°로 보관하였다. 상기 생체시료 저장소의 시료는 선적 시간 및 방법, 처리 절차, 보관 조건 및 보관기간과 관련하여, SLE 환자 및 대조군에서의 시료 중 용해성 매개체 및 SLE-연관 AutoAbs의 수치를 결정하는 능력에 대해 연구된 바 있다(33, 36, 37, 40~45).
표 1.연구 참여자 인구통계
Figure 112021055439856-pct00001
aSLE 환자가 SLE에 대한 분류 기준 4개 이상에 부합함(ACR 및 SLICC)
b인종, 성별 및 연령 별 SLE에 대응됨
c결합(paired) t-검정(연속 데이터) 또는 피셔의 정확 검정(범주 데이터)에 의해 결정된 통계학적 유의미성(p≤0.05)
d비-EA = 아프라카계 아메리카인, 아시아인, 아메리칸 인디언, 또는 여러 인종
앞서 기술된 바와 같이(39), 인구통계학적 및 임상적 정보, 예컨대 의약품 용도, 임상적 실험실 값, 및 임상적 질병 활성도를 수집하였다. 중추신경계(CNS; 발작, 정신병, 기질적 뇌 증후군, 시력 장애, 뇌신경 장애, 또는 루푸스 두통), 혈관염, 관절염, 근염, 신장염(요원주, 혈뇨, 단백뇨, 또는 농뇨), 점막피부 손상(발진, 탈모, 또는 점막 궤양), 장막염(능막염 또는 심막염), 또는 혈액학적 징후(낮은 보체, DNA 결합의 증가, 열, 혈소판 감소증, 또는 백혈구감소증)(16)을 수반하는 질병 징후의 존재를 비롯하여, 장기 체계 관여의 존재를 하이브리드 전신 홍반성 낭창 질병 활성도 지수(hSLEDAI; SLEDAI-2K에 의해 정의된 바와 같이 단백뇨와 SELENA-SLEDAI)(32, 33)의 시행에 의해 평가하였다. hSLEDAI 점수가 < 4 인 환자 방문자는 "저활성" 질병 활성도로 간주되었고, 반면 hSLEDAI 점수가 ≥ 4 인 환자 방문자는 "활성" 질병으로 간주되었다. 각 임상적 방문 시 각 참가자에게서 혈액 시료를 조달하였다. 혈장과 혈청 시료를 분석의 시기까지 -20℃에서 보관하였다. 분석은 새로 해동된 시료에서 수행하였다.
용해성 매개체 및 자가항체 특이성의 특징. 입증된 다중 비드-기반 분석 또는 ELISA(BLyS, APRIL 및 TGF-β)를 사용하여, 혈장 용해성 매개체(n=32, 표 2), 예컨대 사이토카인, 케모카인 및 용해성 수용체를 검토하였다(46). 시료/분석물 당 100개 비드의 더 낮은 경계를 가지고, 데이터를 Bio-Rad BioPlex 200® 어레이 시스템(Bio-Rad Technologies, Hercules, CA) 상에서 분석하였다. 5-매개변수 로지스틱 비선형 회귀 표준곡선에서 각 분석물에 대한 중간 형광 강도를 채워넣었다. 검출 한계값 아래 분석물에 0.001 pg/mL이란 값을 부여하였다. 알려진 대조군 혈청이 각 플레이트(Cellgro 인간 AB 혈청, Cat#2931949, L/N#M1016)에 포함되었다. 사이토카인 검출에 대한 다중 비드-기반 분석의 변화량(CV)의 중간 인터(inter)-분석 상관계수가 사전에 10~14%(47, 48)임이 보여진 바 있고, 본 분석에서의 분석물에 걸쳐 건강한 대조군 혈청을 사용하여 유사한 평균 CV(10.5%)를 획득하였다. 중복 웰의 인트라(Intra)-분석 정밀도가 매 xMAP 분석에서 평균 10% CV 미만이었다.
표 2. SLE 환자 및 대조군 시료에서 평가된 혈장 매개체
Figure 112021055439856-pct00002
BioPlex 2200 다중장치(Bio-Rad Technologies, Hercules, CA)를 사용하여 자가항체 특이성에 대해 혈청 시료를 선별하였다. 상기 BioPlex 2200 ANA 키트는 11개 자가항체 특이성 수치, 예컨대 dsDNA, 염색질, 리보솜 P, Ro/SSA, La/SSB, Sm, the Sm/RNP 복합체, RNP, Scl-70, 동원체 B 및 Jo-1에 대한 반응성의 동시 검출을 위해 형광염색된 자기성 비드를 사용한다(49). 본 연구에서 분석을 위해 dsDNA, 염색질, Ro/SSA, La/SSB, Sm, Sm/RNP 복합체 및 RNP에 대한 SLE-연관 자가항체 특이성을 사용하였다. 항-dsDNA(IU/mL)는 사전에 10 IU/mL의 양성 컷오프(cutoff)를 결정한 바 있고; AI=1.0의 양성 컷오프를 갖는 기타 자가항체 특이성들 각각의 형광 강도를 반영하기 위해, 제조업체가 항체 지수(AI) 값(범위 0~8)을 보고한다. AI 척도는 제조업체가 제공하는 교정장치 및 대조군 시료에 비례하여 표준화된다.
통계학적 분석. 범주형 변수를 피셔의 정확 검정으로 비교하였다. 비결합 t-검정을 사용하여, 저활성 대 활성 질병 임상적 방문자의 질병 활성도 점수를 비교하였다. 맨-휘트니 검정에 의해 저활성 또는 활성 질병을 가진 SLE 환자 방문자들 사이의 자가항체 특이성과 혈장 용해성 매개체 농도의 수를 비교하였다. 던의 다중비교를 포함한 크루스칼-왈리스 검정에 의해, 저활성 및 활성 질병을 갖는 SLE 환자 방문자들과 인종/성별에 대응되는 대조군 시료 사이에서 혈장 매개체 농도 및 자가항체 특이성의 수를 비교하였다. 스피어만 순위 상관에 의해, 혈장 매개체 농도가 hSLEDAI 점수 또는 자가항체 특이성의 수와 상관관계가 있음을 보여주었다. 언급된 경우를 제외하고, GraphPad Prism 6.02(GraphPad Software, San Diego, CA)를 사용하여 분석을 수행하였다.
대조군에서 구별되는 다양한 수준의 질병 활성도를 갖는 환자 방문 중에 염증의 전반적인 수치를 비교하기 위해 루푸스 질병 활성도 면역 지수(LDAII) 계산을 개발하였다. LDAII 계산은 SLE 환자를 위해 사용된 루푸스 활성(flare) 예측 지수(LFPI)를 개발하기 위해 본 발명의 발명가들이 유사하게 사용했던 접근법을 따랐다(42, 45). LDAII가 저활성 및 활성 질병을 갖는 클리닉 방문 SLE 환자 및 대응되는 대조군에서 평가되고, 동일한 방문에서 확보된 시료에서 검출된 AutoAb 특이성의 수에 대한 그들의 상관관계에 의해 가중치가 부여된 32개 혈장 매개체 전부의 조절장애를 요약해준다. LDAII를 하기와 같이 계산하였다: 1. 32개 기준선 혈장 매개체 전부의 농도(표 2)를 각각의 SLE 환자 또는 대조군 방문자에 대해 로그전환하였다. 2. 각 참여 방문자에 대한 각각의 로그전환된 용해성 매개체 수치를 표준화하였다: (관측값)-(모든 SLE 환자와 대조군 방문자의 평균 값)/(SLE 환자와 대조군 방문자의 표준 편차) 3. 모든 SLE 환자 및 대조군 방문자에서 평가된 각각의 용해성 매개체에 대한 AutoAb 특이성의 수 사이의 연관성을 검사하는 선형 회귀 모델에서 스피어만 상관계수를 생성하였다(스피어만 r); 4. 그들 각각의 스피어만 상관계수(스피어만 r)에 의해 상기의 전환 및 표준화된 용해성 매개체 수치에 가중치를 부여(곱셈)하였다. 5. 각 참여 방문자 경우, 32개 용해성 매개체 각각에 대한 상기 로그 전환되고, 표준화되고 및 가중치가 부여된 값을 합산하여 총 LDAII를 계산하였다.
맨-휘트니 검정에 의해 저활성 및 활성 질병을 가진 SLE 환자 방문자들 사이에서 LDAII를 비교하였고, 추가적으로 던의 다중비교를 포함한 크루스칼-왈리스 검정에 의해 대조군과 비교하였다. 활성 질병 대 저활성 질병 활성도(또는 대조군)를 가진 SLE 환자 방문자가 각각 양성 또는 음성 LDAII 점수를 가질 가능성에 대해 교차비(OR)를 결정하였고; 피셔의 정확 검정에 의해 유의성을 결정하였다.
임상학적 활성 질병에서 AutoAb 특이성의 수의 증가 및 선택 매개체의 변경된 수치.
본 발명의 발명가들은 분류된 SLE(ACR 분류 기준 중 4개 이상에 부합됨(39))로 이행된 환자가 여러 수준의 면역 조절장애, 예컨대 SLE-연관 AutoAb 특이성(36, 37, 50)의 축적과 염증 및 조절 용해성 매개체 모두의 변경(36, 37)을 보임을 사전에 입증한 바 있다. 그와 같은 면역 조절장애가 또한 임상적 활성 질병을 가진 SLE 환자에 반영될 것이라는 가설을 기반으로, 본 발명의 발명가들은 클리닉 방문 중에 확보된 시료에서 혈청 자가항체 및 혈장 용해성 매개체 프로파일을 비교하였고, 이로써 198명의 SLE 환자가 저활성 질병 활성도(hSLEDAI < 4, 범위 0-3, n=132) 또는 활성 질병(hSLEDAI ≥ 4, 범위 4-30, n=179)을 보여주었다(도 1a 및 1b, 및 표 3). 기대했던 바 대로, 활성 질병을 가진 SLE 환자는 저활성 질병 활성도를 가진 SLE 환자보다 hSLEDAI 점수가 유의하게 더 높았고(도 1a) 다양한 장기 체계 징후를 보일 가능성이 더 높았다(표 3). 이와 더불어, 활성 질병을 앓는 SLE 환자가 저활성 질병 활성도 동안 검출된 수와 비교하여 SLE-연관 AutoAb 특이성의 수에 유의미한 증가를 보인 반면(p=0.0038, 도 1b), 질병 활성도와 관계 없이, SLE 환자가 대응되는 대조군과 비교하여 유의미하게 더 많은 AutoAb 특이성을 보였다(p<0.0001). dsDNA(p<0.0001), 염색질(p=0.0005) 및 Sm(p=0.0380)에 저항하는 AutoAbs가 활성 질병의 기간 동안 양성일 가능성이 더 높은 반면, Ro/SSA, La/SSB, SmRNP 및 RNP AutoAb 특이성의 회수는 저활성 및 활성 질병에서 유사하였다, 표 3. 활성 질병을 가진 SLE 환자가 스테로이드를 처방받을 가능성이 더 높았고(p<0.0001) 저활성 질병 활성도를 갖는 환자와 유사하게 하이드록시클로로퀸 및/또는 면역억제제가 처방되었다, 표 3.
표 3. SLE 환자 약물, 자가항체 및 임상적 특징
Figure 112021055439856-pct00003
a저활성 = hSLEDAI < 4; 활성 = hSLEDAI ≥ 4
b결합된 t-검정(연속 데이터) 또는 피셔의 정확 검정(범주형 데이터)에 의해 결정된 통계학적 유의성( p≤0.05 )
c면역억제제 = 메토트렉세이트, 아자티오프린
d주요 면역억제제 = 마이코페놀에이트 모페틸, 사이클로포스파마이드
eBioplex® 2200 ANA Screen에 의해 결정됨
fCNS = 발작, 정신병, 유기 뇌 기질적 뇌 증후군, 시력 장애, 뇌 신경 장애, 루푸스 두통, CVA
g신장 = 요원주, 혈뇨, 단백뇨, 농뇨
h점막피부 = 발진, 탈모, 점막 궤양
i장막염 = 흉막염, 심막염
j혈청학적 = 낮은 보체, DNA 결합 증가
k혈액학적 = 혈소판 감소증, 백혈구감소증
본 발명의 발명가는 AutoAb 특이성의 변화와 더불어, 활성 질병을 앓는 SLE 환자가 SLE-연관 용해성 매개체에서 변경을 갖는지 여부 또한 판단하였다, 표 4 및 도 2a 내지 2i. 다중 비교를 위해 조절한 후, 선택된 매개체, 예컨대 IL-8, IP-10, IL-1α 및 IL-6의 혈장 수치가 시료 확보와 동시에 클리닉 방문 시 hSLEDAI 점수와 직접적으로 상관관계가 있었다, 표 4. 이것은 더 나아가 활성 질병을 않는 SLE 환자에서 혈장 매개체의 수치 증가에 반영되었다. IFN으로 추진된 케모카인과 함께 유형 I IFN, IFN-α(도 2a), IP-10(도 2b) 및 본래 매개체, IL-6(도 2c)이 저활성 질병 활성도와 비교하여 활성 질병의 기간에 있던 SLE 환자 시료에서 모두 유의미하게 더 높았고, 임상적 질병 활성도와 관계 없이, SLE 환자가 대조군보다 이들 매개체의 수치가 더 높았다(p< 0.05). 본래 매개체, IL-1α(도 2d), 케모카인 IL-8(도 2e) 및 Th17-유형 매개체, IL-21(도 2f)이 활성 질병을 앓는 SLE 환자에서 가장 높았고(p<0.05), 저활성 질병 활성도를 갖는 환자가 대조군과 유사한 수준을 가졌다. SLE 환자는 질병 활성도와 상관없이 대조군보다 더 높은 수치의 BlyS를 보였는데(p<0.001), 이것은, 비록 유의미하지는 않았지만, 활성 질병을 앓는 SLE 환자에게서 가장 높았다(도 2g). 조절 매개체, IL-10(도 2h)이 저활성 질병 활성도를 가진 SLE 환자에게서 가장 높았고(SLE 환자가 대조군보다 유의미하게 더 높은 수치를 가짐, p<0.01), TGF-β 수치가 대조군에서 가장 높았고(p<0.01) 저활성 및 활성 질병을 앓는 SLE 환자 사이에서 유사하였다(도 2i). 이와 같은 데이터는 수많은 선택적 매개체가 임상적 활성 SLE와 직접적으로 연관되어 변경될 수 있음을 보여준다.
표 4. 구별되는 혈장 매개체가 질병 활성도와 상관관계가 있다
Figure 112021055439856-pct00004
a스피어만 상관, 본페로니 교정 유의성 p=0.0038
용해성 매개체 수치가 AutoAbs의 존재 및 임상적 질병 활성도와 연관되어 변경된다. 활성 질병을 앓는 SLE 환자에서 검출된 AutoAb 특이성의 수의 증가 및 선택된 혈장 매개체의 변경된 수치를 고려할 때, 본 발명의 발명가는 용해성 매개체 수치가 검출된 AutoAb 특이성의 수와 상관관계가 있는지에 대해 의문을 제기하였다(표 5). 본 발명의 발명가들은 여러 추가적 용해성 매개체(22/32 평가됨)가 SLE 환자와 대응되는 건강한 대조군에 존재하는 축적된 SLE-연관 AutoAbs, 예컨대 본래 및 적응성 매개체, 케모카인, 및 TNF 상과 구성원의 수와 유의미하게(p≤0.0010) 상관관계가 있음을 밝혀냈다. 이로써 우리는 AutoAb 음성(Neg)이거나 또는 양성(Pos)인, 저활성 또는 활성 질병을 앓는 SLE 환자와 대조군 사이에서 이와 같은 용해성 매개체의 수치가 어떻게 비교되는지 평가할 수 있었다(도 3~6). 유형 I(IFN-α, 도 3a) 및 유형 II(IFN-γ, 도 3b) IFN가 AutoAb Pos SLE 환자에서 증가되면서 활성 질병을 앓는 AutoAb Neg 및 Pos 환자 사이에 유의미한 차이를 보이고; 활성 질병을 앓는 AutoAb 양성 SLE 환자가 대조군과 비교하여 이들 매개체의 혈장 수치가 가장 높았다(p<0.001). IFN 케모카인 IP-10(도 3c) 및 MIG(도 3d)의 경우, 낮은 활성(p<0.05) 또는 활성(p<0.0001) 질병을 앓는 AutoAb Pos 및 Neg SLE 환자 사이에서 이들 매개체의 유의미한 증가가 있었고, 대조군과 비교하여, 활성 질병을 앓는 AutoAb Pos SLE 환자에서 수치가 가장 높았다(p<0.001). 이와 같은 데이터는 변경된 질병 활성도(도 2)와 직접적으로 연관될 가능성과 더불어, IFN-연관 매개체가 또한 AutoAb 특이성의 축적에 연계될 수 있음을 시사한다(도 3a 내지 3d).
표 5. 혈장 매개체가 SLE-연관 자가항체 특이성의 수와 상관관계가 있다
Figure 112021055439856-pct00005
a스피어만 상관, 본페로니 교정 유의성 p=0.0018
B-림프구 자극제(BLyS)는 유형 I(51)과 유형 II(52) IFN에 반응하여 분비되어 B 세포 생존 및 분화를 지원함으로써, 자가항체 생산 및 분류 전환(53)에 기여하는 TNF 상과 구성원이다. IFN-연관 매개체와 유사하게, BLyS(도 4a)가 저활성 또는 활성 질병(p<0.01)을 앓는 AutoAb Pos SLE 환자에서 증가됨으로써, AutoAb Pos SLE 환자가 대조군과 비교하여 가장 높은 수치를 보인다(p<0.0001). B-림프구 활성 및 AutoAb 생산과 관련하여 BlyS와 관련된 또 다른 TNF 상과 구성원인 증식-유도 리간드(APRIL, 도 4b)(53)가 활성 질병을 앓는 AutoAb Pos SLE 환자에서 유사하게 증가된다(p<0.0001). 흥미롭게도, 저활성 대 활성 질병을 앓는 SLE 환자를 비교할 때 APRIL 수치가 AutoAb 양성 SLE 환자와 비교하여 AutoAb Neg SLE 환자에서 더 낮음이 밝혀졌고, 여기서 APRIL이 활성 질병을 앓는 SLE 환자에서 가장 높음이 밝혀졌다(p<0.05). 평가된 기타 TNF 상과 구성원, 예컨대 TRAIL(도 4c) 및 TNFRII(도 4d)도 활성 질병을 앓는 AutoAb Pos SLE 환자에서 증가되었다(p<0.0001). 이들 두 가지 매개체 역시 어느 정도 질병 활성도와 상관관계가 있음(표 4)을 고려할 때, TNF 상과 구성원이 AutoAb 생산 및 상승된 임상적 질병 활성도 모두에 기여할 수 있는 가능성이 있다.
기타 본래 및 적응성 매개체가 SLE 발병기전 및 상승된 임상적 질병에서 변경됨이 본 발명가들의 이전 연구에서 밝혀진 바 있다(36, 42, 45). 본 발명의 발명가들은 본래 매개체, 예컨대 IL-1a(도 5a, p<0.01) 및 IL-6(도 5b, p<0.05)가 저활성 또는 활성 질병을 앓는 AutoAb Pos SLE 환자에서 증가됨을 관찰하였다. 이와 더불어, IL-1a가 AutoAb Pos SLE 환자에서 저활성 대 활성 질병을 구별짓는다(도 5a, p=0.0206). 적응성 매개체, 예컨대 Th1-유형 매개체, IL-2(도 5c) 및 Th17-유형 매개체, IL-21(도 5d)의 수치 증가가 또한 활성 질병을 앓는 AutoAb Pos SLE 환자에서 유의미하게 상승되었다(p<0.05). 기타 염증성 매개체, 예컨대 SCF(도 6a, p=0.0356) 및 IL-8(도 6b, p<0.0001)가 역시 상승되었다. 비록 IL-10의 혈장 수치(도 6c)가 저활성 질병 활성도를 갖는 AutoAb Neg SLE 환자에서 가장 높고, 이것이 그것의 조절 속성을 반영한다고 해도, 활성 질병을 앓는 AutoAb Neg 및 Pos SLE 환자 사이에 IL-10 수치에는 유의미한 차이가 있었는데(p=0.0089), AutoAb Pos SLE 환자에서 수치가 더 높았고, 이는 IL-10이 그 능력으로, 또한 B-림프구 활성화 및 AutoAb 생산의 친-염증성, 양성 조절자로서 작용할 수 있음을 시사한다(54, 55). 이와 유사하게, TGF-β(도 6d)가 대조군에서 가장 높고, 이것이 SLE 환자에서의 억제된 조절을 반영하는데(36, 42, 45), 활성 질병을 앓는 AutoAb Neg SLE 환자에 비해 활성 질병을 앓는 AutoAb Pos SLE 환자에서 수치가 더 높다(p=0.0066). 이것은 IL-6와 연계하여 분비될 때(도 5b), TGF-β가 항-염증성, Th17-유형 반응을 유발하는 능력(56, 57)을 보여주는 것을 수 있다.
가중치가 부여된 루푸스 질병 활성도 면역 지수(LDAII)가 SLE 환자에서 활성 질병을 구별짓는다. SLE 환자에서 활성 임상적 질병과 연관된 여러 면역 경로의 유의미한 변경을 고려하여, 본 발명의 발명가들은 루푸스 질병 활성도 면역 지수(LDAII)를 개발하여 개별 환자에서의 면역 조절장애를 요약하고, SLE 환자에서의 저활성 및 활성 질병과 건강한 개인 또는 대조군(Ctl)에서 발견된 면역 프로파일과 비교하였다(도 7a 및 7b). 검출된 SLE-연관 AutoAb 특이성의 수에 대한 상관관계를 기반으로 가중치가 부여된, 각 용해성 매개체의 로그전환되고 표준화된 수치를 사용하여 LDAII를 계산한다. 각 분석물에 대한 가중치가 부여되고, 로그 전환되며, 표준화된 수치의 합이 포괄적인 LDAII를 생산한다(자세한 내용은 물질 및 방법 참조). 이와 같은 접근법의 뚜렷한 이점은 이것이 양성을 수립하기 위해 각 사이토카인/케모카인에 대한 컷오프를 요구하지 않고, 활성 질병을 앓는 SLE 환자에게서 발견될 AutoAb 특이성의 축적과의 더 강한(스피어만) 상관관계를 갖는 그와 같은 전환되지 않은 매개체에 영향을 준다는 점이다. LDAII(각 용해성 매개체에 의해 제공된 하위 점수의 총합으로 계산됨)가 저활성 질병 활성도를 가진 SLE 환자 및 대조군 시료와 비교하여, 활성 임상적 질병을 앓는 SLE 환자에서 유의미하게 더 높았다(도 7a). 예컨대 상기 알고리즘에서 건강한 개인은 저활성 질병 활성도를 가진 SLE 환자의 최적의 구별을 가능하게 한다. 중요한 점은 LDAII가 hSLEDAI 점수(r=0.226, p<0.0001)와 유의미하게 상관관계가 있고, 대조군과 활성 질병 또는 저활성 질병 활성도를 가진 SLE 환자를 구별짓고(AUC = 0.671, p=0.0001), 그리고 79% 특이성 및 49% 민감도를 갖는 0.94의 양성 예측도(PPV)를 제공한다는 점이다(도 7b). 이와 같은 데이터는 추가적인 면역 조절장애가 임상적 질병 활성도와 연관이 있으며, 임상적 치료에 영향을 줄 수 있는 잠재력을 가진 LDAII를 형성하는 데 이와 같은 이질성 조절장애가 활용될 수 있다는 점을 시사한다.
LDAII가 임상학적 및 혈청학적 활성 질병 및 휴지기 질병을 앓는 SLE 환자를 구별짓는다. 임상적 질병 활성도(hSLEDAI) 점수를 기반으로 면역 조절장애의 차이를 평가하는 것과 더불어, 본 발명의 발명가들은 또한 대조군과 비교하여, LDAII가 혈청학적으로 활성(SA) 질병 대 휴지기 질병(SQ)(면역학적 질병 활성도 기준(항-dsDNA 결합 AutoAbs 및/또는 낮은 보체 수치)(14, 15)에 부합하는지로 정의됨)과 조합하여 임상적 활성(CA) 대 휴지기(CQ) 질병을 구별지을 수 있는지 여부를 평가하였다(도 8a~8f). 임상적 활성 질병(CASA)을 앓는 SLE 환자가 임상학적 휴지기 질병(CQSQ)을 앓는 SLE 환자보다 LDAII 점수가 유의미하게 더 높았다. 양쪽 SLE 환자 그룹 모두 0.88의 PPV, 79% 특이성 및 71% 민감도(AUC = 0.804 [p<0.0001])로, 대조군(도 8a)과 유의미하게 구별되었다(도 8b). 이와 같은 데이터는 SLE 환자에서 이질적으로 변경된 수많은 면역 경로에 의해 영향을 받은 면역 지수가 상승된 임상적 질병 활성도를 가진 환자를 식별할 수 있음을 시사한다. 더불어, 본 발명의 발명가들은 CASA SLE 환자에서의 매개체(p<0.01), 예컨대 IL-6(도 8c), IL-8(도 8d) 및 IP-10(도 8e)의 수치 증가 뿐만 아니라, SLE-연관 AutoAb 특이성의 수 증가(도 8f)도 관찰하였다. 흥미롭게도, 여러 CQSQ 환자가 최소한 하나의 AutoAb 특이성에 대해 여전히 양성이고, 임상학적 및 혈청학적 휴지기임에도 불구하고, 염증성 매개체가 대조군보다 더 높다.
LDAII가 질병 활성도의 신장 장기 징후를 갖는 SLE 환자를 구별짓는다. 만성 면역 조절장애, 예컨대 병리학적 자가항체 생산 및 염증성 매개체의 수치 증가가 진행 중인 말기 장기 손상에 기여한다. SLE의 가장 심각한 후유증에는 신장 손상 및 루푸스 신장염이 포함되고, 이것이 SLE-관련 질병의 발병률 및 사망률(58)에 실질적으로 기여한다. 영구적 장기 손상의 위험을 최소화하고 신장 기능을 보존하기 위해, 신장 손상의 조기 발견 및 치료가 반드시 이루어져야 한다. 본 발명의 발명가들은 LDAII가 활성 질병을 앓는 SLE 환자에 존재하는 신장 관여가 있는 SLE 환자를 구별지을 수 있는지 여부를 평가하였다(도 9a~9e)(표 3). 본 발명의 발명가들은 활성 질병 및 신장 징후를 앓는 SLE 환자가 신장 징후가 없이 활성 질병을 앓는 SLE 환자보다 LDAII 점수가 유의미하게 더 높음(p=0.0099)(도 9a)을 밝혔다. 신장 징후의 존재(p=0.0002) 또는 부재(p=0.0359) 하의 활성 질병을 갖는 SLE 환자가, 저활성 질병 활성도(도 9a)를 갖는 SLE 환자보다, LDAII 점수가 0.96의 NPV, 49% 특이성 및 88% 민감도(AUC = 0.689 [p=0.0029])로 더 높았다(도 9b). AutoAb 특이성의 수(도 9e) 뿐만 아니라 SCF(도 9c) 및 TNFRII(도 9 d)도 질병 활성도의 신장 징후를 보이지 않는 환자와 비교하여, 활성 질병과 신장 징후를 앓는 SLE 환자에서 증가되었다(p<0.001 대 비-신장/활성 질병; p<0.01 대 저활성 질병 활성도 방문). 이와 더불어, 활성 질병을 앓지만 신장 징후가 없는 SLE 환자는 저활성 질병 활성도를 가진 SLE 환자보다 존재하는 SLE-연관 AutoAb 특이성이 더 많았다(p=0.0261, 도 9e). 이들 데이터는 LDAII에 영향을 미치기 위해 면역 조절장애를 활용하는 것이 루푸스 신장염 및 말기 신장 질병(ESRD)의 진전, 질병의 발병률 및 조기 사망률을 방지하기 위해 좀 더 면밀한 임상적 모니터링에서 혜택을 받을 수 있는 신장 징후가 있는 SLE 환자를 식별하는 데 유용할 수 있음을 시사한다.
활성 질병이 SLE 환자에게 지속적으로 부담이 되고, 심지어 오래된 질병을 앓는 환자들의 경우(19)에도 삶의 질에 영향을 미친다(59). 시간이 경과하면서 질병 활성도가 증가함이 보여진 바 있고, 저활성 질병 활성도를 갖는 환자들 중 다수가 장기 손상과 조기 사망률 모두와 연관(24, 25, 60)되어, SLE의 최적의 관리의 차이를 부각시키는 활성 질병(19)에 걸린다. 궁극적인 목표는 장기 징후가 더 적고 영구적 장기 손상이 더 낮으며, 유의미한 부작용과 질병의 발병률을 수반하는 치료가 더 적고, 사망률이 더 낮음으로써, 결과 및 예후를 개선(61)함을 보인 바 있는 저활성 질병 활성도로 환자들을 이동시키는 것이다.
조직 및 장기 손상을 방지하기 위한 발견 및 조기 치료는, 질병 활성도의 조짐 및 증상이 발생된 후 포착되기 때문에, 어려운 숙제이다. 게다가, 질병 활성도를 관리하기 위해 필요한 스테로이드(23)와 기타 면역-억제제(27)의 장기 사용이 질병의 발병률의 증가와 연관이 있다. 임상적 질병을 적극적으로 관리할 수 없는 무능력이 반응적 치료에 대한 의료적 돌봄을 제한하고, 이 때문에 말기 장기 손상을 방지 (6~8)하고 SLE의 병리학적 및 사회경제학적 부담(29)을 축소시키기 위해 스테로이드를 적게 쓰는 면역 변형제제(28)를 추가하거나 또는 증가시키는 적극적인 전략이 배제된다. 본 발명의 발명가는 이전에 SLE-연관 AutoAb 특이성(36, 37, 50)의 축적과 함께, 여러 면역 경로의 조절장애(36, 37)가 분류된 SLE로의 전개 및 이행의 기저를 이룸을 입증한 바 있다. 본 발명의 발명가들은 추가적인 면역 조절장애가 임상적 질병 활성(flare)에 앞서 발생하고, 루푸스 활성(flare) 예측지수(42, 45)의 출현에 의해 면역 경로 조절장애 및 임상적 질병의 이질성이 활용될 수 있음을 추가로 보여준 바 있다. 흥미롭게도, 이 지수는 동시에 발생하는 임상적 질병 활성도에 영향을 미치지 않았다(42, 45).
본 발명의 발명가들은 진행 중인 임상적 질병 활성도를 반영하는 기저 면역 조절장애를 결정하고 현재 임상적 질병 활성도 도구를 보완하는 면역 지수에 영향을 미치는 정보를 활용하고자 하였다. 현재의 연구 내에서, 본 발명의 발명가들은 활성 대 저활성 질병 활성도를 갖는 SLE 환자 시료에서 변경된 면역 경로의 수와 유형에서의 이질성을 관찰하였다. 이것은, 단독으로 또는 조합하여, 질병 활성도의 제안된 혈청학적 표지, 예컨대 항-dsDNA, 보체, 보체 분열(split) 생성물 및 염증성 표지 (ESR 및 CRP)(65-67)와의 일관되지 않은 상관관계 및 제한적인 임상적 활용 뿐만 아니라, 이전 보고서(62~64)에서의 활성 질병을 앓는 SLE 환자에서 염증성 매개체의 변동성을 부분적으로 설명한다. 면역 경로 관여에서의 이질성에도 불구하고, 각각의 환자가 최소한 하나의 경로에서 염증성 매개체의 상승을 입증하였다. IFN-연관 매개체가 영향을 받지 않았다는 점, 예컨대 유형 I IFN(IFN-α), 유형 II IFN(IFN-γ 및 IFN-연관 케모카인(IP-10, SLE 환자에 존재하는 잘 기술된 IFN 특징(68)을 고려할 때)의 변경이 그리 놀랍지 않았다. IFN-연관 매개체는, 환자의 하위집합에서, SLE-연관 AutoAbs의 존재와 관련할 뿐만 아니라, 질병 활성도(저활성 대 활성, 임상학적/혈청학적 휴지기 대 활성)와 관련하여 직접적으로 영향을 받았다. 이와 같은 발견은 IFN 경로가 질병 활성도(69)를 반영함을 보여주는 이전 연구들에 의해 뒷받침되고, 환자의 하위집합에서 AutoAbs의 존재 여부에 의존하지만(70), 보편적으로 동시에 발생하는 임상적 질병 활성도를 설명하지는 않는다(71).
질병 활성도 측정치와 직접적으로 상관관계가 없지만, AutoAb 특이성의 축적과 상관관계가 있고 AutoAb 양성 대 음성 SLE 환자 내에서 저활성 대 활성 질병 클리닉 방문자를 구별지을 수 있는 수많은 매개체가 있었다. B-림프구 활성화 및 AutoAb 생산에 기여하는 TNF 상과 매개체, BLyS 및 APRIL(72~74)이 이와 같은 범주에서 주목할 만하였다. BLyS 수치는 루푸스-연관 자가항체 특이성(37)의 축적과 상호작용하는 유형 I(51) 및 유형 II(52) IFN 매개체의 조기 조절장애에서 발생할 수 있다. 본 발명의 발명가들은 APRIL 뿐만 아니라 BlyS가 IFN-연관 매개체(도 3~4)와 유사하게 활성 질병을 앓는AutoAb 음성 대 양성 SLE 환자를 구별지음을 관찰하였다. 그러나 APRIL 역시 AutoAb 음성 환자(활성 < 저활성 질병 활성도)와 AutoAb 양성 환자(활성 > 저활성 질병 활성도)에서 질병 활성도(저활성 대 활성)를 구별지을 수 있었다. 일부 경우에(AutoAb 음성 시료) BlyS의 이와 같은 일탈과 다른 경우(AutoAb 양성 시료)에서의 수렴이 SLE에서의 기타 연구에 의해 뒷받침되고(72, 75~78), BlyS와 APRIL이 활용하는 독특하고 중첩되는 수용체에 의해 설명될 수 있다(72, 73, 79-82). BlyS와 APRIL이 공유하는 이와 같은 수용체/경로는 수렴하는 하류 이벤트(AutoAb 생산)로 이어질 가능성이 있는 반면, 일탈하는 수용체-신호전달 경로 메커니즘(예를 들어 APRIL-TACI 상호작용(80))은, 본 발명의 발명가들이 AutoAb 음성 SLE 시료에서 봤듯이, 부정적 조절에서 APRIL의 명백한 역할에 기여할 수 있다(도 4a~4d).
루푸스 질병 활성도와 관련하여 표면상 이중 항-및 친-염증성 기능을 갖는 용해성 매개체의 또 다른 쌍은 IL-10과 TGF-β이다. 이들 매개체 모두 조절 기능을 가짐이 밝혀진 바 있고(83~88), 본 발명의 발명가들은 IL-10이 저활성 질병 활성도를 갖는 AutoAb 음성 SLE 환자에게서 가장 높고(도 6a~6d), 반면 TGF-β가 건강한 대조군에서 가장 높음을 관찰하였는데, 이는 SLE 환자에서 조절의 상실을 가리킨다(87, 88). 반대로, 활성 질병을 앓는 SLE 환자는 AutoAb 양성(대 음성) 시료에서 IL-10과 TGF-β의 수치가 증가한다(도 6a~6d). IL-10은 B-림프구 활성화 및 AutoAb 생산과 관련하여 친 염증성 특성을 가짐이 밝혀진 바 있고(89), 반면 TGF-β는 IL-21 분비를 유발시키는 IL-6(90, 91)의 존재 하에 Th17-유형 반응 및 AutoAb 생산 및 SLE 발병기전(92, 93)에 기여하는 B-림프구의 자극에 기여하는 것으로 밝혀진 바 있다.
이와 같은 면역계 변화는, 루푸스 활성(flare) 예측 지수(42, 45)를 형성하면서 배운 교훈과 함께, 용해성 매개체 변경에 의해 영향을 받고, SLE-연관 AutoAb 축적과의 상관관계에 의해 가중치를 부여받는 루푸스 질병 활성도 면역 지수(LDAII)를 개발하도록 우리를 이끌어주었다. 질병 활성도 평가에서의 변동성을 최소화하기 위한 특별한 훈련의 시간 및 요구(31, 35)가 종종 일상적인 임상적 진료에서 입증된 SLE 질병 활성도 측정치의 사용을 제한한다. LDAII에 영향을 미치기 위해 활용되는, 지속되는 임상적 질병 활성도와 연관된 면역계 변화의 검출은 더욱 면밀한 모니터링을 필요로 하는 환자의 식별을 가능하게 하고, 말기 장기 손상을 방지하기 위해(6~8) 면역 변형 치료를 이용한 조기 개입을 가능하게 한다. 양성 점수는 좀더 자주 모니터링할 필요(94) 및/또는 새로운 또는 악화되는 임상적 징후의 시작에 앞서 진행 중인 염증을 바꾸기 위한 약물의 변화를 시사할 것이다. 음성 점수는 진행 중인 모니터링 및 약물 일정(약물이 효과적인 경우)의 유지, (특히 방문이 최소한 분기별로 이루어질 경우)모니터링의 회수 감소 필요성, 및/또는 유의미한 부작용을 가져오는 스테로이드(23) 또는 기타 면역 변형제제(27)를 줄이는 것에 대한 고려를 시사할 것이다. 임상 치료에 보다 적극적으로 참여하는 SLE 환자는 영구적 장기 손상(95)이 적다는 것이 밝혀진 바 있다. LDAII로 인해 임상적 질병 활성도를 배제하는 면역 활성도에 대해 환자가 모니터링 받을 수 있고, 환자와 의료 제공자가 추가적인 임상적 평가에 대한 필요성에 예민하게 대응할 수 있다.
상승된 질병 활성도의 위험에 처한 임상학적 휴지기 SLE 환자는 규칙적으로 모니터링받아야 한다(14). 활성 질병을 앓는 SLE 환자가 hSLEDAI 혈청학적 기준(DNA 결합 및/또는 저보체혈증 증가)에 좀 더 부합할 수 있고 항-dsDNA AutoAbs에 양성일 수 있으나(표 3), 이들 인자들 중 어느 것도 상승된 임상적 질병 활성도의 예측자임이 밝혀진 바 없다(14, 42, 45). 중요한 점은 LDAII가, hSLEDAI 질병 활성도 점수만(도 1~2)을 사용할 때보다, 임상학적 및 혈청학적 휴지기(CQSQ) 대 활성(CASA) 질병(도 8a~8f)을 앓는 환자 사이에 존재하는 SLE-연관 AutoAbs의 수 뿐만 아니라 IL-6, IL-8 및 IP-10 수치의 더 큰 차이로, CQSQ 대 CASA 질병(도 8a~8f)을 앓는 환자를 구별할 수 있다는 점이다. 이와 더불어, LDAII가 신장 징후를 보인 활성 질병을 앓는 SLE 환자를 구별할 수 있다(도 9a~9e). 본 발명은 경로-특이적 면역 조절장애의 분석이 신장 징후 및 루푸스 신장염(LN)을 앓는 SLE 환자에 대한 개인맞춤형의 정밀한 약물을 가능하도록 허용한다. 추가적으로, 본 발명은 LN이 생길 가장 큰 위험에 처한 개인을 식별하고, 경로-특이적 면역 조절장애의 측정치를 정의하여 주어진 경로-특이적 생물학적 치료에 가장 적합한 LN 환자를 선택하는 것을 가능하게 한다. 신장 관여가 있는 SLE 환자의 현재 평가에서 변경된 두 가지 매개체는 SCF와 TNFRII(도 9a~9e)이다. SCF와 그것의 수용체 c-kit와의 상호작용이 신장 손상, 예컨대 사구체신염 및 신부전에 기여함이 이전에 밝혀진 바 있다(96, 97). 정상적으로 림프구에 존재하는 TNFRII(98-100)은 만성 염증의 상황에서, 예컨대 신장에서, 비정상적으로 상향조절되어, 염증, 신장 손상 및 신부전에 기여한다(101~104).
임상적 질병 활성도의 반영으로서 면역 상태의 변화를 검출하는 능력은 질병 감시 및 치료의 개선을 가능하게 하고, 이것은 환자의 치료 결과를 개선하고 SLE의 병리학적 및 사회경제학적 부담을 축소시킬 수 있다(29). 본 발명의 특별한 기술적 효과는 양성을 수립하기 위해 각 용해성 매개체에 대한 컷오프를 필요로 하지 않고, 및/또는 특정 환자의 질병 활성도에 기여하는 염증성 경로에 대한 사전 지식을 요구하지 않는 환자의 LDAII를 계산한다는 점이다. 본 발명은 SLE 임상실험 및 질병 관리에서 전망적인 다민족 연구에서 추가로 입증될 수 있다. 개별 환자의 포괄적인 임상적 그림에 따라, 상승된 임상적 질병 활성도 및 장기 손상에 대한 위험의 조기 발견이 더 면밀한 모니터링, 하나 이상의 예방차원의 치료의 선택 또는 LDAII 내에서 변경되는 경로와 관련된 표적 생물제제에 대한 임상 실험에 포함을 촉진한다.
본 명세서에서 논의된 모든 구현예는 본 발명의 모든 방법, 키트, 시약 또는 조성물관 관련하여 이행될 수 있고, 반대로도 이루어짐이 고려된다. 더 나아가, 본 발명의 조성물은 본 발명의 방법을 달성하기 위해 사용될 수 있다.
본원에 기술된 특정 구현예는 예시의 방식으로 보여진 것이지, 본 발명을 제한하는 것이 아님이 이해될 것이다. 본 발명의 주요 특징들이 본 발명의 범위에서 벗어나지 않으면서 다양한 구현예에 활용될 수 있다. 당해기술의 숙련가는 단지 일상적인 실험을 사용하여, 본원에 기술된 구체적 절차와 동등한 여러 등가물을 인식하거나 또는 확인할 수 있을 것이다. 이와 같은 등가물은 본 발명의 범위 내에 있다고 간주되며, 청구항에 의해 포함된다.
본 명세서에서 언급된 모든 문헌 및 특허출원은 본 발명과 관련된 당해기술의 숙련가의 기술 수준을 보여준다. 모든 문헌 및 특허 출원은 본원에 개별적인 각 문헌 또는 특허 출원이 구체적으로 그리고 개별적으로 참조로 편입되었음이 표시되는 한, 참조로 본원에 편입된다.
청구항 및/또는 명세서에서 용어 "포함하는(comprising)"과 연계하여 사용될 경우, 단어 "a" 또는 "an"의 사용은 "하나"를 의미할 수 있으나, 또한 "하나 이상", "적어도 하나" 및 "둘 이상"의 의미와 일치할 수도 있다. 청구항에서 용어 "또는"의 사용은 대안만을 가리킨다고 명백하게 표시되지 않는 한, 또는 대안이 상호 배타적이지 않는 한 "및/또는"을 의미하기 위해 사용되는데, 그러나 본 개시는 오로지 대안을 그리고 "및/또는"을 가리키는 정의를 뒷받침한다. 본 출원 전체를 통해, 용어 "약"은 하나의 값이 장치, 상기 값을 결정하기 위해 활용되는 방법, 또는 연구 주제들 중에 존재하는 변동에 대한 오차의 본질적인 변동을 포함함을 표시하기 위해 사용된다.
본 명세서 및 청구항에 사용된 바와 같이, 단어 "포함하는"("포함하다"와 같이 포함하는의 모든 형태), "가지는"("가지다"와 같이 가지는의 모든 형태), "포함하는(including)"("포함하다"와 같이 포함하는의 모든 형태), "함유하는"("함유하다"와 같이 함유하는의 모든 형태)이 포함하거나 개방적이며, 언급되지 않은 추가적 요소 또는 방법 단계들을 배제하지 않는다. 본원에 제공된 모든 조성물 및 방법의 구현예에서, "포함하는"은 "필수적으로 ~으로 이루어지는" 또는 "~으로 이루어지는"으로 교체될 수 있다. 본원에 사용된 어구 "필수적으로 ~으로 이루어지는"은 청구된 발명의 특성 또는 기능에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것 뿐만 아니라 명시된 정수(들) 또는 단계들을 필요로 한다. 본원에 사용된 용어 "이루어지는"은 언급된 정수(예를 들면, 특성, 요소, 특징, 속성, 방법/과정 단계 또는 제한) 또는 정수들의 무리(예를 들면, 특성(들), 요소(들), 특징(들), 속성(들), 방법/과정 단계들 또는 제한(들))만의 존재를 가리키기 위해 사용된다.
본원에 사용된 용어 "또는 그들의 조합물"은 상기 용어에 앞서 나열된 항목들의 순열 및 조합을 가리킨다. 예를 들면, "A, B, C 또는 그들의 조합물"에는 최소한 하기 중 하나가 포함되는 것이고: A, B, C, AB, AC, BC 또는 ABC, 만약 특정한 상황에서 순서가 중요하다면, BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC 또는 CAB가 포함된다. 상기 예에서 계속하여, 하나 이상의 항목 또는 용어의 반복체를 함유하는 조합물, 예컨대 BB, AAA, AB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB 등이 명백히 포함된다. 숙련가는 문맥 상 달리 명백하지 않는 한, 전형적으로 모든 조합에 항목 또는 용어의 수에 제한이 없음을 이해할 것이다.
본원에 사용된 근사치의 단어들, 예컨대 비제한적으로, "약", "실질적인" 또는 "실질적으로"는 그렇게 수식될 때 반드시 절대적이거나 또는 완벽하지 않음이 이해되지만, 존재하는 조건을 지명함을 보장하기 위해 당해기술의 숙련가에게 충분히 근사값으로 간주되는 조건을 가리킨다. 본 설명이 얼마나 달라질 수 있는지는 얼마나 큰 변화가 도입되는지에 달려 있고, 그것은 당해기술의 숙련가가 변형된 특성이 변형되지 않은 특성의 필수 특징 및 능력을 여전히 가지고 있음을 인식하게 한다. 일반적으로, 본원에서 "약"과 같은 근사치의 언어에 의해 수식되는 수치값은, 앞서 논의에 영향을 받지만, 언급된 값에서 최소한 ±1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 12 또는 15% 정도 달라질 수 있다.
본원에 개시되고 청구된 모든 조성물 및/또는 방법은 본 개시의 측변에서 과도한 실험 없이 제조 및 시행될 수 있다. 본 발명의 조성물과 방법이 바람직한 구현예의 관점으로 기술되었으나, 본 발명의 개념, 원리 및 범위에서 벗어나지 않으면서, 상기 조성물 및/또는 방법에, 그리고 본원에 기술된 방법의 단계들 또는 단계의 순서에 변형이 가해질 수 있음이 당해기술의 숙련가에게 명백할 것이다. 당해기술의 숙련가에게 명백한 이와 같은 유사한 치환물 및 변형은 첨부된 청구항에 의해 정의된 바에 의해, 본 발명의 원리, 범위 및 개념 내에 속하는 것으로 간주된다.
본원에 첨부된 청구항을 해석할 때 특허청과, 본 출원에 발표된 모든 특허의 독자들을 돕기 위해, 출원인은 특정 청구항에서 단어 "~을 위한 수단" 또는 "~을 위한 단계"가 명백하게 사용되지 않는 한, 본원의 출원 일자에 존재하 듯이, 첨부된 청구항 중 어느 것도 35 U.S.C. §112의 단락 6, U.S.C. §112 단락(f), 또는 등가물을 발동시키기 위해 의도된 것이 아님을 언급하고자 한다.
각 청구항의 경우, 각 종속항은 독립항에, 그리고 앞선 청구항이 청구 용어 또는 요소에 대한 적절한 선행 근거를 제공하는 한, 각각의 청구항에 대한 앞선 종속항 각각에 종속될 수 있다.
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Claims (25)

  1. 전신 홍반성 낭창 환자(SLE)의 질병 활성도를 특징 규명하는 방법으로서,
    (a) 상기 환자에서 혈액, 혈청, 혈장 또는 소변 시료와 연관된 데이터 집합을 획득하되, 상기 데이터 집합이 (b) 내지 (g) 각각에서의 혈액, 혈청, 혈장 또는 소변 시료 중 하나 이상의 생체지표의 수치를 나타내는 데이터를 포함하는 것인 단계;
    (b) IL-1α, IL-1β, IL-1RA, IFN-α, IL-12p70, IL-6 및 IL-23p19에서 선택된 최소한 하나의 본래(innate) 혈청 또는 혈장 매개체 생체지표의 단백질 발현의 존재 여부 또는 그것의 양에 대해 상기 데이터 집합을 평가하는 단계;
    (c) IL-2, IFN-γ, IL-5, IL-13, IL-17A, IL-21, IL-10 및 TGF-β에서 선택된 최소한 하나의 적응성 혈청 또는 혈장 매개체 생체지표의 단백질 발현의 존재 여부 또는 그것의 양에 대해 상기 데이터 집합을 평가하는 단계;
    (d) IL-8/CXCL8, IP-10/CXCL10, MIG/CXCL9, MIP-1α/CCL3, MIP-1β/CCL4, MCP-1/CCL2, MCP-3/CCL7 및 ICAM-1에서 선택된 최소한 하나의 케모카인/부착 분자 생체지표의 존재 여부 또는 그것의 양에 대해 상기 데이터 집합을 평가하는 단계;
    (e) TNFRI, TNFRII, TRAIL, TWEAK, CD40L/CD154, BLyS 및 APRIL에서 선택된 최소한 하나의 용해성 TNF 상과(superfamily) 생체지표의 존재 여부 또는 그것의 양에 대해 상기 데이터 집합을 평가하는 단계;
    (f) 염증성 매개체 생체지표 SCF의 존재 여부 또는 그것의 양에 대해 상기 데이터 집합을 평가하는 단계;
    (g) dsDNA, 염색질, RiboP, Ro/SSA, La/SSB, Sm, SmRNP 및 RNP에서 선택된 최소한 하나의 SLE-연관 자가항체 특이성 생체지표의 존재 여부 또는 그것의 양에 대해 상기 데이터 집합을 평가하는 단계; 및
    (h) 루푸스 질병 활성도 면역 지수(LDAII) 점수를
    1. 32개 기준선 혈장 매개체 전부의 농도(표 2)를 각각의 SLE 환자 또는 대조군 방문자에 대해 로그전환하고,
    2. 각 참여 방문자에 대한 각각의 로그전환된 용해성 매개체 수치를 표준화하고: (관측값)-(모든 SLE 환자와 대조군 방문자의 평균 값)/(SLE 환자와 대조군 방문자의 표준 편차),
    3. 모든 SLE 환자 및 대조군 방문자에서 평가된 각각의 용해성 매개체에 대한 자가항체(AutoAb) 특이성의 수 사이의 연관성을 검사하는 선형 회귀 모델에서 스피어만 상관계수를 생성하고(스피어만 r),
    4. 그들 각각의 스피어만 상관계수(스피어만 r)에 의해 상기 전환 및 표준화된 용해성 매개체 수치에 가중치를 부여(곱셈)하고,
    5. 각 참여 방문자 경우, 32개 용해성 매개체 각각에 대한 상기 로그 전환되고, 표준화되고 및 가중치가 부여된 값을 합산하여 총 LDAII를 계산함으로써, 계산하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 최소한 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 또는 39개 생체지표가 상기 LDAII의 계산에 사용되는, 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 데이터 집합이 로그전환되고; 표준화되고; 상기 표준화된 데이터 집합에서 자가항체 특이성에 대한 스피어만 r 상관에 의해 가중치가 부여되고, 용해성 단백질 표지의 총합이 LDAII 점수와 같은, 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 최소한 하나의 면역측정법의 수행이 제1 시료를 획득하되, 상기 제1 시료가 단백질 표지를 포함하는 것인 단계; 상기 제1 시료를 다수의 구별되는 시약과 접촉시키는 단계; 상기 시약과 표지 사이에 다수의 구별되는 복합체를 생성하는 단계; 및 상기 복합체를 검출하여 상기 데이터를 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 최소한 하나의 면역측정법이 멀티플렉스 측정법을 포함하는, 방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 LDAII가 SLE의 중등도 또는 진행 수준을, 혈청학적(dsDNA 결합 및 적은 보체) 활성(SA) 또는 혈청학적 휴지기(SQ)인 임상적 활성(CA) 또는 임상적 휴지기(CQ)로 나누는, 방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 LDAII 점수가 활성 및 저활성 루푸스 질병 활성도 사이에서 구별되는, 방법.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 환자에게 분류된 SLE로의 이행에 대한 예후가 있음을 결정한 후 임상적 질병 분류에 도달하기에 앞서, 상기 환자에게 치료를 시행하되, 상기 치료가 하이드록시클로로퀸(HCQ), 벨리무맙, 비스테로이드성 항염증 약물, 스테로이드 또는 질병 변형 항류마티즘 약물(DMARD) 중 최소한 하나를 포함하는 것인 단계를 추가로 포함하는 방법.
  9. 환자의 질병 활성도 및 전신 홍반성 낭창(SLE) 임상적 질환의 진행을 평가하는 방법으로:
    상기 환자에게서 혈액, 혈청, 혈장 또는 소변 시료를 획득하는 단계;
    상기 환자의 시료에 최소한 하나의 면역측정법을 수행하여 하기 (1) 내지 (6) 각각에서 최소한 하나의 생체지표를 포함하는 데이터 집합을 생성하는 단계:
    (1) IL-1α, IL-1β, IL-1RA, IFN-α, IL-12p70, IL-6 및 IL-23p19에서 선택된 최소한 하나의 본래 혈청 또는 혈장 매개체 생체지표의 단백질 발현의 존재 여부 또는 그것의 양에 대해 상기 데이터 집합을 평가하는 단계;
    (2) IL-2, IFN-γ, IL-5, IL-13, IL-17A, IL-21, IL-10 및 TGF-β에서 선택된 최소한 하나의 적응성 혈청 또는 혈장 매개체 생체지표의 존재 여부 또는 그것의 양에 대해 상기 데이터 집합을 평가하는 단계;
    (3) IL-8/CXCL8, IP-10/CXCL10, MIG/CXCL9, MIP-1α/CCL3, MIP-1β/CCL4, MCP-1/CCL2, MCP-3/CCL7 및 ICAM-1에서 선택된 최소한 하나의 케모카인/부착 분자 생체지표의 존재 여부 또는 그것의 양에 대해 상기 데이터 집합을 평가하는 단계;
    (4) TNFRI, TNFRII, TRAIL, TWEAK, CD40L/CD154, BLyS 및 APRIL에서 선택된 최소한 하나의 용해성 TNF 상과 생체지표의 존재 여부 또는 그것의 양에 대해 데이터 집합을 평가하는 단계;
    (5) 염증성 매개체 생체지표 SCF의 존재 여부 또는 그것의 양에 대해 상기 데이터 집합을 평가하는 단계; 및
    (6) dsDNA, 염색질, RiboP, Ro/SSA, La/SSB, Sm, SmRNP 및 RNP에서 선택된 최소한 하나의 SLE-연관 자가항체 특이성 생체지표의 존재 여부 또는 그것의 양에 대해 상기 데이터 집합을 평가하는 단계; 및
    LDAII 점수를 계산하는 단계를 포함하는 방법.
  10. 청구항 9에 있어서, 최소한 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 또는 39개 생체지표가 상기 LDAII의 계산에 사용되는, 방법.
  11. 청구항 9에 있어서, 상기 데이터 집합이 로그 전환되고; 표준화되고; 상기 표준화된 데이터 집합에서 자가항체 특이성에 대한 스피어만 r 상관에 의해 가중치가 부여되고, 상기 용해성 단백질 표지의 총합이 루푸스 질병 활성도 면역 지수(LDAII) 점수와 같은, 방법.
  12. 청구항 9에 있어서, 상기 최소한 하나의 면역측정법의 수행이 제1 시료를 획득하되, 상기 제1 시료가 단백질 표지를 포함하는 것인 단계; 상기 제1 시료를 다수의 구별되는 시약과 접촉시키는 단계; 상기 시약과 표지 사이에 다수의 구별되는 복합체를 생성하는 단계; 및 상기 복합체를 검출하여 상기 데이터를 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
  13. 청구항 9에 있어서, 상기 최소한 하나의 면역측정법이 멀티플렉스 측정법을 포함하는, 방법.
  14. 청구항 9에 있어서, 상기 LDAII가 SLE의 중등도 또는 진행 수준을 혈청학적(dsDNA 결합 및 적은 보체) 활성(SA) 또는 혈청학적 휴지기(SQ)인 임상적 활성(CA) 또는 임상적 휴지기(CQ) 질병으로 나누는, 방법.
  15. 청구항 9에 있어서, 상기 LDAII 점수가 활성 및 저활성 루푸스 질병 활성도 사이에서 구별되는, 방법.
  16. 청구항 9에 있어서, 상기 환자에게 분류된 SLE로의 이행에 대한 예후가 있음을 결정한 후 임상적 질병 분류에 도달하기에 앞서 상기 SLE 환자에게 치료를 시행하되, 상기 치료가 하이드록시클로로퀸(HCQ), 벨리무맙, 비스테로이드성 항염증 약물, 스테로이드 또는 질병 변형 항류마티즘 약물(DMARD) 중 최소한 하나를 포함하는 것인 단계를 추가로 포함하는 방법.
  17. 청구항 9에 있어서, 상기 시료와 연관된 제1 데이터 집합을 획득하는 단계가 상기 시료를 획득하고 상기 시료를 가공하여 실험적으로 제1 데이터 집합을 결정하는 단계를 포함하거나, 또는 상기 시료와 연관된 제1 데이터 집합을 획득하는 단계가 상기 시료를 가공하여 실험적으로 제1 데이터 집합을 결정한 바 있는 제3자에게서 상기 제1 데이터 집합을 받는 단계를 포함하는, 방법.
  18. 청구항 9에 있어서, SCF, TNFRII 및 MCP-1 생체지표의 증가가 신장 기관 관여를 나타내는, 방법.
  19. 한 개체에서 생체지표 집합의 발현 수준을 측정함으로써 루푸스 질병 활성도 면역 지수(LDAII)를 계산하는 방법으로, 하기 단계를 포함하는 방법:
    생리학적 시료에서 면역측정법에 의해 생체지표 집합의 생체지표 측정치를 결정하되, 상기 생체지표가 펩타이드, 단백질, 펩타이드를 품은 번역후 변형, 단백질을 품은 번역후 변형, 또는 이것의 조합물을 포함하고; 상기 생리학적 시료가 전혈, 혈액 혈장, 혈액 혈청 또는 이들의 조합물이고; 생체지표 집합이 하기에서 선택된 생체지표들의 각각의 범주 중 최소한 하나에서 선택된 측정치의 데이터 집합을 포함하는 단계:
    IL-1α, IL-1β, IL-1RA, IFN-α, IL-12p70, IL-6 및 IL-23p19에서 선택된 최소한 하나의 본래 혈청 또는 혈장 매개체 생체지표 데이터 집합의 단백질 발현의 존재 여부 또는 그것의 양;
    IL-2, IFN-γ, IL-5, IL-13, IL-17A, IL-21, IL-10 및 TGF-β에서 선택된 최소한 하나의 적응성 혈청 또는 혈장 매개체 생체지표 데이터 집합의 단백질 발현의 존재 여부 또는 그것의 양;
    IL-8/CXCL8, IP-10/CXCL10, MIG/CXCL9, MIP-1α/CCL3, MIP-1β/CCL4, MCP-1/CCL2, MCP-3/CCL7 및 ICAM-1에서 선택된 최소한 하나의 케모카인/부착 분자 생체지표 데이터 집합의 존재 여부 또는 그것의 양;
    TNFRI, TNFRII, TRAIL, TWEAK, CD40L/CD154, BLyS 및 APRIL에서 선택된 최소한 하나의 용해성 TNF 상과 생체지표 데이터 집합의 존재 여부 또는 그것의 양;
    염증성 매개체 생체지표 SCF의 존재 여부 또는 그것의 양; 및
    dsDNA, 염색질, RiboP, Ro/SSA, La/SSB, Sm, SmRNP 및 RNP에서 선택된 최소한 하나의 SLE-연관 자가항체 특이성 생체지표 데이터 집합의 존재 여부 또는 그것의 양; 및
    LDAII 점수를 계산하되, 이로써 상기 데이터 집합이 로그 전환되고; 표준화되고; 표준화된 데이터 집합에서 자가항체 특이성에 대한 스피어만 r 상관에 의해 가중치가 부여되고, 상기 용해성 단백질 표지의 총합이 LDAII 점수와 같은 것인 단계.
  20. 청구항 19에 있어서, 분류 체계에서 생체지표 측정치의 집합을 사용하여 전신 홍반성 낭창(SLE)의 존재 또는 발달과 관련된 시료를 상기 개체에서 혈청학적(dsDNA 결합 및 적은 보체) 활성(SA) 또는 혈청학적 휴지기(SQ)인 임상적 활성(CA) 또는 임상적 휴지기(CQ) 질병으로 분류하되, 상기 분류 체계가 피셔의 정확 검정, 맨-휘트니 검정, 크루스칼-왈리스 검정, 던의 다중비교를 포함하는 크루스칼-왈리스 검정, 스피어만 순위 상관 또는 이들의 조합에서 선택된 분류 및 회귀 트리를 포함하는 머신러닝 시스템인 단계; 및
    상기 루푸스 질병 활성도 면역 지수(LDAII)를 계산하되, 상기 LDAII 점수가 활성 SLE와 저활성 SLE 질병 활성도(저활성 임상적 질환(SLEDAI < 4)) 사이에서 구별되는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  21. 청구항 19에 있어서, 건강한 대조군과 비교하여 임상학적 및 혈청학적 휴지기(CQSQ) SLE 환자를 구별하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  22. 청구항 19에 있어서, 최소한 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 또는 39개 생체지표의 양이 상기 LDAII의 계산에 사용됨을 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  23. 청구항 19에 있어서, 상기 면역측정법이 다중 면역측정법인, 방법.
  24. 청구항 19에 있어서, 상기 LDAII가 추가로 하기와 같이 계산된, 방법:
    농도 생체지표가 상기 개체에 대해 결정되고 로그전환되고, 각 개체 시료에 대해 결정된 각 로그전환된 용해성 매개체 수치가 하기와 같이 표준화되는 단계:
    (관찰된 값)-(SLE 환자 전부와 건강한 대조군 방문자의 평균값)/(SLE 환자 전부 및 건강한 대조군 방문자의 표준 편차);
    건강한 대조군(스피어만 r)과 비교하여 상기 SLE 환자에서 평가된 각 용해성 매개체에 대한 하나 이상의 자가항체(AutoAb) 특이성 사이의 연관성을 검증하는 선형 회귀 모델에서 스피어만 상관계수를 생성하는 단계;
    상기 개체의 용해성 매개체 수치의 값과 그들의 각각의 스피어만 상관계수(스피어만 r)에 의해 가중치가 부여된 (곱셈이 된) 값을 전환 및 표준화하는 단계; 및
    각 참여 방문자에 대해 4개 이상의 용해성 매개체 각각에 대한 로그 전환되고, 표준화되고, 가중치가 부여된 값들을 합하여 LDAII를 계산하는 단계.
  25. 청구항 19에 있어서, 상기 LDAII의 증가가 SLE 질병의 진행, 자가면역 질병 활성도의 증가, 또는 장기 손상 중 최소한 하나를 보여주는, 방법.
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