KR20160079901A - 분열 촉진 인자 활성화 단백질 키나제 의존성 재조합 우두 바이러스(md-rvv) 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

암 세포에서 특이적으로 증식하고, 암 세포에 장해를 일으키는 우두 바이러스의 제공 및 해당 바이러스의 암 치료에의 이용의 제공.
우두 바이러스 증식인자(VGF) 및 O1L의 기능이 결손해 있으며, 정상 세포 내에서는 증식하지 않지만, 암 세포 내에서 특이적으로 증식하며, 암 세포에 특이적으로 장해를 일으키는 종양 용해성을 갖는 분열 촉진 인자 활성화 단백질 키나제 의존성 우두 바이러스.

Description

분열 촉진 인자 활성화 단백질 키나제 의존성 재조합 우두 바이러스(MD-RVV) 및 이의 용도{MITOGEN-ACTIVATED PROTEIN KINASE-DEPENDENT RECOMBINANT VACCINIA VIRUS (MD-RVV) AND USE THEREOF}
본 발명은 신규한 우두 바이러스 및 그것을 이용한 바이러스 벡터에 관한 것이다. 구체적으로는, 바이러스 단백질인 VGF(vaccinia virus growth factor) 및 O1L의 기능을 결손시킨 우두 바이러스이며, 암 세포 내에서 특이적으로 증식하고, 암 세포를 파괴하는 종양 용해성을 갖는 분열 촉진 인자 활성화 단백질 키나제 의존성 재조합 우두 바이러스에 관한 것이다.
최근, 바이러스를 암 치료에 이용하는 암 바이러스 치료에 관한 다양한 기술이 개발되고 있다. 이러한 치료에 이용하는 바이러스로서 아데노 바이러스, 레트로바이러스 외에, 우두 바이러스가 있다.
최근 우두 바이러스는, 그 넓은 숙주역과 높은 발현 효율이라는 특성으로, 외래유전자를 도입한 발현 벡터로서 감염증(HIV나 SARS)에 대한 다가백신으로서도 이용되고 있다.
또한, 우두 바이러스의 암 세포에 대한 용해성을 이용하여, 암 치료에 이용하는 기술에 대해서도 보고되고 있다 (특허 문헌 1을 참조).
한편, 우두 바이러스에 있어서, 감염 세포의 ERK를 활성화 시키고, 우두 바이러스의 증식을 바로 제어하는 유전자로서, 우두 바이러스 증식인자(VGF) 유전자 및 O1L 유전자 (비특허문헌 1을 참조)가 보고되어 있었다. VGF 유전자에 관해서는, VGF 유전자를 결실시킴으로써, 백신의 병원성이 저하되는 것이 보고되어 있었다 (비특허문헌 2를 참조). 또한, VGF 유전자 및 TK (티미딘 키나제) 유전자를 결손시킨 우두 바이러스를 암 치료에 적용하는 것에 대해서도 보고되어 있었다 (특허 문헌 2 및 비특허문헌 3을 참조).
특허문헌 1: WO 2011/125469 특허문헌 2: WO 2013/038066
비특허문헌 1: Schweneker M. et al., Journal of Virology, Vol. 86, No. 4, pp. 2323-2336, 2012 비특허문헌 2: Buller RM. et al., Journal of Virology, Vol. 62, No. 3, pp. 866-874, 1988 비특허문헌 3: McCart JA. et al., Cancer Research, Vol. 61, No. 24, pp. 8751-8757, 2001
(발명의 개요)
본 발명은 암세포에서 특이적으로 증식하고, 암 세포에 장해를 일으키는 우두 바이러스의 제공 및 해당 바이러스의 암 치료에의 이용의 제공을 목적으로 한다.
현재 전 세계적으로 살아있는 바이러스를 이용하여 암을 치료하는 암 바이러스 요법에 관한 전임상연구 및 임상치험이 적극적으로 행해지고 있다.
우두 바이러스의 경우, 감염 초기에 EGF(상피 증식 인자)와 높은 상동성을 갖는 우두 바이러스 증식인자(VGF)를 생산한다. 분비된 VGF는 감염 세포나 주위의 세포 상의 EGFR (상피 증식 인자 수용체)에 결합하고, Ras/Raf/MEK/ERK 대사 경로를 활성화함으로써 세포 분열을 촉진한다. 최근, 우두 바이러스 O1L 유전자에 코드된 O1L 단백질도, 감염 세포 내의 ERK를 활성화시키는 것이 보고되었다. VGF와 O1L은 같은 경로를 활성시킨다고 생각되어지는 점에서, 상류에 작용하는 CGF의 기능을 결손하는 것의 영향은 크지 않다는 것이 상정 되었다.
본 발명자들은, ERK를 활성화시키는 기능을 갖는 유전자가 코드하는 단백질의 기능을 결손시킴으로써, 정상세포에 감염한 경우는 ERK를 활성화 되지 못하기 때문에, 세포 분열은 촉진되지 않고, 그 결과 바이러스 증식은 현저히 저하하지만, 한편으로 Ras/Raf/MEK/ERK 대사 경로가 비정상적으로 활성하고 있는 암 세포에서는 이상활성화가 바이러스에 의한 ERK의 활성화기능을 보충하고, 바이러스가 증식하고, 암 세포를 용해시키며, 또한 병원성이 저하한다고 생각하여, 예의 검토하였다. 이 때, VGF 단백질과 O1L 단백질 양쪽의 기능을 결손시킴으로써, 정상 세포에서 예상 외의 안전성이 향상하는 한편으로, 암 세포에 대한 용해성이 예상 외로 높아지는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 아래와 같다.
[1] 우두 바이러스 증식 인자 (VGF) 및 O1L의 기능이 결손해 있고, 정상 세포 내에서는 증식하지 않으나, 암 세포 내에서 특이적으로 증식하며, 암 세포에 특이적으로 장해를 일으키는 종양 용해성을 갖는 분열 촉진 인자 활성화 단백질 키나제 의존성 우두 바이러스.
[2] 우두 바이러스가 LC16 세포주, LC16mO 세포주 또는 B5R 유전자가 발현하도록 개변된 LC16m8 세포주인, [1]의 분열 촉진 인자 활성화 단백질 키나제 의존성 우두 바이러스.
[3] [1] 또는 [2]의 우두 바이러스를 포함하는 암 치료를 위한 의약 조성물.
[4] [1] 또는 [2]의 분열 촉진 인자 활성화 단백질 키나제 의존성 우두 바이러스 벡터.
[5] 외래 DNA가 마커 DNA, 세포 독성 효과 혹은 면역 부활 효과를 갖는 치료용 유전자, 또는 암, 바이러스, 세균 혹은 원충의 항원을 코드하는 DNA인, [4] 의 분열 촉진 인자 활성화 단백질 키나제 의존성 우두 바이러스 벡터.
[6] [4] 또는 [5]의 분열 촉진 인자 활성화 단백질 키나제 의존성 우두 바이러스 벡터를 포함하는, 암 치료를 위한, 또는 암, 바이러스, 세균 혹은 항원에 대한 백신으로써 사용하기 위한 의약조성물.
본 명세서는 본원의 우선권의 기초인 일본국 특허 출원 2013-241299 호의 명세서 및 / 또는 도면에 기재된 내용을 포함한다.
도 1은, 분열 촉진 인자 활성화 단백질 키나제(Mitogen-activated protein kinase (MAPK)) 의존성 재조합 우두 바이러스에 의해 정상세포가 장해를 받지 않고, 암 세포가 장해를 받는 원리를 나타내는 그림이다.
도 2는, 재조합 우두 바이러스 LC16mO(mO), LC16mO/VGF-(VGF-), LC16mO/O1L-(O1L-) 및 LC16mO/VGF-O1L-(VGF-/O1L-)의 구조를 나타내는 그림이다.
도 3은, 혈청 존재 하에서의 정상세포ㆍ종양세포에 있어서 MD-RVV의 세포 장해성을 나타내는 그림이다.
도 4는, 혈청 비 존재 하에서의 정상세포ㆍ종양 세포에 있어 MD-RVV의 세포 장해성을 나타내는 그림이다.
도 5-1은, 혈청 비 존재 하에서의 정상세포ㆍ종양세포에 있어 바이러스 감염과 ERK 활성을 나타내는 그림이다.
도 5-2는, 혈청 존재 하 및 비 존재 하에서의 정상세포 및 종양세포의 바이러스 감염과 ERK의 활성화를 나타내는 그림이다.
도 6A는, 면역 부전 SCID 쥐의 바이러스 투여 후의 바이러스 체내 분포를 나타내는 그림이다.
도 6B는, 면역 부전 SCID 쥐의 바이러스 투여 후의 증식 바이러스의 수치화 결과를 나타내는 그림이다.
도 7은, 면역 부전 SCID 쥐의 바이러스 투여 후의 체중 변화를 나타내는 그림이다.
도 8은, 면역 부전 SCID 쥐의 바이러스 투여 33주 후의 바이러스 체내 분포를 나타내는 그림이다.
도 9는 인간 췌장암 BxPC3 복막 파종 쥐 모델의 분열 촉진 인자 활성화 단백질 키나제 의존성 재조합 우두 바이러스의 항암 효과를 나타내는 그림이다.
도 10A는, BxPC3 복막 파종 쥐 모델의 바이러스 투여 후의 종양 체내 분포를 나타내는 그림이다.
도 10B는, BxPC3 복막 파종 쥐 모델의 바이러스 투여 후의 종양 증식의 수치화 결과를 나타내는 그림이다.
도 11은, BxPC3 복막 파종 쥐 모델의 바이러스 투여 후의 바이러스 체내 분포를 나타내는 그림이다.
도 12는, BxPC3 복막 파종 쥐 모델의 종양 특이적 바이러스 증식과 ERK 활성을 나타내는 그림이다. 도 12A는 복막 파종한 종양의 상태를 나타내며, 도 12B는 종양 특이적 바이러스의 증식을 나타낸다. 또한, 도 12C는, Renilla Luciferase (Rluc)의 검출 결과를 나타내며, 도 12D는 인산화된 p44/42 MAPK 단백질 (Erk1/2)(pERK)의 검출 결과를 나타내며, 도 12E는 우두 바이러스의 검출 결과를 나타낸다.
도 13A는, BxPC-3 복막 파종 쥐 모델의 바이러스 용량과 항암 효과의 관계를 나타내는 그림이다.
도 13B는, BxPC-3 복막 파종 쥐 모델의 바이러스 용량과 항암 효과의 관계를 수치화한 결과를 나타내는 그림이다.
도 14는, BxPC-3 복막 파종 쥐 모델의 바이러스 용량과 안전성의 관계를 나타내는 그림이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 우두 바이러스는, 분열 촉진 인자 활성화 단백질 키나제(Mitogen-activated protein kinase (MAPK)) 의존성 재조합 우두 바이러스 (MD-RVV)이며, 우두 바이러스의 우두 바이러스 증식 인자 (VGF : vaccinia virus growth factor) 및 O1L의 기능을 결실한 우두 바이러스이다.
우두 바이러스의 VGF 및 O1L의 유전자 배열을, 각각, 서열번호 및 2 라고 표기한다.
분열 촉진 인자 활성화 단백질 키나제(MAPK)는 세린-트레오닌 키나제의 하나이며, 대표적인 것으로는 ERK가 있다. 상피 증식 인자(EGF)가 상피 증식 인자 수용체 (EGFR)에 결합하며, Ras, Raf, MEK, ERK로 이어지는 시그널 카스케이드의 활성화를 일으키고, 세포 분열을 촉진한다.
우두 바이러스 증식 인자 (VGF)는, EGF와 높은 아미노산 배열 상동성을 갖는 단백질이며, EGF와 동일하게 EGFR에 결합하고, 상기의 시그널 카스케이드의 활성화를 일으키며, 세포 분열을 촉진한다.
우두 바이러스가 세포에 감염된 경우, 감염의 초기에 우두 바이러스 증식 인자(VGF)를 생산한다. 분비된 VGF는 감염 세포나 주위 세포 상의 EGFR(상피 증식 인자 수용체)에 결합하고, Ras/Raf/MEK/ERK 대사 경로를 활성화하는 것으로 인해 세포 분열을 촉진한다. 또한, 우두 바이러스 O1L 유전자에 코드된 O1L도, 감염 세포 내의 ERK를 활성화한다. 즉, VGF와 O1L은 양자 모두 ERK를 활성화하고, 우두 바이러스 증식을 바로 제어하는 것이 된다.
바이러스 단백질 VGF와 O1L의 양자가 ERK를 활성화하고, 우두 바이러스 증식을 제어하고 있으므로, 이 2개의 우두 바이러스 단백질의 기능을 결손시키는 것으로 인해, 감염된 세포에 있어, VGF와 O1L에 의한 ERK의 활성화는 발생하지 않는다. 정상세포와 암 세포에 있어서 Ras/Raf/MEK/ERK 대사경로를 비교하면, 암 세포에 있어 Ras/Raf/MEK/ERK 대사경로는 비정상적으로 활성화 되어 있기 때문에, VGF 및 O1L의 기능이 결손된 우두 바이러스가 정상 세포에 감염된 경우, 정상세포에서는 ERK가 활성화되지 않기 때문에, 세포 분열은 촉진 되지 않고, 그 결과, 우두 바이러스 증식은 저명하게 저하한다 (도1 좌측). 한편, 암 세포에서는 Ras/Raf/MEK/ERK 대사경로가 비정상적으로 활성화 되어 있기 때문에, 그것이 우두 바이러스의 VGF 및 O1L에 의한 ERK의 활성화 기능을 보충하므로, 우두 바이러스는 증식할 수 있다 (도1 우측). 그 결과, 우두 바이러스는 암 세포 특이적으로 증식하고, 암세포를 파괴하여 장해를 초래한다. 즉, 본 발명의 분열 촉진 인자 활성화 단백질 키나제 의존성 재조합 우두 바이러스는 암 세포 특이적인 종양 용해성을 갖는다.
본 발명의 분열 촉진 인자 활성화 단백질 키나제 (Mitogen-activated protein kinase (MAPK)) 의존성 재조합 우두 바이러스를 제조하기 위한 우두 바이러스의 세포주는 한정되지 않지만, 리스터 (Lister) 세포주, 리스터 세포주에서 확립된 LC16 세포주, LC16mO 세포주, LC16m8 세포주 (So Hashizume, Clinical Virology, vol. 3, No. 3, 269, 1975, and others), NYBH 세포주, Wyeth 세포주, 코펜하겐 세포주, WR 세포주, MVA 세포주 등이 꼽힌다. LC16mO 세포주는, Lister 세포주로부터 LC16 세포주를 거쳐 만들어진 세포주이며, LC16m8 세포주는 또한 LC16mO 세포주에서 만들어진, 바이러스막 단백질을 코드하는 유전자인 B5R 유전자에 프레임 시프트 변이가 인정되어, 이 단백질이 발현, 기능하지 않게 되어 약독화 된 세포주이다(Protein, Nucleic Acid, Enzyme, Vol. 48, No. 12 (2003), pp. 1693-1700).
현재 전 세계적으로, 살아있는 바이러스를 이용하여 암을 치료하는 암 바이러스 요법에 관한 전임상연구 및 임상치험이 적극적으로 행해지고 있다. 이 바이러스 요법에 있어 최대의 키 포인트는, 바이러스가 원래 가지고 있는 정상 조직에 대해 병원성을 얼마나 배제하는가 하는 점이다.
인간에게 투여하는 경우의 안전성이 확립된다는 점에서, 본 발명에서 이용되는 우두 바이러스는 약독화되어, 병원성을 가지지 않는 것이 바람직하다. 이러한 약독화된 세포주로서, B5R 유전자를 부분적으로 또는 완전히 결실한 세포주가 꼽힌다. B5R 유전자는, 우두 바이러스의 외피에 존재하는 단백질을 코드하고 있고,B5R 유전자 산물은, 바이러스의 감염ㆍ증식에 관여하고 있다. B5R 유전자 산물은 감염 세포 표면 및 바이러스의 외피에 존재하며, 인접한 세포 혹은 숙주 체내의 다른 부위에 바이러스가 감염ㆍ전파할 때, 감염 효율을 높이는 움직임을 하여, 바이러스의 플라크 사이즈 및 숙주역에도 관여하고 있다. B5R 유전자를 결실시키면, 동물 세포에 감염시킨 경우의 플라크 사이즈가 작아지고, 포크 사이즈도 작아진다. 또, 피부 증식능이 저하되고, 피부병원성 저하된다. B5R 유전자가 부분적으로 또는 완전히 결실된 우두 바이러스는, B5R 유전자의 유전자 산물이 그 정상 기능을 갖지 않고, 피부증식성도 작으며, 인간에게 투여한 경우에도 부작용을 일으키지 않는다. B5R 유전자를 결실한 상태의 약독화 세포주로서, 예를 들어 상기의 LC16m8 세포주로부터 B5R 유전자를 완전히 결실시켜 확립된 m8△ 세포주 (LC16m8△ 세포주라고도 부른다),가 꼽힌다. 또, LC16mO 세포주에서 B5R 유전자를 완전히 결실시켜 확립된 mO△ 세포주(LCmO△ 세포주라고도 부른다)를 이용하는 것도 가능하다. 이러한 B5R 유전자를 부분적 또는 완전히 결실한, 약독화된 우두 바이러스 세포주는 국제 공개 제 WO2005/054451 호 국제 공개 팸플릿에 기재되어 있으며, 그 기재에 근거하여 입수할 수 있다. 우두 바이러스가 B5R 유전자를 부분적 또는 완전히 결실하고, B5R 단백질의 기능이 결실되어 있는지 어떤지는, 예를 들어 RK13 세포에 감염시켰을 때 형성되는 플라크 사이즈, 포크 사이즈, Vero 세포에서의 바이러스 증식성, 토끼의 경우의 피부병원성을 지표로 판단할 수 있다. 또한, 우두 바이러스의 유전자 배열을 조사해도 좋다.
본 발명에 있어 이용되는 우두 바이러스는, B5R 유전자를 암세포에 발현시켜, B5R 단백질의 작용에 의해, 암세포의 상해를 야기한다. 따라서, 본 발명에서 이용되는 우두 바이러스는 완전한 B5R 유전자를 발현하는 것이 바람직하다. 상기와 같이 B5R 유전자를 가지고 있지 않으며, 약독화되어 안전성이 확립되어 있는 우두 바이러스를 이용한 경우, 해당 B5R 유전자를 결실한 우두 바이러스에 다시금 완전한 B5R 유전자를 도입한다. B5R 유전자를 부분적으로 또는 완전히 결실한 우두 바이러스를 이용하는 경우, 해당 우두 바이러스 게놈에, B5R 유전자를 삽입하여, 본 발명의 우두 바이러스 제조의 재료로서 사용하면 된다.
B5R 유전자의 우두 바이러스에의 삽입은 어떠한 방법으로 행하여도 좋지만, 예를 들어 공지의 상동 재조합 방법을 통해 행하는 것이 가능하다. 또한, 이 경우의 B5R 유전자를 삽입하는 위치는, 원래 B5R 유전자가 존재하고 있던 B4R 유전자와 B6R 유전자의 사이여도 좋고, 우두 바이러스 게놈의 임의의 부위여도 좋다. 거기에, 사전에 B5R 유전자를 DNA Construct로서 구축하고, 그것을 우두 바이러스에 도입해도 좋다.
상동 재조합이란, 세포 내에서 두 개의 DNA 분자가 같은 염기배열을 개재시키고 상호 간에 재조합을 일으키는 현상으로, 우두 바이러스와 같은 거대한 게놈 DNA를 갖는 바이러스의 재조합에 때때로 이용되는 방법이다. 먼저, 표적이 되는 우두 바이러스 유전자 부위의 배열을 중앙에서 분단하는 형태로, B5R 유전자를 연결한 플라스미드(이것을 트랜스퍼 벡터라고 부른다)를 구축하고, 이것을 우두 바이러스를 감염시킨 세포에 도입시켜 주면, 바이러스 복제의 과정에서 원래 형태가 된 바이러스 DNA와 트랜스퍼 벡터 상의 같은 배열 부분과의 사이에 교차가 일어나, 사이에 낀 B5R 유전자가 바이러스 게놈 안에 편입된다. 이 때 사용하는 세포로는, BSC-1 세포, HTK-143 세포, Hep2 세포, MDCK 세포, Vero 세포, HeLa 세포, CV1 세포, COS 세포, RK13 세포, BHK-21 세포, 초대 토끼 신장세포 등 우두 바이러스가 감염할 수 있는 세포를 사용할 수 있다. 또, 벡터의 세포로의 도입은, 인산칼슘법, 카티오닉리보솜법, 일렉트로포레이션법 등, 공지의 방법으로 행하면 된다.
우두 바이러스의 VGF 및 O1L의 기능 결손이란, VGF를 코드하는 유전자 및 O1L을 코드하는 유전자가 발현하지 않거나, 또는 발현해도 그 발현 단백질이 VGF, O1L의 정상적인 기능을 유지하지 않는 것을 말한다. 우두 바이러스의 VGF 및 O1L의 기능을 결손시키기 위해서는, VGF를 코드하는 유전자 및 O1L을 코드하는 유전자의 모두 혹은 일부를 결실시키면 된다. 또, 염기를 치환,결실 또는 부가하는 것에 의해 유전자를 변이시켜, 정상적인 VGF 또는 O1L을 코드하는 유전자 안에 외래 유전자를 삽입해도 좋다. 외래 유전자의 삽입이나 유전자의 결실, 변이는 예를 들어 알려진 상동 재조합이나 부위 특이적 돌연변이 도입법에 의해 행하는 것이 가능하다.본 발명에 있어, 유전자의 결실이나 변인에 의해 정상적인 유전자산물이 발현되지 않을 경우, 유전자가 결손되어 있다고 한다.
VGF 및 O1L이 기능을 결손한 상태인지 아닌지는, 본 발명의 VGF 및 O1L의 기능을 결손한 분열 촉진 인자 활성화 단백지 키나제 의존성 재조합 우두 바이러스를 제조하고, 해당 바이러스가 이들 단백질을 발현하고 있는가를 결정하면 된다. 예를 들어, VGF에 대한 항체 또는 O1L에 대한 항체를 이용한 면역학적 어세이에 의해 VGF또는 O1L의 존재를 확인하는 것이 가능하다. 또, PCR에 의해 VGF를 코드하는 유전자나 O1L을 코드하는 유전자의 존재를 결정하는 것이 가능하다.
본 발명의 분열 촉진 인자 활성화 단백질 키나제 의존성 우두 바이러스는 암 치료를 위해 이용하는 것이 가능하다. 즉, 본 발명은 분열 촉진 인자 활성화 단백질 키나제 의존성 우두 바이러스를 포함하는 암 치료용 의약조성물을 포함한다.
대상으로 하는 암은 한정되지 않고, 예를 들어 발생 장기별로 분류한 경우, 폐암, 췌장암, 난소암, 피부암, 위암, 간암, 결장암, 항문암, 직장암, 식도암, 자궁암, 유방암, 방광암, 전립선암, 식도암, 뇌ㆍ신경종양, 임파선 종양ㆍ백혈병, 골ㆍ골육종, 평활근종, 횡문근종 등 각종 암, 종양이 대상이 된다. 특히, 폐암, 췌장암, 난소암의 치료에 호적하게 이용하는 것이 가능하다.
본 발명의 분열 촉진 인자 활성화 단백질 키나제 의존성 우두 바이러스를 포함하는 암 치료용 의약조성물은, 의약적으로 유효량의 본 발명의 분열 촉진 인자 활성화 단백질 키나제 의존성 우두 바이러스를 유효성분으로 포함하고 있으며, 무균의 수성 또는 비수성의 용액, 현탁액, 또는 에멀전의 형태여도 좋다. 더욱이, 소금, 완충제, 보조제 등의, 의약적으로 허용할 수 있는 희석제, 조제, 담체 등을 포함하고 있어도 좋다. 투여는 각종 비경구경로, 예를 들어 피하경로, 정맥내경로, 피내경로, 근육내경로, 복강내경로, 비내경로, 경피경로에 의하면 된다. 또한, 암 부위에 국소투여해도 좋다. 유효 투여량은 피험체의 연령, 성별, 건강 및 체중 등에 의해 적절히 결정할 수 있다. 예를 들어, 한정되지 않지만 인간 성인에 대하여 투여 당 약 102~1010 플라크 형성 단위(PFU), 더 바람직하게는 105~106 플라크 형성 단위(PFU)이다.
더욱이, 본 발명의 분열 촉진 인자 활성화 단백질 키나제 의존성 우두 바이러스는, 외래 유전자 (외래 DNA 또는 외래 폴리뉴클레오티드)를 포함하고 있어도 좋다. 외래 유전자 (외래 DNA 또는 외래 폴리뉴클레오티드)로는, 마커 유전자, 세포독성이나 면역 부활 효과를 갖는 산물을 코드하는 치료용 유전자를 들 수 있으며, 또한 암, 바이러스, 세균, 원충 등의 단백질 항원을 코드하는 DNA를 들 수 있다. 마커 유전자는 리포터 유전자라고도 하며, 루시페라아제(LUC) 유전자, 녹색 형광 단백질(Green fluorescent protein ; GFP) 등의 형광 단백질 유전자, 적색 형광 단백질 (DsRed) 등의 형광 단백질 유전자, β글루쿠로니다아제(GUS) 유전자, 클로람페니콜아세틸전달효소(CAT) 유전자, β-갈락토시다아제(LacZ) 유전자 등을 들 수 있다. 이들 외래 유전자를 포함하는 분열 촉진 인자 활성화 단백질 키나제 의존성 우두 바이러스를 분열 촉진 인자 활성화 단백질 키나제 의존성 우두 바이러스 벡터라고 부를 수 있다.
치료용 유전자는, 암이나 감염증 등의 특정한 질환의 치료에 이용할 수 있는 유전자이며, p53, Rb 등의 종양 억제 유전자, 인터루킨 1(IL-1), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12,IL-13, IL-14, IL-15, α-인터페론, β-인터페론, γ-인터페론, 앤지오스타틴, 트롬보스폰딘, 엔도스탄틴, METH-1, METH-2, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, 종양 괴사 인자 등의 생리활성물질을 코드하는 유전자 등을 들 수 있다. 루시페라아제나 GFP를 발현하는 분열 촉진 인자 활성화 단백질 키나제 의존성 재조합 우두 바이러스는, 그 감염 세포인 암 세포를 간편, 신속하게 검출하는 것이 가능하다. 본 발명의 분열 촉진 인자 활성화 단백질 키나제 의존성 우두 바이러스를 암 치료에 이용하는 경우, 우두 바이러스가 갖는 종양 용해성과 함께, 암에 대한 치료용 유전자가 암 치료 효과를 발휘하는 것이 가능하다.
외래 유전자(외래 DNA)로서 바이러스, 세균, 원충 및 암 등의 항원을 코드하는 DNA를 도입함으로써, 외래 유전자를 도입한 우두 바이러스 벡터를 각종 바이러스, 세균, 원충 및 암에 대한 백신으로 이용하는 것이 가능하다. 예를 들어, 인간 면역 부전 바이러스, 간염 바이러스, 헤르페스 바이러스. 마이코박테리아, 말라리아 원충, 중증 급성 호흡기 증후군(SARS=사스) 바이러스 등의 감염 방어 항원(중화항원) 혹은 암 항원을 코드하는 유전자를 도입하면 된다.
이들 외래 유전자는, 예를 들어, 상동 재조합의 수법을 이용함으로써 도입할 수 있다. 상동 재조합은 상술한 방법으로 행하면 된다. 예를 들어, 도입하고자 하는 부위의 DNA 배열 안에 도입해야 할 외래 유전자를 연결한 플라스미드(트랜스벡터)를 제작하고, 이것을, 우두 바이러스를 감염시킨 세포의 안에 도입하면 된다. 외래 유전자의 도입 영역은, 우두 바이러스의 생활환에 필수가 아닌 유전자 안이 바람직하다.
또한, 외래 유전자를 도입할 때, 외래 유전자의 상류에 적당한 프로모터를 기능할 수 있는 형태로 연결시키는 것이 바람직하다. 프로모터는, 한정된 것은 아니나, 상술한 PSFJ1-10이나, PSFJ2-16, p7.5K 프로모터, p11K 프로모터, T7.10 프로모터, CPX프로모터, HF 프로모터, H6 프로모터, T7 하이브리드 프로모터 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 우두 바이러스 벡터에 외래 유전자를 도입하는 방법은, 재조합 우두 바이러스 벡터를 구축하는 공지의 방법에 의해 행하는 것이 가능하며, 예를 들면, 별책 Experimental Medicine, extra issue, Protocol Series, Transgene & Expression Analysis Experiment Method, Saito et al. (ed.), YODOSHA (date of issue: September 1, 1997) 혹은 DNA Cloning 4: Mammalian Systems (2nd edition), D. M. Glover et al (editors), Ikunoshin Kato (translation supervisor), TaKaRa, EMBO Journal (1987, Vol. 6, pp. 3379-3384) 등의 기재에 따르면 된다.
본 발명을 이하의 실시 예에 따라 구체적으로 설명하되, 본 발명은 이들 실시 예에만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 분열 촉진 인자 활성화 단백질 키나제 의존성 재조합 우두 바이러스 MD-RVV(MAPK-dependent Recombinant Vaccinia Virus)의 구축
바이러스 단백 VGF와 O1L의 기능을 없앤 재조합 우두 바이러스를 만들어내기 위해 백신 세포주(LC16mO)의 VGF 유전자에 루시페라아제-GFP 융합 유전자 발현 카세트를 삽입한 재조합 바이러스(LC16mO/VGF-(VGF-)), 또는 O1L 유전자에 루시페라아제-GFP 융합 유전자 발현 카세트를 삽입한 재조합 바이러스 (LC16mO/O1L-(O1L-)), 또는 VGF 유전자에 루시페라아제-GFP 융합 유전자 발현 카세트와 O1L 유전자에 DsRed 발현 카세트를 삽입한 재조합 바이러스(LC16mO/VGF-O1L-))(MD)를 제작했다. 또한, LC16mO의 바이러스 증식능에 영향을 끼치지 않는 HA 유전자에 루시페라아제-GFP 융합 유전자 발현 카세트를 삽입한 재조합 바이러스 (mO)을, 콘트롤로서 사용했다. 도 2에 만들어 낸 재조합 우두 바이러스의 구조를 나타냈다. 도 2 중에, A,B,C 및 D는, 각각 LC16mO(mO), LC16mO/VGF-(VGF-), LC16mO/O1L-(O1L-) 및 LC16mO/VGF-O1L-(VGF-/O1L-)의 구조를 나타낸다.
처음으로, LC16mO 세포주의 게놈 DNA를 주형으로 하여, 두 개의 프라이머5'-cgcggatcctattctcattcatattctct-3'(서열번호 3)과 5'-cgcaagcttagatctggaaaa
tgtctgttagt-3'(서열번호 4)에 의해 VGF 유전자 영역을, 또는 두 개의 프라이머-5'-gcgctagcttaacgagttccatttatat-3'(서열번호 5)와 5'-gcgctagcatgttcatgtatccgg
aattt-3' (서열번호 6)에 의해 O1L 유전자 영역을 증폭했다. 그 각 PCR 산물을 제한 효소 BamHI와 HindIII, 또는 NheI으로 절단하고, 그것을 pUC19 벡터의 같은 제한 효소 부위에 클로닝하고, pCU19-VGF, 또는 pUC19-O1L을 구축했다.
한편, LC16mO 세포주의 게놈 DNA를 주형으로 하여, 두개의 프라이머 5'-cgcagctgagcttttgcgatcaataaatg-3' (서열번호 7)과 5'-ttcagctgaatatgaaggagca a-3' (서열번호 8)에 의해, TK 유전자 영역을 증폭했다. 그 PCR 산물을 제한 효소 PvuII으로 절단하고, 그것을 pUC19 벡터의 같은 제한 효소 부위에 클로닝하고, pTK를 구축했다. 또, 2개의 합성 DNA 5'-aattgcatgcgtcgacattaatggccggaccggccttcgaag
-3' (서열번호 9)와 5'-aattcttcgaaggccggtccggccattaatgtcgacgcatgc-3' (서열번호 10)를 아닐하고, 그것을 제한 효소 EcoRI로 절단한 pTK에 클로닝하여, pTK-MSC를 구축하였다. 합성 우두 바이러스 프로모터 (Hammond JM. et al., Journal of Virological Methods, 1997, 66 (1): 135-138)를 삽입하기 때문에, 2개의 DNA(5'tcgaaattggatcagcttttttttttttttttttggcatataaataaggtcgaggtaccaaaaattgaaaa
actattctaatttattgcacggccggac-3'(서열번호 11)과 5'-cggccgtgcaataaattagaatagtt
tttcaatttttggtacctcgaccttatttatatgccaaaaaaaaaaaaaaaaaagctgatccaatt-3'(서열번호 12)를 아닐하고, 그것을 제한 효소 SfiI와 SalI로 절단한 pTK-MSC에 클로닝 하여, pTK-SP-MSC를 구축했다.
pVNC-110-Luc/IRES/EGFP 플라스미드에서 제한 효소 SfiI와 EcoRI의 절단에 의해 획득한 Luc/IRES/EGFP 유전자 단편을, pTK-SP-MSC의 같은 제한 효소 부위에 클로닝하여, pTK-SP-LG를 획득했다.
pGL4.20 (Promega KK.)의 플라스미드 DNA를 주형으로, 2개의 프라이머(5'-caacccgggccatggaagatgccaaaaaca-3'(서열번호 13)과 5'-ctgcggccgccacggcgatcttgc cgccct-3' (서열번호 14)에 의해, 반딧불 루시페라아제 유전자 영역을 증폭했다. 그 PCR 산물을 제한 효소 SmaI과 NotI으로 절단하고, 그것을 pIRES 벡터(Clontech Laboratories, Inc.)의 플라스미드 DNA를 주형으로 하여, 2개의 프라이머 5'-gcgcg gccgcagccaccatggtgagcaagggcgagga-3'(서열번호 15)와 5'-gctgcggccgcttcgaattct tacttgtacagctcgtcca-3'(서열번호 16)에 의해, EGFP 유전자 영역을 증폭했다. 그 PCR 산물을 제한 효소 NotI로 절단하고, 그것을 pIRES-Luc의 같은 제한 효소 부위에 클로닝하여, pIRES-LucGFP를 구축했다. pIRES-LucGFP를 제한 효소 SmaI 과 EcoRI로 절단하여 얻은 벡터 단편에 클로닝 하여, pTK-SP-LucGFP를 구축했다.
pTK-SP-LucGFP를 제한 효소 SphI and EcoRI로 절단하고, Blunt 처리 후, 그 SP-LucGFP 단편을, pUC19-VGF를 제한 효소 AccI으로 절단해 Blunt 처리한 부위에, 또는 pUC19-O1L를 제한 효소 XbaI으로 절단해 Blunt 처리한 부위에 클로닝하여 pUC19-VGF-SP-LucGFP, 또는 pUC19-O1L-SP-LucGFP를 구축했다. 마찬가지로, pTK-SP-LucGFP를 제한 효소 SphI 및 EcoRI으로 절단하고, Blunt 처리 후, 그 SP-LucGFP 단편을, pVNC110(Suzuki H. et al., Vaccine, 2009; 27 (7): 966-971)를 제한 효소 SpeI으로 절단해 Blunt 처리한 부위에 클로닝하여, pVNC110-SP-LucGFP를 구축했다.
한편, 합성 우두 바이러스 프로모터가 아닌, p7.5K 프로모터를 pTK-MSC의 제한 효소 SphI와 SalI 부위에 클로닝 하여, pTK-P-MSC를 구축했다. pDsRed-Express-N1 (Clontech Laboratories, Inc.)의 DsRed-Express 유전자 영역을 pCR4 (Invitrogen)에 클로닝 하여, pCR4-DsRed를 구축했다. pCR4-DsRed를 제한 효소 PmeI과 NotI로 절단하고, Blunt 처리한 DsRed 단편을, pTK-P-MSC 를 SalI으로 절단하고 Blunt 처리한 부위에 클로닝하여, pTK-P-DsRed를 구축했다. pTK-P-DsRed를 제한 효소 SphI으로 절단하여, Blunt 처리 후, 그 P-DsRed 단편을, pUC19-O1L을 제한효소 XbaI으로 절단하여 Blunt 처리한 부위에 클로닝한 pUC19-O1L-P-DsRed를 구축했다.
도2에 나타난 바이러스 게놈을 갖는 각 분열 촉진 인자 활성화 단백질 키나제 의존성 재조합 우두 바이러스의 회수를 위해, 6well 디쉬에 80% 컨플루엔트에 배양된 RK13 세포에 우두 바이러스 (LC16mO)을 MOI=0.02~0.1로 감염시켜, 실온에서 1시간 흡착 후, FuGENE HD (Roche)와 혼합한 트랜스퍼 벡터 플라스미드 DNA (pUC19-VGF-SP-LucGFP, pUC19-O1L-SP-LucGFP, or pVNC110-SP-LucGFP)를 매뉴얼에 따라 세포에 첨가하여 합쳐, 37℃ 에서 2~5일간 배양했다. 세포를 동결 융해 후, 소니케이션 처리하고, 거의 컨플루엔트가 된 RK13 세포에 적당히 희석하여 접종하고, 0.8% 메틸셀룰로오스를 함유한 Eagle MEM, 5%FBS 배지를 더해, 37℃ 에서 2~5일간 배양했다. 배지를 제거하고, 라지 플라크를 칩 끝으로 긁어,Opti-MEM배지 (Invitrogen)에 부유시켰다. RK13 세포에 거듭 3회 이상, 이 조작을 반복하여, 플라크를 순화시켰다. 플라크 순화 후에 채취한 플라크의 부유액을 소니케이션 한 후, 그 200 mL를 15,000 rpm, 30분간 원심하고, 침전물에 50 mL의 멸균 증류수 또는 10 mM Tris-HCl (pH 7.5)를 첨가했다. 30초간 소니케이션 한 후, 95℃ 에서 10분간 가열하여 게놈 DNA를 추출하고, PCR에 의한 스크리닝에 제공하였다. VGF에 관해서는 2개의 프라이머 5'-atgttgataaattatctga-3'(서열번호 17)과 5'-ttatggcaca accatatct-3'(서열번호 18)에 의해, O1L에 관해서는 2개의 프라이머 5'-acagggattaagacggaaag-3'(서열번호 19)와 5'-gtcaacaagcatcttccaac-3'(서열번호 20)에 의해, HA에 관해서는 2개의 프라이머 5'-cgactatagacataatacta-3'(서열번호 21)과 5'-cagatgatgcacttactgta-3'(서열번호 22)에 의해 PCR를 행하여, 소정의 크기의 PCR 프로덕트가 검출된 클론에 대하여, PCR 프로덕트의 염기 배열을 직접 순서 결정법에 의해 확인했다. 염기 배열에 문제가 없는 바이러스 클론을 선택하여, RK13 세포에서 대량 배양하고 정제한 후, RK13 세포에서 바이러스 역가를 측정하고, 실험에 제공하였다. 또, VGF-/O1L- 분열 촉진 인자 활성화 단백질 키나제 의존성 재조합 우두 바이러스의 회수를 위해, 마찬가지로 배양된 RK13 세포에 VGF-바이러스를 MOI=0.02~0.1로 감염시켜, 실온에서 1시간 흡착 후, FuGENE HD (Roche)와 혼합한 트랜스퍼 벡터 플라스미드 DNA (pUC19-O1L-P-DsRed)를 매뉴얼에 따라 세포에 첨가하여 합쳐, 37℃ 에서 2~5일간 배양했다. 이하, 상기와 동일한 방법으로 회수하고, VGF-/O1L- 바이러스로서 실험에 제공하였다.
실시예 2 분열 촉진 인자 활성화 단백질 키나제 의존성 재조합 우두 바이러스의 특성
도2에 나타나있는 바이러스 게놈을 갖는 각 분열 촉진 인자 활성화 단백질 키나제 의존성 재조합 바이러스를 24 well에서 혈청 존재 하에, 혹은 혈청 비 존재하에서 배양한 각 인간 정상 폐 섬유아 NHLF 세포, 그리고 인간 암 세포주 (폐암 A549 세포, 췌장암 AsPC-1 세포, 췌장암 BxPC-3 세포, 췌장암 PANC-1 세포, 난소암 SKOV3 세포)에 MOI-1로 감염시켜, 37℃에서 30시간 배양 후, 형광현미경(Olympus Corporation)으로 생 세포 인채로 명시야 관찰과 형광 관찰을 하여, 그들 양쪽의 사진을 겹쳤다. 그 결과, 혈청 존재 하에서는, 정상 세포 및 암 세포에 있어서 각 바이러스의 세포 장해성은 거의 동등하고, 그 GFP 단백의 발현도 거의 동등하였다(도3, 기준자는 500mM를 가르킨다). 도3은, 인간 정상 폐 섬유아 NHLF 세포, 그리고 인간 암 세포주(폐암 A549 세포, 췌장암 AsPC-1 세포, 췌장암 BxPC-3 세포, 췌장암 PANC-1 세포, 난소암 SKOV3 세포)에 모크(콘트롤), mO 세포주, VGF 결손 mO 세포주(VGF-), O1L 결손 mO 세포주(O1L-) 및 VGF와 O1L 결손 mO 세포주(VGF-/O1L-)를 감염시킨 결과를 나타내고 있다. 각각 판넬의 좌측에 세포를, 위에는 감염시킨 우두 바이러스를 나타낸다. 그림에서 녹색 부분이 형광 감염된 부위를 나타낸다(흑백에서는 백색으로 보인다). 이것에 대해, 혈청 비 존재 하에서는, 암 세포에 있어서 각 바이러스의 GFP 발현ㆍ세포 장해성은 거의 동등했지만, 정상 세포에 있어서 GFP 발현ㆍ세포 장해성은 mO가 가장 높고, 그 뒤로 VGF-와 O1L-의 순서였다. 그리고 VGF-/O1L-에 있어서의 GFP 발현ㆍ세포 장해성은 다른 바이러스에 비해 지극히 낮아, 모의 대조 세포 (Mock)와 거의 동등했다(도4, 기준자는 500 mM을 가리킨다).도4의 각 판넬의 의미는 도3과 동일하다.
이어서, 도2에 나타나는 바이러스 게놈을 갖는 각 분열 촉진 인자 활성화 단백질 키나제 의존성 재조합 우두 바이러스 mO, 또는 VGF-/O1L-을, 8well 챔버 슬라이드 글라스 위에서 혈청 비 존재 하에서 배양한 각 인간 정상 유선 상피 MCF10A 세포 및 폐암 A549 세포에 MOI=1로 감염시켜, 37℃에서 12시간 배양 후, 4% 포름알데히드 고정, 메탄올 투과화 처리했다(이들 처리 후에는 GFP 단백을 확인할 수는 있었으나, DsRed 단백은 확인할 수 없었다). 그리고 인산화된 p44/42 MAPK 단백질 (Erk1/2)을 검출하는 1차 항체(#4370,CST Japan)에서 반응했다. PBS로 세정 후, 2차 형광(Alexa Fluor 568) 항체(#A21069, Invitrogen)으로 염색하고,DAPI를 포함하는 핵염색봉입제를 더해 형광 현미경(Olympus Corporation)으로 관찰하고, 얻어진 각 염색 사진을 합성했다. 또, 양성 콘트롤로서, 고정 15분 전에, 상피 성장 인자 EFG 단백을 200 ng/ml의 농도로 더했다. 도5-1에 있어서, 인간 정상 유선 상피 MCF10A 세포, 또는 폐암 A549 세포(각 판넬의 왼쪽에 나타나있다)에 Mock(콘트롤), EGF 자극(양성 콘트롤), mO 세포주 또는 VGF와 O1L 결손 mO 세포주(VGF-/O1L-)를 감염시킨 경우의 결과를 나타낸다(기준자는 500 mM을 가리킨다). Mock의 MCF10A 세포에서는 핵만이 염색(청색)되는 것에 비해, Mock의 A549 세포에서는 핵과 세포질에 있어 인산화된 p44/42 MAPK 단백질이 염색(적색)되어 있다. 한편, EGF 자극 세포에서는 MCF10A 세포, A549 세포 모두 세포의 핵(청색)과 세포질에 있어 인산화 된 p44/42 MAPK 단백질이 강하게 염색(적색)되어 있다. mO를 감염시킨 MCF10A 세포 및 A549 세포에서는, mO 바이러스 유래의 발현 GFP 단백이 보이며, 그 감염 세포와 주위의 감염되지 않은 세포에서 핵(청색)과 세포질에 있어서 인산화된 p44/42 MAPK 단백질이 강하게 염색(적색) 되어 있다. VGF-/O1L-를 감염시킨 세포에서는, MCF10A 세포에 있어서는 핵이 염색(청색) 되어있지만 인산화된 p44/42 MAPK 단백질의 염색은 인정되지 않고, mO와 비교하여 VGF-/O1L- 바이러스 유래의 GFP 단백을 발현하는 세포가 멸소해 있었다. 이에 비해 A549 세포에 있어서는, Mock와 마찬가지로 인산화 된 p44/42 MAPK 단백질이 염색(적색) 되어 있고, VGF-/O1L- 바이러스 유래의 GFP 단백을 발현하는 세포도 mO와 동등하였다.
한편, 도2에 나타나는 바이러스 게놈을 갖는 각 분열 촉진 인자 활성화 단백질 키나제 의존성 재조합 우두 바이러스 mO, VGF-, O1L- 또는 VGF-/O1L-를, 96well에서 혈청 존재 하, 또는 혈청 비 존재하에서 배양한 각 인간 정상 폐 섬유아 NHLF 세포, 그리고 인간 췌장암 AsPC-1 세포에 MOI=1으로 감염시켜, 37℃에서 30시간 배양 후, Pierce ERK1/2 Colorimetric In-Cell ELISA Kit (62206, Thermo Scientific)을 이용하여, 내재성 레벨의 인산화 된 p44/42 MAPK 단백질(Erk1/2)을 검출했다. 결과를 도5-2에 나타냈다. 도5-2에서, 혈청 존재 하(serum-stimulated cells), 또는 혈청 비 존재 하(serum-starved cells)에서 배양한 정상 NHLF 세포, 또는 췌장암 AsPC-1 세포에 Mock(콘트롤), mO 세포주(VGF+/O1L+), O1L 결손 mO 세포주(VGF+/O1L-), VGF 결손 mO 세포주(VGF-/O1L+) 또는 VGF와 O1L 결손 mO 세포주(VGF-/O1L-)를 감염시킨 경우의 결과를 나타낸다(세로축의 흡광도 450nm은, 인산화 된 Erk1/2 레벨을 나타낸다). 혈청 존재 하의 정상 NHLF 세포, 그리고 췌장암 AsPC-1 세포에서는, 바이러스의 종류나 그 감염에 관계 없이, 높은 ERK 활성화가 인정된다. 그에 비해, 혈청 비 존재 하의 췌장암 AsPC-1 세포에서는, 그 인산화 된 Erk1/2 레벨은 거의 반멸하나, 바이러스 종류나 그 감염에 관계 없이, 동등한 ERK의 활성화가 인정된다. 그에 비해, 혈청 비 존재하의 정상 NHLF 세포에서는 VGF-/O1L-의 감염 세포에 있어서 인산화된 Erk1/2 레벨은 격감하고, 바이러스가 감염하지 않은 콘트롤 세포에 있어서의 그 레벨과 유의차가 인정되지 않았다. 한편, VGF+/O1L+,VGF+/O1L-,또는 VGF-/O1L+의 감염 세포에 있어서의 인산화된 Erk1/2 레벨은, 여전히 콘트롤 세포에 있어서의 그 레벨에 비해 유의하게 상승해 있었다. 이상으로, VGF-/O1L- 분열 촉진 인자 활성화 단백질 키나제 의존성 재조합 우두 바이러스는, Ras/Raf/MEK/ERK 대사 경로가 활성화되어 있지 않은 정상 세포에서는 그 증식성이 현저히 저하하지만, Ras/Raf/MEK/ERK 대사 경로가 활성화되어 있는 암 세포에서는, 그것이 VGF-/O1L- 바이러스의 ERK 활성화 기능을 보충하여 바이러스는 증식할 수 있다는 것이 증명되었다..
실시 예3 분열 촉진 인자 활성화 단백질 키나제 의존성 재조합 우두 바이러스의 안전성
이 분열 촉진 인자 활성화 단백질 키나제 의존성 재조합 우두 바이러스의 쥐 체내에 있어서의 바이러스 병원성을 검토했다. VGF-/O1L- 분열 촉진 인자 활성화 단백질 키나제 의존성 재조합 우두 바이러스가 감염한 정상 세포에서는 ERK를 활성화 할 수 없기 때문에, 세포 분열은 촉진되지 않아, 그 결과 바이러스 증식은 현저히 저하한다고 예상된다. 106 pfu의 도2에 나타난 바이러스 게놈을 갖는 각 분열 촉진 인자 활성화 단백질 키나제 의존성 재조합 우두 바이러스를 SCID 쥐에게 복강내 투여했다(각군 2마리). 투여 후, 3일(D3), 9일(D9), 16일(D16), 22일(D22) 후에 루시페린을 투여하고, 바이러스가 감염, 증식한 세포에 있어 루시페라아제 발현(=증식 바이러스 수)을 in vivo 이미징 시스템 (Berthold, NightDHADE LB985)에 의해 비침습적으로 모니터하고(도6A), 수치화했다(도6B). 그 결과, 바이러스 투여 3일 후에는, mO 투여 쥐에게서 높은 루시페라아제 발현이 보였으며, 이어서 O1L- 투여 쥐, VGF-투여 쥐, 그리고 VGF-/O1L- 투여 쥐의 순서이며, 바이러스 투여 9일 후의 VGF-/O1L- 투여 쥐에게서는 그 발현이 보이지 않았다. 그 후, mO와 O1L- 투여 쥐에게서는, 바이러스가 감염, 증식하고, 시간 경과에 따라 투여 부위인 복강내 뿐만 아니라, 전신으로 넓어져, 주로 꼬리, 손발, 구강에서 보여지는 증상과 일치해있었다. 한편, VGF-와 VGF-/O1L- 투여 쥐에게서는, 바이러스가 상실해 있었다. 도6A와 도6B에서, 각 판넬의 위와 아래 기재는 mO 세포주, VGF 결손 mO 세포주(VGF-), O1L 결손 mO 세포주(O1L-) 및 VGF와 O1L 결손 mO 세포주(VGF-/O1L-)를 나타내며, 각 판넬의 좌측과 위의 기재는 투여 후의 일수를 나타낸다. 도6A의 막대는 루시페라아제에 의한 광원의 광도, 즉 빛의 강도의 스케일을 나타내고, 위부터 적색, 오렌지 색, 황색황녹, 청색, 보라색의 순으로 빛의 강도를 나타낸다. 그리고 도6B에서는 그 빛의 강도의 단위인 photons/sec의 총 수를 세로축에 나타내고 있다.
다음으로, 이들 바이러스 투여 쥐의 체중 변화를 장기적으로 관찰하였다(도7). VGF-/O1L- 투여 쥐에게서는, 체중 감소가 나타나지 않아, 바이러스가 체내에서 상실한 것과 일치했다. 이에 비해 mO 투여 쥐는, 급격한 체중 감소를 동반하는 바이러스 독성에 의해, 투여 35일 후와 49일 후에 사망했다. 또, O1L- 투여 쥐는, 마찬가지로 투여 49일 후와 77일 후에 사망했다. 한편, VGF- 투여 쥐 군 중에서는, 투여 217일 후 경부터 꼬리에 증상이 발견되고, 그와 함께 그 부위가 괴사하며, 급격한 체중 감소를 보이는 쥐가 있었다. 또, 투여 231일 후의 루시페라아제 발현의 비 침습적 이미징에서는, 그 증상부위(→)에서 증식 바이러스가 확인되었다(도8). 또한, 측정 조건은 도6A와 동일하며, 빛의 강도를 나타내는 스케일도 동일 범위로 위에서 부터 적색, 오렌지, 황색황녹, 청색, 보라색의 순으로 빛의 강도를 나타낸다. 최종적으로 VGF- 투여 쥐는, 투여 252일 후와 287일 후에 사망했다(도7). 이상으로, VGF-/O1L- 분열 촉진 인자 활성화 단백질 키나제 의존성 재조합 우두 바이러스는, Ras/Raf/MEK/ERK 대사 경로를 활성화하기 위한 바이러스 단백 VGF와 O1L을 코드하는 유전자가 결실해있기 때문에, 정상 세포에서는 그 증식성이 현저히 저하하는 것이 쥐의 체내에 있어 증명되었다.
실시 예4 분열 촉진 인자 활성화 단백질 키나제 의존성 재조합 우두 바이러스의 항암 효과
레닐라 루시페라아제를 안정적으로 발현하는 인간 췌장암 BxPC-3 세포(5x 106 개)를 SCID 쥐의 복강 내에 투여하고, 그로부터 7일 후에 106 pfu의 각 분열 촉진 인자 활성화 단백질 키나제 의존성 재조합 우두 바이러스를 복강 내에 투여하였다(각 군 5마리). 그 결과, VGF-, 또는 VGF-/O1L-는, BxPC-3 모의 파종 모델 쥐에서 강력한 항암작용을 나타내고, 바이러스 투여 없는 모의 대비 군에 비해, 생존율에서 매우 유의한 차이가 Log-rank 검정에 의해 확인되었으며(P = 0.0047), 바이러스 독성에 대한 부작용도 보이지 않았다(도9). 또한, VGF-/O1L-는, VGF-와 비교하여도, 생존율에서 유의한 차이가 Log-rank 검정에 의해 확인되었다(P = 0.031).
다음으로, 바이러스 투여 2일 전 및 바이러스 투여 11일 후에, 레닐라 루시페라아제의 기질인 실렌테라진을 복강 내 투여함으로써, 쥐 체내에서의 종양 세포(=증식 세포 수)를 in vivo 이미징 시스템(Berthold, NightDHADE LB985)에 의해 비 침습적으로 모니터하고(도10A), 수치화하였다(도10B). 그 결과, 바이러스 투여 2일 전에는 BxPC-3 세포의 복막 파종이 확인되었고, 모든 바이러스 투여군에서 치료 11일 후의 복강 내 종양이 거의 상실해 있었으나, 콘트롤군에서는 치료 효과 없이 종양이 증대해 있었다. 가장 생존율 향상을 보였던 VGF-/O1L- 투여 쥐에게서는, 치료 전에 비해 치료 11일 후에 97.4%~99.3%의 종양 세포가 소실되어 있었다. 도10A와 도10B에서, 각 판넬의 위와 오른쪽의 기재는, mO 세포주, VGF 결손 mO 세포주(VGF-), O1L 결손 mO 세포주(O1L-) 및 VGF와 O1L 결손 mO 세포주(VGF-/O1L-)를 나타낸다. 도10A의 오른쪽 막대는 루시페라아제에 의한 광원의 광도, 즉 빛의 강도의 스케일을 나타내며, 적색, 오렌지, 황색황녹, 청색, 보라색의 순으로 빛의 강도를 나타낸다. 그리고 도10B에서는 그 빛의 강도의 단위인 photons/sec의 총 수를 세로축에 나타내고 있다.
다음으로, 바이러스 투여 3일 후 및 10일 후에, 반딧불 루시페라아제의 기질인 루시페린을 복강 내 투여함으로써, 쥐 체내에서의 바이러스 분포를 비 침습적으로 모니터하였다. 그 결과, 투여 3일 후에는 복강 내 종양에 있어 각 바이러스 (mO, VGF-, O1L-, 및 VGF-/O1L-)의 동등한 증식이 확인되었다. 투여 10일 후에는 mO및 O1L-을 투여한 쥐에게서, 종양 조직만이 아니라 정상 조직에서도 바이러스 증식이 보였으나, VGF- 및 VGF-/O1L-에서는, 체내에서 바이러스가 상실하거나, 혹은 바이러스 증식이 복강 내의 종양에만 국한되어, 정상 조직에서의 바이러스 증식은 보이지 않았다(도11). 도11에서, 각 판넬의 위쪽의 기재는, mO 세포주, VGF 결손 mO 세포주(VGF-), O1L 결손 mO 세포주(O1L-) 및 VGF와 O1L 결손 mO 세포주(VGF-/O1L-)를 나타낸다.
또, 같은 BxPC-3 복막 파종 쥐 모델을, VGF-/O1L- 투여 3일 후에 반딧불 루시페라아제의 기질인 루시페린을 복강 내 투여하고 안락사시켜, 직접 복강 내를 관찰하였다(도12A). 복막 파종한 종양 조직(도12A의 황색 점선 부분)이 확인되었고(도12A), 또한 바이러스의 증식을 나타내는 발광도 확인되었다(도12B). 다음으로, 정상 조직을 포함하는 조양 조직을 회수하여, 10% 포르말린으로 고정 후, 파라핀 절편을 제작했다. 탈 파라핀 처리, 10 mM 구연산 나트륨 버퍼(pH 6.0)를 이용한 마이크로웨이브 방식에 의한 항원 부활화 처리 후, 블로킹 액(TBST/5% 정상 염소 혈청)으로 연속 절편을 실온에서 1시간 블로킹하였다. Renilla Luciferase를 검출하는 1차 항원(PMO47, MBL), 인산화된 p44/42 MAPK 단백질(Erk1/2)을 검출하는 1차 항원(#4370, CST Japan), 또는 우두 바이러스를 검출하는 1차 항원(ab35219, abcam)을 각 절편에 첨가하여, 4℃에서 하룻밤 인큐베이트하고 세정한 후, SignalStain(등록상표) Boost IHC Detection Reagent (#8114, CST Japan) 과 SignalStain(등록상표) DAB Substrate Kit (#8059, CST Japan)을 이용하여 발색시켜, 헤마톡실린으로 절편을 대비 염색 했다. 도12C가 Renilla Luciferase(Rluc)의 검출 결과를 나타내며, 도12D가 인산화된 p44/42 MAPK 단백질 (Erk1/2)(pERK)의 검출 결과를 나타내며, 도12E가 우두 바이러스의 검출 결과를 나타낸다. 도12C에 나타낸대로 도의 상부의 조직이 정상 조직이며, 도의 하부의 조직이 종양 조직이다. Renilla Luciferase와 우두 바이러스는, 종양 세포에서만 검출되었다. 그 종양 세포는, Ras/Raf/MEK/ERK 대사 경로의 활성화가 확인되었으나, 주위의 정상 세포에서는 그 경로가 활성화되지 않아 있었다.
실시 예5 BxPC -3 복막 파종 쥐 모델에서의 바이러스 용량과 항암 효과, 안전성의 관계의 검토
한편, 같은 BxPC-3 복막 파종 쥐 모델에 있어, 바이러스 용량과 항암 효과ㆍ안전성을 평가했다. 레닐라 루시페라아제를 안정적으로 발현하는 인간 췌장암 BxPC-3(5x106개)를 SCID 쥐의 복강 내에 투여하고, 그 7일 후에 105,106, 또는 107 pfu의 각 분열 촉진 인자 활성화 단백질 키나제 의존성 재조합 우두 바이러스를 복강 내에 투여했다(각 군 5마리). 바이러스 투여 2일 전 및 바이러스 투여 11일 후에, 레닐라 루시페라아제의 기질인 실렌테라진을 복강 내 투여함으로써, 쥐 체내에서의 종양 세포(=증식 세포 수)를 in vivo 이미지 시스템(Berthold, NightDHADE LB985)에 의해 비 침습적으로 모니터하고(도13A), 수치화하였다(도13B). 그 결과, 모든 바이러스 투여 2일 전에는 BxPC-3 세포의 복막 파종이 유의차 없이 동등하게 확인되어, 치료 11일 후의 복강 내에서는, 105 pfu 바이러스 투여군에서 치료 전의 87.7%~98.3%, 106 바이러스 투여군에서 치료 전의 92.4%~99.3%, 107 바이러스 투여군에서 치료 전의 88.3%~98.9%의 종양이 유의차 없이 동등하게 소실해 있었다. 콘트롤군에서는 치료 효과 없이 종양이 증대해 있었다. 도13A와 도13B에서, 각 판넬의 위와 오른쪽의 기재는, mO 세포주, VGF 결손 mO 세포주(VGF-), O1L 결손 mO 세포주(O1L-) 및 VGF와 O1L 결손 mO 세포주(VGF-/O1L-)를 나타낸다. 도13A의 오른쪽 막대는 루시페라아제에 의한 광원의 광도, 즉 빛의 강도의 스케일을 나타내며, 적색, 오렌지, 황색황녹, 청색, 보라색의 순으로 빛의 강도를 나타낸다. 그리고 도13B에서는 그 빛의 강도의 단위인 photons/sec의 총 수를 세로축에 나타내고 있다.
다음으로, 바이러스 투여 3일 후 및 10일 후에, 반딧불 루시페라아제의 기질인 루시페린을 복강 내 투여함으로써, 쥐 체내에서의 바이러스 분포를 비 침습적으로 모니터하였다. 그 결과, 투여 3일 후에는 복강 내 종양에 있어 각 바이러스 투여군(105,106, 또는 107pfu의 VGF-/O1L-)에서는, 동등한 증식이 확인되었다. 그리고 투여 10일 후에는 체내에서 바이러스가 상실하거나 혹은 바이러스 증식이 복강 내의 종양에만 국한되어, 정상 조직에서의 바이러스 증식은 보이지 않았다(도14). 도14에서, 각 판넬의 위쪽의 기재는, mO 세포주, VGF 결손 mO 세포주(VGF-), O1L 결손 mO 세포주(O1L-) 및 VGF와 O1L 결손 mO 세포주(VGF-/O1L-)를 나타낸다.
이상으로, VGF-/O1L- 분열 촉진 인자 활성화 단백질 키나제 의존성 재조합 우두 바이러스는, Ras/Raf/MEK/ERK 대사 경로가 활성화되어 있지 않은 정상 세포에서는 그 증식성이 현저히 저하하지만, Ras/Raf/MEK/ERK 대사 경로가 활성해 있는 종양 세포에서는, 그것이 VGF-/O1L- 바이러스의 ERK 활성화 기능을 보충하여 바이러스는 증식할 수 있다는 것이 쥐의 체내에 있어 증명되었다. 또한, VGF-/O1L- 치료군의 항암 효과가, 10배, 100배의 VGF-/O1L- 치료군의 그것과 동등하다는 것은, 보다 낮은 투여량으로도, 감염한 종양 세포 내에서 증식하면서 사멸시킨다는 바이러스 요법의 이점이 실증되었다.
본 발명의 분열 촉진 인자 활성화 단백질 키나제 의존성 재조합 우두 바이러스는, Ras/Raf/MEK/ERK 대사 경로를 활성화하는, VGF 및 O1L의 기능이 결손해있다. 따라서 정상 세포에 있어서는, 세포의 Ras/Raf/MEK/ERK 대사 경로를 활성화하는 것이 불가능하므로, 세포는 증식하지 않아, 그 결과 우두 바이러스도 증식하는 것이 불가능하여, 정상 세포에 장해를 끼치지 않는다. 한편, 암 세포에 있어서는, 원래 Ras/Raf/MEK/ERK 대사 경로가 비정상적으로 활성화되어 있으므로, VGF 및 O1L에 의한 활성화가 없어도, 암 세포는 증식할 수 있다. 따라서, 본 발명의 분열 촉진 인자 활성화 단백질 키나제 의존성 재조합 우두 바이러스는 암의 치료에 이용할 수 있다.
또한, 우두 바이러스는, 넓은 숙주역과 높은 발현 효율이 있기 때문에, 다른 외래 유전자를 도입하는 벡터로서도 기능한다. 루시페라아제나 GFP를 발현하는 분열 촉진 인자 활성화 단백질 키나제 의존성 재조합 우두 바이러스는, 그 감염 세포를 간편, 신속하게 동정하는 것이 가능해진다. 또, 세포 독성 효과나 면역 부활 효과를 갖는 치료 유전자를 발현시키는 것으로, 다른 치료법과의 병용도 가능해진다.
서열 프리 텍스트
서열번호 3-8, 13-22 프라이머
서열번호 9-12 합성
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 그대로 참고로서 본 명세서에 채택하는 것으로 한다.
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Claims (6)

  1. 우두 바이러스(vaccinia virus) 증식 인자 (VGF) 및 O1L의 기능이 결손하고 정상 세포 내에서 증식하지 않지만, 암세포 내에서 특이적으로 증식하고, 암세포를 특이적으로 저해하는 종양 용해성(oncolytic)을 갖는, 분열 촉진 인자 활성화 단백질 키나제(mitogen-activated protein kinase) 의존성 우두 바이러스.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 우두 바이러스는 B5R 유전자를 발현하도록 변형된 세포주 LC16, LC16mO 또는 LC16m8인, 분열 촉진 인자 활성화 단백질 키나제 의존성 우두 바이러스.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 기재된 우두 바이러스를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 기재된 분열 촉진 인자 활성화 단백질 키나제 의존성 우두 바이러스에 외래 DNA를 도입한, 분열 촉진 인자 활성화 단백질 키나제 의존성 우두 바이러스 벡터.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 외래 DNA는 마커 DNA, 세포 독성 효과(cytotoxic effects) 또는 면역 자극 효과(immunostimulating effects)를 갖는 치료용 유전자, 또는 암, 바이러스, 박테리아 또는 원생동물(protozoan) 항원을 암호화하는 DNA 인, 분열 촉진 인자 활성화 단백질 키나제 의존성 우두 바이러스 벡터.
  6. 제 4항 또는 제 5항에 기재된 분열 촉진 인자 활성화 단백질 키나제 의존성 우두 바이러스 벡터를 포함하는 암 치료용, 또는 암, 바이러스, 박테리아 또는 원생동물에 대한 백신으로 사용하기 위한 약학적 조성물.
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