KR20130026407A - 종양 용해 백시니아 바이러스 병용 암 치료요법 - Google Patents

Abstract

본 발명의 양태는 티미딘 키나제 결핍 백시니아 바이러스를 포함하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 백시니아 바이러스에 의한 치료 후 재관류에 대해 종양을 평가하고 재관류가 검출되는 경우 항-혈관형성 제제를 투여함을 포함한다.

Description

종양 용해 백시니아 바이러스 병용 암 치료요법{ONCOLYTIC VACCINIA VIRUS COMBINATION CANCER THERAPY}

본 발명은 일반적으로 종양학 및 바이러스학 분야에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은, 특히 암 치료에 적합한 종양 용해(oncolytic) 백시니아 바이러스를 포함하는, 폭스바이러스, 및 항-혈관형성 제제와 병용되는 이의 용도에 관한 것이다.

정상적인 조직 항상성은 세포 증식 및 세포 사멸의 고도로 조절된 과정이다. 세포 증식 또는 세포 사멸의 불균형은 암성 상태로 발전할 수 있다[참조: Solyanik et al ., 1995; Stokke et al ., 1997; Mumby and Walter, 1991; Natoli et al ., 1998; Magi-Galluzzi et al ., 1998]. 예를 들면, 자궁경부암, 신장암, 폐암, 췌장암, 결장직장암 및 뇌암은 발생할 수 있는 많은 암들 중의 단지 일부 예이다[참조: Erlandsson, 1998; Kolmel, 1998; Mangray and King, 1998; Mougin et al., 1998]. 사실, 암 발생률은 매우 높으며, 미국에서만 1년에 500,000명 이상이 암으로 인해 사망한다.

현재는, 많은 통상적인 암 종류의 치료를 위한 효과적인 대안이 거의 없다. 주어진 개체를 위한 치료 과정은 진단, 질환 발생 단계, 및 환자의 연령, 성별 및 전반적인 건강상태와 같은 요인에 따라 달라진다. 암 치료의 가장 통상적인 대안으로는 수술, 방사선치료요법 및 화학치료요법이 있다. 수술은 암의 진단 및 치료에서 중심적인 역할을 한다. 통상적으로, 수술적 접근법은 생검을 위하여, 그리고 암 성장을 제거하는데 요구된다. 하지만, 암이 전이되어 광범위하게 확산된 경우에는, 수술로 치료하기 어렵고 대안적 접근법을 선택해야 한다.

복제-선택성 종양 용해 바이러스는 암 치료에 대해 전망이 있다[참조: Kirn et al., 2001]. 이러한 바이러스는 직접적인 복제-의존성 및/또는 바이러스 유전자 발현-의존성 종양 용해 효과를 통해 종양 세포 사멸을 일으킬 수 있다[참조: Kirn et al., 2001]. 또한, 상기 바이러스는 숙주 내에서 세포-매개된 항종양성 면역 유도를 향상시킬 수 있다[참조: Todo et al., 2001; Sinkovics et al., 2000]. 이러한 바이러스를 조작하여 종양 내에서 치료학적 도입유전자(transgene)를 발현시켜 항종양 효능을 향상시킬 수도 있다[참조: Hermiston, 2000]. 하지만, 이러한 치료학적 접근법에도 주요 한계가 존재한다.

그러므로, 암 치료를 위해 보다 추가적인 치료요법이 요구된다. 종양 용해 바이러스의 사용은 개발을 위한 잠재적인 영역을 제공한다.

발명의 요약

시험관내 연구는 소라페니브 및 유사한 키나제 억제제가 배양된 세포주에 대해 병용되어 사용되는 경우 폭스바이러스, 백시니아 바이러스 및 특히 JX-594의 효과를 억제함을 지적하였다. 상기 시험관내 발견과는 반대로, 임상전 효능 모델은 소라페니브 및 JX-594의 병용이 단독의 제제보다 실제로 우수한 효능을 나타냄을 보여주었다. 따라서, 본 발명의 다양한 측면은 상기 예상치 않은 발견을, 폭스바이러스, 백시니아 바이러스 또는 JX-594 바이러스와 항-혈관형성 제제, 예를 들어, 키나제 억제제, 소라페니브, 수텐트(sutent) 또는 유사 화합물과의 병용을 사용하는 생체내 치료요법으로서 적용하는 것에 관한 것이다.

본 발명의 양태는 유효량의 항-혈관형성 제제를 투여함을 포함하는, 사전에 폭스바이러스 치료요법을 투여받은 피검체에서 암을 치료하기 위한 방법에 관한 것이다. 특정 측면에서, 치료되는 종양이 재-혈관형성을 진행하는 지가 관측된다. 추가의 측면에서, 폭스바이러스는 백시니아 바이러스이다. 여전히 추가의 측면에서, 백시니아 바이러스는 GM-CSF를 발현하는 백시니아 바이러스이다. 대안으로, 상기 백시니아 바이러스는 기능성 티미딘 키나제 유전자가 없다. 특정 측면에서, 상기 백시니아 바이러스는 JA-594이다.

특정 양태는, 항-혈관형성 치료요법, 특히 이 요법에 대해 환자가 실패하고, 내성이 발생하고 반응하지 않거나 부분적으로 반응하는 항-혈관형성 치료요법을 강화시키는 것에 관한 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "강화시킬 수 있는", "강화시키는", "강화시키는 치료요법", "치료학적 효과가 강화된다" 및 "치료학적 효과를 강화시키는"은 하기의 생리학적 효과중 하나 이상을 나타내는 것으로서 본원에서 정의된다: 치료학적 제제와 함께 부가적 또는 공동상승적 세포 독성 방식으로 작용함에 의한 치료학적 제제의 세포독성의 증가 또는 증진; 암 세포 또는 종양을 치료학적 제제의 항암 활성에 감작화시키는 것; 및/또는 치료요법의 항-혈관형성 효과 또는 치료요법에 대한 종양의 민감성을 복구시키는 것. 본 발명의 양태는 암 치료용 치료학적 제제로서 항-혈관형성 제제를 포함한다. 특정 측면에서, 항-혈관형성 치료요법을 강화시키는 방법은 폭스바이러스를, 항-혈관형성 치료요법의 치료학적 효능을 강화시키는 양으로 항-혈관형성 치료요법에 민감성이 아니거나 이에 대해 내성을 나타내거나 이에 충분히 반응하지 않는 환자에게 투여함을 포함한다. 추가의 측면에서, 항-혈관형성 치료요법은 키나제 억제제, 소라페니브, 수텐트 또는 유사 화합물이다. 본 발명의 방법은 또한 항-혈관형성 치료 후 내성이거나 반응하지 않거나 암 재발을 갖는 환자를 동정하는 것을 포함할 수 있다. 특정 측면에서, 감작화 양의 폭스바이러스, 백시니아 바이러스 또는 JX-594 바이러스는 항-혈관형성 치료요법(항-혈관형성 키나제 억제제, 소라페니브, 수텐트 또는 유사 화합물)에 내성이거나 관용성이거나 불감성인 환자에게 투여된다. 감작화 양은 담당의 또는 과학자에 의해 결정되는 바와 같이, 치료에 대해 치료학적 반응을 나타내지 않는 종양이 동일하거나 유사한 치료요법에 반응할 수 있도록 하기에 충분한 양이다.

"치료요법 내성" 암 및 종양은 항-혈관형성 암 치료요법에 내성이 된 암을 지칭한다. "치료요법 민감성" 암은 치료요법에 대해 반응한다(반응의 임상적 파라미터, 예를 들어, 종양 성장 감소, 종양 괴사, 종양 수축, 종양 혈관 폐쇄 등은 검출 또는 측정가능하다). 당업자는 일부 암이 특정 제제에 대해 치료요법 민감성이지만 다른 제제에는 민감성이 아님을 인지할 것이다.

특정 측면에서, 항-혈관형성 제제는 키나제 억제제이다. 다른 측면에서, 키나제 억제제는 Raf 키나제 경로를 억제한다. 특정 측면에서, 키나제 억제제는 소라페니브, 수텐트 또는 유사 항-혈관형성 키나제 억제제이다.

특정 양태는 종양이 재-혈관형성을 진행하는지의 여부를 결정함을 추가로 포함하는 방법에 관한 것이다. 특정 측면에서, 재-혈관형성은 종양의 비-침투성 이미지화, 예를 들어, 자기 공명 이미지화(MRI)에 의해 결정된다. 특정 측면에서, 자기 공명 이미지화는 역동적 조영 증강 MRI(DCE-MRI)이다.

방법의 특정 측면에서, 항-혈관형성 제제는 1회, 2회, 3회, 4회, 4회, 5회 이상 백시니아 바이러스를 투여한 후, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10주 이상 투여되고, 상기 투여 기간 모두 및 이 사이의 범위가 포함된다.

특정 측면에서, 종양은 뇌 종양, 두경부암 종양, 식도 종양, 피부 종양, 폐 종양, 흉선 종양, 위 종양, 결장 종양, 간 종양, 난소 종양, 자궁 종양, 방광 종양, 고환 종양, 직장 종양, 유방 종양, 신장 종양 또는 췌장 종양이다. 추가의 측면에서, 상기 종양은 간세포 암종 또는 결장직장 암이다.

특정 측면에서, 상기 방법은 먼저 피검체에게 폭스바이러스, 백시니아 바이러스 또는 JX-594 바이러스 치료요법을 투여함을 추가로 포함한다. 추가의 측면에서, 상기 바이러스 치료요법은 종양 매쓰로 주사하거나 혈관내 주사함에 의해 투여될 수 있다. 특정 측면에서, 상기 바이러스는 종양 혈관계 내로 주사된다. 특정 측면에서, 상기 바이러스 치료요법은 다중 양상, 예를 들어, 혈관내 및 종양내 등을 통해 투여될 수 있다.

특정 양태는 소라페니브를 종양으로 투여함을 포함하는, 환자의 간 또는 다른 기관내 간 종양 또는 전이성 종양을 치료하기 위한 방법에 관한 것이고, 이때, 상기 종양은 사전에 폭스바이러스, 백시니아 바이러스 또는 JX-594 바이러스로 치료되었다. 본 발명의 방법은 또한 종양이 재관류를 진행하는지의 여부를 관측함을 포함할 수 있다.

특정 측면은, 폭스바이러스, 백시니아 바이러스 또는 JX-594 바이러스 유효량을 투여하고 항-혈관형성 제제를 투여함을 포함하는, 원발성 또는 전이성 종양(여기서, 상기 전이성 종양은 이것이 치료되는 부위에서 원거리에 위치한 기관 또는 조직에서 기원하는 종양이다)인 간 종양을 치료하는 방법에 관한 것이다. 특정 측면에서, 상기 항-혈관형성 제제는 키나제 억제제일 수 있다. 추가의 측면에서, 키나제 억제제는 소라페니브 또는 수텐트이다.

특정 양태는 유효량의 폭스바이러스, 백시니아 바이러스 또는 JX-594 바이러스를 투여함을 포함하는, 간 종양을 치료하는 방법에 관한 것이고, 이때, 상기 종양은 재관류에 대해 평가될 수 있고, 상기 종양이 재관류를 진행하는 경우 소라페니브 치료요법을 위한 후보물인 것으로 결정될 수 있다.

여전히 추가의 측면에서, 본 발명은 (a) 재관류를 검출하기 위해 종양의 비-침투성 이미지화에 의해 항암 치료요법으로 처리된 종양을 평가하는 단계 및 (b) 유효량의 항-혈관형성 제제, 예를 들어, 소라페니브 또는 수텐트 또는 유사 키나제 억제제를 재관류가 검출되거나 의심되는 종양으로 투여하는 단계를 포함하는, 종양을 갖는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 이미지화는 JX-594 및 항-혈관형성 제제, 예를 들어, 소라페니브 또는 수텐트 또는 유사 키나제 억제제의 병용으로 종양을 치료하는데 요구되지 않는다.

JX-594는 암 세포에서 선택적으로 복제하고 상기 암 세포를 파괴하도록 디자인된 표적화된 종양 용해 폭스바이러스이다. 직접적인 종양 용해 및 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자(GM-CSF) 발현은 또한 종양내에서 종양 혈관 폐쇄를 자극한다.

본 발명의 특정 양태는 티미딘 키나제 결손 백시니아 바이러스의 투여를 포함하는 방법에 관한 것이다. 특정 측면에서, 상기 방법은 처리된 종양 또는 투여 부위로부터 원거리에 위치한 다른 종양내에서 세포의 종양 용해를 유도하기에 충분한 양으로 TK-결손, GM-CSF 발현, 복제-컴피턴트 백시니아 바이러스 벡터(예를 들어, JX-594)를 피검체에게 투여함을 포함한다. 백시니아 바이러스의 투여 후, 항-혈관형성 제제, 예를 들어, 항-혈관형성 티로신 키나제 억제제를 투여할 수 있다.

상기 티로신 키나제 억제제는 수니티니브(SU1 1248; Sutent?), SU5416, SU6668, 바탈라니브(PTK787/ZK222584), AEE788, ZD6474, ZD4190, AZD2171, GW786034, 소라페니브(BAY 43-9006), CP-547,632, AG013736, YM-359445, 게피티니브(Iressa?), 에를로티니브(Tarceva?), EKB-569, HKI-272, 및 CI-1033로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 소라페니브(Nexavar, Bayer)는 원발성 신장 암(후기 신장 세포 암종) 및 후기 원발성 간암(간세포 암종)의 치료를 위해 승인된 약물이다. 소라페니브는 수개의 티로신 단백질 키나제의 소분자 억제제이다. 소라페니브는 Raf/Mek/Erk 경로(MAP 키나제 경로)를 표적화한다. 따라서, 상기 경로를 표적화하는 다른 키나제 억제제는 또한 JX-594와 병용하기에 유용한 것으로 고려된다.

특정 측면에서, 상기 피검체는 적어도 1 x 10⁷, 1 x 10⁸, 2 x 10⁸, 5 x 10⁸, 1 x 10⁹, 2 x 10⁹, 5 x 10⁹, 1 x 10¹⁰, 5 x 10¹⁰, 1 x 10¹¹, 5 x 10¹¹, 1 x 10¹², 또는 5 x 10¹² 이상의 바이러스 입자 또는 플라크 형성 단위(pfu)가 투여되고, 상기 사이에서 다양한 수치 및 범위가 포함된다. 바이러스 용량은 0.1, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 100, 500, 1000 ml 이상으로 투여되고, 상기 수치 사이의 모든 수치 및 범위가 포함된다. 하나의 측면에서, 상기 용량은 환자의 혈청에서 검출가능한 수준의 GM-CSF를 생성시키기에 충분하고, 예를 들어, 적어도 약, 최대 약 또는 약 2, 5, 10, 40, 50, 100, 200, 500, 1,000, 5,000, 10,000, 15,000 내지 20,000 pg/mL이고, 상기 수치 사이의 모든 수치 및 범위가 포함된다. 단일 용량의 바이러스는 피검체에게 또는 종양에 0.1, 0.5. 1, 2, 5, 10, 15, 20, 또는 24시간의 기간 이상 투여되는 양을 언급하고, 상기 수치 사이의 모든 수치 범위를 포함하는 것으로 고려된다. 상기 용량은 시간 추이에 따라 또는 별도의 주사에 의해 확산될 수 있다. 통상적으로, 예를 들어, 다중 용량은 종양 인접 부위 또는 정맥내 투여의 경우 피검체의 혈류 또는 림프계에서 특정 진입점과 같은 동일한 일반적인 표적 영역으로 투여된다. 특정 측면에서, 바이러스 용량은 단일 주사 바늘내 다중 포트를 제공하는 주사 바늘, 주사기에 연결된 다중 프롱 또는 이의 조합체를 포함하는 주사 장치에 의해 전달된다. 추가의 측면에서, 백시니아 바이러스 벡터는 2, 3, 4 또는 5회 이상 투여된다. 여전히 추가의 측면에서, 백시니아 바이러스는 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 이상 또는 수주 이상 투여된다.

특정 양태에서 상기 피검체는 사람이다. 상기 피검체는 암 및/또는 종양을 앓고 있을 수 있다. 특정 양태에서 상기 종양은 치료전에 제거 가능하지 않고 치료후에 제거 가능한 것일 수 있다. 특정 측면에서 상기 종양은 간상에 또는 간 내에 위치한다. 다른 측면에서 상기 종양은 뇌암 종양, 두경부암 종양, 식도암 종양, 피부암 종양, 폐암 종양, 흉선암 종양, 위암 종양, 결장암 종양, 간암 종양, 난소암 종양, 자궁암 종양, 방광암 종양, 고환암 종양, 직장암 종양, 유방암 종양 또는 췌장암 종양일 수 있다. 다른 양태에서 종양은 방광 종양이다. 또 다른 양태에서 상기 종양은 흑색종이다. 상기 종양은 재발성, 원발성, 전이성 및/또는 다중 약물 내성 종양일 수 있다. 특정 양태에서, 상기 종양은 또 다른 조직 또는 위치로부터 기원하는 간세포 종양 또는 전이 종양이다. 특정 측면에서 종양은 간에 있다.

특정 측면에서, 환자는 종양 재관류에 대해 모니터링된다. 특정 측면에서, 환자의 모니터링 또는 평가는 비-침습성 또는 최소 침습성 이미지화, 예를 들어, 자기 공명 이미지화에 의해 수행될 수 있다. 재관류가 검출되거나 의심되는 경우, 환자에게 항-혈관형성 티로신 키나제 억제제와 같은 항-혈관형성 제제가 투여될 수 있다. 특정 측면에서, 상기 티로신 키나제 억제제는 소라페니브 또는 유사 제제이다. 항-혈관형성 제제는 폭스바이러스 바이러스 치료요법 후 적어도, 최대 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13주 이상 투여될 수 있다.

특정 측면에서, 상기 방법은 피검체에게 부가적 암 치료요법을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 부가적 암 치료요법은 화학치료요법제, 생물학적 치료요법, 방사선치료요법, 면역치료요법, 호르몬 치료요법, 항-혈관 치료요법, 냉동치료요법, 독소 치료요법 및/또는 수술일 수 있고 이들의 병용을 포함한다. 여전히 추가의 측면에서, 수술은 경동맥 화학색전술(TACE 과정, 참조: Vogl et al., European Radiology 16(6): 1393, 2005)을 포함한다. 상기 방법은 백시니아 바이러스 벡터의 제2 투여를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 방법은 치료 전, 동안에 또는 후에 또는 이의 병용으로 종양 세포 생존도를 평가하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 특정 양태에서 상기 바이러스는 혈관내, 종양내 또는 이의 조합으로 투여된다. 추가의 측면에서 상기 투여는 종양 매쓰에 주사하는 것이다. 추가의 양태에서, 상기 투여는 종양 혈관계 영역내로 또는 영역에 주사하는 것이다. 또 다른 추가의 양태에서, 상기 투여는 상기 종양에 인접한 림프계 또는 혈관계로 주사하는 것이다. 특정 측면에서 상기 방법은 투여 전에 또는 투여 동안에 종양을 이미지화하는 것을 포함한다. 특정 측면에서, 환자는 백시니아 바이러스 백신으로 사전 면역화되거나 사전 면역화되지 않는다. 추가의 측면에서, 상기 피검체는 본래에 또는 임상적으로 면역손상일 수 있다.

특정 측면에서, 상기 바이러스는 주사된 종양에서 세포의 적어도 15%, 주사된 종양에서 세포의 적어도 20%, 주사된 종양에서 세포의 적어도 30%, 주사된 종양에서 세포의 적어도 40%, 주사된 종양에서 세포의 적어도 50%, 주사된 종양에서 세포의 적어도 60%, 주사된 종양에서 세포의 적어도 70%, 주사된 종양에서 세포의 적어도 80% 또는 주사된 종양에서 세포의 적어도 90%에서 세포 또는 암 세포 사멸 또는 괴사를 유도하기에 충분한 양으로 투여된다.

본 발명의 추가의 측면에서, 상기 방법은 백시니아 백신을 사용하여 피검체를 예비 치료함을 배제할 수 있고, 예를 들어, 피검체는 본원에 기재된 치료요법을 투여하기 1, 2, 3, 4, 5일 이상, 수주, 수개월 또는 수년 전에 백신 접종할 필요가 없다. 몇몇 측면에서, 비-주사된 종양 또는 암은 치료학적 바이러스로 감염시킬 수 있고 따라서 국소 투여와 전신 파종 둘다에 의해 환자를 치료한다.

본 발명의 다른 양태는 본원 전반에 걸쳐 논의된다. 본 발명의 한 측면과 관련하여 논의된 임의의 양태는 또한 발명의 다른 측면에 적용되고 또는 이의 반대의 경우에도 마찬가지이다. 실시예 섹션에서의 양태는 발명의 모든 측면에 적용될 수 있는 발명의 양태인 것으로 이해된다.

청구항 및/또는 명세서에 사용되는 경우 용어 "억제하는" "감소시키는" 또는 "예방" 또는 이들 용어의 모든 변형은 목적하는 결과를 성취하기 위한 임의의 측정 가능한 감소 또는 완전한 억제를 포함한다.

"하나("a" 또는 "an")"라는 단어는, 청구항 및/또는 명세서에서 "포함하는"이라는 용어와 함께 사용되는 경우, "하나(one)"를 의미할 수 있지만, "하나 이상", "적어도 하나" 및 "하나 또는 그 이상"의 의미와도 일관된다.

본원에 논의된 임의의 양태는 본 발명의 임의의 방법 또는 조성물과 관련하여 수행될 수 있는 것으로 고려되고 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 추가로, 본 발명의 조성물 및 키트를 사용하여 발명의 방법을 성취할 수 있다.

본원 전반에 걸쳐 용어 "약(about)"은 수치가 수치를 결정하는데 사용되는 장치 또는 방법에서 오류의 표준 오차를 포함함을 지적하기 위해 사용된다.

청구항에서 용어 "또는"의 사용은 대용물로 명백히 지적되지 않거나 대용물이 상호 배타적이지 않는 경우 "및/또는"을 의미하기 위해 사용되지만, 당해 기재는 단지 대용물 및 "및/또는"을 언급하는 정의를 지지한다.

본원 명세서 및 청구항(들)에 사용된 바와 같이, 용어 "포함하는" (및 포함하는의 임의의 형태, 예를 들어, "포함한다(comprise 또는 comprises)"), "갖는"(및 갖는의 임의의 형태, 예를 들어, "갖는다"), "포함하는(including)"(및 임의의 형태의 포함하는, 예를 들어, "포함한다(include 또는 includes)") 또는 "함유하는(containing)"(및 함유하는의 임의의 형태, 예를 들어, "함유한다(contain 또는 contains)")은 포괄적이거나 개방적이고(open-ended) 추가의 언급되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다.

본 발명의 다른 목적, 특징 및 장점은 다음의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 하지만, 상세한 설명 및 구체적인 실시예에는 본 발명의 구체적인 양태가 제시되어 있지만 오직 설명 목적으로만 제시된다는 것을 이해하여야 하며, 이는 본 발명의 취지 및 범위 내에서의 다양한 변화 및 변형이 이러한 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이기 때문이다.

다음의 도면들은 본 명세서의 일부를 형성하며, 본 발명의 특정 양상을 추가로 설명하기 위하여 포함된다. 본 발명은 본원에 제시된 특정 양태의 상세한 설명과 함께 하나 이상의 이러한 도면을 참조하여 보다 충분하게 이해될 수 있다.
도 1. JX-594 복제는 시험관내 소라페니브의 존재하에 억제된다. 다양한 감염 다중도(MOI)에서, JX-594 단독 또는 10μΜ 소라페니브와 조합된 JX-594를 PLC/PRF/5 세포에 첨가하였다. 24시간 감염 후, 세포 및 상등액은 베로 세포(Vero cell)에 대한 플라크 분석으로 적정하기 위해 수거하였다.
도 2. 소라페니브는 JX-594 플라크 형성 및 복제를 억제한다. JX-594가 증가하는 농도의 소라페니브의 존재 또는 부재하에 단층의 A2780 또는 HepG2 세포에 감염되도록 하였다. 상부 패널은 본래의 단층에 대한 플라크 형성 및 새로운 바이러스 입자의 생성(방출(burst))을 측정하는 실험을 보여준다. 하부 패널은 세포독성 수준 미만의 농도가 바이러스 복제를 억제하는데 효과적임을 보여준다. 상기 데이타는 대조군(JX-594 부재, 소라페니브 부재)의 %로서 표현된다. 오류 막대는 복제물의 표준 편차이다.
도 3. 소라페니브를 사용한 병용 치료요법은 CT26 피하 고형 종양에 대한 JX-594 효능을 증진시킨다. 상부 패널은 CT2 피하 종양을 사용한 마우스에서 조합 효능 임상전 연구의 연구 디자인을 보여준다. 캐플란-메이어(Kaplan-Meier) 생존 곡선은 중앙 패널에서 각각의 조건에 대해 나타낸다. 종양 용적에 대한 효과는 하부 패널에 나타낸다.
도 4. 소라페니브를 사용한 병용 치료요법은 뮤린(murine) B16 전이 흑색종 모델에서 JX-594 효능을 증진시킨다. 상부 패널은 B16 뮤린 종양 모델에서 병용 효능 임상전 연구의 연구 디자인을 보여준다. 하부 패널은 각각의 그룹에서 나타난 폐 전이의 평균 수를 보여준다.
도 5. JX-594에 이어서 소라페니브의 투여는 HCC 이종이식체 모델에서 보다 우수한 효능을 보여준다. 챠트는 각각의 그룹에 대한 치료 스케줄을 기재한다. 그래프는 시간 경과에 따라 각각의 그룹에 대한 평균 종양 크기(mm³)를 플롯팅한다(막대는 평균 표준 오차이다).
도 6. JX-594에 이어서 소라페니브의 투여에 따른 항-혈관 효과. 상부 패널은 HepG2 이종이식체 모델에서 JX-594에 이어서 소라페니브의 투여에 따른 임상전 연구의 연구 디자인을 보여준다. 하부 패널은 종양에서 혈관의 평균 수를 보여준다(3개의 200x 필드를 계수하였다). 오류 막대는 표준 오차이다.
도 7. HCC 환자의 DCE-MRI 스캐닝은 혈관 폐쇄를 보여준다.
도 8. DCE-MRI 스캐닝은 종양내 주사 부위에 대해 원거리에 위치한 부위에서의 반응을 보여준다.
도 9. DCE-MRI 스캐닝은 종양내 주사 부위에 대해 원거리에 위치한 부위에서의 반응을 보여준다.
도 10은 초이(Choi) 평가를 포함하는, 요약된 환자 반응을 설명한다.
도 11. 환자 1702 - 소라페니브 처리 4주 및 8주 후 DCE-MRI 이미지 (3개의 상이한 평면을 보여주고 각각의 평면은 4주 및 8주 후 이미지이다).
도 12. 환자 1705 - JX-594 처리 전 및 5일 후 DCE-MRI 이미지: 소라페니브 처리 전 및 4주 후 DCE-MRI 이미지.
도 13. 환자 1712 - 소라페니브 처리 전 및 4주 후 DCE-MRI 이미지.
도 14. 환자 11301 - 신장 세포 암종의 간으로의 전이를 갖는 환자의 평가.
도 15. 연속적으로 JX-594 및 소라페니브를 사용하여 관찰된 종양 안정화 및 감소된 증진의 예시 (환자 1705).
도 16은 JX-594에 이어서 소라페니브를 사용하여 처리된 환자에서 상당한 괴사 유도를 예시한다(환자 1705).
도 17은 JX-594 및 소라페니브를 사용한 연속적 치료요법 후 감소된 생존가능한 종양 용적을 예시한다.
도 18. 간세포 암종을 갖고 JX-594의 2기 임상 시험에 등록된 환자의 DCE-MRI 스캐닝은 비-주사된 간외 종양에서 소라페니브 개시 10일 후 재관류의 상실을 보여주었다. JX-594 투여를 완료한 후(1회는 정맥내 및 2회는 종양내 투여), 소라페니브를 환자에게 투여하였다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명은 암의 치료를 위한 종양 용해 폭스바이러스의 용도에 관한 것이다. 특히, 특정 정도의 종양 용해를 성취하기 위한 GM-CSF 발현 백시니아 바이러스의 용도가 기재되어 있다. 또 다른 양태에서, 백시니아 바이러스는 혈관화된 또는 혈관형성 종양을 치료하는데 보다 효과적인 치료 요법에 사용될 수 있다. 특정 요법은 종양 용해 백시니아 바이러스를 사용한 치료 후 항-혈관형성 제제의 사용이다. 특정 측면에서, 상기 치료 요법은 백시니아 바이러스가 종양의 혈관 붕괴를 유도한 후 종양의 재-혈관형성으로부터 비롯되는 재관류를 평가하기 위해 종양을 이미지화하는 것을 포함한다. 특정 측면에서, 상기 백시니아 바이러스는 JX-594 바이러스(TK 음성 GM-CSF 발현 백시니아 바이러스)이다.
I. 치료 요법 및 약제학적 제형
본 발명의 양태에서, JX-594와 같은 종양 용해 백시니아 바이러스 전달에 의한 암과 같은 과증식성 질환의 치료 방법이 고려된다.
상기 방법은 종양 용해 백시니아 바이러스 또는 항-혈관형성 제제를 포함하는, 유효량의 약제학적 조성물을 투여함을 포함한다. 약제학적 유효량은 종양 용해(암 세포의 붕괴 또는 용해) 및/또는 종양의 혈관형성 억제 또는 신생-혈관의 파괴를 유도하기에 충분한 양으로서 정의된다. 상기 용어는 종양의 성장 또는 크기의 서행화, 억제 또는 감소를 포함하고, 특정 경우에 종양의 박멸을 포함한다. 특정 측면에서, 유효량의 백시니아 바이러스는 치료학적 바이러스의 종양으로의 전신 파종, 예를 들어, 비-주사된 종양의 감염을 초래한다.
A. 병용 치료
본 발명의 화합물 및 방법은 암을 포함하는, 과증식성 질환/병태와 관련하여 사용될 수 있고 투여 사이의 다양한 시간 차이와 함께 특정 순차의 투여에 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물, 예를 들어, GM-CSF 발현 백시니아 바이러스를 사용한 치료 효과를 증가시키기 위해, 상기 조성물을 항-혈관형성 제제 및 암의 치료에 효과적인 기타 제제와 병용하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 암의 치료는 항-혈관형성 제제와 병용하여 본 발명의 치료학적 화합물로 수행할 수 있다.
다양한 조합이 사용될 수 있고, 예를 들어, 백시니아 바이러스 JX-594와 같은 폭스바이러스는 "A"이고 부수적 항-혈관형성 치료요법은 "B"이다:
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
본 발명의 폭스바이러스/백시니아 벡터의 환자로의 투여는 경우에 따라 폭스바이러스 치료에 대한 독성을 고려하여, 특정 치료요법의 투여를 위한 일반적인 프로토콜에 따를 수 있다. 백시니아 바이러스를 사용한 치료 후, 항-혈관형성 제제는 백시니아 바이러스 처리된 종양의 혈관 신생 또는 재관류를 효과적으로 치료하기 위해 투여된다. 필요에 따라 치료 주기는 반복될 것으로 예상된다. 또한, 수술적 중재 뿐만 아니라 다양한 표준 치료요법이 상기된 암 또는 종양 세포 치료요법과 병용하여 적용될 수 있음이 고려된다.
"항-혈관형성" 제제는, 예를 들어, 세포를 사멸시키고 세포에서 아폽토시스를 유도하고, 혈관형성에 관여하는 세포의 성장 속도를 감소시키고 종양 또는 암 세포로의 혈액 공급을 효과적으로 감소시킴에 의해, 종양에서 혈관 형성에 부정적인 영향을 미칠 수 있다. 항-혈관형성 제제의 예는 소라페니브, 수텐트 및 유사 화합물, 레티노산 및 이의 유도체, 2-메톡시에스트라디올, ANGIOSTATIN™, ENDOSTATIN™, 수라민, 스쿠알라민, 메탈로프로테이나제-1의 조직 억제제, 메탈로프로테이나제-2의 조직 억제제, 플라스미노겐 활성화제 억제제-1, 플라스미노겐 활성화제 억제제-2, 연골 유래된 억제제, 파클리탁셀, 혈소판 인자 4, 프로타민 설페이트 (클루페인), 황산화된 키틴 유도체(퀸 크랩 껍질로부터 제조됨), 황산화된 폴리사카라이드 펩티도글리칸 복합체 (sp-pg), 스타우로스포린, 매트릭스 대사의 조절제[예를 들어, 프롤린 유사체(I-아제티딘-2-카르복실산(LACA), 시스하이드록시프롤린, d,I-3,4-데하이드로프롤린, 티아프롤린, 알파-디피리딜, 베타-아미노프로피오니트릴 푸마레이트, 4-프로필-5-(4-피리디닐)-2(3h)-옥사졸론)를 포함함]; 메토트렉세이트, 미톡산트론, 헤파린, 인터페론, 2 마크로글로불린-혈청, 킴프(chimp)-3, 키모스타틴, β-사이클로덱스트린 테트라데카설페이트, 에포네마이신; 푸마길린, 골드 나트륨 티오말레이트, d-페니실라민 (CDPT), 베타-1-항콜라게나제-혈청, 알파 2-항플라스민, 비산트렌, 로벤자리트 이나트륨, n-2-카르복시페닐-4-클로로안트로닐산 이나트륨 또는 "CCA", 탈리도미드; 혈관억제 스테로이드, 카르복신아미놀미다졸; 메탈로프로테이나제 억제제, 예를 들어, BB94를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 다른 항-혈관형성 제제는 항체, 예를 들어, 이들 혈관 성장 인자 bFGF, aFGF, FGF-5, VEGF 이소형, VEGF-C, HGF/SF 및 Ang-l/Ang-2에 대한 모노클론 항체를 포함한다[문헌참조: Ferrara N. and Alitalo, K "Clinical application of angiogenic growth factors and their inhibitors" (1999) Nature Medicine 5:1359-1364]. 다른 항-혈관형성 제제는 VEGF 전사의 억제제를 포함할 수 있다.
기존의 모세관으로부터 새로운 혈관이 형성되는 혈관형성은 광범위한 생리학적 및 병리학적 과정에서 중요한 일련의 사건들이다. 다수의 질환들이 새로운 혈관계 형성과 관련된다. 혈관형성은, 종양과 같은 세포의 비정상적이거나 비조절된 증식을 특징으로 하거나 이와 관련된 병리학을 포함하는 다양한 병리학의 중요한 특징이다. 과도한 혈관형성을 포함하는 병리학은 예를 들어, 암(고형 종양 및 혈액 종양 둘 다)을 포함한다. 암 환자는 혈관형성-종양 혈관형성의 억제로부터 이득을 수득할 수 있다.
혈관형성은 신생물 조직의 성장에 중요하다. 100년 이상 동안, 종양은 정상 조직보다 더 혈관을 형성하는 것으로 관찰되었다. 여러 실험적 연구는 원발성 종양 성장 및 전이 둘다가 혈관신생을 필요로 함을 제안하였다. 활발한 종양 성장을 위해 필요한 병리학적 혈관신생은 일반적으로 지속적이고 꾸준히 발생하고 혈관형성 표현형의 초기 획득이 다양한 고형 및 혈액 종양 유형의 발병에 공통된 기작이다. 혈관 네트워크를 이용할 수 없고 지속할 수 없는 종양은 전형적으로 동일계에 비증상 병변으로서 잠복 상태로 존재한다. 전이는 또한 혈관형성 의존성이다: 종양 세포가 성공적으로 전이하기 위해, 일반적으로 원발성 종양에서 혈관으로 접근하여 순환계로부터 생존하여 표적 기관의 미세혈관계에 유지되고 상기 혈관계로부터 이탈하여 표적 기관에 성장하고 표적 부위에서 혈관형성을 유도한다. 따라서, 혈관형성은 전이 연속 반응의 완결 뿐만 아니라 개시에 필요한 것으로 나타난다.
따라서, 신생물의 성장 및 전이에 대한 혈관형성의 중요성은 치료학적 노력을 위한 표적을 제공한다. 적당한 항-혈관형성 제제는 직접 또는 간접적으로 작용하여 종양의 혈관 신생 개시를 지연시키거나 이의 지속성을 차단하여 종양 관련 혈관형성에 영향을 미칠 수 있다.
추가의 항암제는 생물학적 제제(생물치료요법), 화학치료요법 제제 및 방사선치료요법 제제를 포함한다. 보다 일반적으로, 이들 다른 조성물은 세포를 사멸시키거나 이의 증식을 억제하는데 효과적인 병용된 양으로 제공될 수 있다.
전형적으로, 백시니아 바이러스 치료요법은 수일 내지 수주 범위의 간격으로 다른 제제 보다 선행될 수 있다. 다른 제제 및 폭스바이러스가 별도로 세포에 투여되는 양태에서, 일반적으로 상당한 시간이 각각의 전달 시점 사이에 완료되지 않도록하여 상기 제제와 폭스바이러스가 여전히 세포에 대해 유리하게 병용된 효과를 발휘할 수 있도록 해야한다. 상기 경우에, 서로 약 2 내지 20주 사이에 상기 2 종류의 치료 제와 세포를 접촉시킬 수 있음이 고려된다. 일부 상황에서, 수일 (2, 3, 4, 5, 6 또는 7일) 내지 수주 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8주)가 각각의 투여 사이에 존속하는 경우 치료를 위한 기간을 연장시키는 것이 상당히 바람직할 수 있다.
백시니아 바이러스와 항-혈관형성 제제를 사용한 피검체의 치료 이외에, 통상적인 암 치료요법을 포함하는 추가의 치료요법이 사용될 수 있다.
1. 화학치료요법
암 치료요법은 화학적 및 방사선 기반의 치료와 다양하게 병용된 치료요법을 포함한다. 병용 화학치료요법은 예를 들어, 시스플라틴(CDDP), 카보플라틴, 프로카바진, 메클로레타민, 사이클로포스파미드, 캄프토테신, 이포스파미드, 멜팔란, 클로람부실, 부설판, 니트로스우레아, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 블레오마이신, 플리코마이신, 미토마이신, 에토포사이드 (VP16), 타목시펜, 랄록시펜, 에스트로겐 수용체 결합제, 탁솔, 겜시타비엔, 나벨빈, 파르네실-단백질 트랜스퍼라제 억제제, 트랜스플라티늄, 5-플루오로우라실, 빈크리스틴, 빈블라스틴 및 메토트렉세이트, 테마졸로미드(DTIC의 수성 형태), 또는 상기된 것의 임의의 유사체 또는 유도 변이체를 포함한다. 생물학적 치료요법과 화학치료요법의 병용은 생화학적 치료요법으로서 공지된다.
2. 방사선치료요법
DNA 손상을 유발하고 광범위하게 사용되어온 다른 인자들은 감마선, X선, 및/또는 방사능동위원소의 종양 세포로의 지시된 전달로서 통상적으로 공지된 것들을 포함한다. 마이크로파 및 UV-조사와 같은 다른 형태의 DNA 손상 인자가 또한 고려된다. 이들 인자들 모두는 DNA, DNA의 전구체, DNA의 복제 및 복구 및 염색체의 어셈블리 및 유지에 대해 광범위한 손상을 일으킬 가능성이 높다. X선에 대한 투여 범위는 연장된 기간(3 내지 4주) 동안 50 내지 200 뢴트겐의 하루 투여에서 2000 내지 6000 뢴트겐의 단일 투여에 이르는 범위이다. 방사능동위원소의 투여 범위는 광범위하고 동위원소의 반감기, 방출된 방사선의 강도 및 유형, 및 신생물 세포에 의한 흡수에 의존한다.
세포에 적용되는 경우 용어 "접촉된" 및 "노출된"은 본원에서 치료학적 작제물과 화학요법 또는 방사선치료 제제가 표적 세포로 전달되거나 표적 세포에 직접적으로 바로 인접하게 위치시키는 과정을 기술하기 위해 사용된다. 세포 사멸 또는 성장 억제를 성취하기 위해, 2개의 제제는 세포를 사멸시키거나 이것이 분열하는 것을 방지하기 위해 효과적인 병용된 양으로 세포에 전달된다.
3. 면역치료요법
면역요법은 일반적으로 면역 이펙터 세포, 및 암세포를 표적화하고 파괴하는 분자의 용도에 의존한다. 상기 면역 이펙터는, 예를 들어, 종양 세포의 표면상의 일부 마커에 특이적인 항체일 수 있다. 상기 단독의 항체는 치료요법의 이펙터로서 작용할 수 있거나, 이것은 다른 세포를 유인하여 실제로 세포 사멸에 영향을 줄 수 있다. 상기 항체는 또한 약물 또는 독소(화학요법제, 방사선핵종, 리신 A쇄, 콜레라 독소, 백일해 독소 등)에 접합되어 단순히 표적화제로서 작용할 수 있다. 대안으로, 상기 이펙터는 직접 또는 간접적으로 종양 세포 표적과 상호작용하는 표면 분자를 갖는 림프구일 수 있다. 다양한 이펙터 세포는 세포독성 T 세포 및 NK 세포를 포함한다. 치료학적 종류의 병용, 즉 특정 폭스바이러스 폴리펩티드의 직접적인 세포독성 활성 및 억제 또는 감소가 암 치료에 치료학적 이득을 제공할 수 있다.
4. 수술
암을 갖고 있는 사람의 대략 60%는, 예방적, 진단학적 또는 시기판별, 치유적 및 일시적 처방 수술을 포함하는, 일부 유형의 수술을 받을 것이다. 치유적 수술은 본 발명의 치료, 화학치료요법, 방사선치료요법, 호르몬 치료요법, 유전자 치료요법, 면역치료요법 및/또는 대안적인 치료요법과 같은 다른 치료요법과 연계하여 사용될 수 있는 암 치료이다.
치유적 수술은 암 조직 전부 또는 일부가 물리적으로 제거, 절개되고/되거나 파괴되는 절제술을 포함한다. 종양 절제술은 종양의 적어도 일부의 물리적 제거를 언급한다. 종양 절제술 이외에, 수술에 의한 치료는 레이저 수술, 저온수술, 전기수술, 및 현미경적으로 조절되는 수술(모흐 수술(Mohs' surgery))을 포함한다. 본 발명이 표피 암, 전구 암 또는 부수적인 양의 정상 조직의 제거와 연계하여 사용될 수 있는 것으로 추가로 고려된다.
모든 암 세포, 조직 또는 종양의 일부를 절개시, 체내에 공동(cavity)이 형성될 수 있다. 치료는 추가의 항암 치료요법을 사용한 관류, 직접적인 주사 또는 영역의 국소 적용에 의해 성취될 수 있다. 상기 치료는 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 마다, 또는 1, 2, 3, 4 및 5 주 마다 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개월 마다 반복될 수 있다. 상기 치료는 또한 용량을 다양하게 하여 수행될 수 있다.
5. 기타 제제
본 방법과 연계하여 사용하기 위한 또 다른 형태의 치료요법은 환자의 조직이 고온(106°F 이하)에 노출되는 과정인 열 치료법을 포함한다. 외부 또는 내부 가열 장치가 국소, 국부 또는 전신 열 치료법의 적용에 포함될 수 있다. 국소 열 치료법은 열을 종양과 같은 작은 영역에 적용함을 포함한다. 열은 체외 장치로부터 종양을 표적화하는 고주파를 사용하여 외부적으로 생성될 수 있다. 내부 열은 얇은 가열된 전선 또는 온수로 채워진 중공(hollow) 튜브를 포함하는 멸균 프로브, 이식된 마이크로파 안테나 또는 고주파 전극을 포함할 수 있다.
환자의 기관 또는 사지는 자기와 같은 고에너지를 생성하는 장치를 사용하여 수행되는 국부 치료요법을 위해 가열된다. 대안으로, 환자 혈액의 일부가 제거되고 내부적으로 가열될 영역으로 관류되기 전에 가열될 수 있다. 전신 가열은 또한 암이 신체 전반에 퍼져있는 경우에 이식될 수 있다. 온수 블랭킷, 고온 왁스, 유도 코일 및 열 챔버가 상기 목적을 위해 사용될 수 있다.
호르몬 치료요법은 또한 본 발명과 연계하여 또는 이전에 기재된 임의의 다른 암 치료요법과 병용하여 사용될 수 있다. 호르몬의 용도는 테스토스테론 또는 에스트로겐과 같은 특정 호르몬의 수준을 저하시키거나 이의 효과를 차단하기 위해 유방암, 전립선암, 난소암, 또는 자궁경부암과 같은 특정 암의 치료에 사용될 수 있다.
B. 투여
종양을 치료하는데 있어서, 본 발명의 방법은 종양 용해 백시니아 바이러스를 투여하고, 이어서 이후에 항-혈관형성 제제를 포함하는 조성물을 투여한다. 투여 경로는 본래 종양의 위치 및 특성에 따라 다양할 것이고, 예를 들어, 피내, 경피, 비경구, 정맥내, 근육내, 비강내, 피하, 국부(예를 들어, 종양에 근접하게, 특히 종양의 혈관계 또는 인접한 혈관계), 경피적, 기관지내, 복강내, 동맥내, 방광내, 종양내, 흡입, 관류, 위장, 및 경구 투여를 포함한다. 조성물은 특정 투여 경로에 따라서 제형화될 수 있다.
종양내 주사 또는 종양 혈관계로의 직접적인 주사가 구체적으로 고려된다. 국소, 국부 또는 전신 투여가 또한 적당할 수 있다. 4cm 초과의 종양에 대해, 투여될 용적은 약 4 내지 10ml (바람직하게는 10ml)이고, 4cm 미만의 종양에 대해서는 약 1 내지 3cm의 용적(바람직하게는 3ml)이 사용될 수 있다. 단일 용량으로서 전달되는 다중 주사는 약 0.1 내지 약 0.5 ml 용적을 포함한다. 상기 바이러스는 종양에 다중 주사로 대략 1cm 간격의 위치에 투여될 수 있다. 수술 중재의 경우에, 본 발명은 수술전에 수술불가능한 종양 대상이 절개술에 적용되도록 하는데 사용될 수 있다. 연속 투여가 또한 적당한, 예를 들어, 카테터를 종양내 또는 종양 혈관계 내로 이식시킴에 의해 적용될 수 있다. 상기 연속 관류는 치료 개시 후 약 1 내지 2 시간에서 약 2 내지 6 시간까지, 약 6 내지 12 시간까지, 약 12 내지 24 시간까지, 약 1 내지 2일까지, 약 1 내지 2 주 이상 동안 수행할 수 있다. 일반적으로, 연속 관류를 통한 치료학적 조성물의 용량은 단일 또는 다중 주사에 의해 주어지는 용량과 동등하고 관류시키는 기간에 걸쳐 조정된다. 사지 또는 기관 관류가 본 발명의 치료학적 조성물을 투여하기 위해, 특히 간 종양, 흑색종 및 육종의 치료에 사용될 수 있는 것으로 추가로 고려된다.
치료 요법은 또한 다양할 수 있고 흔히 종양 유형, 종양 위치, 질환 진행 및 환자의 건강 및 연령에 의존한다. 특정 유형의 종양은 보다 공격적인 치료를 요구하는 반면, 이와 동시에 특정 환자들은 보다 힘든 프로토콜을 견딜 수 없다. 임상의는 치료학적 제형의 공지된 효능 및 독성(존재하는 경우)을 기준으로 상기 결정을 내리는 것이 최상으로 적합할 것이다.
특정 양태에서, 치료될 종양은 적어도 초기에는 절제가능하지 않을 수 있다. 치료학적 바이러스 작제물을 사용한 치료는 가장 자리 부분의 수축으로 인해 또는 특히 특정의 침습성 부분의 제거에 의해 종양의 절제가능성을 증가시킬 수 있다. 치료 후, 절제가 가능할 수 있다. 절제에 이어서 추가의 치료가 종양 부위에서 현미경적 잔류 환부를 제거하는 작용을 할 수 있다.
상기 치료는 다양한 "단위 용량"을 포함할 수 있다. 단위 용량은 소정량의 치료학적 조성물을 함유하는 것으로서 정의된다. 투여될 양 및 특정 경로 및 제형은 임상 분야의 당업자의 기술 범위내에 있다. 단위 용량은 1회 주사로서 투여될 필요가 없고 특정 기간에 걸친 연속 주입을 포함할 수 있다. 본 발명의 단위 용량은 간편하게 바이러스 작제물에 대한 플라크 형성 단위(pfu)로 기재될 수 있다. 단위 용량 범위는 10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹, 10¹², 10¹³ pfu 이상이다. 대안으로, 바이러스의 종류 및 달성가능한 역가에 의존하여, 1 내지 100, 10 내지 50, 100 내지 1000, 또는 약 또는 적어도 약 1 x 10⁴, 1 x 10⁵, 1 x 10⁶, 1 x 10⁷, 1 x 10⁸, 1 x 10⁹, 1 x 10¹⁰, 1 x 10¹¹, 1 x 10¹², 1 x 10¹³, 1 x 10¹⁴, 또는 1 x 10¹⁵ 이상(이 사이의 모든 수치 및 범위를 포함함)의 감염 바이러스 입자(vp)를 종양 또는 종양 부위로 전달할 수 있다.
C. 주사가능한 조성물 및 제형
본 발명에서 폭스바이러스 게놈의 전부 또는 일부를 암호화하는 발현 작제물 또는 바이러스를 암 또는 종양 세포로 전달하기 위해 바람직한 방법은 종양내 주사를 통해서이다. 그러나, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 대안으로, 미국 특허 공보 제5,543,158호, 제5,641,515호 및 제5,399,363호(이의 각각은 이의 전문이 본원에서 구체적으로 인용됨)에 기재된 바와 같이 비경구, 정맥내, 피내, 근육내, 경피적으로 또는 심지어 복강으로 투여될 수 있다.
핵산 작제물의 주사는 주사기에 의해, 또는 발현 작제물이 주사를 위해 필요한 바늘의 특정 게이지를 통해 통과할 수 있는 한 용액의 주사를 위해 사용되는 임의의 다른 방법에 의해 전달될 수 있다. 용액을 보유하기 위한 앰푸울 챔버를 갖는 노즐 및 노즐로부터 용액을 전달 부위로 밀어내기 위한 에너지 장치를 갖는 신규한 바늘 부재의 주사 시스템이 최근에 보고되었다(미국 특허 공보 제5,846,233호). 주사기 시스템은 또한 임의의 깊이에서 정확하게 소정량 용액의 다중 주사를 허용하는 유전자 치료요법에 사용하기 위해 기재되었다(미국 특허 공보 제5,846,225호).
유리 염기 또는 약제학적으로 허용되는 염으로서 활성 화합물 용액은 하이드록시프로필셀룰로스와 같은 계면활성제와 적합하게 혼합된 물중에서 제조될 수 있다. 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 혼합물 중에서 및 오일 중에서 제조될 수 있다. 통상적인 저장 및 사용 조건하에서, 이들 제제는 미생물의 성장을 방지하기 위한 방부제를 함유한다. 주사용으로 적합한 약제학적 형태는 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 주사용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다(문헌참조; 미국 특허 공보 제5,466,468호, 본원에서 이의 전문이 구체적으로 참조로 인용됨). 모든 경우에, 상기 형태는 멸균성이어만 하고 용이한 주사능을 가질 정도로 유동성이 있어야만 한다. 이것은 제조 및 저장 조건하에서 안정해야만 하고, 세균 및 진균류와 같은 미생물의 오염 작용에 대하여 보존되어야만 한다. 상기 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물 및/또는 식물성유를 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적당한 유동성은 예를 들어, 렉시틴과 같은 피복물의 사용, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용으로 유지될 수 있다. 미생물 작용 방지는 다양한 항세균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 수행될 수 있다. 많은 경우에, 등장성 제제, 예를 들어, 슈가 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 주사가능한 조성물의 지연 흡수는 조성물 중에 흡수 지연제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 사용하여 수행될 수 있다.
수용액 중에서의 비경구 투여를 위해, 예를 들어, 상기 용액을 필요에 따라 적합하게 완충시켜야만 하고, 먼저 액체 희석으로 충분한 식염수 또는 글루코스와 등장성이 되도록 해야만 한다. 이들 특정 수용액은 특히 정맥내, 근육내, 피하, 종양내 및 복강내 투여용으로 적합하다. 이와 관련하여, 사용될 수 있는 멸균 수성 매질은 본원의 기재 측면에서 당업자에게 공지될 수 있다. 예를 들어, 하나의 용량을 1ml의 등장성 NaCl 용액 중에 용해시킬 수 있고, 1000ml의 피하주입 유체에 첨가하거나 제안된 주입 부위에 주사할 수 있다(문헌참조: 예를 들어, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580). 용량은 치료될 피검체의 조건에 따라 일부 변화가 반드시 나타날 수 있다. 어느 경우든 투여 담당자는 개별 피검체에 대한 적당한 용량을 결정할 수 있다. 더욱이, 사람 투여를 위해, 제제는 생물학표준 FDA 사무소에서 요구되는 바와 같은 멸균성, 발열성, 일반적인 안전성 및 순도 표준을 충족해야 한다.
멸균 주사가능한 용액은 요구되는 바와 같이 상기 열거된 다양한 다른 성분들과 함께 적당한 용매 중에서 요구되는 양으로 활성화 화합물을 혼입시키고 이어서 여과 멸균시킴에 의해 제조한다. 일반적으로, 분산액은 다양한 멸균된 활성 성분을, 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터 요구되는 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 혼입시킴에 의해 제조한다. 멸균 주사가능한 용액을 제조하기 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 활성 성분, 및 이의 이전 멸균 여과된 용액 기원의 임의의 추가의 목적하는 성분의 분말을 생성시키는 진공 건조 및 동결 건조 기술이다.
본원에 기재된 조성물은 중성 또는 염 형태로 제형화시킬 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염은, (단백질의 유리 아미노 그룹과 함께 형성되고) 예를 들어, 염산 또는 인산과 같은 무기산 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기산과 형성되는 산 부가염을 포함한다. 유리 카르복실 그룹과 형성되는 염은 또한 예를 들어, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘 또는 수산화철과 같은 무기 염기 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유래할 수 있다. 제형화시, 용액은 용량 제형과 양립가능한 방식으로 및 치료학적 유효량으로 투여될 수 있다. 상기 제형은 주사가능한 용액, 약물 방출 캡슐 등과 같은 다양한 용량 형태로 용이하게 투여된다.
본원에 사용된 "담체"는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 비히클, 피복물, 희석제, 항세균제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제, 완충제, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등을 포함한다. 약제학적 활성 물질을 위한 상기 매질 및 제제의 용도는 당업계에 익히 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 활성 성분과 양립할수 없는 경우를 제외하고, 치료학적 조성물에서의 이의 사용이 고려된다. 보충 활성 성분은 또한 상기 조성물 중에 혼입될 수 있다.
용어 "약제학적으로 허용되는" 또는 "약리학적으로 허용되는"은 사람에게 투여되는 경우 알레르기 또는 유사한 원치않는 반응을 생성하지 않는 분자 실체 및 조성물을 언급한다. 활성 성분으로서 단백질을 함유하는 수성 조성물의 제조는 당업계에서 익히 이해되고 있다. 통상적으로, 상기 조성물은 수용액 또는 현탁액으로서 주사가능하게 제조되고; 주사 전 액체중에 용액 또는 현탁액을 위해 적합한 고체 형태가 또한 제조될 수 있다.
II. 백시니아 바이러스 JX-594
폭스바이러스는 수세기 동안 공지되어 있었고, 바리올라 바이러스(천연두)에 의해 생성되는 특징적인 마맛자국 때문에 당해 계열에 이름이 붙여졌다. 천연두는 2000년 전에 중국 및 극동에서 처음 출현한 것으로 나타난다. 다행히도 이러한 흔한 치명적 바이러스는 1977년에 소말리아에서의 자연 발병을 마지막으로 현재 박멸되었다.
폭스바이러스 바이러스성 입자는 타원형 또는 벽돌형이고 몇몇은 길이가 200 내지 400nm로 측정된다. 외부 표면은 종종 나선형으로 배열된 평행선으로 융기되어 있다. 당해 입자는 매우 복합적이고 100개 이상의 독특한 단백질을 함유한다. 세포외부 형태는 2개의 막(EEV - 세포외부 외피 비리온(virion))을 함유하는 반면, 세포내 입자는 단지 내막(IMV - 세포내 성숙 비리온)을 갖는다. 외부 표면은 코어를 둘러싸는 지질 및 단백질로 이루어지고 당해 코어는 밀착된 핵단백질로 이루어진다. 항원적으로, 폭스바이러스는 또한 매우 복합하고 특이적 및 가교 반응 항체 둘다를 유도한다. 입자내에는 적어도 10개의 효소가 있고 이의 대부분은 핵산 대사/게놈 복제와 관련되어 있다.
폭스바이러스의 게놈은 130 내지 300Kbp의 선형 이중가닥 DNA이다. 게놈의 말단은 여러 탠덤 반복 서열을 갖는 말단 헤어핀 루프를 갖는다. 여러 폭스바이러스 게놈은 서열분석되었고 필수 유전자 대부분은 게놈의 중앙 부분에 위치하는 반면 비필수 유전자는 말단에 위치한다. 폭스바이러스 게놈에는 약 250개의 유전자가 있다.
복제는 세포질내에서 일어나고 바이러스는 충분히 복합적이어서 게놈 복제를 위해 필요한 획득한 모든 기능을 갖고 있다. 몇몇은 세포에 의존하지만 이러한 의존의 특성은 명백하지 않다. 그러나, 폭스바이러스 유전자 발현 및 게놈 복제가 핵이 있는 세포에서 일어나지만 성숙화가 차단되고 이는 몇몇 역할이 세포에 의한 것임을 지적한다.
폭스바이러스에 대한 수용체는 일반적으로 공지되어 있지 않지만, 그 수가 다량이고 상이한 세포 유형상에 존재할 것으로 짐작된다. 백시니아에 대해, 유력한 수용체 중 하나는 EGF 수용체이다(문헌참조: McFadden, 2005). 침투에는 하나 이상의 기전을 포함할 수 있다. 탈피복은 2개의 단계로 일어난다: (a) 입자가 세포로 진입함으로써 세포질에서 외부 막이 제거되고, (b) 입자는 추가로 탈피복되어 코어는 세포질내로 전달된다.
일단 세포 세포질내로 진입하면, 유전자 발현은 코어와 관련된 바이러스 효소에 의해 수행된다. 발현은 2개의 단계로 나누어진다: 약 50% 게놈을 차지하며 게놈 복제 전에 발현되는 초기 유전자, 및 게놈 복제 후 발현되는 후기 유전자. 발현의 일시적 조절은 활성을 위해 DNA 복제에 의존하는 후기 프로모터에 의해 제공된다. 게놈 복제는 자가 프라이밍을 포함하는 것으로 여겨져, 고분자량의 컨카터머(concatamer)를 형성하고 이는 후속적으로 개열되고 복구되어 바이러스 게놈을 제조한다. 바이러스 어셈블리는 세포 골격에서 일어나고 세포골격 단백질(예를 들어, 액틴-결합 단백질)과의 상호작용에 관여하는 것으로 짐작된다. 세포질내 내포 형태는 바이러스 입자로 성숙한다. 세포에서 세포로의 확산은 감염 확산을 위한 또 다른 기전을 제공할 수 있다. 전체적으로, 당해 대형의 복합적 바이러스의 복제는 매우 신속하고 평균적으로 단지 12시간 소요된다.
적어도 9개의 상이한 폭스바이러스는 사람에서 질환을 유발하고 바리올라 바이러스 및 백시니아가 가장 잘 알려져 있다. 바리올라 균주는 바리올라 메이져(25 내지 30% 치사율) 및 바리올라 마이너(동일한 증상이지만 1% 미만의 치사율)로 나누어진다. 바이러스 둘 다에 의한 감염은 자연적으로 호흡 경로에 의해 일어나고 전신성이어서 다양한 증상을 나타내지만, 대부분은 바리올라 특징적인 피부 농포 및 상처를 유발하는 것으로 유명하다.
A. 백시니아 바이러스
백시니아 바이러스는 약 190K bp의 선형 이중가닥 DNA 게놈을 갖고 약 250개의 유전자를 암호화하는 복합적 거대 외피 바이러스이다. 백시니아는 천연두를 박멸시키는 백신으로서의 이의 역할 때문에 널리 알려져 있다. 천연두의 박멸 후, 과학자들은 유전자를 생물학적 조직으로 전달하기 위한 도구로서 백시니아의 용도를 연구하고 있다(유전자 치료요법 및 유전자 조작). 백시니아 바이러스는 이것이 숙주 세포의 세포질내에서만 복제함으로써 DNA 바이러스 중에서 독특하다. 따라서, 대형 게놈은 바이러스 DNA 복제를 위해 요구되는 다양한 효소와 단백질을 암호화하기 위해 요구된다. 복제 동안에, 백시니아는 이들의 외막이 상이한 다양한 감염성 형태를 생성한다: 세포내 성숙한 비리온(IMV), 세포내 외피 비리온(IEV), 세포 관련 외피 비리온(CEV) 및 세포외 외피 비리온(EEV). IMV는 가장 풍부한 감염성 형태이고 숙주간 확산에 관여하는 것으로 사료된다. 한편, CEV는 세포 대 세포 확산에서 역할을 하는 것으로 사료되고, EEV는 숙주 유기체내에서 오랜 범위의 파종을 위해 중요한 것으로 사료된다.
백시니아 바이러스는 우두를 유발하는 바이러스와 밀접하게 관련되어 있다. 백시니아의 정확한 기원은 알려져 있지 않지만 대부분의 공통된 견해는 백시니아 바이러스, 우두 바이러스 및 바리올라 바이러스(천연두의 발병제)가 모두 공통된 선조 바이러스로부터 유래되었다는 것이다. 또한 백시니아 바이러스는 본래에 말로부터 분리되었다는 의견이 있다. 백시니아 바이러스 감염은 경증이고 통상적으로 건강한 개체에서는 증상이 없지만 이는 약한 발진 및 열을 유발할 수 있고 치사율은 매우 낮다. 백시니아 바이러스 감염에 대해 생성된 면역 반응은 사람을 치명적인 천연두 감염으로부터 보호한다. 이러한 이유 때문에, 백시니아 바이러스는 천연두에 대한 생바이러스(live-virus) 백신으로서 사용되었다. 백시니아 바이러스 백신은 이것이 천연두 바이러스를 함유하지 않기 때문에 안전하지만, 때로는 특히 백신이 면역손상시키는 경우 특정 합병증 및/또는 백신 부작용을 유발할 수 있다.
상기 논의된 바와 같이, 백시니아 바이러스는 다수의 외래 단백질을 발현하도록 조작되었다. 하나의 당해 단백질은 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자, 또는 GM-CSF이다. GM-CSF는 줄기 세포가 과립구(호중구, 호산구 및 호염기구) 및 대식세포가 되도록 자극하는 대식세포에 의해 분비되는 단백질이다. 사람 GM-CSF는 아미노산 잔기 23번(류신), 27번(아스파라긴) 및 39번(글루탐산)에서 글리코실화된다(문헌참조: 미국 특허 공보 제5,073,627호, 본원에 참조로서 인용됨). GM-CSF는 또한 몰그라모스팀(molgramostim) 또는 단백질이 효모 세포에서 발현되는 경우, 사르그라모스팀(sargramostim)(상표명 Leukine^?)으로서 공지되어 있고, 이는 화학치료요법 후 백혈구 세포, 특히 과립구 및 대식세포의 생성을 자극하기 위한 약물로서 사용된다. GM-CSF를 발현하는 백시니아 바이러스는 이전에 보고되었다. 그러나, 이것은 종양 용해제로서 전달되지 않고 단지 GM-CSF에 대한 전달 벡터로서 전달된다. 이와 같이, 상당한 종양 용해를 성취할 수 있는 것 미만의 용량으로 환자에게 투여되었다. 본원에서는 몇몇 양태에서 1 x 10⁸ 초과의 pfu 또는 입자 농도로 투여되는 GM-CSF 발현 백시니아 바이러스의 용도가 기재되어 있다.
백시니아 바이러스는 본원에 참조로서 인용된 문헌[참조: Earl and Moss, in Ausubel et al ., 1994]에 기술된 방법을 사용하여 증식시킬 수 있다.
III. 핵산 조성물
특정 양태에서, 본 발명은 백시니아 바이러스 및 이의 변이체에 관한 것이다.
A. 바이러스 폴리펩티드의 변이체
발명의 백시니아 바이러스 벡터에 의해 암호화된 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체는 치환, 삽입 또는 결실 변이체일 수 있다. 바이러스 폴리펩티드를 암호화하는 유전자 내의 돌연변이는, 야생형과 비교하여, 폴리펩티드의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500개 또는 그 이상의 비-연속적인 또는 연속적인 아미노산에 영향을 줄 수 있다. 백시니아 바이러스에 의해 암호화된 다양한 폴리펩티드는, 본원에 참조로서 인용된 문헌[참조: Rosel et al., 1986, Goebel et al ., 1990] 및 GenBank 수탁 번호 NC001559를 참조하여 확인할 수 있다.
결실 변이체는 천연 또는 야생형 단백질의 하나 이상의 잔기가 없다. 개개의 잔기가 결실되거나, 도메인 (예를 들어, 촉매 또는 결합 도메인)의 전부 또는 일부가 결실될 수 있다. 종결 코돈이 암호화 핵산 서열 속으로 (치환 또는 삽입에 의해) 도입되어 절두된 단백질이 생성될 수 있다. 삽입 돌연변이체는 통상적으로 폴리펩티드의 비-말단 지점에 물질의 부가를 포함한다. 이는 면역반응성 에피토프(epitope) 또는 단순하게 하나 이상의 잔기의 삽입을 포함할 수 있다. 융합 단백질이라고 하는 말단 부가물이 생성될 수도 있다.
치환 변이체는 통상적으로 단백질 내의 하나 이상의 부위에서 하나의 아미노산의 다른 아미노산으로의 교환을 함유하고, 다른 기능 또는 특성을 손실시키거나 손실시키지 않으면서, 폴리펩티드의 하나 이상의 특성을 조절하도록 디자인될 수 있다. 치환은 보존적일 수 있다, 즉 하나의 아미노산이 유사한 모양과 전하를 갖는 아미노산으로 치환될 수 있다. 보존적 치환은 당업계에 익히 공지되어 있고, 예를 들면, 알라닌에서 세린으로; 아르기닌에서 리신으로; 아스파라긴에서 글루타민 또는 히스티딘으로; 아스파르테이트에서 글루타메이트로; 시스테인에서 세린으로; 글루타민에서 아스파라긴으로; 글루타메이트에서 아스파르테이트로; 글리신에서 프롤린으로; 히스티딘에서 아스파라긴 또는 글루타민으로; 이소류신에서 류신 또는 발린으로; 류신에서 발린 또는 이소류신으로; 리신에서 아르기닌으로; 메티오닌에서 류신 또는 이소류신으로; 페닐알라닌에서 티로신, 류신 또는 메티오닌으로; 세린에서 트레오닌으로; 트레오닌에서 세린으로; 트립토판에서 티로신으로; 티로신에서 트립토판 또는 페닐알라닌으로; 및 발린에서 이소류신 또는 류신으로의 치환이 포함된다. 대안으로, 치환이 비-보존적이어서, 폴리펩티드의 기능 또는 활성이 영향을 받을 수 있다. 비-보존적 치환에는 통상적으로, 화학적으로 상이한 잔기로의 치환, 예를 들면 극성 또는 전하를 띤 아미노산에서 비극성 또는 전하를 띠지 않은 아미노산으로의 치환 및 그 반대가 포함된다.
본원에서 사용되는 "기능적으로 동등한 코돈"이라는 용어는 동일한 아미노산을 암호화하는 코돈을 말한다 (하기 표 1 참조).
[표 1]

아미노산 및 핵산 서열은 추가적인 N- 또는 C-말단 아미노산 또는 5' 또는 3' 서열과 같은 추가적인 잔기를 포함할 수 있으며, 서열이 위에 제시된 기준 (단백질 발현과 관련하여 생물학적 단백질 활성의 유지를 포함)을 충족하는 한, 본질적으로 본원에서 공개된 서열 중의 하나에 제시된 것과 같다는 것이 또한 이해될 수 있다. 말단 서열의 부가는 특히, 예를 들면, 암호화 영역의 5' 또는 3' 부분을 플랭킹(flanking)하는 다양한 비-암호화 서열을 포함하거나, 유전자 내에 발생하는 것으로 공지된 다양한 내부 서열(즉, 인트론)을 포함할 수 있는 핵산 서열에 적용된다.
다음은 단백질의 아미노산의 변화를 통한 동등하거나 심지어 향상된 제2 세대 분자의 생성을 토대로 하는 논의이다. 예를 들면, 특정 아미노산은 단백질 구조에서, 예를 들면, 항체의 항원 결합 영역 또는 기질 분자 상의 결합 부위와 같은 구조와의 상호작용 결합 능력의 분명한 손실 없이 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 단백질의 생물학적 기능적 활성을 결정하는 것은 단백질의 상호작용 능력 및 특성이므로, 특정 아미노산 치환을 단백질 서열에서, 그리고 이의 DNA 암호화 서열에서 실시하여도 유사한 특성을 갖는 단백질이 생성될 수 있다. 따라서, 아래에 논의된 바와 같이 이들의 생물학적 유용성 또는 활성의 분명한 손실 없이 유전자의 DNA 서열에서 다양한 치환을 실시할 수 있다는 것을 본 발명자는 고려한다. 표 1에는 특정 아미노산을 암호화하는 코돈이 제시되어 있다.
이러한 치환의 생성에서, 아미노산의 하이드로파시 지수(hydropathic index)를 고려할 수 있다. 상호작용하는 생물학적 기능을 단백질에 부여함에 있어서 하이드로파시 아미노산 지수의 중요성은 당업계에서 일반적으로 이해된다[참조: Kyte and Doolittle, 1982]. 아미노산의 상대적인 하이드로파시 특성은 생성되는 단백질의 2차 구조에 관여하고, 이는 단백질과 다른 분자 (예를 들어, 효소, 기질, 수용체, DNA, 항체, 항원 등) 간의 상호작용을 결정한다는 것이 인정된다.
유사한 아미노산의 치환을 친수도에 따라 효과적으로 실시할 수 있다는 것은 또한 당업계에서 이해된다. 본원에 참조로서 인용된 미국 특허 공보 제4,554,101호에는, 인접 아미노산의 친수도에 의해 결정되는 단백질의 국지적인 평균 친수도의 최대값은 단백질의 생물학적 특성과 관련된다는 것이 언급되어 있다. 미국 특허 공보 제4,554,101호에 상세히 설명된 바와 같이, 다음의 친수도 값이 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌 (+3.0); 리신 (+3.0); 아스파르테이트 (+3.0 ± 1); 글루타메이트 (+3.0 ± 1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글리신 (0); 트레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5 ± 1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 류신 (-1.8); 이소류신 (-1.8); 티로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4).
아미노산을 유사한 친수도 값을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시켜 생물학적으로 동등하고 면역학적으로 동등한 단백질을 생성시킬 수 있다는 것이 이해된다. 이러한 치환에서, 친수도 값이 ±2 내에 있는 아미노산의 치환이 바람직하고, ±1 내에 있는 것이 특히 바람직하며, ±0.5 내에 있는 것이 보다 특히 바람직하다.
앞서 개관한 바와 같이, 아미노산 치환은 일반적으로 아미노산 측쇄 치환기의 상대적인 유사성, 예를 들면 이들의 소수성, 친수성, 전하, 크기 등을 토대로 한다. 다양한 앞서 언급한 특징에서 고려되는 대표적인 치환은 당업자에게 익히 공지되어 있고, 아르기닌과 리신; 글루타메이트와 아스파르테이트; 세린과 트레오닌; 글루타민과 아스파라긴; 및 발린, 류신과 이소류신이 포함된다.
B. 천연 단백질 또는 변형된 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드
본 발명은 단백질 또는 폴리펩티드의 전부 또는 일부를 발현할 수 있고 세포로부터 분리가능한 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명의 일부 양태에서, 본 발명은 특이적으로 돌연변이되어 특정한 기능성 바이러스 폴리펩티드가 없는 바이러스를 생성시키는 바이러스 게놈에 관한 것이다. 폴리뉴클레오티드는 바이러스 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 함유하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화할 수 있고, 또는 이들을 조작하여 이러한 바이러스 폴리펩티드를 암호화하지 않게 하거나, 적어도 하나의 기능 또는 활성이 감소되거나, 축소되거나, 없어진 바이러스 폴리펩티드를 암호화하게 할 수 있다. 재조합 단백질을 발현 세포로부터 정제하여 활성 단백질을 수득할 수 있다. 게놈 뿐만 아니라, 백시니아 바이러스의 암호화 영역의 정의는 본원에 참조로서 인용된 문헌[참조: Rosel et al . 1986, Goebel et al., 1990] 및/또는 GenBank 수탁 번호 NC_001559에서 찾을 수 있다.
본원에서 사용되는 "DNA 세그먼트"라는 용어는 특정한 종의 전체 게놈 DNA 없이 분리된 DNA 분자를 말한다. 그러므로, 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 세그먼트는, 전체 포유동물 또는 사람 게놈 DNA로부터 분리되거나 정제된, 야생형, 다형성 또는 돌연변이 폴리펩티드-암호화 서열을 함유하는 DNA 세그먼트를 말한다. "DNA 세그먼트"라는 용어에는 폴리펩티드(들), 폴리펩티드보다 작은 DNA 세그먼트 및 재조합 벡터, 예를 들면 플라스미드, 코스미드(cosmid), 파지, 바이러스 등이 포함된다.
본 특허원에서 사용되는 "폭스바이러스 폴리뉴클레오티드"라는 용어는 전체 게놈 핵산 없이 분리된 폭스바이러스 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 말한다. 유사하게, "백시니아 바이러스 폴리뉴클레오티드"는 전체 게놈 핵산 없이 분리된 백시니아 바이러스 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 말한다. "폭스바이러스 게놈" 또는 "백시니아 바이러스 게놈"은 숙주 세포에 제공하여, 헬퍼 바이러스의 존재 또는 부재 하에서, 바이러스 입자를 수득할 수 있는 핵산 분자를 말한다. 게놈은 야생형 바이러스와 비교하여 재조합적으로 돌연변이되거나 되지 않을 수 있다.
"cDNA"라는 용어는 메신저 RNA(mRNA)를 주형으로서 사용하여 제조된 DNA를 말한다. 게놈 DNA, 또는 게놈, 비- 또는 부분적으로-프로세싱된 RNA 주형으로부터 중합된 DNA와 달리, cDNA를 사용하는 것의 장점은 cDNA는 주로 상응하는 단백질의 암호화 서열을 함유한다는 것이다. 최적 발현을 위하여 비-암호화 영역이 필요한 경우, 또는 안티센스(antisense) 전략에서 인트론과 같은 비-암호화 영역을 표적화하는 경우와 같이, 전체 또는 부분적 게놈 서열이 바람직한 경우가 있을 수 있다.
주어진 종으로부터의 특정 폴리펩티드가, 약간 상이한 핵산 서열을 갖지만 그럼에도 불구하고 동일한 단백질을 암호화하는 천연 변이체에 의해 발현될 수 있는 것이 또한 고려된다 (상기 표 1 참조).
유사하게, 분리되거나 정제된 야생형 또는 돌연변이 폴리펩티드 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드는, 다른 천연 유전자 또는 단백질 암호화 서열로부터 실질적으로 분리된 야생형 또는 돌연변이 폴리펩티드 암호화 서열 및, 특정 양상에서, 조절 서열을 포함하는 DNA 세그먼트를 말한다. 상기 측면에서, 간단하게 사용되는 "유전자"라는 용어는 기능성 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드-암호화 단위 (적당한 전사, 해독후 변형 또는 위치결정에 필요한 임의의 서열을 포함)를 말한다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 이러한 기능적 용어에는 단백질, 폴리펩티드, 도메인, 펩티드, 융합 단백질 및 돌연변이체를 발현하거나, 발현하도록 변형될 수 있는 게놈 서열, cDNA 서열 및 조작된 작은 유전자 세그먼트가 포함된다.
천연 또는 변형된 폴리펩티드의 전부 또는 일부를 암호화하는 핵산은 다음의 길이를 갖는 이러한 폴리펩티드의 전부 또는 일부를 암호화하는 연속적인 핵산 서열을 함유할 수 있다: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 441, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1070, 1080, 1090, 1095, 1100, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 9000, 10000개 또는 그 이상의 뉴클레오티드, 뉴클레오시드 또는 염기쌍.
"재조합체"라는 용어는 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드의 이름과 함께 사용될 수 있고, 이는 일반적으로 시험관내에서 조작된 핵산 분자로부터 생산된 폴리펩티드 또는 이러한 분자의 복제된 산물인 폴리펩티드를 말한다.
본 발명에서 사용되는 핵산 세그먼트는, 암호화 서열 자체의 길이에 관계없이, 프로모터, 폴리아데닐화 시그날, 추가적인 제한 효소 부위, 다중 클로닝 부위, 다른 암호화 세그먼트 등과 같은 다른 핵산 서열과 조합되어, 이들의 전체 길이가 상당히 변화할 수 있다. 그러므로, 거의 모든 길이의 핵산 단편이 사용될 수 있고, 바람직하게는 의도된 재조합 DNA 프로토콜에서의 제조 및 사용을 용이하게 하기 위하여 전체 길이가 제한되는 것이 고려된다.
본 발명의 핵산 작제물은, 임의의 공급원으로부터의 전체 길이 폴리펩티드를 암호화하거나, 폴리펩티드의 절두된 버전, 예를 들면 절두된 백시니아 바이러스 폴리펩티드를 암호화하여 암호화 영역의 전사체가 절두된 버전을 발현하게 할 수 있는 것이 고려된다. 이어서, 절두된 전사체는 절두된 단백질로 해독될 수 있다. 태그 또는 다른 이종성 폴리펩티드를 변형된 폴리펩티드-암호화 서열에 부가할 수 있고, 이때 "이종성"은 변형된 폴리펩티드와 동일하지 않은 폴리펩티드를 말한다.
특정 다른 양태에서, 본 발명은 이들의 서열 내에 본원에서 확인된 (및/또는 참조로서 인용된) 서열에 제시된 것으로부터의 연속적인 핵산 서열을 포함하는 분리된 DNA 세그먼트 및 재조합 벡터에 관한 것이다. 하지만, 이러한 서열을 돌연변이시켜, 야생형과 비교하여 활성이 변화된 단백질 산물을 수득할 수 있다.
본 발명은 이러한 확인된 서열의 특정 핵산 및 아미노산 서열에 한정되지 않는다는 것도 이해될 것이다. 그러므로, 재조합 벡터 및 분리된 DNA 세그먼트는 폭스바이러스-암호화 영역 자체, 기본적인 암호화 영역 내에 선택된 변화 또는 변형을 갖는 암호화 영역을 다양하게 포함하거나, 그럼에도 폭스바이러스-암호화 영역을 포함하는 큰 폴리펩티드를 암호화하거나, 변이 아미노산 서열을 갖는 생물학적으로 기능성인 동등한 단백질 또는 펩티드를 암호화할 수 있다.
본 발명의 DNA 세그먼트는 생물학적으로 기능성인 동등한 폭스바이러스 단백질 및 펩티드를 포함한다. 이러한 서열은 핵산 서열 및 이에 의해 암호화된 단백질 내에서 자연적으로 발생하는 것으로 알려진 코돈 중복성 및 기능적 등가성의 결과로서 발생할 수 있다. 대안으로, 기능적으로 동등한 단백질 또는 펩티드는 재조합 DNA 기술을 적용하여 생성시킬 수 있고, 이때 치환되는 아미노산의 특성을 고려하여 단백질 구조의 변화를 조작할 수 있다. 사람에 의해 디자인된 변화를 부위-지시된 돌연변이유발 기술을 적용하여 도입시켜, 예를 들면 단백질의 항원성을 개선시킬 수 있다.
C. 폭스바이러스 폴리뉴클레오티드의 돌연변이유발
다양한 양태에서, 폭스바이러스 폴리뉴클레오티드를 변화시키거나 돌연변이유발시킬 수 있다. 변화 또는 돌연변이에는 삽입, 결실, 점 돌연변이, 역위 등이 포함될 수 있고, 이는 특정 경로 또는 분자 기전 또는 특정 단백질(예를 들어, 티미딘 키나제)을 조절, 활성화 및/또는 불활성화시킬 뿐만 아니라, 유전자 산물의 기능, 위치 또는 발현을 변화시키고, 특히 유전자 산물을 비-기능성으로 만들 수 있다. 사용되는 경우, 폭스바이러스의 전부 또는 일부를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 돌연변이유발은 다양한 표준 돌연변이유발 방법에 의해 달성될 수 있다[참조: Sambrook et al ., 1989].
돌연변이는 화학적 또는 물리적 돌연변이유발물질에 노출된 후 유도될 수 있다. 이러한 돌연변이 유도제에는 이온화 방사선, 자외선, 및 (일반적으로 일부 대사적 생체내 전환(biotransformation) 후에) 핵산과 직접적 또는 간접적으로 상호작용할 수 있는 알킬화제 및 다환식 방향족 탄화수소 모두와 같은 다양한 일련의 화학물질이 포함된다. 이러한 유도제에 의해 유도된 DNA 손상은, 영향을 받은 DNA가 복제되거나 복구되는 경우, 염기 서열이 변형되어 돌연변이를 유도할 수 있다. 돌연변이는 특정한 표적화 방법을 사용하여 부위-지시될 수도 있다.
D. 벡터
폭스바이러스 게놈에서 돌연변이를 생성하기 위해, 천연 및 변형된 폴리펩티드는 벡터에 포함된 핵산 분자에 의해 암호화될 수 있다. "벡터"라는 용어는 벡터가 복제될 수 있는 세포 속으로 도입시키기 위한 외인성 핵산 서열을 삽입시킬 수 있는 운반체 핵산 분자를 말하는데 사용된다. 핵산 서열은 "외인성"일 수 있고, 이는 벡터를 도입시키는 세포에 대해 외부의 것이라는 의미이거나, 서열이 세포 내의 서열에 대해 상동이지만 서열이 통상적으로 발견되지 않는 숙주 세포 핵산 내의 위치에 서열이 위치하는 것을 의미한다. 벡터에는 플라스미드, 코스미드, 바이러스 (박테리오파지, 동물 바이러스 및 식물 바이러스) 및 인공 염색체 (예를 들어, YAC)가 포함된다. 당업자는 본원에 참조로서 인용된 문헌[참조: Sambrook et al ., (1989) 및 Ausbel et al ., 1994]에 기술된 표준 재조합 기술을 통해 벡터를 작제할 수 있는 능력을 충분히 갖추고 있을 것이다. 변형된 겔로닌과 같은 변형된 폴리펩티드를 암호화하는 것 외에도, 벡터는 태그 또는 표적화 분자와 같은 비-변형된 폴리펩티드 서열을 암호화할 수 있다.
"발현 벡터"라는 용어는 전사될 수 있는 유전자 산물의 적어도 일부를 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 벡터를 말한다. 일부 경우에, RNA 분자는 이후에 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드로 해독된다. 다른 경우에, 이러한 서열은, 예를 들면 안티센스 분자 또는 리보자임(ribozyme)의 생산에서 해독되지 않는다. 발현 벡터는 다양한 "조절 서열"을 함유할 수 있고, 이는 특정 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결된 암호화 서열의 전사 및 아마도 해독에 필요한 핵산 서열을 말한다. 전사 및 해독을 제어하는 조절 서열 외에도, 벡터 및 발현 벡터는 하기에 기술된 다른 기능도 수행하는 핵산 서열을 함유할 수 있다.
1. 프로모터 및 인핸서
"프로모터"는 개시 및 전사 속도가 조절되는 핵산 서열의 영역인 조절 서열이다. 이는 RNA 폴리머라제 및 다른 전사 인자와 같은 조절 단백질 및 분자가 결합할 수 있는 유전적 요소를 함유할 수 있다. "작동가능하게 위치한", "작동가능하게 연결된", "조절 하에" 및 "전사적 조절하에"라는 어구는 프로모터가 핵산 서열과 관련하여 정확한 기능적 위치 및/또는 배향으로 존재하여 상기 서열의 전사 개시 및/또는 발현을 조절하는 것을 의미한다. 프로모터는 핵산 서열의 전사적 활성화에 관련된 시스-작용(cis-acting) 조절 서열을 말하는 "인핸서"와 함께 사용되거나 그렇지 않을 수 있다.
프로모터는, 암호화 세그먼트 및/또는 엑손의 상류에 위치한 5' 비-암호화 서열을 분리하여 수득될 수 있는 것과 같이, 유전자 또는 서열과 본래 연결되어 있는 것일 수 있다. 이러한 프로모터는 "내인성"이라고 할 수 있다. 유사하게, 인핸서는 이러한 서열의 하류 또는 상류에 위치한 핵산 서열과 본래 연결되어 있는 것일 수 있다. 대안으로, 암호화 핵산 세그먼트를 재조합 또는 이종성 프로모터(자연 환경에서는 핵산 서열과 일반적으로 연결되어 있지 않은 프로모터를 말함)의 조절 하에 위치시켜 특정한 장점을 얻을 것이다. 재조합 또는 이종성 인핸서는 또한 자연 환경에서는 핵산 서열과 일반적으로 연결되어 있지 않은 인핸서를 말한다. 이러한 프로모터 또는 인핸서에는 다른 유전자의 프로모터 또는 인핸서, 및 임의의 다른 원핵생물, 바이러스 또는 진핵생물 세포로부터 분리된 프로모터 또는 인핸서, 및 "천연"이 아닌, 즉 상이한 전사 조절 영역의 상이한 요소 및/또는 발현을 변화시키는 돌연변이를 함유하는 프로모터 또는 인핸서가 포함될 수 있다. 프로모터 및 인핸서의 핵산 서열을 합성적으로 생산하는 것 이외에, 서열은 본원에 공개된 조성물과 함께 재조합 클로닝 및/또는 핵산 증폭 기술 (예를 들어, PCR™)을 사용하여 생산할 수 있다[참조: 본원에 참조로서 인용된 미국 특허 공보 제4,683,202호, 제5,928,906호]. 또한, 미토콘드리아, 엽록체 등과 같은 비-핵 세포소기관 내에서 서열의 전사 및/또는 발현을 지시하는 조절 서열을 사용할 수도 있는 것이 고려된다.
물론, 발현을 위하여 선택된 세포 종류, 세포소기관 및 유기체에서 DNA 세그먼트의 발현을 효과적으로 지시하는 프로모터 및/또는 인핸서를 사용하는 것이 중요할 수 있다. 분자 생물학 분야의 숙련자는 일반적으로 단백질 발현을 위한 프로모터, 인핸서 및 세포 종류 조합의 사용을 알고 있다[예를 들어, 참조: 본원에 참조로서 인용된 Sambrook et al . (1989)]. 사용되는 프로모터는, 재조합 단백질 및/또는 펩티드의 대규모 생산에 유리한 것과 같이, 도입된 DNA 세그먼트의 높은 수준의 발현을 지시하는데 적당한 조건하에서 구성적(constitutive), 조직-특이적, 유도성이고/이거나 유용할 수 있다. 프로모터는 이종성이거나 내인성일 수 있다.
조직-특이적 프로모터 또는 요소의 확인 뿐만 아니라, 이들의 활성을 특성규명하기 위한 분석은 당업자에게 익히 공지되어 있다. 이러한 영역의 예에는 사람 LIMK2 유전자[참조: Nomoto et al . 1999], 소마토스타틴 수용체 2 유전자[참조: Kraus et al ., 1998], 뮤린 부고환 레티노산-결합 유전자[참조: Lareyre et al ., 1999], 사람 CD4[참조: Zhao-Emonet et al., 1998], 마우스 α2 (XI) 콜라겐 [참조: Tsumaki, et al., 1998], D1A 도파민 수용체 유전자[참조: Lee, et al., 1997], 인슐린-유사 성장 인자 II[참조: Wu et al., 1997], 사람 혈소판 내피 세포 부착 분자-1[참조: Almendro et al., 1996] 및 SM22α 프로모터가 포함된다.
2. 개시 시그날 및 내부 리보솜 결합 부위
특정한 개시 시그날이 암호화 서열의 효율적인 해독을 위하여 필요할 수도 있다. 이러한 시그날에는 ATG 개시 코돈 또는 인접한 서열이 포함된다. ATG 개시 코돈을 포함하는 외인성 해독 조절 시그날이 제공되어야 할 필요가 있을 수 있다. 당업자는 이를 쉽게 결정하여 필요한 시그날을 제공할 수 있을 것이다. 개시 코돈은 목적하는 암호화 서열의 판독 프레임(reading frame)과 "프레임을 유지하며" 존재해야 전체 삽입체의 해독이 보장된다는 것은 익히 공지되어 있다. 외인성 해독 조절 시그날 및 개시 코돈은 천연적이거나 합성적일 수 있다. 발현의 효율은 적당한 전사 인핸서 요소를 포함시켜 향상될 수 있다.
본 발명의 특정 양태에서, 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 요소의 용도는 사용하여 다중유전자, 폴리시스트론성(polycistronic), 메시지(message)를 생성시키는데 사용된다. IRES 요소는 5'-메틸화된 캡 의존성 해독의 리보솜 스캐닝 모델을 우회하여 내부 부위에서 해독을 개시시킬 수 있다[참조: Pelletier and Sonenberg, 1988]. 피코르나바이러스 과의 2개의 일원 (폴리오 및 뇌심근염 바이러스)의 IRES 요소[참조: Pelletier and Sonenberg, 1988] 뿐만 아니라, 포유동물 메시지로부터의 IRES도 기술되었다[참조: Macejak and Sarnow, 1991]. IRES 요소를 이종성 개방 판독 프레임(open reading frame)에 연결시킬 수 있다. 각각 IRES에 의해 분리된 다수의 개방 판독 프레임이 함께 전사되어, 폴리시스트론성 메시지가 생성될 수 있다. IRES 요소에 의해, 각각의 개방 판독 프레임이 리보솜에 접근가능하여 효율적으로 해독된다. 단일 프로모터/인핸서를 사용해서 단일 메시지를 전사시켜 다수의 유전자를 효율적으로 발현시킬 수 있다[참조: 본원에 참조로서 인용된 미국 특허 공보 제5,925,565호 및 제5,935,819호].
3. 다중 클로닝 부위
벡터는, 표준 재조합 기술과 함께 사용되어 벡터를 분해시킬 수 있는 다수의 제한 효소 부위를 함유하는 핵산 영역인 다중 클로닝 부위(MCS)를 포함할 수 있다[참조: 본원에 참조로서 인용된 Carbonelli et al., 1999, Levenson et al., 1998, 및 Cocea, 1997]. "제한 효소 분해"는 핵산 분자 내의 특정 위치에서만 기능하는 효소를 사용한 핵산 분자의 촉매적 개열을 말한다. 다수의 이러한 제한효소가 시판된다. 이러한 효소의 사용은 당업자가 폭넓게 이해하고 있다. 종종, 벡터를 MCS 내에서 절단하는 제한 효소를 사용하여 선형화시키거나 단편화시켜, 외인성 서열이 벡터에 연결되게 할 수 있다. "연결"은 서로 연속적이거나 연속적이지 않을 수 있는 2개의 핵산 단편 사이에 포스포디에스테르 결합이 형성되는 과정을 말한다. 제한 효소 및 연결 반응과 관련된 기술은 재조합 기술 분야의 숙련자에게 익히 공지되어 있다.
4. 스플라이싱(splicing) 부위
대부분의 전사된 진핵생물 RNA 분자는 RNA 스플라이싱이 일어나 1차 전사체로부터 인트론이 제거될 것이다. 진핵생물 게놈 서열을 함유하는 벡터는, 단백질 발현을 위한 전사체의 적당한 프로세싱을 보장하기 위하여 공여체 및/또는 수용체 스플라이싱 부위를 필요로 할 수 있다[참조: 본원에 참조로서 인용된 Chandler et al., 1997].
5. 종결 시그날
본 발명의 벡터 또는 작제물은 일반적으로 적어도 하나의 종결 시그날을 포함할 것이다. "종결 시그날" 또는 "종결인자(terminator)"는 RNA 폴리머라제에 의한 RNA 전사체의 특이적인 종료에 관련된 DNA 서열을 포함한다. 따라서, 특정 양태에서, RNA 전사체의 생산을 종료시키는 종결 시그날이 고려된다. 종결인자는 생체내에서 바람직한 메시지 수준을 달성하는데 필요할 수 있다.
진핵생물 시스템에서, 종결인자 영역은 새로운 전사체의 부위-특이적인 개열을 가능하게 하여 폴리아데닐화 부위를 노출시키는 특정 DNA 서열을 포함할 수도 있다. 이는 특수한 내인성 폴리머라제가 전사체의 3' 말단에 일련의 약 200개의 A 잔기 (폴리A)를 부가하도록 시그날을 전달한다. 이러한 폴리A 테일(tail)로 변형된 RNA 분자는 보다 안정하고 보다 효율적으로 해독되는 것 같다. 따라서, 진핵생물과 관련된 다른 양태에서, 종결인자가 RNA의 개열을 위한 시그날을 포함하는 것이 바람직하고, 종결인자 시그날이 메시지의 폴리아데닐화를 촉진시키는 것이 보다 바람직하다. 종결인자 및/또는 폴리아데닐화 부위 요소는 메시지 수준을 향상시키고/시키거나 카세트(cassette)에서부터 다른 서열까지 판독되는 것을 최소화시키는 역할을 할 수 있다.
본 발명에서 사용하는데 고려되는 종결인자에는 본원에서 기술되거나 당업자에게 공지된 임의의 공지된 전사 종결인자가 포함되고, 예를 들면, 유전자의 종결 서열 (예를 들어, 소 성장 호르몬 종결인자) 또는 바이러스 종결 서열 (예를 들어, SV40 종결인자)이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 특정 양태에서, 종결 시그날은, 예를 들면 서열 절두로 인하여, 전사가능하거나 해독가능한 서열이 없을 수 있다.
6. 폴리아데닐화 시그날
발현에서, 특히 진핵생물 발현에서, 통상적으로 폴리아데닐화 시그날을 포함시켜 전사체의 적당한 폴리아데닐화에 영향을 미칠 것이다. 폴리아데닐화 시그날의 특성은 본 발명의 성공적인 실시에 결정적인 것으로 생각되지 않고/않거나 임의의 이러한 서열을 사용할 수 있다. 바람직한 양태에는 편리하고/하거나 다양한 표적 세포에서 기능을 잘하는 것으로 공지된 SV40 폴리아데닐화 시그날 및/또는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 시그날이 포함된다. 폴리아데닐화는 전사체의 안정성을 증가시키거나 세포질 운반을 촉진시킬 수 있다.
7. 복제 오리진(origin of replication)
벡터를 숙주 세포에서 증식시키기 위하여, 벡터는 복제가 개시되는 특정한 핵산 서열인 하나 이상의 복제 오리진 부위 (종종 "ori"라고 함)를 함유할 수 있다. 대안으로, 숙주 세포가 효모인 경우에는 자가 복제 서열(ARS)을 사용할 수 있다.
8. 선별가능 및 스크리닝가능 마커
본 발명의 특정 양태에서, 본 발명의 핵산 작제물을 함유하는 세포는 발현 벡터에 마커를 포함시켜 시험관내 또는 생체내에서 확인할 수 있다. 이러한 마커는 확인가능한 변화를 세포에 부여하여, 발현 벡터를 함유하는 세포를 쉽게 확인할 수 있게 할 것이다. 일반적으로, 선별가능 마커는 선별을 가능하게 하는 특성을 부여하는 것이다. 양성 선별가능 마커는 마커의 존재가 이의 선별을 가능하게 하는 것이고, 반면에 음성 선별가능 마커는 이의 존재가 이의 선별을 막는 것이다. 양성 선별가능 마커의 예로는 약물 내성 마커가 있다.
일반적으로 약물 선별 마커의 포함은 형질전환체의 클로닝 및 확인을 돕고, 예를 들면, 네오마이신, 퓨로마이신, 하이그로마이신, DHFR, GPT, 제오신(zeocin) 및 히스티디놀에 대한 내성을 부여하는 유전자는 유용한 선별가능 마커이다. 조건의 이행에 따라 형질전환체의 구별을 가능하게 하는 표현형을 부여하는 마커 외에도, 비색 분석을 토대로 하는 GFP와 같은 스크리닝가능한 마커를 포함하는 다른 종류의 마커도 고려된다. 대안으로, 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 (tk) 또는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT)와 같은 스크리닝가능한 효소를 사용할 수 있다. 당업자는 아마도 FACS 분석과 함께 면역학적 마커를 사용하는 방법도 알고 있을 것이다. 사용되는 마커는, 유전자 산물을 암호화하는 핵산과 동시에 발현될 수 있는 한, 중요한 것으로 생각되지 않는다. 선별가능 및 스크리닝가능 마커의 추가적인 예는 당업자에게 익히 공지되어 있다.
E. 숙주 세포
본원에 사용된 용어 "세포", "세포주" 및 "세포 배양"은 상호교환적으로 사용될 수 있다. 당해 용어 모두는 또한 임의의 모든 후속 세대인 이들의 자손을 포함한다. 모든 자손은 의도되거나 의도되지 않은 돌연변이로 인해 동일하지 않을 수 있다는 것이 이해된다. 이종 핵산 서열을 발현하는 것과 관련하여, "숙주 세포"는 원핵 또는 진핵 세포를 의미하고 이것은 벡터를 복제할 수 있고/있거나 벡터에 의해 암호화된 이종성 유전자를 발현시킬 수 있는 임의의 형질전환가능한 유기체를 포함한다. 숙주 세포는 벡터 또는 바이러스(이것이 외인성 폴리펩티드를 발현하지 않는다면 벡터로서의 자격이 없다)에 대한 수용자로서 사용될 수 있고 사용되었다. 숙주 세포는 "형질감염된" 또는 "형질전환된"일 수 있고 이는 외인성 핵산, 예를 들어, 변형된 단백질-암호화 서열이 숙주 세포로 형질감염되거나 도입되는 과정을 의미한다. 형질전환된 세포는 주요 대상 세포 및 이의 자손을 포함한다.
숙주 세포는 원핵 세포, 또는 효모 세포, 곤충 세포 및 포유동물 세포를 포함하는 진핵 세포 유래일 수 있고, 이는 목적하는 결과가 벡터의 복제이거나 벡터- 암호화된 핵산 서열의 일부 또는 모두의 발현이냐에 따라 다양하다. 많은 세포주 및 배양물은 숙주 세포로서 사용하기 위해 유용하고 이들은 생존 배양물 및 유전자 물질을 보관하는 기관인 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션[American Type Culture Collection(ATCC)]을 통해 구입할 수 있다(www.atcc.org). 적당한 숙주는 벡터 골격 및 목적하는 결과를 기준으로 당업자에 의해 결정될 수 있다. 플라스미드 또는 코스미드는 예를 들어, 많은 벡터의 복제를 위해 원핵 숙주 세포로 도입될 수 있다. 벡터 복제 및/또는 발현을 위해 숙주 세포로서 사용되는 세균 세포는 SURE^? 컴피턴트 세포 및 SOLOPACK^TM 골드 세포(STRATAGENE^? La Jolla, Calif.)와 같은 다수의 시판되는 세균 숙주 뿐만 아니라 DH5α, JM109, 및 KC8을 포함한다. 대안으로, 이.콜라이 LE392와 같은 세균 세포는 파아지 바이러스를 위한 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 적당한 효모 세포는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae ), 사카로마이세스 폼베(Saccharomyces pombe ), 및 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)를 포함한다.
벡터의 복제 및/또는 발현을 위한 진핵 숙주 세포의 예는 HeLa, NIH3T3, Jurkat, 293, Cos, CHO, Saos, 및 PC12를 포함한다. 다양한 세포 유형 및 유기체 기원의 많은 숙주 세포는 유용하고 당업자에게 공지될 수 있다. 유사하게, 바이러스 벡터는 특히 벡터의 복제 또는 발현을 위해 허용되는 것인 진핵 세포 또는 원핵 숙주 세포와 연계하여 사용될 수 있다.
몇몇 벡터는 이것이 원핵 세포 및 진핵 세포 둘 다에서 복제되고/되거나 발현되도록 하는 조절 서열을 사용할 수 있다. 당업자는 추가로 상기된 숙주 세포 모두를 유지하고 벡터의 복제를 허용하기 위해 당해 세포를 배양하는 조건을 이해할 것이다. 또한 벡터에 의해 암호화된 핵산 및 이들의 동종 폴리펩티드, 단백질 또는 펩티드의 제조 뿐만 아니라, 벡터의 대규모 생산을 가능하게 하는 기술 및 조건은 공지되어 있고 이해되고 있다.
F. 유전자 전달 방법
본 발명의 조성물의 발현에 영향을 미치는 핵산 전달에 적당한 방법에는, 본원에서 기술되거나 당업자에게 공지된 바와 같이, 핵산 (예를 들어, 바이러스 및 비-바이러스 벡터를 포함하는 DNA)을 세포소기관, 세포, 조직 또는 유기체 속으로 도입시킬 수 있는 거의 모든 방법이 포함된다고 생각된다. 이러한 방법에는 주입 [참조: 본원에 참조로서 인용된 미국 특허 공보 제5,994,624호, 제5,981,274호, 제5,945,100호, 제5,780,448호, 제5,736,524호, 제5,702,932호, 제5,656,610호, 제5,589,466호 및 제5,580,859호], 예를 들면 미세주입 [참조: 본원에 참조로서 인용된 Harland and Weintraub, 1985; 미국 특허 공보 제5,789,215호]; 전기영동 [참조: 본원에 참조로서 인용된 미국 특허 공보 제5,384,253호]; 인산칼슘 침전 [참조: Graham and Van Der Eb, 1973; Chen and Okayama, 1987; Rippe　 et al .,　1990]; DEAE-덱스트란을 사용한 후의 폴리에틸렌 글리콜의 사용 [참조: Gopal, 1985]; 직접적인 초음파 로딩(sonic loading) [참조: Fechheimer　et al.,　1987]; 리포좀 매개된 형질감염 [참조: Nicolau and Sene, 1982; Fraley　et al.,　1979; Nicolau　et al.,　1987; Wong　et al., 1980; Kaneda　et al.,　1989; Kato　et al.,　1991]; 미세발사체 포격(microprojectile bombardment) [참조: 본원에 참조로서 인용된 국제 특허 출원 공보 제WO 94/09699호 및 제95/06128호; 미국 특허 공보 제5,610,042호, 제5,322,783호, 제5,563,055호, 제5,550,318호, 제5,538,877호 및 제5,538,880호]; 탄화규소 섬유를 사용한 교반 [참조: 본원에 참조로서 인용된 Kaeppler　 et al .,　1990; 미국 특허 공보 제5,302,523호 및 제5,464,765호]; 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개된 형질전환 [참조: 본원에 참조로서 인용된 미국 특허 공보 제5,591,616호 및 제5,563,055호]; 또는 원형질체의 PEG-매개된 형질전환[참조: 본원에 참조로서 인용된 Omirulleh　 et al .,　1993; 미국 특허 공보 제4,684,611호 및 제4,952,500호]; 건조/억제-매개된 DNA 흡수 [참조: Potrykus　 et al.,　1985]에 의해서와 같은 DNA의 직접적인 전달이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 이와 같은 기술의 적용을 통해, 세포소기관(들), 세포(들), 조직(들) 또는 유기체(들)를 안정하게 또는 일시적으로 형질전환시킬 수 있다.
G. 지질 성분 및 잔기
특정 양태에서, 본 발명은 핵산, 아미노산 분자 (예를 들어, 펩티드) 또는 또 다른 작은 분자 화합물과 결합된 하나 이상의 지질을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본원에서 논의된 임의의 양태에서, 분자는 폭스바이러스 폴리펩티드 또는 폭스바이러스 폴리펩티드 조절인자, 예를 들면 폭스바이러스 폴리펩티드의 전부 또는 일부를 암호화하는 핵산, 또는 대안으로, 폭스바이러스 폴리펩티드 조절인자의 전부 또는 일부를 암호화하는 아미노산 분자일 수 있다. 지질은 특징적으로 물에 불용성이고 유기 용매로 추출가능한 물질이다. 본원에서 구체적으로 기술된 것 이외의 화합물은 당업자에 의해 지질로서 이해되고, 본 발명의 조성물 및 방법에 포함된다. 지질 성분 및 비-지질은 서로 공유적으로 또는 비-공유적으로 부착될 수 있다.
지질은 천연 또는 합성 (즉, 사람에 의해 디자인되거나 생산된) 지질일 수 있다. 하지만, 지질은 일반적으로 생물학적 물질이다. 생물학적 지질은 당업계에 익히 공지되어 있고, 예를 들면, 중성 지방, 인지질, 포스포글리세라이드, 스테로이드, 테르펜, 리소리피드, 글리코스핀고리피드, 글루코리피드, 설파티드, 에테르 및 에스테르-결합된 지방산을 갖는 지질 및 중합가능한 지질, 및 이들의 조합이 포함된다.
지질과 결합된 핵산 분자 또는 아미노산 분자 (예를 들어, 펩티드)를, 지질을 함유하는 용액 중에 분산시키거나, 지질과 함께 용해시키거나, 지질과 함께 유화시키거나, 지질과 혼합하거나, 지질과 배합하거나, 지질에 공유결합시키거나, 지질 중에 현탁액으로서 함유시키거나, 또는 지질과 결합시킬 수 있다. 본 발명의 지질 또는 지질/폭스바이러스-결합된 조성물은 임의의 특정 구조에 한정되지 않는다. 예를 들면, 이들은 단순하게 용액 중에 산재되어, 아마도 크기 또는 모양이 일정하지 않은 집합체를 형성할 수도 있다. 또 다른 예에서, 이들은 마이셀(micelle)로서 또는 "붕괴된" 구조로, 이중층 구조로 존재할 수 있다. 또 다른 비제한적인 예에서, 리포펙타민(lipofectamine)[판매원: Gibco BRL]-폭스바이러스 또는 슈퍼펙트(Superfect)[판매원: Qiagen]-폭스바이러스 복합체도 고려된다.
특정 양태에서, 지질 조성물은 특정 지질, 지질 종류 또는 비-지질 성분, 예를 들어, 본원에서 공개되거나 당업자에게 공지된 약물, 단백질, 당, 핵산 또는 다른 물질을 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4% 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25%, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29%, 약 30%, 약 31%, 약 32%, 약 33%, 약 34%, 약 35%, 약 36%, 약 37%, 약 38%, 약 39%, 약 40%, 약 41%, 약 42%, 약 43%, 약 44%, 약 45%, 약 46%, 약 47%, 약 48%, 약 49%, 약 50%, 약 51%, 약 52%, 약 53%, 약 54%, 약 55%, 약 56%, 약 57%, 약 58%, 약 59%, 약 60%, 약 61%, 약 62%, 약 63%, 약 64%, 약 65%, 약 66%, 약 67%, 약 68%, 약 69%, 약 70%, 약 71%, 약 72%, 약 73%, 약 74%, 약 75%, 약 76%, 약 77%, 약 78%, 약 79%, 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 100% 또는 이 사이의 임의의 범위로 포함할 수 있다. 비제한적인 예에서, 지질 조성물은 약 10% 내지 약 20%의 중성 지질, 및 약 33% 내지 약 34%의 세레브로사이드, 및 약 1%의 콜레스테롤을 포함할 수 있다. 다른 비제한적인 예에서, 리포좀은 약 4% 내지 약 12%의 테르펜 (이때, 마이셀의 약 1%는 구체적으로는 라이코펜이고, 리포좀의 나머지 약 3% 내지 약 11%는 다른 테르펜을 포함함); 및 약 10% 내지 약 35%의 포스파티딜 콜린, 및 약 1%의 약물을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 지질 조성물은 임의의 지질, 지질 종류 또는 다른 성분을 임의의 조합 또는 % 범위로 포함할 수 있는 것이 고려된다.
IV. 실시예
다음의 실시예는 본 발명의 다양한 양태를 예시하는 목적을 위하여 제시되며 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하도록 의미하지는 않는다. 당업자는 본 발명이 본원에 언급된 목적을 수행하고 목표 및 장점을 달성할 뿐만 아니라 본 발명에 내재된 목적, 목표 및 장점을 달성하는데 충분히 적당하다는 것을 쉽게 인식할 것이다. 본 실시예는 본원에 기재된 방법과 함께 바람직한 양태를 현재 대표하며 예시하지만 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 특허청구범위에 정의된 본 발명의 취지 내에 포함되는 기타 용도 및 변화는 당업자라면 인식할 수 있을 것이다.
임상전 연구는 뮤린 HCC 모델에서 수행하여 JX-594 유도된 혈관 폐쇄 및 후속 재관류의 기전을 평가한다. 재관류를 차단하기 위한 소라페니브의 잠재력을 평가하였다. 2기 임상 시험에서, HCC를 갖는 환자는 3주기 동안 2주 마다 종양내 주사에 의해 JX-594로 치료하였다. 종양 크기, 혈류 및 밀도는 기준선 5일째 및 8주째에 동적 조영 증강된 (dce)-MRI 및 DW-MRI로 평가하였다. 8주째에 부분적 종양 재관류를 갖는 2명의 환자는 표준 소라페니브 치료요법을 개시하고, 후속적인 DCE-MRI 스캐닝을 수행하였다.
종양 혈관 폐쇄는 뮤린 HCC 모델에서 JX-594의 IT 또는 IV 투여 후 입증되었다. 혈관 폐쇄는 바이러스 복제에 의존하였고; 바이러스로부터의 mGM-CSF 발현 및 호중구 침투는 상기 효과를 증진시켰다. 종양 테두리의 재관류는 시간 경과에 따라 입증되었고 종양내 증가된 VEGF 수준과 관련되었다. 보조제 소라페니브 치료요법은 혈관형성을 억제하였고 단독의 제제에 대한 항-종양 효능을 상당히 개선시켰다. JX-594로 치료한 HCC 환자는 간내에 주사되고 비주사된 종양 둘다에서 급성 종양 혈관 폐쇄 및 괴사를 입증하였다. 8주 평가 후 소라페니브를 사용한 보조제 치료요법은 2명의 환자에서 급격하고 지속적인 종양 괴사 및 혈관 폐쇄를 유도하였다. 단독의 소라페니브에 대한 HCC 환자로부터의 연속 MRI 스캔을 검토한 결과 이들 발견이 JX-594로 전처리된 환자에게 특이적임을 입증하였다.
종양은 높은 돌연변이율을 갖고 따라서 고도의 이질성을 가져 임의의 하나의 치료요법에 대해 혼합된 반응을 유도하기 때문에, 대안적인 작용 기작을 갖는 특정 항암제를 병용하는 것이 유용할 수 있다. 소라페니브와 종양 용해 바이러스 치료요법의 병용이 안전하고 효과적인지를 결정하기 위해, 시험관내 및 생체내 임상전 실험을 수행하였다.
실시예 1
시험관내 데이타 - 소라페니브는 JX-594를 억제한다
JX-594는 사람 HCC 세포주 PLC/PRF/5에 대해 소라페니브와 병용하여 시험하였다. PLC/PRF/5 사람 HCC 세포주는 JX-594 복제를 지원한다. 그러나, 소라페니브가 (10 μΜ)가 JX-594 감염 전, 감염 동안에 또는 2시간 후에 첨가되는 경우, 방출량는 100배까지 감소하였다(도 1). JX-594는 또한 사람 난소암 세포주 A2780 및 사람 HCC 주 HepG2에 대해 소라페니브와 병용하여 시험되었다.
세포 배양 및 소라페니브 제제: 사람 종양 세포주 A2780 (난소) 및 HepG2 (HCC)는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)으로부터 수득하였다. 세포는 10% FBS와 1% pen/step이 보충된 DMEM에서 배양하였다. 세포는 5% CO₂를 함유하는 습윤화된 배양기에서 37℃에서 성장시켰다. 시험관내 사용을 위해, 소라페니브는 1mg/ml의 농도로 DMSO(Sigma-Aldrich Corp.)중에 용해시키고 추가로 10% 소 태아 혈청을 함유한 DMEM중에서 적당한 최종 농도(100 ng/ml, 250 ng/ml, 500 ng/ml, 1000 ng/ml 및 2500 ng/ml)로 희석하였다. 최종 용액중 DMSO는 0.2%(v/v)를 초과하지 않았다.
플라크 형성, 방출 분석 및 세포 생존도: A2780 또는 HepG2 세포는 4 x 10⁵ 세포/웰로 6-웰 플레이트에 씨딩하고, 밤새 방치하였다. 이어서, 100 pfu의 JX-594를 각각의 웰에 첨가하고 2시간동안 감염되도록 방치하였다. 감염 말기에, 상기 배지를 제거하고 0, 0.1, 0.25, 0.5, 1.0 및 2.5 μg/mL의 최종 농도로 소라페니브를 함유하는 3% 카르복시메틸셀룰로스 DMEM 오버레이를 첨가하였다. 3일 후, 플레이트를 크리스탈 바이올렛으로 염색시키고 플라크를 계수하였다. 이와 병행하여 복제(방출량)를 평가하기 위해, 6-웰 플레이트를 상기와 같이 제조하였다. 플라크를 염색하고 계수하는 것 대신, 세포는 바이러스 정제를 위해 각각의 웰로부터 수거하였다. 세포를 3회 동결 및 해동시키고 이어서 초음파 처리하여 용해시킨 후 원액 바이러스 용해물의 연속 희석액을 A2780 세포에 첨가하여 플라크 분석에 의해 바이러스 역가를 측정하였다. 추가로, 세포 생존도에 대한 소라페니브의 직접적인 효과를 평가하기 위해, 세포를 96웰 플레이트에 분주하고 단독의 소라페니브로 항온처리하였다. 세포 생존도는 테트라졸륨 염의 생존 세포에 의해 매개되는 포르마잔 크로마겐으로의 환원을 기초로 하는 비색 측정 분석으로 결정하였다(세포 계수 키트-8, Donjindo Laboratories, Kumamoto, Japan).
결과: 세포 독성 수준 미만 농도의 소라페니브는 A2780 및 HEPG2 종양 세포주 상의 바이러스 성장 및 복제를 억제할 수 있다(도 2). 추가의 실험은 소라페니브가 SNU423, SNU398, SNU475, SNU449, SNU387 및 사람 골육종주 U20S를 포함하는 다른 사람 HCC 주에서 JX-594 복제를 억제함을 보여주었다.
소라페니브는 멀티키나제 억제제이고 세포내 세린/트레오닌 키나제 Raf-1 및 B-Raf를 억제하여 Ras 시그날 전달 경로(RAS/RAF/MEK/ERK)를 억제할 수 있다. Ras/Raf 경로의 활성화는 통상적으로 암에서 발생하고 티미딘 키나제(TK)와 같은 S-상 유전자를 포함하는, E2F-반응성 유전자의 전사 활성화를 유도한다 (문헌참조: Hengstschlager et al., 1994). JX-594는 바이러스 TK 유전자의 불활성화에 의해 약독화되는 백시니아 바이러스이다. 상기 돌연변이는 고수준의 세포성 TK를 갖는 세포(즉, 항상성 E2F 활성화를 유도하는 비정상적으로 활성화된 경로를 갖는 암세포)에서 선택적 복제를 제공하도록 디자인된다. 따라서, 소라페니브 및 JX-594 둘다는 활성화된 Ras 경로를 갖는 표적화된 암 세포로 디자인되고 시험관내에서 치료요법의 동시 투여는 활성화된 Ras 경로에 의존하는 바이러스 복제의 억제를 유도할 수 있다.
실시예 2
생체내 데이타 - 소라페니브는 JX-594를 증진시킨다
시험관내 발견과는 반대로, 임상전 효능 모델은 소라페니브와 JX-594의 병용이 단독의 제제보다 우수한 효능을 나타냄을 보여주었다.
소라페니브는 생체내에서 뮤린 CT26 원발성 종양에 대한 JX-594 활성을 증진시킨다: JX-594 및 소라페니브의 병용은 피하 이식된 CT26 결장직장 종양 세포의 면역적격성 뮤린 모델에서 시험하였다. Balb/c 마우스에 3 x 10⁵ CT26 세포를 피하 주사하고 11일 후 단독의 소라페니브(10 mg/kg p.o. 2주 동안 매일), 단독의 JX594 (1주 동안 주당 3회 10⁸ pfu IV), 또는 병용하여 (소라페니브 전 JX594, 또는 JX594 전 소라페니브) 처리를 개시하였다(n = 그룹 당 4) (도 3, 상부 패널). 대조군 동물에는 PBS만을 투여하였다. 상기 실험을 위해, 뮤린 GM-CSF를 발현하는 JX-594 버젼을 사용하였다. 종양은 종점시까지 주당 2회 측정하였다. 처리 후 각각의 시점에서 각각의 연구 그룹의 생존 비율을 나타낸다(도 3, 중간 패널). 처리후 각각의 시점에서 각각의 연구 그룹의 평균 종양 용적을 나타낸다(도 3, 하부 패널). 단독의 JX-594와 비교하여, 소라페니브와 병용된 JX-594는 생존을 증진시켰고 종양 과적(burden)을 감소시켰다. 소라페니브와 병용된 JX-594는 또한 소라페니브 단독 처리된 동물과 비교하여 종양 과적을 감소시켰다. 바람직한 치료 요법은 JX-594 처리 후 소라페니브 처리였다.
소라페니브는 생체내 뮤린 B16 흑색종 폐 노듈에 대한 JX-594 활성을 증진시킨다: JX-594와 소라페니브의 병용은 B16 흑색종 종양의 면역적격성 뮤린 모델에서 시험하였다. C57BL/6 마우스에 3 x l0⁵ B16-F10-LacZ 세포를 IV 주사하고 단독의 소라페니브(HD: 10 mg/kg, LD: 50 μg/kg p.o. 2주동안 매일), 단독의 JX594 (1주 동안 주당 3회 10⁷ pfu IV), 또는 병용하여(JX-594 IV 전 LD 또는 HD 소라페니브) (n = 그룹 당 5)(도 4, 상부 패널) 처리하였다. 처리 말기에, 마우스를 희생시키고 폐를 고정하고 염색하여 B16 표면 노듈을 검출하였다(n = 그룹 당 5). 연구 말기에 종양 노듈의 평균 수는 각각의 그룹에 대해 나타낸다(도 4). 50 μg/kg p.o. 소라페니브 + JX-594 그룹에서, 단독의 JX-594 그룹 또는 단독의 소라페니브 그룹과 비교하여 B16 종양을 상당히 감소시켰다.
소라페니브는 생체내에서 사람 HCC 이종이식체 모델에 대한 JX-594 활성을 증진시킨다: SCID 마우스에 피하 HepG2 사람 간세포 암종 이종이식체 종양을 이식하였다. 종양이 대략 12 내지 14mm의 최대 직경 크기 도달하면, 마우스를 6개의 처리 그룹 중 하나에 무작위 할당한다(n = 그룹당 8): (1) 단독의 PBS, (2) 단독의 소라페니브(400ug으로 매일 표준 복강내 투여), (3) 단독의 JX-594 (6개 총 투여를 위해 주당 10⁷ pfu의 정맥내 처리), (4) JX-594와 소라페니브의 동시 처리, (5) 소라페니브 처리에 이어서 JX-594 처리 및 (6) JX-594 (2회 용량) 처리에 이어서 소라페니브 처리.
종양 크기는 캘리퍼(caliper)를 사용하여 측정하고 종양 과적이 윤리적 목적상 허용가능한 한계치에 도달하는 경우 마우스를 안락사시켰다. JX-594 처리 후 소라페니브를 처리하는 치료 요법은 종양 성장 및 시간 대 종양 진행 측면에서 대조군 또는 단독의 제제보다 우수하였다. 또한, 상기 처리 순서는 소라페니브 후 JX-594 처리 및 동시 처리보다 우수하였다(도 5).
A. 혈관 폐쇄의 임상전 HCC 종양 모델 연구
실험적 방법, 파일롯 실험: 상기 파일롯 실험은 JX-594 후 소라페니브 처리가 HepG2 모델에서 급성 혈관 폐쇄를 유도함을 보여주기 위해 디자인하였다. 3개의 그룹을 사용하였다(n= 각 5마리의 동물). 그룹 1에서는 단지 PBS를 투여하였고; 그룹 2에서는 1회 용량의 10⁶ pfu JX-594를 정맥내(IV) 투여하였고; 그룹 3에서는 1회 용량의 10⁶ pfu JX-594를 종양내(IT) 투여하였다. VEGF 및 GM-CSF 수준을 측정하기 위해 5일 째에 혈청 샘플을 수거하였다. 안락사시키기 전에, 마우스에 형광성 미소구를 주사하여 종양 관류가 가시화되도록 하였다. 절제된 종양은 분석을 위해 세 부분으로 나누었다: 1) VEGF 단백질 수준을 측정하기 위한 순간 동결된 샘플, 2) 미소구 및 혈관 마커 CD31을 가시화하기 위한 동결된 종양 절편의 OCT-매립된 샘플 제조 및 3) 조직학적 분석을 위한 포르말린 고정된/파라핀-매립된 샘플.
실험 방법, 혈관질 연구: 상기 연구는 혈관질에 대한 보다 장기적 효과에 대해 수행하였고 HepG2 모델에서 JX-594 +/- 소라페니브의 효능을 평가하였다. HepG2 (사람 HCC 주) 종양은 누드 마우스에 피하 이식하였다. 동물은 7개의 처리 그룹으로 무작위 할당하여(n= 그룹당 5) 단독의 제제 및 병용 제제를 시험하였다. 그룹은 도 6에서와 같이 세부 스케줄에 따라 JX-594 (10⁶ pfu 종양내, D1 및 D8) 및/또는 소라페니브 (400 ㎍ i.p., 매일 D15-D29) 또는 PBS (대조군)로 처리하였다. 종양은 캘리퍼를 사용하여 주당 2회 측정하였다. 혈청 샘플은 VEGF 및 GM-CSF 수준의 측정을 위해 Dl, D8, D15, D22 및 D29일째에 수거하였다. 마우스를 D22 또는 D35일째에 안락사시켰다. 안락사시키기 전에, 마우스에 형광성 미소구를 주사하여 종양 관류가 가시화되도록 하였다. 상기 절제된 종양은 분석을 위해 3개 부분으로 나누었다: 1) VEGF 단백질 수준의 평가를 위한 순간 동결된 샘플, 2) 미소구 및 혈관 마커 CD31을 가시화하기 위한 동결된 종양 절편의 OCT-매립된 샘플 제조 및 3) 조직학적 분석을 위한 포르말린 고정된/파라핀-매립된 샘플.
결과: CD31-염색된 OCT 종양 절편에서 혈관을 계수하였다; 200x 배율의 3개 영역에서 평균 혈관수를 도 6에 나타낸다. 단독의 소라페니브는 혈관수의 일시적 감소를 유도하였지만(29일째), 혈관 수는 시간 경과(35일째)에 따라 다시 증가한다. 그러나, JX-594 후 소라페니브를 받은 동물에서, 35일째 혈관 수는 단독의 소라페니브 그룹에 비해 감소하였고 이는 상기 병용이 종양 혈관형성에 대해 보다 지속적인 효과를 가짐을 시사한다.
B. 임상 데이타
JX-594는 암 세포에서 선택적으로 복제하고 암 세포를 파괴하도록 디자인된 1등급 표적화된 종양 용해 폭스바이러스이다. 직접적인 종양 용해 + 과립구 대식세포 - 콜로니 자극 인자(GM-CSF) 발현은 또한 동물 종양 모델에서 종양 혈관 폐쇄를 자극한다. 종양 혈관 폐쇄는 간세포 암종을 갖는 환자에서 JX-594 치료요법 후 평가하였다. 추가로, 간 세포 암종(HCC)의 임상전 및 임상 연구 둘다 에서 JX-594 처리 후 재관류를 차단하는, 소라페니브를 사용한 보조제 항-혈관형성 치료요법의 수행가능성을 연구하였다.
방법: 임상전 연구는 뮤린 HCC 모델에서 수행하여 JX-594 유도된 혈관 폐쇄 및 후속적인 재관류 기전을 평가하였다. 재관류를 차단하는 소라페니브의 잠재력을 평가하였다. 2기 임상 연구에서, HCC를 갖는 환자는 3주기 동안 2주 마다 종양내 주사를 통해 JX-594로 처리하였다. 종양 크기, 혈류 및 밀도는 기준선, 5일 및 8주째에서 동적 조영 증강된 (DCE)-MRI 및 DW-MRI로 평가하였다. 8주째에 부분적 종양 재관류를 갖는 5명의 환자는 표준 소라페니브 치료요법을 개시하고, 후속적으로 dce-MRI 스캐닝을 수행하였다.
발견: 종양 혈관 폐쇄는 JX-594의 IT 또는 IV 투여 후 뮤린 HCC 모델에서 발생한다. 혈관 폐쇄는 바이러스 복제에 의존하였고; 바이러스로부터 mGM-CSF 발현 및 호중구 침투는 상기 효과를 증진시켰다. 종양 테두리의 재관류는 시간 경과에 따라 입증되었고, 종양에서 증가된 VEGF 수준과 관련되었다. 보조제 소라페니브 치료요법은 혈관형성을 억제하였고 단독의 제제보다 항-종양 효능을 상당히 개선시켰다. JX-594로 처리된 HCC 환자는 간내에서 주사되고 비주사된 종양 둘 다에서 급성 종양 혈관 폐쇄 및 괴사를 입증하였다. 8주 평가 후 소라페니브를 사용한 보조 치료요법은 적어도 3명의 환자에서 급격하고 지속적인 종양 괴사 및 혈관 폐쇄를 유도하였다. 단독의 소라페니브에 대한 15명의 HCC 환자로부터 일련의 MRI 스캔을 검토한 결과, 상기 발견이 JX-594로 전처리된 환자에서 증진되고 집적됨을 입증하였다.
JX-594는 HCC 종양에서 급성 혈관 폐쇄 및 괴사를 유도하고 HCC가 소라페니브를 사용한 후속 치료요법에 감작화되도록 하였다. JX-594 후 소라페니브 처리 대 단독의 소라페니브 처리의 무작위 조절된 시험을 지적한다. 종양 용해 폭스바이러스 후 항-혈관형성 제제를 사용한 연속적 치료요법 처방은 전망이 있다.
서론: 상기 표적화된 종양 용해 폭스바이러스 JX-594는 암 세포에서 선택적으로 복제하여 바이러스 후손을 생성하고 종양 세포를 괴사시켜 종양 조직내에서 방출되고 확산된다. JX-594는 또한 종양 용해로부터 비롯되는 항-종양 면역력을 증진시키기 위해 GM-CSF 전이유전자를 발현하도록 조작된다. 상기 백시니아 골격은 본질적으로 EGFR-ras 경로 의존성 및 인터페론에 대한 종양 내성으로 인해 종양 선택적이다. 상기 고유 치료학적 지수는 TK 결실에 의해 증폭되고; JX-594 복제는 암에서 비정상적인 세포 주기에 의해 고수준으로 구동되는 세포성 TK에 의존한다. 난치성 간 종양을 갖는 환자에서 JX-594의 1기 임상 시험으로부터의 결과는 안전성, 효능 및 JX-594 복제, 전신 확산 및 생물학적 활성 GM-CSF 발현에 대한 기계론적 개념 증명을 입증하였다. 최근에 공개된 임상전 연구는 종양 용해 바이러스 치료요법이 또한 급성 종양 혈관 폐쇄를 유도할 수 있음을 입증하였다(문헌참조: Breitbach, et al. 2007).
본 발명자는 종양 용해 폭스바이러스 JX-594가 종양 혈관 폐쇄를 유발하고 바이러스로부터의 GM-CSF 발현이 호중구 유인 및 활성화를 증진시켜 항-혈관 효과를 증강시킴을 고려한다. 임상전 연구에 따라, 본 발명자는 과다혈관성 종양 유형인 HCC를 갖는 환자에서 종양 혈관 폐쇄를 평가한다. 임상전 및 임상 연구는 혈관화된 종양 테두리의 후속적 진행 가능성을 입증하였다.
소라페니브는 신장 세포 암종(RCC) 및 간세포 암종(HCC)의 치료용으로 승인된 경구 멀티키나제 억제제이다. 소라페니브는 표면 티로신 키나제 수용체(VEGF-R, PDGF-R) 및 세포내 세린/트레오닌 키나제(Raf-1, B-Raf)를 억제하고, 따라서 다중기전의 항암제이다. 소라페니브는 암세포에서 통상적으로 활성화되어 세포 증식을 촉진시키는 Ras 시그날 전달 경로(RAS/RAF/MEK/ERK)를 억제함에 의해 직접적으로 종양 세포에 영향을 줄 수 있다. 소라페니브는 또한 VEGF-R의 억제로부터 비롯되는 이의 항-혈관형성 효과를 통해 종양 성장을 감소시킬 수 있다. 수텐트(수니티니브/SU11248)는 혈관 내피 성장 인자(VEGF)의 작용을 억제하여 항-혈관형성 효과를 갖는 또 다른 표적화된 암 치료요법이다. 이것은 신장 세포 암종 및 위장관 기질 종양(GIST) 치료용으로 승인되어 있다.
본 발명자는 JX-594 처리 후 재관류가 HCC 환자용으로 승인된 항-혈관형성 제제 또는 RCC 환자용으로 승인된 수텐트에 의해 차단됨을 고려한다. 본 발명자는 HCC의 임상전 모델에서 및 JX-594를 사용한 치료요법 완료 후의 5명의 환자에서 상기 가설에 대해 시험하였다.
C. 재료 및 방법
연구 승인 및 등록: 연구 프로토콜 및 통지 동의서 형태는 미국 FDA, 한국 FDA 및 기관[Institutional Review and Infection Control Committees at Pusan National University Hospital, Busan, South Korea]에 의해 승인되었다. 상기 프로토콜은 전세계 광역 웹(clinicaltrials.gov)을 통해 등록되었다.
환자 선별: 환자는 지침서(Good Clinical Practice (GCP) guidelines)에 따라 통지 동의서에 서명하였다. 채택 기준은 표준 치료요법을 사용한 치료에도 불구하고 진행하는 간 내의 절제가능하지 않은 주사가능한 간세포 종양(들)(원발성 HCC)(치료 난치성), 정상적인 조혈 기능(백혈구 수 > 3 x 10⁹ 세포/L, 헤모글로빈 >100 g/L, 혈소판 수 >60 x 10⁹ 세포/L) 및 기관 기능(132.6 μmol/L 이하의 크레아티닌, 정상적 상한치의 2.5 이하의 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 (AST)/알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT), 간장애(Child-Pugh) 부류 A 또는 B를 포함함), 수명 16주 이상, 및 70 이상의 카르노프스키(Karnofsky) 수행능 상태(KPS)를 포함하였다. 제외 기준은 간외 종양, 10cm 최대 직경 초과의 종양, 백신 접종 합병증에 대한 증가된 위험(예를 들어, 면역억제, 습진), 4주 이내 면역억제 또는 암 치료 제제를 사용한 치료, 급성 진행성 복수, 임신 또는 간호직을 포함했다.
JX-594 제조 및 준비: JX-594는 사람 CSF2 및 LacZ 유전자가 각각 합성 어얼리-레이트(early-late) 프로모터 및 p7·5 프로모터 조절하에 TK 유전자 영역으로 삽입되어 변형된 와이어쓰(Wyeth) 백시니아 주이다. 임상 시험 물질 (CTM)은 베로(Vero) 세포에서 지침서(Good Manufacturing Practice (GMP))에 따라 합성하고, 슈크로스 농도구배 원심분리를 통해 정제하였다. 상기 게놈-대-pfu 비율은 대략 70:1이었다. JX-594는 10% 글리세롤, 138 mM 염화나트륨을 함유한 인산 완충 식염수(pH 7.4)중에서 제형화하였다. 최종 제품 품질 관리 출하 시험은 멸균성, 내독소 및 효능에 대한 분석을 포함했다. CTM은 또한 GM-CSF 단백질 농도에 대해 시험하였고 음성이었다(14,000 pg/mL 미만의 검출 하한치). JX-594는 표적 종양(들)의 평가된 총 용적의 25%와 동등한 용적으로 0.9% 정상 식염수 중에서 희석시켰다.
JX -594 치료 과정. 11301( 수텐트 환자)을 제외한 모든 IT 환자: 절제가능하지 않은 HCC를 갖는 환자는 2개의 용량 수준 중 하나(10⁸ 또는 10⁹ pfu)를 투여받도록 무작위 할당하였다. JX-594는 대략 구형 종양에서 작살 모양의 4중 융합 주사 바늘을 사용한 이미지화 가이드된 종양내 주사를 통해서 그리고 불규칙형의 종양에서 21-게이지 PEIT(경피 에탄올 주사, 다중-공극; HAKKO Medicals; Tokyo, Japan) 바늘에 의해 투여하였다. 종양(n=1 내지 5)에 3주기 동안 2주 마다 주사하였다. 1주기상에 주사된 동일한 종양에 이후 각각의 주기로 주사하였다.
JX -594 치료 후 소라페니브 치료요법 및 종양 반응 평가: 환자는 연구 8주 후에 JX-594의 IT 임상 시험을 완료하였다. 일부 환자(환자 1702, 1705, 1002, 1712, 1713)는 계속해서 표준 소라페니브 치료(하루 2회 p.o. 400mg)를 받았다. 이어서, 이들 환자에서의 종양은 JX-594 처리에 대한 반응을 평가하기 위해 사용된 동일한 과정을 사용하여, DCE-MIR 이미지화하였다.
JX -594 치료 과정, IV JX -594에 이어 IT JX -594 치료 후 소라페니브로 치료된 환자: 절제가능하지 않은 HCC를 갖는 환자에게 JX-594 수준(10⁹ pfu)의 2개 용량을 투여하였다. 제1 용량(1일째)에 대해 JX-594는 60분에 걸쳐 정맥내 주입에 의해 투여하였다. 제2 및 제3 용량에 대해(8일 및 22일) JX-594를 대략 구형 종양에서 작살 모양의 4중 융합 주사 바늘을 사용한 이미지화 가이드된 종양내 주사를 통해서, 또는 불규칙형의 종양에서 21-게이지 PEIT(경피 에탄올 주사, 다중-공극; HAKKO Medicals; Tokyo, Japan) 바늘에 의해 투여하였다. 25일째에서 개시하여, 환자는 경구 소라페니브 치료요법(하루 2회 400mg p.o.)을 개시하였다. 생존 종양 조직을 갖는 환자에게 JX-594를 12주 IT 주사하였다(소라페니브 치료는 상기 부스터 주사 2-3일 전, 이 동안에, 및 4-5일 후에 일시적으로 중단하였다). 이미지화(CT, DECE MIR 및/또는 PET-CT)는 기준선, 25일, 6주 및/또는 12주에 수행하여 반응을 평가하였다.
JX -594 치료, 환자 11301 ( 수텐트 환자): 환자 11301은 간으로 전이된 신장 세포 암종을 가졌다. 간 종양은 21-게이지 PEIT 바늘을 사용한 종양내 주사에 의해 처리하였다. 상기 환자는 3주 간격으로 총 4개 용량의 JX-594(10⁹ pfu/용량)(=4주기)를 투여받도록 하였다. 치료의 2주기 후 마다, 조영 증진 CT 스캐닝을 수행하였고, 6주 반응 평가는 RECIST 및 초이 기준(Choi criteria)을 사용하여 수행하였다. 환자는 RECIST 기준 및 초이 반응으로 안정한 질환(SD)을 경험하였다(HU에서 42% 감소)(문헌참조: Park et al., 2008).
수텐트 치료: 후속적으로, 환자 11301을 진행하고 계속해서 수텐트 처리를 받도록하였다. 환자에게 3개 코스의 50mg/매일(4주 시행, 2주 중단)에 이어서 3개 코스의 37.5 mg/매일(4주 시행, 2주 중단)을 투여하고, 25mg/매일(2주 시행, 1 내지 2주 중단)의 스케줄로 유지시켰다.
종양 혈관질 및 반응 평가: DCE MRI (동적 조영 증강된 자기 공명 이미지화)는 5일째(임의로) 및 8주째에 스크리닝(기준선)에서 수행하였다. 소라페니브로 처리중인 환자에 대해, DCE MRI는 소라페니브 처리 개시 후 4주 및/또는 8주째에 수행하였다. DCE MRI는 종양 크기, 혈관질 및 괴사를 평가한다. 상기 스크리닝/기준선 DCE MRI는 진행 및 반응률에 대한 시간을 결정하기 위한 기준으로서 사용하였다. 5일째 (임의로) DCE MRI를 사용하여 급성 혈관 폐쇄와 같은 조기 효과를 평가하였다. 종양 진행 상태 및 JX-594에 대한 종양 반응(들)은 8주 방문에서 변형된 RECIST 및 변형된 초이 기준에 의해 방사선학적으로 평가하였다. 이미지의 독립적인 검토는 MRI 스캔 상의 간세포 암종을 평가하는데 경험을 가진 방사선 전문의(들)이 수행하였다. 간내 종양의 평가를 위해, 객관적인 "완전한" 또는 "부분적인" 항 종양 반응을 갖는 피검체의 비율은 변형된 RECIST, 및 변형된 초이 기준(MRI에서 가장 긴 직경의 합에서 10% 이상의 감소 및/또는 평균 종양 시그날 강도에서 15% 이상의 감소로서 정의됨)에 의한 측정된 반응을 기준으로 결정하였다.
변형된 RECIST에 의한 종양 반응: 종양 반응 및 종양 진행의 측정을 위한 RECIST에 대한 변형은 다음과 같았다. 치료 동안에 또는 치료 후 간 내에 발생된 신규 종양(들)을 측정하였다. 이들의 최대 직경(들)은 모든 간내 종양의 최대 직경의 합에 포함시켰다. 그러나, 간내 신규 종양은 그 자체가 진행성에 대한 증거로서 고려되지 않았다. 상기 RECIST 기준 변형에 대한 합리적 판단은 다음과 같다. 본래 방사선학적으로 검출가능하지 않은 종양 매쓰의 JX-594 감염은 상기 종양이 염증 및/또는 괴사로 인해 새롭고/새롭거나 진행성인 것으로 보이게 할 수 있다; 그러나 이들 변화는 진정한 종양 진행을 나타내지 않는다. 추가로, 치료 목적은 간내 종양 과적을 조절하기 위한 것이기 때문에, 복부에서 간외적으로 검출된 새로운 종양이 주지되지만(위치 판독됨) 전체 반응의 결정에 포함시키지 않았다. 따라서, 종양 반응 또는 진행은 측정가능한 간내 종양의 최장 직경의 합으로 결정하고 다음과 같이 결정하였다: 완전한 반응(CR): 모든 종양(들)의 소실. 부분적 반응(PR): 종양(들)의 LD 합의 적어도 30% 감소, 기준선 합계 LD를 기준으로서 취함. 진행성 질환 (PD): 종양(들)의 LD 합의 적어도 20% 증가, 기준선 합계 LD를 기준으로서 취함. 안정한 질환 (SD): PR로서의 적격에 충분하지 못한 수축 또는 PD로서의 적격에 충분하지 못한 증가, 기준선 합계 LD를 기준으로서 취함.
변형된 초이 기준에 의한 종양 반응: 상기 초이 반응 기준은 종양 직경(RECIST에 대하여) 뿐만 아니라 종양 밀도의 변화를 고려하고 이의 활용을 지지하는 데이타가 공개되었다(문헌참조: Choi et al. 2004). 조기 연구는 JX-594로 처리된 간 종양은 초이(문헌참조: Choi et al.(2004))에 의해 위장관 기질 종양에서 보고된 바와 같이 수반되는 크기 감소 없이 상당한 내부 괴사를 발생시킬 수 있다는 것을 나타냈다. 따라서, 간내 종양을 측정하고 반응은 변형된 초이 기준을 사용하여 평가하였다. 기준의 변형은 DCE MRI가 종양 반응을 측정하기 위해 사용되는 이미지화 양상임으로 필요하다. MRI가 CT 하운스필드 단위와 유사한 조영 밀도 측정의 표준화 시스템을 갖지 못하기 때문에 기준선에서 및 처리 후의 종양의 % 증진의 비교는 관심 있는 영역(ROI)의 시그날 강도(SI) 측정을 사용하여 수행하였다. 상기 스크리닝/기준선 DCE MRI는 반응을 결정하기 위한 기준으로서 사용하였다. 변형된 초이 기준에 의한 반응은 주사된 종양(들)의 최장 직경 합의 10% 이상 감소 및/또는 MRI상에서의 평균 주사된 종양 시그날 강도에서의 15% 이상 감소로서 정의된다. 상기 평균 MRI 시그날 강도(SI)는 종양 %로서 측정하였다.
MRI 이미지화 프로토콜: 각각의 환자에 대해 프로토콜에 의해 처방된 시점에서 동적 조영 증강된 자기 공명 이미지화(DCE MRI)를 포함하는 복부의 MRI를 수행할 것이다. 이미지화는 환자가 드러누운 상태에서 간의 완전한 이미지화 포괄을 위해 위치된 신체/동체 어레이 코일을 사용한 1.5T 또는 3.0T MR 시스템상에서 수행할 것이다. 유전체 패드는 간 위에 위치할 수 있다.
전형적으로 이미지화 파라미터는 환자의 후속 방문 사이로 고정시킨다. 하기 시퀀스(sequence)는 허용가능한 범위의 파라미터를 열거하고 일단 환자는 이들의 초기 스캔을 갖고 이들 파라미터는 모든 후속적 스캔상에 사용되어야만 한다. 추가로, 환자는 동일한 MIR 스캐너를 사용하여 스캐닝되어야만 한다.
정맥내 주사선 작업은 KVO에서 정상의 식염수가 흐르는 가능한한 말초 정맥에 위치한 최대 게이지 카테터로 조사하기 전에 개시될 것이다. 대안으로, 자동화된 조영 주사기와 양립가능한 PICC 주사선 또는 외부 정맥 카테터 포트를 갖는 환자에 대해 이들은 정맥 접근을 위해 사용될 수 있다. 세포외 가돌리늄 킬레이트 조영제는 자동화된 주사기를 통해 초당 2cc의 속도로 0.1mmol/kg 용량으로 정맥내 1회분 주사함에 의해 투여하고 이어서 20cc 식염수를 즉각적으로 주사할 것이다. 주사 속도 또는 용량 또는 조영제의 분출로부터의 임의의 변화는 CRF에 기록될 것이다.
1.5 테슬라(tesla) MR 시스템에 대한 이미지화 프로토콜: 하기의 펄스 시퀀스를 수행할 것이다:
조영전 이미지화: (1) 2D 축 내부 및 반대 T1상: T1-칭량된 농도 구배 에코(SPGR) 듀얼 상 축 이미지화(TR: 가능한 최단; TE: 2.1 및 4.2; 플립 각도 (FA): 80 내지 90 도, 슬라이스 두께 5 내지 7mm, 슬라이스 갭 최대 1mm; 상은 256 x 256으로 외삽된 160-192을 인코딩하고; 환자의 체형에 최적화된 시야, 300 내지 450 mm. (2) 2D FSE T2 축: TR: 3500 내지 5000 msec (효과적임); TE: 60 내지 88 msec; 상은 160-256 x 256을 인코딩하고; 환자의 체형에 최적화된 시야, 300 내지 450 mm; 슬라이스 두께, 5 내지 7 mm; 최대 슬라이스 갭 1 mm; 이미지화는 지방 억압과 함께 수행되어야만 한다. 호흡 트리깅(trigging) 또는 기타 움직임 억압 기술이 고무된다.
DCE-MRI: (3) 3D T1 역학적 이미지화: 총 6개 세트의 상기 시퀀스를 수행한다: 조영전 1개, 조영 후 즉시 4개, 및 1개의 5분 지연된 이미지 세트. 3D T1-칭량된 지방 억압 획득을 위한 파라미터는 다음과 같다: TR = 2.0 내지 4.5 msec; TE = 1.42 내지 2.0 msec; 플립 각도, 8 내지 12°; 상은 512 x 512에 이외삽된 160-192을 인코딩하고; 환자의 체형에 최적화된 시야, 300 내지 450 mm; 외삽된 절편 두께, 1.5 내지 3 mm; 간을 완전히 덮기에 충분한 슬랩 두께.
제1 조영 증강 획득(간 동맥 상)을 위한 타이밍을 결정하기 위해, 1 내지 2ml의 조영 물질 시험 1회분을 투여하고 순환 시간(동맥 증진을 최대화하기 위한 시간)을 획득 지연 시간으로서 설정할 것이다. 대안으로, 자동화 타이밍 소프트웨어가 동맥 상 증진을 결정하기 위해 가용한 경우 이것을 또한 사용할 수 있다. 4개의 광 조영 역학적 시퀀스는 각각의 획득 사이에 40초 시간 갭을 사용하여 수행될 것이다. 추가의 지연된 시퀀스는 또한 주사 후(총 5회 조영 후 시퀀스에 대해) 5분째에 획득될 것이다. 모든 획득은 기관 관행을 기준으로 지연 호흡, 흡식 또는 날숨동안에 수행할 것이다. 상기 시스템은 조영 전후 시퀀스 사이에 임의의 조정 변화를 진행하지 않는다. 이미지화 프로토콜로부터의 임의의 변화는 CRF에 기록될 것이다.
3.0 텔사 MR 시스템에 대한 이미지화 프로토콜: 하기의 펄스 시퀀스를 수행할 것이다:
조영전 이미지화: (1) Tlw 2D 축 인-페이즈(In-Phase) (IP) 및 아웃-오브-페이즈 (OP): 듀얼-페이즈 스포일링된 구배 에코(dual-phase spoiled gradient echo)(SPGR). FOV: 체형에 최적화된, 300 내지 450 mm; TR: 간을 덮기위한 최소; TE: 상및 반대 상 TE의 디폴트; 플립 각도: 80 내지 90도; 슬라이스 두께: 5 내지 7 mm; 갭: 0 내지 1 mm (0-mm 갭이 바람직함); 프리퀀시 매트릭스: 320; 상은 512 x 512에 외삽된 160-224를 인코딩함; 패트 새트(Fat sat): 오프; 밴드너비: 디폴트 세팅.
(2) T2w 2D 축 SSFSE. FOV: 상기 (1)과 동일하게 사용; TR: 완전한 간을 이미지화하기 위한 최단 효과적인 TR; TE 효과적인: 60 내지 88 msec; 슬라이스 두께: (1)과 동일하게 사용; 갭: (1)과 동일하게 사용; 프리퀀시 매트릭스: 320; 상은 512 x 512에 외삽된 160-224를 인코딩함; 패트 새트: 오프
(3) T2w 2D 축 FSE. 호흡 유발을 사용한 자유 호흡 또는 호흡 중단 이미지화를 여기서 사용할 수 있다. 그러나, 환자의 조사내에서 표준화할 것이다. 예를 들어, 환자가 호흡 유발을 사용한 기준선에서 스캐닝되는 경우, 모든 후속적 MR 시험은 상기 시퀀스와 함께 호흡 유발을 사용할 것이다. 호흡 유발이 사용되는 경우, 최적의 시그날 대 노이즈에 대해 충분한 자극/획득을 위해 에코 트레인 길이 12 내지 20이 사용되어야만 한다. 호흡 중단 T2 이미지화가 수행되는 경우, 에코 트레인 길이 24 내지 32 및 1 획득을 사용한다. FOV: 상기 (1)과 동일하게 사용. TR 효과적임: 3500 내지 5000; 슬라이스 두께: (1)과 동일하게 사용; 갭: (1)과 동일하게 사용; 프리퀀시 매트릭스: 320; 상은 512 x 512에 외삽된 160-224를 인코딩함; 패트 새트: 온. DCE MRI
(4) Tlw 3D 축 스포일링된 구배 에코(SPGR). FOV: 상기 (1)과 동일하게 사용; TR: 2 내지 5 msec; TE: 1.4 내지 2.5; 플립 각도: 8 내지 15; 슬라이스 두께 : 1.5 내지 3 mm 외삽됨; 슬랩 두께: 전체 간을 포괄함; 프리퀀시 매트릭스: 288 내지 320; 상은 512 x 512에 외삽된 160-224을 인코딩함; 패트 새트: 온. 스캔 수: 총 5회 (조영전 1회 및 조영 후 4회 스캔에 이어서 조영제 주사 후 5분째에 5번째 스캔)). 표준 기관 관행에 따라 지연 호흡 동안에, 날숨 멈춤 또는 흡식 멈춤에서 수행했다.
D. 임상적 시험 데이타: JX-594 치료 후 종양 및 결장직장 암종 종양에서 5일째 혈관 폐쇄
관류 CT에 의한 측정시 급성 혈관 폐쇄는 종양내 주사에 의해 직접 JX-594로 처리된 종양내에서 이전에 확인되었다(문헌참조: Liu et al, 2008). 본 발명자는 JX-594 처리에 반응하는 혈관 폐쇄 및 종양 괴사 과정에 따른 종양 관류의 감소를 추적하기 위해 DCE MRI 분석을 적용했다. 5일, 13일째 임의의 DCE-MRI 스캐닝을 사용한 새로운 임상 시험에 가입한 16명의 환자로부터 상기 스캔을 수득하고 간세포 암종(HCC)를 갖는 환자에서 추가의 혈관 폐쇄에 대한 예가 있다(도. 7).
이전에 분석된 HCC 예에서, 직접적인 종양 주사가 감소된 종양 관류를 유발하는데 필요한 것으로 나타났다(도 1, 참조(Liu et al, 2008)). 상기 데이타로부터 , 혈관 폐쇄가 JX-594의 원거리 적용에 반응하여 비-주사된 종양에서 나타난다는 것이 예측되지 않았다. 현재, 처음으로, 본 발명자는 상기 반응을 갖기 위해 모든 종양에 주사할 필요가 없고 원거리의 비-주사된 종양이 또한 혈관 폐쇄를 나타낼 수 있음을 보여준다(도 8 및 9).
추가로, 본 발명자는 JX-594가, HCC 보다 혈관 형성이 적고(도 9) 따라서 혈관 변화를 일으킬 가능성이 적은 것으로 고려되는 종양 유형인 결장직장 암종(CRC)의 간 기반 전이를 갖는 환자에서 입증된 바와 같이 비-HCC 종양에서 혈관 폐쇄를 유발할 수 있음을 입증한다.
실시예 1703: 환자 1703은 간세포 암종을 갖고 JX-594의 2기 임상 시험에 입회하였다. JX-594는 단일의 대형 종양(10⁹ pfu/용량)에 주사하였다. 5일 후, DCE MRI는 급성 혈관 폐쇄(상부 검정색 및 백색 패널)를 보여주었다(도 9). 하부 패널은 혈관 폐쇄/종양 괴사 정도를 정량하기 위해 사용되는 세그멘테이션 분석(segmentation analysis)에 대한 예를 보여준다(하부 패널)(도 7).
실시예 1708: 환자 1708은 다중 종양이 간에 존재하는 간세포 암종을 가졌고 JX-594의 2기 임상 시험에 입회하였다. JX-594는 간 종양 모두는 아니지만 일부 종양에 주사하였다(총 용량 10⁸ pfu/용량). 5일 후, DCE MRI는 주사되고 비주사된 간 기반 종양에서 급성 괴사/혈관 폐쇄를 나타내었다. 도 8은 JX-594 처리 전후 둘다의 이미지를 포함하는 2개의 평면도를 보여준다.
실시예 0204: 환자 0204는 전이가 간, 폐 및 림프절에 존재하는 결장직장 암종을 가졌고 JX-594의 2기 임상 시험에 입회하였다. JX-594는 간 전이의 모두는 아니지만 일부 종양에 주사하였다(총 용량 10⁹ pfu/용량). 5일 후, DCE MRI는 주사되고 비주사된 간 기반 종양에서 급성 괴사/혈관 폐쇄를 보여주었다(도 9).
E. 임상 시험 데이타: JX-594는 소라페니브 및 수텐트 항-VEGF 치료요법을 강화시킨다
JX-594 치료를 완료한 후 8주째에 재관류를 보여주는 5명의 환자에게 이어서 표준 소라페니브 용량(매일 2회 400mg)을 투여하였다. 증진된 초이 반응을 나타냈다(표 A). 이들 반응은 단독의 JX-594 처리에 대한 임의의 초기 초이 반응 이상으로 증진시켰다(도 11, 12, 및 13)
[표 A]

단독의 소라페니브로 치료된 예는 "대조군 그룹"(도면에 포함됨): 실질적으로 단독의 소라페니브에 대한 RECIST 반응률은 1 내지 2%이다(문헌참조: Llovet et al, 2008; Cheng et al, 2009). 초이 기준에 의해 평가된 국소 대조군 그룹과 관련하여, JX-594를 투여받지 않았지만 소라페니브를 투여받은 HCC 환자는 초이 반응에 대해 평가하였다. 병원에서 JX-594 처리된 환자 5명 중 4명이 치료된 경우에서 26명의 다른 환자들은 동일한 기간내에 소라페니브를 투여받았다. 7명 환자는 반응 평가전에 사망하였고 15명의 환자를 초이 반응에 대해 평가하였다. 소라페니브만 처리된 환자중 2명만이 Choi+ 반응을 나타내었다(총 26명중 15명이 초이 반응에 대해 평가되었다). 이들 환자 모두가 소라페니브 치료요법과 연계하여 방사선 치료요법을 받았음을 주지해야 한다. 대조적으로, 상기 기간동안에 소라페니브 치료요법 전에 JX-594 치료요법을 받은 2명의 환자는 초이+ 반응을 가졌고(도 10), 이는 종양에 대한 소라페니브 효과가 놀랍게도 엄청나게 개선된 것이다.
종양 괴사를 평가하기 위해 MRI 스캔을 사용한 소라페니브 단독 처리 임상 시험에서, 일부 간 매쓰는 중앙 종양 괴사를 나타내었고 평균 종양 괴사가 기준선의 9.8%로부터 여러 과정의 치료 후 27%까지 중간 정도로 증가한 것이다(문헌참조: Abou-Alfa et al, 2006).
실시예 1702: 환자 1702는 간세포 암종을 가졌고 JX-594에 대한 2기 임상 시험에 입회하였고 3회의 JX-594 종양내 용량(10⁹ pfu/용량, 2주 간격으로 투여)을 투여받았다. 상기 환자는 변형된 초이 기준을 사용하여 JX-594에 대한 반응에 대해 평가할 수 없었지만 8주째 스캔에서 주사된 종양에서는 안정한 질환(SD)을 나타내었고 변형된 RECIST 기준을 사용한 신규 종양의 출현으로 인해 진행성 질환(PD)이 나타났다. 따라서, 환자 1702는 계속해서 8주동안 표준 과정의 소라페니브 치료(200mg 매일 2회 p.o.)를 받았다. 소라페니브 치료 개시 후 4주 및 8주째에 DCE MRI 스캔은 급성 종양 괴사를 나타내었다. 도면은 3개의 상이한 평판을 보여주고, 좌측상의 이미지는 소라페니브 치료 후 4주차이고 우측상의 이미지는 소라페니브 치료 후 8주차이다(도 11).
실시예 1705: 환자 1705는 간세포 암종을 갖고 JX-594의 2기 임상 시험에 입회하였다. 제1 JX-594 투여 후 5일째, DCE MRI에 의한 관류의 현저한 감소가 종양내 발생된 혈관 폐쇄를 확인시켜주었다(상부 패널). JX-594 투여를 완료 한 후(2주 간격으로 투여되는 10⁸ pfu/용량의 3회 종양내 투여), 8주째 스캔은 변형된 CHOI 기준에 의한 반응(-36%)을 보여주었지만 변형된 RCIST 기준에 의해 진행성 질환(PD)이 나타났다. 따라서, 환자 1705는 계속해서 4주동안 표준 과정의 소라페니브 치료 (매일 2회 400mg p.o.)를 받았다. 4주째에 취한 DCE MRI 스캔은 급성 종양 괴사를 나타내었다(하부 우측 패널).(도 12, 도 15, 도 16)
실시예 1712: 환자 1712는 간세포 암종을 가졌고 JX-594의 2기 임상 시험에 입회하였다. JX-594 투여를 완료한 후(2주 간격으로 주어진 10⁹ pfu/용량의 3회 종양내 투여), 8주째 스캔은 변형된 CHOI 기준에 의한 반응(-33%)을 나타냈지만 변형된 RECIST 기준에 의하면 진행성 질환(PD)이 나타났다. 환자 1712는 4주동안 표준 과정의 소라페니브 치료(매일 2회 400mg p.o.)를 받았다. 4주째에 취한 DCE-MRI 스캔은 급성 종양 괴사를 나타내었다(도 13).
실시예 11301, 수텐트 환자: 수텐트는 VEGF 활성 및 혈관형성을 억제하는, 신장 세포 암종(RCC)에 대해 승인된 또 다른 표적화된 암 치료요법이다. 환자 11301은 간으로의 전이를 갖는 RCC를 가졌고 간-기반 종양의 치료를 위해 JX-594의 1기 임상 시험에 입회하였다. 2회 과정의 JX-594 투여를 완료한 후(3주마다 주어지는 10⁹ pfu/용량의 종양내 투여), 6주째 평가는 RECIST에 의해 안정한 질환을 나타내었다. 상기 환자는 2회 이상 과정의 JX-594 치료를 받았지만 하나의 간 매쓰 및 대형(14cm) 복부 매쓰가 진행되었다. 따라서, 환자 1705는 계속해서 수텐트 치료요법을 받았다. 상기 환자에 대한 예후는 낮은 헤모글로빈 및 간 전이 정도를 기준으로 불량하였다(문헌참조: Motzer et al, 2006). 놀랍게도, 모든 환자의 종양에서 완전한 반응이 나타났다(도 14). 전신 PET 스캐닝은 어떠한 시그날을 나타내지 않았다. JX-치료 후 생존은 3년 이상이다(환자는 여전히 생존한다). 대조적으로 10cm 초과의 종양에서 단독의 수텐트에 대한 조직학적 RCC 완전한 반응률은 0%이다. 불량한 예후를 갖는 5% 미만의 RCC 환자는 3년 생존하였다.
실시예 JX16 - HCC -03, IV + IT + IT + 소라페니브 환자: 환자 JX16-HCC-03은 간세포 암종을 가졌고 JX-594의 2기 임상 시험에 입회하였다. JX-594 투여를 완료한 후(1회 정맥내 및 2회 종양내 투여), 환자는 소라페니브를 투여받았다. DCE-MRI 스캔은 비주사된 간외 종양에서 소라페니브 처리 개시 후 10일째에 관류 상실을 나타내었다(도 18).
본원에서 공개되고 청구된 모든 조성물 및 방법은 본 명세서에 비추어 과도한 실험 없이 제조되고 수행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 바람직한 양태에 관하여 기술되었지만, 본 발명의 개념, 취지 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 본원에서 기술된 조성물 및/또는 방법 및 방법의 단계 또는 단계의 시퀀스를 변화시킬 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 보다 구체적으로는, 화학적으로 그리고 생리학적으로 관련된 특정한 약제로 본원에서 기술된 약제를 대체할 수 있고, 동일하거나 유사한 결과가 달성될 것이라는 점은 명백할 것이다. 당업자에게 명백한 모든 이러한 유사한 대체 및 변형은 첨부된 청구항에 의해 정의되는 본 발명의 취지, 범위 및 개념 내에 있는 것으로 간주된다.
참조문헌
다음의 참고문헌은, 본원에서 제시된 것을 보충하는 대표적인 방법 또는 다른 상세사항을 제공하는 정도까지, 본원에 참조로서 구체적으로 인용된다.

Claims (29)

1. 유효량의 항-혈관형성 제제를 투여함을 포함하는, 사전에 폭스바이러스 치료요법을 투여받은 피검체에서 암을 치료하기 위한 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 백시니아 바이러스 치료요법이, GM-CSF를 발현하는 백시니아 바이러스를 포함하는, 방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 백시니아 바이러스가, 기능성 티미딘 키나제 유전자가 결핍된, 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 항-혈관형성 제제가 키나제 억제제인, 방법
5. 제4항에 있어서, 상기 키나제 억제제가 Raf 키나제 경로를 억제하는, 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 키나제 억제제가 소라페니브인, 방법.
7. 제1항에 있어서, 종양이 재혈관형성을 진행하는지의 여부를 결정함을 추가로 포함하는 방법.
8. 제7항에 있어서, 종양 재혈관형성을 결정하는 것이 상기 종양의 비침습성 이미지화에 의한 것인, 방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 비침습성 이미지화가 자기 공명 이미지화(MRI)인, 방법.
10. 제9항에 있어서, 상기 자기 공명 이미지화가 동적 조영 증강 MRI(dce-MRI)인, 방법.
11. 제1항에 있어서, 상기 항-혈관형성 제제가 백시니아 바이러스 투여 후 적어도 5, 6, 7 또는 8주째에 투여되는, 방법.
12. 제1항에 있어서, 상기 종양이, 뇌 종양, 두경부암 종양, 식도 종양, 피부 종양, 폐 종양, 흉선 종양, 위 종양, 결장 종양, 간 종양, 난소 종양, 자궁 종양, 방광 종양, 고환 종양, 직장 종양, 유방 종양, 신장 종양 또는 췌장 종양인, 방법.
13. 제12항에 있어서, 상기 종양이 간세포 암종 또는 신장 암종인, 방법.
14. 제12항에 있어서, 상기 종양이 전이인, 방법.
15. 제14항에 있어서, 상기 전이가 결장 또는 신장 전이인, 방법.
16. 제1항에 있어서, 상기 백시니아 바이러스 치료요법을 상기 피검체에 먼저 투여함을 추가로 포함하는 방법.
17. 제16항에 있어서, 상기 백시니아 바이러스 치료요법의 투여가 종양 매쓰(tumor mass) 내로의 주사를 포함하는, 방법.
18. 제16항에 있어서, 상기 백시니아 바이러스의 투여가 종양 혈관계 내로의 주사를 포함하는, 방법.
19. 제16항에 있어서, 상기 백시니아 바이러스가 혈관내, 종양내, 또는 혈관내 및 종양내 둘 다로 투여되는, 방법.
20. 환자에서 간 종양을 치료하는 방법으로서, 상기 종양에 소라페니브를 투여함을 포함하고, 여기서, 상기 종양은, i) GM-CSF를 발현하는 백시니아 바이러스로 사전에 치료되었고 ii) 재관류를 진행하는 것으로 관측된 것인, 방법.
21. 간 종양을 치료하는 방법으로서,
    (a) GM-CSF를 발현하는 유효량의 백시니아 바이러스를 투여하는 단계, 및
    (b) 재관류를 진행하는 것으로 관측된 종양에 소라페니브를 투여하는 단계
    를 포함하는, 방법.
22. GM-CSF를 발현하는 유효량의 백시니아 바이러스를 투여함을 포함하는, 간 종양을 치료하는 방법으로서, 상기 종양이 재관류에 대해 평가될 것이고, 상기 종양이 재관류를 진행하는 경우 상기 종양이 소라페니브 치료요법을 위한 후보가 될 것인지가 관측될 것인, 방법.
23. 종양을 갖는 환자를 치료하는 방법으로서,
    (a) 상기 종양의 비침습성 이미지화에 의해, 항암 치료요법으로 치료된 종양을 평가하여 재관류를 검출하는 단계; 및
    (b) 유효량의 소라페니브를, 재관류가 검출된 종양에 투여하는 단계
    를 포함하는, 방법.
24. 유효량의 폭스바이러스를 투여함을 포함하는, 항-혈관형성 치료요법에 대해 환자를 감작화시키는 방법.
25. 제24항에 있어서, 상기 환자가 사전에 항-혈관형성 치료요법에 실패했던, 방법.
26. 제24항에 있어서, 상기 폭스바이러스가 백시니아 바이러스인, 방법.
27. 제26항에 있어서, 상기 백시니아 바이러스가 GM-CSF를 발현하는, 방법.
28. 제24항에 있어서, 상기 항-혈관형성 치료요법이 항-혈관형성 키나제 억제제 치료요법인, 방법.
29. 제28항에 있어서, 상기 항-혈관형성 키나제가 소라페니브 또는 수텐트인 방법.

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