KR101772375B1 - Ｇｍ-ｃｓｆ를 발현하는 폭스바이러스를 사용한 전이성 및/또는 전신 파종성 암의 전신 치료법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 백시니아 바이러스의 혈관내 투여를 사용한 암 및 암세포의 치료를 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 일부 양태에서, 방법 및 조성물에는 GM-CSF를 암호화하는 복제가능 백시니아 바이러스가 포함된다.

Description

ＧＭ-ＣＳＦ를 발현하는 폭스바이러스를 사용한 전이성 및/또는 전신 파종성 암의 전신 치료법{Systemic treatment of metastatic and/or systemically-disseminated cancers using GM-CSF-expressing poxviruses}
본 출원은 전문이 본원에 참조로서 인용된 2005년 9월 7일자 미국 가출원 제60/714,679호에 대해 우선권을 주장한다.
본 발명은 일반적으로 종양학 및 바이러스학 분야에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 GM-CSF를 발현하는 백시니아 바이러스, 및 암 치료를 위한 전신 투여에서의 이의 용도에 관한 것이다.
정상적인 조직 항상성은 세포 증식 및 세포 사멸의 고도로 조절된 과정이다. 세포 증식 또는 세포 사멸의 불균형은 암성 상태로 발전할 수 있다[참조: Solyanik et al ., 1995; Stokke et al ., 1997; Mumby and Walter, 1991; Natoli et al ., 1998; Magi-Galluzzi et al ., 1998]. 예를 들면, 자궁경부암, 신장암, 폐암, 췌장암, 결장직장암 및 뇌암은 발생할 수 있는 많은 암 중의 단지 일부 예이다[참조: Erlandsson, 1998; Kolmel, 1998; Mangray and King, 1998; Gertig and Hunter, 1997; Mougin et al ., 1998]. 사실, 암 발생률은 매우 높으며, 미국에서만 1년에 500,000명 이상이 암으로 인해 사망한다.
세포 증식 및 세포 사멸의 유지는 적어도 부분적으로 원종양 유전자(proto-oncogene) 및 종양 억제인자(tumor suppressor)에 의해 조절된다. 원종양 유전자 또는 종양 억제인자는 세포 증식을 유도하는 단백질 (예: sis, erbB, src, ras 및 myc), 세포 증식을 억제하는 단백질 (예: Rb, p16, p19, p21, p53, NF1 및 WT1), 또는 프로그램화된 세포 사멸을 조절하는 단백질 (예: bcl-2)을 암호화할 수 있다[참조: Ochi et al ., 1998; Johnson and Hamdy, 1998; Liebermann et al ., 1998]. 하지만, 이러한 원종양 유전자 및 종양 억제인자에서 유전자 재배열 또는 돌연변이가 일어나면, 원종양 유전자가 강력한 발암성 종양유전자로 전환되거나, 종양 억제인자가 불활성 폴리펩티드로 전환된다. 종종, 하나의 점 돌연변이는 형질전환을 일으키는데 충분하다. 예를 들면, p53 종양 억제인자 단백질에서 하나의 점 돌연변이가 야생형 p53 기능을 완전히 소실시킨다[참조: Vogelstein and Kinzler, 1992].
현재는, 많은 통상적인 암 종류의 치료를 위한 효과적인 대안이 거의 없다. 주어진 개체를 위한 치료 과정은 진단, 질병 발생 단계, 및 환자의 연령, 성별 및 전반적인 건강상태와 같은 요인에 따라 달라진다. 암 치료의 가장 통상적인 대안으로는 수술, 방사선 요법 및 화학요법이 있다. 수술은 암의 진단 및 치료에서 중심적인 역할을 한다. 통상적으로, 수술적 접근법은 생검을 위하여, 그리고 암 성장물을 제거하는데 요구된다. 하지만, 암이 전이되어 광범위하게 확산된 경우에는, 수술로 치료되기 어렵고 다른 접근법을 선택해야 한다. 방사선 요법, 화학요법 및 면역요법은 암의 수술적 치료에 대한 대안이다[참조: Mayer, 1998; Ohara, 1998; Ho et al ., 1998]. 방사선 요법은 고에너지 방사선을 정확히 조준하여 암세포를 파괴하는 것을 포함하며, 이는 수술과 매우 유사하고, 주로 비-전이된 국부적인 암세포의 치료에 효과적이다. 방사선 요법의 부작용에는 피부 자극, 연하 곤란, 구강 건조, 오심, 설사, 탈모 및 기력 감퇴가 포함된다[참조: Curran, 1998; Brizel, 1998].
항암 약물로 암을 치료하는 화학요법은 다른 방식의 암 치료법이다. 주어진 항암 약물 요법의 유효성은 고형 종양 전체에 약물 전달을 달성하기가 어려워 종종 제한된다[참조: el-Kareh and Secomb, 1997]. 화학요법적 방법은 종양 조직의 성장에 근거하여, 빠르게 분열하는 암세포에 항암 약물을 표적화시킨다. 대부분의 화학요법적 접근법은 하나 이상의 항암 약물의 병용을 포함하고, 이는 광범위한 암의 반응률을 증가시키는 것으로 입증되었다[참조: 본원에 참조로서 인용된 미국특허 제5,824,348호; 제5,633,016호 및 제5,798,339호]. 화학요법 약물의 주요 부작용은 정상적인 조직 세포에도 영향을 준다는 것이고, 가장 영향을 받기 쉬운 세포는 일부 경우에 빠르게 분열하는 세포이다 (예: 골수, 위장관, 생식기 계통 및 모낭). 화학요법 약물의 다른 독성 부작용에는 구강 궤양, 연하 곤란, 구강 건조, 오심, 설사, 구토, 피로, 출혈, 탈모 및 감염이 포함될 수 있다.
암 연구에서 빠르게 발전하고 있는 분야인 면역요법은 특정한 종류의 암의 치료를 위한 또다른 대안이다. 이론적으로는, 면역 시스템이 자극되어 종양 세포가 이물질인 것으로 식별되고 이들이 표적화되어 파괴될 수 있다. 불행하게도, 이러한 반응은 통상적으로 대부분의 종양 성장을 예방하는데 충분하지 않다. 하지만, 최근 면역요법 분야에서는, 면역 시스템의 자연 방어 기전을 증대시키거나 보충하는 방법을 개발하는데 집중되었다. 현재 연구 중이거나 사용중인 면역요법의 예로는 면역 애주번트 (예: 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis), 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum), 디니트로클로로벤젠 및 방향족 화합물)[참조: 미국특허 제5,801,005호 및 제5,739,169호; Hui and Hashimoto, 1998; Christodoulides et al ., 1998], 사이토카인 요법 (예: 인터페론 (IL-1, GM-CSF 및 TNF))[참조: Bukowski et al ., 1998; Davidson et al ., 1998; Hellstrand et al ., 1998], 유전자 요법 (예: TNF, IL-1, IL-2, p53)[참조: Qin et al ., 1998; Austin-Ward and Villaseca, 1998; 미국특허 제5,830,880호 및 제5,846,945호], 및 모노클로날 항체 (예: 항-갱글리오사이드(ganglioside) GM2, 항-HER-2, 항-p185)[참조: Pietras et al ., 1998; Hanibuchi et al ., 1998; 미국특허 제5,824,311호]가 있다. 이러한 방법들은 어느 정도 전망을 보이고 있으며, 제한적인 성공이 입증되었다.
복제-선택성 종양 용해 바이러스(oncolytic virus)는 암 치료에 대해 전망이 밝다[참조: Kirn et al ., 2001]. 이러한 바이러스는 직접적인 복제-의존성 및/또는 바이러스 유전자 발현-의존성 종양 용해 효과를 통해 종양 세포 사멸을 일으킬 수 있다[참조: Kirn et al ., 2001]. 또한, 상기 바이러스는 숙주 내에서 세포-매개된 항종양성 면역 유도를 향상시킬 수 있다[참조: Todo et al ., 2001; Sinkovics et al ., 2000]. 이러한 바이러스를 조작하여 종양 내에서 치료학적 전이유전자(transgene)를 발현시켜 항종양 효능을 향상시킬 수도 있다[참조: Hermiston, 2000].
하지만, 이러한 치료학적 접근법에 중요한 한계가 존재한다. 어느 정도의 자연적인 종양-선택성은 일부 바이러스 종에 대해 증명될 수 있지만, 종양 용해 바이러스의 종양-선택성을 조작하고/하거나 향상시켜 안전성을 최대화시키기 위한 새로운 접근법이 여전히 필요하다. 이러한 선택성은, 정맥내 투여를 사용하는 경우, 및 잠재적인 독성이 있는 치료 유전자를 이러한 바이러스에 부가하여 항종양 효능을 향상시키는 경우에 특히 중요해질 것이다; 정상적인 조직에서는 유전자 발현을 엄격하게 제한시킬 필요가 있을 것이다. 또한, 항종양 면역의 유도 또는 종양 관련 혈관계의 표적화와 같은 추가적인 기전을 통해 증가된 항종양 효능은 매우 바람직하다.
그러므로, 암 치료를 위한 보다 효과적이고 독성이 낮은 치료법이 요구된다. 종양 용해 바이러스 및 면역요법의 사용은 발전될 수 있는 분야이지만, 상기한 한계를 극복해야할 필요가 있다. 따라서, 본 발명은 이러한 한계를 해결한다.
발명의 요약
따라서, 본 발명에 따라, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)를 암호화하는 핵산의 발현을 지시하는 프로모터와 발현 영역을 갖는 유효량의 복제가능 백시니아 바이러스를 대상체(subject)에게 투여함을 포함하여, 대상체에서 암세포를 사멸시키는 방법이 제공되며, 이때 투여는 혈관내 투여이다. 상기 핵산이 사람 GM-CSF를 암호화하는 것이 구체적으로 고려된다.
백시니아 바이러스는, 예를 들면 정맥내 점적 또는 일시 주사(bolus)를 사용하거나 펌프를 사용하여, 정맥내 또는 동맥내로 투여할 수 있다. 백시니아 바이러스는 약제학적으로 허용되는 제형 중에 분산시킬 수 있다. 대상체에게 약 105, 106 107, 108 내지 약 109, 1010, 1012, 1013 pfu의 바이러스, 또는 약 107 내지 약 1010 pfu의 바이러스를 투여할 수 있다. 대상체에게 백시니아 바이러스를 여러 회 (1, 2, 3, 4, 5, 6회 또는 그 이상) 투여할 수 있고, 예를 들면, 이때 2차 투여를 1차 투여 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일 또는 주 이내에 실시하거나, 또는 2차 투여를 1차 투여 후 2주 이내에 실시한다. 동일하거나 상이한 용량을 투여할 수 있다. 암세포는 전이된 암세포일 수 있다. 대상체에는 뇌암, 두경부암, 신장암, 난소암, 고환암, 자궁암, 위암, 폐암, 결장직장암, 유방암, 전립선암, 췌장암, 간세포암, 백혈병, 림프종, 골수종 또는 흑색종이 있을 수 있다.
백시니아 바이러스는 게놈에 결실이 있거나 하나 이상의 유전자에 돌연변이가 있을 수 있다. 백시니아 바이러스의 티미딘 키나제 유전자가 결실되었을 수 있다. 백시니아 바이러스는 (a) 백시니아 바이러스 성장 인자; (b) 기능성 인터페론 조절 폴리펩티드 (여기서, 인터페론 조절 폴리펩티드는 인터페론에 직접 결합한다); (c) 보체 조절 폴리펩티드 (여기서, 돌연변이가 발생하면 하나 이상의 기능성 보체 조절 폴리펩티드가 없는 바이러스가 생성된다); (d) TNF 조절 폴리펩티드 (여기서, 돌연변이가 발생하면 하나 이상의 기능성 TNF 조절 폴리펩티드가 없는 바이러스가 생성된다); (e) 세린 프로테아제 억제제 (여기서, 돌연변이가 발생하면 하나 이상의 기능성 세린 프로테아제 억제제가 없는 바이러스가 생성된다); (f) IL-1β 조절인자 폴리펩티드 (여기서, 돌연변이가 발생하면 하나 이상의 기능성 IL-1β 조절인자 폴리펩티드가 없는 바이러스가 생성된다); (g) 기능성 A41L, B7R, N1L 또는 vCKBP 케모카인(chemokine) 결합 폴리펩티드 또는 C11R EGF-유사 폴리펩티드 (여기서, 돌연변이가 발생하면 하나 이상의 A41L, B7R, N1L, vCKBP 또는 C11R의 기능이 없는 바이러스가 생성된다); 또는 (h) 폴리펩티드 (여기서, 돌연변이가 발생하면 감염성 EEV형 백시니아 바이러스가 증가한다)를 암호화하는 유전자에 돌연변이가 있을 수 있다. 또한, 백시니아 바이러스는 백시니아 바이러스 성장 인자에 돌연변이를 포함할 수 있다. 백시니아 바이러스는 와이어스(Wyeth) 또는 웨스턴 리저브(WR; Western Reserve) 주(strain)일 수 있다. 프로모터는 백시니아 바이러스 프로모터, 합성 프로모터, 적어도 감염 초기 동안에 전사를 지시하는 프로모터, 또는 적어도 감염 후기 동안에 전사를 지시하는 프로모터일 수 있다.
다른 양태에서, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)를 암호화하는 핵산의 발현을 지시하는 프로모터와 발현 영역을 갖는 유효량의 복제가능 백시니아 바이러스를 대상체에게 투여함을 포함하여, 대상체에서 암을 치료하는 방법이 제공되며, 이때 투여는 혈관내 투여이다.
또다른 양태에서, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)를 암호화하는 핵산의 발현을 지시하는 프로모터와 발현 영역을 갖는 유효량의 복제가능 백시니아를 대상체에게 투여함을 포함하여, 대상체에서 하나 이상의 전이를 치료하는 방법이 제공되며, 이때 투여는 혈관내 투여이다.
다른 양태에서, 혈관내로 투여되는 복제가능 백시니아 바이러스를 포함하는 방법이 GM-CSF 이외에 단백질 또는 RNA를 암호화하는 핵산을 함유할 수 있는 것이 고려된다. 특정 양태에서, 핵산은 다른 사이토카인을 암호화한다. 특정 양태에서, 핵산은 다른 면역자극성 사이토카인 또는 케모카인, 예를 들면 IL-12, IL-2 등을 암호화한다. 추가적인 양태에서, 핵산은 티미딘 데아미나제 또는 종양 괴사 인자(TNF) (예: TNF-α)를 암호화할 수 있다. 또한, 복제가능 백시니아 바이러스가 하나 이상의 이종성(heterologous) 서열을 발현할 수 있는 것이 고려된다. 예를 들면, GM-CSF 단백질 및 다른 단백질 또는 RNA 분자를 발현할 수 있다.
특정 방법 또는 조성물과 관련하여 기술된 임의의 양태를 본 발명의 다른 방법 및 조성물과 관련하여 실시할 수 있는 것이 구체적으로 고려된다.
"하나"라는 단어는, 청구항 및/또는 명세서에서 "포함하는"이라는 용어와 함께 사용되는 경우, "하나"를 의미할 수 있지만, "하나 이상", "적어도 하나" 및 "하나 또는 그 이상"의 의미와도 일관된다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 장점은 다음의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 하지만, 상세한 설명 및 구체적인 실시예에는 본 발명의 구체적인 양태가 제시되어 있지만 오직 설명 목적으로만 제시된다는 것을 이해하여야 하며, 이는 본 발명의 취지 및 범위 내에서의 다양한 변화 및 변형이 이러한 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이기 때문이다.
다음의 도면은 본 명세서의 일부를 형성하며, 본 발명의 특정 양상을 추가적으로 설명하기 위하여 포함된다. 본 발명은 본원에 제시된 특정 양태의 상세한 설명과 함께 하나 이상의 이러한 도면을 참조하여 보다 충분하게 이해될 수 있다.
도 1 - 자발성 래트 간세포 암종(HCC)의 JX -594 정맥내 ( IV ) 치료. 래트에 돌연변이유발물질 N-니트로소모폴린(NMM) (175 mg/L)을 래트의 식수 중에 8주 동안 공급하고 나서, HCC 종양이 형성되고 300 내지 400mm3가 될 때 (통상적으로 16 내지 20주 후)까지 초음파(US)를 실시하였다. 이어서, 동물에 PBS (n = 17) 또는 1x108 PFU의 JX-594 바이러스 (n = 6)를 3회 정맥내 투여하였다 (2주 마다 1회, 화살표). 이어서, 이후의 종양 용적을 초음파 이미지로부터의 종양 측정에 따라 계산하였다.
도 2A, 2B - 래빗에서 VX2 간 종양의 JX -594 정맥내 투여 치료, 1차 종양 및 전이에 대한 효능. VX2 세포 (분리된 1mm3의 종양으로부터 유래됨)를 뉴질랜드 흰색 래빗의 간 속에 이식하고, 종양 성장을 초음파(US) 및 CT 스캔으로 추적하였다. 일단 종양이 2 내지 4cm3에 도달하면, 동물을 정맥내 또는 초음파 유도 IT 주사를 통해, 단일 용량의 PBS (n = 7) 또는 JX-594 (1x109 PFU) (n = 3 / 그룹)로 처리하였다 (도 2A). 이후의 간의 종양 용적을 7주 후에 CT 스캔으로 측정하고 (도 2B), 폐에서 검출가능한 종양 전이의 수를 CT 스캔 후 6주 및 7주에 계산하였다.
도 3 - 래빗에서 VX2 간 종양의 JX -594 및 JX -963 저용량 정맥내 반복 치료. 종양 세포를 도 2A, 2B에 기술된 바와 같이 이식하였다. 종양이 2 내지 4cm3에 도달한 후, 동물을 1x108 PFU의 JX-594. JX-963 또는 vvDD (n = 6 / 그룹), 또는 PBS (n = 18)로 정맥내로 3회 처리하였다 (2주 마다, 화살표). 이후의 1차 종양 용적을 CT 스캔으로 추적하였다.
도 4 - VX2 간 종양이 있는 래빗에서 폐 전이에 대한 JX -594, vvDD 및 JX -963의 효과. 동물 (도 3에 기술된 연구로부터의 동물)을 치료 시작 후 1주 간격으로 CT 스캔으로 간 전이에 대해 검사하였다. 각각의 그룹에서 동물 당 검출가능한 전이의 수의 평균이 제시되어 있다.
도 5 - JX -963의 IV 전달 후 VX2 간 종양이 있는 래빗의 생존. 간 종양이 있는 동물을 도 3에 기술된 바와 같이 1x108 PFU의 JX-963의 3회 투여로 처리하였다. 이러한 동물과 대조군 처리 그룹의 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존율 곡선을 제시한다. JX-594 및 vvDD 그룹은 생존율에서 유의적인 차이를 보이지 않아, JX594 및 vvDD 그룹은 포함시키지 않았다.
도 6A 내지 6C - 백시니아 주( strain )의 버스트( burst ) 비, 세포변성 효과(cytopathic effect) 및 종양으로의 바이러스주의 전신적 전달. [도 6A] 정상 세포에 대한 종양에서의 백시니아 주의 버스트 비. 상이한 백시니아 주를 사용하여, 1.0 플라크 형성 단위(PFU)/세포의 감염 다중도(MOI; Multiplicity Of Infection)로 정상적인 1차 세포 (NHBE) 및 종양 세포주 (A2780)를 감염시켰다. 48시간 후 수집한 바이러스를 플라크 검정으로 적정하여, 정상 세포에 대한 종양에서 (세포 당) 생산된 바이러스의 비를 제시한다. [도 6B] 바이러스 감염에 의해 생성된 세포변성 효과. 웨스턴 리저브, 아데노바이러스 혈청형 5 및 아데노바이러스 주 dl1520 (ONYX-015)을 (일부 검정에서) 다양한 MOI (PFU/세포) 범위로 세포주에 첨가하여, 세포 생존성을 72시간 후에 MTS[판매원: Promega]를 사용하여 측정하였다. 세포 생존성을 미처리 대조군 웰의 50%로 감소시키는데 필요한 바이러스의 MOI(PFU/세포) (ED50)의 그래프를 작성한다. [도 6C] 종양으로의 바이러스주의 전신적 전달. 1x109 PFU의 백시니아 주 웨스턴 리저브 또는 아데노바이러스 혈청형 5를 피하 CMT 64 또는 JC 종양이 있는 면역적격(immunocompetent) 마우스에 정맥내로 투여하였다. 마우스를 48 또는 72시간 후에 희생시키고, 파라핀 포매된(embedded) 종양 조직 절편 상에서 바이러스 피막(coat) 단백질에 대해 면역조직화학을 수행하였다. 그래프에는 각각의 종양에서 양성 세포의 득점이 제시되어 있다 (* = 검출 불가능). 각각의 조건에서 결과는 3마리의 마우스로부터의 종양을 근거로 하고, 각각의 종양에 대해 10개의 무작위로 선택된 시야에서 점수를 매겼다.
도 7 - 다양한 사람 종양 세포주에 대한 WR 및 vvDD 의 세포변성 효과. EC50 값을 종양 세포주를 WR 또는 vvDD로 감염시키고 72시간 후에 측정하였다. 세포 생존성을 미처리 대조군 웰의 50%로 감소시키는데 필요한 바이러스의 MOI (PFU/세포) (ED50)의 그래프를 작성한다.
도 8A 내지 8C - 바이러스 복제에 대한 H- Ras 의 과발현의 효과, 종양이 있는 마우스로의 전신적 전달 후 WR 및 vvDD의 생체분포(biodistribution), 및 발광에 의해 정량화된 바이러스 유전자 발현. [도 7A] 바이러스 복제에 대한 H-Ras의 과발현의 효과. 증식배양하거나 혈청기아 배양한 NIH 3T3 세포 및 활성화된 H-Ras를 발현하는 NIH 3T3 세포를, 상이한 백시니아 주로 1.0 PFU/세포의 MOI로 감염시켰다. 바이러스주는 모(parental) 웨스턴 리저브(WR), 및 티미딘 키나제(TK) 유전자 또는 바이러스 성장 인자(VGF) 유전자에 결실 또는 삽입을 함유하거나(vJS6 또는 vSC20) 상기 두 유전자에 모두 결실을 함유하는(vvDD) WR이었다. 감염성 바이러스를 48시간 후에 플라크 검정으로 적정하였다. [도 7B] 종양이 있는 마우스로의 전신적 전달 후 WR 및 vvDD의 생체분포. 피하 사람 HCT 116 종양 (화살표)이 있는 무흉선(athymic) CD1 nu/nu 마우스를 꼬리 정맥 주사를 통해 1x107 PFU의 백시니아 주로 처리하였다. 바이러스주 (WR 및 vvDD)는 루시퍼라제를 발현하였고, 이후의 바이러스 유전자 발현의 생체분포를 기질 루시페린을 첨가한 후에 처리 후 표시된 시간에서 IVIS100 시스템[판매원: Xenogen Corp, Alameda]에서 생물발광(bioluminescence) 이미지로 검출하였다. [도 7C] 발광에 의해 정량화된 바이러스 유전자 발현을, 피하 JC 종양이 있고 꼬리 정맥 주사를 통해 1x107 PFU의 바이러스로 처리한 BALB/c 마우스 (n = 5 마우스 / 그룹)에 대해, 전신을 포함하는 관심대상의 영역에 대해 (배쪽 이미지)(점선, 흰색 기호), 또는 종양으로부터만 (등쪽 이미지)(실선, 검은색 기호) 시간에 걸쳐 그래프를 작성하였다.
도 9A 내지 9C - 간 속으로 이식된 VX2 종양이 있는 래빗을 종양 이식 후에 CT 이미지로 추적함, VX2 종양 세포에 대한 CTL 검정, 및 JX-963으로 재처리한 래빗. [도 9A] 간 속으로 이식된 VX2 종양이 있는 래빗을 종양 이식 후에 CT 이미지로 추적하였다. 1x109 PFU의 바이러스 vvDD 및 JX-963을 종양 이식 2, 3 및 4주 후 (화살표) 종양이 5cm3로 측정되었을 때 귀 정맥 주사로 전달하였다. 검출가능한 폐 전이의 수를 또한 상기 동물에서 측정하였다 (8주에서의 1차 간 종양의 대표적인 CT 이미지가 제시되어 있다) (대조군 처리 그룹의 경우 n = 18; vvDD 처리 그룹의 경우 n = 6; JX-963 처리 그룹의 경우 n = 6). [도 9B] VX2 종양 세포를 표적화하는 CTL 검정. CTL 검정은, VX2 종양이 있고 JX-963으로 처리한 래빗으로부터의; VX2 종양이 있는 비-처리된 동물로부터의; 그리고 비-실험(naive) 동물로부터의 12.5x, 25x 및 50x 비-표지된 말초 혈액 림프구와 혼합된 예비표지된 VX2 세포를 사용하여 FACS 분석으로 수행하였다. 세포 사멸을 ACT1 검정[판매원: Cell Technology, Mountain View]으로 정량화하였다. [도 9C] JX-963으로 (A)에서와 같이 처리한 4마리의 래빗을 이식 후 42일에 (화살표) 1x109 PFU의 JX-963으로 재처리하고, 이후의 종양 용적을 CT 스캔으로 추적하였다.
도 10A, 10B - WR 또는 Ad5 로 감염시킨 세포주의 바이러스 생산, 및 바이러스 감염에 의해 생성된 세포변성 효과. [도 10A] 상이한 세포주를 웨스턴 리저브 또는 아데노바이러스 혈청형 5로 1.0 PFU/세포의 MOI로 감염시켰다. 48시간 후에 생산된 바이러스의 양 (감염 단위/세포)을 플라크 검정으로 적정하였다. [도 10B] 도 1C에서와 같이 처리한 마우스를 희생시켜, 종양 절편을 바이러스 피막 단백질에 대해 염색하였다. 처리 후 72시간 및 10일에서의 절편의 대표적인 사진이 제시되어 있다.
도 11 - WR 또는 Ad5 로 감염시킨 세포주의 바이러스 생산. 증식배양하거나 접촉 억제로 성장시킨 (N.B. 종양 세포는 접촉 억제되지 않았다) 사람 종양 세포주 (Panc-1 및 MCF-7) 또는 사람 불멸화된(immortalized) 비-형질전환된 세포주 (Beas-2B 및 MRC-5)를 상이한 백시니아 주로 1.0 PFU/세포의 MOI로 처리하였다. 사용된 주는 웨스턴 리저브(WR), 및 티미딘 키나제(TK) 유전자 또는 바이러스 성장 인자(VGF) 유전자에 결실을 함유(vJS6 또는 vSC20)하거나 상기 두 유전자에 모두 결실을 함유(vvDD)하는 WR이었다. 48시간 후에 생산된 바이러스를 플라크 검정으로 적정하였다.
도 12 - 전신적으로 전달된 vvDD 의 회수. 피하 MC38 종양이 있는 C57B/6 마우스에 전신적으로 (1x109 PFU의 복강내 주사) 전달된 vvDD의 회수. 마우스를 처리 후 5 또는 8일에 희생시키고(n = 8 / 그룹) 상이한 조직을 회수하여 바이러스 감염 단위(PFU/조직mg)를 플라크 검정으로 적정하였다 (* = 검출 한계 미만).
도 13A, 13B - 종양이 있는 마우스 모델에 상이한 경로로 전달한 후 vvDD 의 효능. [도 13A] 티미딘 키나제 결실이 있는 1x109 PFU의 바이러스 주 vvDD 또는 백시니아 와이어스 주의 단일 정맥내 주사를 피하 TIB 75 종양 (50 내지 100mm3)이 있는 면역적격 마우스에 전달하였다. 종양 용적을 캘리퍼(caliper)로 측정하였다 (n = 8 / 그룹). [도 13B] 1x109 PFU의 vvDD를 피하 HT29 종양이 있는 SCID 마우스 또는 피하 MC38 종양이 있는 C57B/6 마우스에 종양내로(IT) 또는 복강내로(IP) 전달하여, 이후의 종양 용적을 비-감염시킨 대조군 그룹과 비교하였다 (n = 8 / 그룹).
도 14 - VX2 종양이 있는 래빗을 JX -963 (1 x 10 8 PFU )으로 처리한 후 중화 항체의 형성. 표시된 시간에 래빗으로부터 수득한 혈장의 희석액을, 알고 있는 수의 바이러스 PFU로 항온처리하여, 플라크의 50%를 유지하는데 필요한 희석을 제시한다 (n = 3).
GM-CSF를 발현하는 폭스바이러스는 흑색종이 있는 동물 및 환자에서 종양내 주사 후 효능 및 안전성이 입증되었다[참조: Mastrangelo et al ., 1999; 2000]. 국부적인 주사 부위 및 원거리 효과, 예를 들면 종양 퇴행(tumor regression) 및 안정화를 보였다[참조: Mastrangelo et al ., 1999]. 효능은 포유동물에서 암세포에 대한 면역 반응의 유도로 인한 것이라고 제안되었다. 미국특허 제6,093,700호 및 제6,475,999호에는 사람에서 종양내 주사에 의해 GM-CSF를 종양에 전달하여 흑색종, 두경부암, 전립선암 및 방광암에 대해 원위치(in situ) 면역화시키기 위한 폭스바이러스의 용도가 제안되어 있다[참조: Mastrangelo et al ., 2002]. 이러한 암을 선택한 이유는 이들의 표재성 및 직접적 종양내 주사를 위한 접근성 때문이었다. 이러한 암은 또한 전신적인 종양-특이적 세포독성 T-림프구를 유도하는 면역요법적 접근법에 민감한 것으로 보고되어 있다. GM-CSF는 종양-특이적 세포독성 T-림프구(CTL)의 강력한 유도인자인 것으로 증명되었다[참조: Dranoff et al ., 1993]. 바이러스는 면역 세포 침윤 및 염증촉진성 사이토카인을 유도하므로, 바이러스는 종양 덩어리 내에서 GM-CSF를 전달하고 발현시키는 이상적인 방법을 구성할 수 있다.
하지만, 종양내 주사 경로는 중요한 한계를 갖는다. 이는 치료를, 안전한 종양내 주사로 접근가능한 종양, 일반적으로 앞서 열거한 것과 같은 표재성 종양으로 제한한다. 또한, 비-주사된 종양에 대한 효능은 충분히 강력한 종양-특이적 세포독성 T-림프구의 유도를 필요로 한다. 이러한 단점은, 표재성이면서 충분히 강력한 종양-특이적 세포독성 T-림프구를 전신적으로 유도할 수 있는 암에 대한 상기 접근법의 유용성을 제한한다. 이러한 종양은 드물다. 이러한 접근법의 적용가능성의 명확한 유일한 예는 전이성 흑색종이다. 하지만, 이러한 종양 종류에서도, 원거리 반응은 느렸고 표재성 피부 전이에 한정되었다. 기관 종양 또는 내장 종양은 반응하지 않았다. 이러한 종양은 거의 모든 암 관련 이환율 및 사망의 원인이므로, 전신적인 세포독성 T-림프구는 지속적인 전신적 내장 반응 또는 치료를 유도하는데 충분하지 않은 것 같다. 그러므로, 대다수의 사람 종양은 이러한 접근법으로 성공적인 효능을 보이지 않는다.
전이성 종양 및 면역 조직 (예: 세망 내피 세포)으로 전달하는 혈관내 투여 (즉, 정맥내, 동맥내 투여)는 많은 이론적인 장점을 갖는다. 첫번째로, GM-CSF를 발현하는 폭스바이러스를 포유동물 신체 내의 대부분의 종양 부위 또는 모든 종양 부위로 전달하면, 국부적 종양내 효과 (폭스바이러스 복제 및 GM-CSF는 감염된 종양 내에서 국부적으로 효과가 있기 때문) 및 종양-특이적 세포독성 T-림프구 유도에 의해 전신적인 종양 파괴가 일어나고 나서, 감염된 종양 부위 및 원거리 (초기 투여량으로 직접 감염되지 않은 종양 부위)에서 효능이 나타나게 된다. 바이러스를 혈류를 통해 종양에 전달하면 또한, 종양 내의 암세포를 보다 일정하고 광범위하게 감염된다. 그러므로, 본 발명자는 현재, 다병소성(multi-focal), 파종성, 전이성 종양을 GM-CSF를 발현하는 혈관내 폭스바이러스로 효과적으로 치료할 수 있다고 제안한다. 종양내 접근법에 적당하지 않은 많은 암 종류 및/또는 암의 병기는 또한, 혈관내 주사 접근법으로 잠재적으로 치료가능할 것이다. 예에는 폐암, 결장직장암, 유방암, 전립선암, 췌장암, 간세포암, 백혈병, 림프종, 골수종 및 흑색종이 포함되지만, 이에 제한되지 않을 것이다.
하지만, 당업자는 GM-CSF를 발현하는 혈관내 폭스바이러스의 안전하고 효과적인 사용이 잠재적인 문제에 의해 부정적인 영향을 받는다고 생각하였다. 첫번째로, 안전성 문제가 상당하였다. 혈관내 투여 후, 많은 정상적인 조직이 폭스바이러스 감염에 노출될 것이다. 이후, GM-CSF와 같은 강력한 염증촉진성 사이토카인의 발현은 간, 폐, 신장, 심장, 뇌 등과 같은 많은 기관에서 상당한 염증을 잠재적으로 유도할 것이라고 예상될 것이다. 또한, 바이러스혈증(viremia)에의 전신적 노출은 패혈증 및 이와 관련된 합병증 (예: 저혈압)을 잠재적으로 유도할 수 있다. 마우스 또는 사람의 뇌에서 폭스바이러스 감염은, 예를 들면, 임상적으로 중대하고, 치명적일 수도 있는 뇌염을 일으킬 수 있다. GM-CSF 발현은 염증을 향상시켜 잠재적으로 이러한 합병증을 상당히 악화시킬 수 있다.
두번째로, GM-CSF 발현을 통한 종양-특이적 CTL의 전신적 유도는, 예전에는 직접 종양내로 주사하거나 (예: 백시니아-GM-CSF, HSV-GM-CSF), 또는 자가(autologous) 또는 동종이계(allogeneic) 종양 세포를 생체외 감염/형질감염시켜 GM-CSF를 발현시킨 후 (예: GVAX 접근법) GM-CSF 세포를 피부 속에 주사하는 방법으로, 국부적인 GM-CSF 발현을 통해서만 수행되었다.
이러한 잠재적인 단점에도 불구하고, 본 발명자는 현재 2개의 상이한 GM-CSF-발현 폭스바이러스가 정맥내로 충분히 용인되고 파종성 종양 및 전이에 대해 매우 효과적이라는 것을 증명하였다. 또한, GM-CSF를 발현하는 폭스바이러스는 정맥내 투여 후 GM-CSF를 발현하지 않는 대조군보다 1차 종양 및 폐 전이에 대해 상당히 우수한 효능이 있었다. 또한, 상기 바이러스는 다른 바이러스에 존재하지 않는 vgf 유전자 내의 추가적인 결실에도 불구하고, 유사한 바이러스 (와이어스 백신 주) 보다 1차 종양 및 폐 전이에 대해 상당히 우수한 효능이 있었다. 그러므로, 사람 GM-CSF를 발현하는 백시니아의 정맥내 투여는 GM-CSF가 없는 동일한 백시니아 보다 상당히 우수한 효능을 보였고, 사람 GM-CSF를 발현하는 WR 주 결실 돌연변이체의 혈관내 투여는 GM-CSF를 발현하는 표준 백시니아 주 보다 상당히 우수하였다. 이러한 바이러스는 종양이 있는 동물 (래트 및 래빗) 및 정상 동물 (래빗)에 정맥내 투여한 후 충분히 용인되었다. 치료를 받지 않은 종양이 있는 동물은 체중이 감소한 반면에, 치료받은 동물은 체중이 감소하지 않았다. 정맥내 치료 후 생존율이 증가하였다. 혈액 검사 또는 조직병리학 상에 어떠한 현저한 기관 독성도 보고되지 않았다. 재현적인 유일한 조직병리학적 소견은 치료 후 보고된 다수의 림프구성 증식증 부위였다 (전신적 면역자극과 일관됨). 조직병리학 상에 어떠한 현저한 독성도 보고되지 않았다. 그러므로, 이러한 GM-CSF-발현 폭스바이러스는 전신성 암에 대해 매우 효과적인 용량에서 충분히 용인된다.
I. 폭스바이러스
A. 백시니아 바이러스
백시니아 바이러스는 바이러스학의 불가사의이다. 백시니아 바이러스는 유전자 재조합의 산물인지, 장기간 계대 배양에 의해 우두 바이러스 또는 천연두 바이러스로부터 유래된 종인지, 또는 새로운 멸종 바이러스의 살아있는 표본인지 알려져 있지 않다. 백시니아 바이러스는 상박 피부의 표면층 속으로 접종하여 천연두 백신접종에 사용되었다. 하지만, 천연두가 박멸되고, 백시니아 바이러스를 사용한 정기적인 백신접종이 중단되었다. 백시니아에서 최근의 관심은 다른 바이러스에 대한 면역접종을 위한 벡터로서의 가능한 용도 및 유전자 요법에 집중되었다.
백시니아 바이러스는 폭스바이러스(Poxviridae) 과, 코르도폭스바이러스(Chordopoxvirinae) 아과 및 오르토폭스바이러스(Orthopoxvirus) 속의 일원이다. 비리온(virion)은 RNA 폴리머라제, 초기 전사 인자, 폴리(A) 폴리머라제, 캡핑(capping) 효소 복합체, RNA (뉴클레오사이드-2') 메틸트랜스퍼라제, 뉴클레오사이드 트리포스페이트 포스포하이드롤라제 II, 닉(nick) 연결 효소, DNA 토포이소머라제 및 단백질 키나제를 함유한다. 게놈은 10 kB 역위 말단 반복을 특징으로 하는 180,000 염기쌍 이상의 이본쇄 DNA이다. 상기 바이러스는 원형질막과의 pH-의존적 융합 또는 저 pH-의존적 엔도좀 경로를 통해 세포 속에 들어간다.
B. 기타 폭스바이러스
오르토폭스바이러스 속은 코르도폭스바이러스 아과의 다른 일원보다 상대적으로 보다 동질적이고, 11개의 상이하지만 밀접하게 관련된 종을 포함하며, 여기에는 백시니아 바이러스, 천연두 바이러스 (천연두의 원인체), 우두 바이러스, 버팔로(buffalo) 천연두 바이러스, 원숭이 천연두 바이러스, 쥐 천연두 바이러스 및 말 천연두 바이러스 종 등이 포함된다[참조: Moss, 1996]. 본원에서 기술되는 본 발명의 특정 양태는 오르토폭스바이러스 속 뿐만 아니라, 파라폭스바이러스(Parapoxvirus), 아비폭스바이러스(Avipoxvirus), 카프리폭스바이러스(Capripoxvirus), 레포리폭스바이러스(Leporipoxvirus), 수이폭스바이러스(Suipoxvirus), 몰루시폭스바이러스(Molluscipoxvirus) 및 야타폭스바이러스(Yatapoxvirus) 속의 다른 일원으로 확장될 수 있다. 폭스바이러스 과의 속은 일반적으로 실험 동물에서의 중화 및 교차 반응성을 포함하는 혈청학적 방법으로 정해진다. 오르토폭스바이러스 속의 다양한 일원 뿐만 아니라, 코르도폭스바이러스 아과의 다른 일원은 면역조절 분자 (이의 예는 본원에서 제공된다)를 사용하여 숙주 유기체의 면역 반응을 방해한다. 따라서, 본원에서 기술되는 본 발명은 백시니아 바이러스에 한정되지 않으며, 많은 바이러스에 적용될 수 있다.
II . 폭스바이러스의 조작
바이러스는 종종 인터페론 (-α, -β, -γ) 및 종양 괴사 인자-α(TNF-α)와 같은 면역조절 분자에 의해 불활성화되거나, 억제되거나, 제거된다[참조: Moss, 1996]. 숙주 조직 및 염증/면역 세포는 종종 바이러스 감염에 반응하여 이러한 분자를 분비한다. 이러한 분자는 직접적인 항바이러스 효과, 및/또는 염증 세포 및 림프구의 동원(recruitment) 및/또는 활성화를 통한 간접적인 효과를 가질 수 있다. 이러한 면역학적 제거 기전의 중요성에 따라, 바이러스는 진화되어 이러한 사이토카인/케모카인 및 인터페론의 유도 및/또는 기능을 억제하는 유전자 산물을 발현한다. 예를 들면, 백시니아 바이러스 (VV; 및 일부 다른 폭스바이러스)는 CC 케모카인 (예: RANTES, 에오탁신(eotaxin), MIP-1-알파)에 결합하여 이를 억제하는 분비 단백질 vCKBP (B29R)를 암호화한다[참조: Alcami et al., 1998]. 일부 VV 주는 또한 TNF (예: 리스터(Lister) A53R)에 결합하여 이를 불활성화시키는 분비되는 바이러스 단백질을 발현한다[참조: Alcami et al., 1999]. 대부분의 폭스바이러스 주는 인터페론-α/β(예: B18R) 또는 인터페론-γ(B8R)에 결합하여 이의 기능을 억제하는 분비 단백질을 암호화하는 유전자를 갖는다. vC12L은, IL-18이 IFN-γ 및 NK 세포/세포독성 T 세포 활성화를 유도하지 못하게 하는 IL-18 결합 단백질이다.
대부분의 폭스바이러스 병원성 연구는 마우스에서 수행되었다. 전부는 아니지만 많은 이러한 단백질은 마우스에서 활성이 있다 (예를 들면, B18R은 활성이 없다). 이러한 단백질이 표적 사이토카인의 마우스 버전에 대해 활성이 있는 경우, 이러한 유전자를 결실시키면, 이러한 유전자에 결실 또는 기능적 돌연변이가 있는 VV 돌연변이체로 병원성이 감소되고 안전성이 증가된다. 또한, 이러한 돌연변이체에 대한 염증/면역 반응 및 바이러스 제거는 종종, 억제 단백질을 발현하는 모 바이러스주와 비교하여 증가된다. 예를 들면, T1/35kDa 계열의 폭스바이러스 분비 단백질 (케모카인-결합/-억제 단백질)이 결실되면, 바이러스에 감염된 조직 속으로의 백혈구 침윤이 현저하게 증가할 수 있다[참조: Graham et al ., 1997]. VV에서 vC12L 유전자가 결실되면, 마우스에서 비강내 투여 후 바이러스 역가/독성이 감소되고; 또한, NK 세포 및 세포독성 T-림프구 활성이 IFN-γ 유도와 함께 증가된다[참조: Smith et al ., 2000]. 점액종(Myxoma) 바이러스 T7 유전자 (IFN-γ 및 광범위한 케모카인에 결합할 수 있음)가 결실되면, 독성 모델에서 병원성이 감소되고 조직 염증/침윤이 상당히 증가된다[참조: Upton et al ., 1992; Mossman et al ., 1996]. 점액종 바이러스로부터 M-T2 유전자가 결실되면 또한, 래빗 모델에서 병원성이 감소된다[참조: Upton et al . 1991]. B18R 항-인터페론-α/-β 유전자 산물이 결실되면 또한, IFN-매개된 제거에 대한 바이러스의 민감성이 향상되고, 정상 조직에서 역가가 감소되며, 병원성이 감소된다[참조: Symons et al ., 1995; Colamonici et al ., 1995; Alcami et al ., 2000]. 요약하면, 이러한 바이러스 유전자 산물은 항바이러스 면역 반응 및 바이러스에 감염된 조직 속으로의 염증 세포의 침윤을 감소시키는 기능을 한다. 결실/돌연변이를 통해 단백질 기능이 손실되면, 숙주 조직 내에서 바이러스의 병원성이 감소하고/하거나 염증촉진성이 증가된다[참조: 본원에 참조로서 인용된 PCT/US2003/025141].
사이토카인 및 케모카인은 강력한 항종양 효과를 가질 수 있다[참조: Vicari et al ., 2002; Homey et al ., 2002]. 이러한 효과는 종양 세포 자체에 대한 직접적인 효과이거나 (예: TNF), 비-암성 세포에 대한 효과를 통한 간접적인 효과일 수 있다. 후자의 예로는 TNF가 있고, 이는 종양 관련 혈관에 독성을 일으켜 항종양 효과를 가질 수 있다; 이는 종양으로의 혈류를 감소시켜 종양 괴사를 일으킨다. 또한, 케모카인은 호중구, 호산구, 대식세포 및/또는 림프구와 같은 면역 효과인자 세포(effector cell)를 동원(하여 일부 경우에 활성화)하는 작용을 할 수 있다. 이러한 면역 효과인자 세포는 많은 기전에 의해 종양 파괴를 일으킬 수 있다. 이러한 기전에는 항종양 사이토카인 (예: TNF)의 발현, fas-리간드의 발현, 퍼포린(perforin) 및 그랜자임(granzyme)의 발현, 자연 킬러 세포의 동원 등이 포함된다. 염증 반응은 결국 전신적인 종양-특이적 면역을 유도할 수 있다. 마지막으로, 많은 이러한 사이토카인 (예: TNF) 또는 케모카인은 화학요법 또는 방사선 요법과 함께 상승적으로 작용하여 종양을 파괴시킬 수 있다.
이러한 면역자극 단백질의 재조합 버전의 임상적으로 효과적인 전신 투여는, (1) 전신 투여에 따른 심한 독성의 유도 및 (2) 종양 조직 내에서의 국소적 발현이 국소적 침윤 및 항종양 효과를 자극하는데 필요하다는 점으로 인해 적합하지 않다. 종양 덩어리 내에서 이러한 분자의 국소적인 농도를 높이면서 전신 순환 수준을 최소화시키는 접근법이 필요하다. 이들의 효능을 향상시키기 위한 시도로, 바이러스를 조작하여 사이토카인 또는 케모카인 유전자를 발현시킬 수 있다. 복제-선택적 벡터로부터의 이러한 유전자의 발현은 비-복제 벡터로부터의 발현 이상의 잠재적인 장점을 갖는다. 복제 바이러스로부터의 발현은 종양 덩어리 내에서의 국소적인 농도를 높일 수 있고; 또한, 복제 바이러스는 염증촉진성 환경에서 종양 세포 파괴/종양 용해 및 종양 항원의 방출을 통해 항종양 면역성을 유도하는 것을 도울 수 있다. 하지만, 이러한 접근법에는 다수의 한계가 있다. 높은 국소 농도로 발현되는 경우 독성이 있을 수 있는 유전자를 갖는 복제가능 바이러스가 (종양-선택적이기는 하지만) 주변환경 속으로 방출될 가능성으로 인해 심각한 안전성 문제가 발생한다. 그러므로, 게놈으로부터 강력한 염증촉진성 유전자를 발현하는 바이러스는 치료받는 환자 및 일반 대중에 대해 안전 위험성을 지닐 수 있다. 이러한 유전자를 발현하는 종양-표적화 복제-선택적 바이러스를 사용하더라도, 유전자 발현이 정상 조직에서 일어나서 독성이 발생할 수 있다. 또한, 크기 제한으로 인해 아데노바이러스와 같은 바이러스로부터의 다수의 및/또는 큰 유전자의 발현이 제한되고; 이러한 분자는 함께, 분명히 보다 유효하게 작용할 것이다. 마지막으로, 사용되는 종양 용해 바이러스 중의 다수는 항염증 단백질을 발현을 발현하므로, 이러한 바이러스는 감염된 종양 덩어리 내에서 염증촉진성 환경의 유도를 방해할 것이다. 그 결과, 항종양 면역, 항혈관 효과 및 화학요법-/방사선요법-민감화의 유도가 억제될 것이다.
A. 백시니아 바이러스 산물
1. 인터페론-조절 폴리펩티드
인터페론-α/-β는 다수의 기전을 통해 바이러스 복제를 차단한다. 인터페론-γ는 직접적인 바이러스 억제 효과는 약하지만, 다수의 기전을 통한 세포-매개된 면역의 강력한 유도인자이다. 바이러스는 진화되어, 인터페론의 항바이러스 효과를 방해할 수 있는 분비되는 유전자 산물을 발현하게 되었다. 예를 들면, 백시니아 바이러스 (및 기타 폭스바이러스)는 각각 인터페론-γ 및 -α/-β에 결합하는 분비 단백질 B8R 및 B18R을 암호화한다[참조: Smith et al ., 1997; Symons et al ., 1995; Alcami et al ., 2000]. 인터페론 유도를 감소시키는 백시니아 유전자 산물의 추가적인 예로는 인터페론-γ-유도 인자 IL-18의 활성화를 억제하는 카스파제-1 억제제 B13R이 있다. 인터페론 조절 폴리펩티드에는 B18R (백시니아 바이러스의 코펜하겐(Copenhagen) 주와 같은 다른 바이러스 주에서는 B19R이라고도 함); B8R; B13R; vC12L; A53R; E3L 및 유사한 활성 또는 특성을 갖는 다른 바이러스 폴리펩티드가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. IFN 조절 폴리펩티드는 주로 IFNα 및/또는 β 경로를 조절하는 것 (예: B18R, B8R, B13R 또는 vC12L)과 IFNγ 경로를 조절하는 것 (예: B8R, B13R 또는 vC12L)의 비-배타적인 범주로 분류될 수 있다.
암세포는 종종 인터페론의 효과에 대해 내성이다. 많은 기전이 관여한다. 이는 암세포의 공통적인 특징인 ras 시그날 전달 경로 활성화 (예: ras 돌연변이, 상류 성장 인자 수용체 과발현/돌연변이 등에 의한)가 PKR 억제를 유도한다는 사실과 관련되어 있다. 또한, 림프구는 종종, 종양 세포에 의한 IL-10 생산 및 fas-L 발현을 포함하는 다양한 기전에 의해 종양 덩어리에서 억제된다. 림프구는 인터페론-γ 생산의 주요 공급원이므로, 림프구가 억제되면 종양에서 인터페론-γ 생산이 감소된다. 그러므로, 종양 덩어리는 인터페론의 효과로부터의 보호구역이 되는 경향이 있다. 또한, 인터페론 자체는 항종양 효과를 가질 수 있다. 예를 들면, IFN-γ는 MHC 클래스-I-관련 항원 제시를 증가시킬 수 있고; 이는 보다 효율적인 CTL-매개된 종양 세포 사멸을 가능하게 할 것이다. IFN-α/β는, 예를 들면 종양 덩어리 내에서 혈관신생(angiogenesis)을 차단하여 종양 성장을 차단할 수 있다.
2. 보체 조절 폴리펩티드
바이러스 병원체 제거의 주요 기전은 보체-의존적 기전에 의한 숙주 내의 감염된 세포의 사멸 또는 유기체 내의 비리온의 사멸이다. 감염된 세포가 죽게 되므로, 감염성 바이러스를 계속 생산할 수 없게 된다. 또한, 아폽토시스(apoptosis) 동안에 DNA를 분해하는 세포내 효소가 방출된다. 이러한 효소로 인해 바이러스 DNA가 분해되고 바이러스가 불활성화될 수 있다. 아폽토시스는 활성화된 보체와 보체 막 공격 복합체(complement membrane attack complex)의 결합을 포함하는 많은 기전에 의해 유도될 수 있다. 백시니아와 같은 폭스바이러스는 진화되어, 바이러스 및/또는 바이러스에 감염된 세포의 보체-매개된 제거를 방해할 수 있는 유전자 산물을 발현하게 되었다. 그러므로 이러한 유전자는 아폽토시스를 방해하고 보체-의존적 기전에 의한 바이러스 제거를 억제하여, 바이러스 감염이 계속되게 하고 바이러스 병원성이 증가되게 한다. 예를 들면, 백시니아 바이러스 보체 조절 단백질(VCP)(예: C21L)은 보체-매개된 세포 사멸 및/또는 바이러스 불활성화의 예방에서 일정한 역할을 한다[참조: Isaacs et al., 1992]. VCP는 또한, VCP가 발현되면 바이러스에 감염된 조직 속으로의 백혈구 침윤이 감소되므로, 항염증 효과를 갖는다. 보체 조절 폴리펩티드에는 C3L 또는 C21L로도 공지된 VCP가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
암세포는 종종 세포 항-보체 단백질을 과발현하고; 이는 암세포가 보체 공격 +/- 종양-특이적 항체에 대해 살아남게 한다[참조: Caragine et al ., 2002; Durrant et al ., 2001; Andoh et al . 2002]. 그러므로, 보체-매개된 사멸에 대한 내재된 내성으로 인해 주로 종양 세포를 표적화하는 약제는 광범위한 사람 암에서 선택성 및 잠재적인 효능을 가질 것이다[참조: Durrant et al., 2001]. 또한, 암세포의 특징 중의 하나는 정상적인 아폽토시스 기전의 손실이다[참조: Gross et al., 1999]. 아폽토시스에 대한 내성은 발암 뿐만 아니라, 항종양제 (예: 면역제, 화학요법제 및 방사선 요법제)에 대한 내성을 촉진시킨다[참조: Eliopoulos et al., 1995]. 아폽토시스 억제는 아폽토시스 촉진성 분자 (예: bax) 기능의 손실, 항-아폽토시스 분자 (예: bcl-2)의 수준/기능의 증가 및 최종적으로 보체 민감성의 손실에 의해 매개될 수 있다.
3. TNF -조절 폴리펩티드
바이러스 병원체 제거의 다양한 기전 중의 하나는 상기한 바와 같이 아폽토시스의 유도에 의한 숙주 내의 감염된 세포의 사멸이다. 아폽토시스는 TNF 및 림포톡신(lymphotoxin)-알파(LTα)와 세포 TNF 수용체와의 결합을 포함하는 다양한 기전에 의해 유도될 수 있고, 이는 세포내 시그날전달 연속증폭단계(cascade)를 유도한다. TNF 수용체의 활성화는 면역 및 염증 반응의 조절에서 뿐만 아니라, 아폽토시스성 세포 사멸을 유도하는데 기능을 한다[참조: Wallach et al ., 1999].
일부 백시니아 바이러스 주를 포함하는 다양한 폭스바이러스 주는 진화되어, 바이러스 및/또는 바이러스에 감염된 세포의 TNF-매개된 제거를 방해할 수 있는 유전자 산물을 발현하게 되었다. 이러한 유전자에 의해 암호화된 단백질은 세포외 TNF와 결합하여 이를 격리시켜 TNF의 염증촉진성 및 아폽토시스 유도 활성을 우회하여, 바이러스 제거를 억제한다. 바이러스가 제거되지 않으므로, 바이러스 감염이 계속되어, 바이러스 병원성이 증가하게 된다. 폭스바이러스 과의 다양한 일원은 분비되는 바이러스 TNF 수용체(vTNFR)를 발현한다. 예를 들면, 다수의 폭스바이러스는 vTNFR을 암호화하고, 예를 들면 점액종 (T2 단백질), 우두 및 백시니아 바이러스 주, 예를 들면 리스터(Lister)는 하나 이상의 CrmB, CrmC (A53R), CrmD, CrmE, B28R 단백질 및/또는 이의 동등물을 암호화할 수 있다. 이러한 vTNFR은 TNF-매개된 세포 사멸 및/또는 바이러스 불활성화의 예방에서 일정한 역할을 한다[참조: Saraiva and Alcami, 2001]. TNF 조절 폴리펩티드에는 A53R, B28R (이 단백질은 존재하지만, 백시니아 바이러스의 코펜하겐 주에서는 불활성일 수 있다) 및 유사한 활성 또는 특성을 갖는 다른 폴리펩티드가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
암세포의 특징 중의 하나는 이상(異常) 유전자 발현이고, 이는 TNF의 항암 활성에 대한 민감성과 같은 성장 조절을 위한 많은 분자 기전에 대한 민감성을 손실시킬 수 있다. 따라서, 바이러스 면역조절 기전은 종양 미세환경 내에서의 바이러스의 증식에 필요하지 않을 수 있다.
4. 세린 프로테아제 억제제
바이러스 병원체 제거의 주요 기전은 숙주 내의 감염된 세포에서의 아폽토시스의 유도이다. 감염된 세포가 사멸하므로, 감염성 바이러스를 계속 생산할 수 없게 된다. 또한, 아폽토시스 동안에 DNA를 분해하는 세포내 효소가 방출된다. 이러한 효소로 인해 바이러스 DNA가 분해되고 바이러스가 불활성화될 수 있다. 아폽토시스는 사이토카인 (예: 종양 괴사 인자)의 결합, 세포독성 T-림프구에 의한 그랜자임 생산 또는 fas-리간드 결합을 포함하는 많은 기전에 의해 유도될 수 있으며; 카스파제 활성화는 마지막의 공통적인 아폽토시스 경로의 결정적인 부분이다. 바이러스는 진화되어, fas-리간드 또는 종양 괴사 인자(TNF)/TNF-관련 분자 [예: 아데노바이러스의 E3 10.4/ 14.5, 14.7 유전자(참조: Wold et al ., 1994); 아데노바이러스의 E1B-19kD(참조: Boyd et al ., 1994); 우두 바이러스의 crmA; 백시니아 바이러스의 B13R]를 포함하는 분자에 의해 유도되는 세포내 시그날전달 연속증폭단계를 방해할 수 있는 유전자 산물을 발현하게 되었다[참조: Dobbelstein et al ., 1996; Kettle et al ., 1997]. 이러한 유전자 산물은 아폽토시스 유도 분자에 의한 아폽토시스를 방해하여, 항바이러스성 아폽토시스 유도 사이토카인, fas, 그랜자임 또는 다른 아폽토시스 자극인자의 존재에도 불구하고 바이러스 복제가 계속되게 한다.
VV SPI-2/B13R은 우두 CrmA에 대한 상동성이 높고, SPI-1 (VV)은 CrmA에 대한 상동성이 낮다[참조: Dobbelstein et al ., 1996]. 이러한 단백질은 세르핀(serpin; 세린 프로테아제 억제제)이고, CrmA 및 SPI-2는 다양한 형태의 아폽토시스의 예방에서 일정한 역할을 한다. 인터루킨-1β-전환 효소(ICE) 및 그랜자임의 억제는, 예를 들면, 감염된 세포의 아폽토시스를 방해할 수 있다. 이러한 유전자 산물은 또한 항염증 효과를 갖는다. 이들은 IL-18의 활성화를 억제할 수 있고, 이는 IL-18-매개된 IFN-γ의 유도를 감소시킬 것이다. 따라서 세포-매개된 면역에 대한 IFN-γ의 면역자극 효과가 억제된다[참조: Kettle et al ., 1997]. SPI에는 B13R, B22R 및 유사한 활성 또는 특성을 갖는 다른 폴리펩티드가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
암세포의 특징 중의 하나는 정상적인 아폽토시스 기전의 손실이다[참조: Gross et al ., 1999]. 아폽토시스에 대한 내성은 발암 뿐만 아니라, 항종양제 (예: 면역제, 화학요법제 및 방사선 요법제)에 대한 내성을 촉진시킨다[참조: Eliopoulos et al ., 1995]. 아폽토시스 억제는 아폽토시스 촉진성 분자 (예: bax) 기능의 손실 또는 항-아폽토시스 분자 (예: bcl-2)의 수준/기능의 증가에 의해 매개될 수 있다.
5. IL -1β 조절 폴리펩티드
IL-1β는 국소적으로 작용하고 전신적으로도 작용하는 생물학적 활성 인자이다. IL-1β와 IL-1α 간의 몇몇 기능적 차이만이 기술되었다. IL-1β의 많은 생물학적 활성은 IL-1이 기술되는 많은 상이한 두문자어로서 예시된다. IL-1은, 돼지 세포에서 불활성인 사람 IL-1β를 제외하고는 종 특이성을 보이지 않는다. IL-1의 일부 생물학적 활성은 ACTH (코르티코트로핀), PGE2 (프로스타글란딘 E2), PF4 (혈소판 인자-4), CSF (콜로니 자극 인자), IL-6 및 IL-8을 포함하는 다른 매개인자의 합성의 유도에 의해 간접적으로 매개된다. IL-1의 합성은 TNF-α, IFN-α, IFN-β 및 IFN-γ를 포함하는 다른 사이토카인에 의해 유도될 수 있고, 세균 내독소(endotoxin), 바이러스, 미토겐(mitogen) 및 항원에 의해서도 유도될 수 있다. IL-1의 주요 생물학적 활성은 T-헬퍼 세포를 자극하는 것이고, 이것이 유도되어 IL-2가 분비되고 IL-2 수용체가 발현된다. 바이러스에 감염된 대식세포는 T 세포 성숙 결함이 있는 환자에서 기회 감염 및 세포의 형질전환을 지원할 수 있는 다량의 IL-1 억제제를 생산한다. IL-1은 B 세포에 직접 작용하여, 이의 증식 및 면역글로불린의 합성을 촉진시킨다. IL-1은 또한 B 세포를 IL-5에 대해 반응성으로 만드는 프라이밍(priming) 인자 중의 하나로서 기능을 한다. IL-1은 NK 세포, 섬유아세포, 흉선 세포 및 신경교아세포종 세포의 증식 및 활성화를 자극한다.
바이러스 단백질에 의한 IL-1β 합성 차단은, IL-1에 의해 유도되는 전신적 항바이러스 반응을 억제시키거나 감소시키는 바이러스의 전략인 것으로 생각된다. B15R과 유사한 활성으로 IL-1의 기능을 효과적으로 차단하는 결합 단백질은 우두 바이러스의 유전자에 의해서도 암호화되는 것으로 밝혀졌다. 백시니아 바이러스는 또한 B8R이라고 명명된 또다른 단백질을 암호화하고, 이는 사이토카인에 대한 수용체처럼 작용한다[참조: Alcami and Smith, 1992; Spriggs et al ., 1992]. IL-1 조절 폴리펩티드에는 B13R, B15R 및 유사한 활성 또는 특성을 갖는 다른 폴리펩티드가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
암세포의 특징 중의 하나는 이상 유전자 발현이고, 이는 IL-1의 항암 활성에 대한 민감성과 같은 성장 조절을 위한 많은 분자 기전에 대한 민감성을 손실시킬 수 있다. 따라서, 바이러스 면역조절 기전은 종양 미세환경 내에서의 바이러스의 증식에 필요하지 않을 수 있다.
6. EEV 형
전이성 종양 부위로의 바이러스의 확산, 및 감염된 고형 종양 덩어리 내에서의 확산도 일반적으로 비효율적이다[참조: Heise et al ., 1999]. 정맥내로 투여하면 통상적으로, 항체 (예: 아데노바이러스)[참조: Kay et al ., 1997] 및/또는 보체 시스템 (예: HSV)[참조: Ikeda et al ., 1999]에 의해 바이러스가 제거되거나 불활성화된다. 이러한 면역-매개된 기전 외에도, 이러한 바이러스의 생체분포로 인해 대다수의 정맥내 바이러스는 종양 덩어리 보다는 정상 조직 내에 침착된다. 정맥내 아데노바이러스는, 예를 들면, 주로 간 및 비장 내에 존재하게 되고; 면역결핍 마우스에서도 투입된 바이러스의 0.1% 미만이 종양 내에 침착된다[참조: Heise et al., 1999]. 그러므로, 일부 적당한 항종양 효능이 면역결핍 마우스 종양 모델에서 매우 높은 상대적인 용량을 사용하여 증명될 수 있지만, 정맥내 전달은 매우 비효율적이고 효능을 상당히 제한한다.
백시니아 바이러스는 고형 종양 내에서 복제하여 괴사를 일으키는 능력을 갖는다. 또한, 티미딘 키나제 결실 돌연변이체는 종양 덩어리 및 난소 조직을 감염시켜, 마우스 종양 모델 시스템에서 우선적으로 마커 유전자를 발현할 수 있다[참조: Gnant et al ., 1999]. 하지만, 이러한 연구는 일반적으로 5일 이상 후에 마커 유전자 발현에 따라 종양 표적화를 측정하였기 때문에, 바이러스가 우선적으로 종양/난소 조직에서 침착되거나, 유전자를 발현하거나, 복제하는지는 불명확하다[참조: Puhlmann et al ., 2000]. 기전에 관계없이, 추가적인 전이유전자가 부재하는 이러한 바이러스의 항종양 효능은 통계적으로 유의적이지 않았다[참조: Gnant et al., 1999]. 대조적으로, 종양내 바이러스 주사는 유의적인 항종양 효능이 있었다[참조: McCart et al . 2000]. 그러므로, 종양으로의 i.v. 전달을 향상시키면 i.v. 효능이 향상될 수 있을 것이다.
백시니아 바이러스는 세포에서 복제하여 세포내 바이러스 (세포내 성숙 바이러스 (IMV), 세포내 외피 바이러스 (IEV)) 및 세포외 바이러스 (세포외 외피 바이러스 (EEV), 세포 결합된 세포외 바이러스 (CEV))를 생산한다[참조: Smith et al ., 1998]. IMV는 야생형 백시니아 바이러스 주에 의한 복제 후 대략 99%의 바이러스 수율을 나타낸다. 상기 바이러스형은 자연환경에서 상대적으로 안정하므로, 이는 개체 간의 확산을 주로 담당하지만; 대조적으로, 상기 바이러스는 세포로부터의 비효율적인 방출 및 보체 및/또는 항체 중화에 대한 민감성으로 인해 감염된 숙주 내에서 효율적으로 확산되지 않는다. 대조적으로, EEV는 세포외 환경 속으로 방출되고, 일반적으로 대략 1%의 바이러스 수율만을 나타낸다[참조: Smith et al ., 1998]. EEV는 감염된 숙주 내에서 바이러스 확산을 담당하고, 숙주 밖에서는 상대적으로 쉽게 분해된다. 중요하게는, EEV는 혈류 내에서의 이의 중화를 억제시키는 다수의 기전을 발전시켰다. 첫번째로, EEV는 보체에 대해 상대적으로 내성이다[참조: Vanderplasschen et al ., 1998]; 이 특징은 외막 피막 속으로의 보체의 숙주 세포 억제제의 혼입, 및 국소적 세포외 환경으로의 백시니아 바이러스 보체 조절 단백질(VCP)의 분비로 인한 것이다. 두번째로, EEV는 IMV와 비교하여 중화 항체 효과에 대해 상대적으로 내성이다[참조: Smith et al ., 1997]. EEV는 또한 IMV (세포 사멸 동안/후에만 방출됨)보다 감염 후 초기 시점 (예: 4 내지 6시간)에 방출되므로, EEV형의 확산이 더 빠르다[참조: Blasco et al ., 1993].
불행하게도, 하지만, 야생형 백시니아 주는 상대적으로 소량의 EEV만을 생산한다. 또한, 백시니아 바이러스를 사용한 치료 (즉, 바이러스의 투여)는 현재까지 세포내 바이러스형에 한정되었다. 표준 백시니아 바이러스(VV) 제조 및 정제 방법으로는 EEV가 불활성화되고[참조: Smith et al ., 1998], 주로 비-사람 세포주를 사용하여 바이러스를 제조하며; 비-사람 세포로부터의 EEV는 보체-매개된 제거로부터 보호되지 않을 것이다 (EEV에 의해 세포로부터 수득된 보체 억제 단백질은 종 제한된(species restricted) 효과를 갖는다). 그러므로, 백시니아 바이러스 효능은 중화에 대한 IMV형의 상대적인 민감성 및 고형 종양 덩어리 내에서의 비효율적인 확산에 의해 제한되었고; 이러한 확산은 통상적으로 임의의 세포에서 근처의 세포로의 확산이다. 혈류 또는 림프관을 통한 원거리 종양 덩어리로의 IMV 확산은 또한 비효율적이다.
그러므로, 드문 EEV형의 백시니아 바이러스는 현재까지 환자에서 사용되는 백시니아 바이러스형(IMV)보다 우수한 특성을 자연적으로 획득하였다; EEV는 국소적으로 고형 종양을 통한 신속하고 효율적인 확산, 및 국부적 또는 원거리 종양 부위로의 확산에 최적화되어 있다. EEV는 보체 효과에 대해 상대적으로 내성이므로, 동일한 종으로부터의 세포 종류에서 성장시키는 경우, 상기 바이러스형은 혈관내 투여 후 표준 백시니아 바이러스 (IMV만을 함유함) 제제보다 향상된 안정성을 갖고 혈중에서 활성을 오래 유지할 것이다[참조: Smith et al ., 1998]. EEV는 항체-매개된 중화에 대해 내성이므로, 상기 바이러스형은 혈관내 투여 후 표준 백시니아 바이러스 (거의 IMV만을 함유함) 제제보다 혈중에서 활성을 오래 유지할 것이다[참조: Vanderplasschen et al ., 1998]. 이러한 특징은 일단 중화 항체 수준이 증가한 경우 반복 투여에 특히 중요할 것이다; 모든 승인된 항암 요법은 반복 투여를 필요로 한다. 그러므로, EEV형의 백시니아 및 기타 폭스바이러스는 혈류를 통해 종양으로 치료학적 바이러스 및 이의 유전적 적재(genetic payload)를 우수하게 전달할 것이다. 이는 표준 폭스바이러스 제제와 비교하여 전신적 효능을 향상시킬 것이다. 마지막으로, EEV는 생체 밖에서 매우 불안정하므로, 일반 대중에서 개체로의 전염 위험성을 상당히 감소시켜야 한다. EEV형의 바이러스의 조절에 관련된 폴리펩티드에는 A34R, B5R 및 EEV형의 폭스바이러스의 생산에 영향을 주는 다양한 다른 단백질이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. A34R의 코돈 151번에서 리신이 아스파르트산으로 돌연변이 (K151D 돌연변이)가 일어나면, A34R 단백질이 EEV형을 세포막에 테더링(tethering)을 잘 할 수 없게 된다. B5R은 보체에 결합할 수 있는 EEV-막 결합된 폴리펩티드이다. A43R 전체가 결실되면 EEV 방출이 증가하지만 바이러스의 감염성이 현저하게 감소할 수 있는 반면에, K151D 돌연변이는 방출된 바이러스의 감염성을 유지하면서 EEV 방출을 증가시킨다. B5R은 VCP(항-보체)에 대해 서열 동일성을 갖지만, 보체 억제는 아직 입증되지 않았다.
간단하게 설명하면, 강화된 EEV형을 확인하는 한가지 방법은 다음과 같다. EEV를 빙냉 MEM 중에 희석하여, 빙냉 MEM 중에 희석 (1/10, 1/20 또는 1/30의 최종 혈청 희석)된 활성 또는 열-불활성화된 (56℃, 30분, 대조군) 혈청과 혼합한다 (1:1 용적). 75분 동안 7℃에서 항온처리한 후, 샘플을 얼음 상에서 냉각시키고 mAb 5B4/2F2를 새로운 EEV 샘플에 첨가하여 임의의 오염물질(IMV 및 파열된 EEV)을 중화시킨다. 이어서, 비리온을 RK13 세포에 1시간 동안 얼음 상에서 결합시키고, 보체 및 비-결합된 비리온을 씻어내어, 2일 후에 플라크의 수를 센다. 플라크의 수가 많을수록 보체에 대한 내성이 높다[참조: 본원에 참조로서 인용된, Vanderplasschen et al ., 1998]. EEV형의 백시니아 바이러스의 분리를 기술한 대표적인 방법은 문헌[참조: Blasco et al ., 1992 (본원에 참조로서 인용됨)]에서 찾을 수 있다.
7. 기타 폴리펩티드
기타 바이러스 면역조절 폴리펩티드에는 다른 면역 반응 조절인자에 결합하고/하거나 면역 반응과 관련된 분자 경로를 조절하는 폴리펩티드, 예를 들면, B29R (이 단백질은 존재하지만, 백시니아 바이러스의 코펜하겐 주에서는 불활성일 수 있다), C23L, vCKBP, A41L 및 유사한 활성 또는 특성을 갖는 폴리펩티드와 같은 케모카인 결합 폴리펩티드가 포함될 수 있다. 바이러스 EGF-유사 성장 인자인 백시니아 바이러스 성장 인자 (예: C11L)와 같은 다른 백시니아 바이러스 단백질은, 본 발명의 일부 양태에서 변형을 위한 표적이 될 수도 있다. 바이러스 면역조절 인자로서 분류될 수 있는 다른 폴리펩티드에는 B7R, N1L, 또는 활성 또는 특성이 폭스바이러스의 병원성을 증가시키는 다른 폴리펩티드가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
8. 백시니아 바이러스-유도된 세포 융합
본 발명의 특정 양태에서, A56R 또는 K2L 암호화 핵산 유전자의 변형, 결실 또는 돌연변이는 VV 감염에 의해 유도된 세포-세포 융합 또는 합포체(syncytium) 형성을 유도할 수 있다. 백시니아 바이러스-유도된 세포 융합은 통상적으로 종양내 바이러스 확산으로 인해 VV의 항종양 효능을 증가시킬 것이다. 세포 융합에 의한 종양내 바이러스 확산은 통상적으로 바이러스가 중화 항체 및 면역 반응을 회피하게 할 것이다. 근처의 비-감염된 세포의 사멸 및 감염 (즉, "방관자(bystander)" 효과)은 하나 또는 2개의 상기 유전자에 돌연변이를 갖는 VV에서 보다 효율적일 수 있고, 이는 국소적 항종양 효과를 향상시킬 수 있다.
B. 바이러스 증식
백시니아 바이러스는 본원에 참조로서 인용된 문헌[참조: Earl and Moss, Ausbel et al ., Current Protocols in Molecular Biology, pages 16.15.1-16.18.10]에 기술된 방법을 사용하여 증식시킬 수 있다.
III . 단백질성 및 핵산 조성물
본 발명은 환자의 암세포 및 암을 연구하고 치료하는데 유리한 폭스바이러스에 관한 것이다. 본 발명은 야생형과 비교하여 임의로 하나 이상의 돌연변이를 갖도록 작제되어, 비-암세포에 대해 독성이 낮거나 무독성이면서, 암세포에 대해 사용하는데 바람직한 특성을 갖는 백시니아 바이러스에 관한 것이다. 이러한 폭스바이러스는 본원에 참조로서 인용된 PCT/US2003/025141에 기술되어 있다. 아래에 기술된 설명은 본 발명의 방법 및 조성을 실시하는 다양한 프로토콜을 예로서 제공한다. 이들은 돌연변이된 바이러스를 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성시키기 위한 배경기술을 제공한다.
A. 단백질성 조성물
특정 양태에서, 본 발명은 임의로 하나 이상의 기능성 폴리펩티드 또는 단백질이 없는 백시니아 바이러스의 생성 및/또는 감염성 EEV형과 같은 특정 형태의 바이러스를 보다 많이 방출시키는 능력을 갖는 폭스바이러스의 생성에 관한 것이다. 다른 양태에서, 본 발명은 폭스바이러스, 및 약제학적으로 허용되는 제형의 일부분으로서 단백질성 조성물과 함께 이의 용도에 관한 것이다.
본원에서 사용되는 "단백질" 또는 "폴리펩티드"는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 분자를 말한다. 일부 양태에서, 단백질 또는 폴리펩티드의 야생형 버전이 사용되지만, 본 발명의 많은 양태에서, 바이러스 단백질 또는 폴리펩티드는 부재하거나 변형되어, 바이러스가 환자의 암세포 또는 암의 치료에 보다 유용하게 된다. 상기 용어는 본원에서 상호교환가능하게 사용될 수 있다. "변형된 단백질" 또는 "변형된 폴리펩티드"는 야생형 단백질 또는 폴리펩티드와 비교하여 화학 구조가 변형된 단백질 또는 폴리펩티드를 말한다. 일부 양태에서, 변형된 단백질 또는 폴리펩티드는 하나 이상의 변형된 활성 또는 기능을 갖는다 (단백질 또는 폴리펩티드는 다수의 활성 또는 기능을 가질 수 있다는 것을 인식한다). 변형된 활성 또는 기능은, 야생형 단백질 또는 폴리펩티드의 활성 또는 기능과 비교하여, 일부 다른 면 (예: 특이성)에서 감소되거나, 축소되거나, 제거되거나, 향상되거나, 개선되거나, 변형될 수 있다. 변형된 단백질 또는 폴리펩티드가 다른 면에서는 아직 야생형 활성 또는 기능을 보유하면서, 하나의 활성 또는 기능에 대해 변형될 수 있는 것이 구체적으로 고려된다. 대안으로, 변형된 단백질은 완전히 비-기능성이거나, 이의 동족(cognate) 핵산 서열이 변형되어 폴리펩티드가 더이상 전혀 발현되지 않거나, 절두(truncation)되거나, 프레임 이동(frameshift)의 결과로서 상이한 아미노산 서열이 발현될 수 있다.
특정 양태에서, 돌연변이된 단백질 또는 폴리펩티드의 크기에는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500개 또는 그 이상의 아미노산 분자 잔기 및 이 사이의 임의의 범위가 포함될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 폴리펩티드가 절두에 의해 돌연변이되어, 상응하는 야생형보다 더 짧아지는 것이 고려된다.
본원에서 사용되는 "아미노산 분자"는 당업자에게 공지된 바와 같은 임의의 아미노산, 아미노산 유도체 또는 아미노산 모방체(mimic)를 말한다. 특정 양태에서, 단백질성 분자의 잔기는 아미노산 분자 잔기의 서열에 개입된 비-아미노산 분자 없이 연속적이다. 다른 양태에서, 서열은 하나 이상의 비-아미노산 분자 잔기를 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 단백질성 분자의 잔기의 서열에 하나 이상의 비-아미노산 분자 잔기가 개입될 수 있다.
따라서, "단백질성 조성물"이라는 용어는 자연적으로 합성되는 단백질 중의 20개의 통상적인 아미노산 중 하나 이상, 또는 하나 이상의 변형된 또는 비-통상적인 아미노산을 포함하는 아미노산 분자 서열을 포함한다.
단백질성 조성물은 표준 분자 생물학적 기술을 통한 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 발현, 천연 공급원으로부터의 단백질성 화합물의 분리, 또는 단백질성 물질의 화학적 합성을 포함하는, 당업자에게 공지된 임의의 기술로 제조할 수 있다. 다양한 유전자에 대한 뉴클레오타이드 및 단백질, 폴리펩티드 및 펩티드 서열은 이미 공개되었고, 당업자에게 공지된 컴퓨터화된 데이터베이스에서 검색할 수 있다. 한가지 이러한 데이터베이스로는 기관[National Center for Biotechnology Information]의 GenBank 및 GenPept 데이터베이스 (www.ncbi.nlm.nih.gov)가 있다. 이러한 공지된 유전자에 대한 암호화 영역은 본원에서 공개되거나 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 증폭시키고/시키거나 발현시킬 수 있다.
1. 기능적인 면
본 특허원에서 바이러스 단백질 또는 폴리펩티드의 기능 또는 활성을 말하는 경우, 이는 달리 명시하지 않으면 생리학적 조건 하에서 상기 바이러스 단백질 또는 폴리펩티드의 활성 또는 기능을 말하는 것이다. 예를 들면, 인터페론-조절 폴리펩티드는 직접적 또는 간접적으로 하나 이상의 인터페론 및 이의 활성에 영향을 주는 폴리펩티드를 말한다. 폴리펩티드는 직접적 또는 간접적으로 인터페론의 활성을 유도하거나, 향상시키거나, 높이거나, 증가시키거나, 축소시키거나, 약화시키거나, 감소시키거나, 억제시키거나, 차폐시킬 수 있다. 일부 양태에서, 인터페론에 직접적으로 영향을 주는 예에는 인터페론에 특이적으로 결합하는 인터페론-조절 폴리펩티드가 포함된다. 어떤 분자가 이러한 활성을 갖는지 결정하는 것은 당업자에게 익숙한 검정을 사용하여 달성할 수 있다. 예를 들면, 인터페론 또는 이의 변이체를 조절하는 산물을 암호화하는 유전자를, 이러한 유전자가 전달된 세포와 비교하여 인터페론 활성에 대해 유도된 세포 속으로 전달하여, 인터페론 반응의 상이한 수준에 의해, 인터페론-조절 기능을 갖는 분자를 확인할 수 있다.
조절인자는, 예를 들면 인터페론-암호화 전사체에 결합하여, 표적화된 분자의 경로에 관련된 단백질성 조성물의 발현에 영향을 주는 분자일 수 있는 것이 구체적으로 고려된다. 어떤 분자가 인터페론, IL-1β, TNF 또는 치료학적으로 유용한 다른 분자의 적당한 조절인자인지 결정하는 것은 당업자에게 익숙한 검정을 사용하여 달성할 수 있으며, 이들 중 일부는 본원에 공개되어 있고, 예를 들면, 천연 및/또는 재조합 바이러스 단백질의 사용이 포함될 수 있다.
2. 바이러스 폴리펩티드의 변이체
본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체는 치환, 삽입 또는 결실 변이체일 수 있다. 바이러스 폴리펩티드를 암호화하는 유전자 내의 돌연변이는, 야생형과 비교하여, 폴리펩티드의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500개 또는 그 이상의 비-연속적인 또는 연속적인 아미노산에 영향을 줄 수 있다. 백시니아 바이러스에 의해 암호화된 다양한 폴리펩티드는, 본원에 참조로서 인용된 문헌[참조: Rosel et al . (1986), Goebel et al . (1990)] 및 GenBank 번호 NC_001559를 참조하여 확인할 수 있다.
결실 변이체는 천연 또는 야생형 단백질의 하나 이상의 잔기가 없다. 개개의 잔기가 결실되거나, 도메인 (예: 촉매 또는 결합 도메인)의 전부 또는 일부가 결실될 수 있다. 종결 코돈이 암호화 핵산 서열 속으로 (치환 또는 삽입에 의해) 도입되어 절두된 단백질이 생성될 수 있다. 삽입 돌연변이체는 통상적으로 폴리펩티드의 비-말단 지점에 물질의 부가를 포함한다. 이는 면역반응성 에피토프(epitope) 또는 단순하게 하나 이상의 잔기의 삽입을 포함할 수 있다. 융합 단백질이라고 하는 말단 부가물이 생성될 수도 있다.
치환 변이체는 통상적으로 단백질 내의 하나 이상의 부위에서 하나의 아미노산의 다른 아미노산으로의 교환을 함유하고, 다른 기능 또는 특성을 손실시키거나 손실시키지 않으면서, 폴리펩티드의 하나 이상의 특성을 조절하도록 설계될 수 있다. 치환은 보존적일 수 있다, 즉 하나의 아미노산이 유사한 모양과 전하를 갖는 아미노산으로 치환될 수 있다. 보존적 치환은 당업계에 익히 공지되어 있고, 예를 들면, 알라닌에서 세린으로; 아르기닌에서 리신으로; 아스파라긴에서 글루타민 또는 히스티딘으로; 아스파르테이트에서 글루타메이트로; 시스테인에서 세린으로; 글루타민에서 아스파라긴으로; 글루타메이트에서 아스파르테이트로; 글리신에서 프롤린으로; 히스티딘에서 아스파라긴 또는 글루타민으로; 이소류신에서 류신 또는 발린으로; 류신에서 발린 또는 이소류신으로; 리신에서 아르기닌으로; 메티오닌에서 류신 또는 이소류신으로; 페닐알라닌에서 티로신, 류신 또는 메티오닌으로; 세린에서 트레오닌으로; 트레오닌에서 세린으로; 트립토판에서 티로신으로; 티로신에서 트립토판 또는 페닐알라닌으로; 및 발린에서 이소류신 또는 류신으로의 치환이 포함된다. 대안으로, 치환이 비-보존적이어서, 폴리펩티드의 기능 또는 활성이 영향을 받을 수 있다. 비-보존적 치환에는 통상적으로, 화학적으로 상이한 잔기로의 치환, 예를 들면 극성 또는 전하를 띤 아미노산에서 비극성 또는 전하를 띠지 않은 아민노산으로의 치환 및 그 반대가 포함된다.
본원에서 사용되는 "기능적으로 동등한 코돈"이라는 용어는 아르기닌 또는 세린에 대한 6개의 코돈과 같이 동일한 아미노산을 암호화하는 코돈을 말하며, 또한 생물학적으로 동등한 아미노산을 암호화하는 코돈을 말한다 (아래 표 1 참조).
아미노산 및 핵산 서열은 추가적인 N- 또는 C-말단 아미노산 또는 5' 또는 3' 서열과 같은 추가적인 잔기를 포함할 수 있으며, 서열이 위에 제시된 기준 (예: 단백질 발현과 관련하여 생물학적 단백질 활성의 유지)을 충족하는 한, 본질적으로 본원에서 공개된 서열 중의 하나에 제시된 것과 같다. 말단 서열은 특히, 예를 들면, 암호화 영역의 5' 또는 3' 부분을 플랭킹(flanking)하는 다양한 비-암호화 서열을 포함하거나, 유전자 내에 존재하는 것으로 공지된 다양한 내부 서열(즉, 인트론)을 포함할 수 있는 핵산 서열에 부가될 수 있다.
[표 1]
Figure 112014022063024-pat00001
다음은 단백질의 아미노산의 변화를 통한 동등하거나 향상된 제2 세대 분자의 생성을 토대로 하는 논의이다. 예를 들면, 특정 아미노산은 단백질 구조에서, 예를 들면, 항체의 항원 결합 영역 또는 기질 분자 상의 결합 부위와 같은 구조와의 상호작용 결합 능력의 분명한 손실 없이 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 단백질의 생물학적 기능적 활성을 결정하는 것은 단백질의 상호작용 능력 및 특성이므로, 특정 아미노산 치환을 단백질 서열에서, 그리고 이의 DNA 암호화 서열에서 실시하여도 유사한 특성을 갖는 단백질이 생성될 수 있다. 따라서, 아래에 논의된 바와 같이 생물학적 유용성 또는 활성의 분명한 손실 없이 유전자의 DNA 서열에서 다양한 치환을 실시할 수 있다는 것을 본 발명자는 고려한다. 표 1에는 특정 아미노산을 암호화하는 코돈이 제시되어 있다.
이러한 치환의 생성에서, 아미노산의 하이드로파시 지수(hydropathic index)를 고려할 수 있다. 상호작용하는 생물학적 기능을 단백질에 부여함에 있어서 하이드로파시 아미노산 지수의 중요성은 당업계에서 일반적으로 이해된다[참조: Kyte and Doolittle, 1982]. 아미노산의 상대적인 하이드로파시 특성은 생성되는 단백질의 2차 구조에 관여하고, 이는 단백질과 다른 분자 (예: 효소, 기질, 수용체, DNA, 항체, 항원 등) 간의 상호작용을 결정한다는 것이 인정된다.
유사한 아미노산의 치환을 친수도에 따라 효과적으로 실시할 수 있다는 것은 또한 당업계에서 이해된다. 본원에 참조로서 인용된 미국특허 제4,554,101호에는, 근처의 아미노산의 친수도에 의해 결정되는 단백질의 국지적인 평균 친수도의 최대값은 단백질의 생물학적 특성과 관련된다는 것이 언급되어 있다. 미국특허 제4,554,101호에 상세히 설명된 바와 같이, 다음의 친수도 값이 아미노산 잔기에 부여되었다: 아르기닌 (+3.0); 리신 (+3.0); 아스파르테이트 (+3.0 ± 1); 글루타메이트 (+3.0 ± 1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글리신 (0); 트레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5 ± 1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 류신 (-1.8); 이소류신 (-1.8); 티로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4).
아미노산을 유사한 친수도 값을 갖는 다른 아미노산으로 치환시켜 생물학적으로 동등하고 면역학적으로 동등한 단백질을 생성시킬 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 이러한 치환에서, 친수도 값이 ±2 내에 있는 아미노산의 치환이 바람직하고, ±1 내에 있는 것이 특히 바람직하며, ±0.5 내에 있는 것이 보다 특히 바람직하다.
앞서 개관한 바와 같이, 아미노산 치환은 일반적으로 아미노산 측쇄 치환기의 상대적인 유사성, 예를 들면 소수성, 친수성, 전하, 크기 등을 토대로 한다. 다양한 앞서 언급한 특징에서 고려되는 대표적인 치환은 당업자에게 익히 공지되어 있고, 아르기닌과 리신; 글루타메이트와 아스파르테이트; 세린과 트레오닌; 글루타민과 아스파라긴; 및 발린, 류신과 이소류신이 포함된다.
IV . 핵산 분자
A. 천연 단백질 또는 변형된 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드
본 발명은 단백질 또는 폴리펩티드의 전부 또는 일부를 발현할 수 있고 세포로부터 분리가능한 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 일부 양태에서, 본 발명은 특이적으로 돌연변이되어 특정한 기능성 바이러스 폴리펩티드가 없는 바이러스를 생성시키는 바이러스 게놈에 관한 것이다. 폴리뉴클레오타이드는 바이러스 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 함유하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화할 수 있고, 또는 이들을 조작하여 이러한 바이러스 폴리펩티드를 암호화하지 않게 하거나, 하나 이상의 기능 또는 활성이 감소되거나, 축소되거나, 없어진 바이러스 폴리펩티드를 암호화하게 할 수 있다. 재조합 단백질을 발현 세포로부터 정제하여 활성 단백질을 수득할 수 있다. 게놈 뿐만 아니라, 백시니아 바이러스의 암호화 영역의 정의는 본원에 참조로서 인용된 문헌[참조: Rosel et al . (1986), Goebel et al . (1990)] 및/또는 GenBank 번호 NC_00159에서 찾을 수 있다.
본원에서 사용되는 "DNA 단편"이라는 용어는 특정한 종의 전체 게놈 DNA 없이 분리된 DNA 분자를 말한다. 그러므로, 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 단편은, 전체 포유동물 또는 사람 게놈 DNA로부터 분리되거나 정제된, 야생형, 다형성 또는 돌연변이 폴리펩티드-암호화 서열을 함유하는 DNA 단편을 말한다. "DNA 단편"이라는 용어에는 폴리펩티드(들), 폴리펩티드보다 작은 DNA 단편 및 재조합 벡터, 예를 들면 플라스미드, 코스미드(cosmid), 파지, 바이러스 등이 포함된다.
본 특허원에서 사용되는 "폭스바이러스 폴리뉴클레오타이드"라는 용어는 전체 게놈 핵산 없이 분리된 폭스바이러스 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 말한다. 유사하게, "백시니아 바이러스 폴리뉴클레오타이드"는 전체 게놈 핵산 없이 분리된 백시니아 바이러스 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 말한다. "폭스바이러스 게놈" 또는 "백시니아 바이러스 게놈"은 숙주 세포에 제공하여, 헬퍼 바이러스의 존재 또는 부재 하에서, 바이러스 입자를 수득할 수 있는 핵산 분자를 말한다. 게놈은 야생형 바이러스와 비교하여 재조합적으로 돌연변이되거나 되지 않을 수 있다.
"cDNA"라는 용어는 메신저 RNA(mRNA)를 주형으로서 사용하여 제조된 DNA를 말한다. 게놈 DNA, 또는 게놈, 비- 또는 부분적으로-프로세싱된 RNA 주형으로부터 중합된 DNA와 달리, cDNA를 사용하는 것의 장점은 cDNA는 주로 상응하는 단백질의 암호화 서열을 함유한다는 것이다. 최적 발현을 위하여 비-암호화 영역이 필요한 경우, 또는 안티센스(antisense) 전략에서 인트론과 같은 비-암호화 영역을 표적화하는 경우와 같이, 전체 또는 부분적 게놈 서열이 바람직한 경우가 있을 수 있다.
주어진 종으로부터의 특정 폴리펩티드가, 약간 상이한 핵산 서열을 갖지만 그럼에도 불구하고 동일한 단백질을 암호화하는 천연 변이체에 의해 발현될 수 있는 것이 또한 고려된다 (위의 표 1 참조).
유사하게, 분리되거나 정제된 야생형 또는 돌연변이 폴리펩티드 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오타이드는, 다른 천연 유전자 또는 단백질 암호화 서열로부터 실질적으로 분리된 야생형 또는 돌연변이 폴리펩티드 암호화 서열 및, 특정 양상에서, 조절 서열을 포함하는 DNA 단편을 말한다. 상기 양상에서, 간단하게 사용되는 "유전자"라는 용어는 기능성 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드-암호화 단위 (예: 적당한 전사, 해독후 변형 또는 위치결정에 필요한 임의의 서열)를 말한다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 이러한 기능적 용어에는 단백질, 폴리펩티드, 도메인, 펩티드, 융합 단백질 및 돌연변이체를 발현하거나, 발현하도록 변형될 수 있는 게놈 서열, cDNA 서열 및 조작된 작은 유전자 단편이 포함된다. 천연 또는 변형된 폴리펩티드의 전부 또는 일부를 암호화하는 핵산은 다음의 길이를 갖는 이러한 폴리펩티드의 전부 또는 일부를 암호화하는 연속적인 핵산 서열을 함유할 수 있다: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 441, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1070, 1080, 1090, 1095, 1100, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 9000, 10000개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드, 뉴클레오사이드 또는 염기쌍.
특정 양태에서, 본 발명은 아미노산 서열 내에 천연 폴리펩티드에 따른, 또는 본질적으로 이에 상응하는 연속적인 아미노산 서열을 포함하는 야생형 또는 돌연변이 폭스바이러스 폴리펩티드 또는 펩티드를 암호화하는 DNA 서열을 혼입시키는 분리된 DNA 단편 및 재조합 벡터에 관한 것이다. 따라서, 분리된 DNA 단편 또는 DNA 단편을 함유하는 벡터는, 예를 들면, TNF 활성을 억제하거나 감소시킬 수 있는 TNF 조절인자 또는 TNF-조절 폴리펩티드를 암호화할 수 있다. "재조합체"라는 용어는 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드의 이름과 함께 사용될 수 있고, 이는 일반적으로 시험관내에서 조작된 핵산 분자로부터 생산된 폴리펩티드 또는 이러한 분자의 복제된 산물인 폴리펩티드를 말한다.
다른 양태에서, 본 발명은 아미노산 서열 내에 폴리펩티드에 따른, 또는 본질적으로 이에 상응하는 연속적인 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 펩티드를 암호화하는 DNA 서열을 혼입시키는 분리된 DNA 단편 및 재조합 벡터에 관한 것이다.
본 발명에서 사용되는 핵산 단편은, 암호화 서열 자체의 길이에 관계없이, 프로모터, 폴리아데닐화 시그날, 추가적인 제한 효소 부위, 다중 클로닝 부위, 다른 암호화 단편 등과 같은 다른 핵산 서열과 조합되어, 전체 길이가 상당히 변화할 수 있다. 그러므로 거의 모든 길이의 핵산 단편이 사용될 수 있고, 바람직하게는 의도된 재조합 DNA 프로토콜에서의 제조 및 사용을 용이하게 하기 위하여 전체 길이가 제한되는 것이 고려된다.
본 발명의 핵산 작제물은, 임의의 공급원으로부터의 전체 길이 폴리펩티드를 암호화하거나, 폴리펩티드의 절두된 버전, 예를 들면 절두된 백시니아 바이러스 폴리펩티드를 암호화하여 암호화 영역의 전사체가 절두된 버전을 발현하게 할 수 있는 것이 고려된다. 이어서, 절두된 전사체는 절두된 단백질로 해독될 수 있다. 대안으로, 핵산 서열은 추가적인 이종성 암호화 서열을 갖는 전체 길이 폴리펩티드 서열을 암호화하여, 예를 들면 폴리펩티드의 정제, 운반, 분비, 해독후 변형을 가능하게 하거나, 표적화 또는 효능과 같이 치료학적으로 유용하게 할 수 있다. 앞서 논의한 바와 같이, 태그 또는 다른 이종성 폴리펩티드를 변형된 폴리펩티드-암호화 서열에 부가할 수 있고, 이때 "이종성"은 변형된 폴리펩티드와 동일하지 않은 폴리펩티드를 말한다.
비제한적인 예에서, B18R 유전자와 같은 특정 유전자와 동일하거나 이와 상보적인 연속적인 일련의 뉴클레오타이드를 포함하는 하나 이상의 핵산 작제물을 제조할 수 있다. 핵산 작제물은, 효모 인공 염색체와 같은 핵산 작제물의 출현이 당업자에게 공지된 경우 하에서, 길이가 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 10,000, 15,000, 20,000, 30,000, 50,000, 100,000, 250,000, 500,000, 750,000 내지 적어도 1,000,000 뉴클레오타이드일 뿐만 아니라, 염색체 크기 이하의 큰 크기의 작제물일 수 있다 (모든 중간 길이 및 중간 범위가 포함됨). 본원에서 사용되는 "중간 길이" 및 "중간 범위"는 예로 든 수치를 포함하거나 그 사이에 속하는 임의의 길이 또는 범위 (즉, 이러한 수치를 포함하고 그 사이에 속하는 모든 정수)를 의미한다는 것은 쉽게 이해될 것이다.
본 발명에서 사용되는 DNA 단편에는 생물학적으로 기능성인 동등한 변형된 폴리펩티드 및 펩티드, 예를 들면 변형된 겔로닌(gelonin) 독소가 포함된다. 이러한 서열은 핵산 서열 및 이에 의해 암호화된 단백질 내에서 자연적으로 발생하는 것으로 알려진 코돈 중복성(redundancy) 및 기능적 등가성(equivalency)의 결과로서 발생할 수 있다. 대안으로, 기능적으로 동등한 단백질 또는 펩티드는 재조합 DNA 기술을 적용하여 생성시킬 수 있고, 이때 치환되는 아미노산의 특성을 고려하여 단백질 구조의 변화를 조작할 수 있다. 사람에 의해 설계된 변화를 부위-지시된 돌연변이유발 기술을 적용하여 도입시켜, 예를 들면 단백질의 항원성을 개선시키거나, 단백질을 투여받는 대상체에 대해 생체내에서 단백질의 독성 효과를 감소시키거나, 단백질을 포함하는 임의의 치료의 효능을 증가시킬 수 있다.
특정 양태에서, 본 발명은 서열 내에 본원에서 확인된 (및/또는 참조로서 인용된) 서열에 제시된 것으로부터의 연속적인 핵산 서열을 포함하는 분리된 DNA 단편 및 재조합 벡터에 관한 것이다. 하지만, 이러한 서열을 돌연변이시켜, 야생형과 비교하여 활성이 변화된 단백질 산물을 수득할 수 있다.
본 발명은 이러한 확인된 서열의 특정 핵산 및 아미노산 서열에 한정되지 않는다는 것은 또한 이해될 것이다. 그러므로, 재조합 벡터 및 분리된 DNA 단편은 폭스바이러스-암호화 영역 자체, 기본적인 암호화 영역 내에 선택된 변화 또는 변형을 갖는 암호화 영역을 다양하게 포함하거나, 그럼에도 폭스바이러스-암호화 영역을 포함하는 큰 폴리펩티드를 암호화하거나, 변이 아미노산 서열을 갖는 생물학적으로 기능성인 동등한 단백질 또는 펩티드를 암호화할 수 있다.
본 발명의 DNA 단편은 생물학적으로 기능성인 동등한 폭스바이러스 단백질 및 펩티드를 포함한다. 이러한 서열은 핵산 서열 및 이에 의해 암호화된 단백질 내에서 자연적으로 발생하는 것으로 알려진 코돈 중복성 및 기능적 등가성의 결과로서 발생할 수 있다. 대안으로, 기능적으로 동등한 단백질 또는 펩티드는 재조합 DNA 기술을 적용하여 생성시킬 수 있고, 이때 치환되는 아미노산의 특성을 고려하여 단백질 구조의 변화를 조작할 수 있다. 사람에 의해 설계된 변화를 부위-지시된 돌연변이유발 기술을 적용하여 도입시켜, 예를 들면 단백질의 항원성을 개선시킬 수 있다.
B. 폭스바이러스 폴리뉴클레오타이드의 돌연변이유발
다양한 양태에서, 폭스바이러스 폴리뉴클레오타이드를 변화시키거나 돌연변이유발시킬 수 있다. 변화 또는 돌연변이에는 삽입, 결실, 점 돌연변이, 역위 등이 포함될 수 있고, 이는 특정 경로 또는 분자 기전을 조절, 활성화 및/또는 불활성화시킬 뿐만 아니라, 유전자 산물의 기능, 위치 또는 발현을 변화시키고, 특히 유전자 산물을 비-기능성으로 만들 수 있다. 사용되는 경우, 폭스바이러스의 전부 또는 일부를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 돌연변이유발은 다양한 표준 돌연변이유발 방법에 의해 달성될 수 있다[참조: Sambrook et al ., 1989]. 돌연변이는 유기체의 양 또는 구조에 변화가 일어나는 과정이다. 돌연변이에는 단일 유전자, 유전자 블록 또는 전체 염색체의 뉴클레오타이드 서열의 변형이 포함될 수 있다. 단일 유전자의 변화는 DNA 서열 내의 단일 뉴클레오타이드 염기의 제거, 부가 또는 치환을 포함하는 점 돌연변이의 결과이거나, 다수의 뉴클레오타이드의 삽입 또는 결실을 포함하는 변화의 결과일 수 있다.
돌연변이는 화학적 또는 물리적 돌연변이유발물질에 노출된 후 유발될 수 있다. 이러한 돌연변이 유발제에는 이온화 방사선, 자외선, 및 (일반적으로 일부 대사적 생체내 전환(biotransformation) 후에) 핵산과 직접적 또는 간접적으로 상호작용할 수 있는 알킬화제 및 다환식 방향족 탄화수소와 같은 다양한 일련의 화학물질이 포함된다. 이러한 유발제에 의해 유도된 DNA 손상은, 영향을 받은 DNA가 복제되거나 복구되는 경우, 염기 서열이 변형되어 돌연변이를 유도할 수 있다. 돌연변이는 특정한 표적화 방법을 사용하여 부위-지시될 수도 있다.
1. 무작위 돌연변이유발
a. 삽입 돌연변이유발
삽입 돌연변이유발은 공지된 DNA 단편의 삽입을 통한 유전자의 불활성화를 사용한다. 이는 몇몇 종류의 DNA 단편의 삽입을 포함하므로, 생성된 돌연변이는 일반적으로 기능 획득 돌연변이이기 보다는 기능 손실 돌연변이이다. 하지만, 기능 획득 돌연변이를 생성시키는 삽입의 다수의 예가 있다. 삽입 돌연변이유발은 세균 및 드로소필라(Drosophila)에서 매우 성공적이었고[참조: Cooley et al ., 1988], 최근에는 옥수수 (아라비돕시스(Arabidopsis)) [참조: Marks et al ., 1991; Koncz et al . 1990] 및 안티르히눔(Antirrhinum) [참조: Sommer et al ., 1990]에서 강력한 도구가 되었다. 삽입 돌연변이유발은 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 달성할 수 있다.
b. 화학적 돌연변이유발
화학적 돌연변이유발은, 표현형적 중증도의 정도와 함께 돌연변이의 전체 범위를 찾을 수 있는 능력과 같은 특정한 장점을 제공하며, 수행하는데 편리하고 비용이 많이 들지 않는다. 대다수의 화학적 발암물질은 DNA에 돌연변이를 일으킨다. 벤조[a]피렌, N-아세톡시-2-아세틸 아미노플루오렌 및 아플로톡신 B1은 세균 및 포유동물 세포에서 GC에서 TA로의 전환(transversion)을 일으킨다. 벤조[a]피렌은 또한 AT에서 TA로의 치환과 같은 염기 치환을 일으킬 수 있다. N-니트로소 화합물은 GC에서 AT로의 전환을 일으킨다. n-니트로소우레아에의 노출에 의해 유도된 티민의 O4 위치의 알킬화는 TA에서 CG로의 전환을 일으킨다.
c. 방사선 돌연변이유발
생물학적 분자는 이온화 방사선에 의해 분해된다. 입사 에너지의 흡착은 이온 및 자유 라디칼의 생성, 및 일부 공유 결합의 절단을 유도한다. 방사선 손상에 대한 감수성은 분자 간에, 그리고 동일한 분자의 상이한 결정 형태 간에 매우 다양한 것 같다. 이는 총 축적 선량, 및 또한 선량률(dose rate)에 따라 달라진다 (일단 유리 라디칼이 존재하면, 이들이 일으키는 분자 손상은 이들의 자연적 확산 속도에 따라 달라지므로 실시간적으로 달라진다). 가능한 한 샘플의 온도를 낮추어 손상을 감소시키고 조절한다. 이온화 방사선은 일반적으로 선량률에 비례하여 DNA 손상을 일으킨다.
본 발명에서, "이온화 방사선"이라는 용어는, 이온화 (전자의 획득 또는 소실)를 일으키는데 충분한 에너지를 갖거나 이에 충분한 에너지를 생산할 수 있는 입자 또는 광자를 포함하는 방사선을 의미한다. 대표적이고 바람직한 이온화 방사선으로는 x-방사선이 있다. 주어진 세포에서 필요하거나 특정 분자에 대해 필요한 이온화 방사선의 양은 일반적으로 상기 세포 또는 분자의 특성 및 돌연변이 표적의 특성에 따라 달라진다. 방사선의 유효량을 결정하기 위한 수단은 당업계에 익히 공지되어 있다.
d. 시험관내 스캐닝 돌연변이유발
무작위 돌연변이유발은 오류 빈발(error prone) PCR을 사용하여 도입시킬 수도 있다. 돌연변이유발의 속도는 주형의 희석액이 있는 다수의 관에서 PCR을 수행하여 증가시킬 수 있다.
한가지 특히 유용한 돌연변이유발 기술로는, 단백질 입체구조의 대규모 섭동(perturbation)의 위험성을 최소화시키면서, 많은 잔기를 아미노산 알라닌으로 개별적으로 치환시켜 측쇄 상호작용 손실의 효과를 측정할 수 있는 알라닌 스캐닝 돌연변이유발이 있다[참조: Cunningham et al ., 1989].
시험관내 스캐닝 포화 돌연변이유발은 (i) 리간드 결합 특이성을 조절하는 잔기의 확인, (ii) 주어진 위치에서 활성을 유지시키는 아미노산 및 활성을 없애는 아미노산의 확인을 통한 리간드 결합의 보다 나은 이해, (iii) 활성 부위 또는 단백질 하위도메인의 전체적인 유연성의 평가, (iv) 결합을 증가시키는 아미노산 치환의 확인을 포함하는 대량의 구조-기능 정보를 얻는 신속한 방법을 제공한다.
2. 부위-지시된 돌연변이유발
구조-유도된 부위-특이적 돌연변이유발은 단백질-리간드 상호작용의 분석 및 조작을 위한 강력한 도구를 제공한다[참조: Wells, 1996; Braisted et al ., 1996]. 상기 기술은 선택된 DNA 속에 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열 변화를 도입시켜 서열 변이체의 제조 및 검사를 제공한다.
부위-특이적 돌연변이유발은 목적하는 돌연변이의 DNA 서열을 암호화하는 특정 올리고뉴클레오타이드 서열 뿐만 아니라, 충분한 수의 근처의 비-변형된 뉴클레오타이드를 사용한다. 이러한 방식으로, 전환되는 결실 접합점의 양측에서 안정한 듀플렉스(duplex)를 형성하는데 충분한 크기 및 복잡성을 갖는 프라이머 서열을 제공한다. 변화되는 서열의 접합점의 양측에 약 5 내지 10개의 잔기를 갖고, 길이가 약 17 내지 25 뉴클레오타이드인 프라이머가 바람직하다.
상기 기술은 통상적으로 일본쇄 및 이본쇄 형태로 존재하는 박테리오파지 벡터를 사용한다. 부위-지시된 돌연변이유발에 유용한 벡터에는 M13 파지와 같은 벡터가 포함된다. 이러한 파지 벡터는 시판되고, 이들의 사용은 당업자에게 익히 공지되어 있다. 이본쇄 플라스미드도 부위-지시된 돌연변이유발에서 일상적으로 사용되며, 이는 관심대상의 유전자를 파지에서 플라스미드로 전달하는 단계를 생략시킨다.
일반적으로, 먼저 서열 내에 목적하는 단백질 또는 유전적 요소를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 일본쇄 벡터를 수득하거나, 이본쇄 벡터의 두 쇄를 용융시킨다. 이어서, 목적하는 돌연변이된 서열을 갖는 합성적으로 제조된 올리고뉴클레오타이드 프라이머를, 하이브리드화 조건을 선택할 때 미스매치(mismatch)의 정도를 고려하여, 일본쇄 DNA 제조물과 어닐링시킨다. 하이브리드화된 산물에 이.콜라이(E. coli) 폴리머라제 I (클레노우(Klenow) 단편)과 같은 DNA 중합 효소를 가하여 돌연변이를 갖는 쇄의 합성을 완료한다. 이에 의해, 헤테로듀플렉스(heteroduplex)가 형성되고, 이때 하나의 쇄는 본래의 비-돌연변이된 서열을 암호화하고, 제2 쇄는 목적하는 돌연변이를 갖는다. 이어서, 이러한 헤테로듀플렉스 벡터를 사용하여 이.콜라이 세포와 같은 적당한 숙주 세포를 형질전환시켜, 돌연변이된 서열 배열을 갖는 재조합 벡터를 포함하는 클론을 선별한다.
단백질의 주어진 잔기의 기능적 중요성 및 정보 내용에 관한 종합적인 정보는, 모든 19개의 아미노산 치환을 검사하는 포화 돌연변이유발에 의해 가장 잘 얻을 수 있다. 이러한 접근법의 단점은 다중잔기 포화 돌연변이유발의 세부계획이 위압적이라는 것이다[참조: Warren et al ., 1996, Zeng et al ., 1996; Burton and Barbas, 1994; Yelton et al ., 1995; Hilton et al ., 1996]. 수백개 내지 수천개의 부위 특이적인 돌연변이체를 연구해야 한다. 하지만, 향상된 기술로 인해 돌연변이체의 생산 및 신속한 스크리닝이 매우 수월해졌다. 또한, "워크 쓰루(walk-through)" 돌연변이유발의 설명에 관해서는 미국특허 제5,798,208호 및 제5,830,650호를 참조한다. 다른 부위-지시된 돌연변이유발 방법은 미국특허 제5,220,007호; 제5,284,760호; 제5,354,670호; 제5,366,878호; 제5,389,514호; 제5,635,377호 및 제5,789,166호에 공개되어 있다.
C. 벡터
"벡터"라는 용어는 벡터가 복제될 수 있는 세포 속으로 도입시키기 위한 외인성 핵산 서열을 삽입시킬 수 있는 운반체 핵산 분자를 말하는데 사용된다. 핵산 서열은 "외인성"일 수 있고, 이는 벡터를 도입시키는 세포에 대해 외부의 것이라는 의미이거나, 서열이 세포 내의 서열에 대해 상동이지만 서열이 통상적으로 발견되지 않는 숙주 세포 내의 위치에 핵산이 위치하는 것을 의미한다. 벡터에는 플라스미드, 코스미드, 바이러스 (박테리오파지, 동물 바이러스 및 식물 바이러스) 및 인공 염색체 (예: YAC)가 포함된다. 당업자는 본원에 참조로서 인용된 문헌[참조: Sambrook et al . (1989) 및 Ausubel et al . (1994)]에 기술된 표준 재조합 기술을 통해 벡터를 작제하는데 필요한 지식을 충분히 갖추고 있을 것이다. 변형된 겔로닌과 같은 변형된 폴리펩티드를 암호화하는 것 외에도, 벡터는 태그 또는 표적화 분자와 같은 비-변형된 폴리펩티드 서열을 암호화할 수 있다. 이러한 융합 단백질을 암호화하는 유용한 벡터에는, 일련의 히스티딘을 암호화하는 벡터인 pIN 벡터[참조: Inouye et al ., 1985], 및 이후의 정제 및 분리 또는 절단을 위한 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST) 가용성 융합 단백질을 생성시키는데 사용하기 위한 pGEX 벡터가 포함된다. 표적화 분자는 변형된 폴리펩티드를 특정 기관, 조직, 세포 또는 대상체의 신체 내의 다른 위치로 지시하는 것이다.
"발현 벡터"라는 용어는 전사될 수 있는 유전자 산물의 적어도 일부를 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 벡터를 말한다. 일부 경우에, RNA 분자는 이후에 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드로 해독된다. 다른 경우에, 이러한 서열은, 예를 들면 안티센스 분자 또는 리보자임(ribozyme)의 생산에서 해독되지 않는다. 발현 벡터는 다양한 "조절 서열"을 함유할 수 있고, 이는 특정 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결된 암호화 서열의 전사 및 아마도 해독에 필요한 핵산 서열을 말한다. 전사 및 해독을 제어하는 조절 서열 외에도, 벡터 및 발현 벡터는 아래에 기술된 다른 기능도 수행하는 핵산 서열을 함유할 수 있다.
본 발명에 있어서, 백시니아 바이러스는 그 자체로 발현 벡터이다. 본 발명의 백시니아 바이러스를 조작하는데 사용될 수도 있는 다른 바이러스 및 비-바이러스 벡터도 존재한다. 한가지 양태에서, 이러한 벡터를 조작하여 GM-CSF를 발현시킬 수 있다.
1. 프로모터 및 인핸서
"프로모터"는 개시 및 전사 속도가 조절되는 핵산 서열의 영역인 조절 서열이다. 이는 RNA 폴리머라제 및 다른 전사 인자와 같은 조절 단백질 및 분자가 결합할 수 있는 유전적 요소를 함유할 수 있다. "작동가능하게 위치한", "작동가능하게 연결된", "조절 하에" 및 "전사적 조절 하에"라는 어구는 프로모터가 핵산 서열과 관련하여 정확한 기능적 위치 및/또는 배향(orientation)으로 존재하여 상기 서열의 전사 개시 및/또는 발현을 조절하는 것을 의미한다. 프로모터는 핵산 서열의 전사적 활성화에 관련된 시스-작용(cis-acting) 조절 서열을 말하는 "인핸서"와 함께 사용되거나 그렇지 않을 수 있다.
프로모터는, 암호화 단편 및/또는 엑손의 상류에 위치한 5' 비-암호화 서열을 분리하여 수득될 수 있는 것과 같이, 본래 유전자 또는 서열과 연결되어 있는 것일 수 있다. 이러한 프로모터는 "내인성"이라고 할 수 있다. 유사하게, 인핸서는 하류 또는 상류에 위치한 핵산 서열과 본래 연결되어 있는 것일 수 있다. 대안으로, 암호화 핵산 단편을 재조합 또는 이종성 프로모터 (일반적으로 자연 환경에서는 핵산 서열과 연결되어 있지 않은 프로모터를 말함)의 조절 하에 위치시켜 특정한 장점을 얻을 것이다. 재조합 또는 이종성 인핸서는 또한 일반적으로 자연 환경에서는 핵산 서열과 연결되어 있지 않은 인핸서를 말한다. 이러한 프로모터 또는 인핸서에는 다른 유전자의 프로모터 또는 인핸서, 및 임의의 다른 원핵생물, 바이러스 또는 진핵생물 세포로부터 분리된 프로모터 또는 인핸서, 및 "천연"이 아닌, 즉 상이한 전사 조절 영역의 상이한 요소 및/또는 발현을 변화시키는 돌연변이를 함유하는 프로모터 또는 인핸서가 포함될 수 있다. 프로모터 및 인핸서의 핵산 서열을 합성적으로 생산하는 것 이외에, 서열은 본원에 공개된 조성물과 함께 재조합 클로닝 및/또는 핵산 증폭 기술 (예: PCR™)을 사용하여 생산할 수 있다[참조: 본원에 참조로서 인용된 미국특허 제4,683,202호, 제5,928,906호]. 또한, 미토콘드리아, 엽록체 등과 같은 비-핵 세포소기관 내에서 서열의 전사 및/또는 발현을 지시하는 조절 서열을 사용할 수도 있는 것이 고려된다.
물론, 발현을 위하여 선택된 세포 종류, 세포소기관 및 유기체에서 DNA 단편의 발현을 효과적으로 지시하는 프로모터 및/또는 인핸서를 사용하는 것이 중요할 수 있다. 본 발명의 특정 양태에서, 프로모터는 백시니아 바이러스의 복제 사이클 동안에 활성인 백시니아 바이러스 프로모터이다. 특히, 프로모터는 백시니아 바이러스 후기 프로모터일 수 있고, 후기 프로모터의 조절 하에서는 발현이 복제 사이클의 후기 단계로 제한되어 암-선택성이 향상된다 (정상 조직에서는 후기 유전자 발현이 최소화되거나 부재할 것이므로). 유전자 발현을 합성 초기-후기 프로모터 하에서 조절하여 유전자 발현의 지속기간 및 수준을 최대화시킬 수도 있다[참조: 본원에 참조로서 인용된 Mastrangelo et al ., 1999].
분자 생물학 분야의 숙련자는 일반적으로 단백질 발현을 위한 프로모터, 인핸서 및 세포 종류 조합의 사용을 알고 있다[참조: 본원에 참조로서 인용된 Sambrook et al . (1989)]. 사용되는 프로모터는, 재조합 단백질 및/또는 펩티드의 대규모 생산에 유리한 것과 같이, 도입된 DNA 단편의 높은 수준의 발현을 지시하는데 적당한 조건 하에서 구성적(constitutive), 조직-특이적, 유도성이고/이거나 유용할 수 있다. 프로모터는 이종성이거나 내인성일 수 있다. 특정 프로모터로는, 바이러스가 세포질에서 복제하기 때문에 세포질에서 활성일 수 있는 것이 있다.
표 2에는 본 발명의 특정 양태와 관련하여 사용되어 유전자의 발현을 조절할 수 있는 다수의 요소/프로모터를 열거한다. 이 목록은 발현의 촉진에 관련된 모든 가능한 요소를 열거하려는 것이 아니고, 단지 예시하는 것이다. 표 3에는 특정 자극에 반응하여 활성화될 수 있는 핵산 서열의 영역인 유도성 요소의 예를 제시한다.
[표 2a]
Figure 112014022063024-pat00002
[표 2b]
Figure 112014022063024-pat00003
[표 3]
Figure 112014022063024-pat00004
조직-특이적 프로모터 또는 요소의 확인 뿐만 아니라, 이들의 활성을 특성규명하기 위한 검정은 당업자에게 익히 공지되어 있다. 이러한 영역의 예에는 사람 LIMK2 유전자[참조: Nomoto et al . 1999], 소마토스타틴 수용체 2 유전자[참조: Kraus et al ., 1998], 쥐 부고환 레티노산-결합 유전자[참조: Lareyre et al ., 1999], 사람 CD4[참조: Zhao-Emonet et al ., 1998], 마우스 알파2 (XI) 콜라겐 [참조: Tsumaki, et al ., 1998], D1A 도파민 수용체 유전자[참조: Lee, et al ., 1997], 인슐린-유사 성장 인자 II[참조: Wu et al ., 1997], 사람 혈소판 내피 세포 부착 분자-1[참조: Almendro et al ., 1996] 및 SM22α 프로모터가 포함된다.
덱틴-1 및 덱틴-2 프로모터도 본 발명에서 유용한 것으로 고려된다. 본 발명과 함께 사용될 수 있는 추가적인 바이러스 프로모터, 세포 프로모터/인핸서 및 유도성 프로모터/인핸서는 표 2 및 3에 열거되어 있다. 또한, (진핵생물 프로모터 데이터베이스(EPDB)에 따라) 임의의 프로모터/인핸서 조합을 사용하여, 올리고당 프로세싱 효소, 단백질 폴딩(folding) 보조 단백질, 선택성 마커 단백질 또는 관심대상의 이종성 단백질을 암호화하는 구조 유전자의 발현을 진행시킬 수도 있다. 대안으로, 암 유전자 요법 (표 4) 또는 종양의 표적화 (표 5)를 위한 조직-특이적 프로모터를 본 발명의 핵산 분자와 함께 사용할 수 있다.
[표 4]
Figure 112014022063024-pat00005
[표 5]
Figure 112014022063024-pat00006
2. 개시 시그날 및 내부 리보좀 결합 부위
특정한 개시 시그날이 암호화 서열의 효율적인 해독을 위하여 필요할 수도 있다. 이러한 시그날에는 ATG 개시 코돈 또는 인접한 서열이 포함된다. ATG 개시 코돈을 포함하는 외인성 해독 조절 시그날이 제공되어야 할 필요가 있을 수 있다. 당업자는 이를 쉽게 결정하여 필요한 시그날을 제공할 수 있을 것이다. 개시 코돈은 목적하는 암호화 서열의 판독 프레임(reading frame)과 "프레임을 유지하며" 존재해야 전체 삽입체의 해독이 보장된다는 것은 익히 공지되어 있다. 외인성 해독 조절 시그날 및 개시 코돈은 천연적이거나 합성적일 수 있다. 발현의 효율은 적당한 전사 인핸서 요소를 포함시켜 향상될 수 있다.
본 발명의 특정 양태에서, 내부 리보좀 진입 부위(IRES) 요소를 사용하여 다중유전자, 폴리시스트론성(polycistronic) 메시지(message)를 생성시킨다. IRES 요소는 5'-메틸화된 캡 의존성 해독의 리보좀 스캐닝 모델을 우회하여 내부 부위에서 해독을 개시시킬 수 있다[참조: Pelletier and Sonenberg, 1988]. 피코르나바이러스 과의 2개의 일원 (폴리오 및 뇌심근염 바이러스)의 IRES 요소[참조: Pelletier and Sonenberg, 1988] 뿐만 아니라, 포유동물 메시지로부터의 IRES도 기술되었다[참조: Macejak and Sarnow, 1991]. IRES 요소를 이종성 개방 판독 프레임(open reading frame)에 연결시킬 수 있다. 각각 IRES에 의해 분리된 다수의 개방 판독 프레임이 함께 전사되어, 폴리시스트론성 메시지가 생성될 수 있다. IRES 요소에 의해, 각각의 개방 판독 프레임이 리보좀에 접근가능하여 효율적으로 해독된다. 단일 프로모터/인핸서를 사용해서 단일 메시지를 전사시켜 다수의 유전자를 효율적으로 발현시킬 수 있다[참조: 본원에 참조로서 인용된 미국특허 제5,925,565호 및 제5,935,819호].
3. 다중 클로닝 부위
벡터는, 표준 재조합 기술과 함께 사용되어 벡터를 분해시킬 수 있는 다수의 제한 효소 부위를 함유하는 핵산 영역인 다중 클로닝 부위(MCS)를 포함할 수 있다[참조: 본원에 참조로서 인용된 Carbonelli et al ., 1999, Levenson et al ., 1998, and Cocea, 1997]. "제한 효소 분해"는 핵산 분자 내의 특정 위치에서만 기능하는 효소를 사용한 핵산 분자의 촉매적 절단을 말한다. 다수의 이러한 효소가 시판된다. 이러한 효소의 사용은 당업자가 일반적으로 이해하고 있다. 종종, 벡터를 MCS 내에서 절단하는 제한 효소를 사용하여 선형화시키거나 단편화시켜, 외인성 서열이 벡터에 연결되게 할 수 있다. "연결"은 서로 연속적이거나 연속적이지 않을 수 있는 2개의 핵산 단편 사이에 포스포디에스테르 결합이 형성되는 과정을 말한다. 제한 효소 및 연결 반응과 관련된 기술은 재조합 기술 분야의 숙련자에게 익히 공지되어 있다.
4. 스플라이싱 ( splicing ) 부위
대부분의 전사된 진핵생물 RNA 분자는 RNA 스플라이싱이 일어나 1차 전사체로부터 인트론이 제거될 것이다. 진핵생물 게놈 서열을 함유하는 벡터는, 단백질 발현을 위한 전사체의 적당한 프로세싱을 보장하기 위하여 공여체 및/또는 수용체 스플라이싱 부위를 필요로 할 수 있다[참조: 본원에 참조로서 인용된 Chandler et al., 1997].
5. 종결 시그날
본 발명의 벡터 또는 작제물은 일반적으로 하나 이상의 종결 시그날을 포함할 것이다. "종결 시그날" 또는 "종결인자(terminator)"는 RNA 폴리머라제에 의한 RNA 전사체의 특이적인 종료에 관련된 DNA 서열을 포함한다. 따라서, 특정 양태에서, RNA 전사체의 생산을 종료시키는 종결 시그날이 고려된다. 종결인자는 생체내에서 바람직한 메시지 수준을 달성하는데 필요할 수 있다.
진핵생물 시스템에서, 종결인자 영역은 새로운 전사체의 부위-특이적인 절단을 가능하게 하여 폴리아데닐화 부위를 노출시키는 특정 DNA 서열을 포함할 수도 있다. 이는 특수한 내인성 폴리머라제가 전사체의 3' 말단에 일련의 약 200개의 A 잔기 (폴리A)를 부가하도록 시그날을 전달한다. 이러한 폴리A 테일(tail)로 변형된 RNA 분자는 보다 안정하고 보다 효율적으로 해독되는 것 같다. 따라서, 진핵생물과 관련된 다른 양태에서, 종결인자가 RNA의 절단을 위한 시그날을 포함하는 것이 바람직하고, 종결인자 시그날이 메시지의 폴리아데닐화를 촉진시키는 것이 보다 바람직하다. 종결인자 및/또는 폴리아데닐화 부위 요소는 메시지 수준을 향상시키고/시키거나 카세트(cassette)에서부터 다른 서열까지 판독되는 것을 최소화시키는 역할을 할 수 있다.
본 발명에서 사용하는데 고려되는 종결인자에는 본원에서 기술되거나 당업자에게 공지된 임의의 공지된 전사 종결인자가 포함되고, 예를 들면, 유전자의 종결 서열 (예: 소 성장 호르몬 종결인자) 또는 바이러스 종결 서열 (예: SV40 종결인자)이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 특정 양태에서, 종결 시그날은, 예를 들면 서열 절두로 인하여, 전사가능하거나 해독가능한 서열이 없을 수 있다.
6. 폴리아데닐화 시그날
발현에서, 특히 진핵생물 발현에서, 통상적으로 폴리아데닐화 시그날을 포함시켜 전사체의 적당한 폴리아데닐화를 달성할 것이다. 폴리아데닐화 시그날의 특성은 본 발명의 성공적인 실시에 결정적인 것으로 생각되지 않고/않거나 임의의 이러한 서열을 사용할 수 있다. 바람직한 양태에는 편리하고/하거나 다양한 표적 세포에서 기능을 잘하는 것으로 공지된 SV40 폴리아데닐화 시그날 및/또는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 시그날이 포함된다. 폴리아데닐화는 전사체의 안정성을 증가시키거나 세포질 운반을 촉진시킬 수 있다.
7. 복제 오리진( origin of replication )
벡터를 숙주 세포에서 증식시키기 위하여, 벡터는 복제가 개시되는 특정한 핵산 서열인 하나 이상의 복제 오리진 부위 (종종 "ori"라고 함)를 함유할 수 있다. 대안으로, 숙주 세포가 효모인 경우에는 자가 복제 서열(ARS)을 사용할 수 있다.
8. 선별가능 및 스크리닝가능 마커
본 발명의 특정 양태에서, 본 발명의 핵산 작제물을 함유하는 세포는 발현 벡터에 마커를 포함시켜 시험관내 또는 생체내에서 확인할 수 있다. 이러한 마커는 확인가능한 변화를 세포에 부여하여, 발현 벡터를 함유하는 세포를 쉽게 확인할 수 있게 할 것이다. 일반적으로, 선별가능 마커는 선별을 가능하게 하는 특성을 부여하는 것이다. 양성 선별가능 마커는 마커의 존재가 이의 선별을 가능하게 하는 것이고, 반면에 음성 선별가능 마커는 이의 존재가 이의 선별을 막는 것이다. 양성 선별가능 마커의 예로는 약물 내성 마커가 있다.
일반적으로 약물 선별 마커의 포함은 형질전환체의 클로닝 및 확인을 돕고, 예를 들면, 네오마이신, 퓨로마이신, 하이그로마이신, DHFR, GPT, 제오신(zeocin) 및 히스티디놀에 대한 내성을 부여하는 유전자는 유용한 선별가능 마커이다. 조건의 이행에 따라 형질전환체의 구별을 가능하게 하는 표현형을 부여하는 마커 외에도, 비색 분석을 토대로 하는 GFP와 같은 스크리닝가능한 마커를 포함하는 다른 종류의 마커도 고려된다. 대안으로, 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 (tk) 또는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT)와 같은 스크리닝가능한 효소를 사용할 수 있다. 당업자는 아마도 FACS 분석과 함께 면역학적 마커를 사용하는 방법도 알고 있을 것이다. 사용되는 마커는, 유전자 산물을 암호화하는 핵산과 동시에 발현될 수 있는 한, 중요한 것으로 생각되지 않는다. 선별가능 및 스크리닝가능 마커의 추가적인 예는 당업자에게 익히 공지되어 있다.
D. 핵산 검출
폭스바이러스 단백질, 폴리펩티드 및/또는 펩티드의 발현을 지시하는데 있어서의 용도 이외에, 본원에 공개된 핵산 서열은 다양한 다른 용도를 갖는다. 예를 들면, 핵산 하이브리드화와 관련된 양태의 경우 이들은 프로브 또는 프라이머로서 유용성을 갖는다. 이들은 본 발명의 진단 또는 스크리닝 방법에서 사용될 수 있다. 폭스바이러스 또는 폭스바이러스 폴리펩티드 조절인자를 암호화하는 핵산의 검출은 본 발명에 포함된다.
1. 하이브리드화
길이가 13 내지 100 뉴클레오타이드, 바람직하게는 17 내지 100 뉴클레오타이드이거나, 본 발명의 일부 양상에서 길이가 최대 1 내지 2 킬로염기 이상인 프로브 또는 프라이머의 사용은, 안정하면서 선택적인 듀플렉스 분자의 형성을 가능하게 한다. 길이가 20 염기 이상인 연속적인 쇄에 걸쳐 상보적인 서열을 갖는 분자는 일반적으로, 수득된 하이브리드 분자의 안정성 및/또는 선택성을 증가시키는데 바람직하다. 하이브리드화를 위하여, 20 내지 30 뉴클레오타이드이거나 목적하는 경우에는 이보다 긴 하나 이상의 상보적인 서열을 갖는 핵산 분자를 설계하는 것이 일반적으로 바람직할 것이다. 이러한 단편은, 예를 들면, 화학적 수단으로 단편을 직접 합성하거나, 선택된 서열을 재조합 생산을 위한 재조합 벡터 속에 도입시켜 쉽게 제조할 수 있다.
따라서, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은, 상보적인 DNA 및/또는 RNA 쇄를 갖는 듀플렉스 분자를 선택적으로 형성하거나 샘플로부터의 DNA 또는 RNA의 증폭을 위한 프라이머를 제공하는 능력에 대해 사용될 수 있다. 계획된 용도에 따라, 다양한 하이브리드화 조건을 사용하여 표적 서열에 대한 프로브 또는 프라이머의 다양한 정도의 선택성을 달성하기 원할 것이다.
높은 선택성을 요구하는 적용의 경우에는, 상대적으로 높은 엄중성(stringency) 조건을 사용하여 하이브리드를 형성시키기를 통상적으로 원할 것이다. 예를 들면, 약 50℃ 내지 약 70℃의 온도에서 약 0.02M 내지 약 0.10M NaCl에 의해 제공되는 것과 같은 상대적인 저염 및/또는 고온 조건이 사용된다. 이러한 높은 엄중성 조건은 프로브 또는 프라이머와 주형 또는 표적 쇄 간의 미스매치 (존재하는 경우)를 거의 용인하지 않으며, 특정 유전자를 분리하거나 특정 mRNA 전사체를 검출하는데 특히 적당할 것이다. 첨가하는 포름아미드의 양을 증가시켜 조건을 보다 엄중하게 할 수 있다는 것은 일반적으로 인식된다.
특정한 적용, 예를 들면, 부위-지시된 돌연변이유발의 경우, 낮은 엄중성 조건이 바람직하다는 것이 인식된다. 이러한 조건 하에서, 하이브리드화 쇄의 서열이 완전하게 상보적이지 않고, 하나 이상의 위치에서 미스매치가 존재하더라도, 하이브리드화가 일어날 수 있다. 염 농도를 증가시키고/시키거나 온도를 감소시켜 조건을 덜 엄중하게 할 수 있다. 예를 들면, 중간 엄중성 조건은 약 37℃ 내지 약 55℃의 온도에서 약 0.1 내지 0.25M NaCl에 의해 제공될 수 있고, 반면에 낮은 엄중성 조건은 약 20℃ 내지 약 55℃ 범위의 온도에서 약 0.15M 내지 0.9M 염에 의해 제공될 수 있다. 하이브리드화 조건은 목적하는 결과에 따라 쉽게 조절할 수 있다.
다른 양태에서, 하이브리드화는, 예를 들면 대략 20℃ 내지 약 37℃의 온도에서 50mM Tris-HCl (pH 8.3), 75mM KCl, 3mM MgCl2, 1.0mM 디티오트레이톨의 조건 하에서 달성할 수 있다. 사용되는 다른 하이브리드화 조건은 대략 40℃ 내지 약 72℃ 범위의 온도에서 대략 10mM Tris-HCl (pH 8.3), 50mM KCl, 1.5mM MgCl2를 포함할 수 있다.
특정 양태에서, 하이브리드화를 결정하기 위한 표지(label)와 같은 적당한 수단과 함께 본 발명의 정해진 서열의 핵산을 사용하는 것이 유리할 것이다. 검출될 수 있는 형광, 방사능, 효소 또는 다른 리간드 (예: 아비딘/비오틴)를 포함하는 광범위한 적당한 지표(indicator) 수단은 당업계에 공지되어 있다. 바람직한 양태에서, 방사능 또는 다른 환경적으로 바람직하지 않은 시약 대신에, 형광 표지 또는 효소 태그, 예를 들면 우레아제, 알칼리성 포스파타제 또는 퍼옥시다제를 사용하기 원할 수 있다. 효소 태그의 경우에, 육안으로 또는 분광광도법으로 검출가능한 검출 수단을 제공하여 상보적인 핵산 함유 샘플과의 특이적인 하이브리드화를 확인하는데 사용될 수 있는 비색 지표 기질이 공지되어 있다.
일반적으로, 본원에서 기술된 프로브 또는 프라이머는 PCR™과 같은 용액 하이브리드화에서 뿐만 아니라, 고체상을 사용하는 양태에서 상응하는 유전자의 발현의 검출을 위한 시약으로서 유용할 것으로 계획된다. 고체상과 관련된 양태에서, 검사 DNA (또는 RNA)를 선택된 매트릭스 또는 표면에 흡착시키거나 또는 부착시킨다. 이어서, 이러한 고정된 일본쇄 핵산을 목적하는 조건 하에서 선택된 프로브와 하이브리드화시킨다. 선택되는 조건은 특정 환경에 따라 (예를 들면, G+C 함량, 표적 핵산의 종류, 핵산의 공급원, 하이브리드화 프로브의 크기 등에 따라) 달라질 것이다. 관심대상의 특정한 적용을 위한 하이브리드화 조건의 최적화는 당업자에게 익히 공지되어 있다. 하이브리드화된 분자를 세척하여 비-특이적으로 결합된 프로브 분자를 제거한 후, 결합된 표지의 양을 측정하여 하이브리드화를 검출하고/하거나 정량한다. 대표적인 고체상 하이브리드화 방법은 미국특허 제5,843,663호, 제5,900,481호 및 제5,919,626호에 공개되어 있다. 본 발명의 실시에서 사용될 수 있는 다른 하이브리드화 방법은 미국특허 제5,849,481호, 제5,849,486호 및 제5,851,772호에 공개되어 있다. 본 명세서의 본 부문에서 확인된 상기 및 기타 참고문헌의 관련된 부분은 본원에 참조로서 인용된다.
2. 핵산의 증폭
증폭을 위한 주형으로서 사용되는 핵산은 표준 방법론에 따라 세포, 조직 또는 다른 샘플로부터 분리할 수 있다[참조: Sambrook et al ., 1989]. 특정 양태에서, 분석은 주형 핵산의 실질적인 정제 없이 전체 세포 또는 조직 균질액 또는 생물학적 유체 샘플에 대해 수행한다. 핵산은 게놈 DNA 또는 분획화된 또는 전체 세포 RNA일 수 있다. RNA를 사용하는 경우, 먼저 RNA를 상보적인 DNA로 전환시키는 것이 바람직할 수 있다.
본원에서 사용되는 "프라이머"라는 용어는 주형-의존적 과정에서 발생기의(nascent) 핵산의 합성을 프라이밍할 수 있는 임의의 핵산을 포함하는 의미이다. 통상적으로, 프라이머는 길이가 10 내지 20 및/또는 30 염기쌍인 올리고뉴클레오타이드이지만, 보다 긴 서열을 사용할 수 있다. 프라이머는 이본쇄 및/또는 일본쇄 형태로 제공될 수 있지만, 일본쇄 형태가 바람직하다.
본원에서 확인된 유전자의 서열에 상응하는 핵산에 선택적으로 하이브리드화하도록 설계된 프라이머 쌍을, 선택적 하이브리드화를 가능하게 하는 조건 하에서 주형 핵산과 접촉시킨다. 목적하는 용도에 따라서, 프라이머에 대해 완전하게 상보적인 서열에 대한 하이브리드화만을 가능하게 할 높은 엄중성 하이브리드화 조건을 선택할 수 있다. 다른 양태에서, 하이브리드화를 감소된 엄중성 하에서 실시하여, 프라이머 서열과의 하나 이상의 미스매치를 함유하는 핵산의 증폭을 가능하게 할 수 있다. 일단 하이브리드화되면, 주형-프라이머 복합체를 주형-의존적 핵산 합성을 촉진시키는 하나 이상의 효소와 접촉시킨다. 충분한 양의 증폭 산물이 생산될 때까지 여러 회 ("사이클"이라고도 함)의 증폭을 수행한다.
증폭 산물을 검출하거나 정량할 수 있다. 특정한 적용에서, 검출은 육안적 수단으로 수행할 수 있다. 대안으로, 검출에는 화학발광, 혼입된 방사성표지 또는 형광 표지의 방사능 신티그래피(scintigraphy)를 통한, 또는 전기적 및/또는 열적 임펄스(impulse) 시그날을 사용한 시스템을 통한 산물의 간접적인 확인이 포함될 수 있다[참조: Bellus, 1994].
많은 주형 의존적 과정을 사용하여 주어진 주형 샘플에 존재하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 증폭시킬 수 있다. 가장 잘 알려진 증폭 방법 중의 하나는, 전문이 본원에 참조로서 인용된 미국특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호 및 문헌[참조: Innis et al ., 1988]에 상세히 기술된 폴리머라제 연쇄 반응(PCR™이라고 함)이다.
리버스 트랜스크립타제 PCR™ 증폭 방법을 수행하여, 증폭된 mRNA의 양을 정량할 수 있다. RNA를 cDNA로 역전사시키는 방법은 익히 공지되어 있다[참조: Sambrook et al ., 1989]. 역전사를 위한 대안적인 방법은 열안정성 DNA 폴리머라제를 사용한다. 이러한 방법은 국제공개공보 제WO 90/07641호에 기술되어 있다. 폴리머라제 연쇄 반응 방법론은 당업계에 익히 공지되어 있다. 대표적인 RT-PCR 방법은 미국특허 제5,882,864호에 기술되어 있다.
증폭을 위한 다른 방법은, 전문이 본원에 참조로서 인용된 유럽 특허원 제320 308호에 공개된 리가제 연쇄 반응("LCR")이다. 미국특허 제4,883,750호에는 프로브 쌍을 표적 서열에 결합시키기 위한 LCR과 유사한 방법이 기술되어 있다. PCR™ 및 미국특허 제5,912,148호에 공개된 올리고뉴클레오타이드 리가제 검정(OLA)에 따른 방법을 사용할 수도 있다.
본 발명의 실시에서 사용될 수 있는 표적 핵산 서열의 증폭을 위한 대안적인 방법은, 전문이 본원에 참조로서 인용된 미국특허 제5,843,650호, 제5,846,709호, 제5,846,783호, 제5,849,546호, 제5,849,497호, 제5,849,547호, 제5,858,652호, 제5,866,366호, 제5,916,776호, 제5,922,574호, 제5,928,905호, 제5,928,906호, 제5,932,451호, 제5,935,825호, 제5,939,291호 및 제5,942,391호, 영국 특허원 제2 202 328호, 및 국제 특허원 제PCT/US89/01025호에 공개되어 있다.
국제 특허원 제PCT/US87/00880호에 기술된 큐베타 레플리카제(Qbeta Replicase)는 또한 본 발명에서 증폭 방법으로서 사용될 수 있다. 이 방법에서, 표적 영역에 상보적인 영역을 갖는 RNA의 복제 서열을 RNA 폴리머라제의 존재 하에서 샘플에 첨가한다. 폴리머라제는 복제 서열을 복제할 것이고, 이어서 이를 검출할 수 있다.
제한 엔도뉴클레아제 및 리가제를 사용하여 제한 부위의 하나의 쇄에 뉴클레오타이드 5'-[알파-티오]-트리포스페이트를 함유하는 표적 분자의 증폭을 달성하는 등온 증폭 방법은 또한, 본 발명에서 핵산의 증폭에 유용할 수 있다[참조: Walker et al ., 1992]. 미국특허 제5,916,779호에 공개된 쇄 치환 증폭(SDA; Strand Displacement Amplification)은 여러 회의 쇄 치환 및 합성을 포함하여 핵산의 등온 증폭을 수행하는 또다른 방법, 즉 닉(nick) 해독이다.
다른 핵산 증폭 방법에는 핵산 서열 기반 증폭 (NASBA) 및 3SR을 포함하는 전사-기반 증폭 시스템(TAS)이 포함된다[참조: 전문이 본원에 참조로서 인용된 Kwoh et al ., 1989; 국제공개공보 제WO 88/10315호]. 유럽 특허원 제329 822호에는 일본쇄 RNA("ssRNA"), ssDNA 및 이본쇄 DNA(dsDNA)를 순환적으로 합성함을 포함하는 핵산 증폭 과정이 공개되어 있고, 이는 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
국제공개공보 제WO 89/06700호 (전문이 본원에 참조로서 인용됨)에는, 프로모터 영역/프라이머 서열을 표적 일본쇄 DNA("ssDNA")에 하이브리드화시킨 후 많은 RNA 서열 카피가 전사되는 것을 토대로 하는 핵산 서열 증폭 방법이 공개되어 있다. 이 방법은 순환적이지 않다, 즉 생성된 RNA 전사체로부터 새로운 주형이 생성되지 않는다. 다른 증폭 방법에는 "RACE" 및 "단측(one-sided) PCR"이 포함된다[참조: Frohman, 1990; Ohara et al ., 1989]
3. 핵산의 검출
임의의 증폭 후, 증폭 산물을 주형 및/또는 과량의 프라이머로부터 분리하는 것이 바람직할 수 있다. 한가지 양태에서, 증폭 산물은 표준 방법을 사용하여 아가로스, 아가로스-아크릴아미드 또는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분리한다[참조: Sambrook et al ., 1989]. 분리된 증폭 산물을 겔로부터 잘라내어 용출시켜 추가로 조작할 수 있다. 저 융점 아가로스 겔을 사용하여, 분리된 밴드를 겔을 가열하여 제거한 후, 핵산을 추출할 수 있다.
핵산의 분리는 당업계에 공지된 크로마토그래피 기술로 달성할 수도 있다. 흡착, 분배, 이온 교환, 수산화인회석, 분자 체(molecular sieve), 역상(reverse-phase), 칼럼, 종이, 박층 및 가스 크로마토그래피 뿐만 아니라, HPLC를 포함하여, 본 발명의 실시에서 사용될 수 있는 많은 종류의 크로마토그래피가 있다.
특정 양태에서, 증폭 산물을 시각화시킨다. 통상적인 시각화 방법에는 에티디움 브로마이드를 사용한 겔의 염색, 및 UV 빛 하에서의 밴드의 시각화가 포함된다. 대안으로, 증폭 산물을 방사- 또는 형광측정-표지된 뉴클레오타이드로 완전히 표지한 경우, 분리된 증폭 산물을 x-레이 필름에 노출시키거나 적당한 여기(excitatory) 스펙트럼 하에서 시각화시킬 수 있다.
한가지 양태에서, 증폭 산물의 분리 후, 표지된 핵산 프로브를 증폭된 마커 서열과 접촉시킨다. 프로브를 바람직하게는 발색단(chromophore)에 접합시키지만, 방사성표지할 수도 있다. 다른 양태에서, 프로브를 결합 파트너 (예: 항체 또는 비오틴) 또는 검출가능한 잔기를 보유하는 다른 결합 파트너에 접합시킨다.
특정 양태에서, 검출은 표지된 프로브를 사용한 서던 블롯팅(Southern blotting) 및 하이브리드화에 의해 수행한다. 서던 블롯팅에 관련된 기술은 당업자에게 익히 공지되어 있다[참조: Sambrook et al ., 1989]. 이의 한가지 예는 본원에 참조로서 인용된 미국특허 제5,279,721호에 기술되어 있는데, 여기에는 핵산의 자동화된 전기영동 및 전달을 위한 장치 및 방법이 공개되어 있다. 상기 장치는 겔의 외부적 조작 없이 전기영동 및 블롯팅을 가능하게 하고, 본 발명에 따른 방법을 수행하는데 이상적으로 적당하다.
본 발명의 실시에서 사용될 수 있는 다른 핵산 검출 방법은 본원에 참조로서 인용된 미국특허 제5,840,873호, 제5,843,640호, 제5,843,651호, 제5,846,708호, 제5,846,717호, 제5,846,726호, 제5,846,729호, 제5,849,487호, 제5,853,990호, 제5,853,992호, 제5,853,993호, 제5,856,092호, 제5,861,244호, 제5,863,732호, 제5,863,753호, 제5,866,331호, 제5,905,024호, 제5,910,407호, 제5,912,124호, 제5,912,145호, 제5,919,630호, 제5,925,517호, 제5,928,862호, 제5,928,869호, 제5,929,227호, 제5,932,413호 및 제5,935,791호에 공개되어 있다.
4. 기타 검정
유전적 스크리닝을 위한 다른 방법을 본 발명의 범위 내에서 사용하여, 예를 들면, 게놈 DNA, cDNA 및/또는 RNA 샘플에서 돌연변이를 검출할 수 있다. 점 돌연변이를 검출하는데 사용되는 방법에는 변성 구배 겔 전기영동("DGGE"; Denaturing Gradient Gel Electrophoresis), 제한 단편 길이 다형성("RFLP"; Restriction Fragment Length Polymorphism) 분석, 화학적 또는 효소적 절단 방법, PCR™(상기 참조)에 의해 증폭된 표적 영역의 직접 서열분석, 일본쇄 입체구조 다형성("SSCP"; Single-Strand Conformation Polymorphism) 분석 및 당업계에 익히 공지된 다른 방법이 포함된다.
점 돌연변이에 대해 스크리닝하는 한가지 방법은 RNA/DNA 또는 RNA/RNA 헤테로듀플렉스 내의 염기쌍 미스매치의 RNase 절단을 토대로 한다. 본원에서 사용되는 "미스매치"라는 용어는 이본쇄 RNA/RNA, RNA/DNA 또는 DNA/DNA 분자 내의 하나 이상의 염기쌍 비-형성된 또는 염기쌍이 잘못 형성된 뉴클레오타이드의 영역으로서 정의된다. 따라서, 상기 정의에는 삽입/결실 돌연변이 뿐만 아니라, 단일 또는 다중 염기 점 돌연변이로 인한 미스매치가 포함된다.
미국특허 제4,946,773호에는 일본쇄 DNA 또는 RNA 검사 샘플을 RNA 프로브에 어닐링시키고 나서, 핵산 듀플렉스를 RNase A로 처리함을 포함하는 RNase A 미스매치 절단 검정이 기술되어 있다. 미스매치의 검출을 위하여, 전기영동에 의해 크기에 따라 분리된 RNase A 처리의 일본쇄 산물을, 유사하게 처리된 대조군 듀플렉스와 비교한다. 대조군 듀플렉스에서는 보이지 않는 작은 단편 (절단 산물)을 함유하는 샘플은 양의 점수를 부여받는다.
다른 연구자들은 미스매치 검정에서 RNase I의 사용을 기술하였다. 미스매치 검출을 위한 RNase I의 사용은 Promega Biotech로부터의 문헌에 기술되어 있다. Promega는 공지된 4개의 미스매치 중 3개를 절단하는 것으로 보고된 RNase I을 함유하는 키트를 시판한다. 다른 연구자들은 단일 염기 미스매치의 검출을 위한 MutS 단백질 또는 다른 DNA-복구 효소를 사용하여 기술하였다.
본 발명의 실시에서 사용될 수 있는 결실, 삽입 또는 치환 돌연변이의 검출을 위한 대안적인 방법은 전문이 본원에 참조로서 인용된 미국특허 제5,849,483호, 제5,851,770호, 제5,866,337호, 제5,925,525호 및 제5,928,870호에 공개되어 있다.
E. 유전자 전달 방법
본 발명의 조성물의 발현을 달성하는 핵산 전달에 적당한 방법에는, 본원에서 기술되거나 당업자에게 공지된 바와 같이, 핵산 (예: 바이러스 및 비-바이러스 벡터를 포함하는 DNA)을 세포소기관, 세포, 조직 또는 유기체 속으로 도입시킬 수 있는 거의 모든 방법이 포함된다고 생각된다. 이러한 방법에는 주입 [참조: 본원에 참조로서 인용된 미국특허 제5,994,624호, 제5,981,274호, 제5,945,100호, 제5,780,448호, 제5,736,524호, 제5,702,932호, 제5,656,610호, 제5,589,466호 및 제5,580,859호], 예를 들면 미세주입 [참조: 본원에 참조로서 인용된 Harlan and Weintraub, 1985; 미국특허 제5,789,215호]; 전기영동 [참조: 본원에 참조로서 인용된 미국특허 제5,384,253호]; 인산칼슘 침전 [참조: Graham and Van Der Eb, 1973; Chen and Okayama, 1987; Rippe　 et al .,　1990]; DEAE-덱스트란을 사용한 후의 폴리에틸렌 글리콜의 사용 [참조: Gopal, 1985]; 직접적인 초음파 로딩(sonic loading) [참조: Fechheimer　 et al .,　1987]; 리포좀 매개된 형질감염 [참조: Nicolau and Sene, 1982; Fraley　 et al .,　1979; Nicolau　 et al .,　1987; Wong　et al ., 1980; Kaneda　 et al .,　1989; Kato　 et al .,　1991]; 미세발사체 포격(microprojectile bombardment) [참조: 본원에 참조로서 인용된 국제공개공보 제WO 94/09699호 및 제95/06128호; 미국특허 제5,610,042호, 제5,322,783호, 제5,563,055호, 제5,550,318호, 제5,538,877호 및 제5,538,880호]; 탄화규소 섬유를 사용한 교반 [참조: 본원에 참조로서 인용된 Kaeppler　 et al .,　1990; 미국특허 제5,302,523호 및 제5,464,765호]; 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개된 형질전환 [참조: 본원에 참조로서 인용된 미국특허 제5,591,616호 및 제5,563,055호]; 원형질체의 PEG-매개된 형질전환 [참조: 본원에 참조로서 인용된 Omirulleh　 et al .,　1993; 미국특허 제4,684,611호 및 제4,952,500호]; 또는 건조/억제-매개된 DNA 흡수 [참조: Potrykus　 et al .,　1985]에 의해서와 같은 DNA의 직접적인 전달이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 이와 같은 기술의 적용을 통해, 세포소기관(들), 세포(들), 조직(들) 또는 유기체(들)를 안정하게 또는 일시적으로 형질전환시킬 수 있다.
5. 지질 성분 및 잔기
특정 양태에서, 본 발명은 핵산, 아미노산 분자 (예: 펩티드) 또는 다른 작은 분자 화합물과 결합된 하나 이상의 지질을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본원에서 논의된 임의의 양태에서, 분자는 폭스바이러스 폴리펩티드 또는 폭스바이러스 폴리펩티드 조절인자, 예를 들면 폭스바이러스 폴리펩티드의 전부 또는 일부를 암호화하는 핵산, 또는 대안으로, 폭스바이러스 폴리펩티드 조절인자의 전부 또는 일부를 암호화하는 아미노산 분자일 수 있다. 지질은 특징적으로 물에 불용성이고 유기 용매로 추출가능한 물질이다. 본원에서 구체적으로 기술된 것 이외의 화합물은 당업자에 의해 지질로서 이해되고, 본 발명의 조성물 및 방법에 포함된다. 지질 성분 및 비-지질은 서로 공유적으로 또는 비-공유적으로 부착될 수 있다.
지질은 천연 또는 합성 (즉, 사람에 의해 설계되거나 생산된) 지질일 수 있다. 하지만, 지질은 일반적으로 생물학적 물질이다. 생물학적 지질은 당업계에 익히 공지되어 있고, 예를 들면, 중성 지방, 인지질, 포스포글리세라이드, 스테로이드, 테르펜, 리소리피드, 글리코스핑고리피드, 글루코리피드, 설파티드, 에테르 및 에스테르-결합된 지방산을 갖는 지질 및 중합가능한 지질, 및 이의 조합이 포함된다.
지질과 결합된 핵산 분자 또는 아미노산 분자 (예: 펩티드)를, 지질을 함유하는 용액 중에 분산시키거나, 지질과 함께 용해시키거나, 지질과 함께 유화시키거나, 지질과 혼합하거나, 지질과 배합하거나, 지질에 공유결합시키거나, 지질 중에 현탁액으로서 함유시키거나, 또는 지질과 결합시킬 수 있다. 본 발명의 지질 또는 지질/폭스바이러스-결합된 조성물은 임의의 특정 구조에 한정되지 않는다. 예를 들면, 이들은 단순하게 용액 중에 산재되어, 아마도 크기 또는 모양이 일정하지 않은 집합체를 형성할 수도 있다. 다른 예에서, 이들은 마이셀(micelle)로서 또는 "붕괴된" 구조로, 이중층 구조로 존재할 수 있다. 다른 비제한적인 예에서, 리포펙타민(lipofectamine)[판매원: Gibco BRL]-폭스바이러스 또는 슈퍼펙트(Superfect)[판매원: Qiagen]-폭스바이러스 복합체도 고려된다.
특정 양태에서, 지질 조성물은 본원에서 공개되거나 당업자에게 공지된 약물, 단백질, 당, 핵산 또는 다른 물질로서 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4% 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25%, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29%, 약 30%, 약 31%, 약 32%, 약 33%, 약 34%, 약 35%, 약 36%, 약 37%, 약 38%, 약 39%, 약 40%, 약 41%, 약 42%, 약 43%, 약 44%, 약 45%, 약 46%, 약 47%, 약 48%, 약 49%, 약 50%, 약 51%, 약 52%, 약 53%, 약 54%, 약 55%, 약 56%, 약 57%, 약 58%, 약 59%, 약 60%, 약 61%, 약 62%, 약 63%, 약 64%, 약 65%, 약 66%, 약 67%, 약 68%, 약 69%, 약 70%, 약 71%, 약 72%, 약 73%, 약 74%, 약 75%, 약 76%, 약 77%, 약 78%, 약 79%, 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 100% 또는 이 사이의 임의의 범위의 특정 지질, 지질 종류 또는 비-지질 성분을 포함할 수 있다. 비제한적인 예에서, 지질 조성물은 약 10% 내지 약 20%의 중성 지질, 및 약 33% 내지 약 34%의 세레브로사이드, 및 약 1%의 콜레스테롤을 포함할 수 있다. 다른 비제한적인 예에서, 리포좀은 약 4% 내지 약 12%의 테르펜 (이때, 마이셀의 약 1%는 구체적으로는 라이코펜이고, 리포좀의 나머지 약 3% 내지 약 11%는 다른 테르펜을 포함함); 및 약 10% 내지 약 35%의 포스파티딜 콜린, 및 약 1%의 약물을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 지질 조성물은 임의의 지질, 지질 종류 또는 다른 성분을 임의의 조합 또는 % 범위로 포함할 수 있는 것이 고려된다.
V. GM - CSF
본 발명의 특정 양상에서, 백시니아 바이러스는 GM-CSF를 암호화하는 유전자를 보유할 것이다. GM-CSF는 보다 많은 백혈구, 특히 과립구, 대식세포 및 혈소판이 되는 세포가 만들어지도록 돕는 물질인 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자이다. 이는 조혈제(혈액 형성제)라고 하는 약물 계열에 속하는 사이토카인이고, 사르그라모스팀(sargramostim)으로도 공지되어 있다. GM-CSF는 켄트렐(Cantrell) 등에 의해 1985년에 처음 클로닝되고 서열분석되었다. 사람 GM-CSF는 단일 개방 판독 프레임에 의해 암호화된 144 아미노산의 당단백질로서, 예상 분자량은 16,293 달톤이다. 이는 마우스 GM-CSF에 대해 69%의 뉴클레오타이드 상동성 및 54%의 아미노산 상동성을 나타내며, 단일 카피 유전자로서 존재한다.
GM-CSF는 사이토카인 또는 면역 및 염증 자극에 반응하여 많은 상이한 세포 종류 (예: 활성화된 T 세포, B 세포, 대식세포, 비만세포, 내피 세포 및 섬유아세포)에 의해 생산된다. 과립구-대식세포 전구세포 외에도, GM-CSF는 또한 적혈구, 거핵구 및 호산구 전구세포에 대한 성장인자이다. 성숙한 조혈 세포에 대하여, GM-CSF는 과립구, 단핵구/대식세포 및 호산구에 대한 생존 인자이고, 이들의 효과인자 기능을 활성화시킨다. GM-CSF는 또한 비-조혈 세포에 대해 기능적인 역할을 갖는 것으로 보고되었다. 이는 사람 내피 세포가 이동하여 증식하도록 유도할 수 있다.
GM-CSF는 종 특이적이고, 사람 GM-CSF는 마우스 세포에 대한 생물학적 효과가 없다. GM-CSF는 특정한 세포 표면 수용체에 결합하여 생물학적 효과를 발휘한다. 사람 GM-CSF 시그날 전달에 필요한 고 친화도 수용체는, GM-CSF-특이적 α 쇄 및 IL-3 및 IL-5에 대한 고 친화도 수용체에 의해 공유되는 공통적인 β 쇄로 이루어진 헤테로이량체인 것으로 밝혀졌다.
GM-CSF는 많은 종양 세포주 (예: 골 육종, 암종 및 선암종 세포주)의 증식을 자극할 수 있지만, GM-CSF (단독으로 또는 다른 면역요법과 함께)의 임상 시험은 흑색종, 백혈병, 림프종, 신경아세포종(neuroblastoma), 카포시 육종(Kaposi sarcoma), 중피종(mesothelioma), 폐암, 유방암, 전립선암, 결장직장암, 뇌 종양, 신장암 및 자궁경부암 환자에 대해 진행중이다. GM-CSF의 통상적인 부작용에는 독감-유사 증상 (열, 두통, 근육통), 발진, 안면 홍조 및 골통이 포함된다.
VI . 기타 이종성 유전자
일부 양태에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 백시니아 바이러스는, GM-CSF를 암호화하지 않지만 다른 이종성 서열을 암호화하는 이종성 서열을 발현하는 핵산 서열을 함유한다. 특정 양태에서, 이종성 서열은 다른 사이토카인을 암호화한다. 대안으로 또는 추가적으로, 백시니아 바이러스는 IL-12, 티미딘 데아미나제, TNF 등을 암호화하는 핵산을 함유할 수 있다. 또한, 본원에서 논의된 임의의 유전자 산물은 백시니아 바이러스 내에 함유된 핵산에 의해 암호화될 수 있고, 본 발명의 방법에서 사용된다.
VII . 약제학적 제형, 전달 및 치료 방법
본 발명의 양태에서, 백시니아 바이러스의 전달에 의해 과증식성 질환 (예: 암)을 치료하는 방법이 고려된다. 치료를 위하여 고려되는 암의 예에는 폐암, 두경부암, 유방암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 자궁암, 골암, 고환암, 자궁경부암, 위장관암, 림프종, 폐의 전-신생(pre-neoplastic) 병변, 결장암, 흑색종, 방광암 및 치료될 수 있는 임의의 다른 암 또는 종양이 포함된다.
약제학적 조성물의 유효량은 일반적으로, 질환의 정도 또는 증상을 검출가능하게 그리고 반복적으로 완화시키거나, 경감시키거나, 최소화시키거나, 제한하는데 충분한 양으로서 정의된다. 질환의 제거, 근절 또는 치료를 포함하는 보다 엄격한 정의를 적용할 수 있다.
바람직하게는, 환자는 적당한 골수 기능 (말초 절대 과립구 수 > 2,000 / mm3 및 혈소판 수 100,000 / mm3으로서 정의됨), 적당한 간 기능 (빌리루빈 < 1.5 mg / dl) 및 적당한 신장 기능 (크레아틴 < 1.5 mg / dl)을 가질 것이다.
본 발명의 방법 및 조성물에 의해 치료될 수 있는 암세포에는 방광, 혈액, 골, 골수, 뇌, 유방, 결장, 식도, 위장관, 치주, 두부, 신장, 간, 폐, 비인두, 경부, 난소, 전립선, 피부, 위, 고환, 혀 또는 자궁으로부터의 세포가 포함된다. 또한, 암은 구체적으로는 다음의 조직학적 종류일 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다: 악성 신생물; 암종; 미분화된 암종; 거대 및 방추 세포 암종; 소세포 암종(small cell carcinoma); 유두상 암종(papillary carcinoma); 편평 세포 암종; 림프상피 암종(lymphoepithelial carcinoma); 기저 세포 암종; 모기질 암종(pilomatrix carcinoma); 이행세포 암종(transitional cell carcinoma); 유두상 이행세포 암종; 선암종; 악성 가스트린종(gastrinoma); 담관암종(cholangiocarcinoma); 간세포 암종; 복합 간세포 암종 및 담관암종; 소주형 선암종(trabecular adenocarcinoma); 선양 낭성 암종(adenoid cystic carcinoma); 선종상 용종(adenomatous polyp)의 선암종; 가족성 결장 용종증(polyposis coli) 선암종; 고형 암종; 악성 유암종(carcinoid tumor); 세기관지 폐포 선암종(bronchiolo-alveolar adenocarcinoma); 유두상 선암종; 혐색소세포 암종(chromophobe carcinoma); 호산성세포 암종(acidophil carcinoma); 호산세포 선암종(oxyphilic adenocarcinoma); 호염기성세포 암종(basophil carcinoma); 투명 세포 선암종(clear cell adenocarcinoma); 과립세포 암종(granular cell carcinoma); 여포상 선암종(follicular adenocarcinoma); 유두상 및 여포상 선암종; 비피막성 경화성 암종(nonencapsulating sclerosing carcinoma); 부신피질 암종(adrenal cortical carcinoma); 자궁내막양 암종(endometroid carcinoma); 피부 부속기 암종(skin appendage carcinoma); 아포크린 선암종(apocrine adenocarcinoma); 피지 선암종(sebaceous adenocarcinoma); 이구선 선암종(ceruminous adenocarcinoma); 점액표피양 암종(mucoepidermoid carcinoma); 낭선암종(cystadenocarcinoma); 유두상 낭선암종; 유두상 장액성 낭선암종; 점액성 낭선암종; 점액성 선암종; 반지세포 암종(signet ring cell carcinoma); 침윤성 관암종(infiltrating duct carcinoma); 수질성 암종(medullary carcinoma); 소엽성 암종(lobular carcinoma); 염증성 암종; 유방 파제트병(mammary paget's disease); 포상세포 암종(acinar cell carcinoma); 선편평세포 암종(adenosquamous carcinoma); 편평화생 선암종(squamous metaplasia adenocarcinoma); 악성 흉선종(thymoma); 악성 난소 기질 종양(ovarian stromal tumor); 악성 난포막종(thecoma); 악성 과립막 세포 종양(granulosa cell tumor); 악성 남성모세포종(androblastoma); 세르톨리 세포 암종(sertoli cell carcinoma); 악성 간질 세포 종양(leydig cell tumor); 악성 지질 세포 종양(lipid cell tumor); 악성 부신경절종(paraganglioma); 악성 유방외 부신경절종(extra-mammary paraganglioma); 갈색세포종(pheochromocytoma); 사구맥관육종(glomangiosarcoma); 악성 흑색종; 무색소성 흑색종(amelanotic melanoma); 표재 확장성 흑색종(superficial spreading melanoma); 거대 색소 모반(giant pigmented nevus)의 악성 흑색종; 상피양 세포 흑색종(epithelioid cell melanoma); 악성 청색 모반(blue nevus); 육종; 섬유육종; 악성 섬유성 조직구증(fibrous histiocytoma); 점액육종(myxosarcoma); 지방육종(liposarcoma); 평활근육종(leiomyosarcoma); 횡문근육종(rhabdomyosarcoma); 배아성 횡문근육종(embryonal rhabdomyosarcoma); 폐포성 횡문근육종(alveolar rhabdomyosarcoma); 기질 육종(stromal sarcoma); 악성 혼합 종양; 뮬러 혼합 종양(mullerian mixed tumor); 신경모세포종(nephroblastoma); 간모세포종(hepatoblastoma); 암육종; 악성 간엽종(mesenchymoma); 악성 브레너 종양(brenner tumor); 악성 엽상 종양(phyllodes tumor); 활막 육종(synovial sarcoma); 악성 중피종(mesothelioma); 미분화세포종(dysgerminoma); 배아 암종(embryonal carcinoma); 악성 기형종(teratoma); 악성 난소 갑상선종(struma ovarii); 융모막암종(choriocarcinoma); 악성 중신종(mesonephroma); 혈관육종(hemangiosarcoma); 악성 혈관내피종(hemangioendothelioma); 카포시 육종(Kaposi's sarcoma); 악성 혈관주위세포종(hemangiopericytoma); 림프관육종(lymphangiosarcoma); 골육종(osteosarcoma); 골막 골육종(juxtacortical osteosarcoma); 연골육종(chondrosarcoma); 악성 연골모세포종(chondroblastoma); 간엽성 연골육종(mesenchymal chondrosarcoma); 골 거대 세포 종양; 유잉 육종(Ewing's sarcoma); 악성 치성 종양(odontogenic tumor); 법랑모세포 치아육종(ameloblastic odontosarcoma); 악성 법랑모세포종(ameloblastoma); 법랑모세포 섬유육종; 악성 송과체종; 척삭종(chordoma); 악성 신경교종(glioma); 뇌실막세포종(ependymoma); 성상세포종(astrocytoma); 원형질성 성상세포종(protoplasmic astrocytoma); 원섬유성(fibrillary astrocytoma); 성상모세포종(astroblastoma); 신경교아종(glioblastoma); 핍지교종(oligodendroglioma); 핍지모세포종(oligodendroblastoma); 원시 신경외배엽 종양(primitive neuroectodermal); 소뇌 육종(cerebellar sarcoma); 신경절신경모세포종(ganglioneuroblastoma); 신경모세포종(neuroblastoma); 망막모세포종(retinoblastoma); 후신경원성 종양(olfactory neurogenic tumor); 악성 수막종(meningioma); 신경섬유육종(neurofibrosarcoma); 악성 신경초종(neurilemmoma); 악성 과립 세포 종양; 악성 림프종; 호지킨병(hodgkin's disease); 호지킨 부육아종(hodgkin's paragranuloma); 악성 소림프구 림프종; 악성 대세포 미만성 림프종; 악성 여포상 림프종; 진균성 진균증(mycosis fungoid); 기타 명시된 비-호지킨 림프종; 악성 조직구증(histiocytosis); 다발성 골수종; 비만 세포 육종(mast cell sarcoma); 면역증식성 소장 질환; 백혈병; 림프구성 백혈병; 형질세포성 백혈병; 적백혈병(erythroleukemia); 림프육종 세포 백혈병(lymphosarcoma cell leukemia); 골수성 백혈병(myeloid leukemia); 호염기구성 백혈병(basophilic leukemia); 호산기구성 백혈병(eosinophilic leukemia); 단핵구성(monocytic leukemia); 비만세포성 백혈병(mast cell leukemia); 거핵아구성 백혈병(megakaryoblastic leukemia); 골수성 육종(myeloid sarcoma); 및 털세포 백혈병(hairy cell leukemia).
본 발명에서는 임의의 종류의 원발성 암의 국소적 침습 및/또는 전이를 억제하거나 예방하는 방법이 고려된다. 예를 들면, 원발성 암은 흑색종, 비-소(小)세포 폐암, 소세포 폐암, 폐암, 간암종, 망막아세포종, 성상세포종, 신경교아종, 치주암, 설암, 백혈병, 신경아세포종, 두부암, 경부암, 유방암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 골암, 고환암, 난소암, 중피종, 자궁경부암, 위장관암, 림프종, 뇌암, 결장암 또는 방광암일 수 있다. 본 발명의 특정 양태에서, 원발성 암은 폐암이다. 예를 들면, 폐암은 비-소세포 폐 암종일 수 있다.
또한, 본 발명을 사용하여 암을 치료하거나, 화생(metaplasia), 이형성(dysplasia) 및 과형성(hyperplasia)을 포함하는 전암(pre-cancer) 또는 전악성(premalignant) 세포를 치료할 수 있다. 본 발명을 사용하여, 편평 화생, 이형성, 양성 전립선 과형성 세포, 과형성 병변 등과 같이 바람직하지 않지만 양성인 세포를 억제할 수도 있다. 암으로의 진행 또는 보다 심각한 형태의 암으로의 진행은, 본원에서 논의되는 백시니아 바이러스에 의해 암호화된 GM-CSF 폴리펩티드 또는 다른 폴리펩티드(들)를 포함하는 본 발명의 방법에 의해 정지시키거나, 중단시키거나, 지연시킬 수 있다.
A. 투여
본 발명의 방법 및 조성물을 사용하여, 세포를 사멸시키고, 세포 성장을 억제하고, 전이를 억제하고, 종양 또는 조직 크기를 감소시키고, 또는 종양 세포의 악성 표현형을 전환시키거나 감소시키기 위하여, 일반적으로 과증식성 세포를 폴리펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 발현 작제물과 같은 치료학적 화합물과 접촉시킬 것이다. 투여 경로는, 물론, 병변의 위치 및 성질에 따라 달라질 것이고, 예를 들면, 피내, 경피(transdermal), 비경구, 정맥내, 근육내, 비강내, 피하, 국부, 경피(percutaneous), 기관내, 복강내, 동맥내, 방광내, 종양내, 흡입, 관류, 세척(lavage), 직접 주사 및 경구 투여 및 제형이 포함된다.
본 발명은 구체적으로 본 발명의 백시니아 바이러스의 혈관내 투여에 관한 것이다. "혈관내"라는 용어는 환자의 '혈관(들) 속으로', '혈관(들) 내로' 또는 '혈관(들) 속에'를 의미하는, 환자의 혈관계 속으로의 전달을 말하는 것으로 이해된다. 특정 양태에서, 투여는 정맥인 것으로 간주되는 혈관 속으로의 (정맥내) 투여이지만, 다른 양태에서 투여는 동맥인 것으로 간주되는 혈관 속으로의 투여이다. 정맥에는 내경정맥(internal jugular vein), 말초 정맥, 관상정맥, 간 정맥, 문정맥, 대복재정맥(great saphenous vein), 폐 정맥, 상대정맥, 하대정맥, 위 정맥, 비장 정맥, 하장간막 정맥(inferior mesenteric vein), 상장간막 정맥(superior mesenteric vein), 두부 정맥 및/또는 대퇴 정맥이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 동맥에는 관상동맥, 폐 동맥, 상완동맥(brachial artery), 내경동맥(internal carotid artery), 대동맥궁(aortic arch), 대퇴 동맥, 말초 동맥 및/또는 모양체 동맥(ciliary artery)이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 소동맥 또는 모세혈관을 통해, 또는 소동맥 또는 모세혈관으로 전달할 수 있는 것이 고려된다.
종양 혈관계 속으로의 주사는 산재된, 고형의, 접근가능한 종양의 경우에 구체적으로 고려된다. 국소, 국부 또는 전신 투여도 적절할 수 있다. 4cm 초과의 종양의 경우, 투여될 용적은 약 4 내지 10ml (바람직하게는 10ml)일 것이지만, 4cm 미만의 종양의 경우, 약 1 내지 3ml (바람직하게는 3ml)의 용적이 사용될 것이다. 단일 용량으로서 전달되는 수회의 주사는 약 0.1 내지 약 0.5ml의 용적을 포함한다. 바이러스 입자를 대략 1cm의 간격을 두고 종양에 수회의 주사를 투여하여 유리하게 접촉시킬 수 있다.
외과적 수술의 경우에, 본 발명을 수술 전에 사용하여, 수술불가능한 종양 대상체가 절제술을 받을 수 있게 할 수 있다. 대안으로, 본 발명을 수술 시에 및/또는 수술 후에 사용하여, 잔류성 또는 전이성 질환을 치료할 수 있다. 예를 들면, 절제된 종양 베드(bed)를, 폭스바이러스 폴리펩티드, 또는 폭스바이러스를 암 또는 암세포의 치료에 유리하게 하는 돌연변이를 포함하는 폭스바이러스를 포함하는 제형으로 주사하거나 관류시킬 수 있다. 관류는, 예를 들면, 이식된 카테터를 수술 부위에 남겨놓는 방법으로, 절제술 후에 계속될 수 있다. 주기적인 수술후 치료도 계획된다.
연속 투여는 경우에 따라, 예를 들면, 종양을 절제하고 종양 베드를 치료하여 잔류하는 미시적 질환을 제거하는 경우에 적용할 수도 있다. 주사기 또는 카테터삽입을 통한 전달이 바람직하다. 이러한 연속 관류는 치료 시작 후 약 1 내지 2시간부터, 약 2 내지 6시간, 약 6 내지 12시간, 약 12 내지 24시간, 약 1 내지 2일, 약 1 내지 2주 또는 그 이상 동안 실시할 수 있다. 일반적으로, 연속 관류를 통한 치료학적 조성물의 용량은, 관류를 실시하는 기간 동안에 걸쳐 조절되는 단일 또는 수회 주사에 의해 주어지는 것과 동등할 것이다. 특히 흑색종 및 육종의 치료에서, 사지 관류(limb perfusion)를 사용하여 본 발명의 치료학적 조성물을 투여할 수 있는 것이 추가로 고려된다.
치료 방법은 달라질 수도 있고, 종종 종양 종류, 종양 위치, 질환 진행 및 환자의 건강 및 연령에 따라 달라진다. 분명히, 특정 종류의 종양은 보다 공격적인 치료를 필요로 할 것이지만, 동시에, 특정 환자는 보다 부담되는 프로토콜을 견딜 수 없을 것이다. 임상의는 치료학적 제형의 공지된 효능 및 독성(존재하는 경우)을 토대로 이러한 결정을 내리는데 가장 적합할 것이다.
특정 양태에서, 치료하는 종양은, 적어도 초기에는, 절제가능하지 않을 수 있다. 치료학적 바이러스 작제물을 사용한 치료는, 가장자리에서의 수축으로 인해 또는 특정한 특히 침습적인 부분의 제거에 의해 종양의 절제가능성을 증가시킬 것이다. 치료 후, 절제술이 가능할 수 있다. 절제술 이후의 추가적인 치료는 종양 부위에서 미시적 잔류 질환을 제거하는 역할을 할 것이다.
원발성 종양 또는 절제술 후의 종양 베드의 경우, 통상적인 치료 과정은 수회 투여를 포함할 것이다. 통상적인 원발성 종양 치료는 2주 기간에 걸친 6회 용량 투여를 포함한다. 2주 치료를 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회 또는 그 이상 반복할 수 있다. 치료 과정 동안, 계획된 투여를 완료할 필요성을 재평가할 수 있다.
치료는 다양한 "단위 용량"을 포함할 수 있다. 단위 용량은 미리 결정된 양의 치료학적 조성물을 함유하는 것으로 정의된다. 투여될 양, 및 특정 경로 및 제형은 임상 분야의 숙련자의 범위 내에 있다. 단위 용량은 단일 주사로서 투여될 필요는 없지만, 일정한 기간에 걸친 연속 주입을 포함할 수 있다. 본 발명의 단위 용량은 바이러스 작제물의 경우 플라크 형성 단위(pfu)로 편리하게 기술될 수 있다. 단위 용량의 범위는 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013 pfu 및 그 이상이다. 대안으로, 바이러스의 종류 및 도달가능한 역가에 따라, 1 내지 100, 10 내지 50, 100 내지 1000, 또는 최대 약 1 x 104, 1 x 105, 1 x 106, 1 x 107, 1 x 108, 1 x 109, 1 x 1010, 1 x 1011, 1 x 1012, 1 x 1013, 1 x 1014 또는 1 x 1015 또는 그 이상의 감염성 바이러스 입자(vp)를 환자 또는 환자의 세포에 전달할 것이다.
B. 주사가능한 조성물 및 제형
본 발명에서 폭스바이러스 게놈의 전부 또는 일부를 암호화하는 발현 작제물 또는 바이러스를 암 또는 종양 세포로 전달하는 바람직한 방법은 종양내 주사를 통한 것이다. 하지만, 본원에 공개된 약제학적 조성물은 대안으로 미국특허 제5,543,158호, 제5,641,515호 및 제5,399,363호 (각각 구체적으로 전문이 본원에 참조로서 인용됨)에 기술된 바와 같이 비경구적으로, 정맥내로, 피내로, 근육내로, 경피적으로 또는 복강내로도 투여할 수 있다.
핵산 작제물의 주사는, 발현 작제물이 주사를 위해 필요한 특정한 규격의 바늘을 통해 통과할 수 있는 한, 주사기 또는 용액의 주사를 위하여 사용되는 임의의 다른 방법에 의해 전달될 수 있다. 용액을 담는 앰플 챔버를 결정하는 노즐, 및 용액을 노즐에서 전달 부위로 밀어내기 위한 에너지 장치를 갖는 신규 무바늘(needleless) 주사 시스템이 최근에 기술되었다 [참조: 미국특허 제5,846,233호]. 미리 결정된 양의 용액을 정확하게 임의의 깊이로 수회 주사할 수 있는 유전자 요법용 주사기 시스템도 기술되었다[참조: 미국특허 제5,846,225호].
유리 염기 또는 약리학적으로 허용되는 염으로서의 활성 화합물의 용액을 하이드록시프로필셀룰로스와 같은 계면활성제와 적당하게 혼합된 물 중에 제조할 수 있다. 분산액을 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이의 혼합물 중에, 및 오일 중에 제조할 수도 있다. 통상의 보관 및 사용 조건 하에서, 이러한 제제는 보존제를 함유하여 미생물의 성장을 방지한다. 주사가능한 용도로 적당한 약제학적 형태에는 멸균 수성 용액제 또는 분산액제, 및 멸균 주사가능 용액제 또는 분산액제의 즉석 제조를 위한 멸균 산제가 포함된다[참조: 구체적으로 전문이 본원에 참조로서 인용된 미국특허 제5,466,468호]. 모든 경우에, 형태는 멸균이어야 하고, 주사하기 쉬운 정도로 유체이어야 한다. 이는 제조 및 보관 조건 하에서 안정해야 하고, 세균 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올 (예: 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이의 적당한 혼합물 및/또는 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적당한 유동성은, 예를 들면, 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지시킬 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항세균제 및 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에, 등장제, 예를 들면, 당 또는 염화나트륨을 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사가능 조성물의 장기간 흡수는 조성물 중에 흡수 지연제, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 사용하여 달성할 수 있다.
수용액 중의 비경구 투여의 경우, 예를 들면, 필요한 경우 용액을 적당하게 완충시켜야 하고, 액체 희석제를 먼저 충분한 식염수 또는 글루코스를 사용하여 등장으로 만들어야 한다. 이러한 특정한 수용액은 특히 정맥내, 근육내, 피하, 종양내 및 복강내 투여에 적당하다. 이와 관련하여, 사용될 수 있는 멸균 수성 매질은 본 명세서에 비추어 당업자에게 공지되어 있을 것이다. 예를 들면, 1회 용량을 1ml의 등장 NaCl 용액에 용해시켜 1000ml의 대량피하주사(hypodermoclysis) 유체에 첨가하거나 계획된 주입 부위에 주사할 수 있다[참조: "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 및 1570-1580]. 물론, 치료받는 대상체의 상태에 따라 약간의 투여량의 변화가 발생할 것이다. 투여를 담당하는 사람은, 임의의 경우에, 개개의 대상체에 대한 적당량을 결정할 것이다. 또한, 사람 투여의 경우, 제제는 FDA Office of Biologics의 기준에 의해 요구되는 무균성, 발열성(pyrogenicity), 일반적인 안전성 및 순도 기준을 충족시켜야 한다.
멸균 주사가능 용액은, 앞서 열거한 다양한 다른 성분과 함께 적당한 용매 중에 활성 화합물을 필요한 양으로 혼입시킨 후, 필요에 따라, 여과 멸균하여 제조한다. 일반적으로, 분산액은 다양한 멸균된 활성 성분을 기본 분산 매질 및 앞서 열거한 것으로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 속에 혼입시켜 제조한다. 멸균 주사가능 용액의 제조를 위한 멸균 산제의 경우, 바람직한 제조 방법은, 이의 미리 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분 및 임의의 추가적인 목적하는 성분의 분말을 수득하는 진공건조 및 냉동건조 기술이다.
본원에 공개된 조성물을 중성 또는 염 형태로 제형화할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염에는 산 부가염 (단백질의 유리 아미노 그룹을 사용하여 형성됨)이 포함되고, 이는 무기산 (예: 염산 또는 인산) 또는 유기산 (예: 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등)을 사용하여 형성된다. 유리 카복실 그룹을 사용하여 형성되는 염은 무기 염기 (예: 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘 또는 수산화철) 및 유기 염기 (예: 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인(procaine) 등)로부터 유도될 수도 있다. 제형시, 용액제는 투여 제형에 적합한 방식으로 그리고 치료학적으로 유효한 양으로 투여될 것이다. 제형은 주사가능 용액, 약물 방출 캡슐 등과 같은 다양한 투여 형태로 쉽게 투여된다.
본원에서 사용되는 "담체"에는 임의의 그리고 모든 용매, 분산 매질, 비히클, 제피, 희석제, 항세균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제, 완충제, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등이 포함된다. 약제학적 활성 물질에 대한 이러한 매질 및 약제의 사용은 당업계에 익히 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 약제가 활성 성분과 비-상용성인 경우를 제외하고는, 이를 치료학적 조성물 중에 사용하는 것이 고려된다. 보충 활성 성분을 조성물 속에 혼입시킬 수도 있다.
"약제학적으로 허용되는" 또는 "약리학적으로 허용되는"이라는 어구는 사람에게 투여하는 경우 알레르기 또는 유사한 부적당한 반응을 일으키지 않는 분자 물질 및 조성물을 말한다. 활성 성분으로서 단백질을 함유하는 수성 조성물의 제조는 당업계에서 충분히 이해된다. 통상적으로, 이러한 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서, 주사가능물질로서 제조된다; 액체 중의 용액 또는 현탁액에 대해 적당한 주사 전의 고체 형태를 제조할 수도 있다.
C. 병용 치료
본 발명의 조성물 및 방법은 암 및 죽상동맥경화증을 포함하는 과증식성 질환/상태와 관련하여 사용될 수 있다. 약독화된(attenuated) 백시니아 바이러스와 같은 본 발명의 조성물을 사용한 치료의 유효성을 증가시키기 위하여, 이러한 조성물을 상기 질환 및 상태의 치료에 효과적인 다른 약제와 배합하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 암 치료는 본 발명의 치료학적 화합물 및 다른 항암 요법 (예: 항암제 또는 수술)을 사용하여 실시할 수 있다.
다양한 조합을 사용할 수 있다; 예를 들면, 약독화된 폭스바이러스 (예: 백시니아 바이러스)는 "A"이고, 제2의 항암 요법은 "B"이다:
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환자에게 본 발명의 치료학적 발현 작제물을 투여하는 것은, 폭스바이러스 치료의 독성(존재하는 경우)을 고려하여, 상기 특정한 제2의 요법의 투여에 관한 일반적인 프로토콜을 따를 것이다. 치료 주기는 필요에 따라 반복될 것이라고 예상된다. 다양한 표준 요법 뿐만 아니라 외과적 수술도, 상기 암 또는 종양 세포 치료법과 함께 적용될 수 있는 것이 또한 고려된다.
1. 항암 요법
"항암제"는, 예를 들면, 암세포를 사멸시키거나 (예: 암세포의 아폽토시스), 암세포의 성장 속도를 감소시키거나, 전이의 발생 또는 수를 감소시키거나, 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 억제하거나, 종양 또는 암세포로의 혈액 공급을 감소시키거나, 암세포 또는 종양에 대한 면역 반응을 촉진시키거나, 암의 진행을 예방 또는 억제하거나, 암이 있는 대상체의 수명을 증가시켜, 대상체에서 암에 음성적으로 영향을 줄 수 있다. 항암제에는 생물학적 제제(생물요법), 화학치료제 및 방사선치료제가 포함된다. 보다 일반적으로, 이러한 기타 조성물은 세포를 사멸시키거나 세포의 증식을 억제시키는데 효과적인 배합량으로 제공될 것이다. 상기 방법은 세포를 발현 작제물 및 약제(들) 또는 다수의 인자(들)와 동시에 접촉시킴을 포함할 것이다. 이는 세포를 두 제제를 포함하는 단일 조성물 또는 약리학적 제형과 접촉시키거나, 세포를 2개의 상이한 조성물 또는 제형과 동시에 접촉시켜 달성할 수 있고, 이때 하나의 조성물은 발현 작제물을 포함하고 다른 조성물은 제2의 약제(들)를 포함한다.
화학치료제 또는 방사선치료제에 대한 종양 세포 내성은 임상 종양학에서 중요한 문제를 일으킨다. 현재의 암 연구의 한가지 목표는 화학요법 및 방사선요법을 유전자 요법과 병용하여 효능을 향상시키는 방법을 찾는 것이다. 예를 들면, 단순 포진 티미딘 키나제 (HS-tK) 유전자는, 레트로바이러스 벡터 시스템에 의해 뇌 종양으로 전달된 경우, 항바이러스제 간시클로비어(ganciclovir)에 대한 감수성을 성공적으로 유도하였다[참조: Culver et al ., 1992]. 본 발명과 관련하여, 폭스바이러스 요법은 다른 아폽토시스 촉진제(pro-apoptotic agent) 또는 세포 주기 조절제 뿐만 아니라, 화학치료, 방사선치료, 면역치료 또는 다른 생물학적 시술과 함께 유사하게 사용될 수 있다.
대안으로, 유전자 요법은 다른 약물 치료에 앞서 또는 이후에 수분 내지 수주 범위의 간격을 두고 실시할 수 있다. 다른 약제 및 발현 작제물을 개별적으로 세포에 투여하는 양태에서, 일반적으로 각각의 전달 사이에 상당한 시간이 경과되지 않게 하여, 약제 및 발현 작제물이 세포에 대해 유리한 병용 효과를 여전히 발휘할 수 있도록 할 것이다. 이러한 예에서, 세포를 두 요법과 서로 약 12 내지 24시간 내에, 보다 바람직하게는 서로 약 6 내지 12시간 내에 접촉시킬 수 있는 것이 고려된다. 일부 경우에, 치료 기간을 상당히 연장시키는 것이 바람직할 수 있지만, 이때 각각의 투여 사이에 수일 (2, 3, 4, 5, 6 또는 7일) 내지 수주 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8주)의 경과를 둔다.
a. 화학요법
암 치료법에는 또한 화학 및 방사선을 사용하는 치료법을 사용한 다양한 병용 요법이 포함된다. 병용 화학요법에는, 예를 들면, 시스플라틴 (CDDP), 카보플라틴, 프로카바진, 메클로레타민, 사이클로포스파미드, 캄프토테신, 이포스파미드, 멜팔란, 클로람부실, 부설판, 니트로스우레아, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 블레오마이신, 플리코마이신, 미토마이신, 에토포사이드 (VP16), 타목시펜, 랄록시펜, 에스트로겐 수용체 결합제, 탁솔, 젬시타비엔, 나벨바인, 파네실-단백질 트랜스퍼라제 억제제, 트랜스플라티눔, 5-플루오로우라실, 빈크리스틴, 빈블라스틴 및 메토트렉세이트, 테마졸로마이드 (DTIC의 수성 형태), 또는 이의 임의의 유사체 또는 유도 변형체가 포함된다. 화학요법과 생물학적 요법의 병용은 생물화학요법으로 공지되어 있다.
b. 방사선요법
DNA 손상을 일으키고 광범위하게 사용되어온 한가지 요소에는 일반적으로 종양 세포로의 γ-레이, X-레이 및/또는 방사성 동위원소의 직접 전달로 공지된 것이 포함된다. 마이크로파 및 UV 조사와 같은 다른 형태의 DNA 손상 요소도 고려된다. 모든 이러한 요소는 DNA, DNA의 전구체, DNA의 복제 및 복구, 및 염색체의 어셈블리 및 유지에 광범위한 손상을 초래하는 것 같다. X-레이의 선량 범위는 장기간 (3 내지 4주) 동안의 50 내지 200 뢴트겐의 1일 선량에서부터, 2000 내지 6000 뢴트겐의 단일 선량까지이다. 방사선 동위원소의 선량 범위는 광범위하게 달라지고, 동위원소의 반감기, 방출된 방사선의 세기 및 종류, 및 신생 세포(neoplastic cell)에 의한 흡수에 따라 달라진다.
"접촉된" 및 "노출된"이라는 용어는, 세포에 적용되는 경우, 치료학적 작제물 및 화학치료제 또는 방사선치료제를 표적 세포로 전달하거나 표적 세포에 바로 근접하게 위치에 시키는 과정을 기술하기 위하여 본원에서 사용된다. 세포 사멸 또는 정지(stasis)를 달성하기 위하여, 두 약제를 세포를 사멸시키거나 세포의 분열을 억제하는데 효과적인 배합량으로 세포에 전달한다.
c. 면역요법
면역치료제는 일반적으로 암세포를 표적화하고 파괴하는 면역 효과인자 세포 및 분자의 사용에 의존적이다. 면역 효과인자는, 예를 들면, 종양 세포의 표면 상의 일부 마커에 대해 특이적인 항체일 수 있다. 항체는 단독으로 치료법의 효과인자로서 역할을 하거나, 다른 세포를 동원하여 실제로 세포 사멸을 달성할 수 있다. 항체는 또한 약물 또는 독소 (화학치료제, 방사선 핵종(radionuclide), 리신(ricin) A 쇄, 콜레라 독소, 백일해(pertussis) 독소 등)에 접합되어 단지 표적화 약제로서 역할을 할 수 있다. 대안으로, 효과인자는 종양 세포 표적과 직접적 또는 간접적으로 상호작용하는 표면 분자를 보유하는 림프구일 수 있다. 다양한 효과인자 세포에는 세포독성 T 세포 및 NK 세포가 포함된다. 치료 요법의 병용, 즉 특정 폭스바이러스 폴리펩티드의 직접적인 세포독성 활성 및 억제 또는 감소는 암 치료에서 치료학적 이익을 제공할 것이다.
면역요법은 병용 요법의 일부로서 사용될 수도 있다. 병용 요법을 위한 일반적인 접근법은 아래에 논의된다. 면역요법의 한가지 양상에서, 종양 세포는 표적화될 수 있는, 즉 대다수의 다른 세포에는 존재하지 않는 일부 마커를 보유해야 한다. 많은 종양 마커가 존재하고, 임의의 이러한 마커는 본 발명과 관련하여 표적화에 적당할 수 있다. 통상적인 종양 마커에는 암배아성(carcinoembryonic) 항원, 전립선 특이적 항원, 비뇨 종양 관련 항원, 태아 항원, 티로시나제 (p97), gp68, TAG-72, HMFG, 시알릴 루이스(Sialyl Lewis) 항원, MucA, MucB, PLAP, 에스트로겐 수용체, 라미닌 수용체, erb B 및 p155가 포함된다. 면역요법의 다른 양상은 면역 자극 효과를 갖는 항암 효과에 대한 것이다. 면역 자극 분자로는 또한 사이토카인 (예: IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, IFNγ), 케모카인 (예: MIP-1, MCP-1, IL-8) 및 성장인자 (예: FLT3 리간드)가 존재한다. 단백질로서, 또는 유전자 전달을 사용하여, mda-7과 같은 종양 억제인자와 면역 자극 분자를 배합시키는 것은 항종양 효과를 향상시키는 것으로 밝혀졌다[참조: Ju et al ., 2000].
앞서 논의된 바와 같이, 현재 연구 중이거나 사용중인 면역요법의 예로는 면역 애주번트 (예: 마이코박테리움 보비스, 플라스모디움 팔시파룸, 디니트로클로로벤젠 및 방향족 화합물) [참조: 미국특허 제5,801,005호; 제5,739,169호; Hui and Hashimoto, 1998; Christodoulides et al ., 1998], 사이토카인 요법 (예: 인터페론 α, β 및 γ; IL-1, GM-CSF 및 TNF) [참조: Bukowski et al ., 1998; Davidson et al., 1998; Hellstrand et al ., 1998], 유전자 요법 (예: TNF, IL-1, IL-2, p53) [참조: Qin et al ., 1998; Austin-Ward and Villaseca, 1998; 미국특허 제5,830,880호 및 제5,846,945호] 및 모노클로날 항체 (예: 항-갱글리오사이드 GM2, 항-HER-2, 항-p185) [참조: Pietras et al ., 1998; Hanibuchi et al ., 1998; 미국특허 제5,824,311]가 있다. 허셉틴(Herceptin)(트라스투주맙)은 HER2-neu 수용체를 차단하는 키메릭(chimeric) (마우스-사람) 모노클로날 항체이다. 이는 항종양 활성을 갖고 있고, 악성 종양의 치료용으로 승인되었다[참조: Dillman, 1999]. 허셉틴과 화학요법을 사용한 암의 병용 치료법은 개개의 치료법보다 효과적인 것으로 밝혀졌다. 따라서, 하나 이상의 항암 요법을 본원에서 기술된 폭스바이러스 관련 요법과 함께 사용할 수 있는 것이 고려된다.
수동 면역요법. 암의 수동 면역요법을 위한 많은 상이한 접근법이 존재한다. 이들은 다음의 범주로 광범위하게 분류될 수 있다: 항체의 단독 주사; 독소 또는 화학치료제와 결합된 항체의 주사; 방사성 동위원소와 결합된 항체의 주사; 항-이디오타입(idiotype) 항체의 주사; 및 마지막으로, 골수내 종양 세포의 퍼징(purging).
바람직하게는, 사람 모노클로날 항체는 환자에서 부작용을 거의 또는 전혀 일으키지 않으므로 수동 면역요법에서 사용된다. 하지만, 이들은 풍부하지 않아 이들의 적용은 다소 제한되고, 지금까지는 병변내 투여만 실시되었다. 갱글리오사이드 항원에 대한 사람 모노클로날 항체는 피부 재발성 흑색종을 겪고 있는 환자에게 병변내로 투여되었다[참조: Irie and Morton, 1986]. 매일 또는 매주 병변내로 주사한 후, 10명의 환자 중 6명에서 퇴행(regression)이 관찰되었다. 다른 연구에서는, 2개의 사람 모노클로날 항체의 병변내 주사로부터 적절한 성공이 달성되었다[참조: Irie et al ., 1989].
2개의 상이한 항원에 대해 지시된 하나 이상의 모노클로날 항체 또는 다중 항원 특이성을 갖는 항체를 투여하는 것이 유리할 수 있다. 치료 프로토콜에는 문헌[참조: Bajorin et al . (1988)]에 기술된 림포카인 또는 다른 면역 증강제의 투여가 포함될 수도 있다. 사람 모노클로날 항체의 개발은 본 명세서의 다른 부분에 상세히 기술되어 있다.
능동 면역요법. 능동 면역요법에서는, 항원성 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질, 또는 자가 또는 동종이계(allogenic) 종양 세포 조성물 또는 "백신"을, 일반적으로 상이한 세균 애주번트와 함께 투여한다[참조: Ravindranath and Morton, 1991; Morton et al ., 1992; Mitchell et al ., 1990; Mitchell et al ., 1993]. 흑색종 면역요법에서, 높은 IgM 반응을 나타내는 환자는 종종 IgM 항체가 나타나지 않거나 낮게 나타나는 환자보다 오래 생존한다[참조: Morton et al ., 1992]. IgM 항체는 종종 일시적인 항체이고, 이에 대한 예외로는 항-갱글리오사이드 또는 항-탄수화물 항체가 있는 것 같다.
입양 면역요법. 입양(adoptive) 면역요법에서는, 환자의 순환 림프구 또는 종양 침윤 림프구를 시험관내에서 분리하여, IL-2와 같은 림포카인으로 활성화시키거나 종양 괴사에 대한 유전자로 형질도입시켜, 재투여한다[참조: Rosenberg et al., 1988; 1989]. 이를 달성하기 위하여, 본원에서 기술된 애주번트-혼입된 항원성 펩티드 조성물과 함께 면역학적 유효량의 활성화된 림프구를 동물 또는 사람 환자에게 투여할 것이다. 활성화된 림프구는 가장 바람직하게는, 먼저 혈액 또는 종양 샘플로부터 분리되어 시험관내에서 활성화된 (또는 "증식된(expanded)") 환자 자신의 세포일 것이다. 이러한 형태의 면역요법은 흑색종 및 신장 암종의 퇴행의 다수의 증례를 보였지만, 반응자의 비율은 반응하지 않은 사람과 비교하여 매우 낮았다.
d. 유전자
또다른 양태에서, 2차 치료는 약독화된 폭스바이러스를 투여하기 전, 후, 또는 이와 동시에 치료학적 폴리뉴클레오타이드를 투여하는 유전자 요법이다. 다음 중 하나의 유전자 산물을 암호화하는 벡터와 함께 폭스바이러스를 전달하는 것은 표적 조직에 대해 병용 항암 효과를 가질 것이다. 대안으로, 폭스바이러스를 바이러스 벡터로서 조작하여 치료학적 폴리뉴클레오타이드를 포함시킬 수 있다. 다양한 단백질이 본 발명 내에 포함되고, 이들 중 일부는 아래에 기술되어 있다. 표 7에는 본 발명과 함께 일부 형태의 유전자 요법에 대해 표적화될 수 있는 다양한 유전자가 열거되어 있다.
세포 증식의 유도인자. 세포 증식을 유도하는 단백질은 기능에 따라 다양한 범주로 추가로 분류된다. 모든 이러한 단백질의 공통점은 세포 증식을 조절하는 능력이다. 예를 들면, PDGF의 한가지 형태인 sis 종양유전자는 분비되는 성장 인자이다. 종양유전자는 성장 인자를 암호화하는 유전자로부터는 거의 생겨나지 않고, 현재는 sis가 유일한 공지된 천연 종양유발성(oncogenic) 성장 인자이다. 본 발명의 한가지 양태에서, 특정한 세포 증식 유도인자에 대해 지시된 안티센스 mRNA를 사용하여 세포 증식 유도인자의 발현을 방해하는 것이 고려된다.
FMS, ErbA, ErbB 및 neu 단백질은 성장 인자 수용체이다. 이러한 수용체가 돌연변이되면 조절성 기능이 손실된다. 예를 들면, Neu 수용체 단백질의 막관통 도메인에 영향을 주는 점 돌연변이는 neu 종양유전자를 생성시킨다. erbA 종양유전자는 갑상선 호르몬에 대한 세포내 수용체로부터 유래된다. 변형된 종양유발성 ErbA 수용체는 내인성 갑상선 호르몬 수용체와 경쟁하여 비-조절된 성장을 일으키는 것으로 생각된다.
가장 큰 종양유전자 계열에는 시그날 전달 단백질 (예: Src, Abl 및 Ras)이 포함된다. Src 단백질은 세포질 단백질-티로신 키나제이고, 일부 경우에 이의 원종양 유전자(proto-oncogene)로부터 종양유전자로의 변형은 527번 티로신 잔기에서의 돌연변이를 통해 발생한다. 대조적으로, GTPase 단백질인 ras의 원종양 유전자로부터 종양유전자로의 변형은, 한가지 예에서, 서열 내의 12번 아미노산에서의 발린에서 글리신으로의 돌연변이로부터 발생하고, 이는 ras GTPase 활성을 감소시킨다.
Jun, Fos 및 Myc 단백질은 전사 인자로서 핵 기능에 직접적으로 영향을 발휘하는 단백질이다.
세포 증식의 억제제. 종양 억제인자 종양유전자는 과도한 세포 증식을 억제하는 기능을 한다. 이러한 유전자의 불활성화는 이들의 억제 활성을 소실시켜, 비-조절된 증식을 일으킨다. 종양 억제인자인 p53, p16 및 C-CAM은 아래에 기술되어 있다.
앞서 기술된 p53 외에도, 다른 세포 증식 억제제로는 p16이 있다. 진핵생물 세포 주기의 주요 전이(transition)는 사이클린-의존성 키나제 또는 CDK에 의해 유도된다. CDK 중 하나인 사이클린-의존성 키나제 4 (CDK4)는 G1을 통과하는 진행을 조절한다. 상기 효소의 활성은 후기 G1에서 Rb를 인산화시키는 것일 수 있다. CDK4의 활성은 활성화 서브유닛인 D형 사이클린, 및 억제 서브유닛에 의해 조절되고, p16INK4는 CDK4에 특이적으로 결합하여 이를 억제하여, Rb 인산화를 조절할 수 있는 단백질로서 생화학적으로 특성규명되었다[참조: Serrano et al ., 1993; Serrano et al ., 1995]. p16INK4 단백질은 CDK4 억제제이므로[참조: Serrano, 1993], 이러한 유전자의 결실은 CDK4의 활성을 증가시켜, Rb 단백질의 과인산화를 일으킬 수 있다. p16은 또한 CDK6의 기능을 조절하는 것으로 공지되어 있다.
p16INK4는 p16B, p19, p21WAF1 및 p27KIP1도 포함되는 신규로 기술된 CDK 억제 단백질 계열에 속한다. p16INK4 유전자는 많은 종양 종류에서 종종 결실되는 염색체 영역인 9p21에 매핑(mapping)된다. p16INK4 유전자의 동형접합성(homozygous) 결실 및 돌연변이는 사람 종양 세포주에서 빈번하다. 이러한 증거는 p16INK4 유전자가 종양 억제인자 유전자라는 것을 시사한다. 하지만, 이러한 해석은, p16INK4 유전자 변화의 빈도가 배양된 세포주에서보다 원발성 비-배양된 종양에서 훨씬 낮다는 관찰에 의해 이의제기되었다[참조: Caldas et al ., 1994; Cheng et al ., 1994; Hussussian et al ., 1994; Kamb et al ., 1994; Kamb et al ., 1994; Mori et al ., 1994; Okamoto et al ., 1994; Nobori et al ., 1994; Orlow et al ., 1994; Arap et al., 1995]. 플라스미드 발현 벡터를 사용한 형질감염에 의한 야생형 p16INK4 기능의 복원은 일부 사람 암 세포주에 의한 콜로니 형성을 감소시켰다[참조: Okamoto, 1994; Arap, 1995].
본 발명에 따라 사용될 수 있는 다른 유전자에는 Rb, APC, DCC, NF-1, NF-2, WT-1, MEN-I, MEN-II, zac1, p73, VHL, MMAC1 / PTEN, DBCCR-1, FCC, rsk-3, p27, p27/p16 융합, p21/p27 융합, 항-혈전 유전자 (예: COX-1, TFPI), PGS, Dp, E2F, ras, myc , neu , raf , erb , fms , trk , ret , gsp , hst , abl, E1A, p300, 혈관신생에 관련된 유전자 (예: VEGF, FGF, 트롬보스폰딘, BAI-1, GDAIF 또는 이들의 수용체) 및 MCC가 포함된다.
프로그램화된 세포 사멸의 조절인자. 아폽토시스 또는 프로그램화된 세포 사멸은 정상적인 배아 발생, 성체 조직에서의 항상성 유지 및 발암 억제에 필수적인 과정이다[참조: Kerr et al ., 1972]. Bcl-2 계열의 단백질 및 ICE-유사 프로테아제는 다른 시스템에서 아폽토시스의 중요한 조절인자 및 효과인자인 것으로 증명되었다. 소포 림프종(follicular lymphoma)과 관련하여 발견된 Bcl-2 단백질은, 다양한 아폽토시스성 자극에 반응하여 아폽토시스를 조절하고 세포 생존을 향상시키는데 있어서 현저한 역할을 한다[참조: Bakhshi et al ., 1985; Cleary and Sklar, 1985; Cleary et al ., 1986; Tsujimoto et al ., 1985; Tsujimoto and Croce, 1986]. 진화적으로 보존된 Bcl-2 단백질은 현재는, 관련된 단백질 계열의 일원인 것으로 인식되며, 사멸 효능제 또는 사멸 길항제로 분류될 수 있다.
이의 발견 이후에, Bcl-2는 다양한 자극에 의해 유도되는 세포 사멸을 억제하는 작용을 하는 것이 밝혀졌다. 또한, 공통적인 구조 및 서열 상동성을 공유하는 Bcl-2 세포 사멸 조절 단백질 계열이 존재한다는 것이 현재는 명백하다. 이러한 상이한 계열 일원은 Bcl-2와 유사한 기능을 갖거나 (예: BclXL, BclW, BclS, Mcl-1, A1, Bfl-1), Bcl-2 기능을 방해하여 세포 사멸을 촉진시키는 것으로 밝혀졌다 (예: Bax, Bak, Bik, Bim, Bid, Bad, Harakiri).
D. 수술
대략 60%의 암환자는 예방적, 진단적 또는 병기결정(staging), 치료적 및 고식적(palliative) 수술을 포함하는 몇몇 종류의 수술을 받을 것이다. 치료적 수술은 다른 요법 (예: 본 발명의 치료, 화학요법, 방사선요법, 호르몬 요법, 유전자 요법, 면역요법 및/또는 대안적 요법)과 함께 사용될 수 있는 암 치료이다.
치료적 수술에는 암 조직의 전부 또는 일부를 물리적으로 제거, 절개 및/또는 파괴하는 절제술이 포함된다. 종양 절제술은 적어도 종양의 일부의 물리적인 제거를 말한다. 종양 절제술 이외에, 수술에 의한 치료에는 레이저 수술, 저온수술, 전기수술 및 현미경 통제 수술 (모즈(Mohs') 수술)이 포함된다. 본 발명을 표재성(superficial) 암, 전암(precancer) 또는 부수적인 양의 정상 조직의 제거와 함께 사용할 수 있는 것이 추가로 고려된다.
암 세포, 조직 또는 종양의 일부 또는 전부의 절제시, 신체에 공간이 형성될 수 있다. 치료는 추가적인 항암 요법과 함께, 영역의 관류, 직접 주사 또는 국소 적용에 의해 달성될 수 있다. 이러한 치료는, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 마다, 또는 1, 2, 3, 4 및 5주 마다, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개월 마다 반복할 수 있다. 이러한 치료는 또한 다양한 용량으로 할 수 있다.
E. 기타 약제
본 발명과 함께 기타 약제를 사용하여 치료의 치료학적 효능을 향상시키는 것이 고려된다. 이러한 추가적인 약제에는 면역조절제, 세포 표면 수용체 및 간극 연결(GAP junction)의 상향조절에 영향을 주는 약제, 세포증식 억제제 (cytostatic agent) 및 분화제(differentiation agent), 세포 부착 억제제, 아폽토시스 유도인자에 대해 과증식성 세포의 민감성을 증가시키는 약제, 또는 다른 생물학적 약제가 포함된다. 면역조절제에는 종양 괴사 인자; 인터페론 α, β 및 γ; IL-2 및 다른 사이토카인; F42K 및 다른 사이토카인 유사체; 또는 MIP-1, MIP-1β, MCP-1, RANTES 및 다른 케모카인이 포함된다. 세포 표면 수용체 또는 이들의 리간드, 예를 들면 Fas / Fas 리간드, DR4 또는 DR5 / TRAIL (Apo-2 리간드)의 상향조절은, 과증식성 세포에 대한 자가분비 또는 측분비 효과의 달성에 의한 본 발명의 아폽토시스 유도 능력을 강화시킬 것이 추가로 고려된다. 간극 연결의 수를 증가시켜 세포내 시그날전달을 증가시키면, 인접한 과증식 세포 집단에 대한 항-과증식 효과가 증가될 것이다. 다른 양태에서, 세포증식 억제제 또는 분화제를 본 발명과 함께 사용하여 치료의 항-과증식 효능을 향상시킬 수 있다. 세포 부착 억제제는 본 발명의 효능을 향상시키는 것으로 생각된다. 세포 부착 억제제의 예로는 국소 부착 키나제 (FAK; Focal Adhesion Kinase) 억제제 및 로바스타틴(Lovastatin)이 있다. 아폽토시스에 대한 과증식성 세포의 민감성을 향상시키는 다른 약제 (예: c225 항체)를 본 발명과 함께 사용하여 치료 효능을 향상시킬 수 있다.
Apo2 리간드 (Apo2L, 또한 TRAIL이라고 함)는 종양 괴사 인자(TNF) 사이토카인 계열의 일원이다. TRAIL은 많은 종류의 암세포에서 신속한 아폽토시스를 활성화시키지만, 정상 세포에 대해서는 독성이 없다. TRAIL mRNA는 광범위한 조직에 존재한다. 대부분의 정상 세포는 TRAIL의 세포독성 작용에 대해 내성인 것 같고, 이는 TRAIL에 의한 아폽토시스 유도에 대해 보호할 수 있는 기전의 존재를 시사한다. 사멸 수용체 4 (DR4)라고 하는, TRAIL에 대해 기술된 최초의 수용체는, 세포질 "사멸 도메인"을 함유하며; DR4는 TRAIL에 의해 전달된 아폽토시스 시그날을 전달한다. TRAIL에 결합하는 추가적인 수용체가 확인되었다. DR5라고 하는 한가지 수용체는 세포질 사멸 도메인을 함유하고, DR4와 매우 유사하게 아폽토시스 시그날을 전달한다. DR4 및 DR5 mRNA는 많은 정상 조직 및 종양 세포주에서 발현된다. 최근에는, TRAIL이 DR4 및 DR5를 통해 아폽토시스를 유도하지 못하게 하는 DcR1 및 DcR2와 같은 디코이(decoy) 수용체가 확인되었다. 따라서, 이러한 디코이 수용체는, 세포 표면에서 직접적으로 아폽토시스 촉진성 사이토카인에 대한 민감성을 조절하는 신규 기전을 나타낸다. 정상 조직에서의 이러한 억제 수용체의 우선적인 발현은, TRAIL이 정상 세포는 남겨두면서 암세포에서 아폽토시스를 유도하는 항암제로서 유용할 수 있다는 것을 시사한다[참조: Marsters et al ., 1999].
세포독성 화학치료 약물의 도입 이후 암 치료법에서 많은 진보가 있었다. 하지만, 화학요법의 결과 중 하나는 약물 내성 표현형의 발생/획득 및 다중 약물 내성의 발생이다. 약물 내성의 발생은 이러한 종양의 치료에서 중요한 장애물로 남으며, 그러므로 유전자 요법과 같은 대안적인 접근법에 대한 분명한 필요성이 있다.
화학요법, 방사선 요법 또는 생물학적 요법과 함께 사용하기 위한 다른 형태의 요법에는 온열요법(hyperthermia)이 포함되고, 이는 환자의 조직을 고온 (최대 106℉)에 노출시키는 방법이다. 외부 또는 내부 가열 장치는 국소, 국부 또는 전신 온열요법의 적용에 포함될 수 있다. 국소 온열요법은 종양과 같은 작은 영역에 열을 가하는 것을 포함한다. 열은 신체 외부의 장치로부터 종양을 표적화하는 고주파를 사용하여 외부적으로 생성시킬 수 있다. 내부 열은 멸균 프로브(sterile probe), 예를 들면 가느다란 가열된 철사 또는 온수로 채워진 중공관, 이식된 마이크로파 안테나, 또는 고주파 전극(radiofrequency electrode)을 필요로 할 수 있다.
국부 요법의 경우 환자의 장기 또는 사지를 가열하며, 이는 높은 에너지를 발생시키는 장치 (예: 자석)를 사용하여 달성된다. 대안으로, 환자의 혈액 중 일부를 채취하여, 내부적으로 가열될 영역 속으로 관류시키기 전에 가열시킬 수 있다. 전신 가열은 암이 전신으로 확산된 경우에 수행할 수도 있다. 이를 위하여, 온수 담요, 열 왁스(hot wax), 유도 코일 및 열 챔버(thermal chamber)를 사용할 수 있다.
호르몬 요법은 본 발명과 함께 또는 앞서 기술된 임의의 다른 암 치료법과 함께 사용될 수도 있다. 호르몬을 특정 암 (예: 유방암, 전립선암, 난소암 또는 자궁경부암)의 치료에서 사용하여, 특정 호르몬 (예: 테스토스테론 또는 에스트로겐)의 수준을 감소시키거나 이의 효과를 차단할 수 있다. 이러한 치료는 종종 하나 이상의 다른 암 치료법과 함께, 치료 옵션으로서 또는 전이의 위험성을 감소시키기 위하여 사용된다.
[표 6a]
Figure 112014022063024-pat00008
[표 6b]
Figure 112014022063024-pat00009
[표 6c]
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[표 6d]
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VIII . 실시예
다음의 실시예는 본 발명의 바람직한 양태를 증명하기 위하여 포함된다. 당업자는, 본 발명자에 의해 발견된 대표 기술을 따르는 본 실시예에서 공개된 기술이 본 발명의 실시에서 우수하게 기능을 하고, 따라서 본 발명의 실시를 위한 바람직한 방식을 구성하는 것으로 고려될 수 있다는 것을 인식해야 한다. 하지만, 당업자는, 본 명세서에 비추어, 공개된 특정 양태에서 많은 변화가 가능하고, 본 발명의 취지 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 유사한 결과를 얻을 수 있다는 것을 인식해야 한다.
실시예 1: 재료 및 방법
바이러스 및 세포주. 다양한 야생형 폭스바이러스 주(strain) (와이어스(Wyeth), 웨스턴 리저브(WR), USSR, 티안탄(Tian Tan), 타슈켄트(Tash Kent), 파트워당거(Patwadangar), 리스터(Lister), 킹(King), IHD-W, IHD-J 및 에반스(Evans))는 제프 스미스(Geoff Smith) 박사 (Imperial College, London)로부터 감사하게 제공받았다. 사람 아데노바이러스 혈청형 5 (Ad5)는 ATCC로부터 입수하였다. 바이러스 성장 인자(VGF) 결실된 WR 주 (vSC20)는 버니 모스(Bernie Moss) 박사 (NIH)로부터 감사하게 제공받았다. 티미딘 키나제 결실된 WR 주 (vJS6) 및 TK-, VGF- 이중 결실된 WR 주 (vvDD)는 문헌[참조: Puhlmann et al . (2000) 및 McCart et al . (2001)]에 기술되어 있다. 반딧불이 루시퍼라제를 발현하는 WR 주는 게리 루커(Gary Luker) 박사 (Uni Michigan)로부터 감사하게 제공받았다.
백시니아 JX-963 주는, 이.콜라이 gpt 및 사람 GM-CSF 유전자를 (각각 p7.5 및 pSE/L 프로모터의 조절 하에) 함유하는 pSC65 플라스미드 버전을 WR의 vSC20 (VGF 결실된) 주의 티미딘 키나제 유전자 속에 재조합하여 작제하였다. X-Gal에서 바이러스를 증식시킨 후, 백색 플라크를 추가로 선별하여, 비-기능성 lacZ (lacZ는 vSC20의 VGF로부터 발현된다)를 갖는 바이러스를 생산하였다. TK 유전자 속으로의 정확한 삽입 및 lacZ 기능의 손실을 서열분석으로 확인하였고, GM-CSF 생산을 ELISA로 확인하였다.
루시퍼라제를 발현하는 vvDD는, p7.5 프로모터의 조절 하에 루시퍼라제를 갖는 pSC65 플라스미드 버전을 vSC20 속에 삽입하여 작제하였다. 생물발광을 IVIS 50 시스템[판매원: Xenogen, Alameda]을 사용하여 확인하였다.
사람 종양 세포주에는 A2780 (난소, ECACC로부터 입수함), A549 (폐, ECACC로부터 입수함), HCT 116, HT-29 및 SW620 (결장, ATCC로부터 입수함), HT-1080 (섬유육종, ATCC로부터 입수함), LNCaP (전립선, ATCC로부터 입수함), PANC-1 (췌장, ATCC로부터 입수함), MCF-7 (유방, ATCC로부터 입수함)이 포함된다. 비-형질전환된 세포에는 MRC-5 (폐 섬유아세포, ATCC로부터 입수함), Beas-2B (기관지 상피, 토니 레이드(Tony Reid)(UCSD)로부터 감사하게 제공받음), 및 1차 정상 세포 NHBE (정상 사람 기관지 상피) 및 SAEC (소기도 기관지 상피) (NHBE 및 SAEC는 Clonetics (Walkersville, MD)로부터 입수함)가 포함된다.
마우스 종양 세포주에는 CMT 64 (C57/B6 폐, Cancer Research, UK로부터 입수함), JC (BALB/c 유방, ATCC로부터 입수함), MC38 (C57/B6 결장, NIH로부터 입수함) 및 TIB-75 (BNL 1ME A.7R.1)(BALB/c 간, ATCC로부터 입수함)가 포함된다. H-Ras를 과발현하는 세포주 NIH 3T3 및 NIH 3T3은 리차드 마레(Richard Marais) (ICR, London)로부터 감사하게 제공받았다. 래빗 종양 세포주 VX2는 이미 기술되었다[참조: Kidd, 1940; Tjernberg, 1962; Chen et al ., 2004].
시험관내 복제 및 세포변성 효과 검정. 세포주를 6-웰 플레이트에 5 x 106 세포/웰로 접종하고 하룻밤 동안 둔다. 이어서, 바이러스를 1.0 플라크 형성 단위(PFU)/세포의 감염 다중도(MOI)로 첨가하여 2시간 동안 감염되게 한다. 감염 종료 시, 배지를 교환하고 플레이트를 48시간 동안 배양하고 나서, 세포를 배지 속에 긁어 수거한다. 세포를 3회 냉동 및 해동시켜 용해시키고 나서, 조(crude) 바이러스 용해물의 순차적 희석액을 BSC-1 세포에 첨가하여 바이러스를 적정하기 전에 초음파처리(sonication)한다. 플라크 검정을 이미 기술된 바와 같이 수행한다[참조: Earl et al ., 1998]. 아데노바이러스를 A549 세포에서 적정하였다[참조: Earl et al., 1998]. 연구는 통상적으로 3중으로 수행한다.
바이러스의 세포변성 효과(CPE)를 평가하기 위하여, 세포를 96-웰 플레이트에 1000 세포/웰로 접종하여 하룻밤 동안 부착되게 하였다. 이어서, 검사할 바이러스의 순차적 희석액을 플레이트에 3중으로 첨가하고 (MOI의 범위는 100 내지 0.001), 플레이트를 추가로 72시간 동안 배양하였다. 이후, 배지를 혈청이 없는 배지로 교환하고 MTS[판매원: Promega]를 플레이트에 첨가하였다. 2 내지 4시간 배양한 후, 450nm에서의 흡광도를 ELISA 플레이트 판독기에서 판독하였다. 세포변성 효과는, 세포만을 함유하는 미처리 웰 (100% 생존) 및 무세포 웰 (0% 생존)과 비교하여 검사 세포의 생존성의 감소로서 측정하였다. 결과는 50%의 세포층이 생존했을 때의 MOI (유효 농도 50%, EC50)로서 표현하였다.
마우스 동계( syngeneic ) 및 이종이식( xenograft ) 종양 모델 연구. 면역적격(immunocompetent) 마우스에 피하로 동계 종양 세포 (1 x 106 세포/마우스)를 이식시켜, JC 및 TIB-75 세포를 BALB/c 마우스 속으로 이식하고, MC38 및 CMT64 세포를 C57/B6 마우스 속으로 이식한다. 특정한 사람 이종이식 모델은 SCID 마우스 (모든 마우스는 8 내지 10주령이고 성별이 매치된다) 속으로 피하로 이식된 1 x 107 HT29 세포를 포함한다. 일단 종양이 50 내지 100 mm3에 도달하면, 동물을 재편성하여 지시된 바와 같이 처리한다. 종양 크기를 캘리퍼(caliper) 측정으로 추적하였다.
루시퍼라제 발현 바이러스로 처리한 마우스를 IVIS 100 시스템[판매원: Xenogen, Alameda]을 사용하여 이미지화할 수 있다. 마우스에 루시페린 (30 mg/kg)을 복강내로 주사하고, 이미지화하기 전에 마취(2% 이소플루란)시킨다.
몇몇 마우스를 처리후 지시된 시간에 희생시켜, 바이러스 생체분포 또는 면역조직화학 연구를 위하여 기관을 회수한다. 바이러스 생체분포의 경우, 기술된 바와 같이 플라크 검정을 수행하기 전에 기관을 급속 냉동하여 분쇄한다. 면역조직화학 연구의 경우, 기관을 절편제작을 위한 파라핀 블록에 포매(embedding)시키기 전에 포르말린 중에 고정시킨다. 절편을 헤마톡실린 및 에오신 (H & E) 및 바이러스 피막 단백질 (아데노바이러스 처리된 동물에 대한 폴리클로날 항-백시니아 항체 또는 폴리클로날 항-헥손(hexon) 항체)로 염색한다.
래빗 모델. 뉴질랜드 흰색 래빗의 간 속으로의 VX2 종양의 이식 및 CT 및 초음파 스캔에 의한 종양 진행 및 폐로의 전이의 측정은 이미 기술되었다[참조: Paeng et al ., 2003].
세포독성 T-림프구 ( CTL ) 검정. 이는 지시된 바와 같이 처리한 래빗으로부터 수득한 표지된 말초 혈액 림프구(PBL)를 VX2 종양 세포와 혼합하여 수행한다. 4시간 후, 세포 아폽토시스를 프로피디움 요오다이드 염색 및 유세포 분석법(flow cytometry)으로 측정하였다.
중화 항체 검정. 항-백시니아 중화 항체의 생산은 처리후 래빗으로부터 수득한 혈장 중에서 측정한다. 혈장의 희석액을, A2780 세포를 함유하는 96-웰 플레이트에 첨가하기 전에 1000 PFU의 백시니아와 하룻밤 동안 혼합시킨다. 72시간 후에, 세포 생존성을 MTS 검정으로 측정한다. 바이러스 중화는 바이러스 불활성화를 막는데 필요한 혈장의 희석으로서 측정한다.
통계 분석. 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 곡선을 일반 윌콕슨 검정(Generalized Wilcoxin test)을 사용하여 비교한다. 종양 반응률 및 무전이(metastasis-free) 비는 통상적으로 피셔의 정확 검정(Fisher's exact test)으로 비교한다.
실시예 2: 래트 종양 모델
래트 (Sprague-Dawley, 수컷)를 8주 동안 음료수 중에 발암물질 (N-니트로소모폴린, NNM) (175 mg/L)에 노출시켜, 이 기간 동안 간경화가 발생하고 나서, 평균적으로 16 내지 20주에 간에서 원위치(in situ) 종양 (간세포 암종 또는 담관암종)이 발생하였다 [이미 문헌(참조: Oh et al ., 2002)에 기술된 모델]. 종양 검출 및 평가는 초음파 이미지화를 사용하여 숙련된 초음파기사(ultrasonographer)가 수행하였다. 종양 크기는 처리 개시 직전에 기준선(baseline)에서 직경이 대략 0.75 내지 1.5cm였고; 종양 용적은 기준선에서 대조군과 처리 그룹 간에 유의적인 차이가 없었다 (예상 평균 용적은 400 내지 500 mm3이었다). 대조군 동물 (n = 17)은 어떠한 처리도 받지 않았고, 처리한 동물 (n = 6)은 합성 초기-후기 프로모터로부터 사람 GM-CSF를 발현하는 폭스바이러스 (와이어스 주; 티미딘 키나제 유전자 결실이 존재함) [문헌(참조: Mastrangelo et al ., 1999)에 기술된 바이러스 작제물]로 정맥내 주사를 (꼬리 정맥을 통해) 투여받았다. 바이러스를 0.75ml의 총 용적 중에 108 플라크 형성 단위 [문헌(참조: Earl et al ., 1998)에서와 같이 적정함]의 용량 (목적하는 용적까지 10mM Tris와 혼합된 바이러스 현탁액)으로 꼬리 정맥으로 정맥내로 60초에 걸쳐 투여하였다. 처리를 2주 마다 반복하여 총 3회 투여하였다 (1, 15 및 29일).
처리 개시 후 10주 동안, 대조군 종양은 크기가 평균 약 3000 mm3 (표준오차 500)에 도달할 때까지 상당히 증가하였다 (도 1). 대조군 동물은 이 시기에 종양 진행으로 인해 윤리적인 이유로 희생시켜야할 필요가 있었다. 모든 종양은 크기가 상당히 증가하였다. 대조적으로, 처리한 6마리 중 5마리에서는 종양이 (초음파에 의한 검출 한계 미만으로) 완전히 퇴행하였다. 처리 그룹의 평균 종양 용적은 대략 50 mm3이었다 (표준오차 < 10; p < 0.01 대 대조군).
실시예 3: 래빗 VX2 종양 모델
연구를 VX2 래빗 암종 모델에서 수행하였다[참조: Paeng et al ., 2003]. 사람 GM-CSF는 이미 래빗에서 (마우스와 대조적으로) 상당한 생물학적 활성을 갖는 것으로 증명되었기 때문에, 래빗을 종으로서 선택하였다. VX2 종양을 뉴질랜드 흰색 래빗의 근육에서 성장시키고, 1 내지 2 mm3의 종양 단편으로부터의 세포를 분리하여, 0.1ml의 생리 식염수 중에 재현탁시키고, 간막(liver capsule) 밑에 주사하여 (21 게이지(gauge) 바늘; 주사 부위를 쌈지 봉합사(purse-string tie)가 있는 외과용 패치로 덮음), 1차 종양이 형성될 때까지 (평균 직경 1.5 내지 2.0cm; 예상 용적 2 내지 4cm3) 14일 동안 성장하게 하였다. VX2 세포는 표준 버스트(burst) 검정에서 생체외에서 백시니아 폭스바이러스에 의해 감염될 수 있는 것으로 증명되었다. 종양 크기를 시간에 걸쳐 CT 스캐닝 및 초음파로 모니터하였다. 이후 7주에 걸쳐, 대조군(미처리) 동물 (n = 18)은 간에서 종양 진행이 발생하였고, 예상 평균 종양 용적은 대략 100cm3 (표준오차는 대략 20)에 도달하였다. 또한, 많은 종양 전이가 진행되었고, 시간이 지나면서 폐 및 간에서 검출가능하게 되었다 (도 2A 내지 2B). 7주까지, 대조군 동물은 모두 검출가능한 전이가 있었고, 폐 전이의 평균 수는 17 (표준오차 2.3)이었다. 이러한 대조군 동물의 중앙 생존기간은 (처리된 동물에서 처리 개시 후) 55일이었고, 모두 80일 이내에 사망하였다.
첫번째 실험에서, 처리된 동물 (n = 3)은 합성 초기-후기 프로모터로부터 사람 GM-CSF를 발현하는 폭스바이러스 (와이어스 주; 티미딘 키나제 유전자 결실이 존재함) [문헌(참조: Mastrangelo et al ., 1999)에 기술된 바이러스 작제물]로 단일 정맥내 주사를 (꼬리 정맥을 통해) 투여받았다. 바이러스를 7ml의 총 용적 중에 109 플라크 형성 단위 [문헌(참조: Earl et al ., 1998)에서와 같이 적정함]의 용량 (목적하는 용적까지 10mM Tris와 혼합된 바이러스 현탁액)으로 귀 정맥으로 정맥내로 60초에 걸쳐 투여하였다. 7주까지, 대조군과 대조적으로, 처리된 동물은 CT 스캐닝으로 검출가능한 폐 전이가 없었다 (도 2A 내지 2B). 또한, 생존기간이 상당히 증가하였다. 처리 개시 후 110일까지, 중앙 생존기간에 도달하지 않았고, 대략 70%가 여전히 살아있었다.
두번째 실험에서, 처리된 동물 (그룹 당 n = 6)은 합성 초기-후기 프로모터로부터 사람 GM-CSF를 발현하는 폭스바이러스 (와이어스 주; 티미딘 키나제 유전자 결실이 존재함) [본원에 참조로서 인용된 문헌(참조: Mastrangelo et al ., 1999)에 기술된 바이러스 작제물]인 JX-594, 티미딘 키나제 및 백시니아 성장 인자 유전자에 결실이 있는 백시니아 WR 주인 vvDD [문헌(참조: McCart et al ., 1999)에 기술된 vvDD], 또는 티미딘 키나제 및 백시니아 성장 인자 유전자에 결실이 있고 합성 초기-후기 프로모터로부터 사람 GM-CSF를 발현하는 백시니아 WR 주인 JX-963으로 정맥내 주사를 (꼬리 정맥을 통해) 1주일 간격으로 3회 투여받았다. 바이러스를 7ml의 총 용적 중에 108 플라크 형성 단위 [문헌(참조: Earl et al ., 1998)에서와 같이 적정함]의 용량 (목적하는 용적까지 10mM Tris와 혼합된 바이러스 현탁액)으로 귀 정맥으로 정맥내로 60초에 걸쳐 투여하였다. 7주까지, 대조군과 대조적으로, JX-963 처리한 동물은 CT 스캐닝으로 검출가능한 폐 전이가 없었다 (p<0.01 대 대조군) (도 4). JX-594 처리된 동물은 평균 8 (표준오차 2)개의 폐 종양이 있었다 (p<0.05 대 대조군). vvDD 처리된 동물은 평균 5 (표준오차 2)개의 폐 종양이 있었다 (p<0.05 대 대조군). 중요하게, JX-963 및 vvDD는 또한 상기 용량에서 JX-594와 대조적으로, 간에서 1차 종양 성장에 대해 상당한 효능이 있었고(도 3), JX-963은 상기 동물의 생존기간을 극적으로 증가시켰다 (도 5).
GM-CSF를 발현하는 바이러스인 JX-963은 GM-CSF를 발현하지 않는 대조군 vvDD보다 1차 종양 및 폐 전이에 대해 상당히 우수한 효능이 있었다; 2) GM-CSF를 발현하는 바이러스인 JX-963은 (JX-594에 존재하지 않는 vgf 유전자의 추가적인 결실에도 불구하고) GM-CSF를 발현하는 와이어스 주 대조군보다 1차 종양 및 폐 전이에 대해 상당히 우수한 효능이 있었다. 그러므로, 사람 GM-CSF를 발현하는 백시니아를 사용한 정맥내 투여는 GM-CSF가 없는 동일한 백시니아보다 효능이 상당히 우수하였고, 사람 GM-CSF를 발현하는 WR 주 결실 돌연변이체의 혈관내 투여는 GM-CSF를 발현하는 와이어스 주 (표준 백시니아 주) 결실 돌연변이체보다 상당히 우수하였다.
실시예 4: JX -963을 사용한 전신적 암 효능
표적화 요법은 암 치료에 대하여 매우 유망하지만, 표적 분자의 돌연변이 및/또는 경로 중복성을 통한 종양 회피(tumor escape)를 통해 내성이 종종 발생하므로 신규 약제가 여전히 필요하다. 종양 용해 바이러스는, 본래 또는 유전자 조작을 통해, 복제가 악성 세포 종류에 한정된 바이러스이다[참조: Thorne et al ., 2005]. 선택적 종양내 복제는 바이러스 증식, 유일한 아폽토시스-독립적 기전(종양 용해)에 의한 감염된 암세포의 사멸, 및 다른 종양 세포로의 바이러스의 확산을 유도한다. 그러므로, 바이러스치료제는 난치성 암을 효과적으로 치료할 수 있는 가능성이 있고, 임상 개념증명(proof-of-concept)이 국소 또는 국부 투여로 다수의 종양 용해 바이러스에 대해 달성되었다[참조: Parato et al ., 2005]. 하지만, 종양 용해 바이러스가 환자 생존에 큰 영향을 주기 위해서는, 전신적 효능 및 정맥내 전달이 필요할 것이다.
그러므로, 본 발명자는 단계적 설계 및 개발 전략에 착수하여 보다 효과적인 전신적 약제를 생성시켰다. 우선, 본 발명자는 전신적 파종, 및 보체 및 항체에 의한 제거에 대한 내성에 대해 진화된 바이러스 종으로서 백시니아와 같은 폭스바이러스를 확인하였다[참조: Smith et al ., 1997; Buller and Palumbo, 1991]. 백시니아는 불활성화 없이 혈액 중에서 운반되게 하는 명확한 기전을 갖고 있고, 조직 내에서 신속하게 확산될 수 있으며, 또한 천연두 근절 운동 동안에 오랫동안 인간에 의해 사용된 역사를 갖고 있다. 백신접종 프로그램 동안에 사용된 다양한 백시니아 바이러스 및 일부 관련된 바이러스주를 정상 (NHBE) 및 종양 (A2780) 세포에서 복제하는 능력에 대해 스크리닝하였다. 모든 백시니아 주는 정상 세포에서보다 종양 세포주에서 높은 수준으로 복제되었지만 (도 6A), 치료 지수 (종양 대 정상 세포 복제 비)는 바이러스주 간에 차이가 있었다. 실험실에서 광범위하게 사용된 바이러스주 (예: 웨스턴 리저브 (WR))는 모 백신 주 (와이어스)보다 시험관내에서 본래의 높은 종양 선택성을 보이는 경향이 있었다. 이는 야생형 백시니아 주가 정상 세포와 비교하여 종양 세포주에서 본래의 우수한 복제를 보이는 것으로 최초로 밝혀진 것이다. 하지만, 아데노바이러스 혈청형 5 (Ad5) (임상에서 대다수의 종양 용해 바이러스에 대한 골격)는 이러한 선택성을 보이지 않았으므로, 이는 모든 바이러스에 대해 사실인 것은 아니다 (도 10A).
종양 용해 약제를 위한 다른 바람직한 특성은 신속한 종양내 확산이다[참조: Wein et al ., 2003]. 이는 짧은 복제 주기 및 감염된 세포로부터의 바이러스의 초기 방출을 통해 달성될 수 있다. 그러므로, 종양 세포를 파괴하는 백시니아 WR 주의 능력을 감염 후 초기 시점(72시간)에 검사하여, Ad5 및 종양 용해 아데노바이러스 dl1520 주(ONYX-015)와 비교하였다[참조: Heise et al ., 1997] (도 6B). WR은 Ad5 및 dl1520과 비교하여 이 시기에 종양 세포에서 최대 5 log의 증가된 사멸 가능성 뿐만 아니라, 두 아데노바이러스 주보다 높은 종양 선택성을 보였다.
현재까지 검사된 대부분의 종양 용해 바이러스의 주요 한계는, 1x109 플라크 형성 단위(PFU)의 Ad5를 마우스에서 피하 종양 모델에 정맥내로 전달한 경우 보여지는 바와 같이, 전신적 전달 후 효율적으로 종양을 감염시키지 못하는 것이다 (도 6C 및 도 10B); 이는 70kg의 사람에서 3.5 x 1012 PFU의 용량과 동등하고, 환자에게 주어진 어떤 용량보다도 높다. 바이러스가 거의 또는 전혀 복제되지 않는 것이 종양에서 명백하였다 (바이러스 전달 48 및 72시간 후 바이러스 피막 단백질에 대해 면역조직화학 염색으로 검출된 바와 같이). 하지만, 백시니아 WR 주는 이러한 동일한 모델에서 효과적으로 종양으로 이동하여 이를 감염시킬 수 있었고, 최대 50%의 종양 세포가 처리 48시간 이내에 양성으로 염색되었다. 또한, 백시니아는 면역 반응이 이 시기에 개시되었을 것이라는 사실에도 불구하고, 종양에서 10일 이상 동안 살아남을 수 있었다 (도 10B).
안전성을 최대화시키기 위하여, 특히 면역결핍 암 환자에서 정맥내 투여의 경우, 약독화 및 종양-표적화 유전자 결실을 바이러스 속에 도입시켰다. 본 발명자는 백시니아 티미딘 키나제(TK) 유전자 속에 삽입을 갖는 바이러스 유전자 및 TK 및 바이러스 성장 인자(VGF) 이중 결실을 갖는 바이러스 유전자의 우선적인 종양 발현을 이미 기술하였다[참조: Puhlmann et al ., 1999; McCart et al ., 2001]. 이러한 결실의 표적화 기전은 앞서 증명되지 않았지만, 근거는 바이러스 복제 및 종양 용해를 E2F 수준이 상승된 암세포에 한정시키는 것 [E2F는 세포 티미딘 키나제 유전자 산물의 생산을 유도하기 때문 (참조: Hengstschlager et al . 1994)] 및 상피 성장 인자(EGF) 수용체 경로의 활성화 [VGF에 의한 상기 경로의 활성화는 효율적인 바이러스 복제에 필요하기 때문 (참조: Andrade et al ., 2004)]였다. 본원에서는, TK 및 VGF 이중 결실된 바이러스(vvDD)가 상이한 기원의 광범위한 종양 세포를 파괴하는 우수한 능력을 보였다는 것을 밝혔다 (도 7). 또한, 백시니아 TK 또는 VGF 유전자 내의 단일 결실은 비-증식성 비-형질전환된 사람 세포주에서 복제하는 백시니아의 능력을 약화시켰고, 이중 결실된 바이러스 (vvDD)는 더욱 약화되었다는 것이 밝혀졌다 (도 11). 상기 모든 바이러스주는 사람 종양 세포에서 복제하는 능력이 약화되지 않았다.
비-증식성, 비-형질전환된 세포에서 복제하는 VGF-결실된 바이러스의 능력의 차단은 활성화된 H-ras를 발현하는 세포에서 극복될 수 있다는 것이 추가로 밝혀졌다 (도 8A). H-ras 활성화는 WR의 복제도 증가시켰다는 것 (p=0.0094)과, VGF 결실은 H-ras 활성화된 세포에서 바이러스 복제를 억제시키지 않았지만, TK 결실은 억제시켰다는 것이 밝혀졌다 (p=0.016). 이는 서서히 증식하는 세포 또는 비-증식성 세포도 EGF-R/Ras/MAP 키나제 시그날전달 경로에 돌연변이를 함유하는 경우 표적화될 수 있으므로, vvDD 내의 유전자 결실에 의해 도입된 종양 선택성은 증식성 세포에 대한 단순한 우선성 이상이라는 것을 나타낸다.
이중 결실된 백시니아(vvDD)가 정상적인 증식성 세포 (예: 장 상피, 골수 또는 난소 세포)를 표적화하여 독성을 일으킬 수 있는지를 결정하기 위하여, 생체내 바이러스 유전자 발현을 비-침습성 생물발광 이미지화로 연구하였고 (도 8B), 바이러스 생물분포를 사후에 검사하였다 (도 12). 루시퍼라제를 발현하는 1x107 PFU의 WR 또는 vvDD의 IV 전달 후 생물발광 이미지화는, 두 바이러스가 유사한 초기 감염 및 바이러스 유전자 발현 패턴 (예: 비장, 폐, 간 및 종양)을 보인다는 것을 밝혔다 (도 8B). 하지만, vvDD로부터의 생물발광 시그날은 면역결핍 마우스에서도 종양 이외의 대부분의 기관으로부터 빠르게 제거되었지만, WR은 표적 기관에서 계속 복제되어 다른 조직 (예: 골수, 피부 및 뇌)으로 확산되었다 (도 8B 및 8C). vvDD는 종양 외부에 몇몇 감염 지점을 생성하였지만, 이들은 일시적이고 늦게 출현하여, 복제가 부재하는 2차 확산을 나타내었다 (데이터 제시하지 않음). 1x109 PFU의 vvDD로 정맥내 처리한 마우스의 조직으로부터의 감염성 바이러스 단위의 회수는, 종양에서 처리 후 8일까지 바이러스 역가의 증가를 보였고, 어떤 다른 기관보다도 조직 1mg 당 바이러스 카피가 1,000 배 이상이었지만, 모든 정상 조직은 검출 한계 미만이거나 바이러스 역가의 감소를 보였다 (도 12).
이어서, vvDD의 항종양 효과를 면역적격 마우스 모델에서 분석하였다. vvDD는 정맥내로 전달된 경우, 정맥내로 전달된 와이어스 TK 결실된 백시니아 주 (임상 시험에서 가장 통상적인 백시니아 주, 일반적으로 백신으로서 사용됨)보다 상당히 높은 항종양 효과가 있었다 (도 13). 추가적인 연구는, 1x109 PFU의 vvDD는 사람 종양 이종이식편(xenograft)을 보유하는 면역결핍 마우스 및 동계(syngeneic) 종양을 갖는 면역적격 마우스에 전신 또는 종양내 주사로 전달된 경우, 상당한 항종양 효과를 발휘할 수 있다는 것을 보였다 (도 13).
vvDD의 항종양 가능성을 증가시키고, 정맥내 투여시에 혈관형성되지 않은 미시적 종양 침착의 성장을 억제하기 위하여, 사이토카인 GM-CSF를 (합성 E/L 프로모터의 조절 하에) TK 유전자 부위 속에 삽입하였다; 이 바이러스를 JX-963이라고 명명하였다. 사람 GM-CSF는 설치류에서는 활성이 없지만, 래빗에서는 활성이므로[참조: Cody et al ., 2005], 그리고 반복적으로 전이되는 매우 큰 1차 종양에 대한 활성을 평가하기 위하여, JX-963을 1차 (VX2) 간 종양 및 폐 전이가 있는 래빗 모델에서 사용하였다[참조: Kim et al ., 2006]. 마우스 모델에서와 같이, 1x109 PFU의 정맥내 vvDD는 상당한 항종양 효과가 있었다 (도 9A). vvDD 바이러스는 또한 미시적 폐 전이의 성장을 억제시킬 수 있었다. 공동 GM-CSF 발현으로 인한 추가적인 효능을 평가하기 위하여, JX-963을 vvDD와 직접 비교하였다. JX-963은 1차 종양에 대해 높은 효능을 보였고, 폐 전이의 성장을 완전히 차단하였다. GM-CSF를 JX-963 처리한 마우스의 혈장에서 ELISA로 검출하였다 (데이터 제시하지 않음). 직접적인 종양 용해 효과 외에도, JX-963은 또한 VX2 종양 세포에 대한 CTL 반응을 증가시켜 종양에 대해 동물을 교차보호하는 것으로 밝혀졌다 (도 9B).
백시니아 바이러스를 항종양제로 사용하는데 있어서 한가지 문제는, 종양으로의 전신적 전달이 비-투여(naive) 개체에서 초기에는 가능하더라도, 바이러스에 대한 이전의 노출에 의한 면역 반응이 이후의 처리의 효능을 억제시킬 수 있다는 것이다. 강한 항바이러스 항체 반응은, 검사한 래빗에서 초기 감염의 3주 이내에 증가하였다 (도 14). 중화 항체 형성 후 반복 투여의 실행가능성을 연구하기 위하여, 초기에는 처리에 대해 반응하였지만 치료로부터 4주 후에 종양이 진행된 4마리의 래빗을 재처리하였다. 초기 처리 후 6주에 정맥내로 전달한 1x109 PFU의 JX-963은 처리한 4마리의 동물 중 3마리에서 1차 종양 크기를 감소시켰다 (도 9C).
그러므로, 조혈 시스템을 통해 확산되도록 진화되어온 백시니아 바이러스를 선택하여, 종양 선택적 복제에 대해 주를 스크리닝함으로써, 본 발명자는 신속한 종양 용해 효과와 함께 전신적 종양 전달이 가능한 바이러스를 찾을 수 있었다. 이러한 바이러스의 안전성을 향상시키기 위하여, 치료 지수를 증가시킬 수 있는 다수의 결실을 도입시켜, 이들의 작용 기전을 기술하였고 이들의 생체분포를 생체내에서 검사하였다. 전신적 전달 후에 큰 1차 종양에 대한 극적인 치료 효과가 증명되었다. 마지막으로, 모든 종양 세포가 감염될 것 같지 않으므로, 전신적 바이러스 전달 후에도, GM-CSF를 상기 바이러스 골격으로부터 발현시켰다. GM-CSF의 부가는 1차 종양에 대해 상기 바이러스의 유효성을 증가시키고, 미세전이(micrometastasis)의 성장을 예방하고, 항종양 CTL 반응을 일으키는 것으로 밝혀졌다. 이는 상기 JX-963 바이러스는 종양으로의 전신적 전달이 가능하고, 정상적인 기관은 남겨두면서 신속하고 효율적으로 종양 조직을 파괴하며, 동시에 종양 내에서 원위치에서 생성된 종양 항원을 인식할 수 있는 면역 반응을 유도한다는 것을 나타낸다. 반복 투여는 직접적인 종양 용해에 의해 또는 항종양 면역 반응을 상승시켜, 추가적인 항종양 효과를 일으키는 것으로 추가로 밝혀졌다. 그러므로, JX-963은 다양한 종양을 효과적으로 치료하는 가능성을 갖는다.
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본원에서 공개되고 청구된 모든 조성물 및 방법은 본 명세서에 비추어 과도한 실험 없이 제조되고 수행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 바람직한 양태에 관하여 기술되었지만, 본 발명의 개념, 취지 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 본원에서 기술된 조성물 및/또는 방법 및 방법의 단계 또는 단계의 순서를 변화시킬 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 보다 구체적으로는, 화학적으로 그리고 생리학적으로 관련된 특정한 약제로 본원에서 기술된 약제를 대체할 수 있고, 동일하거나 유사한 결과가 달성될 것이라는 점은 명백할 것이다. 당업자에게 명백한 모든 이러한 유사한 대체 및 변형은 첨부된 청구항에 의해 정의되는 본 발명의 취지, 범위 및 개념 내에 있는 것으로 간주된다.
IX . 참고문헌
다음의 참고문헌은, 본원에서 제시된 것을 보충하는 대표적인 방법 또는 다른 상세사항을 제공하는 정도까지, 본원에 참조로서 구체적으로 인용된다.
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미국특허 제5,981,274호
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Claims (29)

  1. 기능성 티미딘 키나제 유전자의 결실을 갖고, 사람 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)를 암호화하는 핵산의 발현을 지시하는 프로모터와 발현 영역을 갖는 109 내지 1010 pfu의 복제가능 와이어스(Wyeth) 또는 웨스턴 리저브(Western Reserve; WR) 주(strain) 백시니아 바이러스를 포함하고, 복수회의(multiple) 혈관내 투여용으로 제형화된, 사람 대상체에서 전이된 암(metastasized cancer)을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 정맥내 투여용으로 제형화된, 약제학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 동맥내 투여용으로 제형화된, 약제학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 적어도 티미딘 키나제 유전자가 결실된, 약제학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 백시니아 바이러스 성장 인자에 돌연변이를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 프로모터가 백시니아 바이러스 프로모터인, 약제학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 프로모터가 합성 프로모터인, 약제학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 프로모터가 적어도 감염 초기 동안에 전사를 지시하는 것인, 약제학적 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 프로모터가 적어도 감염 후기 동안에 전사를 지시하는 것인, 약제학적 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 2차 치료가 1차 치료의 3주 이내에 실시되는, 약제학적 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 2차 치료가 1차 치료의 2주 이내에 실시되는, 약제학적 조성물.
  12. 제10항에 있어서, 동일한 용량(dose)이 투여되도록 제형화된, 약제학적 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 주사에 의해 혈관내로 투여되도록 제형화된, 약제학적 조성물.
  14. 제1항에 있어서, 정맥내 점적(intravenous drip) 또는 일시 주사(bolus)를 사용하여 혈관내로 투여되도록 제형화된, 약제학적 조성물.
  15. 제1항에 있어서, 펌프를 사용하여 혈관내로 투여되도록 제형화된, 약제학적 조성물.
  16. 제1항에 있어서, 암이 폐암, 결장직장암, 유방암, 전립선암, 췌장암, 간세포암, 신장암, 백혈병, 림프종, 골수종 또는 흑색종인, 약제학적 조성물.
  17. 제1항에 있어서, 암이 간세포, 결장직장 또는 신장 세포 암인, 약제학적 조성물.
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