ES2848650T3 - Terapia combinada contra el cáncer con virus vaccinia oncolítico - Google Patents

Abstract

El inhibidor de tirosina quinasa antiangiogénico sunitinib para su uso en un método para tratar el cáncer metastásico en un sujeto, el sujeto se sometió previamente a una terapia con virus vaccinia, en donde el virus vaccinia es un virus vaccinia que expresa GM-CSF y carece de un gen de timidina quinasa funcional, en donde el inhibidor de tirosina quinasa antiangiogénico se administra como máximo 13 semanas después de la terapia con virus vaccinia, y en donde el virus vaccinia se administró intravascularmente, o tanto intravascularmente como intratumoralmente.

Description

DESCRIPCIÓN

Terapia combinada contra el cáncer con virus vaccinia oncolítico

Antecedentes de la invención

I. Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a los campos de la oncología y la virología. Más particularmente, se refiere a poxvirus, que incluyen específicamente los virus vaccinia oncolíticos adecuados para el tratamiento del cáncer y su uso en combinación con agentes antiangiogénicos.

II. Antecedentes

La homeostasis tisular normal es un proceso altamente regulado de proliferación y muerte celular. Un desequilibrio de la proliferación celular o la muerte celular puede convertirse en un estado canceroso (Solyanik y otros, 1995; Stokke y otros, 1997; Mumby y Walter, 1991; Natoli y otros, 1998; Magi-Galluzzi y otros, 1998). Por ejemplo, el cáncer de cuello uterino, riñón, pulmón, páncreas, colorrectal y cerebro son solo algunos ejemplos de los muchos cánceres que pueden resultar (Erlandsson, 1998; Kolmel, 1998; Mangray y King, 1998; Mougin y otros, 1998). De hecho, la ocurrencia de cáncer es tan alta que solo en los Estados Unidos se atribuyen al cáncer más de 500000 muertes por año.

Actualmente, existen pocas opciones efectivas para el tratamiento de muchos tipos comunes de cáncer. El curso del tratamiento para un individuo determinado depende del diagnóstico, la etapa hasta la que se desarrolló la enfermedad y factores como la edad, sexo y salud general del paciente. Las opciones más convencionales de tratamiento del cáncer son la cirugía, la radioterapia y la quimioterapia. La cirugía desempeña una función central en el diagnóstico y tratamiento del cáncer. Típicamente, se requiere un abordaje quirúrgico para la biopsia y para extirpar el crecimiento canceroso. Sin embargo, si el cáncer hace metástasis y se extiende, es poco probable que la cirugía resulte en una cura y se debe tomar un enfoque alternativo.

Los virus oncolíticos de replicación selectiva son prometedores para el tratamiento del cáncer (Kirn y otros, 2001). Estos virus pueden causar la muerte de las células tumorales a través de efectos oncolíticos directos dependientes de la replicación y/o dependientes de la expresión génica viral (Kirn y otros, 2001). En adición, los virus pueden potenciar la inducción de la inmunidad antitumoral mediada por células en el huésped (Todo y otros, 2001; Sinkovics y otros, 2000). Estos virus también pueden manipularse para expresar transgenes terapéuticos dentro del tumor para mejorar la eficacia antitumoral (Hermiston, 2000). Sin embargo, también existen limitaciones importantes para este enfoque terapéutico. El desarrollo de vectores de virus vaccinia Ankara (MVA) modificados recombinantes que expresan el antígeno tumoral humano 5T4 pero no GM-CSF se probó para determinar su potencial como vacuna contra el cáncer, ya sea solo o en combinación con otras terapias, que incluyen la quimioterapia estándar f. e. o sunitinib. La vacunación con MVA-5T4 es bien tolerada y provoca respuestas humorales y/o celulares específicas a 5T4 en la mayoría de los pacientes tratados. No se completó un estudio de terapia combinada con sunitinib debido a un exceso no significativo en el número de muertes. Los efectos diferenciales de las terapias de combinación sobre la evolución de una población de células T efectoras antitumorales se desconocen en gran medida (Tykodi y Thompson, 2008).

Por lo tanto, se necesitan más terapias adicionales para el tratamiento contra el cáncer. El uso de virus oncolíticos presenta un área potencial de desarrollo.

Resumen de la invención

Los estudios in vitro indican que el sorafenib e inhibidores de quinasas similares suprimen la efectividad del poxvirus, el virus vaccinia y en particular el JX-594 cuando se usan en combinación en líneas celulares cultivadas. Contrariamente a los hallazgos in vitro, los modelos preclínicos de eficacia demostraron que la combinación de sorafenib y JX-594 en realidad muestra una mejor eficacia que cualquier agente solo. Por tanto, varios aspectos de la invención se dirigen a la aplicación de estos hallazgos inesperados como terapia in vivo mediante el uso de una combinación de poxvirus, virus vaccinia, o virus JX-594 y un agente antiangiogénico, que es el inhibidor de quinasa sutent.

La invención se dirige al inhibidor de tirosina quinasa antiangiogénico sunitinib (SU11248 o Sutent) para su uso en un método de tratamiento de cáncer metastásico en un sujeto, el sujeto se sometió previamente a una terapia con virus vaccinia, en donde el virus vaccinia es un virus vaccinia que expresa GM-CSF y que carece de un gen de timidina quinasa funcional, en donde el inhibidor de tirosina quinasa antiangiogénico se administra como máximo 13 semanas después de la terapia con virus vaccinia, y en donde el virus vaccinia se administró intravascularmente, o tanto intravascularmente como intratumoralmente. En ciertos aspectos se determina que el tumor que se trata experimenta una revascularización. Se describe que el poxvirus es un virus vaccinia. De acuerdo con la invención, el virus vaccinia es un virus vaccinia que expresa GM-CSF. Además, el virus vaccinia carece de un gen funcional de timidina quinasa. En ciertos aspectos el virus vaccinia es el JA-594.

Ciertas modalidades se dirigen a potenciar la terapia antiangiogénica, particularmente aquellas para las que un paciente falló, desarrolló tolerancia, no responde o responde parcialmente. Como se usa en la presente descripción, los términos "potenciar", "potencia", "potenciar la terapia", "se potencia el efecto terapéutico" y "potenciar los efectos terapéuticos" se definen en la presente descripción como producir uno o más de los siguientes efectos fisiológicos: el aumento o potenciación de la actividad citotóxica de agentes terapéuticos mediante la actuación de una manera citotóxica aditiva o sinérgica con los agentes terapéuticos; sensibilizar las células cancerosas o un tumor a la actividad anticancerígena de agentes terapéuticos; y/o restaurar la eficacia antiangiogénica de una terapia o la sensibilidad de un tumor a la terapia. Se describen agentes antiangiogénicos como agentes terapéuticos para el tratamiento del cáncer. También se describen métodos para potenciar la terapia antiangiogénica que incluyen la administración de un poxvirus a un paciente que es insensible, desarrolló tolerancia o no responde suficientemente a la terapia antiangiogénica en una cantidad que potencia la eficacia terapéutica de la terapia antiangiogénica. De acuerdo con la invención, la terapia antiangiogénica es sutent. Se describe, además, que la terapia antiangiogénica es un inhibidor de quinasa o un compuesto similar. Los métodos de la invención también pueden incluir identificar a un paciente que sea resistente o no responda o que tenga una recurrencia del cáncer después de la terapia antiangiogénica. En ciertos aspectos se administra una cantidad sensibilizante de virus vaccinia, o virus JX-594, a un paciente que es resistente, tolerante, o insensible a la terapia antiangiogénica (sutent inhibidor de quinasa antiangiogénico). Una cantidad sensibilizante es una cantidad suficiente para que un tumor no muestre una respuesta terapéutica a un tratamiento -según lo determine un médico o científico - capaz de responder a la misma terapia o una terapia similar.

Los cánceres y tumores "resistentes a la terapia" se refieren a cánceres que se vuelven resistentes a las terapias antiangiogénicas contra el cáncer. Los cánceres "sensibles a la terapia" responden (los parámetros clínicos de respuesta son detectables o medibles, tales como reducción del crecimiento tumoral, necrosis tumoral, encogimiento del tumor, interrupción vascular del tumor y similares) a la terapia. Un experto en la técnica apreciará que algunos cánceres son sensibles a la terapia con agentes particulares, pero no a otros.

En ciertos aspectos el agente antiangiogénico es un inhibidor de quinasa. En otros aspectos el inhibidor de la quinasa inhibe la vía de la quinasa Raf. De acuerdo con la invención, el inhibidor de quinasas es sutent. Se describen, además, sorafenib o un inhibidor de quinasa antiangiogénico similar.

Ciertas modalidades se dirigen al uso en un método de tratamiento, que comprende, además, determinar si un tumor experimenta revascularización. En ciertos aspectos, la revascularización se determina mediante imágenes no invasivas del tumor, por ejemplo, imágenes por resonancia magnética (MRI). En ciertos aspectos, la imagen por resonancia magnética es una resonancia magnética con contraste dinámica (DCE-MRI).

En ciertos aspectos del uso en un método de tratamiento, el agente antiangiogénico se administra al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más semanas, que incluyen todos los valores e intervalos entre, después de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta o más administraciones de virus vaccinia.

Se describe que el tumor es un tumor cerebral, un tumor de cáncer de cabeza y cuello, un tumor de esófago, un tumor de piel, un tumor de pulmón, un tumor del timo, un tumor de estómago, un tumor de colon, un tumor de hígado, un tumor de ovario, un tumor uterino, tumor de vejiga, un tumor testicular, un tumor rectal, un tumor de mama, un tumor de riñón, o un tumor de páncreas. En un aspecto adicional el tumor es un carcinoma hepatocelular o un cáncer colorrectal.

De acuerdo con la invención, el uso en un método de tratamiento comprende administrar primero al sujeto el virus vaccinia, o la terapia viral con JX-594. De acuerdo con la invención, la terapia viral puede administrarse mediante inyección en una masa tumoral o mediante administración intravascular. En un aspecto particular el virus se inyecta en la vasculatura del tumor. En ciertos aspectos la terapia viral puede administrarse mediante múltiples modalidades, por ejemplo, intravascular e intratumoral, etc.

Ciertas modalidades se dirigen al uso en un método para tratar un tumor hepático o un tumor metastásico en el hígado u otro órgano de un paciente que comprende administrar sutent al tumor, en donde el tumor se trató previamente con un virus vaccinia o virus JX-594. Los métodos de la invención también pueden incluir determinar si el tumor experimenta reperfusión.

Ciertos aspectos se dirigen al uso en un método para tratar un tumor hepático, ya sea primario o metastásico (un tumor metastásico es un tumor que se origina en un órgano o tejido distal del lugar en el que se trata) que comprende administrar una cantidad de un virus vaccinia, o un virus JX-594, y administrar un agente antiangiogénico. En ciertos aspectos el agente antiangiogénico será un inhibidor de quinasa. En aspectos adicionales el inhibidor de quinasa es sutent.

Ciertas modalidades se dirigen al uso en un método para tratar un tumor hepático que comprende la administración de una cantidad efectiva de un virus vaccinia o un virus JX-594, en donde el tumor se evaluará en cuanto a la reperfusión y se determinará que es un candidato para la terapia sutent si el tumor sufre reperfusión.

Otros aspectos más se dirigen al uso en un método para tratar un paciente que tiene un tumor que comprende (a) evaluar un tumor que se trató con una terapia anticancerosa mediante formación de imágenes no invasivas del tumor para detectar la reperfusión; y (b) administrar una cantidad efectiva de agente antiangiogénico, sutent, a un tumor en el que se detecta o sospecha reperfusión. No se requieren imágenes para tratar un tumor con la combinación de JX-594 y un antiangiogénico tal como sutent.

JX-594 es un poxvirus oncolítico dirigido que se diseñó para replicarse selectivamente y destruir células cancerosas. La oncólisis directa más la expresión del factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) también estimulan la interrupción vascular tumoral en los tumores.

La invención se dirige al uso de un método que incluye la administración de un virus vaccinia deficiente en timidina quinasa. En ciertos aspectos, el método incluye administrar al sujeto un vector de virus vaccinia de replicación competente, que expresa GM-CSF y deficiente en TK (por ejemplo, JX-594) en una cantidad suficiente para inducir la oncólisis de las células en el tumor tratado u otros tumores distales del sitio de administración. La administración de virus vaccinia puede ir seguida de la administración de un agente antiangiogénico, tal como un inhibidor de tirosina quinasa antiangiogénico.

El inhibidor de tirosina quinasa de la presente invención es sunitinib (SU11248; Sutent®). Además, se describen las siguientes tirosina quinasas: SU5416, SU6668, vatalanib (PTK787/ZK222584), AEE788, ZD6474, ZD4190, AZD2171, GW786034, sorafenib (BAY 43-9006), CP-547,632, AG013736, YM-359445, gefitinib (Iressa®), erlotinib (Tarceva®), EKB-569, HKI-272, y CI-1033. Sorafenib (Nexavar, Bayer) es un fármaco aprobado para el tratamiento del cáncer de riñón primario (carcinoma de células renales avanzado) y del cáncer de hígado primario avanzado (carcinoma hepatocelular). El sorafenib es un inhibidor molecular pequeño de varias proteínas quinasas de tirosina. Sorafenib se dirige a la vía Raf/Mek/Erk (vía de las MAP quinasas). Por tanto, también se describen y contemplan otros inhibidores de quinasas que se dirigen a esta vía como útiles en combinación con JX-594.

En ciertos aspectos, al sujeto se administran al menos 1 x 107, 1 x 108, 2 x 108, 5 x 108, 1 x 1092 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010, 1 x 1011, 5 x 1011, 1 x 1012, 5 x 1012 o más partículas virales o unidades formadoras de placa (pfu), que incluyen los diversos valores e intervalos entre ellos. La dosis viral puede administrarse en 0,1, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 100, 500, 1000 o más mililitros, incluidos todos los valores e intervalos entre ellos. En un aspecto, la dosis es suficiente para generar un nivel detectable de GM-CSF en el suero del paciente, por ejemplo, al menos aproximadamente, como máximo aproximadamente o aproximadamente 2, 5, 10, 40, 50, 100, 200, 500, 1000, 5000, 10 000, 15000 a 20000 pg/mL, que incluyen todos los valores e intervalos entre ellos. Se contempla que una dosis única de virus se refiere a la cantidad administrada a un sujeto o un tumor durante un período de 0,1, 0,5, 1, 2, 5, 10, 15, 20 o 24 horas, que incluye todos los valores intermedios. La dosis puede distribuirse con el tiempo o mediante una inyección separada. Típicamente, se administran múltiples dosis a la misma región objetivo general, tal como en la proximidad de un tumor o, en el caso de la administración intravenosa, en un punto de entrada particular en el torrente sanguíneo o sistema linfático de un sujeto. En ciertos aspectos, la dosis viral se administra mediante un aparato de inyección que comprende una aguja que proporciona múltiples puertos en una sola aguja o múltiples puntas acopladas a una jeringa, o una combinación de estos. En un aspecto adicional, el vector de virus vaccinia se administra 2, 3, 4, 5, o más veces. En otro aspecto más, el virus vaccinia se administra durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más días o semanas.

En determinadas modalidades el sujeto es un ser humano. El sujeto puede padecer cáncer y/o un tumor. En determinadas modalidades el tumor puede ser no resecable antes del tratamiento y resecable después del tratamiento. En ciertos aspectos, el tumor se localiza en el hígado. También se describe que el tumor puede ser un tumor de cáncer de cerebro, un tumor de cáncer de cabeza y cuello, un tumor de cáncer de esófago, un tumor de cáncer de piel, un tumor de cáncer de pulmón, un tumor de cáncer del timo, un tumor de cáncer de estómago, un cáncer de colon tumor, un tumor de cáncer de hígado, un tumor de cáncer de ovario, un tumor de cáncer de útero, un tumor de cáncer de vejiga, un tumor de cáncer testicular, un tumor de cáncer de recto, un tumor de cáncer de mama, o un tumor de cáncer de páncreas. También se describe que el tumor es un tumor de vejiga. Se describe además que el tumor es melanoma. El tumor puede ser un tumor recurrente, primario, metastásico, y/o resistente a múltiples fármacos. En determinadas modalidades, el tumor es un tumor hepatocelular o un tumor metastatizado que se origina en otro tejido o ubicación. En ciertos aspectos el tumor está en el hígado.

En ciertos aspectos se monitoriza al paciente para detectar la reperfusión del tumor. En ciertos aspectos el seguimiento o la evaluación del paciente se realizará mediante formación de imágenes no invasivas o mínimamente invasivas, por ejemplo, formación de imágenes por resonancia magnética. Si se detecta o se sospecha reperfusión, puede administrarse a un paciente un agente antiangiogénico, a saber, un inhibidor de tirosina quinasa antiangiogénico. De acuerdo con la invención, el inhibidor de tirosina quinasa es sutent. El agente antiangiogénico puede administrarse al menos, como máximo, o aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, o más semanas después de la terapia con el virus vaccinia.

En ciertos aspectos, el método comprende además administrar al sujeto una terapia adicional contra el cáncer. La terapia adicional contra el cáncer puede ser quimioterapia, terapia biológica, radioterapia, inmunoterapia, terapia hormonal, terapia antivascular, crioterapia, terapia con toxinas y/o cirugía, lo que incluye combinaciones de estas. Aun en otro aspecto adicional, la cirugía incluye la quimioembolización transarterial (procedimiento TACE, ver Vogl y otros, European Radiology 16(6): 1393, 2005). El método puede comprender, además, una segunda administración del vector del virus vaccinia. Los métodos de la invención pueden comprender, además, evaluar la viabilidad de las células tumorales antes, durante, después del tratamiento o una combinación de estos. En determinadas modalidades el virus se administra por vía intravascular, intratumoral, o mediante una combinación de estas. En un aspecto adicional la administración es por inyección en una masa tumoral. Aun en otra modalidad adicional, la administración es por inyección en o en la región de la vasculatura del tumor. Aun en otra modalidad adicional, la administración se realiza mediante inyección en el sistema linfático o vascular próximo al tumor. En ciertos aspectos el método incluye la obtención de imágenes del tumor antes o durante la administración. En ciertos aspectos, un paciente está o no preinmunizado con una vacuna de virus vaccinia. En un aspecto adicional, el sujeto puede estar inmunodeprimido, ya sea naturalmente o clínicamente.

En ciertos aspectos, el virus se administra en una cantidad suficiente para inducir la muerte o necrosis celular o de células cancerosas en al menos el 15 % de las células en un tumor inyectado, en al menos el 20 % de las células en un tumor inyectado, en al menos el 30 % de células en un tumor inyectado, en al menos el 30 % de las células en un tumor inyectado, en al menos el 40 % de las células en un tumor inyectado, en al menos el 50 % de las células en un tumor inyectado, en al menos el 60 % de células en un tumor inyectado, en al menos el 70 % de las células en un tumor inyectado, en al menos el 80 % de las células en un tumor inyectado, o en al menos el 90 % de las células en un tumor inyectado.

En un aspecto adicional de la invención, los métodos pueden excluir el tratamiento previo de un sujeto con una vacuna de vaccinia, por ejemplo, un sujeto necesita no estar vacunado 1,2, 3, 4, 5 o más días, semanas, meses o años antes de administrar la terapia descrita en la presente descripción. En algunos aspectos, el cáncer o los tumores no inyectados se infectarán con el virus terapéutico, con lo que se trata así a un paciente tanto por administración local como por diseminación sistémica.

Otras modalidades de la invención se discuten a lo largo de esta solicitud. Cualquier modalidad discutida con respecto a un aspecto de la invención se aplica a otros aspectos de la invención; así como también viceversa. Las modalidades en la sección de ejemplos se entienden como modalidades de la invención que son aplicables a todos los aspectos de la invención.

Los términos "inhibición", "reducción" o "prevención" o cualquier variación de estos términos, cuando se usan en las reivindicaciones y/o la descripción, incluye cualquier disminución medible o inhibición completa para lograr un resultado deseado.

El uso de la palabra "un" o "una" cuando se usa junto con el término "que comprende" en las reivindicaciones y/o la descripción puede significar "uno," pero también es consistente con el significado de "uno o más," "al menos uno" y "uno o más de uno."

Se contempla que cualquier modalidad discutida en la presente descripción puede implementarse con respecto a cualquier método o composición de la invención, y viceversa. Además, las composiciones y estuches de la invención pueden usarse para lograr los métodos de la invención.

A lo largo de esta solicitud, el término "aproximadamente" se usa para indicar que un valor incluye la desviación estándar del error para el dispositivo o método que es empleado para determinar el valor.

El uso del término "o" en las reivindicaciones se usa para significar "y/o" a menos que se indique explícitamente que se refieren solo a alternativas o que las alternativas son mutuamente excluyentes, aunque la descripción respalda una definición que se refiere solo a alternativas e "y/o."

Como se usa en esta descripción y reivindicación(es), las palabras "que comprende" (y cualquier forma de comprender, tal como "comprenden" y "comprende"), "que tiene" (y cualquier forma de tener, tal como "tienen" y "tiene"), "que incluye" (y cualquier forma de incluir, como "incluye" e "incluyen") o "que contiene" (y cualquier forma de contener, como "contiene" y "contienen") son inclusivos o abiertos y no excluyen elementos o pasos del método adicionales, no enumerados.

Otros objetos, características y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. Debe entenderse, sin embargo, que la descripción detallada y los ejemplos específicos, si bien indican modalidades específicas de la invención, se dan únicamente a modo de ilustración.

Descripción de los dibujos

Los siguientes dibujos forman parte de la presente descripción y se incluyen para demostrar aún más ciertos aspectos de la presente invención. La invención puede entenderse mejor por referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de modalidades específicas presentadas en la presente descripción.

Figura 1 La replicación de JX-594 se inhibe en presencia de sorafenib in vitro. A diversas multiplicidades de infección (MOI), se adicionó JX-594 solo, o con sorafenib 10 pM a las células PLC/PRF/5. Después de 24 horas de infección, se recolectaron las células y los sobrenadantes para titulación mediante ensayo de placa en células Vero.

Figura 2 El sorafenib inhibe la replicación y formación de placas de JX-594. Se permitió que JX-594 infectara monocapas de células A2780 o HepG2 en ausencia o presencia de concentraciones crecientes de sorafenib. Los paneles superiores muestran experimentos que miden la formación de placas en la monocapa original y la producción de nuevas partículas virales (explosión). El panel inferior muestra que las concentraciones por debajo de los niveles citotóxicos son eficaces para inhibir la replicación viral. Los datos se expresan como porcentaje del control (sin JX-594, sin sorafenib). Las barras de error son la desviación estándar de las réplicas

Figura 3 La terapia combinada con sorafenib mejora la eficacia de JX-594 contra los tumores sólidos subcutáneos CT26. El panel superior muestra el diseño del estudio de un estudio preclínico de eficacia combinada en ratones con tumores subcutáneos CT2. Las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier se muestran para cada condición en el panel central. Los efectos sobre el volumen del tumor se muestran en el panel inferior.

Figura 4 La terapia combinada con sorafenib mejora la eficacia de JX-594 en el modelo de melanoma metastásico murino B16. El panel superior muestra el diseño del estudio de un estudio preclínico de eficacia combinada en el modelo de tumor murino B16. El panel inferior muestra el número promedio de metástasis pulmonares que se desarrollaron en cada grupo.

Figura 5 JX-594 seguido de sorafenib muestra una eficacia superior en el modelo de xenoinjerto de HCC. El gráfico describe el programa de tratamiento para cada grupo. El gráfico representa el tamaño promedio del tumor (mm3) para cada grupo a lo largo del tiempo (las barras son el error estándar de la media).

Figura 6 Efectos antivasculares de JX-594 seguido de sorafenib. Los paneles superiores muestran el diseño del estudio de un estudio preclínico de JX-594 seguido de Sorafenib en un modelo de xenoinjerto HepG2. El panel inferior muestra el número promedio de vasos en los tumores (se contaron tres campos de 200x). Las barras de error son el error estándar.

Figura 7 DCE-MRI de un paciente con HCC que muestra una interrupción vascular.

Figura 8 Escaneos de DCE-MRI que muestran respuesta en sitios distantes a los sitios de inyección intratumoral. Figura 9 Escaneos de DCE-MRI que muestran respuesta en sitios distantes a los sitios de inyección intratumoral. Figura 10 Ilustra un resumen de las respuestas de los pacientes, incluida la evaluación de Choi.

Figura 11 Imágenes de DCE-MRI del paciente 1702, 4 semanas y 8 semanas después del tratamiento con sorafenib (se muestran 3 planos diferentes, con imágenes de 4 y 8 semanas de cada plano).

Figura 12 Imágenes de DCE-MRI del paciente 1705 antes y 5 días después del tratamiento con JX-594: imágenes DCE-MRI antes y 4 semanas después del tratamiento con Sorafenib.

Figura 13 Imágenes de DCE-MRI del paciente 1712 antes y 4 semanas después del tratamiento con sorafenib. Figura 14 Paciente 11301 - evaluación de un paciente con metástasis hepática de carcinoma de células renales. FIGURA 15 Ilustración de la estabilización del tumor y la disminución del realce observado con JX-594 y sorafenib secuenciales (paciente 1705).

Figura 16 Ilustra la inducción de necrosis significativa en un paciente tratado con JX-594 seguido de sorafenib (paciente 1705).

Figura 17 Ilustra el volumen tumoral viable reducido después de la terapia secuencial con JX-594 y sorafenib. Figura 18 Los escaneos de DCE-MRI de un paciente con carcinoma hepatocelular y que se inscribió en un ensayo clínico de fase 2 de JX-594 mostraron pérdida de perfusión 10 días después del inicio del sorafenib en un tumor extrahepático no inyectado. Después de completar la administración de JX-594 (una dosis intravenosa y dos intratumorales), el paciente recibió sorafenib.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere al uso de un virus vaccinia que expresa GM-CSF para lograr un grado particular de oncólisis. En otra modalidad, puede usarse un virus vaccinia en un régimen de tratamiento que sea más efectivo para tratar tumores vascularizados o vascularizantes. Un régimen particular es el uso de un agente antiangiogénico después del tratamiento con un virus vaccinia oncolítico. En ciertos aspectos el régimen de tratamiento incluye la formación de imágenes del tumor para evaluar la reperfusión que resulta de la revascularización del tumor después de que el virus vaccinia induzca el colapso vascular del tumor. En ciertos aspectos, el virus vaccinia es el virus ^{j X - 5 9 4} (virus vaccinia que expresa GM-CSF, ^{T k} menos).

I. Regímenes de tratamiento y formulaciones farmacéuticas

En una modalidad de la presente invención, se contempla el uso en un método de tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa, tal como cáncer, mediante la administración de un virus vaccinia oncolítico, tal como JX-594.

Los métodos incluyen la administración de una cantidad efectiva de una composición farmacéutica que comprende un virus vaccinia oncolítico o un agente antiangiogénico. Una cantidad farmacéuticamente efectiva se define como la cantidad suficiente para inducir la oncólisis (la rotura o lisis de una célula cancerosa) y/o la inhibición de la vascularización o destrucción de la neovasculatura de los tumores. El término incluye la desaceleración, inhibición, o reducción del crecimiento o tamaño de un tumor e incluye la erradicación del tumor en ciertos casos. En ciertos aspectos una cantidad efectiva de virus vaccinia da como resultado la diseminación sistémica del virus terapéutico a los tumores, por ejemplo, la infección de tumores no inyectados.

A. Tratamientos combinados

Los compuestos y métodos de la presente invención pueden usarse en el contexto de enfermedades/afecciones hiperproliferativas, que incluyen el cáncer, y pueden usarse en un orden particular de administración con varios intervalos de tiempo entre la administración. Para aumentar la efectividad de un tratamiento con las composiciones de la presente invención, tales como un virus vaccinia que expresa GM-CSF, es deseable combinar estas composiciones con agentes antiangiogénicos y otros agentes efectivos en el tratamiento del cáncer. Por ejemplo, el tratamiento de un cáncer puede implementarse con compuestos terapéuticos de la presente invención en combinación con agentes antiangiogénicos.

Pueden emplearse varias combinaciones; por ejemplo, un poxvirus, tal como el virus vaccinia JX-594, es "A" y la terapia antiangiogénica secundaria es "B":

A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B

B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A

B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A

La administración de los vectores de poxvirus/vaccinia de la presente invención a un paciente seguirá los protocolos generales para la administración de esa terapia particular, al tener en cuenta la toxicidad, si la hay, del tratamiento de poxvirus. Después del tratamiento con virus vaccinia se administra un agente antiangiogénico para tratar efectivamente la neovascularización o reperfusión del tumor tratado con virus vaccinia. Se espera que los ciclos de tratamiento se repitan según sea necesario. También se contempla que puedan aplicarse diversas terapias estándar, así como la intervención quirúrgica, en combinación con la terapia para células tumorales o cáncer descrita.

Un agente "antiangiogénico" es capaz de afectar negativamente la angiogénesis en un tumor, por ejemplo, al matar células, inducir la apoptosis en las células, reducir la tasa de crecimiento de las células que participan en la angiogénesis y reducir efectivamente el suministro de sangre a un tumor o célula cancerosa. Los ejemplos de agentes antiangiogénicos incluyen, pero no se limitan a, sorafenib, sutent y compuestos similares, ácido retinoide y derivados de este, 2-metoxiestradiol, ANGIOSTATIN™, ENDOSTATIN™, suramina, escualamina, inhibidor tisular de metaloproteinasa-1, inhibidor tisular de metaloproteinasa-2, inhibidor del activador del plasminógeno-1, inhibidor del activador del plasminógeno-2, inhibidor derivado del cartílago, paclitaxel, factor plaquetario 4, sulfato de protamina (clupeína), derivados de quitina sulfatados (preparados a partir de conchas de cangrejo reina), complejo de peptidoglicano polisacárido sulfatado (sp-pg), estaurosporina, moduladores del metabolismo de la matriz, que incluyen, por ejemplo, análogos de prolina ((ácido I-azetidin-2-carboxílico (LACA), cishidroxiprolina, d,I-3,4-deshidroprolina, tiaprolina, alfa-dipiridilo, beta-amino-propionitrilo fumarato, 4-propil-5-(4-piridinil)-2(3h)-oxazolona; metotrexato, mitoxantrona, heparina, interferones, 2 macroglobulina-suero, chimp-3, quimostatina, p-ciclodextrina tetradecasulfato, eponemicina; fumagilina, tiomalato de oro y sodio, d-penicilamina (CDPT), beta-1-anticolagenasasuero, alfa 2-antiplasmina, bisantreno, lobenzarit disódico, ácido n-2-carboxifenil-4-cloroantronílico disódico o "CCA", talidomida; esteroide angiostático, carboxinaminolmidazol; inhibidores de metaloproteinasas tales como BB94. Otros agentes antiangiogénesis incluyen anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos monoclonales contra estos factores de crecimiento angiogénicos: bFGF, aFGF, ^{F g F - 5 ,} isoformas de VEGF, VEGF-C, HGF/SF y Ang-1/Ang-2. Ferrara N. y Alitalo, K "Clinical application of angiogenic growth factors and their inhibitors" (1999) Nature Medicine 5:1359-1364. Otros agentes antiangiogénesis pueden incluir inhibidores de la transcripción de VEGF.

La angiogénesis, la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de capilares preexistentes, es una secuencia de eventos que es de importancia clave en una amplia gama de procesos fisiológicos y patológicos. Varias enfermedades se asocian con la formación de nueva vasculatura. La angiogénesis es una característica importante de diversas patologías, que incluyen las patologías caracterizadas o asociadas con una proliferación anormal o incontrolada de células tales como los tumores. Las patologías que implican una angiogénesis excesiva incluyen, por ejemplo, cánceres (tanto tumores sólidos como hematológicos). El paciente con cáncer puede beneficiarse de la inhibición de la angiogénesis - vascularización del tumor.

La angiogénesis es crucial para el crecimiento de tejidos neoplásicos. Durante más de 100 años, se observó que los tumores son más vasculares que los tejidos normales. Varios estudios experimentales sugirieron que tanto el crecimiento del tumor primario como la metástasis requieren neovascularización. La angiogénesis patológica necesaria para el crecimiento tumoral activo es generalmente sostenida y persistente, la adquisición inicial del fenotipo angiogénico es un mecanismo común para el desarrollo de una variedad de tipos de tumores sólidos y hematopoyéticos. Los tumores que no pueden reclutar y mantener una red vascular permanecen típicamente inactivos como lesiones asintomáticas in situ. La metástasis también depende de la angiogénesis: para que una célula tumoral haga metástasis con éxito, generalmente obtiene acceso a la vasculatura en el tumor primario, sobrevive a la circulación, se detiene en la microvasculatura del órgano objetivo, sale de esta vasculatura, crece en el órgano objetivo, e induce angiogénesis en el sitio objetivo. Por tanto, la angiogénesis parece ser necesaria tanto al principio como al final de la cascada metastásica.

La importancia de la angiogénesis para el crecimiento y la metástasis de las neoplasias proporciona, por tanto, un objetivo para los esfuerzos terapéuticos. Los agentes antiangiogénicos apropiados pueden actuar directa o indirectamente para influir en la angiogénesis asociada a tumores, ya sea mediante el retraso de su aparición o mediante el bloqueo de la sostenibilidad de la neovascularización de los tumores.

Los agentes anticáncer adicionales incluyen agentes biológicos (bioterapia), agentes de quimioterapia y agentes de radioterapia. Más generalmente, estas otras composiciones se proporcionarían en una cantidad combinada efectiva para matar o inhibir la proliferación de la célula.

Típicamente, la terapia con el virus vaccinia precederá a otros agentes por intervalos que van desde días a semanas. En las modalidades en las que el otro agente y el virus vaccinia se aplican por separado a la célula, generalmente se asegurará que no expire un período de tiempo significativo entre el momento de cada entrega, de manera que el agente y el virus vaccinia todavía puedan ejercer un efecto combinado ventajosamente sobre la célula. En tales casos, se contempla que pueda ponerse en contacto la célula con ambas modalidades dentro de aproximadamente 2-20 semanas entre sí. En algunas situaciones, puede ser deseable extender significativamente el período de tiempo para el tratamiento desde un lapso de varios días (2, 3, 4, 5, 6 o 7) a varias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8) entre las respectivas administraciones.

En adición a tratar a un sujeto con el virus vaccinia y un agente antiangiogénico, puede usarse una terapia adicional que incluya terapias tradicionales contra el cáncer.

1. Quimioterapia

Las terapias contra el cáncer incluyen una variedad de terapias combinadas con tratamientos químicos y basados en radiación. Las quimioterapias de combinación incluyen, por ejemplo, cisplatino (CDDP), carboplatino, procarbazina, mecloretamina, ciclofosfamida, camptotecina, ifosfamida, melfalán, clorambucilo, busulfán, nitrosurea, dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, bleomicina, plicomicina, mitomicina, etopósido (VP16), tamoxifeno, raloxifeno, agentes aglutinantes del receptor de estrógenos, taxol, gemcitabina, navelbina, inhibidores de la farnesil-proteína transferasa, transplatino, 5-fluorouracilo, vincristina, vinblastina y metotrexato, temazolomida (una forma acuosa de DTIC), o cualquier análogo o variante derivada de los anteriores. La combinación de quimioterapia con terapia biológica se conoce como bioquimioterapia.

2. Radioterapia

Otros factores que causan daño al ADN y que se han usado ampliamente incluyen lo que se conoce comúnmente como rayos gamma, rayos X, y/o la administración dirigida de radioisótopos a las células tumorales. También se contemplan otras formas de factores que dañan el ADN, tales como microondas e irradiación con UV. Es muy probable que todos estos factores afecten a una amplia gama de daños en el ADN, en los precursores del ADN, en la replicación y reparación del ADN, y en el ensamblaje y mantenimiento de los cromosomas. Los intervalos de dosificación para los rayos X están en el intervalo desde dosis diarias de 50 a 200 roentgens durante períodos prolongados de tiempo (3 a 4 semanas), hasta dosis únicas de 2000 a 6000 roentgens. Los intervalos de dosificación para radioisótopos varían ampliamente y dependen de la vida media del isótopo, la fuerza y el tipo de radiación emitida, y la captación por las células neoplásicas.

Los términos "contactado" y "expuesto", cuando se aplican a una célula, se usan en la presente descripción para describir el proceso mediante el cual una construcción terapéutica y un agente quimioterapéutico o radioterapéutico se administran a una célula objetivo o se colocan en yuxtaposición directa con la célula objetivo. Para lograr la muerte o estasis celular, ambos agentes se administran a una célula en una cantidad combinada efectiva para matar la célula o evitar que se divida.

3. Inmunoterapia

Los inmunoterapéuticos, en general, se basan en el uso de células y moléculas efectoras inmunes para atacar y destruir las células cancerosas. El efector inmune puede ser, por ejemplo, un anticuerpo específico para algún marcador en la superficie de una célula tumoral. El anticuerpo solo puede servir como un efector de la terapia o puede reclutar otras células para efectuar realmente la muerte celular. El anticuerpo también puede conjugarse con un fármaco o toxina (quimioterapéutico, radionúclido, cadena A de ricina, toxina del cólera, toxina de la tos ferina, etc.) y servir simplemente como agente de direccionamiento. Alternativamente, el efector puede ser un linfocito que lleva una molécula de superficie que interactúa, directamente o indirectamente, con una célula tumoral objetivo. Diversas células efectoras incluyen células T citotóxicas y células NK. La combinación de modalidades terapéuticas, es decir, actividad citotóxica directa e inhibición o reducción de ciertos polipéptidos de poxvirus proporcionaría un beneficio terapéutico en el tratamiento del cáncer.

4. Cirugía

Aproximadamente el 60 % de las personas con cáncer se someterán a cirugía de algún tipo, que incluye cirugía preventiva, diagnóstica o de estadificación, curativa y paliativa. La cirugía curativa es un tratamiento contra el cáncer que puede usarse junto con otras terapias, tales como el tratamiento de la presente invención, quimioterapia, radioterapia, terapia hormonal, terapia génica, inmunoterapia y/o terapias alternativas.

La cirugía curativa incluye la resección en la que todo o parte del tejido canceroso se extrae, extirpa, y/o destruye físicamente. La resección del tumor se refiere a la extirpación física de al menos parte de un tumor. En adición a la resección del tumor, el tratamiento mediante cirugía incluye cirugía con láser, criocirugía, electrocirugía, y cirugía controlada microscópicamente (cirugía de Mohs). Además, se contempla que la presente invención puede usarse junto con la eliminación de cánceres superficiales, precánceres o cantidades incidentales de tejido normal.

Tras la escisión de parte de todas las células cancerosas, tejido, o tumor, puede formarse una cavidad en el cuerpo. El tratamiento puede lograrse mediante perfusión, inyección directa o aplicación local del área con una terapia adicional contra el cáncer. Tal tratamiento puede repetirse, por ejemplo, cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, o 7 días, o cada 1, 2, 3, 4, y 5 semanas o cada 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12 meses. Estos tratamientos también pueden ser de diferentes dosis.

5. Otros agentes

Otra forma de terapia para usar junto con los métodos actuales incluye la hipertermia, que es un procedimiento en el que el tejido de un paciente se expone a altas temperaturas (hasta 106 °F). Los dispositivos de calentamiento externos o internos pueden participar en la aplicación de hipertermia local, regional, o de cuerpo entero. La hipertermia local implica la aplicación de calor en un área pequeña, tal como un tumor. El calor puede generarse externamente con ondas de alta frecuencia dirigidas a un tumor desde un dispositivo externo al cuerpo. El calor interno puede involucrar una sonda estéril, lo que incluye cables delgados calentados o tubos huecos llenos de agua tibia, antenas de microondas implantadas, o electrodos de radiofrecuencia.

El órgano o extremidad de un paciente se calienta para la terapia regional, lo que se logra mediante el uso de dispositivos que producen alta energía, tales como imanes. Alternativamente, puede extraerse y calentarse parte de la sangre del paciente antes de perfundirla en un área que se calentará internamente. El calentamiento de todo el cuerpo también puede implementarse en los casos en que el cáncer se diseminó por todo el cuerpo. Pueden usarse mantas de agua tibia, cera caliente, bobinas inductivas, y cámaras térmicas para este propósito.

La terapia hormonal también puede usarse junto con la presente invención o en combinación con cualquier otra terapia contra el cáncer descrita previamente. El uso de hormonas puede emplearse en el tratamiento de ciertos cánceres tales como el de mama, próstata, ovario, o cuello uterino para reducir el nivel o bloquear los efectos de ciertas hormonas tales como la testosterona o el estrógeno.

B. Administración

Al tratar un tumor, los métodos de la presente invención administran un virus vaccinia oncolítico y después en un momento posterior administran una composición que comprende un agente antiangiogénico. Las vías de administración variarán, naturalmente, con la ubicación y naturaleza del tumor e incluyen, por ejemplo, la administración intradérmica, transdérmica, parenteral, intravenosa, intramuscular, intranasal, subcutánea, regional (por ejemplo, en la proximidad de un tumor, particularmente con la vasculatura o la vasculatura adyacente de un tumor), percutánea, intratraqueal, intraperitoneal, intraarterial, intravesical, intratumoral, por inhalación, perfusión, lavado, y oral. Las composiciones se formularán en relación con la vía de administración particular.

Se contempla específicamente la inyección intratumoral o la inyección directamente en la vasculatura del tumor. La administración local, regional o sistémica también puede ser apropiada. Para tumores de >4 cm, el volumen a administrar será de aproximadamente 4-10 ml (preferentemente, 10 ml), mientras que para tumores de <4 cm, se usará un volumen de aproximadamente 1-3 ml (preferentemente, 3 ml). Las inyecciones múltiples administradas como dosis única comprenden volúmenes de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,5 ml. El virus puede administrarse en múltiples inyecciones al tumor, espaciadas a intervalos de aproximadamente 1 cm. En el caso de una intervención quirúrgica, la presente invención puede usarse preoperatoriamente, para hacer que un tumor inoperable sea objeto de resección. La administración continua también puede aplicarse cuando sea apropiado, por ejemplo, mediante la implantación de un catéter en un tumor o en la vasculatura del tumor. Tal perfusión continua puede tener lugar durante un período de aproximadamente 1-2 horas, a aproximadamente 2-6 horas, a aproximadamente 6-12 horas, a aproximadamente 12-24 horas, a aproximadamente 1-2 días, a aproximadamente 1-2 semanas. o más después del inicio del tratamiento. Generalmente, la dosis de la composición terapéutica mediante perfusión continua será equivalente a la administrada mediante una única o múltiples inyecciones, ajustada durante un período de tiempo durante el cual se produce la perfusión. Se contempla, además, que la perfusión de miembros u órganos puede usarse para administrar composiciones terapéuticas de la presente invención, particularmente en el tratamiento de tumores hepáticos, melanomas, y sarcomas.

Los regímenes de tratamiento también pueden variar y, a menudo, dependen del tipo de tumor, la ubicación del tumor, la progresión de la enfermedad, y la salud y la edad del paciente. Ciertos tipos de tumores requerirán un tratamiento más agresivo, mientras que, al mismo tiempo, ciertos pacientes no pueden tolerar protocolos más exigentes. El médico será el más adecuado para tomar tales decisiones en base a la eficacia y toxicidad conocidas (si las hay) de las formulaciones terapéuticas.

En determinadas modalidades, el tumor que se trata puede no ser resecable, al menos inicialmente. Los tratamientos con construcciones virales terapéuticas pueden aumentar la resecabilidad del tumor debido al encogimiento en los márgenes o mediante la eliminación de ciertas porciones particularmente invasivas. Después de los tratamientos, puede ser posible la resección. Los tratamientos adicionales posteriores a la resección servirán para eliminar la enfermedad residual microscópica en el sitio del tumor.

Los tratamientos pueden incluir varias "dosis unitarias". La dosis unitaria se define como que contiene una cantidad predeterminada de la composición terapéutica. La cantidad a administrar, y la vía y formulación particulares, están dentro del conocimiento de los expertos en la técnica clínica. No es necesario administrar una dosis unitaria como una única inyección, pero puede comprender una infusión continua durante un período de tiempo establecido. La dosis unitaria de la presente invención puede describirse convenientemente en términos de unidades formadoras de placa (pfu) para una construcción viral. Las dosis unitarias varían de 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013 pfu y más. Alternativamente, en dependencia del tipo de virus y el título alcanzable, uno administrará de 1 a 100, 10 a 50, 100-1000, o hasta aproximadamente o al menos aproximadamente 1 x 104, 1 x 105, 1 x 106, 1 x 107, 1 x 108, 1 x 109, 1 x 1010, 1 x 1011, 1 x 1012, 1 x 1013, 1 x 1014, o 1 x 1015 o más partículas virales (vp) infecciosas, lo que incluye todos los valores e intervalos entre ellos, al tumor o al sitio del tumor.

C. Composiciones y formulaciones inyectables

El método preferido para el suministro de una construcción de expresión o virus que codifica todo o parte de un genoma de poxvirus a células cancerosas o tumorales en la presente invención es mediante inyección intratumoral. Sin embargo, las composiciones farmacéuticas descritas en la presente descripción pueden administrarse alternativamente parenteralmente, intravenosamente, intradérmicamente, intramuscularmente, transdérmicamente o incluso intraperitonealmente como se describe en la patente de los EE. UU. núm. 5,543,158; patente de los EE. UU. núm. 5,641,515 y patente de los EE. UU. núm. 5,399,363.

La inyección de construcciones de ácido nucleico puede administrarse mediante jeringa o cualquier otro método usado para la inyección de una solución, siempre que la construcción de expresión pueda pasar a través del calibre particular de aguja requerido para la inyección. Recientemente se describió un nuevo sistema de inyección sin aguja (patente de los EE. UU. núm. 5,846,233) que tiene una boquilla que define una cámara de ámpula para contener la solución y un dispositivo de energía para empujar la solución fuera de la boquilla al lugar de suministro. También se describió un sistema de jeringa para uso en terapia génica que permite múltiples inyecciones de cantidades predeterminadas de una solución precisamente a cualquier profundidad (patente de los EE. UU. núm. 5,846,225).

Pueden prepararse soluciones de los compuestos activos como base libre o sales farmacológicamente aceptables en agua mezcladas de manera adecuada con un surfactante, tal como hidroxipropilcelulosa. También pueden prepararse dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de estos y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos. Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles (patente de los EE. UU. núm. 5,466,468). En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que exista una fácil inyectabilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El portador puede ser un solvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido y similares), mezclas adecuadas de estos, y/o aceites vegetales. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de surfactantes. La prevención de la acción de los microorganismos puede lograrse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede producirse mediante el uso en las composiciones de agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Para la administración parenteral en una solución acuosa, por ejemplo, la solución debe tamponarse adecuadamente si es necesario y el diluyente líquido primero debe volverse isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, intratumoral e intraperitoneal. A este respecto, los expertos en la técnica conocerán los medios acuosos estériles que pueden emplearse a la luz de la presente descripción. Por ejemplo, una dosis puede disolverse en 1 ml de solución isotónica de NaCl y adicionarse a 1000 ml de líquido de hipodermoclisis o inyectarse en el lugar de infusión propuesto (ver, por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences", 15a edición, páginas 1035-1038 y 1570-1580). Necesariamente se producirá alguna variación en la dosificación en dependencia del estado del sujeto que se trata. La persona responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la dosis apropiada para el sujeto individual. Además, para la administración humana, las preparaciones deben cumplir con los estándares de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza requeridos por los estándares de la Office of Biologics de la FDA.

Las soluciones inyectables estériles se preparan mediante la incorporación de los compuestos activos en la cantidad requerida en el solvente apropiado con varios de los otros ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan mediante la incorporación de los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son técnicas de secado al vacío y liofilización que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado de una solución previamente esterilizada filtrada del mismo.

Las composiciones descritas en la presente descripción pueden formularse en forma neutra o de sal. Sales farmacéuticamente aceptables, incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácido clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico, y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden derivar de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares. Tras la formulación, las soluciones se administrarán de una manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad que sea terapéuticamente efectiva. Las formulaciones se administran fácilmente en una variedad de formas de dosificación tales como soluciones inyectables, cápsulas de liberación de fármacos y similares.

Como se usa en la presente descripción, "vehículo" incluye todos y cada uno de los solventes, medios de dispersión, vehículos, recubrimientos, diluyentes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, tampones, soluciones de vehículos, suspensiones, coloides, y similares. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticas activas se conoce bien en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. También pueden incorporarse a las composiciones ingredientes activos complementarios.

La frase "farmacéuticamente aceptable" o "farmacológicamente aceptable" se refiere a entidades y composiciones moleculares que no producen una reacción adversa alérgica o similar cuando se administran a un ser humano. La preparación de una composición acuosa que contiene una proteína como ingrediente activo se conoce bien en la técnica. Típicamente, tales composiciones se preparan como inyectables, como soluciones o suspensiones líquidas; también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en líquido antes de la inyección.

II. Virus vaccinia jx-594

Los poxvirus se conocen desde hace siglos, con las marcas de viruela características producidas por el virus variola (viruela) que dan nombre a esta familia. Parece que la viruela apareció por primera vez en China y el Lejano Oriente hace más de 2000 años. Afortunadamente, este virus, a menudo fatal, se erradicó y el último brote natural se produjo en 1977 en Somalia.

La partícula viral del poxvirus es ovalada o con forma de ladrillo y mide unos 200-400 nm de largo. La superficie externa está estriada en filas paralelas, a veces dispuestas helicoidalmente. Las partículas son extremadamente complejas y contienen más de 100 proteínas distintas. Las formas extracelulares contienen dos membranas (EEV - viriones con envoltura extracelular), mientras que las partículas intracelulares solo tienen una membrana interna (IMV - viriones maduros intracelulares). La superficie externa está compuesta de lípidos y proteínas que rodean el núcleo, que está compuesto por una nucleoproteína fuertemente comprimida. Antigénicamente, los poxvirus también son muy complejos e inducen anticuerpos tanto específicos como de reacción cruzada. Hay al menos diez enzimas presentes en la partícula, principalmente relacionadas con el metabolismo del ácido nucleico/replicación del genoma.

El genoma del poxvirus es ADN lineal de doble cadena de 130-300 Kbp. Los extremos del genoma tienen un bucle de horquilla terminal con varias secuencias repetidas en tándem. Se secuenciaron varios genomas de poxvirus, con la mayoría de los genes esenciales ubicados en la parte central del genoma, mientras que los genes no esenciales se encuentran en los extremos. Hay aproximadamente 250 genes en el genoma del poxvirus.

La replicación tiene lugar en el citoplasma, ya que el virus es lo suficientemente complejo como para haber adquirido todas las funciones necesarias para la replicación del genoma. Hay alguna contribución de la célula, pero la naturaleza de esta contribución no está clara. Sin embargo, aunque la expresión del gen del poxvirus y la replicación del genoma ocurren en las células enucleadas, la maduración está bloqueada, lo que indica alguna función de la célula.

Los receptores de poxvirus generalmente no se conocen, pero probablemente sean múltiples en número y en diferentes tipos de células. Para el virus vaccinia, uno de los posibles receptores es el receptor de EGF (McFadden, 2005). La penetración también puede involucrar más de un mecanismo. La eliminación del recubrimiento se produce en dos etapas: (a) eliminar la membrana externa cuando la partícula entra en la célula y en el citoplasma, y (b) además se elimina el recubrimiento de la partícula y el núcleo pasa al citoplasma.

Una vez en el citoplasma celular, la expresión génica se lleva a cabo mediante enzimas virales asociadas al núcleo. La expresión se divide en 2 fases: genes tempranos: que representan aproximadamente el 50 % del genoma y se expresan antes de la replicación del genoma, y genes tardíos, que se expresan después de la replicación del genoma. El control temporal de la expresión lo proporcionan los promotores tardíos, que dependen de la replicación del ADN para su actividad. Se cree que la replicación del genoma implica un autocebado, lo que lleva a la formación de concatámeros de alto peso molecular, que posteriormente se escinden y reparan para formar genomas de virus. El ensamblaje viral ocurre en el citoesqueleto y probablemente implica interacciones con las proteínas del citoesqueleto (por ejemplo, proteínas de unión a actina). Se forman inclusiones en el citoplasma que maduran y se convierten en partículas de virus. La propagación de célula a célula puede proporcionar un mecanismo alternativo para la propagación de la infección. En general, la replicación de este virus grande y complejo es bastante rápida, y toma solo 12 horas en promedio.

Al menos nueve poxvirus diferentes causan enfermedades en los seres humanos, pero el virus variola y el vaccinia son los más conocidos. Las cepas de variola se dividen en variola mayor (25-30 % de muertes) y variola menor (mismos síntomas, pero menos del 1 % de tasa de mortalidad). La infección con ambos virus ocurre naturalmente por vía respiratoria y es sistémica, y produce una variedad de síntomas, pero más notablemente pústulas características del variola y cicatrices en la piel.

A. Virus vaccinia

El virus vaccinia es un virus grande, con envoltura compleja que tiene un genoma de ADN de doble cadena lineal de aproximadamente 190 K pb y que codifica aproximadamente 250 genes. El virus vaccinia se conoce por su función como vacuna que erradicó la viruela. Después de la erradicación de la viruela, los científicos exploraron el uso del virus vaccinia como herramienta para introducir genes en tejidos biológicos (terapia génica e ingeniería genética). El virus vaccinia es único entre los virus de ADN, ya que se replica solo en el citoplasma de la célula huésped. Por lo tanto, se requiere que el genoma grande codifique varias enzimas y proteínas necesarias para la replicación del ADN viral. Durante la replicación, el virus vaccinia produce diversas formas infecciosas que difieren en sus membranas externas: el virión maduro intracelular (IMV), el virión envuelto intracelular (IEV), el virión envuelto asociado a células (CEV) y el virión envuelto extracelular (EEV). El IMV es la forma infecciosa más abundante y se cree que es responsable de la propagación entre huéspedes. Por otro lado, se cree que el CEV desempeña una función en la propagación de célula a célula y se cree que el EEV es importante para la diseminación a largo plazo dentro del organismo huésped.

El virus vaccinia se relaciona estrechamente con el virus que causa la viruela vacuna. Se desconoce el origen exacto de la vacuna, pero la opinión más común es que el virus vaccinia, el virus de la viruela vacuna, y el virus variola (el agente causante de la viruela) se derivaron todos de un virus ancestral común. También se especula que el virus vaccinia se aisló originalmente de caballos. Una infección por el virus vaccinia es leve y típicamente asintomática en personas sanas, pero puede causar una erupción leve y fiebre, con una tasa de mortalidad extremadamente baja. Una respuesta inmune generada contra una infección por el virus vaccinia protege a esa persona contra una infección letal por viruela. Por esta razón, el virus vaccinia se usó como vacuna de virus vivo contra la viruela. La vacuna contra el virus vaccinia es segura porque no contiene el virus de la viruela, pero ocasionalmente pueden surgir ciertas complicaciones y/o efectos adversos de la vacuna, especialmente si la persona vacunada está inmunodeprimida.

Como se discutió anteriormente, los virus vaccinia se diseñaron para expresar varias proteínas extrañas. Una de estas proteínas es el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos, o GM-CSF. GM-CSF es una proteína secretada por macrófagos que estimula a las células madre a producir granulocitos (neutrófilos, eosinófilos, y basófilos) y macrófagos. El GM-CSF humano está glicosilado en los residuos de aminoácidos 23 (leucina), 27 (asparagina), y 39 (ácido glutámico) (ver la patente de los EE. UU. núm. 5,073,627). GM-CSF también se conoce como molgramostim

o, cuando la proteína se expresa en células de levadura, sargramostim (marca registrada Leukine®), que se usa como

medicamento para estimular la producción de glóbulos blancos, especialmente granulocitos y macrófagos, después

de la quimioterapia. Se informó previamente de un virus vaccinia que expresa GM-CSF. Sin embargo, no se administró

como un agente oncolítico, sino simplemente como un vector de administración de GM-CSF. Como tal, se administró

a pacientes en dosis inferiores a las que pueden lograr una oncólisis significativa. En la presente descripción se

describe el uso de un virus vaccinia que expresa GM-CSF que, en algunas modalidades, se administra a

concentraciones superiores a 1 x 108 pfu o partículas.

El virus vaccinia puede propagarse mediante el uso de los métodos descritos por Earl y Moss en Ausubeln y otros,

1994,.

III. Composiciones de ácidos nucleicos

En determinadas modalidades, la presente invención se refiere al virus vaccinia y variantes del mismo.

A. Variantes de polipéptidos virales

Las variantes de la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos codificados por los vectores del virus vaccinia de la

invención pueden ser variantes de sustitución, inserción o deleción. Una mutación en un gen que codifica un

polipéptido viral puede afectar a 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26,

27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 o más aminoácidos no contiguos o contiguos del polipéptido, en

comparación con el tipo salvaje. Pueden identificarse varios polipéptidos codificados por el virus vaccinia por referencia

a Rosel y otros, 1986, Goebel y otros, 1990 y número de acceso del GenBank NC001559.

Las variantes de deleción carecen de uno o más residuos de la proteína nativa o de tipo salvaje. Pueden eliminarse

residuos individuales o puede eliminarse todo o parte de un dominio (tal como un dominio catalítico o de unión). Puede

introducirse un codón de terminación (por sustitución o inserción) en una secuencia de ácido nucleico codificante para

generar una proteína truncada. Los mutantes de inserción típicamente implican la adición de material en un punto no

terminal en el polipéptido. Esto puede incluir la inserción de un epítopo inmunorreactivo o simplemente de uno o más

residuos. También pueden generarse adiciones terminales, llamadas proteínas de fusión.

Las variantes de sustitución contienen típicamente el intercambio de un aminoácido por otro en uno o más sitios dentro

de la proteína y pueden diseñarse para modular una o más propiedades del polipéptido, con o sin la pérdida de otras

funciones o propiedades. Las sustituciones pueden ser conservadoras, es decir, un aminoácido se reemplaza por uno

de forma y carga similares. Las sustituciones conservadoras se conocen bien en la técnica e incluyen, por ejemplo,

los cambios de: alanina a serina; arginina a lisina; asparagina a glutamina o histidina; aspartato a glutamato; cisteína

a serina; glutamina a asparagina; glutamato a aspartato; glicina a prolina; histidina a asparagina o glutamina; isoleucina

a leucina o valina; leucina a valina o isoleucina; lisina a arginina; metionina a leucina o isoleucina; fenilalanina a tirosina,

leucina o metionina; serina a treonina; treonina a serina; triptófano a tirosina; tirosina a triptófano o fenilalanina; y valina

a isoleucina o leucina. Alternativamente, las sustituciones pueden ser no conservadoras de manera que se afecte una

función o actividad del polipéptido. Los cambios no conservadores típicamente implican la sustitución de un residuo

por uno que sea químicamente diferente, tal como un aminoácido polar o cargado por un aminoácido no polar o no

cargado, y viceversa.

El término "codón funcionalmente equivalente" se usa en la presente descripción para hacer referencia a codones que

codifican el mismo aminoácido (ver Tabla 1, más abajo).

Tabla 1: Tabla de codones

Aminoácidos Codones

Continuación

Aminoácidos Codones

Asparagina Asn N AAC AAU

Prolina Pro P CCA CCC CCG CCU

Glutamina Gln Q CAA CAG

Arginina Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU

Serina Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU

Treonina Thr T ACA ACC ACG ACU

Valina Val V GUA GUC GUG GUU

Triptófano Trp W UGG

Tirosina Tyr Y UAC UAU

También se entenderá que las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos pueden incluir residuos adicionales, tales como aminoácidos N- o C-terminales adicionales o secuencias 5' o 3', y aun así ser esencialmente como se establece en una de las secuencias descritas en la presente descripción, siempre que la secuencia cumpla con los criterios establecidos anteriormente, que incluyen el mantenimiento de la actividad de la proteína biológica en lo que respecta a la expresión de la proteína. La adición de secuencias terminales se aplica particularmente a las secuencias de ácidos nucleicos que pueden, por ejemplo, incluir varias secuencias no codificantes que flanquean las porciones 5' o 3' de la región codificante o pueden incluir varias secuencias internas, es decir, intrones, que se conoce que aparecen dentro de los genes.

La siguiente es una discusión basada en el cambio de los aminoácidos de una proteína para crear una molécula de segunda generación equivalente, o incluso mejorada. Por ejemplo, ciertos aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos en una estructura de proteína sin una pérdida apreciable de la capacidad de unión interactiva con estructuras tales como, por ejemplo, regiones de unión a antígeno de anticuerpos o sitios de unión en moléculas de sustrato. Dado que es la capacidad interactiva y la naturaleza de una proteína lo que define la actividad funcional biológica de esa proteína, pueden realizarse ciertas sustituciones de aminoácidos en una secuencia de proteína y en su secuencia de codificación de ADN subyacente, y sin embargo producir una proteína con propiedades similares. Por tanto, los inventores contemplan que pueden realizarse diversos cambios en las secuencias de ADN de los genes sin una pérdida apreciable de su utilidad o actividad biológica, como se analiza más abajo. La Tabla 1 muestra los codones que codifican aminoácidos particulares.

Al realizar tales cambios, puede considerarse el índice hidropático de aminoácidos. La importancia del índice hidropático de aminoácidos para conferir una función biológica interactiva a una proteína se entiende generalmente en la técnica según Kyte y Doolittle, 1982. Se acepta que el carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultante, que a su vez define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo, enzimas, sustratos, receptores, ADN, anticuerpos, antígenos, y similares.

También se entiende en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares puede realizarse efectivamente sobre la base de la hidrofilicidad. La patente de los EE. UU. núm. 4,554,101 establece que la mayor hidrofilicidad media local de una proteína, gobernada por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con una propiedad biológica de la proteína. Como se detalla en la patente de los EE. UU. núm. 4,554,101, se asignaron los siguientes valores de hidrofilicidad a los residuos de aminoácidos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0±1); glutamato (+3,0±1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5±1); alanina (-0,5); histidina *-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptófano (-3,4).

Se entiende que un aminoácido puede sustituirse por otro que tenga un valor de hidrofilicidad similar y todavía producir una proteína biológicamente equivalente e inmunológicamente equivalente. En tales cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están dentro de ±2, se prefieren particularmente aquellos que están dentro de ±1, y se prefieren aún más particularmente aquellos dentro de ±0,5.

Como se indicó anteriormente, las sustituciones de aminoácidos generalmente se basan en la similitud relativa de los sustituyentes de la cadena lateral de los aminoácidos, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño, y similares. Las sustituciones ejemplares que toman en consideración las diversas características anteriores se conocen bien por los expertos en la técnica e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina.

B. Polinucleótidos que codifican proteínas nativas o proteínas modificadas

La presente invención se refiere a polinucleótidos, aislables de células, que son capaces de expresar todo o parte de una proteína o polipéptido. En algunas modalidades de la invención, estas se refieren a un genoma viral que se mutó específicamente para generar un virus que carece de ciertos polipéptidos virales funcionales. Los polinucleótidos pueden codificar un péptido o polipéptido que contenga todo o parte de una secuencia de aminoácidos viral o pueden modificarse genéticamente para que no codifiquen tal polipéptido viral o codifiquen un polipéptido viral que tenga al menos una función o actividad reducida, disminuida, o ausente. Las proteínas recombinantes pueden purificarse a

partir de células de expresión para producir proteínas activas. El genoma, así como la definición de las regiones

codificantes del virus vaccinia, pueden encontrarse en Rosel y otros, 1986; Goebel y otros, 1990; y/o número de acceso

del GenBank NC_001559.

Como se usa en la presente descripción, el término "segmento de ADN" se refiere a una molécula de ADN que se

aisló libre de ADN genómico total de una especie particular. Por lo tanto, un segmento de ADN que codifica un

polipéptido se refiere a un segmento de ADN que contiene secuencias codificantes de polipéptidos de tipo salvaje,

polimórficos, o mutantes pero que se aisló o purificó para quedar libre de ADN genómico total de mamífero o humano.

Se incluyen dentro del término "segmento de ADN" un polipéptido o polipéptidos, segmentos de ADN más pequeños

que un polipéptido, y vectores recombinantes, que incluyen, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, fagos, virus, y

similares.

Como se usa en esta solicitud, el término "polinucleótido de poxvirus" se refiere a una molécula de ácido nucleico que

codifica un polipéptido de poxvirus que se aisló para quedar libre de ácido nucleico genómico total. Similarmente, un

"polinucleótido de virus vaccinia" se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido del virus

vaccinia que se aisló para quedar libre de ácido nucleico genómico total. Un "genoma de poxvirus" o un "genoma de

virus vaccinia" se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede proporcionarse a una célula huésped para

producir una partícula viral, en presencia o ausencia de un virus auxiliar. El genoma puede o no haberse mutado de

manera recombinante en comparación con el virus de tipo salvaje.

El término "ADNc" pretende hacer referencia al ADN preparado mediante el uso de ARN mensajero (ARNm) como

molde. La ventaja de usar un ADNc, en contraposición al ADN genómico o al ADN polimerizado a partir de un molde

de ARN genómico, no procesado o parcialmente procesado, es que el ADNc contiene principalmente secuencias

codificantes de la proteína correspondiente. Puede haber ocasiones en las que se prefiera la secuencia genómica

completa o parcial, como cuando se requieren las regiones no codificantes para una expresión óptima o cuando las

regiones no codificantes tales como los intrones, deben dirigirse en una estrategia antisentido.

También se contempla que un polipéptido particular de una especie dada puede estar representado por variantes

naturales que tienen secuencias de ácido nucleico ligeramente diferentes, pero, no obstante, codifican la misma

proteína (ver Tabla 1 anterior).

Similarmente, un polinucleótido que comprende un gen de polipéptido mutante o de tipo salvaje aislado o purificado

se refiere a un segmento de ADN que incluye secuencias codificantes de polipéptido de tipo salvaje o mutante y, en

ciertos aspectos, secuencias reguladoras, aisladas sustancialmente de otros genes naturales o secuencias que

codifican proteínas. A este respecto, el término "gen" se usa por simplicidad para referirse a una proteína funcional,

polipéptido o unidad codificadora de péptidos (que incluye cualquier secuencia requerida para la apropiada

transcripción, modificación postraduccional, o localización). Como entenderán los expertos en la técnica, este término

funcional incluye secuencias genómicas, secuencias de ADNc, y segmentos génicos modificados más pequeños que

expresan, o pueden adaptarse para expresar, proteínas, polipéptidos, dominios, péptidos, proteínas de fusión, y

mutantes.

Un ácido nucleico que codifica todo o parte de un polipéptido nativo o modificado puede contener una secuencia de

ácido nucleico contigua que codifica todo o una parte de tal polipéptido de las siguientes longitudes: 10, 20, 30, 40,

50, 60, 70, 80, 90, 100, 110120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290,

300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 441, 450, 460, 470, 480, 490, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 980, 990, 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1070, 1080, 1090, 1095, 1100, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500,

4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 9000, 10000, o más nucleótidos, nucleósidos, o pares de

bases.

El término "recombinante" puede usarse junto con un polipéptido o el nombre de un polipéptido específico, y esto

generalmente se refiere a un polipéptido producido a partir de una molécula de ácido nucleico que se manipuló in vitro

o que es el producto replicado de tal molécula.

Los segmentos de ácido nucleico usados en la presente invención, independientemente de la longitud de la secuencia

codificante en sí, pueden combinarse con otras secuencias de ácido nucleico, tales como promotores, señales de

poliadenilación, sitios de enzimas de restricción adicionales, sitios múltiples de clonaje, otros segmentos codificantes,

y similares, de manera que su longitud total puede variar considerablemente. Por lo tanto, se contempla que pueda

emplearse un fragmento de ácido nucleico de casi cualquier longitud, la longitud total está, preferentemente, limitada

por la facilidad de preparación y uso en el protocolo de ADN recombinante pretendido.

Se contempla que las construcciones de ácido nucleico de la presente invención pueden codificar polipéptidos de

longitud completa de cualquier fuente o codificar una versión truncada del polipéptido, por ejemplo, un polipéptido

truncado del virus vaccinia, de manera que el transcrito de la región codificante representa la versión truncada. El transcrito truncado puede después traducirse en una proteína truncada. Puede adicionarse una etiqueta u otro polipéptido heterólogo a la secuencia que codifica el polipéptido modificado, en donde "heterólogo" se refiere a un polipéptido que no es el mismo que el polipéptido modificado.

En otras determinadas modalidades, la invención se refiere a segmentos de ADN aislados y vectores recombinantes que incluyen dentro de su secuencia una secuencia de ácido nucleico contigua de la mostrada en las secuencias identificadas en la presente descripción. Sin embargo, tales secuencias pueden mutarse para producir un producto proteico cuya actividad se altera con respecto al tipo salvaje.

También se entenderá que esta invención no se limita a las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos particulares de estas secuencias identificadas. Por lo tanto, los vectores recombinantes y los segmentos de ADN aislados pueden incluir las diversas regiones codificantes de poxvirus, regiones codificantes que portan alteraciones o modificaciones seleccionadas en la región codificante básica, o pueden codificar polipéptidos más grandes que, no obstante, incluyen regiones codificantes de poxvirus o pueden codificar proteínas equivalentes biológicamente funcionales. o péptidos que tienen secuencias de aminoácidos variantes.

Los segmentos de ADN de la presente invención abarcan proteínas y péptidos de poxvirus equivalentes biológicamente funcionales. Tales secuencias pueden surgir como consecuencia de la redundancia de codones y la equivalencia funcional que se sabe que ocurren naturalmente dentro de las secuencias de ácido nucleico y las proteínas así codificadas. Alternativamente, pueden crearse proteínas o péptidos funcionalmente equivalentes mediante la aplicación de tecnología de ADN recombinante, en la que pueden diseñarse cambios en la estructura de la proteína, basados en consideraciones de las propiedades de los aminoácidos que se intercambian. Los cambios diseñados por el hombre pueden introducirse mediante la aplicación de técnicas de mutagénesis sitio dirigidas, por ejemplo, para introducir mejoras en la antigenicidad de la proteína.

C. Mutagénesis de polinucleótidos de poxvirus

En diversas modalidades, el polinucleótido de poxvirus puede modificarse o mutagenizarse. Las alteraciones o mutaciones pueden incluir inserciones, deleciones, mutaciones puntuales, inversiones, y similares y pueden resultar en la modulación, activación y/o inactivación de ciertas vías o mecanismos moleculares o proteínas particulares (por ejemplo, timidina quinasa), así como en la alteración de la función, ubicación, o expresión de un producto génico, en particular al hacer que un producto génico no sea funcional. Cuando se emplea, la mutagénesis de un polinucleótido que codifica todo o parte de un poxvirus puede lograrse mediante una variedad de procedimientos mutagénicos estándar (Sambrook y otros, 1989).

Pueden inducirse mutaciones después de la exposición a mutágenos químicos o físicos. Tales agentes inductores de mutaciones incluyen radiación ionizante, luz ultravioleta y una serie diversa de sustancias químicas tales como agentes alquilantes e hidrocarburos aromáticos policíclicos, todos los cuales son capaces de interactuar directamente o indirectamente (generalmente mediante el seguimiento de algunas biotransformaciones metabólicas) con ácidos nucleicos. El daño del ADN inducido por tales agentes puede dar lugar a modificaciones de la secuencia de bases cuando el ADN afectado se replica o repara y, por lo tanto, a una mutación. La mutación también puede ser sitio dirigida mediante el uso de métodos de selección de destino particulares.

D. Vectores

Para generar mutaciones en el genoma del poxvirus, los polipéptidos nativos y modificados pueden codificarse por una molécula de ácido nucleico comprendida en un vector. El término "vector" se usa para hacer referencia a una molécula de ácido nucleico portadora en la que puede insertarse una secuencia de ácido nucleico exógena para su introducción en una célula donde puede replicarse. Una secuencia de ácido nucleico puede ser "exógena", lo que significa que es extraña a la célula en la que se introduce el vector o que la secuencia es homóloga a una secuencia en la célula, pero en una posición dentro del ácido nucleico de la célula huésped en la que la secuencia normalmente no se encuentra. Los vectores incluyen plásmidos, cósmidos, virus (bacteriófagos, virus animales y virus vegetales), y cromosomas artificiales (por ejemplo, YAC). Un experto en la técnica estaría bien equipado para construir un vector mediante técnicas recombinantes estándar, que se describen en Sambrook y otros, (1989) y Ausbel y otros, 1994. En adición a codificar un polipéptido modificado tal como la gelonina modificada, un vector puede codificar secuencias de polipéptidos no modificados como una etiqueta o una molécula de direccionamiento.

El término "vector de expresión" se refiere a un vector que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos parte de un producto génico capaz de ser transcrito. En algunos casos, las moléculas de ARN se traducen después en una proteína, polipéptido, o péptido. En otros casos, estas secuencias no se traducen, por ejemplo, en la producción de moléculas antisentido o ribozimas. Los vectores de expresión pueden contener una variedad de "secuencias de control", que se refieren a secuencias de ácido nucleico necesarias para la transcripción y posiblemente la traducción de una secuencia codificante unida operativamente en un organismo huésped particular. En adición a las secuencias de control que gobiernan la transcripción y traducción, los vectores y vectores de expresión pueden contener secuencias de ácido nucleico que también cumplen otras funciones y se describen más adelante.

1. Promotores y potenciadores

Un "promotor" es una secuencia de control que es una región de una secuencia de ácido nucleico en la que se controlan el inicio y la velocidad de transcripción. Puede contener elementos genéticos a los que pueden unirse proteínas y moléculas reguladoras tales como la ARN polimerasa y otros factores de transcripción. Las frases "posicionado operativamente", "ligado operativamente", "bajo control" y "bajo control transcripcional" significan que un promotor está en una ubicación funcional y/u orientación correcta en relación con una secuencia de ácido nucleico para controlar el inicio transcripcional y/o expresión de esa secuencia. Un promotor puede o no usarse junto con un "potenciador", que se refiere a una secuencia reguladora que actúa en cis y que participa en la activación transcripcional de una secuencia de ácido nucleico.

Un promotor puede ser uno asociado naturalmente con un gen o secuencia, como puede obtenerse mediante el aislamiento de las secuencias no codificantes 5' ubicadas corriente arriba del segmento codificante y/o exón. Tal promotor puede denominarse "endógeno". Similarmente un potenciador puede ser uno asociado de forma natural con una secuencia de ácido nucleico, ubicado corriente abajo o corriente arriba de esa secuencia. Alternativamente, se obtendrán ciertas ventajas mediante la ubicación del segmento de ácido nucleico codificante bajo el control de un promotor recombinante o heterólogo, que se refiere a un promotor que normalmente no se asocia con una secuencia de ácido nucleico en su entorno natural. Un potenciador recombinante o heterólogo también se refiere a un potenciador que normalmente no se asocia con una secuencia de ácido nucleico en su entorno natural. Tales promotores o potenciadores pueden incluir promotores o potenciadores de otros genes, y promotores o potenciadores aislados de cualquier otra célula procariota, eucariota, o virales, y promotores o potenciadores que no son de origen natural, es decir, que contienen diferentes elementos de diferentes regiones reguladoras de la transcripción. y/o mutaciones que alteran la expresión. En adición a producir secuencias de ácido nucleico de promotores y potenciadores sintéticamente, las secuencias pueden producirse mediante el uso de clonación y/o tecnología de amplificación de ácido nucleico recombinantes, que incluyen PCR™, en relación con las composiciones descritas en la presente descripción (ver patente de los EE. UU. núm. 4,683,202, Patente de los EE. UU. núm. 5,928,906). Además, se contemplan las secuencias de control que dirigen la transcripción y/o expresión de secuencias dentro de orgánulos no nucleares tales como mitocondrias, cloroplastos y similares, las que pueden emplearse también.

Naturalmente, puede ser importante emplear un promotor y/o potenciador que dirija efectivamente la expresión del segmento de ADN en el tipo de célula, orgánulo, y organismo elegido para la expresión. Los expertos en la técnica de la biología molecular generalmente conocen el uso de combinaciones de promotores, potenciadores, y tipos de células para la expresión de proteínas, por ejemplo, ver Sambrook y otros (1989). Los promotores empleados pueden ser constitutivos, específicos de tejido, inducibles, y/o útiles en las condiciones apropiadas para dirigir un alto nivel de expresión del segmento de ADN introducido, tal como es ventajoso en la producción a gran escala de proteínas y/o péptidos recombinantes. El promotor puede ser heterólogo o endógeno.

La identidad de los elementos o promotores específicos de tejido, así como los ensayos para caracterizar su actividad, se conoce bien por los expertos en la técnica. Ejemplos de tales regiones incluyen el gen LIMK2 humano (Nomoto y otros, 1999), el gen del receptor 2 de somatostatina (Kraus y otros, 1998), el gen de unión al ácido retinoico epididimario murino (Lareyre y otros, 1999), CD4 humano (Zhao-Emonet y otros, 1998), colágeno a2 (XI) de ratón (Tsumaki, y otros, 1998), gen del receptor de dopamina D1A (Lee, y otros, 1997), factor de crecimiento similar a la insulina II (Wu y otros, 1997), la molécula 1 de adhesión de células endoteliales plaquetarias humanas (Almendro y otros, 1996), y el promotor SM22a.

2. Señales de inicio y sitios de unión de ribosomas internos

También puede ser necesaria una señal de iniciación específica para una traducción eficiente de las secuencias codificantes. Estas señales incluyen el codón de iniciación ATG o secuencias adyacentes. Puede ser necesario proporcionar señales de control de la traducción exógenas, que incluyen el codón de iniciación ATG. Un experto en la técnica sería capaz de determinar fácilmente esto y proporcionar las señales necesarias. Se conoce bien que el codón de iniciación debe estar "en marco" con el marco de lectura de la secuencia codificante deseada para asegurar la traducción del inserto completo. Las señales de control de la traducción exógenas y los codones de iniciación pueden ser naturales o sintéticos. La eficiencia de la expresión puede mejorarse mediante la inclusión de elementos potenciadores de la transcripción apropiados.

En ciertas modalidades de la invención, el uso de elementos de sitios de entrada de ribosomas internos (IRES) se usa para crear mensajes multigénicos o policistrónicos. Los elementos IRES pueden eludir el modelo de exploración de ribosomas de la traducción dependiente de caperuza metilada en 5' y comenzar la traducción en sitios internos (Pelletier y Sonenberg, 1988). Se describieron elementos IRES de dos miembros de la familia de los picornavirus (polio y encefalomiocarditis) (Pelletier y Sonenberg, 1988), así como un IRES de un mensajero de mamífero (Macejak y Sarnow, 1991). Los elementos IRES pueden vincularse a marcos de lectura abiertos heterólogos. Pueden transcribirse juntos múltiples marcos de lectura abiertos, cada uno separado por un IRES, lo que crea mensajeros policistrónicos. En virtud del elemento IRES, cada marco de lectura abierto es accesible a los ribosomas para una traducción eficiente. Pueden expresarse de manera eficiente múltiples genes mediante el uso de un solo promotor/potenciador para transcribir un solo mensajero (ver las patentes de los EE. UU. 5,925,565 y 5,935,819).

3. Sitios múltiples de clonación

Los vectores pueden incluir un sitio múltiple de clonaje (MCS), que es una región de ácido nucleico que contiene múltiples sitios de enzimas de restricción, cualquiera de los cuales puede usarse junto con tecnología recombinante estándar para digerir el vector. (Ver Carbonelli y otros, 1999, Levenson y otros, 1998 y Cocea, 1997) "Digestión con enzimas de restricción" se refiere a la escisión catalítica de una molécula de ácido nucleico con una enzima que funciona sólo en ubicaciones específicas de una molécula de ácido nucleico. Muchas de estas enzimas de restricción están disponibles comercialmente. El uso de tales enzimas se conoce ampliamente por los expertos en la técnica. Con frecuencia, un vector se linealiza o fragmenta mediante el uso de una enzima de restricción que corta dentro del MCS para permitir que las secuencias exógenas se liguen al vector. "Ligamiento" se refiere al proceso de formación de enlaces fosfodiéster entre dos fragmentos de ácido nucleico, que pueden ser o no contiguos entre sí. Las técnicas que implican enzimas de restricción y reacciones de ligamiento se conocen bien por los expertos en la técnica de la tecnología recombinante.

4. Sitios de corte y empalme

La mayoría de las moléculas de ARN eucariotas transcritas se someterán a un corte y empalme de ARN para eliminar los intrones de las transcripciones primarias. Los vectores que contienen secuencias eucariotas genómicas pueden requerir sitios de corte y empalme de donadores y/o aceptores para asegurar el procesamiento adecuado del transcrito para la expresión de proteínas. (Ver Chandler y otros, 1997)

5. Señales de terminación

Los vectores o construcciones de la presente invención comprenderán generalmente al menos una señal de terminación. Una "señal de terminación" o "terminador" se compone de las secuencias de ADN implicadas en la terminación específica de una transcripción de ARN por una ARN polimerasa. Por tanto, en determinadas modalidades se contempla una señal de terminación que finaliza la producción de un transcripto de ARN. Puede ser necesario un terminador in vivo para lograr niveles de mensajeros deseables.

En los sistemas eucariotas, la región de terminación también puede comprender secuencias de ADN específicas que permiten la escisión específica del sitio del nuevo transcrito para exponer un sitio de poliadenilación. Esto indica a una polimerasa endógena especializada que adicione un tramo de aproximadamente 200 residuos A (poliA) al extremo 3' de la transcripción. Las moléculas de ARN modificadas con esta cola de poliA parecen más estables y se traducen de manera más eficiente. Por tanto, en otras modalidades que implican eucariotas, se prefiere que ese terminador comprenda una señal para la escisión del ARN, y se prefiere más que la señal del terminador promueva la poliadenilación del mensajero. Los elementos del sitio de terminación y/o poliadenilación pueden servir para mejorar los niveles de mensajeros y/o minimizar la lectura desde el casete a otras secuencias.

Los terminadores contemplados para su uso en la invención incluyen cualquier terminador de la transcripción conocido descrito en la presente descripción o conocido por un experto en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, las secuencias de terminación de genes, tales como por ejemplo el terminador de la hormona del crecimiento bovino. o secuencias de terminación viral, como por ejemplo el terminador de SV40. En determinadas modalidades, la señal de terminación puede ser una falta de secuencia transcribible o traducible, tal como debido a un truncamiento de secuencia.

6. Señales de poliadenilación

En la expresión, particularmente en la expresión eucariótica, se incluirá típicamente una señal de poliadenilación para efectuar la poliadenilación adecuada del transcripto. No se cree que la naturaleza de la señal de poliadenilación sea crucial para la práctica satisfactoria de la invención y/o puede emplearse cualquier secuencia de este tipo. Las modalidades preferidas incluyen la señal de poliadenilación de SV40 y/o la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina, conveniente y/o conocida por funcionar bien en diversas células objetivo. La poliadenilación puede aumentar la estabilidad del transcripto o puede facilitar el transporte citoplásmico.

7. Orígenes de la replicación

Para propagar un vector en una célula huésped, este puede contener uno o más orígenes de sitios de replicación (a menudo denominados "ori"), que es una secuencia de ácido nucleico específica en la que se inicia la replicación. Alternativamente, puede emplearse una secuencia de replicación autónoma (ARS) si la célula huésped es una levadura.

8. Marcadores seleccionables y tamizables

En ciertas modalidades de la invención, las células que contienen una construcción de ácido nucleico de la presente invención pueden identificarse in vitro o in vivo mediante la inclusión de un marcador en el vector de expresión. Tales marcadores conferirían un cambio identificable a la célula lo que permitiría una fácil identificación de las células que contienen el vector de expresión. Generalmente, un marcador seleccionable es aquel que confiere una propiedad que permite la selección. Un marcador seleccionable positivo es aquel en el que la presencia del marcador permite su selección, mientras que un marcador seleccionable negativo es aquel en el que su presencia impide su selección. Un ejemplo de marcador seleccionable positivo es un marcador de resistencia a fármacos.

Usualmente la inclusión de un marcador de selección de fármacos ayuda en la clonación e identificación de transformantes, por ejemplo, los genes que confieren resistencia a neomicina, puromicina, higromicina, DHFR, GPT, zeocina e histidinol son marcadores seleccionables útiles. En adición a los marcadores que confieren un fenotipo que permite la discriminación de transformantes en función de la implementación de condiciones, también se contemplan otros tipos de marcadores que incluyen marcadores tamizables tales como GFP, cuya base es el análisis colorimétrico. Alternativamente, pueden utilizarse enzimas detectables tales como la timidina quinasa (tk) del virus del herpes simple o la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT). Un experto en la técnica también sabría cómo emplear marcadores inmunológicos, posiblemente junto con el análisis de FACS. No se cree que el marcador usado sea importante, siempre que sea capaz de expresarse simultáneamente con el ácido nucleico que codifica un producto génico. Los expertos en la técnica conocen bien otros ejemplos de marcadores seleccionables y tamizables.

E. Células huésped

Como se usa en la presente descripción, los términos "célula", "línea celular", y "cultivo celular" pueden usarse indistintamente. Todos estos términos también incluyen su progenie, que es cualquiera y todas las generaciones posteriores. Se entiende que toda la progenie puede no ser idéntica debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. En el contexto de expresar una secuencia de ácido nucleico heteróloga, "célula huésped" se refiere a una célula procariótica o eucariótica, e incluye cualquier organismo transformable que sea capaz de replicar un vector y/o expresar un gen heterólogo codificado por un vector. Una célula huésped puede, y es, usada como receptora de vectores o virus (que no califica como vector si no expresa polipéptidos exógenos). Una célula huésped puede ser "transfectada" o "transformada", que se refiere a un proceso mediante el cual un ácido nucleico exógeno, como una secuencia que codifica una proteína modificada, se transfiere o se introduce en la célula huésped. Una célula transformada incluye la célula sujeto primaria y su progenie.

Las células huésped pueden derivar de procariotas o eucariotas, que incluyen células de levadura, células de insectos, y células de mamíferos, en dependencia de si el resultado deseado es la replicación del vector o la expresión de parte o todas las secuencias de ácido nucleico codificadas por el vector. Numerosas líneas celulares y cultivos están disponibles para su uso como célula huésped, y pueden obtenerse a través de la American Type Culture Collection (ATCC), que es una organización que sirve como archivo de cultivos vivos y materiales genéticos (www.atcc.org). Un experto en la técnica puede determinar un huésped apropiado basado en la estructura del vector y el resultado deseado. Un plásmido o cósmido, por ejemplo, puede introducirse en una célula huésped procariota para la replicación de muchos vectores. Las células bacterianas usadas como células huésped para la replicación y/o expresión de vectores incluyen DH5a, JM109, y KC8, así como una serie de huéspedes bacterianos disponibles comercialmente como SURE® Competent Cells y SOLOPACK™ Gold Cells (STRATAGENE®, La Jolla, Calif.). Alternativamente, podrían usarse células bacterianas tales como E. coli LE392 como células huésped de virus fagos. Las células de levadura apropiadas incluyen Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pombe, y Pichia pastoris.

Los ejemplos de células huésped eucarióticas para la replicación y/o expresión de un vector incluyen HeLa, NIH3T3, Jurkat, 293, Cos, CHO, Saos, y PC12. Se encuentran disponibles muchas células huésped de diversos tipos de células y organismos y los expertos en la técnica las conocerán. Similarmente, puede usarse un vector viral junto con una célula huésped eucariótica o procariótica, particularmente una que sea permisiva para la replicación o expresión del vector.

Algunos vectores pueden emplear secuencias de control que permitan que se replique y/o exprese tanto en células procarióticas como eucarióticas. Un experto en la técnica comprendería mejor las condiciones en las que incubar todas las células huésped descritas anteriormente para mantenerlas y permitir la replicación de un vector. También se entienden y conocen técnicas y condiciones que permitirían la producción a gran escala de vectores, así como la producción de ácidos nucleicos codificados por vectores y sus polipéptidos, proteínas, o péptidos afines.

F. Métodos de transferencia genética

Se cree que los métodos adecuados para la administración de ácido nucleico para efectuar la expresión de las composiciones de la presente invención incluyen prácticamente cualquier método mediante el cual un ácido nucleico (por ejemplo, ADN, incluidos vectores virales y no virales) puede introducirse en un orgánulo, una célula, un tejido u organismo, como se describe en la presente descripción o como se conocería por un experto en la técnica. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a, administración directa de ADN tal como por inyección (patentes de los EE. UU. núm. 5,994,624, 5,981,274, 5,945,100, 5,780,448, 5,736,524, 5,702,932, 5,656,610, 5,589,466 y 5,580,859), que incluye la microinyección (Harland y Weintraub, 1985; patente núm. 5,789,215); por electroporación (patente de los EE. UU. núm. 5,384,253); por precipitación con fosfato de calcio (Graham y Van Der Eb, 1973; Chen y Okayama, 1987; Rippe y otros, 1990); mediante el uso de DEAE-dextrano seguido de polietilenglicol (Gopal, 1985); por carga sónica directa (Fechheimer y otrosm 1987); por transfección mediada por liposomas (Nicolau y Sene, 1982; Fraley y otros, 1979; Nicolau y otros,1987; Wong y otros, 1980; Kaneda y otros, 1989; Kato y otros, 1991); mediante bombardeo con microproyectiles (solicitudes del PCT núm. WO 94/09699 y 95/06128; patentes de los EE. UU. núm. 5,610,042; 5,322,783, 5,563,055, 5,550,318, 5,538,877 y 5,538,880); por agitación con fibras de carburo de silicio (Kaeppler y otros, 1990; patentes de los EE. UU. núm. 5,302,523 y 5,464,765); por transformación mediada por Agrobacterium (patentes de los EE. UU. núm. 5,591,616 y 5,563,055); o por transformación de protoplastos mediada por PEG (Omirulleh y otros, 1993; patentes de los EE. UU. núm. 4,684,611 y 4,952,500); por absorción de ADN mediada por desecación/inhibición (Potrykus y otros, 1985). Mediante la aplicación de técnicas como estas, orgánulo(s), célula(s), tejido(s) u organismo(s) puede(n) transformarse de forma estable o transitoria.

G. Componentes lipídicos y fracciones

En determinadas modalidades, la presente invención se refiere a composiciones que comprenden uno o más lípidos asociados con un ácido nucleico, una molécula de aminoácido, tal como un péptido, u otro compuesto de molécula pequeña. En cualquiera de las modalidades discutidas en la presente descripción, la molécula puede ser un polipéptido de poxvirus o un modulador de polipéptido de poxvirus, por ejemplo, un ácido nucleico que codifica todo o parte de un polipéptido de poxvirus, o alternativamente, una molécula de aminoácido que codifica todo o parte de un modulador de polipéptidos de poxvirus. Un lípido es una sustancia característicamente insoluble en agua y extraíble con un solvente orgánico. Los compuestos que aquellos describen específicamente en la presente descripción se entienden por un experto en la técnica como lípidos, y se incluyen en las composiciones y métodos de la presente invención. Un componente lipídico y un no lipídico pueden unirse entre sí, ya sea covalentemente o no covalentemente.

Un lípido puede ser de origen natural o sintético (es decir, diseñado o producido por el hombre). Sin embargo, un lípido suele ser una sustancia biológica. Los lípidos biológicos se conocen bien en la técnica e incluyen, por ejemplo, grasas neutras, fosfolípidos, fosfoglicéridos, esteroides, terpenos, lisolípidos, glicoesfingolípidos, glucolípidos, sulfátidos, lípidos con éter y ácidos grasos enlazados a éster y lípidos polimerizables y combinaciones de estos.

Una molécula de ácido nucleico o de aminoácidos, tal como un péptido, asociada con un lípido puede dispersarse en una solución que contenga un lípido, disolverse con un lípido, emulsionarse con un lípido, mezclarse con un lípido, combinarse con un lípido, enlazarse covalentemente a un lípido, contenerse como una suspensión en un lípido o asociarse de cualquier otra manera con un lípido. Una composición asociada a lípidos o lípidos/poxvirus de la presente invención no se limita a ninguna estructura particular. Por ejemplo, también pueden intercalarse simplemente en una solución, posiblemente con formación de agregados que no son uniformes ni en tamaño ni en forma. En otro ejemplo, pueden estar presentes en una estructura de dos capas, como micelas, o con una estructura "colapsada". En otro ejemplo no limitante, también se contempla un complejo lipofectamina (Gibco BRL)-poxvirus o Superfect (Qiagen)-poxvirus.

En ciertas modalidades, una composición de lípidos puede comprender aproximadamente 1 %, aproximadamente 2 %, aproximadamente 3 %, aproximadamente 4 % aproximadamente 5 %, aproximadamente 6 %, aproximadamente 7 %, aproximadamente 8 %, aproximadamente 9 %, aproximadamente 10 %, aproximadamente 11 %, aproximadamente 12 %, aproximadamente 13 %, aproximadamente 14 %, aproximadamente 15 %, aproximadamente 16 %, aproximadamente 17 %, aproximadamente 18 %, aproximadamente 19 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 21 %, aproximadamente 22 %, aproximadamente 23 %, aproximadamente 24 %, aproximadamente 25 %, aproximadamente 26 %, aproximadamente 27 %, aproximadamente 28 %, aproximadamente 29 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 31 %, aproximadamente 32 %, aproximadamente 33 %, aproximadamente 34 %, aproximadamente 35 %, aproximadamente 36 %, aproximadamente 37 %, aproximadamente 38 %, aproximadamente 39 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 41 %, aproximadamente 42 %, aproximadamente 43 %, aproximadamente 44 %, aproximadamente 45 %, aproximadamente 46 %, aproximadamente 47 %, aproximadamente 48 %, aproximadamente 49 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 51 %, aproximadamente 52 %, aproximadamente 53 %, aproximadamente 54 %, aproximadamente 55 %, aproximadamente 56 %, aproximadamente 57 %, aproximadamente 58 %, aproximadamente 59 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 61 %, aproximadamente 62 %, aproximadamente 63 %, aproximadamente 64 %, aproximadamente 65 %, aproximadamente 66 %, aproximadamente 67 %, aproximadamente 68 %, aproximadamente 69 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 71 %, aproximadamente 72 %, aproximadamente 73 %, aproximadamente 74 %, aproximadamente 75%, aproximadamente 76 %, aproximadamente 77 %, aproximadamente 78 %, aproximadamente 79 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 81 %, aproximadamente 82 %, aproximadamente 83 %, aproximadamente 84 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 86 %, aproximadamente 87 %, aproximadamente 88 %, aproximadamente 89 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 %, aproximadamente 100 %, o cualquier intervalo derivado de estos, de un lípido particular, tipo de lípido o componente no lipídico, tal como un fármaco, proteína, azúcar, ácidos nucleicos, u otro material descrito en la presente descripción o como se conocería por un experto en la técnica. En un ejemplo no limitante, una composición de lípidos puede comprender de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 20 % de lípidos neutros y de aproximadamente un 33 % a aproximadamente un 34 % de un cerebrósido y aproximadamente un 1 % de colesterol. En otro ejemplo no limitante, un liposoma puede comprender de aproximadamente un 4 % a aproximadamente un 12 % de terpenos, en donde aproximadamente un 1 % de la micela es específicamente licopeno, con de aproximadamente un 3 % a aproximadamente un 11 % del liposoma que comprende otros terpenos; y de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 35 % de fosfatidilcolina y aproximadamente un 1 % de un fármaco. Por tanto, se contempla que las composiciones lipídicas de la presente invención puedan comprender cualquiera de los lípidos, tipos de lípidos u otros componentes en cualquier combinación o intervalo de porcentaje.

IV. Ejemplos

Los siguientes ejemplos se proporcionan con el fin de ilustrar diversas modalidades de la invención y no pretenden limitar la presente invención de ninguna manera. Un experto en la técnica apreciará fácilmente que la presente invención está bien adaptada para llevar a cabo los objetos y obtener los fines y ventajas mencionados, así como aquellos objetos, fines y ventajas inherentes a la presente descripción. Los presentes ejemplos, junto con los métodos descritos en la presente descripción, son actualmente representativos de las modalidades preferidas, son ejemplares, y no pretenden ser limitaciones en el alcance de la invención.

Se realizaron estudios preclínicos en modelos murinos de HCC para evaluar los mecanismos de cierre vascular inducido por JX-594 y la posterior reperfusión. Se evaluó el potencial de sorafenib para bloquear la reperfusión. En un ensayo clínico de fase 2, los pacientes con HCC se trataron con JX-594 mediante inyección intratumoral cada dos semanas durante tres ciclos. El tamaño del tumor, el flujo sanguíneo y la densidad se evaluaron mediante (dce)-MRI mejorada con contraste dinámica y DW-MRI al inicio del estudio, el día 5 y la semana 8. Dos pacientes con reperfusión parcial del tumor en la semana 8 iniciaron la terapia estándar con sorafenib y se realizaron escaneos secuenciales con DCE-MRI.

Se demostró la interrupción vascular del tumor en un modelo de CHC murino después de la administración IT o IV de JX-594. La interrupción vascular dependía de la replicación viral; la expresión de mGM-CSF a partir del virus y la infiltración de neutrófilos mejoraron el efecto. Se demostró una nueva perfusión del borde del tumor a lo largo del tiempo y se correlacionó con niveles aumentados de VEGF en el tumor. La terapia adyuvante con sorafenib inhibió la angiogénesis y condujo a una eficacia antitumoral significativamente mejorada sobre cualquiera de los agentes solos. Los pacientes con HCC tratados con JX-594 demostraron necrosis e interrupción vascular del tumor agudo en tumores tanto inyectados como no inyectados dentro del hígado. La terapia adyuvante con sorafenib después de la evaluación de la semana 8 condujo a una necrosis tumoral dramática y duradera y a una interrupción vascular en dos pacientes. Las revisiones de las resonancias magnéticas seriadas de pacientes con HCC que recibieron sorafenib solo demostraron que estos hallazgos eran específicos de los pacientes tratados previamente con JX-594.

Debido a que los tumores tienen una alta tasa de mutación y por lo tanto pueden tener un alto grado de heterogeneidad que conduce a respuestas mixtas a cualquier terapia, puede ser útil combinar ciertos agentes anticancerígenos con mecanismos de acción alternativos. Para determinar si la combinación de la terapia con virus oncolíticos con sorafenib era segura y efectiva, se realizaron experimentos preclínicos in vitro e in vivo.

Ejemplo 1 de referencia

Datos in vitro - sorafenib inhibe jx-594

Se probó JX-594 en combinación con sorafenib en la línea de células de HCC humano PLC/PRF/5. La línea celular de HCC humano PLC/PRF/5 admite la replicación de JX-594. Sin embargo, cuando se adicionó sorafenib (10 pM) ya sea 2 horas antes; durante; o 2 horas después de la infección con JX-594, el tamaño de la explosión se redujo hasta 100 veces (Figura 1). JX-594 también se probó en combinación con sorafenib en la línea celular de cáncer de ovario humano A2780 y la línea de HCC humana HepG2.

Cultivo celular y preparación de sorafenib: Las líneas celulares de tumores humanos A2780 (ovárico) y HepG2 (HCC) se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC). Las células se cultivaron en DMEM complementado con FBS al 10 % y pen/strep al 1 %. Las células se cultivaron a 37 °C en una incubadora humidificada que contiene 5 % de CO². Para uso in vitro, sorafenib se disolvió en DMSO (Sigma-Aldrich Corp.) a una concentración de 1 mg/ml y se diluyó adicionalmente hasta la concentración final apropiada (100 ng/ml, 250 ng/ml, 500 ng/ml, 1000 ng/ml y 2500 ng/ml) en DMEM con suero fetal bovino al 10 %. El DMSO en la solución final no superó el 0,2 % (v/v).

Formación de placas, ensayo de explosión y viabilidad celular: se sembraron células A2780 o HepG2 en placas de 6 pocillos a 4 X 105 células/pocillo y se dejaron durante la noche. Después, se adicionaron 100 pfu de JX-594 a cada pocillo y se dejó infectar durante 2 horas. Al final de la infección, se retiró el medio y se adicionó una capa de DMEM de carboximetilcelulosa al 3 % que contenía sorafenib a concentraciones finales de 0, 0,1, 0,25, 0,5, 1,0 y 2,5 pg/mL. Tres días después, las placas se tiñeron con cristal violeta y se contaron las placas. Paralelamente, para evaluar la replicación (tamaño de explosión), se prepararon placas de 6 pocillos como anteriormente. En lugar de teñir y contar las placas, se recolectaron células de cada pocillo para la purificación del virus. Las células se lisaron mediante 3 rondas de congelación y descongelación seguidas de sonicación, antes de que se adicionaran diluciones en serie del lisado viral crudo a las células A2780 para titular el virus mediante ensayo en placa. Además, para evaluar los efectos directos de sorafenib sobre la viabilidad celular, las células se sembraron en placas de 96 pocillos y se incubaron solo con sorafenib. La viabilidad celular se determinó mediante un ensayo colorimétrico basado en la reducción mediada por células vivas de la sal de tetrazolio a cromágeno de formazán (Cell Counting Kit-8, Donjindo Laboratories, Kumamoto, Japón).

Resultados: las concentraciones de sorafenib que están por debajo de los niveles citotóxicos pueden inhibir el crecimiento viral y la replicación en las líneas de células tumorales A2780 y HEPG2 (Figura 2). Experimentos adicionales mostraron que sorafenib inhibía la replicación de JX-594 en otras líneas de HCC humano, que incluyen SNU423, SNU398, SNU475, SNU449, SNU387 y la línea de osteosarcoma humano U2OS.

El sorafenib es un inhibidor multiquinasa y es capaz de inhibir la vía de transducción de la señal Ras (RAS/RAF/MEK/ERK) mediante la inhibición de las serina/treonina quinasas intracelulares Raf-1 y B-Raf. La activación de la ruta Ras/Raf ocurre comúnmente en el cáncer y conduce a la activación transcripcional de genes que responden a E2F, incluidos genes de fase S como la timidina quinasa (TK) (Hengstschlager y otros, 1994). JX-594 es un virus vaccinia atenuado por inactivación del gen viral TK. Esta mutación se diseñó para proporcionar la replicación selectiva en células con altos niveles de TK celular (es decir, células cancerosas con vías activadas anormalmente que conducen a la activación constitutiva de E2F). Si bien sorafenib y JX-594, por lo tanto, se diseñaron para atacar células cancerosas con la vía Ras activada, la dosificación simultánea de las terapias in vitro puede conducir a la inhibición de la replicación viral que depende de una vía Ras activada.

Ejemplo inventivo y de referencia 2

Datos in vivo - sorafenib mejora a jx-594

Contrariamente a los hallazgos in vitro, los modelos de eficacia preclínicos mostraron que la combinación de sutent (inventivo) o sorafenib (referencia) y JX-594 muestra una mejor eficacia que cualquier agente solo.

Sorafenib mejora la actividad de JX-594 contra tumores primarios CT26 murinos in vivo: la combinación de JX-594 y sorafenib se probó en un modelo murino inmunocompetente de células tumorales colorrectales CT26 implantadas subcutáneamente. Ratones Balb/c se inyectaron con 3x105 células CT26 subcutáneamente y después de 11 días, el tratamiento se inició con Sorafenib solo (10 mg/kg p.o. diario durante 2 semanas), JX-594 solo (108 pfu IV 3 veces por semana durante 1 semana), o en combinación (JX594 antes de Sorafenib, o Sorafenib antes de JX594) (n = 4 por grupo) (Figura 3, panel superior). Los animales de control recibieron solo PBS. Para este experimento, se usó una versión de JX-594 que expresa GM-CSF murino. Los tumores se midieron dos veces por semana hasta el punto final. Se muestran las proporciones de supervivencia de cada grupo de estudio en cada punto de tiempo posterior al tratamiento (Figura 3, panel central). Se muestran los volúmenes tumorales medios de cada grupo de estudio en cada punto de tiempo posterior al tratamiento (Figura 3, panel inferior). En comparación con JX-594 solo, JX-594 en combinación con sorafenib mejoró la supervivencia y redujo la carga tumoral. JX-594 en combinación con Sorafenib también redujo la carga tumoral en comparación con los animales que solo recibieron Sorafenib. El régimen preferido fue JX-594 seguido de sorafenib.

Sorafenib mejora la actividad de JX-594 contra nódulos pulmonares de melanoma B16 murino in vivo: La combinación de JX-594 y sorafenib se probó en un modelo murino inmunocompentente de tumores de melanoma B16. Se inyectaron ratones C57BL/6 con 3x105 células B16-F10-LacZ IV y se trataron con sorafenib solo (HD: 10 mg/kg, LD: 50 pg/kg p.o. diario durante 2 semanas), JX594 solo (107 pfu IV 3 veces por semana durante 1 semana), o en combinación (LD o HD sorafenib antes de JX-594 IV) (n = 5 por grupo) (Figura 4, panel superior). Al final del tratamiento, se sacrificaron los ratones y se fijaron y tiñeron los pulmones para detectar nódulos de superficie B16 (n = 5 por grupo). Se muestra el número medio de nódulos tumorales al final del estudio para cada grupo (Figura 4). En los 50 pg/kg p.o. En el grupo de Sorafenib JX-594, hubo una reducción significativa en los tumores B16 en comparación con el grupo de JX-594 solo o el grupo de Sorafenib solo.

Sorafenib mejora la actividad de JX-594 contra el modelo de xenoinjerto de HCC humano in vivo: se implantaron ratones SCID con tumores de xenoinjerto de carcinoma hepatocelular humano HepG2 subcutáneo. Una vez que los tumores alcanzaron un tamaño de aproximadamente 12-14 mm de diámetro máximo, los ratones se asignaron al azar a uno de seis grupos de tratamiento (n = 8 por grupo) (1) PBS solo, (2) sorafenib solo (dosis intraperitoneal diaria estándar con 400 pg), (3) JX-594 solo (tratamiento por vía intravenosa de 107 pfu por semana durante seis dosis en total), (4) el tratamiento simultáneo con JX-594 y sorafenib, (5) sorafenib seguido por JX-594 y (6) JX-594 (2 dosis) seguido de sorafenib.

El tamaño del tumor se midió mediante el uso de calibradores y los ratones se sacrificaron cuando la carga del tumor alcanzó el límite permitido por motivos éticos. El régimen de JX-594 seguido de sorafenib fue superior al control o al agente solo en términos de crecimiento tumoral y tiempo hasta la progresión del tumor. En adición, esta secuencia fue superior a sorafenib seguida de JX-594 y al tratamiento simultáneo (Figura 5).

A. Estudios preclínicos del modelo tumoral de HCC de interrupción vascular

Métodos experimentales, experimento piloto: El experimento piloto se diseñó para demostrar que JX-594 seguido de sorafenib induce una interrupción vascular aguda en el modelo HepG2. Se usaron tres grupos (n = 5 animales cada uno). El grupo 1 recibió solo PBS; el grupo 2 recibió una dosis única de 106 pfu JX-594 administrada intravenosamente (IV); y el grupo 3 recibió una dosis única de 106 pfu de JX-594 administrada intratumoralmente (IT). Se recolectaron muestras de suero en D5 para medir los niveles de VEGF y GM-CSF. Antes de la eutanasia, se inyectaron a los ratones microesferas fluorescentes para permitir la visualización de la perfusión del tumor. El tumor resecado se dividió en tres porciones para su análisis 1) Muestra ultracongelada para medir los niveles de proteína de VEGF 2) Preparación de la muestra incluida en OCT de secciones de tumor congeladas para visualizar microesferas y marcador vascular CD31 y 3) Muestra fijada con formalina/incluida en parafina para análisis histológico.

Métodos experimentales, estudio de vascularización: El estudio siguió los efectos a más largo plazo sobre la vascularización y evaluó la eficacia de JX-594 /- Sorafenib en el modelo HepG2. Se implantaron tumores HepG2 (línea HCC humana) subcutáneamente en ratones desnudos. Los animales se asignaron al azar a siete grupos de tratamiento (n = 5 por grupo) para probar los agentes solos y en combinación. Los grupos se trataron con JX-594 (106 pfu intratumoralmente, D1 y D8) y/o Sorafenib (400 g i.p., diario D15-D29) o PBS (control) en el programa detallado en la (Figura 6). Los tumores se midieron mediante el uso de calibradores dos veces por semana. Se recolectaron muestras de suero en D1, D8, D15, D22 y D29 para medir los niveles de VEGF y GM-CSF. Los ratones se sacrificaron en D22 o D35. Antes de la eutanasia, se inyectaron a los ratones microesferas fluorescentes para permitir la visualización de la perfusión del tumor. El tumor resecado se dividió en tres porciones para su análisis 1) Muestra ultracongelada para medir los niveles de proteína de VEGF 2) Preparación de la muestra incluida en OCT de secciones de tumor congeladas para visualizar microesferas y marcador vascular CD31 y 3) Muestra fijada con formalina/incluida en parafina para análisis histológico.

Resultados: Se contaron los vasos en las secciones tumorales de OCT teñidas para CD31; el número medio de vasos en 3 campos de 200 x se presenta en la (Figura 6). El sorafenib solo provocó una disminución transitoria del número de vasos (día 29), pero el recuento de vasos aumenta de nuevo con el tiempo (día 35). Sin embargo, en los animales que recibieron JX-594 seguido de sorafenib, el número de vasos en D35 fue menor en comparación con el grupo de sorafenib solo, lo que sugiere que la combinación tiene un efecto más duradero sobre la vasculatura del tumor.

B. Datos clínicos

JX-594 es el primer poxvirus oncolítico dirigido en su clase diseñado para replicarse selectivamente y destruir células cancerosas. La oncólisis directa más la expresión del factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) también estimula la interrupción vascular del tumor en modelos de tumores animales. Se evaluó la interrupción vascular del tumor después de la terapia con JX-594 en pacientes con carcinoma hepatocelular. En adición, se estudió la viabilidad de la terapia antiangiogénica adyuvante con sorafenib para prevenir la reperfusión después de JX-594 en estudios preclínicos y clínicos de carcinoma hepatocelular (HCC).

Métodos: Se realizaron estudios preclínicos en modelos murinos de HCC para evaluar los mecanismos del cierre vascular inducido por JX-594 y la posterior reperfusión. Se evaluó el potencial de sorafenib para bloquear la reperfusión. En un ensayo clínico de fase 2, los pacientes con HCC se trataron con JX-594 mediante inyección intratumoral cada dos semanas durante tres ciclos. El tamaño del tumor, el flujo sanguíneo y la densidad se evaluaron mediante (DCE)-MRI mejorada con contraste dinámica y DW-MRI al inicio del estudio, el día 5 y la semana 8. Cinco pacientes con reperfusión tumoral parcial en la semana 8 iniciaron el tratamiento estándar con sorafenib y se realizaron escaneos secuenciales con dce-MRI.

Hallazgos: la interrupción vascular del tumor se produce en el modelo de HHC murino después de la administración IT o IV de JX-594. La interrupción vascular dependía de la replicación viral; la expresión de mGM-CSF a partir del virus y la infiltración de neutrófilos mejoraron el efecto. La reperfusión del borde tumoral se demuestra a lo largo del tiempo y se correlaciona con niveles aumentados de VEGF en el tumor. La terapia adyuvante con sorafenib inhibió la angiogénesis y condujo a una eficacia antitumoral significativamente mejorada sobre cualquiera de los agentes solos. Los pacientes con HCC tratados con JX-594 demostraron necrosis e interrupción vascular del tumor agudo en tumores tanto inyectados como no inyectados dentro del hígado. La terapia adyuvante con sorafenib después de la evaluación de la semana 8 condujo a una necrosis tumoral dramática y duradera y una interrupción vascular en al menos tres pacientes. Las revisiones de MRI seriadas de 15 pacientes con HHC que recibieron sorafenib solo demostraron que estos hallazgos mejoraron y enriquecieron en pacientes tratados previamente con JX-594.

JX-594 causa bloqueo vascular agudo y necrosis en los tumores de HCC y sensibiliza a1HCC a la terapia posterior con sorafenib. Están indicados los ensayos controlados aleatorios de JX-594 seguido de sorafenib versus sorafenib solo. Los regímenes de terapia secuencial con poxvirus oncolíticos seguidos de agentes antiangiogénicos son prometedores.

Introducción: El poxvirus oncolítico dirigido JX-594 se replica selectivamente en células cancerosas, lo que resulta en la producción de progenie del virus, necrosis de células tumorales, liberación y diseminación dentro de los tejidos tumorales. JX-594 también se diseñó para expresar el transgén de GM-CSF con el fin de mejorar la inmunidad antitumoral que resulta de la oncólisis. La cadena principal del vaccinia es inherentemente selectiva para el tumor debido a la dependencia de la vía EGFR-ras y la resistencia del tumor a los interferones. El índice terapéutico inherente se amplifica por la deleción de TK; la replicación de JX-594 depende de la TK celular, que es impulsada a niveles elevados por las anomalías del ciclo celular en el cáncer. Los resultados de un ensayo clínico de fase 1 de JX-594 en pacientes con tumores hepáticos refractarios demostraron seguridad, eficacia y prueba de concepto mecanicista para la replicación de JX-594, diseminación sistémica y expresión de GM-CSF biológicamente activo. Los estudios preclínicos publicados recientemente demostraron que la terapia con virus oncolíticos también puede inducir la interrupción vascular aguda del tumor (Breitbach, y otros, 2007).

Los inventores contemplan que el poxvirus oncolítico JX-594 provoca la interrupción vascular del tumor y que la expresión de GM-CSF del virus mejora el reclutamiento y la activación de neutrófilos que conduce al aumento de los efectos antivasculares. Tras los estudios preclínicos, los inventores evalúan la interrupción vascular del tumor en pacientes con HCC, un tipo de tumor que es hipervascular. Los estudios preclínicos y clínicos demostraron la posibilidad de progresión posterior de un borde tumoral vascularizado.

Sorafenib es un inhibidor de multiquinasas oral aprobado para el tratamiento del carcinoma de células renales (RCC) y el carcinoma hepatocelular (HCC). Sorafenib inhibe los receptores de tirosina quinasa de superficie (VEGF-R, PDGF-R) y las serina/treonina quinasas intracelulares (Raf-1, B-Raf) y, por lo tanto, es un agente anticanceroso multimecanístico. El sorafenib puede afectar directamente a las células tumorales al inhibir la vía de señalización Ras (RAS/RAF/MEK/ERK) que se activa comúnmente en las células cancerosas y promueve la proliferación celular. El sorafenib también puede reducir el crecimiento tumoral a través de sus efectos antiangiogénicos que resultan de la inhibición de VEGF-R. Sutent (sunitinib/SU11248) es otra terapia contra el cáncer dirigida que inhibe las acciones del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y tiene efectos antiangiogénicos. Está aprobado para el tratamiento del carcinoma de células renales y el tumor del estroma gastrointestinal (GIST).

Los inventores contemplan que la reperfusión posterior a JX-594 se bloquea por el agente antiangiogénico sorafenib, que está aprobado para su uso en pacientes con HCC, o sutent que está aprobado para su uso en pacientes con RCC. Probamos esta hipótesis en modelos preclínicos de HCC y en cinco pacientes después de completar la terapia con JX-594.

C. Materiales y métodos

Aprobaciones y registro del estudio: El protocolo del estudio y los formularios de consentimiento informado se aprobaron por la FDA de EE. UU., la FDA de Corea, y los Institutional Review and Infection Control Committees del Pusan National University Hospital, Busan, Corea del Sur. El protocolo se registró a través de la red mundial en clinicaltrials.gov.

Selección de pacientes: Los pacientes firmaron el consentimiento informado, de acuerdo con las guías de Buenas Prácticas Clínicas (GCP). Los criterios de inclusión incluyeron tumor(es) hepatocelular(es) inyectable(s) no resecable(s) en el hígado (HCC primario) que progresaron a pesar del tratamiento con terapias estándar (refractario(s) al tratamiento), función hematopoyética normal (recuento de leucocitos >3, x 109 células/L, hemoglobina >100 g/L, recuento de plaquetas >60 x 109 células/L) y función orgánica (incluida creatinina < 132,6 pmol/L, aspartato aminotransferasa (AST)/alanina aminotransferasa (ALT) < 2,5 del límite superior normal, clase Child-Pugh A o B), esperanza de vida > 16 semanas, y estado funcional de Karnofsky (KPS) > 70. Los criterios de exclusión incluyeron tumores extrahepáticos, tumores > 10 cm de diámetro máximo, mayor riesgo de complicaciones de la vacunación (por ejemplo, inmunosupresión, eccema), tratamiento con agentes inmunosupresores o de tratamiento del cáncer en 4 semanas, ascitis rápidamente progresiva, embarazo o lactancia.

Fabricación y preparación de JX-594: JX-594 es una cepa de vaccinia de Wyeth modificada por inserción de los genes CSF2 y LacZ humanos en la región del gen TK bajo el control del promotor sintético temprano-tardío y promotor p7,5, respectivamente. Se generó material de ensayo clínico (CTM) de acuerdo con las pautas de Buenas Prácticas de Fabricación (GMP) en células Vero y se purificó mediante centrifugación en gradiente de sacarosa. La relación de genoma a pfu fue de aproximadamente 70:1. JX-594 se formuló en solución salina tamponada con fosfato con glicerol al 10 %, cloruro de sodio 138 mM a pH 7,4. Las pruebas de liberación de control de calidad del producto final incluyeron ensayos de esterilidad, endotoxina y potencia. La CTM también se probó para la concentración de proteína GM-CSF y fue negativa (límite inferior de detección <14000 pg/ml). Se diluyó JX-594 en solución salina normal al 0,9 % en un volumen equivalente al 25 % del volumen total estimado de los tumores objetivos.

procedimiento de tratamiento con JX-594, todos los pacientes, excepto 11301 (Paciente con Sutent): Los pacientes con HCC no resecable se aleatorizaron para recibir uno de los dos niveles de dosis (108 o 109 pfu). JX-594 se administró mediante inyección intratumoral guiada por imágenes mediante el uso de una aguja de inyección Quadrafuse de múltiples puntas en tumores aproximadamente esféricos y mediante una aguja PEIT (inyección percutánea de etanol, multiporos; HAKKO Medicals; Tokio, Japón) de calibre 21 en tumores con forma irregular. Los tumores (n=1-5) se inyectaron cada dos semanas durante tres ciclos. Los mismos tumores inyectados en el ciclo 1 se inyectaron posteriormente en cada ciclo.

Terapia con sorafenib y evaluación de la respuesta tumoral después de JX-594: los pacientes completaron el ensayo clínico IT de JX-594 después de 8 semanas en el estudio. Algunos pacientes (pacientes 1702, 1705, 1002, 1712, 1713) continuaron con la recepción del tratamiento estándar de sorafenib (400 mg dos veces diario p.o.). Los tumores en estos pacientes se siguieron por imágenes DCE-MRI mediante el uso de los mismos procedimientos que se usaron para evaluar la respuesta al tratamiento con JX-594.

Procedimiento de tratamiento con JX-594, los pacientes tratados por JX-594 IV seguido por JX-594 IT seguido por Sorafenib: los pacientes con HCC no resecable recibido dos dosis de JX-594 niveles (109 pfu). Para la primera dosis (día 1), se administró JX-594 mediante infusión intravenosa durante 60 minutos. Para la segunda y tercera dosis (día 8 y día 22), se administró JX-594 mediante una inyección intratumoral guiada por imágenes mediante el uso de una aguja de inyección Quadrafuse de múltiples puntas en tumores aproximadamente esféricos, o mediante una PEIT de calibre 21 (inyección percutánea de etanol, multiporos; HAKKO Medicals; Tokio, Japón) en tumores con forma irregular. A partir del día 25, los pacientes imitaron el tratamiento con sorafenib oral (400 mg dos veces diario p.o.). Los pacientes con tejido tumoral viable recibieron una inyección IT de JX-594 en la semana 12 (el tratamiento con sorafenib se interrumpió temporalmente 2-3 días antes, durante y 4-5 días después de esta inyección de refuerzo). Se realizaron estudios de imagen (CT, DECE MIR y/o PET-CT) al inicio del estudio, el día 25, la semana 6 y/o la semana 12 para evaluar la respuesta.

Tratamiento con JX-594, paciente 11301 (Paciente con Sutent): el paciente 11301 tenía un carcinoma de células renales que sufrió metástasis en el hígado. Los tumores hepáticos se trataron mediante inyección intratumoral mediante el uso de una aguja PEIT de calibre 21. La paciente recibió un total de 4 dosis de JX-594 (109 pfu/dosis) dado con tres semanas de diferencia (=4 ciclos). Después de cada dos ciclos de tratamiento, se realizó un escaneo de CT mejorada con contraste y la evaluación de la respuesta de la semana 6 se realizó mediante el uso de los criterios RECIST y Choi. El paciente experimentó enfermedad estable (SD) según los criterios RECIST y una respuesta Choi (42 % de disminución en HU) (Park y otros, 2008).

Tratamiento con Sutent: Posteriormente, el paciente 11301 progresó y pasó a recibir tratamiento con Sutent. El paciente recibió 3 ciclos de 50 mg/día (4 semanas con, 2 semanas sin), después 3 ciclos de 37,5 mg/día (4 semanas con, 2 semanas sin), y se mantuvo en un programa de 25 mg/día (2 semanas de tratamiento, 1-2 semanas de descanso).

Evaluación de la vascularización y la respuesta del tumor: se realizó DCE MRI (resonancia magnética dinámica con contraste) en el tamizaje (línea de base), el día 5 (opcional) y la semana 8. Para los pacientes que iban a recibir sorafenib, la DCE MRI se realizó 4 y/o 8 semanas después del inicio del tratamiento con sorafenib. DCE MRI evalúa el tamaño del tumor, la vascularización y la necrosis. La DCE MRI de tamizaje/línea base se usó como referencia a partir de la cual se determina el tiempo de progresión y las tasas de respuesta. La DCE MRI del día 5 (opcional) se usó para evaluar los efectos tempranos, como la interrupción vascular aguda. El estado de progresión del tumor y la respuesta del tumor a JX-594 se evaluaron radiológicamente mediante RECIST modificado y los criterios Choi modificados en la visita de la semana 8. La revisión independiente de las imágenes se realizó por radiólogos con experiencia en la evaluación del carcinoma hepatocelular en resonancias magnéticas. Para la evaluación de los tumores intrahepáticos, la proporción de sujetos con una respuesta antitumoral "completa" o "parcial" objetiva se determinó en función de RECIST modificado y una respuesta medida por los criterios Choi modificados (definidos como > 10 % disminución en la suma del diámetro más largo y/o disminución > 15 % en la intensidad promedio de la señal del tumor en la MRI).

Respuesta tumoral por RECIST modificado: Las modificaciones a RECIST para medir la respuesta tumoral y la progresión tumoral fueron las siguientes. Se midieron los nuevos tumores que se desarrollaron dentro del hígado durante o después del tratamiento. Su diámetro máximo se incluyó en la suma del diámetro máximo de todos los tumores intrahepáticos. Sin embargo, los nuevos tumores dentro del hígado no se consideraron evidencia de progresión per se. El fundamento de esta modificación de los criterios RECIST es el siguiente. La infección por JX-594 de una masa tumoral que originalmente era indetectable radiográficamente puede hacer que el tumor parezca nuevo y/o progresivo debido a inflamación y/o necrosis; sin embargo, estos cambios no representan una verdadera progresión tumoral. En adición, debido a que el objetivo del tratamiento era controlar la carga tumoral intrahepática, se anotaron (y registraron por ubicación) los nuevos tumores detectados extrahepáticamente en el abdomen, pero no se incluyeron en la determinación de la respuesta general. Por tanto, la respuesta o progresión del tumor se determinó mediante la suma de los diámetros más largos de los tumores intrahepáticos medibles y se determinó como sigue: respuesta completa (CR): desaparición de todos los tumores. Respuesta parcial (RP): Al menos un 30 % de disminución en la suma de la LD de tumor(es), al tomar como referencia la LD suma de la línea de base. Enfermedad progresiva (PD): al menos un 20 % de aumento en la suma de la LD de tumor(es), al tomar como referencia la LD suma de la línea de base. Enfermedad estable (SD): Ni contracción suficiente para calificar para PR ni aumento suficiente para calificar para PD, al tomar como referencia la suma de LD inicial.

Respuesta del tumor por criterios Choi modificados: Los criterios de respuesta Choi tienen en cuenta los cambios en la densidad del tumor en adición al diámetro del tumor (en comparación con RECIST) y se publicaron datos que respaldan su utilidad (Choi y otros, 2004). Los primeros estudios demostraron que los tumores de hígado tratados con JX-594 pueden desarrollar una necrosis interna significativa sin una disminución concomitante de tamaño, como se describió en los tumores del estroma gastrointestinal por Choi y otros (2004). Por lo tanto, también se midieron los tumores intrahepáticos y se evaluó la respuesta mediante el uso de un criterio Choi modificado. La modificación de los criterios es necesaria ya que la DCE MRI fue la modalidad de imagen empleada para medir la respuesta tumoral. Como la resonancia magnética no tiene un sistema estandarizado de mediciones de densidad de contraste similar a las unidades Hounsfield de CT, se realizó una comparación del porcentaje de mejora de los tumores al inicio y después del tratamiento mediante el uso de mediciones de intensidad de señal (SI) de región de interés (ROI). El tamizaje/DCE MRI inicial se usó como referencia a partir de la cual determinar la respuesta. Una respuesta según los criterios Choi modificados se definió como una disminución > 10 % en la suma del diámetro más largo de los tumores inyectados y/o una disminución > 15 % en la intensidad de la señal del tumor inyectado promedio en la MRI. La intensidad media de la señal de resonancia magnética (SI) se midió como un porcentaje del tumor.

Protocolos de imágenes de resonancia magnética: cada paciente se someterá a una resonancia magnética del abdomen, que incluye la resonancia magnética con contraste dinámico (DCE MRI), en los momentos prescritos por el protocolo. Las imágenes se realizarán en un sistema de MR de 1,5T o 3,0T mediante el uso de una bobina de matriz de cuerpo/torso colocada para una cobertura completa de imágenes del hígado con el paciente en posición supina. Puede colocarse una almohadilla dieléctrica sobre el hígado.

Típicamente, los parámetros de imagen se fijan entre las visitas de seguimiento de los pacientes. Si bien las secuencias a continuación enumeran un intervalo de parámetros aceptables, una vez que un paciente tuvo su escaneo inicial, estos parámetros deben emplearse en todos los escaneos posteriores. En adición, un paciente debe escanearse mediante el uso del mismo escáner de MRI.

Se iniciará una vía intravenosa antes del examen con el catéter de mayor calibre posible colocado en una vena periférica con solución salina normal en KVO. Alternativamente, para pacientes con líneas PICC o puertos de catéter venoso externo que son compatibles con inyectores de contraste automáticos, estos pueden usarse para acceso venoso. El contraste de quelato de gadolinio extracelular se administrará mediante inyección intravenosa en bolo a una dosis de 0,1 mmol/kg y a una velocidad de 2 cc/segundo mediante un inyector automático, seguida de una inyección inmediata de 20 cc de solución salina. Cualquier variación de la velocidad de inyección o dosis, o extravasación de contraste, se anotará en el CRF.

Protocolo de imagen para sistemas de MR de 1,5 tesla: Se realizarán las siguientes secuencias de pulsos:

Imágenes de precontraste: (1) Fase T1 opuesta y axial 2D: imágenes axiales de doble fase con eco de gradiente incoherente (SPGR) ponderado en T1 (TR: lo más corto posible; TE: 2.1 y 4.2; ángulo de giro (FA): 80-90 grados, grosor de corte 5-7 mm, espacio de corte máximo 1 mm; codificación de fase 160-192 interpolada a 256 x 256; campo de visión optimizado para el hábito corporal del paciente, 300-450 mm. (2) 2D FSE T2 Axial: TR: 3500-5000 mseg (efectivo); TE: 60-88 mseg; codificación de fase: 160-256 x 256; campo de visión optimizado para el hábito corporal del paciente, 300-450 mm; grosor del corte, 5-7 mm; espacio de corte máximo 1 mm; las imágenes deben realizarse con supresión de grasa. Se recomienda la activación respiratoria u otras técnicas de supresión del movimiento.

DCE-MRI: (3) Imágenes dinámicas 3D T1: se realizan un total de 6 conjuntos de esta secuencia: un precontraste, 4 poscontraste inmediato, y un conjunto de imágenes retrasadas de 5 minutos. Los parámetros para las adquisiciones 3D con supresión de grasa ponderadas en T1 son los siguientes: TR = 2,0-4,5 mseg; TE = 1,42-2,0 mseg; ángulo de giro, 8-12°; codificación de fase 160-192 interpolada a 512 x 512; campo de visión optimizado para el hábito corporal del paciente, 300-450 mm; grosor de la sección interpolada, 1,5-3 mm; grosor de bloque para asegurar una cobertura completa del hígado.

Para determinar el momento de la primera adquisición con realce con contraste (fase arterial hepática), se administrará un bolo de prueba de 1-2 ml de material de contraste y el tiempo de circulación (tiempo hasta el realce arterial máximo) se establecerá como el tiempo de retraso de la adquisición. Alternativamente, si se dispone de un software de cronometraje automático para determinar la mejora de la fase arterial, también puede usarse. Las 4 secuencias dinámicas posteriores al contraste se realizarán con un intervalo de tiempo de 40 segundos entre cada adquisición. También se adquirirá una secuencia retardada adicional 5 minutos después de la inyección (para un total de 5 secuencias posteriores al contraste). Todas las adquisiciones se realizarán durante la respiración suspendida, ya sea inspiración o espiración según las prácticas institucionales. El sistema no sufre ningún cambio de ajuste entre las secuencias de pre y poscontraste. Cualquier variación de este protocolo de imágenes se anotará en el CRF.

Protocolo de imagen para sistemas de MR de 3.0 tesla: Se realizarán las siguientes secuencias de pulsos:

Imágenes de precontraste: (1) T1w 2D Axial en fase (IP) y fuera de fase (OP): eco de gradiente incoherente de fase dual (SPGR). FOV: optimizado para el hábito corporal, 300-450 mm; TR: mínimo para cubrir el hígado; TE: TE's por defecto en fase y fase opuesta; Ángulo de volteo: 80-90 grados; Grosor del corte: 5-7 mm; Espacio: 0-1 mm (se prefiere un espacio de 0 mm); Matriz de frecuencia: 320; Codificación de fase: 160-224, interpolada a 512 x 512; Sat. grasas: apagado; Ancho de banda: configuración predeterminada.

(2) T2w 2D Axial SSFSE. FOV: use el mismo que en (1) anterior; TR: TR efectivo más corto para obtener imágenes del hígado completo; TE efectivo: 60-88 mseg; Grosor de corte: use lo mismo que (1); Espacio: use el mismo (1); Matriz de frecuencia: 320; Codificación de fase: 160-224, interpolada a 512 x 512; Sat. grasas: apagado.

(3) T2w 2D Axial FSE. En este caso, puede usarse la respiración libre con activación respiratoria o la formación de imágenes de apnea. Sin embargo, se estandarizará dentro de los exámenes de un paciente. Por ejemplo, si un paciente se escanea al inicio del estudio mediante el uso de activación respiratoria, todos los exámenes de MR posteriores usarán activación respiratoria con esta secuencia. Si se usa la activación respiratoria, se debe emplear una longitud de tren de eco de 12-20, al igual que las excitaciones/adquisiciones suficientes para una señal a ruido óptima. Si se realiza una imagen en T2 en apnea, utilice una longitud de tren de eco de 24-32 y 1 adquisición. FOV: use lo mismo que (1) anterior. TR efectivo: 3500-5000; Grosor de corte: use lo mismo que (1); Espacio: use lo mismo que (1); Matriz de frecuencia: 320; Codificación de fase: 160-224, interpolada a 512 x 512; Sat. grasas: encendido. DCE MRI

(4) Eco de gradiente incoherente axial T1w 3D (SPGR). FOV: use el mismo que en (1) anterior; TR: 2-5 mseg; TE: 1,4-2,5; Ángulo de volteo: 8-15; Grosor de corte: 1,5-3 mm interpolado; Grosor de bloque: cubre todo el hígado; Matriz de frecuencia: 288-320; Codificación de fase: 160-224, interpolada a 512 x 512; Sat. grasas: encendido. Número de escaneos: 5 en total (1 escaneo previo y 4 poscontraste, seguido de un quinto escaneo 5 minutos después de la inyección de contraste). Todas las exploraciones realizadas durante la respiración suspendida, ya sea al final de la espiración o al final de la inspiración según la práctica institucional estándar.

D. Datos de ensayos clínicos: Día 5 interrupción vascular en tumores y tumores de carcinoma colorrectal después del tratamiento con jX-594

El cierre vascular agudo medido por perfusión CT se observó previamente en tumores tratados directamente con JX-594 mediante inyección intratumoral (Liu y otros, 2008). Los inventores aplicaron el análisis DCE MRI para seguir la reducción en la perfusión de tumores para seguir el curso de la interrupción vascular y la necrosis tumoral en respuesta al tratamiento con JX-594. De los 16 pacientes inscritos en un nuevo ensayo clínico con escaneo de DCE-MRI opcional el día 5, 13 recibieron tales escaneos y hay ejemplos adicionales de interrupción vascular en pacientes con carcinoma hepatocelular (HCC) (Figura 7).

En los ejemplos de HCC analizados previamente, parecía que era necesaria la inyección directa del tumor para provocar una reducción de la perfusión del tumor (Figura 1, Liu y otros, 2008). A partir de estos datos, no se predijo que se produciría una interrupción vascular en tumores no inyectados en respuesta a la aplicación a distancia de JX-594. Ahora, por primera vez, los inventores muestran que no es necesario inyectar todos los tumores para tener esta respuesta, y que los tumores distantes, no inyectados, también pueden mostrar interrupción vascular (Figuras 8 y 9).

Además, los inventores demuestran que JX-594 puede causar interrupción vascular en tumores que no son HCC como se evidencia en un paciente con metástasis hepáticas de carcinoma colorrectal (CRC), un tipo de tumor considerado menos bien vascularizado que el HCC (Figura 9), y que por lo tanto es potencialmente menos probable que sufra cambios vasculares.

Ejemplo 1703: El paciente 1703 tenía carcinoma hepatocelular y se inscribió en un ensayo clínico de fase 2 de JX-594. JX-594 se inyectó en un solo tumor de gran tamaño (109 pfu/dosis). Después de cinco días, la DCE MRI mostró una interrupción vascular aguda (paneles superiores en blanco y negro) (Figura 9). Los paneles inferiores muestran un ejemplo de análisis de segmentación usado para cuantificar el grado de interrupción vascular/necrosis tumoral (paneles inferiores) (Figura 7).

Ejemplo 1708: El paciente 1708 tenía carcinoma hepatocelular, con múltiples tumores presentes en el hígado y se inscribió en un ensayo clínico de fase 2 de JX-594. JX-594 se inyectó en algunos, pero no todos los tumores de hígado (dosis total de 108 pfu/dosis). Después de cinco días, DCE MRI mostró necrosis aguda / interrupción vascular en tumores hepáticos inyectados y no inyectados. La Figura 8 muestra dos planos de visión, que incluyen imágenes antes y después del tratamiento con JX-594.

Ejemplo 0204: El paciente 0204 tenía carcinoma colorrectal, con metástasis presentes en el hígado, pulmón y ganglios linfáticos y se inscribió en un ensayo clínico de fase 2 de JX-594. JX-594 se inyectó en algunas, pero no todas de las metástasis hepáticas (dosis total de 109 pfu/dosis). Después de cinco días, DCE MRI mostró necrosis aguda / interrupción vascular en tumores hepáticos inyectados y no inyectados. (Figura 9)

E. Datos de ensayos clínicos: JX-594 mejora la terapia anti-VEGF con sutent y sorafenib

Cinco pacientes que mostraron reperfusión en la semana 8 después de completar el tratamiento con JX-594 recibieron posteriormente una dosis estándar de sorafenib (400 mg dos veces al día). Se observaron respuestas Choi mejoradas (Tabla A). Estas respuestas se mejoraron con respecto a cualquier respuesta Choi inicial al tratamiento con JX-594 solo (Figuras 11, 12, y 13)

Tabla A: Respuesta Choi mejorada en pacientes tratados con JX-594 seguido de sorafenib.

Ejemplo Sorafenib solo "Grupo de control" (Figura incluida): Históricamente, la tasa de respuesta RECIST al sorafenib solo es del 1-2 % (Llovet y otros, 2008; Cheng y otros, 2009). Para un grupo de control local evaluado según los criterios de Choi, se evaluó la respuesta Choi a los pacientes con HCC que no recibieron JX-594, pero que recibieron sorafenib. En el hospital donde se trató a 4 de los 5 pacientes con JX-594, otros 26 pacientes recibieron sorafenib en el mismo período. 7 pacientes murieron antes de la evaluación de la respuesta y se evaluó la respuesta Choi a 15 pacientes. Solo 2 de los pacientes que solo recibieron sorafenib mostraron una respuesta Choi+ (26 en total; 15 evaluados para la respuesta Choi). Cabe señalar que ambos pacientes recibieron radioterapia junto con la terapia de sorafenib. En comparación, los dos pacientes que recibieron la terapia con JX-594 antes de la terapia con sorafenib durante este período tuvieron una respuesta Choi+ (Figura 10), una mejora sorprendente y extraordinaria en el efecto del sorafenib sobre los tumores.

En un ensayo clínico de sorafenib solo que usó escaneos de MRI para evaluar la necrosis tumoral, algunas masas hepáticas mostraron necrosis tumoral central, con un aumento moderado de la necrosis tumoral media del 9,8 % al inicio al 27 % después de varios ciclos de tratamiento (Abou-Alfa y otros, 2006).

Ejemplo 1702: Paciente 1702 tenía carcinoma hepatocelular y se inscribió en un ensayo clínico de fase 2 para JX-594 y recibió tres dosis intratumoral de JX-594 (109 pfu/dosis dada dos semanas de diferencia). Este paciente no fue evaluable para la respuesta a JX-594 mediante el uso de los criterios Choi modificados; sin embargo, los escaneos de la semana 8 mostraron enfermedad estable (SD) en los tumores inyectados, pero enfermedad progresiva (PD) debido a la aparición de nuevos tumores mediante el uso de los criterios RECIST modificados. Por lo tanto, el paciente 1702 recibió un ciclo estándar de tratamiento con sorafenib durante 8 semanas (200 mg dos veces al día p.o.). Las imágenes por DCE MRI tomadas a las 4 y 8 semanas después del inicio del tratamiento con sorafenib mostraron necrosis tumoral aguda. La Figura muestra tres planos diferentes, con imágenes a la izquierda de 4 semanas después del tratamiento con Sorafenib e imágenes a la derecha de 8 semanas después del tratamiento con Sorafenib (Figura 11).

Ejemplo 1705: El paciente 1705 tenía carcinoma hepatocelular y se inscribió en un ensayo clínico de fase 2 de JX-594. Cinco días después de la primera dosis de JX-594, una marcada reducción en la perfusión por DCE MRI confirmó que ocurrió una interrupción vascular en los tumores (paneles superiores). Después de completar la administración JX-594 (tres dosis intratumorales de 108 pfu/dosis dada dos semanas de diferencia), los escaneos de la semana 8 mostraron una respuesta por criterios modificados Choi (-36 %), pero la enfermedad progresiva (PD) por criterios RECIST modificados. Por lo tanto, el paciente 1705 pasó a recibir un ciclo estándar de tratamiento con sorafenib durante 4 semanas (400 mg dos veces al día p.o.). Los escaneos de DCE MRI tomados a las 4 semanas mostraron necrosis tumoral aguda (panel inferior derecho) (Figura 12, Figura 15, Figura 16))

Ejemplo 1712: El paciente 1712 tenía carcinoma hepatocelular y se inscribió en un ensayo clínico de fase 2 de JX-594. Después de completar la administración JX-594 (tres dosis intratumorales de 109 pfu/dosis dada dos semanas de diferencia), los escaneos de la semana 8 mostraron una respuesta por criterios modificados Choi (-33 %), pero la enfermedad progresiva (PD) por criterios RECIST modificados. El paciente 1712 recibió un ciclo estándar de tratamiento con sorafenib durante 4 semanas (400 mg dos veces al día p.o.). Los escaneos de DCE-MRI tomados a las 4 semanas mostraron necrosis tumoral aguda. (Figura 13)

Ejemplo 11301, Paciente con Sutent: Sutent es otra terapia contra el cáncer dirigida aprobada para el carcinoma de células renales (RCC) que inhibe la actividad de VEGF y la angiogénesis. El paciente 11301 tenía RCC con metástasis en el hígado y se inscribió en un ensayo clínico de fase 1 de JX-594 para el tratamiento de tumores hepáticos. Después de completar 2 cursos de administración JX-594 (dosis intratumorales de 109 pfu/dosis dada tres semanas de diferencia), la evaluación de la semana 6 mostró estabilización de la enfermedad por RECIST. El paciente recibió dos ciclos más de tratamiento con JX-594, pero una masa hepática y una masa abdominal grande (14 cm) progresaron. Por lo tanto, el paciente 1705 pasó a recibir terapia con sutent. El pronóstico para el paciente fue malo debido a la baja hemoglobina y la extensión de las metástasis hepáticas (Motzer y otros, 2006). Sorprendentemente, siguió una respuesta completa en todos los tumores del paciente (Figura 14). El escaneo de PET de cuerpo entero no mostró ninguna señal. La supervivencia posterior al tratamiento con JX-594 es de 3 años o más (el paciente aún está vivo). En comparación, la tasa histórica de respuesta completa del CCR al sutent solo en tumores mayores de 10 cm es del 0 %. Menos del 5 % de los pacientes con CCR con mal pronóstico tienen una supervivencia de 3 años.

Ejemplo Paciente JX16-HCC-03, IV+IT+IT+Sorafenib: El paciente JX16-HCC-03 tenía carcinoma hepatocelular y se inscribió en un ensayo clínico de fase 2 de JX-594. Después de completar la administración de JX-594 (una dosis intravenosa y dos intratumorales), el paciente recibió sorafenib. Los escaneos de DCE-MRI mostraron pérdida de perfusión 10 días después del inicio de sorafenib en un tumor extrahepático no inyectado (Figura 18)

Referencias

Las siguientes referencias, en la medida en que proporcionen procedimientos ejemplares u otros detalles complementarios a los expuestos en la presente descripción, se enumeran más abajo.

Patente de os EE. UU. núm. 4,554,101

Patente de os EE. UU. núm. 4,683,202

Patente de os EE. UU. núm. 4,684,611

Patente de os EE. UU. núm. 4,952,500

Patente de os EE. UU. núm. 5,073,627

Patente de os EE. UU. núm. 5,302,523

Patente de os EE. UU. núm. 5,322,783

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Patente de os EE. UU. núm. 5,580,859

Patente de os EE. UU. núm. 5,589,466

Patente de os EE. UU. núm. 5,591,616

Patente de os EE. UU. núm. 5,610,042

Patente de os EE. UU. núm. 5,633,016

Patente de os EE. UU. núm. 5,641,515

Patente de os EE. UU. núm. 5,656,610

Patente de os EE. UU. núm. 5,702,932

Patente de os EE. UU. núm. 5,736,524

Patente de os EE. UU. núm. 5,739,169

Patente de os EE. UU. núm. 5,780,448

Patente de os EE. UU. núm. 5,789,215

Patente de os EE. UU. núm. 5,798,339

Patente de os EE. UU. núm. 5,801,005

Patente de os EE. UU. núm. 5,824,311

Patente de os EE. UU. núm. 5,824,348

Patente de os EE. UU. núm. 5,830,880

Patente de os EE. UU. núm. 5,846,225

Patente de os EE. UU. núm. 5,846,233

Patente de os EE. UU. núm. 5,846,945

Patente de os EE. UU. núm. 5,925,565

Patente de os EE. UU. núm. 5,928,906

Patente de os EE. UU. núm. 5,935,819

Patente de os EE. UU. núm. 5,945,100

Patente de os EE. UU. núm. 5,981,274

Patente de os EE. UU. núm. 5,994,624

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Claims (6)

REIVINDICACIONES

1. El inhibidor de tirosina quinasa antiangiogénico sunitinib para su uso en un método para tratar el cáncer metastásico en un sujeto, el sujeto se sometió previamente a una terapia con virus vaccinia, en donde el virus vaccinia es un virus vaccinia que expresa GM-CSF y carece de un gen de timidina quinasa funcional, en donde el inhibidor de tirosina quinasa antiangiogénico se administra como máximo 13 semanas después de la terapia con virus vaccinia, y en donde el virus vaccinia se administró intravascularmente, o tanto intravascularmente como intratumoralmente.

2. El inhibidor de tirosina quinasa antiangiogénico para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el inhibidor de tirosina quinasa antiangiogénico se administra después de determinar si el tumor experimenta revascularización mediante la formación de imágenes no invasivas del tumor.

3. El inhibidor de tirosina quinasa antiangiogénico para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el inhibidor de tirosina quinasa antiangiogénico es para administración al menos 5, 6, 7, u 8 semanas después de la administración del virus vaccinia.

4. El inhibidor de tirosina quinasa antiangiogénico para su uso de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la formación de imágenes no invasivas del tumor se selecciona entre formación de imágenes por resonancia magnética (MRI) y MRI mejorada con contraste dinámico (dce-MRI).

5. El inhibidor de tirosina quinasa antiangiogénico para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el cáncer metastásico es un cáncer metastásico del hígado.

6. El inhibidor de tirosina quinasa antiangiogénico para su uso de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el sujeto tiene carcinoma de células renales metastásico en el hígado.