CN115175690A - 重组牛痘病毒 - Google Patents

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Abstract

本公开内容提供具有复制能力的重组溶瘤牛痘病毒(RVV)、包含RVV的组合物以及RVV或组合物用于在患有肿瘤的个体中诱导溶瘤的用途。

Description

重组牛痘病毒
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年1月9日提交的美国临时申请号62/959,083的权益，其公开内容通过引用整体并入本文。
通过引用并入以文本文件形式提供的序列表
序列表作为创建于2020年12月3日、大小为69KB的文本文件“PC72576A_SEQ_LISTING_ST25.txt”提供。该文本文件的内容通过引用以其整体并入本文。
背景技术
溶瘤病毒(OV)是选择性或优先感染并杀死癌细胞的病毒。活复制OV已在多种人类癌症的临床试验中进行了测试。OV可以诱导抗肿瘤免疫反应，以及肿瘤细胞的直接裂解(即溶瘤)。OV可以天然存在或可以通过修饰其他病毒来构建。常见的OV包括基于单纯疱疹病毒(HSV)、腺病毒(Ad)、麻疹病毒(MV)、柯萨奇病毒(CV)、水泡性口炎病毒(VSV)和牛痘病毒(VV)的减毒株构建的OV。
VV是痘病毒科的正痘病毒属的成员。它具有长约190kb的线性双链DNA基因组，其编码约200个基因。VV在宿主细胞的细胞质中复制。该大的VV基因组编码用于病毒DNA复制的各种酶和蛋白质。在复制过程中，VV产生在其外膜上不同的几种感染形式：细胞内成熟病毒粒子(IMV)、细胞内包膜病毒粒子(IEV)、细胞相关包膜病毒粒子(CEV)和细胞外包膜病毒粒子(EEV)。IMV是最丰富的传染形式，并且被认为负责宿主之间的传播；CEV被认为在细胞间传播中起作用；EEV被认为对宿主生物体内的远距离传播很重要。EEV特异性蛋白由A33R、A34R、A36R、A56R、B5R和F13 L基因编码。A34是一种由A34R基因编码的II型跨膜糖蛋白，参与肌动蛋白尾的诱导、包膜病毒从感染细胞的表面的释放以及在病毒进入前配体结合后病毒包膜的破坏。
因为VV用作天花的常规疫苗的悠久历史，它是溶瘤病毒工程化的常用骨架之一。临床数据表明溶瘤牛痘病毒(OVV)治疗的功效往往是剂量依赖性的。因此，在临床环境中，更有可能应用高治疗剂量(显著高于疫苗接种剂量)以最大化OVV的抗肿瘤作用。然而，如美国FDA在研究性细胞和基因治疗产品的临床前评估指南(Preclinical Assessment ofInvestigational Cellular and Gene Therapy Products，2013年11月)中所述，在处理具有复制能力的溶瘤病毒(包括OVV)时，高水平、持续的病毒复制可能引起重大安全问题。因此，需要一种复制可控的OVV和控制施用OVV的患者中的OVV复制的方法。
发明内容
本公开内容提供了一种具有复制能力的重组溶瘤牛痘病毒(下文称为“重组牛痘病毒”、“重组VV”或“RVV”)，其包含：(i)编码免疫刺激性细胞因子多肽的核苷酸序列，所述免疫刺激性细胞因子多肽例如白细胞介素-2(IL-2)多肽或其变体(IL-2v)；(ii)编码异源胸苷激酶(TK)多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开内容提供了一种包含单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)多肽的复制可控的RVV，其允许通过抗病毒剂例如2'-脱氧鸟苷类似物(例如，诸如更昔洛韦或GCV)进行病毒复制控制。本公开内容进一步提供了包含RVV的组合物、在患有肿瘤的个体中诱导溶瘤的方法(包括向个体施用有效量的本公开内容的RVV或组合物)以及本公开内容的RVV或组合物在制造用于治疗癌症或诱导溶瘤的药物中的用途。本公开内容还提供了在施用病毒的受试者中控制RVV的复制或减少由RVV引起的副作用的方法，包括向受试者施用有效量的2'-脱氧鸟苷类似物，例如更昔洛韦。
附图说明
图1提供了代表性重组牛痘病毒VV91、VV93和VV96的全基因组的示意图。缩写：LITR＝左侧反向末端重复；RITR＝右侧反向末端重复；A–O＝由HindIII消化片段历史上定义的病毒基因区域；PSEL＝合成的早期晚期启动子；mIL2v＝小鼠白细胞介素2变体；*＝编码A34蛋白的位置151的赖氨酸到谷氨酸的取代的突变；PF17＝来自F17R基因的启动子；HSVTK.007＝单纯疱疹病毒胸苷激酶基因，具有编码在位置168的丙氨酸到组氨酸的取代的突变。
图2提供了代表性重组牛痘病毒VV94和IGV121的全基因组的示意图。缩写：LITR＝左侧反向末端重复；RITR＝右侧反向末端重复；A–O＝由HindIII消化片段历史上定义的病毒基因区域；PSEL＝合成的早期晚期启动子；mIL2v＝小鼠白细胞介素2变体；*＝编码A34蛋白的位置151的赖氨酸到谷氨酸的取代的突变；PF17＝来自F17R基因的启动子；HSV TK.007＝单纯疱疹病毒胸苷激酶基因，具有编码在位置168的丙氨酸到组氨酸的取代的突变。
图3提供了重组牛痘病毒VV101、VV102和VV103的全基因组的示意图。缩写：LITR＝左侧反向末端重复；RITR＝右侧反向末端重复；A–O＝由HindIII消化片段历史上定义的病毒基因区域；PSEL＝合成的早期晚期启动子；hIL2v＝人类白细胞介素2变体；*＝编码A34蛋白的位置151的赖氨酸到谷氨酸的取代的突变；PF17＝来自F17R基因的启动子；HSV TK.007＝单纯疱疹病毒胸苷激酶基因，具有编码在位置168的丙氨酸到组氨酸的取代的突变。
图4提供了用重组溶瘤牛痘病毒感染细胞后小鼠IL-2变体(mIL-2v)表达分析的结果。
图5提供了用重组溶瘤牛痘病毒感染细胞后人IL-2变体(hIL-2v)表达分析的结果。
图6提供了用重组溶瘤牛痘病毒感染细胞后HSV TK.007mRNA表达分析的结果。
图7A-7G提供了对SC植入MC38肿瘤细胞的C57BL/6雌性小鼠的病毒疗法诱导的肿瘤生长抑制的评估结果。显示了用单独的媒介物(A)或配备了萤光素酶-2A-GFP报告因子(Cop.Luc-GFP.A34R-K151E；VV16)(B)、仅mIL-2v(Cop.mGM-CSF.A34R-K151E；VV27)(C)、在B16R基因座中处于正向方向的mIL-2v和HSV TK.007(Cop.mIL-2v.A34R-K151E.HSV TK.007(B16R_For)；VV91)(D)、在J2R基因座中处于反向方向的mIL-2v和HSV TK.007(Cop.mIL-2v.A34R-K151E.HSV TK.007(J2R_Rev)；VV93)(E)、或在B16R基因座中处于反向方向的mIL-2v和HSV TK.007(Cop.mIL-2v.A34R-K151E.HSV TK.007(B16R_Rev)；VV96)(F)的含有A34RK151E突变的Copenhagen牛痘病毒治疗的组中的个体小鼠的肿瘤生长轨迹。每个图上的垂直虚线代表小鼠接受媒介物或病毒的瘤内注射的时间点。每个图上的水平虚线代表用作从研究中移除动物的标准的肿瘤体积阈值。每个治疗组的平均肿瘤体积(mm3)±95％置信区间显示到肿瘤植入后第28天(G)，这是每组中所有动物还活着的最后一个肿瘤测量时间点。
图8提供了使用ANCOVA对病毒疗法诱导的肿瘤生长抑制的统计比较的结果。通过ANCOVA分析媒介物/病毒治疗后(肿瘤植入后第14天至第27天)每组中个体小鼠的肿瘤体积，以确定各个治疗组对肿瘤生长的统计学显著抑制作用。列显示特定治疗组对之间比较的统计结果(p值)。粗体值代表比较ANCOVA结果，其中p≤0.05。
图9提供了MC38肿瘤植入的C57BL/6雌性小鼠在植入后第12天用媒介物或病毒治疗后的存活率的代表性研究结果。在达到肿瘤体积≥1400mm3时，每天将小鼠指定为死亡。每组曲线与水平虚线之间的交点表示组的中位(50％)生存期阈值。
图10提供了在瘤内注射媒介物或重组Cop牛痘病毒后24小时和48小时在从携带MC38肿瘤的C57BL/6雌性小鼠收集的血清中检测到的IL-2水平的结果。每个符号代表对于个体小鼠计算的IL-2血清水平，而条形代表组几何平均值(N＝9只/组)。误差线代表95％的置信区间。
图11A-11F提供了对SC植入LLC肿瘤细胞的C57BL/6雌性小鼠的病毒疗法诱导的肿瘤生长抑制的评估结果。显示了用单独的媒介物(A)或配备了萤光素酶-2A-GFP报告因子(Cop.Luc-GFP.A34R-K151E；VV16)(B)、仅mIL-2v(Cop.IL-2v.A34R-K151E；VV27)(C)、在B16R基因座中处于正向方向的mIL-2v和HSV TK.007(Cop.mIL-2v.A34R-K151E.HSV TK.007(B16R_For)；VV91)(D)、在J2R基因座中处于反向方向的mIL-2v和HSV TK.007(Cop.mIL-2v.A34R-K151E.HSV TK.007(J2R_Rev)；VV93)(E)、或在B16R基因座中处于反向方向的mIL-2v和HSV TK.007(Cop.mIL-2v.A34R-K151E.HSV TK.007(B16R_Rev)；VV96)(F)的含有A34RK151E突变的Copenhagen牛痘病毒治疗的组中的个体小鼠的肿瘤生长轨迹。每个图上的垂直虚线代表小鼠接受媒介物或病毒的瘤内注射的时间点。每个图表上的水平虚线表示用作从研究中移除动物的标准的肿瘤体积阈值。
图12提供了在瘤内注射媒介物或重组Cop牛痘病毒后24、48和72小时在从携带LLC肿瘤的C57BL/6雌性小鼠收集的血清中检测到的IL-2水平的结果。每个符号代表对于个体小鼠计算的IL-2血清水平，而条形代表组几何平均值(N＝5只/组)。误差线代表95％的置信区间。
图13A-13F提供了使用单次(第11天)IV病毒递送对SC植入MC38肿瘤细胞的C57BL/6雌性小鼠的病毒疗法诱导的肿瘤生长抑制的评估结果。对于每个治疗，肿瘤生长轨迹显示为组平均值±95％置信区间，直至肿瘤植入后第32天直至处死时间(A)或对于每组中的个体小鼠直至处死时间或研究终止时间(B-F)。测试病毒包括配备了萤光素酶-2A-GFP报告因子(WR.Luc-GFP.A34R-K151E；VV17)(C)、仅mIL-2v(WR.mIL-2v.A34R-K151E；VV79)(D)、在J2R基因座中处于反向方向的mIL-2v和HSV TK.007(WR.mIL-2v.A34R-K151E.HSV TK.007(J2R_Rev)；VV94)(E)和在B15R/B17R基因座中处于正向方向的mIL-2v和HSV TK.007(WR.mIL-2v.A34R-K151E.HSV TK.007(B16R_For)；IGV-121)(F)的含有A34R K151E突变的WR牛痘病毒。每个图表上的垂直虚线代表小鼠接受病毒IV注射的时间点。每个图表上的水平虚线表示用作从研究中移除动物的标准的肿瘤体积阈值。
图14提供了对于皮下MC38肿瘤模型研究使用ANCOVA对病毒疗法诱导的肿瘤生长抑制的统计比较的结果。通过ANCOVA分析治疗后多天每组中个体小鼠的肿瘤体积，以确定各个治疗组对肿瘤生长的统计学显著抑制作用。列显示特定治疗组对之间比较的统计结果(p值)。粗体值表示比较ANCOVA结果，其中观察到p值≤0.05。
图15提供了在SC肿瘤植入后第11天用重组溶瘤牛痘病毒IV治疗后携带MC38肿瘤的C57BL/6雌性小鼠的存活结果。在达到肿瘤体积≥1400mm3时，每天将小鼠指定为死亡。每组曲线与水平虚线之间的交点表示该组的中位(50％)生存期阈值。P值代表选定病毒组之间对数秩检验(Mantel-Cox)比较的统计结果。
图16提供了在用5e7 pfu重组WR牛痘病毒IV注射后72小时(第14天)从携带MC38肿瘤的C57BL/6雌性小鼠收集的血清中检测到的IL-2水平的结果。每个符号代表在个体小鼠中检测到的IL-2血清水平，而条形代表组几何平均值(N＝10只/组)。误差线代表95％的置信区间。
图17A-17D提供了在SC植入LLC肿瘤细胞的C57BL/6雌性小鼠上使用单次(第14天)IV病毒递送评估病毒疗法诱导的肿瘤生长抑制的结果。对于每个治疗，肿瘤生长轨迹显示为组平均值±95％置信区间，直至肿瘤植入后第27天直至处死时间(A)或对于每组中的个体小鼠直至处死时间或研究终止时间(B-D)。测试病毒包括配备了萤光素酶-2A-GFP报告因子(WR.Luc-GFP；VV3)(C)或在B15R/B17R基因座中处于正向方向的mIL-2v和HSV TK.007并具有A34R K151E突变(WR.mIL-2v.A34R-K151E.HSV TK.007(B16R_For)；IGV-121))(D)的WR牛痘病毒。每个图表上的垂直虚线代表小鼠接受病毒IV注射的时间点。每个图表上的水平虚线表示用作从研究中移除动物的标准的肿瘤体积阈值。
图18提供了对于皮下LLC肿瘤模型研究使用ANCOVA对病毒疗法诱导的肿瘤生长抑制的统计比较的结果。通过ANCOVA分析治疗后多天每组中个体小鼠的肿瘤体积，以确定各个治疗组对肿瘤生长的统计学显著抑制作用。列显示特定治疗组对之间比较的统计结果(p值)。粗体值表示比较ANCOVA结果，其中观察到p值≤0.05。
图19提供了在SC肿瘤植入后第11天用重组溶瘤牛痘病毒IV治疗后携带LLC肿瘤的C57BL/6雌性小鼠的存活结果。在达到肿瘤体积≥2000mm3时，每天将小鼠指定为死亡。每组曲线与水平虚线之间的交点表示该组的中位(50％)生存期阈值。P值代表选定病毒组之间对数秩检验(Mantel-Cox)比较的统计结果。
图20A-20I提供了对SC植入MC38肿瘤细胞的C57BL/6雌性小鼠的病毒疗法诱导的肿瘤生长抑制的评估结果。显示了用单独的媒介物(A)、5e7pfu的配备了在B16R基因座中处于正向方向的mIL-2v和HSV TK.007的Copenhagen牛痘病毒(Cop.mIL-2v.A34R-K151E.HSVTK.007(B16R_For)；VV91))(B)、5e7 pfu的配备了在B16R基因座中处于正向方向的hIL-2v和HSV TK.007(Cop.hIL-2v.A34R-K151E.HSV TK.007(B16R_For)；VV102))的Copenhagen牛痘病毒(C)、5e7 pfu的配备了mGM-CSF和LacZ报告因子转基因的Copenhagen牛痘病毒(Cop.mGM-CSF/LacZ；(VV10)(D)、2e8pfu的配备了萤光素酶-2A-GFP报告因子的Copenhagen牛痘病毒(Cop.Luc-GFP；VV7)(E)、2e8 pfu的配备了在B16R基因座中处于正向方向的mIL-2v和HSV TK.007的Copenhagen牛痘病毒(Cop.mIL-2v.A34R-K151E.HSV TK.007(B16R_For)；VV91))(F)、2e8 pfu的配备了在B16R基因座中处于正向方向的hIL-2v和HSV TK.007的Copenhagen牛痘病毒(Cop.hIL-2v.A34R-K151E.HSV TK.007(B16R_For)；VV102))(G)和2e8 pfu的配备了mGM-CSF和LacZ报告因子转基因的Copenhagen牛痘病毒(Cop.mGM-CSF/LacZ；(VV10)(H)治疗的组中的个体小鼠的肿瘤生长轨迹。每个图上的垂直虚线表示小鼠接受媒介物或病毒的瘤内注射的时间点。每个图上的水平虚线表示用作从研究中移除动物的标准的肿瘤体积阈值。每个治疗组的平均肿瘤体积(mm3)显示到肿瘤植入后第28天(I)。
图21提供了使用ANCOVA对病毒疗法诱导的肿瘤生长抑制的统计比较的结果。通过ANCOVA分析媒介物/病毒治疗后(肿瘤植入后第14天至第28天)每组中个体小鼠的肿瘤体积，以确定对各个治疗组对肿瘤生长的统计学显著抑制作用。列显示特定治疗组对之间比较的统计结果(p值)。粗体值代表比较ANCOVA结果，其中p≤0.05。
图22A-22B提供MC38肿瘤植入的C57BL/6雌性小鼠在植入后第11天用媒介物或重组牛痘病毒治疗后的存活结果。在达到肿瘤体积≥1400mm3时，每天将小鼠指定为死亡。每组曲线与水平虚线的交点表示组的中位(50％)生存期阈值。(A)显示了给予5e7 pfu病毒的组。(B)显示了以2e8 pfu给予病毒的组。
图23提供了在瘤内注射媒介物或重组Cop牛痘病毒后24小时在从携带MC38肿瘤的C57BL/6雌性小鼠收集的血清中检测到的小鼠IL-2水平的结果。每个符号代表对于个体小鼠计算的IL-2血清水平，而条形代表组几何平均值(N＝10只/组)。误差线代表95％的置信区间。
图24提供了在瘤内注射媒介物或重组Cop牛痘病毒后24小时在从携带MC38肿瘤的C57BL/6雌性小鼠收集的血清中检测到的人IL-2水平的结果。每个符号代表对于个体小鼠计算的IL-2血清水平，而条形代表组几何平均值(N＝9只/组)。误差线代表95％的置信区间。
图25提供了在瘤内注射媒介物或重组Cop牛痘病毒后，对SC植入HCT-116肿瘤细胞的无胸腺雌性裸鼠的病毒疗法诱导的肿瘤生长抑制的评估结果。每个治疗组的平均肿瘤体积(mm3)显示到肿瘤植入后第40天。每个图上的垂直虚线代表小鼠接受媒介物或病毒的瘤内注射的时间点。每个图表上的水平虚线表示用作从研究中移除动物的标准的肿瘤体积阈值。
具体实施方式
A.定义
术语“异源”是指在天然存在的生物体中未发现的分子(例如，核酸、多肽、蛋白质或基因)。例如，在本公开内容的重组溶瘤牛痘病毒的上下文中，包含编码“异源”胸苷激酶多肽的核苷酸序列的核酸是指在天然存在的牛痘病毒中没有发现的胸苷激酶多肽，例如来自单纯疱疹病毒(HSV)的胸苷激酶多肽。
术语“溶瘤病毒”是指与正常(非癌细胞)细胞相比，优先感染和杀死癌细胞(溶瘤)的病毒。
术语“具有复制能力的”是指能够在特定宿主细胞内感染和复制的病毒。
术语“重组”病毒是指基于野生型或现有病毒(即亲本病毒)，使用重组核酸技术，通过对病毒基因组引入变化或修饰和/或对病毒蛋白引入变化或修饰而构建的病毒。例如，重组病毒可以包含修饰的内源核酸序列、外源核酸序列或两者。重组病毒还可以包括修饰的蛋白质组分。“重组牛痘病毒”是指基于野生型或现有牛痘病毒修饰或构建的重组病毒。
本文可互换使用的术语“多核苷酸”和“核酸”是指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合形式。因此，该术语包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂合体，或包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然、化学或生化修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基的聚合物。
本文可互换使用的术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”是指哺乳动物，包括但不限于：鼠科动物(例如大鼠、小鼠)、兔形动物(例如兔)、非人类灵长类动物、人类、犬科动物、猫科动物、有蹄类动物(例如，马科动物、牛科动物、绵羊科动物、猪科动物、山羊科动物)。
术语“取代”是指将多肽中的一个氨基酸取代为不同的氨基酸。在本公开内容的上下文中，多肽中的取代表示为：原始氨基酸-位置-取代的氨基酸。因此，符号“K151E”表示该变体包含在对应于亲本多肽中位置151的氨基酸的变体氨基酸位置中用谷氨酸(E)取代赖氨酸(K)。
“治疗有效量”或“有效量”是指当施用于受试者以治疗疾病时，足以引起预期效果，例如对疾病的治疗的药剂(例如，本公开内容的有复制能力的重组溶瘤牛痘病毒)的量，或两种药剂(例如，本公开内容的有复制能力的重组溶瘤牛痘病毒和第二治疗剂)的组合的量。“治疗有效量”将取决于药剂、疾病及其严重程度以及待治疗的受试者的年龄、体重等而变化。
术语“治疗”、“医治”等是指获得期望的药理学和/或生理学效果。就完全或部分预防疾病或其症状而言，该效果可以是预防性的，和/或就疾病和/或归因于该疾病的副作用的部分或完全治愈而言，该效果可以是治疗性的。如本文所用，“治疗”涵盖哺乳动物例如人类疾病的任何治疗，并且包括：(a)防止该疾病在可能易患该疾病但尚未诊断为患有该疾病的受试者中发生；(b)抑制疾病，即阻止其发展；和(c)缓解疾病，即导致疾病消退。
术语“变体”多肽是指相对于参考多肽的氨基酸序列含有一个或多个氨基酸突变并保留参考多肽的某些特性的多肽。变体可以通过对参考多肽的氨基酸序列进行修饰而得到，这样的修饰为例如插入、取代或缺失一个或多个氨基酸。因此，术语“变体”多肽包括参考多肽的片段，其包含足够数量的连续氨基酸残基以赋予所需的生物学特性。
在提供数值范围的情况下，应理解，在该范围的上限和下限之间的每个中间值(除非上下文另有明确规定，否则直到下限单位的十分之一)以及该所述范围中的任何其他所述的或中间的值之间包括在本发明中。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且也包括在本发明内，经受所述范围内任何特别排除的界限。在所述范围包括一个或两个界限的情况下，排除那些包括的界限之一或两个的范围也包括在本发明中。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管与本文所述的那些相似或等效的任何方法和材料也可以用于本发明的实践或测试，但是现在描述优选的方法和材料。本文提及的所有出版物均通过引用并入本文，以公开和描述与引用该出版物相关的方法和/或材料。
必须注意，如本文和所附权利要求中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“一种牛痘病毒”包括多种此类牛痘病毒，提及“变体IL-2多肽”包括提及一个或多个/一种或多种变体IL-2多肽及其本领域技术人员已知的等价物等。还应注意，可以起草权利要求以排除任何可选元素。因此，本声明旨在作为在引用权利要求要素或使用“否定”限制时使用“唯一”、“仅”等排他性术语的先行基础。
应当理解，为了清楚起见，在单独实施方案的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方案中组合地提供。相反，为了简洁起见，在单个实施方案的上下文中描述的本发明的各种特征也可以单独提供或以任何合适的子组合提供。属于本发明的实施方案的所有组合都被本发明特别地包含并且在本文中被公开，就好像每个组合被单独地和明确地公开一样。此外，各种实施方案及其元素的所有子组合也被本发明特别包含并在本文中公开，就好像每个这样的子组合在本文中单独且明确地公开一样。
本文所讨论的出版物仅为了它们在本申请的提交日期之前的公开内容而提供。本文中的任何内容都不应被解释为承认本发明无权因在先发明而早于此类出版物。此外，所提供的公开日期可能与可能需要独立确认的实际公开日期不同。
B.重组溶瘤牛痘病毒
在第一方面，本公开内容提供了一种具有复制能力的重组溶瘤牛痘病毒，其病毒基因组或病毒蛋白相对于相应的野生型或现有病毒(即亲本病毒)具有修饰，其中修饰包含：(i)编码免疫刺激性细胞因子多肽的插入核苷酸序列；(ii)编码异源胸苷激酶多肽的插入核苷酸序列。为方便起见，本发明提供的具有复制能力的重组溶瘤牛痘病毒可称为“重组牛痘病毒”或“RVV”。在一些实施方案中，RVV还包含对病毒的天然基因组、蛋白质或其他组分的一种或多种修饰或突变，其增加或增强病毒的一种或多种期望的抗肿瘤特性，例如增加的肿瘤选择性，增加的溶瘤特性，细胞外包膜病毒(EEV)的增加的产生，或降低的毒性。在本公开内容提供的RVV中发现的插入和其他修饰的示例在下文中详细描述。
B-1.免疫刺激性细胞因子多肽
如上所述，本发明提供的RVV包含编码免疫刺激性细胞因子多肽的插入核苷酸序列。术语“免疫刺激性细胞因子”是指能够在IL-2受体存在下刺激细胞毒性T细胞扩增、增强对肿瘤的先天性或过继性免疫、或以其他方式增强溶瘤病毒的抗癌活性的细胞因子。免疫刺激性细胞因子的例子包括白细胞介素(IL)-2(IL-2；也称为T细胞生长因子)、IL-6、IL-12、IL-15、IL-18(也称为IFN-γ诱导因子)、IL24和GM-CFF。
在一些实施方案中，RVV包含编码野生型IL-2多肽或其变体的核苷酸序列。野生型IL-2多肽的变体在本文中也可称为“IL-2v多肽”。在一个实施方案中，RVV包含编码IL-2v多肽的核苷酸序列，当该多肽在被施用重组VV的受试者中表达时，其具有降低的毒性，降低的与受体CD25(高亲和力IL-2受体α(alpha)亚基)的结合，降低的免疫抑制性T调节细胞(T-reg细胞)的刺激，或以其他方式降低的免疫抑制活性。在一个具体实施方案中，IL-2v多肽包含与野生型IL-2相比提供降低的与CD25结合的氨基酸取代。IL-2v多肽编码核苷酸序列存在于RVV的基因组中，并且可被称为“转基因”。编码IL-2v多肽的核苷酸序列通常不存在于野生型牛痘病毒中，因此对野生型牛痘病毒是异源的。因此，编码IL-2v多肽的核苷酸序列可以被称为编码IL-2v多肽的“异源核苷酸序列”或“插入的核苷酸序列”。包含转基因的病毒被称为“配备”有该转基因。因此，包含编码IL-2v多肽的核苷酸序列的本公开内容的RVV可以被称为“配备”有编码IL-2v的核苷酸序列。
在一些实施方案中，IL-2多肽是人IL-2多肽或其变体。在一些其他实施方案中，IL-2多肽是小鼠IL-2多肽或其变体。野生型人IL-2(hIL-2)多肽的成熟形式的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。野生型hIL-2多肽的前体形式的氨基酸序列在SEQ ID NO：21中列出。野生型hIL-2多肽的前体形式包含信号肽(例如，MYRMQLLSCIALSLALVTNS(SEQ ID NO：22))。野生型小鼠IL-2(mIL-2)多肽的成熟形式的氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示。小鼠野生型IL-2多肽的前体形式的氨基酸序列在SEQ ID NO：24中列出。
在一些情况下，与野生型IL-2相比，由本公开内容的RVV编码的IL-2v多肽提供降低的不良生物活性。在一些情况下，通过测量与野生型IL-2相比在CD25+CD4+Treg细胞中诱导增加的pSTAT5水平的效力来确定所述降低的不良生物活性。在一些情况下，与野生型IL-2相比，IL-2v多肽在诱导CD25+CD4+Treg细胞中增加的pSTAT5水平时提供降低的浓度效力。在一些情况下，与野生型IL-2相比，IL-2v多肽在诱导CD25+CD4+Treg细胞中增加的pSTAT5水平时提供至少1、至少2或至少3个对数的降低的浓度效力。在一些情况下，与野生型IL-2相比，IL-2v多肽在诱导CD25+CD4+Treg细胞中增加的pSTAT5水平时提供约1、约2或约3个对数的降低的浓度效力。在一些情况下，所述降低的不良生物活性通过测量与野生型IL-2相比，用由RVV编码的IL-2v多肽处理后的促炎细胞因子水平来确定，如实施例9中所公开的。在一些情况下，与野生型IL-2相比(例如使用实施例9中公开的测试)，IL-2v多肽提供降低的促炎细胞因子水平。在一些情况下，IL-2v多肽提供与野生型IL-2相比降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％的促炎细胞因子水平。
在一些情况下，IL-2v多肽包含基于SEQ ID NO：1中描绘的IL-2氨基酸序列的氨基酸编号的F42、Y45和L72中的一个或多个的取代。在一些情况下，IL-2v多肽包含基于SEQ IDNO：1中描绘的IL-2氨基酸序列的氨基酸编号的F42和Y45中的一个或多个的取代。在一些情况下，IL-2v多肽包含基于SEQ ID NO：1中描绘的IL-2氨基酸序列的氨基酸编号的F42和L72中的一个或多个的取代。在一些情况下，IL-2v多肽包含基于SEQ ID NO：1中描绘的IL-2氨基酸序列的氨基酸编号的Y45和L72中的一个或多个的取代。在一些情况下，IL-2v多肽包含基于SEQ ID NO：1中描述的IL-2氨基酸序列的氨基酸编号的F42L、F42A、F42G、F42S、F42T、F42Q、F42E、F42D、F42R或F42K取代。在一些情况下，IL-2v多肽包含基于SEQ ID NO：1中描述的IL-2氨基酸序列的氨基酸编号的Y45A、Y45G、Y45S、Y45T、Y45Q、Y45E、Y45N、Y45D、Y45R或Y45K取代。在一些情况下，IL-2v多肽包含基于SEQ ID NO：1中描述的IL-2氨基酸序列的氨基酸编号的L72G、L72A、L72S、L72T、L72Q、L72E、L72N、L72R或L72K取代。
在一些情况下，本公开内容的RVV包含编码IL-2v多肽的核苷酸序列，该多肽包含信号肽(例如，MYRMQLLSCIALSLALVTNS(SEQ ID NO：22)。因此，例如，在一些情况下，本公开内容的具有复制能力的重组溶瘤牛痘病毒包含编码IL-2v多肽的核苷酸序列，所述IL-2v多肽与SEQ ID NO：21中描述的IL-2氨基酸序列具有至少95％(例如至少95％、至少98％、至少99％或100％)的氨基酸序列同一性，并且包含基于SEQ ID NO：21中描述的氨基酸序列的氨基酸编号的IL-2的F62、Y65和L92中的一个或多个的取代。如将理解的，SEQ ID NO：21中描述的IL-2氨基酸序列的F62、Y65和L92对应于SEQ ID NO：1中描述的氨基酸序列的F42、Y45和L72。
在一些情况下，由本发明的RVV编码的IL-2v多肽包含以下一项或多项：基于SEQID NO：1中描述的IL-2氨基酸序列的氨基酸编号的a)F42L、F42A、F42G、F42S、F42T、F42Q、F42E、F42D、F42R或F42K取代；b)Y45A、Y45G、Y45S、Y45T、Y45Q、Y45E、Y45N、Y45D、Y45R或Y45K取代；和c)L72G、L72A、L72S、L72T、L72Q、L72E、L72N、L72R或L72K取代。在一些情况下，IL-2v多肽包含：基于在SEQ ID NO：1中描述的IL-2氨基酸序列的氨基酸编号的a)F42L、F42A、F42G、F42S、F42T、F42Q、F42E、F42D、F42R或F42K取代；和b)Y45A、Y45G、Y45S、Y45T、Y45Q、Y45E、Y45N、Y45D、Y45R或Y45K取代。在一些情况下，IL-2v多肽包含：基于SEQ ID NO：1所示IL-2氨基酸序列的氨基酸编号的a)F42L、F42A、F42G、F42S、F42T、F42Q、F42E、F42D、F42R或F42K取代；和b)L72G、L72A、L72S、L72T、L72Q、L72E、L72N、L72R或L72K取代。在一些情况下，IL-2v多肽包含：基于SEQ ID NO：1所示IL-2氨基酸序列的氨基酸编号的a)Y45A、Y45G、Y45S、Y45T、Y45Q、Y45E、Y45N、Y45D、Y45R或Y45K取代；和b)L72G、L72A、L72S、L72T、L72Q、L72E、L72N、L72R或L72K取代。在一些情况下，IL-2v多肽包含：基于SEQ ID NO：1中描述的IL-2氨基酸序列的氨基酸编号的a)F42L、F42A、F42G、F42S、F42T、F42Q、F42E、F42D、F42R或F42K取代；b)Y45A、Y45G、Y45S、Y45T、Y45Q、Y45E、Y45N、Y45D、Y45R或Y45K取代；和c)L72G、L72A、L72S、L72T、L72Q、L72E、L72N、L72R或L72K取代。
在一些情况下，IL-2v多肽的氨基酸序列包含：(1)F42A、Y45A和L72G的一个或多个取代；(2)F42A和Y45A的一个或两个取代；(3)F42A和L72G的取代；(4)Y45A和L72G的取代；或(5)F42A、Y45A和L72G的取代，其中IL-2v多肽的氨基酸编号基于SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
在一些情况下，由本公开内容的RVV编码的IL-2v多肽包含与SEQ ID NO：1中描述的氨基酸序列具有至少95％(例如，至少95％、至少98％、至少99％或100％)氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且包含选自由以下组成的组的氨基酸取代：
(1)F42A取代；
(2)Y45A取代；
(3)L72G取代；
(4)F42A取代和L72G取代；
(5)F42A取代和Y45A取代；
(6)Y45A取代和L72G取代；和
(7)F42A取代、Y45A取代和L72G取代，
其中IL-2v多肽的氨基酸编号基于SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
在一些情况下，由本公开内容的具有复制能力的RVV编码的IL-2v多肽不包括T3和/或C125的取代。换言之，在一些情况下，基于SEQ ID NO：1中描绘的IL-2氨基酸序列的氨基酸编号，IL-2v多肽在氨基酸位置3包含Thr，在氨基酸位置125包含Cys。
IL-2v多肽的合适氨基酸序列包括例如小鼠IL-2v多肽，其包含与以下氨基酸序列具有至少95％(例如，至少95％、至少98％、至少99％或100％)氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
MYSMQLASCVTLTLVLLVNSAPTSSSTSSSTAEAQQQQQQQQQQQQHLEQLLMDLQELLSRMENYRNLKLPRMLTAKFALPKQATELKDLQCLEDELGPLRHVLDGTQSKSFQLEDAENFISNIRVTVVKLKGSDNTFECQFDDESATVVDFLRRWIAFCQSIISTSPQ(SEQ ID NO：3)，并且包含F76A、Y79A和L106G取代(即包含Ala-76、Ala-79和Gly-106)。
合适的编码IL-2v多肽的核苷酸序列包括例如编码小鼠IL-2v多肽并与以下核苷酸序列具有至少95％(例如至少95％、至少98％、至少99％或100％)核苷酸序列同一性：
ATGTACAGCATGCAGCTGGCCAGCTGCGTGACACTGACCCTCGTGCTGCTGGTGAACAGCGCTCCTACCTCCTCCAGCACCAGCAGCAGCACCGCTGAGGCCCAGCAGCAGCAGCAGCAACAGCAACAGCAGCAACAACATTTAGAACAGCTGCTGATGGATTTACAAGAACTGCTGTCTCGTATGGAGAACTATCGTAATTTAAAGCTGCCTCGTATGCTGACCGCCAAGTTCGCTTTACCCAAGCAAGCTACAGAGCTGAAGGATTTACAGTGTTTAGAGGACGAGCTGGGCCCTCTGAGGCATGTGCTGGACGGCACCCAGAGCAAGAGCTTCCAGCTGGAGGACGCCGAGAACTTTATCAGCAACATTCGTGTGACCGTGGTGAAGCTGAAGGGCAGCGACAACACCTTCGAGTGCCAGTTCGACGACGAGAGCGCCACAGTGGTGGACTTTTTAAGAAGGTGGATCGCCTTCTGCCAGTCCATCATCAGCACCAGCCCCCAG(SEQ ID NO：2)，其中编码的IL-2v多肽包含F76A、Y79A和L106G取代(即包含Ala-76、Ala-79和Gly-106)。该序列针对在小鼠中的表达进行了密码子优化。
在一些情况下，编码小鼠IL-2v多肽的核苷酸序列是针对牛痘病毒进行密码子优化的。以下是针对牛痘病毒密码子优化的编码小鼠IL-2v多肽的核苷酸序列的非限制性实例：
ATGTACTCGATGCAGTTAGCTTCCTGCGTGACCCTAACCTTAGTCTTGCTAGTGAATTCGGCGCCCACCTCATCCTCAACGTCATCTTCCACAGCGGAGGCTCAACAGCAGCAGCAACAGCAGCAACAACAACAGCAGCATTTGGAACAATTGCTAATGGACTTACAGGAACTACTATCAAGAATGGAGAATTATCGAAACCTAAAGTTACCTCGAATGTTGACAGCAAAATTTGCGTTGCCAAAGCAGGCCACAGAGCTAAAGGACCTACAGTGTCTTGAAGATGAGCTAGGACCACTTCGTCACGTTTTAGACGGAACACAGTCCAAGTCTTTTCAGTTGGAAGACGCCGAGAACTTTATATCTAACATACGTGTTACTGTCGTAAAACTTAAAGGATCGGACAATACTTTCGAATGCCAATTCGATGATGAAAGTGCAACCGTCGTGGACTTCTTGCGACGTTGGATCGCCTTCTGTCAAAGTATAATTTCCACTTCGCCACAG(SEQ ID NO：19)。
IL-2v多肽的合适氨基酸序列包括例如人IL-2v多肽，其包含与以下氨基酸序列具有至少95％(例如，至少95％、至少98％、至少99％或100％)氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFAMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNGAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(SEQ ID NO：14)，并且包含F62A、Y65A和L92G取代(即，包含Ala-62、Ala-65和Gly-92)。
合适的编码IL-2v多肽的核苷酸序列包括例如编码人IL-2v多肽并与以下核苷酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的核苷酸序列同一性的核苷酸序列：
ATGTATCGTATGCAGCTGCTGAGCTGCATCGCTTTATCTTTAGCTTTAGTGACCAACAGCGCCCCTACCAGCTCCTCCACCAAGAAGACCCAGCTGCAGCTGGAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTAAACGGCATCAACAACTACAAGAACCCCAAGCTGACTCGTATGCTGACCGCCAAGTTCGCTATGCCCAAGAAGGCCACCGAGCTGAAGCACCTCCAGTGTTTAGAGGAGGAGCTGAAGCCTTTAGAGGAGGTGCTGAATGGAGCCCAGAGCAAGAATTTCCATTTAAGGCCTCGTGATTTAATCAGCAACATCAACGTGATCGTGCTGGAGCTGAAAGGCTCCGAGACCACCTTCATGTGCGAGTACGCCGACGAGACCGCCACCATCGTGGAGTTTTTAAATCGTTGGATCACCTTCTGCCAGAGCATCATCAGCACTTTAACC(SEQ ID NO：12)，其中编码的IL-2v多肽包含F62A、Y65A和L92G取代(即包含Ala-62、Ala-65和Gly-92)。在某些情况下，核苷酸序列是人类密码子优化的。SEQ ID NO：12是人类密码子优化的IL-2v编码核苷酸序列的一个例子。
合适的编码IL-2v多肽的核苷酸序列包括例如编码人IL-2v多肽并与以下核苷酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的核苷酸序列同一性的核苷酸序列：
ATGTATCGAATGCAATTACTTTCCTGTATCGCACTTTCATTAGCCCTTGTGACCAACTCAGCGCCAACATCAAGTTCGACCAAGAAGACGCAGTTGCAGCTAGAGCATTTGCTTTTGGATCTTCAAATGATCCTTAATGGTATAAATAATTATAAGAACCCCAAATTGACGCGAATGCTAACAGCTAAATTCGCAATGCCAAAGAAGGCAACCGAGTTAAAGCACCTACAATGCTTGGAAGAAGAACTAAAACCCCTTGAGGAGGTATTAAATGGTGCTCAGTCGAAGAATTTTCATCTTCGACCTCGAGACCTAATTTCAAATATTAACGTAATTGTTTTGGAATTAAAGGGTTCGGAAACTACTTTTATGTGTGAGTACGCAGACGAGACAGCTACAATAGTGGAGTTTCTTAACCGTTGGATAACCTTTTGTCAATCAATCATTTCGACTTTGACC(SEQ ID NO：13)，其中编码的IL-2v多肽包含F62A、Y65A和L92G取代(即包含Ala-62、Ala-65和Gly-92)。在某些情况下，核苷酸序列针对牛痘病毒进行了密码子优化。SEQ ID NO：13是牛痘病毒密码子优化的IL-2v编码核苷酸序列的一个例子。
IL-2v多肽的合适氨基酸序列包括例如人IL-2v多肽，其包含与以下氨基酸序列具有至少95％(例如，至少95％、至少98％、至少99％或100％)氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFA MPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNGAQSKNFHLRPRDLISNINVIV LELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(SEQ IDNO：9)，并且包含F42A、Y45A和L72G取代(即，包含Ala-42、Ala-45和Gly-72)。
合适的编码IL-2v多肽的核苷酸序列包括例如编码人IL-2v多肽并与以下核苷酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的核苷酸序列同一性的核苷酸序列：
GCCCCTACCAGCTCCTCCACCAAGAAGACCCAGCTGCAGCTGGAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTAAACGGCATCAACAACTACAAGAACCCCAAGCTGACTCGTATGCTGACCGCCAAGTTCGCTATGCCCAAGAAGGCCACCGAGCTGAAGCACCTCCAGTGTTTAGAGGAGGAGCTGAAGCCTTTAGAGGAGGTGCTGAATGGAGCCCAGAGCAAGAATTTCCATTTAAGGCCTCGTGATTTAATCAGCAACATCAACGTGATCGTGCTGGAGCTGAAAGGCTCCGAGACCACCTTCATGTGCGAGTACGCCGACGAGACCGCCACCATCGTGGAGTTTTTAAATCGTTGGATCACCTTCTGCCAGAGCATCATCAGCACTTTAACC(SEQ ID NO：10)，其中编码的IL-2v多肽包含F42A、Y45A和L72G取代(即包含Ala-42、Ala-45和Gly-72)。
在某些情况下，核苷酸序列是人类密码子优化的。SEQ ID NO：10是人类密码子优化的IL-2v编码核苷酸序列的一个例子。
合适的编码IL-2v多肽的核苷酸序列包括例如编码人IL-2v多肽并与以下核苷酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的核苷酸序列同一性的核苷酸序列：
GCGCCAACATCAAGTTCGACCAAGAAGACGCAGTTGCAGCTAGAGCATTTGCTTTTGGATCTTCAAATGATCCTTAATGGTATAAATAATTATAAGAACCCCAAATTGACGCGAATGCTAACAGCTAAATTCGCAATGCCAAAGAAGGCAACCGAGTTAAAGCACCTACAATGCTTGGAAGAAGAACTAAAACCCCTTGAGGAGGTATTAAATGGTGCTCAGTCGAAGAATTTTCATCTTCGACCTCGAGACCTAATTTCAAATATTAACGTAATTGTTTTGGAATTAAAGGGTTCGGAAACTACTTTTATGTGTGAGTACGCAGACGAGACAGCTACAATAGTGGAGTTTCTTAACCGTTGGATAACCTTTTGTCAATCAATCATTTCGACTTTGACC(SEQ ID NO：11)，其中编码的IL-2v多肽包含F42A、Y45A、和L72G取代(即包含Ala-42、Ala-45和Gly-72)。
在某些情况下，核苷酸序列针对牛痘病毒进行了密码子优化。SEQ ID NO：11是牛痘病毒密码子优化的IL-2v编码核苷酸序列的一个例子。
在一些情况下，本公开内容的具有复制能力的重组溶瘤牛痘病毒包含编码IL-2v多肽的同源重组供体片段，其中所述同源重组供体片段包含与SEQ ID NO：4(VV27/VV38同源重组供体片段)、SEQ ID NO：5(VV39同源重组供体片段)、SEQ ID NO：15(含有hIL-2v的VV75同源重组供体片段(人密码子优化的))、SEQ ID NO：16(含有hIL-2v的Copenhagen J2R同源重组质粒(人密码子优化的))、SEQ ID NO：17(含有hIL-2v的同源重组供体片段(牛痘病毒密码子优化))、SEQ ID NO：18(含有hIL-2v的Copenhagen J2R同源重组质粒(牛痘病毒密码子优化的))和SEQ ID NO：20(小鼠IL-2变体(牛痘病毒密码子优化的)同源重组供体片段)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％核苷酸序列同一性的核苷酸序列。
在一些情况下，本公开内容的具有复制能力的重组溶瘤牛痘病毒包含与SEQ IDNO：6所示的核苷酸序列(Copenhagen J2R同源重组质粒)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％核苷酸序列同一性的核苷酸序列；并且包含含有编码IL-2v多肽的核苷酸序列的核酸。
在一些情况下，本公开内容的具有复制能力的重组溶瘤牛痘病毒包含与SEQ IDNO：7所示的核苷酸序列(含有小鼠IL-2变体(mIL-2v)多肽的Copenhagen J2R同源重组质粒)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的核苷酸序列同一性的核苷酸序列。在一些情况下，具有复制能力的重组溶瘤牛痘病毒包含人IL-2变体(hIL-2v)多肽代替mIL-2v多肽，如上所述。
在一些情况下，本公开内容的具有复制能力的重组溶瘤牛痘病毒包含与SEQ IDNO：8所示的核苷酸序列(含有mIL-2v的Western Reserve J2R同源重组质粒)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的核苷酸序列同一性的核苷酸序列。在一些情况下，具有复制能力的重组溶瘤牛痘病毒包含人IL-2变体(hIL-2v)多肽代替mIL-2v多肽，如上所述。
在一些情况下，本公开内容的具有复制能力的重组溶瘤牛痘病毒是VV27(含有A34R-K151E和mIL-2v转基因的Copenhagen牛痘病毒)。在一些情况下，具有复制能力的重组溶瘤牛痘病毒包含人IL-2变体(hIL-2v)多肽代替mIL-2v多肽，如上所述。
在一些情况下，本公开内容的具有复制能力的重组溶瘤牛痘病毒是VV38(含有mIL-2v转基因的Copenhagen牛痘)。在一些情况下，具有复制能力的重组溶瘤牛痘病毒包含人IL-2变体(hIL-2v)多肽代替mIL-2v多肽，如上所述。
在一些情况下，本公开内容的具有复制能力的重组溶瘤牛痘病毒是VV39(含有mIL-2v转基因的Western Reserve牛痘)。在一些情况下，具有复制能力的重组溶瘤牛痘病毒包含人IL-2变体(hIL-2v)多肽代替mIL-2v多肽，如上所述。
B-2.异源胸苷激酶多肽
如上所述，本公开内容提供的具有复制能力的RVV包含编码异源胸苷激酶(TK)多肽的插入核苷酸序列。在一些实施方案中，异源TK多肽是人野生型单纯疱疹病毒(HSV)TK多肽。人野生型HSV-TK多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：25所示。在一些其他实施方案中，异源TK多肽是野生型HSV-TK多肽的变体。野生型HSV-TK的变体在本文中称为“HSV-TKv多肽”、“TKv多肽”或简称为“TKv”。TKv多肽在一些情况下是I型TK多肽，即可以分别催化脱氧鸟苷(dG)磷酸化以产生dG单磷酸的TK多肽。
在野生型牛痘病毒中，J2R区编码牛痘病毒TK。在一些情况下，编码异源TK多肽的核苷酸序列插入牛痘病毒J2R基因的位置。在一些其他实施方案中，编码异源TK多肽的核苷酸序列取代了全部或部分牛痘病毒TK编码核苷酸序列。例如，在一些情况下，异源TK多肽编码核苷酸序列取代至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％，至少75％或100％的牛痘病毒J2R区域。在一些情况下，本公开内容的具有复制能力的重组溶瘤牛痘病毒包含修饰，使得内源(牛痘病毒编码的)TK-编码基因的转录被减少或消除。例如，在一些情况下，内源(牛痘病毒编码的)TK编码基因的转录与未经修饰的内源(牛痘病毒编码的)TK编码基因的转录相比减少至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或超过90％。
在一些情况下，以比编码野生型HSV-TK多肽的具有复制能力的RVV的复制受抑制的浓度更低的浓度用更昔洛韦抑制具有复制能力的RVV的复制。例如，编码野生型HSV-TK的变体的本公开内容的具有复制能力的RVV的复制被抑制最大值的50％(IC50)的更昔洛韦抑制浓度比编码野生型HSV-TK多肽的具有复制能力的RVV的复制的抑制的更昔洛韦IC50低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％或至少80％。
在一些实施方案中，由本公开内容的具有复制能力的RVV中存在的核苷酸序列编码的异源TK多肽是野生型HSV-TK的变体，其中TKv多肽相对于野生型HSV-TK(SEQ ID NO：25)包含一个或多个氨基酸取代。因此，例如，由存在于本公开内容的具有复制能力的重组溶瘤牛痘病毒中的核苷酸序列编码的TKv多肽相对于野生型HSV-TK包含1至40个氨基酸取代。例如，由存在于本公开内容的具有复制能力的重组溶瘤牛痘病毒中的核苷酸序列编码的TKv多肽相对于野生型HSV-TK(SEQ ID NO：25)包含1至5、5至10、10至15、15至20、20至25、25至30、30至35或35至40个氨基酸取代。
在一些实施方案中，本公开内容的RVV中存在的异源TK多肽包含与以下野生型HSV-TK氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
MASYPGHQHASAFDQAARSRGHSNRRTALRPRRQQEATEVRPEQKMPTLLRVYIDGPHGMGKTTTTQLLVALGSRDDIVYVPEPMTYWRVLGASETIANIYTTQHRLDQGEISAGDAAVVMTSAQITMGMPYAVTDAVLAPHIGGEAGSSHAPPPALTLIFDRHPIAALLCYPAARYLMGSMTPQAVLAFVALIPPTLPGTNIVLGALPEDRHIDRLAKRQRPGERLDLAMLAAIRRVYGLLANTVRYLQGGGSWREDWGQLSGTAVPPQGAEPQSNAGPRPHIGDTLFTLFRAPELLAPNGDLYNVFAWALDVLAKRLRPMHVFILDYDQSPAGCRDALLQLTSGMIQTHVTTPGSIPTICDLARTFAREMGEAN(SEQ ID NO:25)，其中TKv多肽相对于SEQ ID NO:25包含一个或多个氨基酸取代。
在一些情况下，异源TK多肽相对于野生型HSV-TK氨基酸序列(如上所示；SEQ IDNO：25)包含一个或多个氨基酸取代。例如，在一些情况下，异源TK多肽包含L159、I160、F161、A168和L169中的一个或多个的取代。
在一些情况下，异源TK多肽包含与上述野生型HSV-TK氨基酸序列(SEQ ID NO：25)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，但在L159处具有取代，即氨基酸159不是Leu。例如，氨基酸159是Gly、Ala、Val、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Met、Gln、Asn、Lys、Arg、His、Asp或Glu。在某些情况下，取代是L159I取代。在某些情况下，取代是L159A取代。在某些情况下，取代是L159V取代。
在一些情况下，异源TK多肽包含与上述野生型HSV-TK氨基酸序列(SEQ ID NO：25)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，但在I160处具有取代，即氨基酸160不是Ile。例如，氨基酸160是Gly、Ala、Val、Leu、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Met、Gln、Asn、Lys、Arg、His、Asp或Glu。在某些情况下，取代是I160L取代。在某些情况下，取代是I160V取代。在某些情况下，取代是I160A取代。在某些情况下，取代是I160F取代。在某些情况下，取代是I160Y取代。在某些情况下，取代是I160W取代。
在一些情况下，异源TK多肽包含与上述野生型HSV-TK氨基酸序列(SEQ ID NO：25)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，但在F161处具有取代，即氨基酸161不是Phe。例如，氨基酸161是Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Met、Gln、Asn、Lys、Arg、His、Asp或Glu。在某些情况下，取代是F161A取代。在某些情况下，取代是F161L取代。在某些情况下，取代是F161V取代。在某些情况下，取代是F161I取代。
在一些情况下，异源TK多肽包含与上述野生型HSV-TK氨基酸序列(SEQ ID NO：25)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，但在A168处具有取代，即氨基酸168不是Ala。例如，氨基酸168是Gly、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Met、Gln、Asn、Lys、Arg、His、Asp或Glu。在某些情况下，取代是A168H。在某些情况下，取代是A168R。在某些情况下，取代是A168K。在某些情况下，取代是A168Y。在某些情况下，取代是A168F。在某些情况下，取代是A168W。在一些情况下，TKv多肽不包括除A168取代之外的任何其他取代。
在一些情况下，异源TK多肽包含与上述野生型HSV-TK氨基酸序列(SEQ ID NO：25)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，但在L169处具有取代，即氨基酸169不是Leu。例如，氨基酸169是Gly、Ala、Val、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Met、Gln、Asn、Lys、Arg、His、Asp或Glu。在某些情况下，取代是L169F。在某些情况下，取代是L169M。在某些情况下，取代为L169Y。在某些情况下，取代是L169W。
在一些情况下，异源TK多肽包含与上述野生型HSV-TK氨基酸序列(SEQ ID NO：25)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中：i)氨基酸159不是Leu；ii)氨基酸160不是Ile；iii)氨基酸161不是Phe；iv)氨基酸168不是Ala；v)氨基酸169不是Leu。在一些情况下，异源TK多肽包含与以下氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
MASYPGHQHASAFDQAARSRGHSNRRTALRPRRQQEATEVRPEQKMPTLLRVYIDGPHGMGKTTTTQLLVALGSRDDIVYVPEPMTYWRVLGASETIANIYTTQHRLDQGEISAGDAAVVMTSAQITMGMPYAVTDAVLAPHIGGEAGSSHVPPPALTILADRHPIAYFLCYPAARYLMGSMTPQAVLAFVALIPPTLPGTNIVLGALPEDRHIDRLAKRQRPGERLDLAMLAAIRRVYGLLANTVRYLQGGGSWREDWGQLSGTAVPPQGAEPQSNAGPRPHIGDTLFTLFRAPELLAPNGDLYNVFAWALDVLAKRLRPMHVFILDYDQSPAGCRDALLQLTSGMIQTHVTTPGSIPTICDLARTFAREMGEAN(“dm30”；SEQ ID NO:26)，
其中氨基酸159是Ile，氨基酸160是Leu，氨基酸161是Ala，氨基酸168是Tyr，氨基酸169是Phe。
在一些情况下，异源TK多肽包含与上述野生型HSV-TK氨基酸序列(SEQ ID NO：25)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中：i)氨基酸159不是Leu；ii)氨基酸160不是Ile；iii)氨基酸161不是Phe；iv)氨基酸168不是Ala；v)氨基酸169不是Leu。在一些情况下，异源TK多肽包含与以下氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
MASYPGHQHASAFDQAARSRGHSNRRTALRPRRQQEATEVRPEQKMPTLLRVYIDGPHGMGKTTTTQLLVALGSRDDIVYVPEPMTYWRVLGASETIANIYTTQHRLDQGEISAGDAAVVMTSAQITMGMPYAVTDAVLAPHIGGEAGSSHAPPPALTIFLDRHPIAFMLCYPAARYLMGSMTPQAVLAFVALIPPTLPGTNIVLGALPEDRHIDRLAKRQRPGERLDLAMLAAIRRVYGLLANTVRYLQGGGSWREDWGQLSGTAVPPQGAEPQSNAGPRPHIGDTLFTLFRAPELLAPNGDLYNVFAWALDVLAKRLRPMHVFILDYDQSPAGCRDALLQLTSGMIQTHVTTPGSIPTICDLARTFAREMGEAN(“SR39”；SEQ ID NO:27)，其中氨基酸159是Ile，氨基酸160是Phe，氨基酸161是Leu，氨基酸168是Phe，和氨基酸169是Met。
在一些情况下，异源TK多肽包含与上述野生型HSV-TK氨基酸序列(SEQ ID NO：25)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中氨基酸168不是Ala，例如，其中氨基酸168是Gly、Val、Ile、Leu、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Met、Gln、Asn、Lys、Arg、His、Asp或Glu。在某些情况下，氨基酸168是His。在某些情况下，氨基酸168是Arg。在某些情况下，氨基酸168是Lys。在一些情况下，异源TK多肽包含与以下氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
MASYPGHQHASAFDQAARSRGHSNRRTALRPRRQQEATEVRPEQKMPTLLRVYIDGPHGMGKTTTTQLLVALGSRDDIVYVPEPMTYWRVLGASETIANIYTTQHRLDQGEISAGDAAVVMTSAQITMGMPYAVTDAVLAPHIGGEAGSSHAPPPALTLIFDRHPIAHLLCYPAARYLMGSMTPQAVLAFVALIPPTLPGTNIVLGALPEDRHIDRLAKRQRPGERLDLAMLAAIRRVYGLLANTVRYLQGGGSWREDWGQLSGTAVPPQGAEPQSNAGPRPHIGDTLFTLFRAPELLAPNGDLYNVFAWALDVLAKRLRPMHVFILDYDQSPAGCRDALLQLTSGMIQTHVTTPGSIPTICDLARTFAREMGEAN(“TK.007”；SEQ ID NO:28)，其中氨基酸168是His。
其中氨基酸168是His的SEQ ID NO：28的异源TK多肽在本公开内容中也被称为“TK.007”或HSV-TK.007。
B-3.其他修饰
除了编码免疫刺激性细胞因子的插入核苷酸序列和编码异源TK的插入核苷酸序列之外，本发明提供的RVV可以包含病毒基因组或病毒蛋白中的相对于亲本病毒的进一步修饰，以进一步改善重组溶瘤牛痘病毒的性质，例如增加或增强其作为溶瘤病毒所需特性的修饰，例如使特定蛋白质功能缺陷、抑制或增强特定基因或蛋白质的表达或表达外源性蛋白质的修饰。
在一些实施方案中，本公开内容提供的RVV进一步包含增加溶瘤牛痘病毒的肿瘤选择性的一种或多种修饰。如本文所用，“肿瘤选择性”是指对肿瘤细胞的毒性(例如，溶瘤)高于对正常细胞(例如，非肿瘤细胞)的毒性。此类修饰的例子包括：(1)使病毒缺乏牛痘生长因子(VGF)功能的修饰(McCart等人(2001)Cancer Research 61:8751)；(2)对牛痘病毒TK基因的修饰以使病毒TK缺陷，或对血凝素(HA)基因或F3基因或打断的F3基因座的修饰(WO2005/047458)；(3)使牛痘病毒的VGF和O1L功能缺陷的修饰(WO2015/076422)；(4)将在癌细胞中表达降低的微小RNA插入B5R基因的3'非编码区(WO2011/125469)；(5)使牛痘病毒以下功能缺陷的修饰：B18R(Kirn等人(2007)PLoS Medicine 4:e353)、核糖核苷酸还原酶(Gammon等人(2010)PLoS Pathogens 6:e1000984)、丝氨酸蛋白酶抑制剂(例如，SPI-1、SPI-2)(Guo等人(2005)Cancer Research 65:9991)、SPI-1和SPI-2(Yang等人(2007)GeneTherapy 14:638)、核糖核苷酸还原酶基因F4L或I4L(Child等人(1990)Virology 174:625；Potts等人(2017)EMBO Mol.Med.9:638)、B18R(Copenhagen株中的B19R)(Spriggs等人(1992)Cell71:145)、A48R(Hughes等人(1991)J.Biol.Chem.266:20103)、B8R(Verardi等人(2001)J.Virol.75:11)、B15R(Copenhagen株中的B16R)(Spriggs等人(1992)Cell 71:145)、A41R(Ng等人(2001)Journal of General Virology82:2095)、A52R(Bowie等人(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:10162)、F1L(Gerlic等人(2013)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 110:7808)、E3L(Chang等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:4825)、A44R-A46R(Bowie等人(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:10162)、K1L(BravoCruz等人(2017)Journal of Virology 91:e00524)、A48R、B18R、C11R和TK(Mejías-Pérez等人(2017)Molecular Therapy:Oncolytics 8:27)、E3L和K3L区域(WO2005/007824)或O1L(Schweneker等人(2012)J.Virol.86:2323)。此外，RVV可以包含使牛痘病毒的B5R的细胞外区域缺陷(Bell等人(2004)Virology325:425)、A34R区域缺陷(Thirunavukarasu等人(2013)Molecular Therapy21:1024)或白细胞介素1□(IL-1□)受体缺陷(WO2005/030971)。此外，具有两种或更多种这样的遗传修饰的组合的牛痘病毒可用于本公开内容的具有复制能力的重组溶瘤牛痘病毒中。例如，可以通过已知的同源重组或定点诱变来进行牛痘病毒基因组上外源基因的插入或基因的缺失或突变。
如本文所用，术语“缺陷”或“缺乏”是指由该术语指定的基因区域或蛋白质具有减少的功能或没有功能。可以通过本领域已知的方式使基因或蛋白质缺陷，例如：i)由该术语指定的基因区域的突变(例如，取代、倒位等)和/或截短和/或缺失；ii)控制基因区域表达的启动子区域的突变和/或截短和/或缺失；和iii)多聚腺苷酸化序列的突变和/或截短和/或缺失，使得由基因区域编码的多肽的翻译被减少或消除。包含修饰使得病毒在给定牛痘病毒基因中“缺陷”的本公开内容的可复制的RVV表现出基因的基因产物(例如，mRNA基因产物；多肽基因产物)的减少的产生和/或活性；例如，基因产物的量和/或活性是野生型牛痘病毒或不包含基因改变的对照牛痘病毒产生的相同基因产物的量和/或活性的小于75％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小于5％或小于1％。例如，“缺陷”可能是由特定基因区域组成的区域中的缺失或包含特定基因区域的相邻基因区域中的缺失的结果。例如，减少基因区域转录的启动子区域的突变和/或截短和/或缺失可导致缺陷。基因区域也可以通过掺入转录终止元件而导致缺陷，使得由基因区域编码的多肽的翻译减少或消除。也可以通过使用基因编辑酶或基因编辑复合物(例如，与引导RNA复合的CRISPR/Cas效应多肽)来减少或消除基因区域的转录而使基因区域缺陷。通过使用竞争性反向启动子/聚合酶占有来减少或消除基因区域的转录也能够使基因区域缺陷。也可以通过将核酸插入基因区域，从而敲除基因区域，而使基因区域缺陷。
在一些具体实施方案中，本公开内容的RVV缺乏牛痘病毒的内源性胸苷激酶(TK)活性。如本文所用，术语“内源性”是指在生物体例如病毒或其细胞内天然存在或天然表达的任何材料，例如多核苷酸、多肽或蛋白质。牛痘病毒TK由牛痘病毒基因组上的TK基因和开放阅读框(ORF)J2R编码。缺乏内源性TK活性的病毒可称为“胸苷激酶阴性”、“TK阴性”、“胸苷激酶缺陷”或“TK缺陷”。在一些情况下，本公开内容的RVV包含牛痘病毒TK编码区的全部或部分缺失，使得牛痘病毒是TK缺陷的。例如，在一些情况下，本公开内容的具有复制能力的重组溶瘤牛痘病毒包含J2R缺失。例如，参见Mejía-Perez等人(2018)Mol.Ther.Oncolytics 8:27。在一些情况下，本公开内容的具有复制能力的重组溶瘤牛痘病毒包含J2R区中的插入，从而导致牛痘病毒TK活性降低或没有。
在一些实施方案中，本公开内容提供了一种RVV，其中病毒的A34R基因包含K151E取代(即，包含在编码的多肽中提供K151E取代的修饰)。参见，例如，Blasco等人(1993)J.Virol.67(6):3319-3325；和Thirunavukarasu等人(2013)Mol.Ther.21:1024。A34R基因编码牛痘病毒gp22-24(也称为蛋白A34)。UniProt(UniProtKB-P21057(Q34_VACCC))提供了牛痘病毒Copenhagen株的A34蛋白的氨基酸序列，该序列由168个氨基酸组成。
在一些实施方案中，本发明提供的RVV包括：(1)编码IL-2v多肽的插入的核苷酸序列；(2)编码异源TK多肽的插入的核苷酸序列；(3)A34R基因中的K151E取代，其中RVV是TK缺陷的。在一些具体实施方案中，由RVV编码的IL-2v多肽包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少95％(例如，至少95％、至少98％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列，并且包含氨基酸取代F42A取代、Y45A取代和L72G取代，其中氨基酸编号基于SEQ ID NO：1的氨基酸序列。在一些进一步的具体实施方案中，异源TK多肽包含与其中氨基酸168是His的SEQ IDNO：28的氨基酸序列具有至少95％(例如，至少95％、至少98％、至少99％或100％)同一性的氨基酸序列。
B-4.重组牛痘病毒的构建
本公开内容的具有复制能力的重组溶瘤牛痘病毒可以由现在已知或将来发现的各种牛痘病毒株中的任一种构建。适合使用的牛痘病毒株包括但不限于毒株Lister、NewYork City Board of Health(NYBH)、Wyeth、Copenhagen、Western Reserve(WR)、修饰的牛痘安卡拉株(Modified Vaccinia Ankara，MVA)、EM63、Ikeda、Dalian、LIVP、Tian Tan、IHD-J、Tashkent、Bern、Paris、Dairen以及类似的衍生物。在一些情况下，本公开内容的具有复制能力的RVV是Copenhagen株牛痘病毒。在一些情况下，本公开内容的具有复制能力的RVV是WR株牛痘病毒。
各种株的牛痘病毒基因组的核苷酸序列是本领域已知的。参见，例如，Goebel等人(1990)Virology 179:247；Goebel等人(1990)Virology 179:517。Copenhagen株牛痘病毒的核苷酸序列是已知的；参见，例如，GenBank登录号M35027。WR株牛痘病毒的核苷酸序列是已知的；参见，例如，GenBank登录号AY243312；和GenBank登录号NC_006998。牛痘病毒的WR株可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)以ATCC VR-1354获得。在一个具体实施方案中，本发明提供的RVV包含：(1)编码IL-2v多肽的插入的核苷酸序列；(2)编码异源TK多肽的插入的核苷酸序列；(3)A34R基因中的K151E取代，其中RVV是Copenhagen株并且是TK缺陷的，其中IL-2v多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO：1并且包含氨基酸取代F42A取代、Y45A取代和L72G取代，其中异源TK多肽包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列，其中氨基酸168是His。
本公开内容的具有复制能力的RVV表现出溶瘤活性。病毒的溶瘤活性可以通过本领域已知的任何合适的方法来评估。用于评估给定病毒是否表现出溶瘤活性的方法的实例包括用于评估通过添加病毒降低癌细胞存活率的体外方法。可以使用的癌细胞或细胞系的实例包括恶性黑色素瘤细胞RPMI-7951(例如，ATCC HTB-66)、肺腺癌HCC4006(例如，ATCCCRL-2871)、肺癌A549(例如，ATCC CCL-185)、肺癌HOP-62(例如，DCTD肿瘤库)、肺癌EKVX(例如，DCTD肿瘤库)、小细胞肺癌细胞DMS 53(例如，ATCC CRL-2062)、肺鳞状细胞癌NCI-H226(例如ATCC CRL-5826)、肾癌细胞Caki-1(例如ATCC HTB-46)、膀胱癌细胞647-V(例如DSMZACC 414)、头颈癌细胞Detroit 562(例如ATCC CCL-138)、乳腺癌细胞JIMT-1(例如DSMZACC 589)、乳腺癌细胞MDA-MB-231(例如，ATCC HTB-26)、乳腺癌细胞MCF7(例如，ATCC HTB-22)、乳腺癌HS-578T(例如，ATCC HTB-126)、乳腺导管癌T-47D(例如，ATCC HTB-133)、食管癌细胞OE33(例如，ECACC 96070808)、胶质母细胞瘤U-87MG(例如，ECACC 89081402)、神经母细胞瘤GOTO(例如，JCRB JCRB0612)、骨髓瘤RPMI 8226(例如，ATCC CCL-155)，卵巢癌细胞SK-OV-3(例如ATCC HTB-77)、卵巢癌细胞OVMANA(例如JCRB JCRB1045)、宫颈癌HeLa(例如ATCC CCL-2)、结肠癌细胞RKO(例如，ATCC CRL-2577)、结肠癌细胞HT-29(例如，ATCCHTB-38)、结肠癌Colo 205(例如，ATCC CCL-222)、结肠癌SW620(例如，ATCC CCL-227)、结直肠癌HCT 116(例如，ATCC CCL-247)、胰腺癌细胞BxPC-3(例如，ATCC CRL-1687)、骨肉瘤U-2OS(例如，ATCC HTB-96)、前列腺癌细胞LNCaP克隆FGC(例如，ATCC CRL-1740)、肝细胞癌JHH-4(例如，JCRB JCRB0435)、间皮瘤NCI-H28(例如，ATCC CRL-5820)、宫颈癌细胞SiHa(例如，ATCC HTB-35)和胃癌细胞Kato III(例如，RIKEN BRC RCB2088)。
可以使用已建立的技术将包含编码IL-2v多肽或异源TK多肽的核苷酸序列的核酸引入牛痘病毒中。合适技术的一个例子是用辅助病毒重新激活。合适技术的另一个例子是同源重组。例如，可以产生其中插入了包含编码IL-2v多肽的核苷酸序列的核酸的质粒(也称为转移载体质粒DNA)，从而产生重组转移载体；重组转移载体可被导入牛痘病毒感染的细胞中。然后通过同源重组将包含编码IL-2v多肽的核苷酸序列的核酸从重组转移载体引入牛痘病毒中。其中引入包含编码IL-2v多肽的核苷酸序列的核酸的区域可以是对牛痘病毒的生命周期非必需的基因区域。例如，其中引入包含编码IL-2v多肽的核苷酸序列的核酸的区域可以是缺乏VGF功能的牛痘病毒中的VGF基因内的区域、缺乏O1L功能的牛痘病毒中的O1L基因内的区域，或缺乏VGF和O1L功能的牛痘病毒中VGF和O1L基因之一或两者内的一个或多个区域。在上文中，可以引入一种或多种外源基因以使其在与VGF和O1L基因相同或相反的方向上转录。作为另一个实例，其中引入包含编码IL-2v多肽的核苷酸序列的核酸的区域可以是缺乏B18(B19)功能的牛痘病毒中的B18基因(Copenhagen中的B19)内的区域。
类似地，可以产生其中插入了编码异源TK多肽的核苷酸序列的质粒(也称为转移载体质粒DNA)，从而产生重组转移载体；可以将重组转移载体导入用来自牛痘病毒的消化的基因组DNA转染并用辅助病毒感染的细胞中。然后通过同源重组将编码TKv多肽的核苷酸序列从重组转移载体引入牛痘病毒。引入编码TKv多肽的核苷酸序列的区域可以是内源牛痘病毒TK编码基因，例如J2R。编码TKv多肽的核酸可以取代全部或部分牛痘病毒J2R。
在一些情况下，编码IL-2v多肽或异源TK多肽的核苷酸序列可操作地连接到转录控制元件，例如启动子。在一些情况下，启动子提供多肽在肿瘤细胞中的表达。合适的启动子包括但不限于pSEL启动子、PSFJ1-10启动子、PSFJ2-16启动子、pHyb启动子、晚期-早期优化启动子、p7.5K启动子、p11K启动子、T7.10启动子、CPX启动子、修饰的H5启动子、H4启动子、HF启动子、H6启动子和T7杂合启动子。
在一些情况下，编码IL-2v多肽或异源TK多肽的核苷酸序列可操作地连接至可调节启动子。在一些情况下，可调节启动子是可逆启动子。在一些情况下，编码IL-2v多肽或异源TK多肽的核苷酸序列可操作地连接到四环素调节的启动子(例如，启动子系统，例如TetActivators、TetON、TetOFF、Tet-On Advanced、Tet-On 3G等)。在一些情况下，编码IL-2v多肽或异源TK多肽的核苷酸序列可操作地连接至可抑制启动子。在一些情况下，编码IL-2v多肽或异源TK多肽的核苷酸序列可操作地连接至四环素可抑制的启动子，例如，该启动子在四环素或四环素类似物或衍生物的存在下被抑制。在一些情况下，编码IL-2v多肽或异源TK多肽的核苷酸序列可操作地连接到TetOFF启动子系统。Bujard和Gossen(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5547。例如，TetOFF启动子系统在四环素(或合适的类似物或衍生物，例如多西环素)的存在下被抑制(无活性)；一旦四环素被去除，启动子就会有活性并驱动多肽的表达。在一些情况下，编码IL-2v多肽或异源TK多肽的核苷酸序列可操作地连接至四环素可激活的启动子，例如，该启动子在四环素或四环素类似物或衍生物的存在下被激活。
C.组合物
在另一个方面，本公开内容提供了一种组合物，其包含由本公开内容提供的RVV。在一些情况下，该组合物是药物组合物。在一些情况下，该药物组合物适合施用于有需要的人。
本发明提供的药物组合物还可以包括一种或多种药学上可接受的承载体。如本文所用，术语“药学上可接受的承载体”是指在施用时基本上没有长期或永久有害作用的任何物质，并且包括诸如药学上可接受的“媒介物”、“稳定剂”、“稀释剂”、“助剂”或“赋形剂”的术语。这样的承载体通常与本公开内容的RVV混合，并且可以是固体、半固体或液体试剂。应当理解，本公开内容的RVV可以是可溶的或可以作为在需要的承载体或稀释剂中的混悬液被递送。可以使用多种药学上可接受的承载体中的任何一种，包括但不限于缓冲剂、防腐剂、张力调节剂、盐、抗氧化剂、填充剂、乳化剂、润湿剂等。各种缓冲剂和调节pH的方法可用于制备本说明书中公开的药物组合物，条件是所得制剂是药学上可接受的。此类缓冲剂包括但不限于乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、中性缓冲盐水、磷酸缓冲盐水和硼酸盐缓冲液。应理解，酸或碱可用于根据需要调节组合物的pH。药学上可接受的抗氧化剂包括但不限于焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠、乙酰半胱氨酸、丁基化羟基茴香醚和丁基化羟基甲苯。有用的防腐剂包括但不限于苯扎氯铵、氯丁醇、硫柳汞、乙酸苯汞、硝酸苯汞和稳定的氧氯组合物，例如PURITETM。适合包含在主题药物组合物中的张力调节剂包括但不限于盐，例如氯化钠、氯化钾、甘露醇或甘油以及其他药学上可接受的张力调节剂。应当理解，药理学领域中已知的这些和其他物质可以包含在主题药物组合物中。
本公开内容的药物组合物可以包含本公开内容的RVV，其量为约102个噬斑形成单位(pfu)/ml(pfu/ml)至约104pfu/ml、约104pfu/ml至约105pfu/ml、约105pfu/ml至约106pfu/ml、约106pfu/ml至约107pfu/ml、约107pfu/ml至约108pfu/ml、约108pfu/ml至约109pfu/ml、约109pfu/ml至约1010pfu/ml、约1010pfu/ml至约1011pfu/ml、或约1011pfu/ml至约1012pfu/ml。
D.诱导肿瘤溶解和治疗癌症的用途和方法
D-1.方法、用途和施用
在另一方面，本公开内容提供了重组溶瘤牛痘病毒和包含重组溶瘤牛痘病毒的组合物的用途以及使用方法。所述用途或方法包括用于在患有肿瘤的个体中诱导溶瘤或治疗癌症的用途或方法，所述方法包括向有需要的个体施用有效量的本公开内容的具有复制能力的RVV或本公开内容的组合物。有效量的本公开内容的具有复制能力的RVV或本公开内容的组合物的施用在本文中也称为“病毒疗法”。
在一些情况下，本公开内容的具有复制能力的RVV的“有效量”是当以一个或多个剂量施用至有需要的个体时减少个体中癌细胞或肿瘤块的数量的量。例如，在一些情况下，具有复制能力的RVV的“有效量”是当以一个或多个剂量施用至有需要的个体时，与施用RVV之前或未施用RVV时个体中的癌细胞数量相比，将个体中癌细胞的数量减少至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的量。在一些情况下，RVV的“有效量”是当以一个或多个剂量施用至有需要的个体时，将个体中癌细胞的数量减少到不可检测水平的量。在一些情况下，本公开内容的RVV的“有效量”是当以一个或多个剂量施用至有需要的个体时减少个体中的肿瘤块的量。例如，在一些情况下，本公开内容的RVV的“有效量”是当以一个或多个剂量施用至有需要的个体时，与施用RVV之前或未施用具有复制能力的重组溶瘤牛痘病毒的个体中的肿瘤块相比，将个体中的肿瘤块减少至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的量。
在一些情况下，本公开内容的RVV的“有效量”是当以一个或多个剂量施用至有需要的个体时增加个体存活时间的量。例如，在一些情况下，本公开内容的RVV的“有效量”是当以一个或多个剂量施用至有需要的个体时，与在没有施用具有复制能力的重组溶瘤牛痘病毒的情况下个体的预期存活时间相比，将个体的存活时间增加至少1个月、至少2个月、至少3个月、3个月至6个月、6个月至1年、1年至2年、2年至5年、5年至10年或超过10年的量。
在一些情况下，本公开内容的RVV的“有效量”是当以一个或多个剂量施用至有需要的个体时提供产生IFN-γ的T细胞的数量的增加的量。例如，在一些情况下，本公开内容的RVV的“有效量”是当以一个或多个剂量施用至有需要的个体时，与在施用具有复制能力的重组溶瘤牛痘病毒之前或在没有施用具有复制能力的重组溶瘤牛痘病毒的情况下个体中产生IFN-γ的T细胞数量相比，在个体中提供至少10％、至少25％、至少50％、至少2倍、至少5倍或至少10倍的产生IFN-γ的T细胞的数量的增加的量。
在一些情况下，本公开内容的RVV的“有效量”是当以一个或多个剂量施用至有需要的个体时提供个体中IL-2或IL-2v的循环水平的增加的量。例如，在一些情况下，本公开内容的RVV的“有效量”是当以一个或多个剂量施用至有需要的个体时，与在施用具有复制能力的重组溶瘤牛痘病毒之前或在没有施用具有复制能力的重组溶瘤牛痘病毒的情况下个体中IL-2或IL-2v的循环水平相比，在个体中提供至少10％、至少25％、至少50％、至少2倍、至少5倍或至少10倍的IL-2或IL-2v的循环水平的增加的量。
在一些情况下，本公开内容的RVV的“有效量”是当以一个或多个剂量施用至有需要的个体时提供个体中IL-2v多肽的循环水平的增加的量。例如，在一些情况下，本公开内容的RVV的“有效量”是当以一个或多个剂量施用至有需要的个体时，与在施用具有复制能力的重组溶瘤牛痘病毒之前或在没有施用具有复制能力的重组溶瘤牛痘病毒的情况下个体中IL-2v多肽的循环水平相比，在个体中提供至少10％、至少25％、至少50％、至少2倍、至少5倍或至少10倍的IL-2v多肽的循环水平的增加的量。
在一些情况下，本公开内容的RVV的“有效量”是当以一个或多个剂量施用至有需要的个体时提供CD8+肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的数量的增加的量。例如，在一些情况下，本公开内容的RVV的“有效量”是当以一个或多个剂量施用至有需要的个体时，与在施用具有复制能力的重组溶瘤牛痘病毒之前或在没有施用具有复制能力的重组溶瘤牛痘病毒的情况下个体中CD8+TIL的数量相比，在个体中提供至少10％、至少25％、至少50％、至少2倍、至少5倍或至少10倍的CD8+TIL的数量的增加的量。
在一些情况下，本公开内容的RVV的“有效量”是当以一个或多个剂量施用于有需要的个体时诱导持久的抗肿瘤免疫应答的量，例如提供持续至少1个月、至少2个月、至少6个月或至少1年的肿瘤细胞数量和/或肿瘤块和/或肿瘤生长的减少的抗肿瘤免疫应答。
合适的剂量可以由主治医师或其他合格的医务人员根据各种临床因素确定。正如医学领域所熟知的，任何一位患者的剂量取决于许多因素，包括患者的体型、体表面积、年龄、肿瘤负荷和其他相关因素。
本公开内容的RVV可以以每剂量约102个噬斑形成单位(pfu)至约104pfu、约104pfu至约105pfu、约105pfu至约106pfu、约106pfu至约107pfu、约107pfu至约108pfu、约108pfu至约109pfu、约109pfu至约1010pfu或约1010pfu至约1011pfu的量施用。
在一些情况下，本公开内容的RVV以约1x 109pfu至5x 1011pfu的总量施用。在一些情况下，本公开内容的RVV以约1x 109pfu至约5x 109pfu、约5x 109pfu至约1010pfu、约1010pfu至约5x 1010pfu、约5x 1010pfu至约1011pfu或约1011pfu至约5x 1011pfu的总量施用。在一些情况下，本公开内容的RVV以约2x 1010pfu的总量施用。
在一些情况下，本公开内容的RVV以约1x108pfu/kg患者体重至约5x109pfu/kg患者体重的量施用。在一些情况下，本公开内容的RVV以约1x108pfu/kg患者体重至约5x108pfu/kg患者体重、约5x108pfu/kg患者体重至约109pfu/kg患者体重，或约109pfu/kg患者体重至约5x109pfu/kg患者体重的量施用。在一些情况下，本公开内容的RVV以1×108pfu/kg患者体重的量施用。在一些情况下，本公开内容的RVV以2×108pfu/kg患者体重的量施用。在一些情况下，本公开内容的RVV以3x108pfu/kg患者体重的量施用。在一些情况下，本公开内容的RVV以4×108pfu/kg患者体重的量施用。在一些情况下，本公开内容的RVV以5×108pfu/kg患者体重的量施用。
在一些情况下，施用多个剂量的本公开内容的RVV。本公开内容的RVV的施用频率可以根据多种因素中的任何一个(例如，症状的严重程度等)而变化。例如，在一些实施方案中，本公开内容的RVV的施用为每月一次，每月两次，每月三次，每隔一周(qow)，每周一次(qw)，每周两次(biw)，每周三次(tiw)，每周四次，每周五次，每周六次，每隔一天(qod)，每天(qd)，一天两次(bid)或一天三次(tid)。
本公开内容的RVV的施用持续时间(例如，本公开内容的多聚体多肽、本公开内容的RVV被施用的时间段)可以根据多种因素中的任何一个(例如患者反应等)而变化。例如，本公开内容的RVV可以在约1天至约1周、约2周至约4周、约1个月至约2个月、约2个月至约4个月、约4个月至约6个月、约6个月至约8个月、约8个月至约1年、约1年至约2年或约2年至约4年或更长的时间段内施用。
使用适用于药物递送的任何可用方法和途径将本公开内容的RVV施用给个体，包括体内和离体方法，以及全身和局部施用途径。
常规和药学上可接受的施用途径包括瘤内、肿瘤周围、肌内、气管内、鞘内、颅内、皮下、皮内、局部施用、静脉内、动脉内、腹膜内、膀胱内、直肠、鼻腔、口服和其他肠内和肠胃外施用途径。如果需要，可以组合施用途径，或根据RVV和/或所需效果进行调整。本公开内容的RVV可以以单剂量或多剂量施用。
在一些情况下，本公开内容的RVV是静脉内施用的。在一些情况下，本公开内容的RVV是肌肉内施用的。在一些情况下，本公开内容的RVV是局部施用的。在一些情况下，本公开内容的RVV是瘤内施用的。在一些情况下，本公开内容的RVV是在肿瘤周围施用的。在一些情况下，本公开内容的RVV是颅内施用的。在一些情况下，本公开内容的RVV是皮下施用的。在一些情况下，本公开内容的RVV是动脉内施用的。在一些情况下，本公开内容的RVV是腹膜内施用的。在一些情况下，本公开内容的RVV通过膀胱内施用途径施用。在一些情况下，本公开内容的RVV是鞘内施用的。
D-2.组合
在一些情况下，本公开内容的RVV与另一种疗法或药剂组合施用。例如，RVV可以作为标准癌症疗法的辅助疗法施用，与另一种癌症疗法组合施用，或与增强RVV的抗肿瘤作用的药剂组合施用。标准的癌症疗法包括手术(例如，癌组织的手术切除)、放射疗法、骨髓移植、化学疗法治疗、抗体治疗、生物反应调节剂治疗、免疫疗法治疗以及上述的某些组合。在一些情况下，本公开内容的方法或用途包括：a)向有需要的个体施用本公开内容的RVV或包含其的组合物；b)向个体施用第二癌症疗法。在一些情况下，第二癌症疗法选自化学疗法、生物疗法、放射疗法、免疫疗法、激素疗法、抗血管疗法、冷冻疗法、毒素疗法、溶瘤病毒疗法(例如，不同于本公开内容的RVV的溶瘤病毒)、细胞疗法和手术。
放射治疗包括但不限于从外部施加的源(例如光束)或通过植入小型放射源递送的X射线或γ射线。
用于癌症治疗的合适抗体包括但不限于，例如，阿维鲁单抗(商品名Bavencio)、曲妥珠单抗(商品名Herceptin)、贝伐珠单抗(商品名Avastin)、西妥昔单抗(商品名Erbitux)、帕尼单抗(商品名Vectibix)、伊匹木单抗(商品名Yervoy)、利妥昔单抗(商品名Rituxan)、阿仑单抗(商品名Lemtrada)、奥法木单抗(商品名Arzerra)、奥戈伏单抗(商品名OvaRex)、lambrolizumab(MK-3475)、帕托珠单抗(商品名Perjeta)、雷珠单抗(商品名Lucentis)等，以及缀合的抗体，例如吉妥单抗(gemtuzumab ozogamicin，商品名Mylortarg)、维布妥昔单抗(Brentuximab vedotin，商品名Adcetris)、90Y-标记的替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan，商品名Zevalin)、131I-标记的托西莫单抗(tositumoma，商品名Bexxar)等。适用于癌症治疗的抗体包括但不限于不限于例如靶向CTLA-4的伊匹木单抗(用于治疗黑色素瘤、前列腺癌、RCC)；靶向CTLA-4的曲美木单抗(用于治疗CRC、胃癌、黑色素瘤、NSCLC)；靶向PD-1的纳武单抗(用于治疗黑色素瘤、NSCLC、RCC)；靶向PD-1的MK-3475(用于治疗黑色素瘤)；靶向PD-1的匹地利珠单抗(用于治疗血液系统恶性肿瘤)；靶向PD-L1的BMS-936559(用于治疗黑色素瘤、NSCLC、卵巢癌、RCC)；靶向PD-L1的MEDI4736；靶向PD-L1的MPDL33280A(用于治疗黑色素瘤)；靶向CD20的利妥昔单抗(用于治疗非霍奇金淋巴瘤)；替伊莫单抗和托西莫单抗(用于治疗淋巴瘤)；靶向CD30的维布妥昔单抗(用于治疗霍奇金淋巴瘤)；靶向CD33的吉妥珠单抗(用于治疗急性骨髓性白血病)；靶向CD52的阿仑单抗(用于治疗慢性淋巴细胞性白血病)；靶向EpCAM的IGN101和阿德木单抗(用于治疗上皮肿瘤(乳腺肿瘤、结肠肿瘤和肺肿瘤))；靶向CEA的拉贝珠单抗(用于治疗乳腺、结肠和肺肿瘤)；靶向gpA33的huA33(用于治疗结肠直肠癌)；靶向粘蛋白的pemtumomab和奥戈伏单抗(用于治疗乳腺、结肠、肺和卵巢肿瘤)；靶向TAG-72的CC49(明瑞莫单抗)(用于治疗乳腺、结肠和肺肿瘤)；靶向CAIX的cG250(用于治疗肾细胞癌)；靶向PSMA的J591(用于治疗前列腺癌)；靶向叶酸结合蛋白的MOv18和MORAb-003(法妥组单抗)(用于治疗卵巢肿瘤)；靶向神经节苷脂(如GD2、GD3和GM2)的3F8、ch14.18和KW-2871(用于治疗神经外胚层肿瘤和一些上皮肿瘤)；靶向Ley的hu3S193和IgN311(用于治疗乳腺、结肠、肺和前列腺肿瘤)；靶向VEGF的贝伐珠单抗(用于治疗肿瘤脉管系统)；靶向VEGFR的IM-2C6和CDP791(用于治疗上皮来源的实体瘤)；靶向整合素_V_3的依他珠单抗(用于治疗肿瘤脉管系统)；靶向整合素_5_1的伏洛昔单抗(用于治疗肿瘤脉管系统)；靶向EGFR的西妥昔单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗和806(用于治疗胶质瘤、肺、乳腺、结肠和头颈部肿瘤)；靶向ERBB2的曲妥珠单抗和帕妥珠单抗(用于治疗乳腺、结肠、肺、卵巢和前列腺肿瘤)；靶向ERBB3的MM-121(用于治疗乳腺、结肠、肺、卵巢和前列腺肿瘤)；靶向MET的AMG102、METMAB和SCH900105(用于治疗乳腺、卵巢和肺肿瘤)；靶向IGF1R的AVE1642、IMC-A12、MK-0646、R1507和CP751871(用于治疗胶质瘤、肺癌、乳腺癌、头颈癌、前列腺癌和甲状腺癌)；靶向EPHA3的KB004和IIIA4(用于治疗肺、肾和结肠肿瘤、黑色素瘤、胶质瘤和血液系统恶性肿瘤)；靶向TRAILR1的马帕木单抗(HGS-ETR1)(用于治疗结肠、肺和胰腺肿瘤和血液系统恶性肿瘤)；靶向TRAILR2的HGS-ETR2和CS-1008；靶向RANKL的地诺单抗(用于治疗前列腺癌和骨转移)；靶向FAP的西罗珠单抗和F19(用于治疗结肠、乳腺、肺、胰腺和头颈部肿瘤)；靶向肌腱蛋白的81C6(用于治疗胶质瘤、乳腺和前列腺肿瘤)；靶向CD3的博纳吐单抗(商品名Blincyto)(用于治疗ALL)；用于癌症免疫治疗的靶向PD-1的帕博丽珠单抗；靶向c-Myc的9E10抗体；等等。
在一些情况下，本公开内容的方法或用途包括施用：a)有效量的本公开内容的RVV；和b)抗PD-1抗体。在一些情况下，本公开内容的方法或用途包括施用：a)有效量的本公开内容的RVV；和b)抗PD-L1抗体。合适的抗PD-1抗体包括但不限于帕博丽珠单抗(
Figure BDA0003812856710000391
MK-3475)、纳武单抗、匹地利珠单抗(CT-011)、AMP-224、AMP-514(MEDI-0680)、PDR001和PF-06801591。合适的抗PD-L1抗体包括但不限于BMS-936559(MDX1105)、德瓦鲁单抗(MEDI4736；Imfinzi)和阿特珠单抗(MPDL33280A；Tecentriq)。例如，参见Sunshine和Taube(2015)Curr.Opin.Pharmacol.23:32；和Heery等人(2017)The LancetOncology 18:587；Iwai等人(2017)J.Biomed.Sci.24:26；Hu-Lieskovan等人(2017)Annalsof Oncology 28:issue Suppl.5，mdx376.048；和美国专利公开号2016/0159905。
在一些情况下，合适的抗体是双特异性抗体，例如双特异性单克隆抗体。卡妥索单抗、博纳吐单抗、索利托单抗、帕妥昔珠单抗和氟替珠单抗是适用于癌症治疗的双特异性抗体的非限制性实例。参见，例如，Chames和Baty(2009)MAbs 1:539；以及Sedykh等人(2018)Drug Des.Devel.Ther.12:195。
适用于与本公开内容的方法结合使用的生物反应调节剂包括但不限于：(1)酪氨酸激酶(RTK)活性抑制剂；(2)丝氨酸/苏氨酸激酶活性抑制剂；(3)肿瘤相关抗原拮抗剂，例如特异性结合肿瘤抗原的抗体；(4)凋亡受体激动剂；(5)白细胞介素-2；(6)干扰素-α；(7)干扰素-γ；(8)集落刺激因子；(9)血管生成抑制剂；和(10)肿瘤坏死因子拮抗剂。
化疗剂是减少癌细胞增殖的非肽类(即非蛋白质)化合物，包括细胞毒剂和细胞抑制剂。化疗剂的非限制性实例包括烷化剂、亚硝基脲、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、植物(长春花)生物碱和类固醇激素。
用于减少细胞增殖的试剂在本领域中是已知的并且被广泛使用。此类试剂包括烷化剂，例如氮芥、亚硝基脲、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸盐和三氮烯，包括但不限于：二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、环磷酰胺(CytoxanTM)、美法仑(L-苯丙氨酸氮芥(L-sarcolysin))、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、司莫司汀(甲基-CCNU)、链脲佐菌素、氯脲菌素、尿嘧啶氮芥、双氯乙基甲胺、异环磷酰胺、苯丁酸氮芥、哌泊溴烷、三乙烯三聚氰胺、三乙烯硫代磷胺、白消安、达卡巴嗪和替莫唑胺。
抗代谢药剂包括叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂，包括但不限于：阿糖胞苷(cytarabine，CYTOSAR-U)、胞嘧啶阿拉伯糖苷、氟尿嘧啶(5-FU)、氟尿苷(FudR)、6-硫鸟嘌呤、6-巯基嘌呤(6-MP)、喷司他丁、5-氟尿嘧啶(5-FU)、甲氨蝶呤、10-炔丙基-5,8-二去氮杂叶酸(PDDF，CB3717)、5,8-二去氮杂四氢叶酸(DDATHF)、亚叶酸、磷酸氟达拉滨、喷司他汀和吉西他滨。
合适的天然产物及其衍生物(例如，长春花生物碱、抗肿瘤抗生素、酶、淋巴因子和表鬼臼毒素)包括但不限于：Ara-C、紫杉醇
Figure BDA0003812856710000401
多西紫杉醇
Figure BDA0003812856710000402
脱氧助间霉素(deoxycoformycin)、丝裂霉素-C、L-天冬酰胺酶、硫唑嘌呤；布喹那(brequinar)；生物碱，例如长春新碱、长春碱、长春瑞滨、长春地辛等；鬼臼毒素，例如依托泊苷、替尼泊苷等；抗生素，例如蒽环类、盐酸道诺霉素(道诺霉素、红比霉素、柔红霉素)、伊达比星、多柔比星、表柔比星及吗啉代衍生物等；吩噁嗪酮双环肽(phenoxizone biscyclopeptides)，例如更生霉素；碱性糖肽，例如博来霉素；蒽醌苷，例如普利霉素(plicamycin)(光辉霉素(mithramycin))；蒽二酮类，例如米托蒽醌；吖丙因吡咯吲哚二酮(azirinopyrroloindolediones)，例如丝裂霉素；大环免疫抑制剂，例如环孢素、FK-506(他克莫司、普乐可复(prograf))、雷帕霉素等；等等。
其他抗增殖细胞毒剂是诺维本、CPT-11、anastrazole、来曲唑(letrazole)、卡培他滨、雷洛昔芬(reloxafine)、环磷酰胺、异环磷酰胺(ifosamide)和droloxafine。
具有抗增殖活性的微管影响剂也适合使用，包括但不限于别秋水仙碱(allocolchicine，NSC 406042)、软海绵素B(Halichondrin B，NSC 609395)、秋水仙碱(colchicine，NSC 757)、秋水仙碱衍生物(例如，NSC 33410)、尾海兔素10(dolstatin 10，NSC 376128)、美登素(NSC 153858)、根瘤素(NSC332598)、紫杉醇
Figure BDA0003812856710000403
衍生物、多西紫杉醇
Figure BDA0003812856710000404
硫代秋水仙碱(NSC 361792)、trityl cysterin、硫酸长春碱、硫酸长春新碱、天然和合成的埃博霉素包括但不限于埃博霉素A、埃博霉素B、圆皮海绵内酯(discodermolide)；雌莫司汀、诺考达唑等。
适合使用的激素调节剂和类因醇(包括合成类似物)包括但不限于肾上腺皮质激素类、例如泼尼松、地塞米松等；雌激素类和孕激素，例如己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、雌二醇、氯米芬、他莫昔芬等；和肾上腺皮质抑制剂，例如氨鲁米特；17α-炔雌醇；己烯雌酚(diethylstilbestrol)、睾酮、氟甲睾酮、丙酸屈他雄酮(dromostanolonepropionate)、睾内酯、甲泼尼龙、甲基睾酮、泼尼松龙、曲安西龙(triamcinolone)、氯烯雌醚、羟孕酮、氨鲁米特、雌莫司汀、醋酸甲羟孕酮、亮丙瑞林、氟他胺(Flutamide)(Drogenil)、托瑞米芬(Fareston)和
Figure BDA0003812856710000412
雌激素刺激增殖和分化，因此结合雌激素受体的化合物用于阻断该活性。皮质类固醇可抑制T细胞增殖。
其它化学治疗剂包括金属络合物，例如顺铂(顺-DDP)、卡铂等；脲，例如羟基脲；和肼类，例如N-甲基肼；epidophyllotoxin；拓扑异构酶抑制剂；丙卡巴肼；米托蒽醌；甲酰四氢叶酸；替加氟(tegafur)等。其它感兴趣的抗增殖试剂包括免疫抑制剂，例如霉酚酸、沙立度胺、去氧精胍菌素、氮杂孢菌素、来氟米特、咪唑立宾、氮杂螺环烷(SKF105685)；4-(3-氯-4-氟苯氨)-7-甲氧基-6-(3-(4-吗啉基)丙氧基)喹唑啉)(商品名Iressa)；等等。
“紫杉烷”包括紫杉醇，以及任何活性紫杉烷衍生物或前药。如本文所用，“紫杉醇”不仅指常见的化学可用形式的紫杉醇，还指类似物、制剂和衍生物，例如多西紫杉醇、
Figure BDA0003812856710000411
(多西紫杉醇的制剂)、紫杉醇的10-去乙酰基类似物和紫杉醇的3'N-去苯甲酰基-3'N-叔丁氧羰基类似物，以及紫杉醇缀合物(例如，紫杉醇-PEG、紫杉醇-葡聚糖或紫杉醇-木糖)。
细胞疗法包括嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法(CAR-T疗法)；自然杀伤(NK)细胞疗法；树突细胞(DC)疗法(例如，基于DC的疫苗)；基于T细胞受体(TCR)工程化T细胞的疗法；等等。
D-3.癌症
可以通过本公开内容的方法、用途和组合物治疗的癌细胞包括来自或位于膀胱、血液、骨、骨髓、脑、乳腺、结肠、食道、胃肠道、牙龈、头、肾、肝、肺、鼻咽、颈部、卵巢、前列腺、皮肤、胃、脊髓、睾丸、舌或子宫中的癌细胞。此外，癌症可能具体属于以下组织学类型，但不限于这些：赘生物，恶性；癌；癌，未分化；巨细胞和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛基质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；胃泌素瘤，恶性；胆管癌；肝细胞癌；合并的肝细胞癌和胆管癌；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤息肉中的腺癌；腺癌，家族性结肠息肉病；实体癌；类癌瘤，恶性；支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸癌；嗜氧腺癌；嗜碱性细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡腺癌；乳头状和滤泡状腺癌；非包膜硬化性癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌；皮肤附属器癌；大汗腺腺癌；皮脂腺癌；盯聍腺腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；佩吉特氏病，乳腺；腺泡细胞癌；腺鳞癌；腺癌伴鳞状上皮化生；胸腺瘤，恶性；卵巢间质瘤，恶性；卵泡膜细胞瘤，恶性；颗粒细胞瘤，恶性；睾丸母细胞瘤(androblastoma)，恶性；sertoli细胞癌；莱迪希细胞肿瘤，恶性；脂质细胞瘤，恶性；副神经节瘤，恶性；乳腺外副神经节瘤，恶性；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤；恶性黑素瘤；无黑素性黑素瘤；浅表扩散性黑素瘤；巨大色素痣内的恶性黑素瘤；上皮样细胞黑素瘤；蓝色痣，恶性；肉瘤；纤维肉瘤；纤维组织细胞瘤，恶性；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎横纹肌肉瘤；肺泡横纹肌肉瘤；基质肉瘤；混合性肿瘤，恶性；苗勒管混合瘤；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤癌；癌肉瘤；间质瘤，恶性；布伦纳瘤，恶性；叶状肿瘤，恶性；滑膜肉瘤；间皮瘤，恶性；无性细胞瘤；胚胎癌；畸胎瘤，恶性；卵巢甲状腺肿样瘤，恶性；绒毛膜癌；中肾瘤，恶性；血管肉瘤；血管内皮瘤，恶性；卡波西氏肉瘤；血管外皮细胞瘤，恶性；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮质旁骨肉瘤；软骨肉瘤；软骨母细胞瘤，恶性；间质软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因氏肉瘤；牙源性肿瘤，恶性；成釉细胞牙肉瘤；成釉细胞瘤，恶性；成釉细胞牙肉瘤；松果体瘤，恶性；脊索瘤；胶质瘤，恶性；室管膜瘤；星形细胞瘤；原生质星形细胞瘤；纤维性星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突胶质细胞瘤；成少突胶质细胞瘤；原始神经外胚层；小脑肉瘤；神经节神经母细胞瘤；成神经细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅觉神经源性肿瘤；脑膜瘤，恶性；神经纤维肉瘤；神经鞘瘤，恶性；颗粒细胞瘤，恶性；恶性淋巴瘤；霍奇金氏病；霍奇金氏；副肉芽肿；恶性淋巴瘤，小淋巴细胞；恶性淋巴瘤，大细胞，弥漫性；恶性淋巴瘤，滤泡性；蕈样真菌病；其他指定的非霍奇金淋巴瘤；恶性组织细胞增生症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠疾病；白血病；淋巴性白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；髓细胞性白血病；嗜碱性粒细胞白血病；嗜酸性粒细胞白血病；单核细胞白血病；肥大细胞白血病；成巨核细胞白血病；髓样肉瘤；胰腺癌；直肠癌；和毛细胞白血病。
可以使用本公开内容的方法或用途治疗的肿瘤包括例如脑癌肿瘤、头颈癌肿瘤、食道癌肿瘤、皮肤癌肿瘤、肺癌肿瘤、胸腺癌肿瘤、胃癌肿瘤、结肠癌肿瘤、肝癌肿瘤、卵巢癌肿瘤、子宫癌肿瘤、膀胱癌肿瘤、睾丸癌肿瘤、直肠癌肿瘤、乳腺癌肿瘤或胰腺癌肿瘤。
在某些情况下，肿瘤是结直肠腺癌。在某些情况下，肿瘤是非小细胞肺癌。在某些情况下，肿瘤是三阴性乳腺癌。在某些情况下，肿瘤是实体瘤。在某些情况下，肿瘤是液体肿瘤。在某些情况下，肿瘤是复发的。在某些情况下，肿瘤是原发性肿瘤。在某些情况下，肿瘤是转移性的。
D-4.适合治疗的受试者
多种受试者适合用治疗癌症的主题方法进行治疗。合适的受试者包括任何个体，例如患有癌症、已被诊断患有癌症、有患癌症风险、曾患有癌症并且有癌症复发风险、已经用除本公开内容的溶瘤牛痘病毒以外的药剂治疗癌症并且对这种治疗没有反应或者已经用除本公开内容的溶瘤牛痘病毒以外的药剂治疗癌症但在对此类治疗的初步反应后复发的人或非人动物。在一些实施方案中，治疗的受试者是人。
D-5.牛痘病毒免疫原性组合物
另一方面，本发明提供的RVV在其基因组中进一步包含编码癌症抗原(本文也称为“癌症相关抗原”)的核苷酸序列。因此，本公开内容提供了一种RVV，其在其基因组中包含：i)编码IL-2v多肽的核苷酸序列，其中与野生型IL-2相比，IL-2v多肽与CD25的结合减少或具有减少的不良特性；ii)编码异源TK多肽的核苷酸序列；iii)编码癌症抗原的核苷酸序列。这样的RVV当施用于有需要的个体(例如，患有癌症的个体)时可以诱导或增强个体中对编码的癌症抗原的免疫反应。免疫反应可以减少个体中癌细胞的数量。在某些情况下，RVV具有复制能力。在某些情况下，RVV无法复制。在某些情况下，RVV不是溶瘤的。合适的IL-2v多肽如上所述。
癌症相关抗原的例子包括：α-叶酸受体；碳酸酐酶IX(CAIX)；CD19；CD20；CD22；CD30；CD33；CD44v7/8；癌胚抗原(CEA)；上皮糖蛋白-2(EGP-2)；上皮糖蛋白-40(EGP-40)；叶酸结合蛋白(FBP)；胎儿乙酰胆碱受体；神经节苷脂抗原GD2；Her2/neu；IL-13R-a2；kappa轻链；LeY；L1细胞粘附分子；黑色素瘤相关抗原(MAGE)；MAGE-A1；间皮素；MUC1；NKG2D配体；癌胎儿抗原(h5T4)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；肿瘤相关糖蛋白72(TAG-72)；血管内皮生长因子受体2(VEGF-R2)(参见，例如，Vigneron等人(2013)CancerImmunity 13:15；和Vigneron(2015)BioMed Res.Int’l Article ID 948501；以及表皮生长因子受体(EGFR)vIII多肽(参见，例如，Wong等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:2965；和Miao等人(2014)PLoSOne 9:e94281)；MUC1多肽；人乳头瘤病毒(HPV)E6多肽；LMP2多肽；HPV E7多肽；表皮生长因子受体(EGFR)vIII多肽；HER-2/neu多肽；黑色素瘤抗原家族A，3(MAGE A3)多肽；p53多肽；突变型p53多肽；NY-ESO-1多肽；叶酸水解酶(前列腺特异性膜抗原；PSMA)多肽；癌胚抗原(CEA)多肽；T细胞识别的黑色素瘤抗原(melanA/MART1)多肽；Ras多肽；gp100多肽；蛋白酶3(PR1)多肽；bcr-abl多肽；酪氨酸酶多肽；生存素多肽；前列腺特异性抗原(PSA)多肽；hTERT多肽；肉瘤易位断点多肽；滑膜肉瘤X(SSX)断点多肽；EphA2多肽；前列腺酸性磷酸酶(PAP)多肽；黑色素瘤细胞凋亡抑制剂(ML-IAP)多肽；甲胎蛋白(AFP)多肽；上皮细胞粘附分子(EpCAM)多肽；ERG(TMPRSS2 ETS融合)多肽；NA17多肽，成对盒-3(PAX3)多肽；间变性淋巴瘤激酶(ALK)多肽；雄激素受体多肽；细胞周期蛋白B1多肽；N-myc原癌基因(MYCN)多肽；Ras同源基因家族成员C(RhoC)多肽；酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)多肽；间皮素多肽；前列腺干细胞抗原(PSCA)多肽；黑色素瘤相关抗原-1(MAGE A1)多肽；细胞色素P450 1B1(CYP1B1)多肽；胎盘特异性蛋白1(PLAC1)多肽；BORIS多肽(也称为CCCTC结合因子或CTCF)；ETV6-AML多肽；乳腺癌抗原NY-BR-1多肽(也称为含锚蛋白重复结构域蛋白30A)；G蛋白信号传导(RGS5)多肽的调节剂；T细胞识别的鳞状细胞癌抗原(SART3)多肽；碳酸酐酶IX多肽；成对盒-5(PAX5)多肽；OY-TES1(睾丸抗原；也称为顶体素结合蛋白)多肽；精子蛋白17多肽；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)多肽；高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)；A-激酶锚定蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤X断点2(SSX2)多肽；X抗原家族成员1(XAGE1)多肽；B7同源物3(B7H3；也称为CD276)多肽；豆荚蛋白多肽(LGMN1；也称为天冬酰胺内肽酶)；具有Ig和EGF同源结构域-2的酪氨酸激酶(Tie-2；也称为血管生成素-1受体)多肽；P抗原家族成员4(PAGE4)多肽；血管内皮生长因子受体2(VEGF2)多肽；MAD-CT-1多肽；成纤维细胞活化蛋白(FAP)多肽；血小板衍生的生长因子受体β(PDGFβ)多肽；MAD-CT-2多肽；Fos相关抗原-1(FOSL)多肽；和Wilms肿瘤1(WT-1)多肽。
癌症相关抗原的氨基酸序列是本领域已知的；参见，例如，MUC1(GenBankCAA56734)；LMP2(GenBank CAA47024)；HPV E6(GenBank AAD33252)；HPV E7(GenBankAHG99480)；EGFRvIII(GenBank NP_001333870)；HER-2/neu(GenBank AAI67147)；MAGE-A3(GenBank AAH11744)；p53(GenBank BAC16799)；NY-ESO-1(GenBank CAA05908)；PSMA(GenBank AAH25672)；CEA(GenBank AAA51967)；melan/MART1(GenBank NP_005502)；Ras(GenBank NP_001123914)；gp100(GenBank AAC60634)；bcr-abl(GenBank AAB60388)；酪氨酸酶(GenBank AAB60319)；生存素(GenBank AAC51660)；PSA(GenBank CAD54617)；hTERT(GenBank BAC11010)；SSX(GenBank NP_001265620)；Eph2A(GenBank NP_004422)；PAP(GenBank AAH16344)；ML-IAP(GenBank AAH14475)；AFP(GenBank NP_001125)；EpCAM(GenBank NP_002345)；ERG(TMPRSS2 ETS融合)(GenBank ACA81385)；PAX3(GenBankAAI01301)；ALK(GenBank NP_004295)；雄激素受体(GenBank NP_000035)；细胞周期蛋白B1(GenBank CAO99273)；MYCN(GenBank NP_001280157)；RhoC(GenBank AAH52808)；TRP-2(GenBank AAC60627)；间皮素(GenBank AAH09272)；PSCA(GenBank AAH65183)；MAGE A1(GenBank NP_004979)；CYP1B1(GenBank AAM50512)；PLAC1(GenBank AAG22596)；BORIS(GenBank NP_001255969)；ETV6(GenBank NP_001978)；NY-BR1(GenBank NP_443723)；SART3(GenBank NP_055521)；碳酸酐酶IX(GenBank EAW58359)；PAX5(GenBank NP_057953)；OY-TES1(GenBank NP_115878)；精子蛋白17(GenBank AAK20878)；LCK(GenBankNP_001036236)；HMW-MAA(GenBank NP_001888)；AKAP-4(GenBank NP_003877)；SSX2(GenBank CAA60111)；XAGE1(GenBank NP_001091073；XP_001125834；XP_001125856；和XP_001125872)；B7H3(GenBank NP_001019907；XP_947368；XP_950958；XP_950960；XP_950962；XP_950963；XP_950965；和XP_950967)；LGMN1(GenBank NP_001008530)；TIE-2(GenBankNP_000450)；PAGE4(GenBank NP_001305806)；VEGFR2(GenBank NP_002244)；MAD-CT-1(GenBank NP_005893NP_056215)；FAP(GenBank NP_004451)；PDGFβ(GenBank NP_002600)；MAD-CT-2(GenBank NP_001138574)；FOSL(GenBank NP_005429)；和WT-1(GenBank NP_000369)。这些多肽也公开于例如Cheever等人(2009)Clin.Cancer Res.15:5323以及其中引用的参考文献；Wagner等人(2003)J.Cell.Sci.116:1653；Matsui等人(1990)Oncogene5:249；和Zhang等人(1996)Nature 383:168。
如上所述，在一些情况下，本公开内容的RVV是没有复制能力的。在一些情况下，RVV包含导致牛痘病毒不能复制的牛痘病毒基因的修饰。可以修饰一种或多种编码复制所需基因产物的牛痘病毒基因，使得牛痘病毒不能复制。例如，可以修饰RVV以降低中间转录因子(例如，A8R和/或A23R)(参见例如，Wyatt等人(2017)mBio 8:e00790；和Warren等人(2012)J.Virol.86:9514)和/或晚期转录因子(例如，G8R、A1L和A2L中的一种或多种)(参见例如，Yang等人(2013)Virology 447:213)的水平和/或活性。降低中间转录因子和/或晚期转录因子的水平和/或活性可以产生修饰的牛痘病毒，其可以表达由与早期病毒启动子可操作连接的核苷酸序列编码的多肽；但是，病毒将不能复制。修饰包括，例如，全部或部分基因的缺失；对基因的插入；以及类似的。例如，可以缺失全部或部分A8R基因。作为另一个例子，A23R基因的全部或部分可以被缺失。作为另一个例子，可以缺失全部或部分G8R基因。作为另一个例子，A1L基因的全部或部分可以被缺失。作为另一个例子，A2L基因的全部或部分可以被缺失。
D-5.2'-脱氧鸟苷类似物的施用
在另一个方面，本公开内容提供本文所述的RVV与2'-脱氧鸟苷的合成类似物组合的施用。
溶瘤病毒可能在接受病毒施用的受试者中引起不良副作用。副作用的例子包括皮肤损伤，如水疱损伤或“水疱疹”。在一些实施方案中，本公开内容提供治疗个体癌症的方法，包括向个体施用：b)有效量的本公开内容的具有复制能力的RVV；b)有效量的2'-脱氧-鸟苷的合成类似物。在一些其他实施方案中，本公开内容提供了一种治疗、减少或控制本公开内容的溶瘤RVV的副作用的方法，其包括向已接受溶瘤RVV施用的受试者施用有效量的2'-脱氧-鸟苷的合成类似物。
2'-脱氧-鸟苷的合成类似物的“有效量”是有效减少施用本公开内容的具有复制能力的RVV的不良副作用的量。例如，在不良副作用是皮肤损伤的情况下，2'-脱氧-鸟苷的合成类似物的有效量是当以一个或多个剂量施用于个体时，有效减少个体中牛痘病毒引起的皮肤损伤的数量和/或严重程度和/或持续时间的量。例如，2'-脱氧-鸟苷的合成类似物的有效量可以是当以一个或多个剂量施用于个体时，与施用2'-脱氧-鸟苷的合成类似物之前或在没有施用2'-脱氧-鸟苷的合成类似物的情况下个体中牛痘病毒引起的皮肤损伤的数量和/或严重程度和/或持续时间相比，有效减少牛痘病毒引起的皮肤损伤的数量和/或严重性和/或持续时间至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少75％或超过75％的量。在一些情况下，2'-脱氧-鸟苷的合成类似物的有效量是当以一个或多个剂量施用个体时有效减少病毒从牛痘病毒诱导的皮肤损伤中脱落的量。例如，在一些情况下，2'-脱氧-鸟苷的合成类似物的有效量是当以一个或多个剂量施用于个体时，与施用2'-脱氧-鸟苷的合成类似物之前或在没有施用2'-脱氧-鸟苷的合成类似物的情况下个体中病毒从牛痘病毒诱导的皮肤损伤中脱落相比，有效减少病毒从牛痘病毒诱导的皮肤损伤中脱落至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少75％或超过75％的量。在不良副作用是皮肤损伤的情况下，在某些情况下，2'-脱氧-鸟苷的合成类似物可以通过任何方便的施用途径(例如，局部、口服、静脉内等)施用。例如，如果不良副作用是皮肤损伤，在某些情况下，可以局部施用2'-脱氧鸟苷的合成类似物。为了减少皮肤损伤，通常局部施用2'-脱氧-鸟苷的合成类似物，例如，通过将2'-脱氧-鸟苷类似物应用于皮肤的损伤区域。
2'-脱氧-鸟苷的合成类似物的施用减少了本公开内容的具有复制能力的RVV的复制。本公开内容的具有复制能力的RVV的这种复制减少可能是合乎需要的，例如，以控制个体中具有复制能力的RVV的水平，以控制具有复制能力的RVV的作用等。因此，在一些实施方案中，本发明提供了一种控制本发明提供的具有复制能力的RVV在施用RVV的个体中复制的方法，包括向个体施用有效量的抗病毒药物，例如2'-脱氧-鸟苷类似物。在一些具体实施方案中，与施用2'-脱氧-鸟苷的合成类似物之前或在没有施用2'-脱氧-鸟苷的合成类似物的情况下个体中具有复制能力的RVV的复制水平相比，施用的2'-脱氧-鸟苷类似物有效地将本公开内容的具有复制能力的RVV在个体中的复制减少至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少75％或超过75％。
在一些其他实施方案中，本发明提供了一种治疗个体癌症的方法，包括：a)施用有效量的本发明的具有复制能力的RVV；b)施用有效量的2'-脱氧-鸟苷的合成类似物。在一些情况下，2'-脱氧-鸟苷的合成类似物的有效量是当以一个或多个剂量施用于个体时，与施用2'-脱氧-鸟苷的合成类似物之前或在没有施用2'-脱氧-鸟苷的合成类似物的情况下个体中具有复制能力的RVV的复制水平相比，有效地将本公开内容的具有复制能力的RVV在个体中的复制减少至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少75％或超过75％。
2'-脱氧-鸟苷的合成类似物可以在施用本公开内容的具有复制能力的RVV之后施用。例如，2'-脱氧-鸟苷的合成类似物可以在施用具有复制能力的重组溶瘤牛痘病毒之后1天至7天、7天至2周、2周至1个月、1个月至3个月或超过3个月施用。
在一些情况下，将2'-脱氧-鸟苷的合成类似物施用至已施用本公开内容的具有复制能力的RVV的个体，在个体中诱导快速、全身性的肿瘤溶解(癌细胞的溶解)。例如，一旦发生溶瘤牛痘病毒诱导的肿瘤生长减缓和/或一旦病毒复制达到或刚好在其峰值之后和/或一旦针对牛痘病毒蛋白的循环抗体达到或刚好在其峰值之后，就可以将2'-脱氧-鸟苷的合成类似物施用于个体。在施用本公开内容的具有复制能力的RVV之后，是否已经发生肿瘤生长的减慢，可以使用多种已建立的测量肿瘤生长和/或癌细胞数量的方法中的任一种来确定。如本文所述，本公开内容的具有复制能力的RVV在个体中的复制是处于其峰值还是刚好在其峰值之后可以通过检测和/或测量个体中TKv多肽的水平来确定，其中非限制性的合适方法的例子是PET。可以使用用于测量抗体水平的标准方法来测量针对本公开内容的具有复制能力的RVV的循环抗体是否处于其峰值或刚好在其峰值之后，其中此类方法包括例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)等。
例如，本公开内容的使用方法可以包括：a)向有需要的个体施用有效量的本公开内容的具有复制能力的RVV；b)测量：i)个体中的肿瘤大小和/或癌细胞数量；和/或ii)个体中TKv多肽的水平；和/或iii)个体中针对具有复制能力的抗体的水平；c)其中测量步骤表明：i)与施用具有复制能力的重组溶瘤牛痘病毒之前的肿瘤生长和/或癌细胞数量相比，肿瘤生长已减慢和/或癌细胞数量已减少；和/或ii)个体中TKv多肽的水平处于或刚刚超过其峰值；和/或iii)个体中针对具有复制能力的RVV的循环抗体的水平处于或刚刚超过其峰值，施用2'-脱氧-鸟苷的合成类似物。例如，本公开内容的方法或用途可以包括：a)向有需要的个体施用有效量的本公开内容的具有复制能力的RVV；b)向个体施用有效量的2'-脱氧-鸟苷的合成类似物，其中施用步骤(b)在步骤(a)之后5天至20天(例如，5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天或20天)进行。
2'-脱氧-鸟苷的合适合成类似物包括，例如，阿昔洛韦(无环鸟苷)、5'-碘脱氧尿苷(也称为“碘苷”)、更昔洛韦、缬更昔洛韦、泛昔洛韦、伐昔洛韦、2'-氟-2'-脱氧-5-碘-1-β-d-阿糖呋喃脲嘧啶(FIAU)等。合适的2'-脱氧鸟苷合成类似物的结构如下所示：
更昔洛韦：
Figure BDA0003812856710000501
缬更昔洛韦：
Figure BDA0003812856710000502
伐昔洛韦：
Figure BDA0003812856710000503
泛昔洛韦：
Figure BDA0003812856710000511
在某些情况下，以低于4000mg的剂量每天口服施用2'-脱氧鸟苷的合成类似物。在一些情况下，2'-脱氧-鸟苷的合成类似物的合适口服剂量在每天约50mg至每天约2500mg的范围内，例如约50mg/天至约100mg/天、约100mg/天至约200mg/天、约200mg/天至约300mg/天、约300mg/天至约400mg/天、约400mg/天至约500mg/天、约500mg/天至约600mg/天、约600mg/天至约700mg/天、约700mg/天至约800mg/天、约800mg/天至约900mg/天、约900mg/天至约1000mg/天、约1000mg/天至约1250mg/天、约1250mg/天至约1500mg/天、约1500mg/天至约1750mg/天、约1750mg/天至约2000mg/天、约2000mg/天至约2250mg/天、或约2250mg/天至约2500mg/天。在一些情况下，2'-脱氧-鸟苷的合成类似物的合适口服剂量为约2500mg/天至约3000mg/天、约3000mg/天至约3500mg/天或约3500mg/天至约4000mg/天。
作为一个非限制性实例，更昔洛韦以1000mg的剂量每天施用3次，总日剂量为3000mg。更昔洛韦可以以小于3000mg(例如，约50mg/天至约2500mg/天、例如约50mg/天至约100mg/天、约100mg/天至约200mg/天、约200mg/天至约300mg/天、约300mg/天至约400mg/天、约400mg/天至约500mg/天、约500mg/天至约600mg/天、约600mg/天至约700mg/天、约700mg/天至约800mg/天、约800mg/天至约900mg/天、约900mg/天至约1000mg/天、约1000mg/天至约1250mg/天、约1250mg/天至约1500mg/天、约1500mg/天至约1750mg/天、约1750mg/天至约2000mg/天、约2000mg/天至约2250mg/天或约2250mg/天至约2500mg/天)的总日剂量施用。在某些情况下，更昔洛韦通过口服施用。
作为另一个非限制性实例，阿昔洛韦可以以1000mg至4000mg的总日剂量施用。阿昔洛韦可以以小于4000mg(例如，约50mg/天至约2500mg/天，例如约50mg/天至约100mg/天、约100mg/天至约200mg/天、约200mg/天至约300mg/天、约300mg/天至约400mg/天、约400mg/天至约500mg/天、约500mg/天至约600mg/天、约600mg/天至约700mg/天、约700mg/天至约800mg/天、约800mg/天至约900mg/天、约900mg/天至约1000mg/天、约1000mg/天至约1250mg/天、约1250mg/天至约1500mg/天、约1500mg/天至约1750mg/天、约1750mg/天至约2000mg/天、约2000mg/天至约2250mg/天或约2250mg/天至约2500mg/天)的总日剂量施用。在某些情况下，阿昔洛韦通过口服施用而施用。
作为另一个例子，缬更昔洛韦以约900mg至约1800mg的总日剂量施用。缬更昔洛韦可以以小于1800mg(例如，约500mg/天至约600mg/天、约600mg/天至约700mg/天、约700mg/天至约800mg/天、约800mg/天至约900mg/天、约900mg/天至约1000mg/天、约1000mg/天至约1200mg/天、约1200mg/天至约1400mg/天或约1400mg/天至约1600mg/天)的总日剂量施用。在某些情况下，缬更昔洛韦通过口服施用而施用。
作为另一个实例，泛昔洛韦以约2000mg/天至约4000mg/天的总日剂量施用。泛昔洛韦可以以小于4000mg(例如，约50mg/天至约2500mg/天、例如约50mg/天至约100mg/天、约100mg/天至约200mg/天、约200mg/天至约300mg/天、约300mg/天至约400mg/天、约400mg/天至约500mg/天、约500mg/天至约600mg/天、约600mg/天至约700mg/天、约700mg/天至约800mg/天、约800mg/天至约900mg/天、约900mg/天至约1000mg/天、约1000mg/天至约1250mg/天、约1250mg/天至约1500mg/天、约1500mg/天至约1750mg/天、约1750mg/天至约2000mg/天、约2000mg/天至约2250mg/天或约2250mg/天至约2500mg/天)的总日剂量施用。在某些情况下，泛昔洛韦通过口服施用而施用。
作为另一个例子，伐昔洛韦以约2000mg至约4000mg的总日剂量施用。伐昔洛韦可以以小于4000mg(例如，约50mg/天至约2500mg/天、例如约50mg/天至约100mg/天、约100mg/天至约200mg/天、约200mg/天至约300mg/天、约300mg/天至约400mg/天、约400mg/天至约500mg/天、约500mg/天至约600mg/天、约600mg/天至约700mg/天、约700mg/天至约800mg/天、约800mg/天至约900mg/天、约900mg/天至约1000mg/天、约1000mg/天至约1250mg/天、约1250mg/天至约1500mg/天、约1500mg/天至约1750mg/天、约1750mg/天至约2000mg/天、约2000mg/天至约2250mg/天或约2250mg/天至约2500mg/天)的总日剂量施用。在某些情况下，伐昔洛韦通过口服施用而施用。
作为另一个例子，更昔洛韦以约10mg/kg的总日剂量施用。更昔洛韦可以以小于10mg/kg(例如，约1mg/kg至约2mg/kg、约2mg/kg至约3mg/kg、约3mg/kg至约4mg/kg、约4mg/kg至约5mg/kg、约5mg/kg至约6mg/kg、约6mg/kg至约7mg/kg、约7mg/kg至约8mg/kg或约8mg/kg至约9mg/kg)的总日剂量施用。在某些情况下，更昔洛韦通过注射(例如，肌肉内注射、静脉内注射或皮下注射)施用。
作为另一个实例，阿昔洛韦以约15mg/kg至约30mg/kg，或约30mg/kg至约45mg/kg的总日剂量施用。阿昔洛韦可以以小于45mg/kg(例如，约5mg/kg至约7.5mg/kg、约7.5mg/kg至约10mg/kg、约10mg/kg至约12.5mg/kg、约12.5mg/kg至约15mg/kg、约15mg/kg至约20mg/kg、约20mg/kg至约25mg/kg、约25mg/kg至约30mg/kg或约30mg/kg至约35mg/kg)的总日剂量施用。在一些情况下，阿昔洛韦通过注射(例如，肌肉内注射、静脉内注射或皮下注射)施用。
作为另一个例子，缬更昔洛韦以约10mg/kg的总日剂量施用。缬更昔洛韦可以以小于10mg/kg(例如，约1mg/kg至约2mg/kg、约2mg/kg至约3mg/kg、约3mg/kg至约4mg/kg、约4mg/kg至约5mg/kg、约5mg/kg至约6mg/kg、约6mg/kg至约7mg/kg、约7mg/kg至约8mg/kg或约8mg/kg至约9mg/kg)的总日剂量施用。在某些情况下，缬更昔洛韦通过注射(例如，肌肉内注射、静脉内注射或皮下注射)施用。
在某些情况下，2'-脱氧鸟苷的合成类似物是局部施用的。适用于局部施用的制剂包括例如皮肤制剂(例如液体、乳膏、凝胶等)和眼科制剂(例如乳膏、液体、凝胶等)。更昔洛韦的局部剂量可以是例如每天5次1滴0.15％制剂，例如用于眼科适应症。阿昔洛韦的局部剂量可以是例如每天6次以足以覆盖皮肤损伤的量施用5％的制剂。碘苷的局部剂量可以是，例如，每4小时应用1滴0.5％软膏或0.1％乳膏。
在某些情况下，2'-脱氧鸟苷的合成类似物以低于10mg/kg体重的剂量静脉内施用。在一些情况下，2'-脱氧-鸟苷的合成类似物的合适静脉内剂量为约1mg/kg体重至约2.5mg/kg体重、约2.5mg/kg体重至约5mg/kg体重、约5mg/kg体重至约7.5mg/kg体重或约7.5mg/kg体重至约10mg/kg体重。
E.公开内容的非限制性方面的示例
单独或与一个或多个其他方面或实施方案组合的上述主题的方面(包括实施方案)可能是有益的。在不限制前述描述的情况下，下文提供了本公开内容的某些非限制性方面。如本领域技术人员在阅读本公开内容时将明显的，各个单独编号的方面中的每一个可以与前面或之后单独编号的方面中的任何一个一起使用或组合。这旨在为方面的所有此类组合提供支持，并且不限于以下明确提供的方面的组合：
方面1.一种RVV，在其基因组中包含：(1)编码变体白细胞介素2(IL-2v)多肽的核苷酸序列，其中与野生型IL-2相比，IL-2v多肽具有减少的不良特性；和(2)编码异源胸苷激酶(TK)多肽的核苷酸序列。
方面2.方面1的RVV，其中牛痘病毒进一步包含使牛痘胸苷激酶缺陷的修饰。
方面3.方面2的牛痘病毒，其中所述修饰导致缺乏J2R表达和/或功能。
方面4.方面1-3中任一项的牛痘病毒，其中所述牛痘病毒是Copenhagen株牛痘病毒。
方面5.方面1-3中任一项的牛痘病毒，其中所述牛痘病毒是WR株牛痘病毒。
方面6.方面1-5中任一项的牛痘病毒，其中所述牛痘病毒包含含有K151E取代的A34R基因。
方面7.方面1-6中任一项的牛痘病毒，其中所述IL-2v多肽包含基于SEQ ID NO：1的IL-2氨基酸序列的氨基酸编号的F42、Y45和L72中的一个或多个的取代。
方面8.方面1-7中任一项的牛痘病毒，其中IL-2v多肽包含基于SEQ ID NO：1的IL-2氨基酸序列的氨基酸编号的F42L、F42A、F42G、F42S、F42T、F42Q、F42E、F42D、F42R或F42K取代。
方面9.方面1-8中任一项的牛痘病毒，其中IL-2v多肽包含基于SEQ ID NO：1的IL-2氨基酸序列的氨基酸编号的Y45A、Y45G、Y45S、Y45T、Y45Q、Y45E、Y45N、Y45D、Y45R或Y45K取代。
方面10.方面1-9中任一项的牛痘病毒，其中IL-2v多肽包含基于SEQ ID NO：1的IL-2氨基酸序列的氨基酸编号的L72G、L72A、L72S、L72T、L72Q、L72E、L72N、L72R或L72K取代。
方面11.方面1-10中任一项的牛痘病毒，其中所述IL-2v多肽包含基于SEQ ID NO：1的IL-2氨基酸序列的氨基酸编号的F42A、Y45A和L72G取代。
方面12.方面1-11中任一项的牛痘病毒，其中所述IL-2v多肽编码核苷酸序列与可调节启动子可操作地连接。
方面13.方面12的牛痘病毒，其中所述可调节启动子受四环素或四环素类似物或衍生物调节。
方面14.一种组合物，其包含：a)方面1-13中任一项的牛痘病毒；b)药学上可接受的赋形剂。
方面15.一种在患有肿瘤的个体中诱导溶瘤的方法，该方法包括向个体施用有效量的方面1-13中任一项的牛痘病毒或方面14的组合物。
方面16.方面15的方法，其中所述施用包括施用单剂量的病毒或组合物。
方面17.方面16的方法，其中所述单剂量包含至少106个噬斑形成单位(pfu)的牛痘病毒。
方面18.方面16的方法，其中所述单剂量包含109至1012pfu的牛痘病毒。
方面19.方面15的方法，其中所述施用包括施用多剂量的牛痘病毒或组合物。
方面20.方面19的方法，其中每隔一天施用所述牛痘病毒或所述组合物。
方面21.方面15-20中任一项的方法，其中每周一次施用所述牛痘病毒或所述组合物。
方面22.方面15-20中任一项的方法，其中每隔一周施用所述牛痘病毒或所述组合物。
方面23.方面15-21中任一项的方法，其中所述肿瘤是脑癌肿瘤、头颈癌肿瘤、食道癌肿瘤、皮肤癌肿瘤、肺癌肿瘤、胸腺癌肿瘤，胃癌肿瘤、结肠癌肿瘤、肝癌肿瘤、卵巢癌肿瘤、子宫癌肿瘤、膀胱癌肿瘤、睾丸癌肿瘤、直肠癌肿瘤、乳腺癌肿瘤或胰腺癌肿瘤。
方面24.方面15-22中任一项的方法，其中所述肿瘤是结肠直肠腺癌。
方面25.方面15-22中任一项的方法，其中所述肿瘤是非小细胞肺癌。
方面26.方面15-22中任一项的方法，其中所述肿瘤是三阴性乳腺癌。
方面27.方面15-22中任一项的方法，其中所述肿瘤是实体瘤。
方面28.方面15-22中任一项的方法，其中所述肿瘤是液体肿瘤。
方面29.方面15-28中任一项的方法，其中所述肿瘤是复发性的。
方面30.方面15-28中任一项的方法，其中所述肿瘤是原发性肿瘤。
方面31.方面15-28中任一项的方法，其中所述肿瘤是转移性的。
方面32.方面15-31中任一项的方法，进一步包括向所述个体施用第二癌症疗法。
方面33.方面32的方法，其中所述第二癌症疗法选自化学疗法、生物疗法、放射疗法、免疫疗法、激素疗法、抗血管疗法、冷冻疗法、毒素疗法、溶瘤病毒疗法、细胞疗法和手术。
方面34.方面32的方法，其中所述第二癌症疗法包括抗PD1抗体或抗PD-L1抗体。
方面35.方面15-34中任一项的方法，其中所述个体是免疫功能低下的。
方面36.方面15-35中任一项的方法，其中所述牛痘病毒或所述组合物的所述施用是肿瘤内的。
方面37.方面15-35中任一项的方法，其中所述牛痘病毒或所述组合物的所述施用是在肿瘤周围的。
方面38.方面15-35中任一项的方法，其中所述牛痘病毒或所述组合物的所述施用是静脉内的。
方面39.方面15-35中任一项的方法，其中所述牛痘病毒或所述组合物的所述施用是动脉内的。
方面40.方面15-35中任一项的方法，其中所述牛痘病毒或所述组合物的所述施用是在膀胱内的。
方面41.方面15-35中任一项的方法，其中所述牛痘病毒或所述组合物的所述施用是鞘内的。
方面42.一种RVV，其在其基因组中包含编码变体白细胞介素2(IL-2v)多肽的核苷酸序列，其中IL-2v多肽包含与野生型IL-2相比提供减少的与CD25的结合的一个或多个氨基酸取代。
方面43.一种RVV，其在其基因组中包含编码变体白细胞介素-2(IL-2v)多肽的核苷酸序列，所述变体白细胞介素-2(IL-2v)多肽包含SEQ ID NO：9，其中牛痘病毒是Copenhagen株牛痘病毒，是牛痘病毒胸苷激酶缺陷型，并且包含含有K151E取代的A34R基因。
方面44.方面43的牛痘病毒，进一步包含信号肽。
方面45.方面44的牛痘病毒，其中所述信号肽包含SEQ ID NO：22。
方面46.一种RVV，其在其基因组中包含含有SEQ ID NO：10的变体白细胞介素-2(IL-2v)核苷酸序列，其中牛痘病毒是Copenhagen株牛痘病毒，是牛痘病毒胸苷激酶缺陷型，并且包含含有K151E取代的A34R基因。
方面47.一种RVV，其在其基因组中包含含有SEQ ID NO：12的变体白细胞介素-2(IL-2v)核苷酸序列，其中牛痘病毒是Copenhagen株牛痘病毒，是牛痘病毒胸苷激酶缺陷型，并且包含含有K151E取代的A34R基因。
方面48.一种组合物，其包含：(i)方面42-47中任一项的牛痘病毒和(ii)药学上可接受的承载体。
方面49.一种RVV，其在其基因组中包含编码变体白细胞介素-2(IL-2v)多肽的核苷酸序列，其中与野生型IL-2相比，IL-2v多肽提供降低的不良生物活性。
方面50.方面1-13中任一项的牛痘病毒或方面14的组合物，用于在患有肿瘤的个体中诱导溶瘤的方法。
方面51.方面1-13中任一项的牛痘病毒或方面14的组合物在制备用于在患有肿瘤的个体中诱导溶瘤的药物中的用途。
F.序列索引
Figure BDA0003812856710000581
Figure BDA0003812856710000591
G.实施例
提供以下实施例的目的是为了说明本发明的某些方面，并不意在限制发明人认为他们的发明的范围，也不意在表示以下实验是全部或唯一进行的实验。已努力确保所用数字(例如数量、温度等)的准确性，但应考虑一些实验误差和偏差。除非另有说明，份数是重量份数，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，压力是大气压或接近大气压。可以使用标准缩写，例如，pl，皮升；s或sec，秒；min，分钟；h或hr，小时；aa，氨基酸；kb，千碱基；bp，碱基对；nt，核苷酸；i.m.，肌肉内注射；i.p.，腹膜内；s.c.，皮下；i.v.，静脉内；i.t.，瘤内；等等。
实施例1：重组牛痘病毒构建体的产生
结合下面提供的实施例生成的某些RVV构建体的选择特征总结在下面的表1中。表1中的每种病毒都具有J2R基因的缺失，除了VV10和VV18具有J2R基因的插入失活。VV27、VV79、VV91-VV96和IGV-121具有编码小鼠IL-2变体(具有F76A、Y79A、L106G取代)的基因，该基因经过密码子优化以在小鼠细胞中表达。VV75和VV101-VV103具有编码人类IL-2变体(具有F62A、Y65A和L92G取代)的基因，该基因经过密码子优化以在人类细胞中表达。
表1.重组牛痘病毒(RVV)构建体的特征
Figure BDA0003812856710000592
Figure BDA0003812856710000601
VV27构建
该病毒基于牛痘的Copenhagen株，并携带在合成的早期晚期启动子和操纵子控制下的编码小鼠IL-2变体的基因。通过在A34R基因中掺入K151E取代，该病毒被改造用于增强细胞外包膜病毒(EEV)的产生。VV27是使用辅助病毒介导的、限制酶引导的同源重组修复和拯救技术构建的。首先，编码小鼠IL-2v(F76A、Y79A、L106G)的基因经过密码子优化以在小鼠细胞中表达并由GeneWiz(South Plainfield，NJ)合成。DNA用BglII/AsiSI消化并插入到同样用BglII/AsiSI消化的Copenhagen J2R同源重组质粒中。通过PCR扩增小鼠IL-2v基因和侧翼左右牛痘同源区以产生同源重组供体片段。BSC-40细胞用辅助病毒Shope Fibroma病毒(SFV)感染一小时，随后用供体扩增子和纯化的牛痘基因组DNA的混合物转染，该DNA先前在J2R区域内进行限制性消化。亲本基因组DNA源自Copenhagen株牛痘病毒，其携带代替天然J2R基因的萤火虫萤光素酶和GFP和A34R基因内的K151E突变(取代)以增强EEV的产生。孵育转染的细胞直至观察到显著的细胞病变效应，并通过3轮冷冻/解冻和超声处理收集总细胞裂解物。裂解物被连续稀释，铺在BSC-40单层上，并用琼脂层覆盖。在荧光显微镜下，经过总共三轮噬斑纯化，分离出GFP阴性噬斑。选择一个噬斑(KR144)在T225烧瓶中的BSC-40细胞中进行中间扩增，然后在20层细胞工厂中在HeLa细胞中进行大规模扩增。通过蔗糖梯度超速离心纯化病毒，并在质量控制测定(包括全基因组下一代测序)中彻底表征。
VV38构建
该病毒基于牛痘的Copenhagen株，并携带在合成的早期晚期启动子和操纵子控制下的编码小鼠IL-2变体的基因。该病毒与VV27相同，只是它携带野生型A34R基因并且不是为增强EEV生产而改造的。VV38是使用辅助病毒介导的、限制酶引导的同源重组修复和拯救技术构建的。BSC-40细胞用SFV辅助病毒感染1-2小时，随后用供体扩增子和先前在J2R区域用AsiSI消化的纯化牛痘基因组DNA的混合物转染。亲本基因组DNA来源于携带萤火虫萤光素酶和GFP代替天然J2R基因的Copenhagen株牛痘病毒。孵育转染的细胞直至观察到显著的细胞病变效应，并通过3轮冷冻/解冻和超声处理收集总细胞裂解物。裂解物被连续稀释，铺在BSC-40单层上，并用琼脂层覆盖。在荧光显微镜下经过总共三轮噬斑纯化，分离出GFP阴性噬斑。选择一个噬斑(LW226)在T225烧瓶中的BSC-40细胞中进行中间扩增，然后在20层细胞工厂中在HeLa细胞中进行大规模扩增。通过蔗糖梯度超速离心纯化病毒，并在质量控制测定(包括全基因组下一代测序)中彻底表征。
VV39构建
该病毒基于牛痘的Western Reserve(WR)株，并携带在合成的早期晚期启动子和操纵子控制下的编码小鼠IL-2变体的基因。VV39是使用辅助病毒介导的、限制酶引导的同源重组修复和拯救技术构建的。BSC-40细胞用SFV辅助病毒感染1-2小时，随后用供体扩增子和先前在J2R区域用AsiSI消化的纯化牛痘基因组DNA的混合物转染。亲本基因组DNA源自WR株牛痘病毒，其携带代替天然J2R基因的萤光素酶-2A-GFP报告基因盒和野生型A34R，其未经工程化以用于增强的EEV生产。孵育转染的细胞直至观察到显著的细胞病变效应，并通过3轮冷冻/解冻和超声处理收集总细胞裂解物。裂解物被连续稀释，铺在BSC-40单层上，并用琼脂层覆盖。在荧光显微镜下，经过总共三轮噬斑纯化，分离出GFP阴性噬斑。选择一个噬斑(LW228)在T225烧瓶中的BSC-40细胞中进行中间扩增，然后在20层细胞工厂中在HeLa细胞中进行大规模扩增。通过蔗糖梯度超速离心纯化病毒(批号#180330)，并在质量控制测定(包括全基因组下一代测序)中彻底表征。
VV79构建
VV79(Copenhagen VV27的WR株等价物)除了添加了A34R K151E取代外，与VV39相同。它是使用辅助病毒介导的同源重组修复和拯救技术构建的，以将K151E突变插入VV39亲本病毒骨架。
VV101构建
VV101是一种基于牛痘病毒Copenhagen(Cop)株的经配备的溶瘤病毒。它与亲本Copenhagen天花疫苗株的不同之处在于四个基因修饰，包括：1)缺失天然牛痘J2R(胸苷激酶)基因，2)在J2R基因座内插入由合成的早期晚期启动子控制的人IL-2变体(hIL-2v)表达盒，3)在J2R基因座内插入由F17启动子控制的单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶变体(TK.007)表达盒，其处于与hIL-2v盒相反的方向，4)病毒A34R基因内的突变，其在A34蛋白的位置151引入赖氨酸到谷氨酸取代(K151E)。VV101是使用辅助病毒介导的同源重组修复和拯救技术构建的。首先，编码HSV TK.007的基因经过密码子优化以用于牛痘病毒的表达，并由Genscript合成。该基因在靶向Copenhagen牛痘的J2R区域的同源重组载体中克隆到F17启动子(PF17)的下游。其次，从纯化的VV27中提取牛痘核酸并与HSV TK.007/J2R同源重组质粒一起转染到Shope FibromaVirus感染的BSC-40细胞中。孵育3天后，通过反复冻融收集裂解物。病毒进行了4轮噬斑纯化，并通过PCR筛选HSV-TK.007的存在。标记为VV93的病毒在HeLa细胞中扩增，通过蔗糖梯度离心纯化，并在包括全基因组下一代测序的质量控制测定中进行了表征。最后，使用如上所述的辅助病毒介导的同源重组修复和拯救技术，通过用编码hIL-2v的基因(针对在人类中的表达进行密码子优化)取代编码小鼠IL-2变体(mIL-2v)的基因从VV93构建VV101。在重组、噬斑纯化和筛选之后，VV101在HeLa细胞中扩增，通过蔗糖梯度离心纯化，并在质量控制测定(包括全基因组下一代测序)中进行了表征。
VV102构建
VV102是一种基于牛痘病毒Copenhagen株的经配备的溶瘤病毒。它与亲本Copenhagen天花疫苗株的不同之处在于四个基因修饰，包括：1)天然牛痘J2R基因的缺失，2)在J2R基因座内插入由合成的早期晚期启动子控制的hIL-2v表达盒，3)在B16R基因座内插入由F17启动子控制的HSV胸苷激酶变体(TK.007)表达盒，取代天然B16R基因的159个碱基，和4)病毒A34R基因内的突变，其在A34蛋白的位置151引入赖氨酸到谷氨酸取代(K151E)。VV102是使用辅助病毒介导的同源重组修复和拯救技术构建的。首先，编码HSVTK.007的基因经过密码子优化以用于牛痘病毒的表达，并由Genscript合成。该基因在同源重组载体中克隆到F17启动子(PF17)的下游，该载体靶向Copenhagen牛痘的B16R区域。其次，从纯化的VV27(在IGNT-001中描述)中提取牛痘核酸，并与HSV TK.007/B16同源重组质粒一起转染到Shope Fibroma病毒感染的BSC-40细胞中。孵育3天后，通过反复冻融收集裂解物。病毒经过4轮噬斑纯化，并通过PCR筛选HSV TK.007的存在。标记为VV91的病毒在HeLa细胞中扩增，通过蔗糖梯度离心纯化，并在包括全基因组下一代测序的质量控制测定中进行了表征。最后，使用如上的辅助病毒介导的同源重组修复和拯救技术，通过用编码hIL-2v的基因(针对在人类中的表达进行了密码子优化)取代编码mIL-2v的基因从VV91构建VV102。在重组、噬斑纯化和筛选之后，VV102在HeLa细胞中扩增，通过蔗糖梯度离心纯化，并在质量控制测定中进行了表征，包括全基因组下一代测序。
VV103构建
VV103是一种基于牛痘病毒Copenhagen株的经配备的溶瘤病毒。它与亲本Copenhagen天花疫苗株的不同之处在于四个基因修饰，包括：1)天然牛痘J2R基因的缺失，2)在J2R基因座内插入由合成的早期晚期启动子控制的hIL-2v表达盒，3)在B16R基因座内插入由F17启动子控制的HSV胸苷激酶变体(TK.007)表达盒，取代整个天然B16R基因，和4)病毒A34R基因内的突变，其在A34蛋白的位置151引入赖氨酸到谷氨酸取代(K151E)。VV103是使用辅助病毒介导的同源重组修复和拯救技术构建的。首先，编码HSV TK.007的基因经过密码子优化以用于牛痘病毒的表达，并由Genscript合成。该基因在同源重组载体中克隆到F17启动子(PF17)的下游，该载体靶向Copenhagen牛痘的B16R区域。其次，从纯化的VV27(在IGNT-001中描述)中提取牛痘核酸，并与HSV TK.007/B16同源重组质粒一起转染到Shope Fibroma病毒感染的BSC-40细胞中。孵育3天后，通过反复冻融收集裂解物。病毒经过4轮噬斑纯化，并通过PCR筛选HSV TK.007的存在。标记为VV96的病毒在HeLa细胞中扩增，通过蔗糖梯度离心纯化，并在包括全基因组下一代测序的质量控制分析中进行了表征。最后，使用如上的辅助病毒介导的同源重组修复和拯救技术，通过用编码hIL-2v的基因(针对在人类中的表达进行了密码子优化)取代编码mIL-2v的基因从VV96构建VV103。在重组、噬斑纯化和筛选之后，VV103在HeLa细胞中扩增，通过蔗糖梯度离心纯化，并在包括全基因组下一代测序的质量控制测定中表征。
VV94构建
VV94是一种基于小鼠适应的Western Reserve(WR)牛痘病毒株的经配备的溶瘤病毒。它与亲本WR毒株的不同之处在于四个遗传修饰，包括：1)天然牛痘J2R基因的缺失，2)在J2R基因座内以正向插入由合成的早期晚期启动子控制的mIL-2v表达盒，3)在J2R基因座内以反向插入由F17启动子控制的HSV胸苷激酶变体(TK.007)表达盒，和4)在病毒A34R基因内的突变，其在A34蛋白的位置151引入赖氨酸到谷氨酸取代(K151E)。VV94是使用辅助病毒介导的同源重组修复和拯救技术构建的。首先，编码HSV TK.007的基因经过密码子优化以用于牛痘病毒的表达，并由Genscript合成。该基因被克隆到靶向WR J2R区域的同源重组载体中F17启动子(PF17)的下游。其次，从纯化的VV79中提取牛痘核酸并与HSVTK.007/J2R同源重组扩增子一起转染到感染了Shope Fibroma病毒的BSC-40细胞中。孵育3天后，通过反复冻融收集裂解物。病毒经过4轮噬斑纯化，并通过PCR筛选HSV-TK.007的存在。标记为VV94的病毒首先在BSC-40细胞中扩增，然后在HeLa细胞中扩增，通过蔗糖梯度离心纯化，并在包括全基因组下一代测序的质量控制测定中进行表征。
IGV-121构建
IGV-121是一种基于小鼠适应的牛痘病毒WR株的经配备的溶瘤病毒。它与亲本WR株的不同之处在于四种遗传修饰，包括：1)天然牛痘J2R基因的缺失，2)在J2R基因座内插入由合成的早期晚期启动子控制的mIL-2v变体表达盒，3)在B15R(也称为WR197)和B17L(WR198)之间的基因间区域中插入由F17启动子控制的HSV胸苷激酶变体(TK.007)表达盒，以及4)病毒A34R基因内的突变，其在A34蛋白的位置151引入赖氨酸到谷氨酸取代(K151E)。IGV-121是使用辅助病毒介导的同源重组修复和拯救技术构建的。首先，编码HSV TK.007的基因经过密码子优化以用于牛痘病毒的表达，并由Genscript合成。该基因被克隆到一个同源重组载体中F17启动子(PF17)的下游，该载体靶向牛痘WR株的B15R和B17L之间的基因间区域。其次，从纯化的VV79(J2R被小鼠IL-2v替换和具有A34RK151E突变的WR株)中提取牛痘核酸，并与HSV TK.007/B15R-B17L同源重组质粒一起转染到Shope Fibroma病毒感染的Vero-B4细胞中。孵育2天后，通过反复冷冻、解冻和超声处理收集裂解物。病毒在BSC-40细胞上经过3轮噬斑纯化。该病毒标记为IGV-121，在HeLaS3细胞中扩增，通过蔗糖梯度离心纯化，并在包括全基因组下一代测序的质量控制测定中进行了表征。图1提供VV91、VV93和VV96的全基因组示意图。图2提供了VV94和IGV-121的全基因组的示意图，和图3提供VV101-VV103的全基因组示意图。
实施例2：通过蛋白质印迹证明病毒感染细胞中重组牛痘病毒的IL-2v表达
将HeLa细胞以6e5个细胞/孔铺板在6孔板中的2mL培养基中，并在大约24小时后，在培养物中用病毒以MOI＝3感染24小时。随后收获每个孔的细胞并在200μL Laemmli缓冲液中裂解，然后用milliQ水1:1稀释。在含有还原剂和1xNuPage LDS样品缓冲液的Tris缓冲盐水(TBS)中将12μL样品制备成最终体积为20μL，然后在95℃下孵育5分钟并加载到NuPage4-12％Bis-Tris凝胶上。使用1xMES运行缓冲液在200V下进行凝胶电泳30分钟。使用iBlot装置将蛋白质转移到PVDF膜上，并使用iBlot装置进行蛋白质印迹。为了检测mIL-2v，使用以下抗体：1:2000稀释的抗IL-2一抗(Abcam，ab11510)，1:1000稀释的山羊抗大鼠IgG-HRP二抗(Invitrogen，#629526)。为了检测hIL-2v，使用以下抗体：1:500稀释的抗IL-2一抗(Novus Biologicals，NBP2-16948)，1:2000稀释的小鼠抗兔IgG-HRP二抗(Pierce，#31460)。随后将TMB底物添加到膜中以显现条带。用水冲洗膜，干燥并扫描。在用重组溶瘤牛痘病毒感染细胞后的mIL-2v表达分析结果提供在图4中。在用重组溶瘤牛痘病毒感染细胞后的hIL-2v表达分析结果提供在图5中。
实施例3：通过RT-qPCR证明病毒感染细胞中重组牛痘病毒的HSV TK.007表达
将HeLa细胞以7e4个细胞/孔接种在6孔板中的2mL培养基中，并在大约72小时后，在培养物中用病毒以MOI＝3感染18小时。随后收获每个孔的细胞并进行处理以用于使用RNeasy Plus通用小型试剂盒(Qiagen，#73404)进行RNA提取。使用高容量cDNA反转录试剂盒(applied Biosystems，#4368814)逆转录500ng总RNA。在用于qPCR之前将cDNA1:10稀释，以使用重组病毒中编码的HSV TK.007转基因的特异性引物和探针和PrimeTime基因表达预混液(IDT，#1055772)分析HSV TK.007mRNA表达水平。PCR在ViiA7仪器(AppliedBiosystems)上进行。含有HSV TK.007cDNA序列的质粒DNA被用作标准品，每个测试样品中的拷贝数/μL由标准曲线确定。在用重组溶瘤牛痘病毒感染细胞后的HSV TK.007表达分析的结果提供在图6中。
实施例4：在携带MC38肿瘤的C57BL/6小鼠中的重组溶瘤牛痘病毒活性(表达mIL-2v的Cop病毒)
将雌性C57BL/6小鼠(8-10周龄)在右上后侧腹皮下(SC)植入5e5个MC38肿瘤细胞。MC38是鼠结肠腺癌细胞系。参见，例如Cancer Research(1975)vol.35，pp.2434-2439。肿瘤细胞植入后11天，根据肿瘤体积将小鼠随机分为不同的治疗组(每组平均肿瘤体积约50mm3；N＝18只/组)。在植入后第12天，直接向肿瘤注射60□L媒介物(30mM Tris，10％蔗糖，pH8.0)或含有5e7个噬斑形成单位(pfu)的重组Copenhagen(Cop)牛痘病毒变体的60□L媒介物。每天观察荷瘤小鼠，每两周测量一次肿瘤体积和体重，直到小鼠因i)肿瘤体积超过1400mm3，ii)体重减轻≥20％，或iii)健康状况严重下降而被人道处死。小鼠组如下处理：
i)组仅媒介物；
ii)组VV16：携带A34R-K151E突变(氨基酸取代)并配备萤光素酶和绿色荧光蛋白(Luc-2A-GFP)双报告因子盒的Cop牛痘病毒；
iii)组VV27：携带A34R-K151E取代并配备mIL-2v转基因的Cop牛痘病毒；
iv)组VV91：携带A34R-K151E取代、配备mIL-2v转基因并编码HSV TK.007(B16R插入，正向)的Cop牛痘病毒；
v)组VV93：携带A34R-K151E取代、配备鼠mIL-2v)转基因并编码HSV TK.007(J2R插入，反向)的Cop牛痘病毒；或者
vi)组VV96：携带A34R-K151E取代、配备mIL-2v转基因并编码HSV TK.007(B16R插入，反向)的Cop牛痘病毒。
组(i)-(vi)的肿瘤生长曲线之间的比较(图7A-7G)揭示了所有测试病毒在连续多天对肿瘤生长产生统计学上显著的抑制作用，所有mIL-2v配备的Cop牛痘病毒(VV27、VV91、VV93和VV96)与对照病毒(VV16)相比，在连续多天对肿瘤生长产生了统计学上显著的抑制作用(图8，ANCOVA结果)，并且将VV27(仅mIL-2v)与VV91、VV93或VV96(均带有mIL-2v和HSVTK.007)进行比较时没有观察到统计学上的显著差异。
每个治疗组(N＝18只/组)中动物的存活也被评估到肿瘤植入后第41天(图9)。与媒介物对照相比，未配备的牛痘对照(VV16)没有显著提高存活(对数秩/Mantel-Cox检验，p＝0.133)。然而，用经配备的牛痘病毒变体VV27、VV91、VV93和VV96治疗的小鼠显示出比报告转基因配备的牛痘对照(VV16)治疗组具有统计学意义的平均生存优势(对数秩/Mantel-Cox检验，p＝0.009、0.006、<0.0001和0.013)。
除了监测肿瘤生长抑制和存活，在注射媒介物或重组Cop牛痘病毒后24小时和48小时从荷瘤小鼠收集血清以评估循环IL-2水平。在接受瘤内注射后24小时和48小时从每个治疗组收集的血清中的循环IL-2水平通过ELISA定量(图10)。在大多数用配备mIL-2v的Cop牛痘病毒变体(VV27、VV91、VV93和VV96)治疗的动物的血清中检测到可测量水平的IL-2，而在来自媒介物或其他Cop牛痘病毒(VV16)组的任何动物中观察到背景水平的IL-2。后一结果表明瘤内注射缺乏mIL-2v转基因的Cop牛痘病毒(至少在测试剂量水平下)不足以诱导治疗动物血清中循环IL-2水平的增加。因此，在用配备mIL-2v的Cop牛痘病毒治疗的小鼠血清中观察到的升高的水平应该表明瘤内注射后转基因介导的表达。
实施例5：在携带Lewis肺癌(LLC)肿瘤的C57BL/6小鼠中配备mIL-2v的牛痘病毒活性(表达mIL-2v的Cop病毒)
将雌性C57BL/6小鼠(8-10周龄)在左上后侧腹皮下(SC)植入1e5个LLC肿瘤细胞。肿瘤细胞植入12天后，根据肿瘤体积将小鼠随机分为不同的治疗组(每组平均肿瘤体积约50mm3；N＝20只/组)。在植入后第13天，直接向肿瘤注射60□L媒介物(30mM Tris，10％蔗糖，pH8.0)或含有5e7个噬斑形成单位(pfu)的重组Copenhagen(Cop)牛痘病毒变体的60□L媒介物。每天观察荷瘤小鼠，每两周测量一次肿瘤体积和体重，直到小鼠因i)肿瘤体积超过1400mm3，ii)体重减轻≥20％，或iii)健康状况严重下降而被人道处死。小鼠组如下处理：
i)组仅媒介物；
ii)组VV16：携带A34R-K151E突变(氨基酸取代)并配备萤光素酶和绿色荧光蛋白(Luc-2A-GFP)双报告因子盒的Cop牛痘病毒；
iii)组VV27：携带A34R-K151E取代并配备mIL-2v转基因的Cop牛痘病毒；
iv)组VV91：携带A34R-K151E取代、配备mIL-2v转基因并编码HSV TK.007(B16R插入，正向)的Cop牛痘病毒；
v)组VV93：携带A34R-K151E取代、配备mIL-2v转基因并编码HSV TK.007(J2R插入，反向)的Cop牛痘病毒；或者
vi)组VV96：携带A34R-K151E取代、配备mIL-2v转基因并编码HSV TK.007(B16R插入，反向)的Cop牛痘病毒。
组(i)-(vi)的肿瘤生长曲线之间的比较(图11A-11F)表明，所有测试病毒都对肿瘤生长产生抑制作用，其中，配备mIL-2v的Cop牛痘病毒(VV27、VV91、VV93和VV96)与对照病毒(VV16)相比对肿瘤生长产生更显著的抑制作用。由于肿瘤溃疡和相关的健康状况下降限制了与不同病毒变体相关的肿瘤生长抑制的统计分析，许多研究中的动物被人道地处死。然而，对个体动物的分析表明，分别用VV91、VV93或VV96治疗后，7/20、2/20和1/20的肿瘤在植入后第30天<50mm3或完全消退，在其他治疗组中没有观察到小肿瘤或完全消退。
除了监测肿瘤生长抑制和存活，在注射媒介物或重组Cop牛痘病毒后24、48和72小时从荷瘤小鼠收集血清以评估循环IL-2水平。在接受瘤内注射后的这些时间点从每个治疗组收集的血清中的循环IL-2水平通过ELISA定量(图12)。在大多数用配备mIL-2v的Cop牛痘病毒变体(VV27、VV91、VV93和VV96)治疗的动物的血清中检测到可测量水平的IL-2，而在来自媒介物或其他Cop牛痘病毒(VV16)组的任何动物中观察到背景水平的IL-2。后一结果表明瘤内注射缺乏mIL-2v转基因的Cop牛痘病毒(至少在测试剂量水平下)不足以诱导治疗动物血清中循环IL-2水平的增加。因此，在用配备mIL-2v的Cop牛痘病毒治疗的小鼠血清中观察到的升高的水平应该表明瘤内注射后转基因介导的表达。
实施例6：在携带MC38肿瘤的C57BL/6小鼠中使用重组溶瘤牛痘病毒(表达mIL-2v的WR病毒)的单次IV病毒疗法
C57BL/6雌性小鼠在左侧腹部皮下(SC)植入5e5个MC38肿瘤细胞。肿瘤细胞植入十天后，根据肿瘤体积将小鼠随机分为不同的治疗组(每组平均肿瘤体积约50mm3；N＝15只/组)。在肿瘤细胞植入后第11天，给小鼠静脉内(IV)注射100□L媒介物(30mM Tris，10％蔗糖，pH8.0)或100□L含有5e7 pfu重组WR牛痘病毒的媒介物。每天观察荷瘤小鼠，每两周测量一次肿瘤体积和体重，直到小鼠因i)肿瘤体积超过1400mm3，ii)体重减轻≥20％，iii)健康状态严重受损或iv)研究终止而被人道处死。
显示为每种测试病毒的组平均值(图13A)或显示为每个测试组中的个体小鼠(图13B-13F)的肿瘤生长曲线分析揭示了一个重要发现。与媒介物和报告因子配备的WR病毒(VV17)治疗相比，IV施用mIL-2v转基因配备的WR病毒(单独编码或与HSV TK.007一起编码mIL-2v)导致MC38肿瘤生长的统计学显著抑制。VV79和IGV-121诱导的肿瘤生长抑制之间没有统计学上的显著差异，但是在VV79和VV94之间检测到统计学上的显著差异(图14，ANCOVA结果)。
相同测试病毒的存活结果显示出与上述肿瘤生长抑制报告非常相似的结果。这包括与相应的配备Luc-GFP报告因子的WR病毒相比，在HSV TK.007存在或不存在的情况下，与配备mIL-2v转基因的WR病毒相关的统计学上优越的组存活率(图15)。总体而言，配备mIL-2v转基因的WR病毒变体的IV递送被证明是MC38SC肿瘤模型中的有效抗肿瘤疗法，并证明了病毒单次治疗施用的效力。
在IV病毒剂量后72小时(第14天)，还从每个测试组中的携带MC38肿瘤的小鼠收集血清，用于评估循环IL-2水平。与测试配备mIL-2v转基因的病毒的其他研究一致，在所有施用配备mIL-2v转基因的WR病毒的测试组中检测到升高的和统计学上显著的IL-2血清水平(图16)。
实施例7：在携带LLC肿瘤的C57BL/6小鼠中使用重组溶瘤牛痘病毒(表达mIL-2v的WR病毒)的单次IV病毒疗法
在这组实验中，C57BL/6雌性小鼠在右侧腹部皮下(SC)植入1e5个LLC肿瘤细胞。肿瘤细胞植入12天后，根据肿瘤体积将小鼠随机分为不同的治疗组(每组平均肿瘤体积约50mm3；N＝20只/组)。在第14天，给小鼠静脉内(IV)注射100□L媒介物(30mM Tris，10％蔗糖，pH8.0)或100□L含有5e7 pfu重组WR牛痘病毒变体的媒介物。每天观察荷瘤小鼠，每两周测量一次肿瘤体积和体重，直到小鼠因i)肿瘤体积超过2000mm3，ii)体重减轻≥20％，iii)健康状态严重受损或iv)研究终止而被人道处死。
显示为每种测试病毒的组平均值(图17A)或每个测试组中的个体小鼠(图17B-17D)的肿瘤生长曲线的分析证明：与报告转基因配备的WR病毒治疗相比，IV施用编码HSVTK.007和A34R-K151E突变的mIL-2v转基因配备的WR病毒(IGV-121)导致LLC肿瘤生长的统计学显著抑制(图18，ANCOVA结果)。
相同测试病毒的存活结果显示出与上述肿瘤生长抑制报告非常相似的结果。这包括与相应的配备Luc-GFP报告因子的WR病毒相比，与配备mIL-2v和HSV TK.007转基因的WR病毒相关的统计学上优越的组存活率(图19)。总体而言，配备mIL-2v转基因的WR病毒变体的IV递送被证明是LLC SC肿瘤模型中的有效抗肿瘤疗法，并证明了单次病毒治疗施用的效力。
实施例8：在携带MC38肿瘤的C57BL/6小鼠中的重组溶瘤牛痘病毒(表达mIL-2v或hIL-2v的Cop病毒)活性
将雌性C57BL/6小鼠(8-10周龄)在右上后侧腹皮下(SC)植入5e5个MC38肿瘤细胞。肿瘤细胞植入十天后，根据肿瘤体积将小鼠随机分为不同的治疗组(每组平均肿瘤体积约50mm3；N＝20只/组)。在植入后第11天，直接向肿瘤注射60□L媒介物(30mM Tris，10％蔗糖，pH8.0)或含有5e7个或2e8个噬斑形成单位(pfu)的重组Copenhagen(Cop)牛痘病毒变体的60□L媒介物。每天观察荷瘤小鼠，每两周测量一次肿瘤体积和体重，直到小鼠因i)肿瘤体积超过1400mm3，ii)体重减轻≥20％，或iii)健康状况严重下降而被人道处死。小鼠组如下处理：
i)组仅媒介物；
ii)组2e8 pfu剂量水平的VV7：配备萤光素酶和绿色荧光蛋白(Luc-2A-GFP)双报告盒的Cop牛痘病毒；
iii)组5e7 pfu剂量水平的VV91：携带A34R-K151E取代、配备鼠白细胞介素2变体(mIL-2v)转基因并编码HSV TK.007(B16R插入，正向)的Cop牛痘病毒；
iv组)2e8 pfu剂量水平的VV91：携带A34R-K151E取代、配备鼠白细胞介素2变体(mIL-2v)转基因并编码HSV TK.007(B16R插入，正向)的Cop牛痘病毒；
v)组VV102：以5e7 pfu剂量水平：携带A34R-K151E取代、配备人白细胞介素2变体(hIL-2v)转基因并编码HSV TK.007(B16R插入，正向)的Cop牛痘病毒；
vi)组2e8 pfu剂量水平的VV102：携带A34R-K151E取代、配备人白细胞介素2变体(hIL-2v)转基因并编码HSV TK.007(B16R插入，正向)的Cop牛痘病毒；
vii)组5e7 pfu剂量水平的VV10：配备小鼠GM-CSF和LacZ报告因子转基因的Cop牛痘病毒；或者
viii)组2e8 pfu剂量水平的VV10：配备小鼠GM-CSF和LacZ报告因子转基因的Cop牛痘病毒；
(i)-(viii)组的肿瘤生长曲线之间的比较(图20A-20I)揭示了所有测试病毒在连续多天对肿瘤生长产生统计学上显著的抑制作用，并且与小鼠GM-CSF配备的Cop牛痘病毒(VV10)相比，小鼠和人IL-2v配备的Cop牛痘病毒(分别为VV91和VV102)在连续多天对肿瘤生长产生统计学上显著的抑制作用(图21，ANCOVA结果)。在比较VV91(mIL-2v和HSVTK.007)与VV102(hIL-2v和HSV TK.007)诱导的肿瘤生长抑制作用时，没有观察到统计学上的显著差异。
每个治疗组(N＝20只/组)的动物存活率也被评估到肿瘤植入后第42天(图22)。在这种情况下，用VV91和VV102治疗的小鼠与媒介物、VV7和VV10治疗组相比显示出统计学上显著的平均存活优势(对于来自对数秩/Mantel-Cox检验的P值，参见图22中的表格)。
除了监测肿瘤生长抑制和存活，在注射媒介物或重组Cop牛痘病毒后24小时从荷瘤小鼠收集血清以评估循环IL-2水平。在接受瘤内注射后24小时从每个治疗组收集的血清中的循环小鼠IL-2和人IL-2水平通过ELISA定量(分别为图23和图24)。在大多数用配备IL-2v的Cop牛痘病毒变体(VV91和VV102)治疗的动物的血清中检测到可测量的IL-2水平，而在来自媒介物或其他Cop牛痘病毒(VV7和VV10)组的任何动物中都观察到了IL-2的背景水平。值得注意的是，小鼠IL-2水平显著升高仅在接受表达mIL-2v的病毒(VV91)的小鼠血清中检测到，而人IL-2水平显著升高仅在接受表达hIL-2v的病毒(VV102)的小鼠血清中检测到。因此，在用配备IL-2v的Cop牛痘病毒治疗的小鼠血清中观察到的升高的水平应该表明瘤内注射后转基因介导的表达。
实施例9：携带HCT-116肿瘤的裸鼠中的重组溶瘤牛痘病毒(表达hIL-2v的Cop病毒)活性
在雌性裸鼠的右侧腹皮下(SC)植入5e6个HCT-116肿瘤细胞。肿瘤细胞植入后8天，根据肿瘤体积将小鼠随机分为不同的治疗组(每组平均肿瘤体积约50mm3；N＝20只/组)。在肿瘤细胞植入后第9天，给小鼠静脉内(IV)注射100□L仅媒介物或含有次优剂量(3e5 pfu)重组溶瘤Cop牛痘病毒的媒介物。每天观察荷瘤小鼠，每两周测量一次肿瘤体积和体重，直到小鼠因i)肿瘤体积超过1400mm3，ii)体重减轻≥20％，iii)健康状态严重受损或iv)研究终止而被人道处死。小鼠组如下处理：
i)组仅媒介物；
ii)组VV90：携带A34R-K151E突变(氨基酸取代)的Cop牛痘病毒，在缺失的J2R基因区域中没有插入转基因；
iii)组VV27：携带A34R-K151E取代并配备鼠白细胞介素2变体(mIL-2v)转基因的Cop牛痘病毒(VV27)；
iv)组VV91：携带A34R-K151E取代、配备鼠白细胞介素2变体(mIL-2v)转基因并编码HSV TK.007(B16R插入，正向)的Cop牛痘病毒；
v)组VV93：携带A34R-K151E取代、配备鼠白细胞介素2变体(mIL-2v)转基因并编码HSV TK.007(J2R插入，反向)的Cop牛痘病毒；或者
vi)组VV96：携带A34R-K151E取代、配备鼠白细胞介素2变体(mIL-2v)转基因并编码HSV TK.007(B16R插入，反向)的Cop牛痘病毒。
(i)-(vi)组的肿瘤生长曲线之间的比较(图25)显示，所有测试病毒在人异种移植肿瘤中连续多天对肿瘤生长产生统计学上显著的抑制作用。
在涉及如本文的治疗方法的实施方案中，此类实施方案也是用于该治疗的其他实施方案，或者备选地用于制造用于该治疗的药物。
尽管已经参照其具体实施方案描述了本发明，但是本领域技术人员应该理解，在不脱离本发明的真实精神和范围的情况下，可以进行各种改变，并且可以进行等效取代。此外，可以进行许多修改以使特定情况、材料、物质组合物、工艺、一个或多个工艺步骤适应本发明的目的、精神和范围。所有这些修改都旨在落入所附权利要求书的范围内。
序列表
<110> 辉瑞大药厂（Pfizer Inc.）
Binder, Joseph J
Eisenbraun, Michael D
Hanahan, Douglas
Lees, Clare
Maruri Avidal, Liliana
Limsirichai, Prajit
<120> 重组牛痘病毒
<130> PC072576A
<160> 28
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 133
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 2
<211> 507
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 2
atgtacagca tgcagctggc cagctgcgtg acactgaccc tcgtgctgct ggtgaacagc 60
gctcctacct cctccagcac cagcagcagc accgctgagg cccagcagca gcagcagcaa 120
cagcaacagc agcaacaaca tttagaacag ctgctgatgg atttacaaga actgctgtct 180
cgtatggaga actatcgtaa tttaaagctg cctcgtatgc tgaccgccaa gttcgcttta 240
cccaagcaag ctacagagct gaaggattta cagtgtttag aggacgagct gggccctctg 300
aggcatgtgc tggacggcac ccagagcaag agcttccagc tggaggacgc cgagaacttt 360
atcagcaaca ttcgtgtgac cgtggtgaag ctgaagggca gcgacaacac cttcgagtgc 420
cagttcgacg acgagagcgc cacagtggtg gactttttaa gaaggtggat cgccttctgc 480
cagtccatca tcagcaccag cccccag 507
<210> 3
<211> 169
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 3
Met Tyr Ser Met Gln Leu Ala Ser Cys Val Thr Leu Thr Leu Val Leu
1 5 10 15
Leu Val Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Ser Ser Ser Thr Ala
20 25 30
Glu Ala Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln His Leu
35 40 45
Glu Gln Leu Leu Met Asp Leu Gln Glu Leu Leu Ser Arg Met Glu Asn
50 55 60
Tyr Arg Asn Leu Lys Leu Pro Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Leu
65 70 75 80
Pro Lys Gln Ala Thr Glu Leu Lys Asp Leu Gln Cys Leu Glu Asp Glu
85 90 95
Leu Gly Pro Leu Arg His Val Leu Asp Gly Thr Gln Ser Lys Ser Phe
100 105 110
Gln Leu Glu Asp Ala Glu Asn Phe Ile Ser Asn Ile Arg Val Thr Val
115 120 125
Val Lys Leu Lys Gly Ser Asp Asn Thr Phe Glu Cys Gln Phe Asp Asp
130 135 140
Glu Ser Ala Thr Val Val Asp Phe Leu Arg Arg Trp Ile Ala Phe Cys
145 150 155 160
Gln Ser Ile Ile Ser Thr Ser Pro Gln
165
<210> 4
<211> 1960
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 4
gattacgacg tgctaatcta gcgtgtgaag acgataaatt aatgatctat ggattaccat 60
ggatgacaac tcaaacatct gcgttatcaa taaatagtaa accgatagtg tataaagatt 120
gtgcaaagct tttgcgatca ataaatggat cacaaccagt atctcttaac gatgttcttc 180
gcagatgatg attcattttt taagtatttg gctagtcaag atgatgaatc ttcattatct 240
gatatattgc aaatcactca atatctagac tttctgttat tattattgat ccaatcaaaa 300
aataaattag aagccgtggg tcattgttat gaatctcttt cagaggaata cagacaattg 360
acaaaattca cagactctca agattttaaa aaactgttta acaaggtccc tattgttaca 420
gatggaaggg tcaaacttaa taaaggatat ttgttcgact ttgtgattag tttgatgcga 480
ttcaaaaaag aatcctctct agctaccacc gcaatagatc ctattagata catagatcct 540
cgtcgcgata tcgcattttc taacgtgatg gatatattaa agtcgaataa agtgaacaat 600
aattaattct ttattgtcat catgaacggg cgcgcctata aaaattgaaa ttttattttt 660
tttttttgga atataaatat ccctatcagt gatagagatc tccctatcag tgatagagag 720
ccaccatgta cagcatgcag ctggccagct gcgtgacact gaccctcgtg ctgctggtga 780
acagcgctcc tacctcctcc agcaccagca gcagcaccgc tgaggcccag cagcagcagc 840
agcaacagca acagcagcaa caacatttag aacagctgct gatggattta caagaactgc 900
tgtctcgtat ggagaactat cgtaatttaa agctgcctcg tatgctgacc gccaagttcg 960
ctttacccaa gcaagctaca gagctgaagg atttacagtg tttagaggac gagctgggcc 1020
ctctgaggca tgtgctggac ggcacccaga gcaagagctt ccagctggag gacgccgaga 1080
actttatcag caacattcgt gtgaccgtgg tgaagctgaa gggcagcgac aacaccttcg 1140
agtgccagtt cgacgacgag agcgccacag tggtggactt tttaagaagg tggatcgcct 1200
tctgccagtc catcatcagc accagccccc agtaatgagc gatcgcgtgt agaaagtgtt 1260
acatcgactc ataatattat attttttatc taaaaaacta aaaataaaca ttgattaaat 1320
tttaatataa tacttaaaaa tggatgttgt gtcgttagat aaaccgttta tgtattttga 1380
ggaaattgat aatgagttag attacgaacc agaaagtgca aatgaggtcg caaaaaaact 1440
gccgtatcaa ggacagttaa aactattact aggagaatta ttttttctta gtaagttaca 1500
gcgacacggt atattagatg gtgccaccgt agtgtatata ggatcggctc ctggtacaca 1560
tatacgttat ttgagagatc atttctataa tttaggaatg attatcaaat ggatgctaat 1620
tgacggacgc catcatgatc ctattctaaa tggattgcgt gatgtgactc tagtgactcg 1680
gttcgttgat gaggaatatc tacgatccat caaaaaacaa ctgcatcctt ctaagattat 1740
tttaatttct gatgtaagat ccaaacgagg aggaaatgaa cctagtacgg cggatttact 1800
aagtaattac gctctacaaa atgtcatgat tagtatttta aaccccgtgg catctagtct 1860
taaatggaga tgcccgtttc cagatcaatg gatcaaggac ttttatatcc cacacggtaa 1920
taaaatgtta caaccttttg ctccttcata ttcagctgaa 1960
<210> 5
<211> 1954
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 5
gattacgacg tgctaatcta gcgtgtgaag acgataaatt aatgatctat ggattaccat 60
ggatgacaac tcaaacatct gcgttatcaa taaatagtaa accgatagtg tataaagatt 120
gtgcaaagct tttgcgatca ataaatggat cacaaccagt atctcttaac gatgttcttc 180
gcagatgatg attcattttt taagtatttg gctagtcaag atgatgaatc ttcattatct 240
gatatattgc aaatcactca atatctagac tttctgttat tattattgat ccaatcaaaa 300
aataaattag aagccgtggg tcattgttat gaatctcttt cagaggaata cagacaattg 360
acaaaattca cagactttca agattttaaa aaactgttta acaaggtccc tattgttaca 420
gatggaaggg tcaaacttaa taaaggatat ttgttcgact ttgtgattag tttgatgcga 480
ttcaaaaaag aatcctctct agctaccacc gcaatagatc ctgttagata catagatcct 540
cgtcgcaata tcgcattttc taacgtgatg gatatattaa agtcgaataa agtgaacaat 600
aattaattct ttattgtcat catgaacgta taaaaattga aattttattt tttttttttg 660
gaatataaat atccctatca gtgatagaga tctccctatc agtgatagag agccaccatg 720
tacagcatgc agctggccag ctgcgtgaca ctgaccctcg tgctgctggt gaacagcgct 780
cctacctcct ccagcaccag cagcagcacc gctgaggccc agcagcagca gcagcaacag 840
caacagcagc aacaacattt agaacagctg ctgatggatt tacaagaact gctgtctcgt 900
atggagaact atcgtaattt aaagctgcct cgtatgctga ccgccaagtt cgctttaccc 960
aagcaagcta cagagctgaa ggatttacag tgtttagagg acgagctggg ccctctgagg 1020
catgtgctgg acggcaccca gagcaagagc ttccagctgg aggacgccga gaactttatc 1080
agcaacattc gtgtgaccgt ggtgaagctg aagggcagcg acaacacctt cgagtgccag 1140
ttcgacgacg agagcgccac agtggtggac tttttaagaa ggtggatcgc cttctgccag 1200
tccatcatca gcaccagccc ccagtaatga gcgatcgcgt gtagaaagtg ttacatcgac 1260
tcataatatt atatttttta tctaaaaaac taaaaataaa cattgattaa attttaatat 1320
aatacttaaa aatggatgtt gtgtcgttag ataaaccgtt tatgtatttt gaggaaattg 1380
ataatgagtt agattacgaa ccagaaagtg caaatgaggt cgcaaaaaaa ctgccgtatc 1440
aaggacagtt aaaactatta ctaggagaat tattttttct tagtaagtta cagcgacacg 1500
gtatattaga tggtgccacc gtagtgtata taggatctgc tcccggtaca catatacgtt 1560
atttgagaga tcatttctat aatttaggag tgatcatcaa atggatgcta attgacggcc 1620
gccatcatga tcctatttta aatggattgc gtgatgtgac tctagtgact cggttcgttg 1680
atgaggaata tctacgatcc atcaaaaaac aactgcatcc ttctaagatt attttaattt 1740
ctgatgtgag atccaaacga ggaggaaatg aacctagtac ggcggattta ctaagtaatt 1800
acgctctaca aaatgtcatg attagtattt taaaccccgt ggcgtctagt cttaaatgga 1860
gatgcccgtt tccagatcaa tggatcaagg acttttatat cccacacggt aataaaatgt 1920
tacaaccttt tgctccttca tattcagctg aaat 1954
<210> 6
<211> 5869
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 6
tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg 60
cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc 120
actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt 180
gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc 240
ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa 300
acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc 360
ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg 420
cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc 480
tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc 540
gtcttgagtc caacacggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca 600
ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact 660
acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg 720
gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt 780
ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct 840
tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga 900
gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa 960
tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac 1020
ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcggc gtaatgctct 1080
gccagtgtta caaccaatta accaattctg attagaaaaa ctcatcgagc atcaaatgaa 1140
actgcaattt attcatatca ggattatcaa taccatattt ttgaaaaagc cgtttctgta 1200
atgaaggaga aaactcaccg aggcagttcc ataggatggc aagatcctgg tatcggtctg 1260
cgattccgac tcgtccaaca tcaatacaac ctattaattt cccctcgtca aaaataaggt 1320
tatcaagtga gaaatcacca tgagtgacga ctgaatccgg tgagaatggc aaaagcttat 1380
gcatttcttt ccagacttgt tcaacaggcc agccattacg ctcgtcatca aaatcactcg 1440
catcaaccaa accgttattc attcgtgatt gcgcctgagc gagacgaaat acgcgatcac 1500
tgttaaaagg acaattacaa acaggaatca aatgcaaccg gcgcaggaac actgccagcg 1560
catcaacaat attttcacct gaatcaggat attcttctaa tacctggaat gctgttttcc 1620
cggggatcgc agtggtgagt aaccatgcat catcaggagt acggataaaa tgcttgatgg 1680
tcggaagagg cataaattcc gtcagccagt ttagtctgac catctcatct gtaacatcat 1740
tggcaacgct acctttgcca tgtttcagaa acaactctgg cgcatcgggc ttcccataca 1800
atcgatagat tgtcgcacct gattgcccga cattatcgcg agcccattta tacccatata 1860
aatcagcatc catgttggaa tttaatcgcg gcctcgagca agacgtttcc cgttgaatat 1920
ggctcataac accccttgta ttactgttta tgtaagcaga caggtcgacg aattcgatta 1980
cgacgtgcta atctagcgtg tgaagacgat aaattaatga tctatggatt accatggatg 2040
acaactcaaa catctgcgtt atcaataaat agtaaaccga tagtgtataa agattgtgca 2100
aagcttttgc gatcaataaa tggatcacaa ccagtatctc ttaacgatgt tcttcgcaga 2160
tgatgattca ttttttaagt atttggctag tcaagatgat gaatcttcat tatctgatat 2220
attgcaaatc actcaatatc tagactttct gttattatta ttgatccaat caaaaaataa 2280
attagaagcc gtgggtcatt gttatgaatc tctttcagag gaatacagac aattgacaaa 2340
attcacagac tctcaagatt ttaaaaaact gtttaacaag gtccctattg ttacagatgg 2400
aagggtcaaa cttaataaag gatatttgtt cgactttgtg attagtttga tgcgattcaa 2460
aaaagaatcc tctctagcta ccaccgcaat agatcctatt agatacatag atcctcgtcg 2520
cgatatcgca ttttctaacg tgatggatat attaaagtcg aataaagtga acaataatta 2580
attctttatt gtcatcatga acgggcgcgc ctataaaaat tgaaatttta tttttttttt 2640
ttggaatata aatatcccta tcagtgatag agatctccct atcagtgata gagagccacc 2700
atggaagatg ccaaaaacat taagaagggc ccagcgccat tctacccact cgaagacggg 2760
accgccggcg agcagctgca caaagccatg aagcgctacg ccctggtgcc cggcaccatc 2820
gcctttaccg acgcacatat cgaggtggac attacctacg ccgagtactt cgagatgagc 2880
gttcggctgg cagaagctat gaagcgctat gggctgaata caaaccatcg gatcgtggtg 2940
tgcagcgaga atagcttgca gttcttcatg cccgtgttgg gtgccctgtt catcggtgtg 3000
gctgtggccc cagctaacga catctacaac gagcgcgagc tgctgaacag catgggcatc 3060
agccagccca ccgtcgtatt cgtgagcaag aaagggctgc aaaagatcct caacgtgcaa 3120
aagaagctac cgatcataca aaagatcatc atcatggata gcaagaccga ctaccagggc 3180
ttccaaagca tgtacacctt cgtgacttcc catttgccac ccggcttcaa cgagtacgac 3240
ttcgtgcccg agagcttcga ccgggacaaa accatcgccc tgatcatgaa cagtagtggc 3300
agtaccggat tgcccaaggg cgtagcccta ccgcaccgca ccgcttgtgt ccgattcagt 3360
catgcccgcg accccatctt cggcaaccag atcatccccg acaccgctat cctcagcgtg 3420
gtgccatttc accacggctt cggcatgttc accacgctgg gctacttgat ctgcggcttt 3480
cgggtcgtgc tcatgtaccg cttcgaggag gagctattct tgcgcagctt gcaagactat 3540
aagattcaat ctgccctgct ggtgcccaca ctatttagct tcttcgctaa gagcactctc 3600
atcgacaagt acgacctaag caacttgcac gagatcgcca gcggcggggc gccgctcagc 3660
aaggaggtag gtgaggccgt ggccaaacgc ttccacctac caggcatccg ccagggctac 3720
ggcctgacag aaacaaccag cgccattctg atcacccccg aaggggacga caagcctggc 3780
gcagtaggca aggtggtgcc cttcttcgag gctaaggtgg tggacttgga caccggtaag 3840
acactgggtg tgaaccagcg cggcgagctg tgcgtccgtg gccccatgat catgagcggc 3900
tacgttaaca accccgaggc tacaaacgct ctcatcgaca aggacggctg gctgcacagc 3960
ggcgacatcg cctactggga cgaggacgag cacttcttca tcgtggaccg gctgaagagc 4020
ctgatcaaat acaagggcta ccaggtagcc ccagccgaac tggagagcat cctgctgcaa 4080
caccccaaca tcttcgacgc cggggtcgcc ggcctgcccg acgacgatgc cggcgagctg 4140
cccgccgcag tcgtcgtgct ggaacacggt aaaaccatga ccgagaagga gatcgtggac 4200
tatgtggcca gccaggttac aaccgccaag aagctgcgcg gtggtgttgt gttcgtggac 4260
gaggtgccta aaggactgac cggcaagttg gacgcccgca agatccgcga gattctcatt 4320
aaggccaaga agggcggcaa gatcgccgtg ggatcccaga ccctgaactt tgatctgctg 4380
aaactggcag gcgatgtgga aagcaaccca ggcccaatgg tgagcaaggg cgaggagctg 4440
ttcaccgggg tggtgcccat cctggtcgag ctggacggcg acgtaaacgg ccacaagttc 4500
agcgtgtccg gcgagggcga gggcgatgcc acctacggca agctgaccct gaagttcatc 4560
tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg cccaccctcg tgaccaccct gacctacggc 4620
gtgcagtgct tcagccgcta ccccgaccac atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc 4680
atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc atcttcttca aggacgacgg caactacaag 4740
acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac accctggtga accgcatcga gctgaagggc 4800
atcgacttca aggaggacgg caacatcctg gggcacaagc tggagtacaa ctacaacagc 4860
cacaacgtct atatcatggc cgacaagcag aagaacggca tcaaggtgaa cttcaagatc 4920
cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc 4980
atcggcgacg gccccgtgct gctgcccgac aaccactacc tgagcaccca gtccgccctg 5040
agcaaagacc ccaacgagaa gcgcgatcac atggtcctgc tggagttcgt gaccgccgcc 5100
gggatcactc tcggcatgga cgagctgtac aagtaatgag cgatcgcgtg tagaaagtgt 5160
tacatcgact cataatatta tattttttat ctaaaaaact aaaaataaac attgattaaa 5220
ttttaatata atacttaaaa atggatgttg tgtcgttaga taaaccgttt atgtattttg 5280
aggaaattga taatgagtta gattacgaac cagaaagtgc aaatgaggtc gcaaaaaaac 5340
tgccgtatca aggacagtta aaactattac taggagaatt attttttctt agtaagttac 5400
agcgacacgg tatattagat ggtgccaccg tagtgtatat aggatcggct cctggtacac 5460
atatacgtta tttgagagat catttctata atttaggaat gattatcaaa tggatgctaa 5520
ttgacggacg ccatcatgat cctattctaa atggattgcg tgatgtgact ctagtgactc 5580
ggttcgttga tgaggaatat ctacgatcca tcaaaaaaca actgcatcct tctaagatta 5640
ttttaatttc tgatgtaaga tccaaacgag gaggaaatga acctagtacg gcggatttac 5700
taagtaatta cgctctacaa aatgtcatga ttagtatttt aaaccccgtg gcatctagtc 5760
ttaaatggag atgcccgttt ccagatcaat ggatcaagga cttttatatc ccacacggta 5820
ataaaatgtt acaacctttt gctccttcat attcagctga aatgaattc 5869
<210> 7
<211> 3943
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 7
tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg 60
cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc 120
actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt 180
gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc 240
ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa 300
acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc 360
ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg 420
cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc 480
tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc 540
gtcttgagtc caacacggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca 600
ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact 660
acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg 720
gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt 780
ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct 840
tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga 900
gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa 960
tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac 1020
ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcggc gtaatgctct 1080
gccagtgtta caaccaatta accaattctg attagaaaaa ctcatcgagc atcaaatgaa 1140
actgcaattt attcatatca ggattatcaa taccatattt ttgaaaaagc cgtttctgta 1200
atgaaggaga aaactcaccg aggcagttcc ataggatggc aagatcctgg tatcggtctg 1260
cgattccgac tcgtccaaca tcaatacaac ctattaattt cccctcgtca aaaataaggt 1320
tatcaagtga gaaatcacca tgagtgacga ctgaatccgg tgagaatggc aaaagcttat 1380
gcatttcttt ccagacttgt tcaacaggcc agccattacg ctcgtcatca aaatcactcg 1440
catcaaccaa accgttattc attcgtgatt gcgcctgagc gagacgaaat acgcgatcac 1500
tgttaaaagg acaattacaa acaggaatca aatgcaaccg gcgcaggaac actgccagcg 1560
catcaacaat attttcacct gaatcaggat attcttctaa tacctggaat gctgttttcc 1620
cggggatcgc agtggtgagt aaccatgcat catcaggagt acggataaaa tgcttgatgg 1680
tcggaagagg cataaattcc gtcagccagt ttagtctgac catctcatct gtaacatcat 1740
tggcaacgct acctttgcca tgtttcagaa acaactctgg cgcatcgggc ttcccataca 1800
atcgatagat tgtcgcacct gattgcccga cattatcgcg agcccattta tacccatata 1860
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acaactcaaa catctgcgtt atcaataaat agtaaaccga tagtgtataa agattgtgca 2100
aagcttttgc gatcaataaa tggatcacaa ccagtatctc ttaacgatgt tcttcgcaga 2160
tgatgattca ttttttaagt atttggctag tcaagatgat gaatcttcat tatctgatat 2220
attgcaaatc actcaatatc tagactttct gttattatta ttgatccaat caaaaaataa 2280
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ttggaatata aatatcccta tcagtgatag agatctccct atcagtgata gagagccacc 2700
atgtacagca tgcagctggc cagctgcgtg acactgaccc tcgtgctgct ggtgaacagc 2760
gctcctacct cctccagcac cagcagcagc accgctgagg cccagcagca gcagcagcaa 2820
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cgtatggaga actatcgtaa tttaaagctg cctcgtatgc tgaccgccaa gttcgcttta 2940
cccaagcaag ctacagagct gaaggattta cagtgtttag aggacgagct gggccctctg 3000
aggcatgtgc tggacggcac ccagagcaag agcttccagc tggaggacgc cgagaacttt 3060
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cagttcgacg acgagagcgc cacagtggtg gactttttaa gaaggtggat cgccttctgc 3180
cagtccatca tcagcaccag cccccagtaa tgagcgatcg cgtgtagaaa gtgttacatc 3240
gactcataat attatatttt ttatctaaaa aactaaaaat aaacattgat taaattttaa 3300
tataatactt aaaaatggat gttgtgtcgt tagataaacc gtttatgtat tttgaggaaa 3360
ttgataatga gttagattac gaaccagaaa gtgcaaatga ggtcgcaaaa aaactgccgt 3420
atcaaggaca gttaaaacta ttactaggag aattattttt tcttagtaag ttacagcgac 3480
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gacgccatca tgatcctatt ctaaatggat tgcgtgatgt gactctagtg actcggttcg 3660
ttgatgagga atatctacga tccatcaaaa aacaactgca tccttctaag attattttaa 3720
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<210> 8
<211> 3935
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 8
tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg 60
cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc 120
actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt 180
gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc 240
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acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc 360
ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg 420
cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc 480
tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc 540
gtcttgagtc caacacggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca 600
ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact 660
acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg 720
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<210> 9
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 9
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 10
<211> 399
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 10
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tggatcacct tctgccagag catcatcagc actttaacc 399
<210> 11
<211> 399
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 11
gcgccaacat caagttcgac caagaagacg cagttgcagc tagagcattt gcttttggat 60
cttcaaatga tccttaatgg tataaataat tataagaacc ccaaattgac gcgaatgcta 120
acagctaaat tcgcaatgcc aaagaaggca accgagttaa agcacctaca atgcttggaa 180
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cgacctcgag acctaatttc aaatattaac gtaattgttt tggaattaaa gggttcggaa 300
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<210> 12
<211> 459
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 12
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tggatcacct tctgccagag catcatcagc actttaacc 459
<210> 13
<211> 459
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 13
atgtatcgaa tgcaattact ttcctgtatc gcactttcat tagcccttgt gaccaactca 60
gcgccaacat caagttcgac caagaagacg cagttgcagc tagagcattt gcttttggat 120
cttcaaatga tccttaatgg tataaataat tataagaacc ccaaattgac gcgaatgcta 180
acagctaaat tcgcaatgcc aaagaaggca accgagttaa agcacctaca atgcttggaa 240
gaagaactaa aaccccttga ggaggtatta aatggtgctc agtcgaagaa ttttcatctt 300
cgacctcgag acctaatttc aaatattaac gtaattgttt tggaattaaa gggttcggaa 360
actactttta tgtgtgagta cgcagacgag acagctacaa tagtggagtt tcttaaccgt 420
tggataacct tttgtcaatc aatcatttcg actttgacc 459
<210> 14
<211> 153
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 14
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
20 25 30
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe
50 55 60
Ala Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys
85 90 95
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile
100 105 110
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
115 120 125
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
130 135 140
Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
145 150
<210> 15
<211> 1914
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 15
gattacgacg tgctaatcta gcgtgtgaag acgataaatt aatgatctat ggattaccat 60
ggatgacaac tcaaacatct gcgttatcaa taaatagtaa accgatagtg tataaagatt 120
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gcagatgatg attcattttt taagtatttg gctagtcaag atgatgaatc ttcattatct 240
gatatattgc aaatcactca atatctagac tttctgttat tattattgat ccaatcaaaa 300
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ccaccatgta tcgtatgcag ctgctgagct gcatcgcttt atctttagct ttagtgacca 780
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atttaaggcc tcgtgattta atcagcaaca tcaacgtgat cgtgctggag ctgaaaggct 1080
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atcgttggat caccttctgc cagagcatca tcagcacttt aacctaatga gcgatcgcgt 1200
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tatgtatttt gaggaaattg ataatgagtt agattacgaa ccagaaagtg caaatgaggt 1380
cgcaaaaaaa ctgccgtatc aaggacagtt aaaactatta ctaggagaat tattttttct 1440
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tcctggtaca catatacgtt atttgagaga tcatttctat aatttaggaa tgattatcaa 1560
atggatgcta attgacggac gccatcatga tcctattcta aatggattgc gtgatgtgac 1620
tctagtgact cggttcgttg atgaggaata tctacgatcc atcaaaaaac aactgcatcc 1680
ttctaagatt attttaattt ctgatgtaag atccaaacga ggaggaaatg aacctagtac 1740
ggcggattta ctaagtaatt acgctctaca aaatgtcatg attagtattt taaaccccgt 1800
ggcatctagt cttaaatgga gatgcccgtt tccagatcaa tggatcaagg acttttatat 1860
cccacacggt aataaaatgt tacaaccttt tgctccttca tattcagctg aaat 1914
<210> 16
<211> 3895
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 16
tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg 60
cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc 120
actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt 180
gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc 240
ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa 300
acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc 360
ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg 420
cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc 480
tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc 540
gtcttgagtc caacacggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca 600
ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact 660
acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg 720
gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt 780
ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct 840
tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga 900
gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa 960
tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac 1020
ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcggc gtaatgctct 1080
gccagtgtta caaccaatta accaattctg attagaaaaa ctcatcgagc atcaaatgaa 1140
actgcaattt attcatatca ggattatcaa taccatattt ttgaaaaagc cgtttctgta 1200
atgaaggaga aaactcaccg aggcagttcc ataggatggc aagatcctgg tatcggtctg 1260
cgattccgac tcgtccaaca tcaatacaac ctattaattt cccctcgtca aaaataaggt 1320
tatcaagtga gaaatcacca tgagtgacga ctgaatccgg tgagaatggc aaaagcttat 1380
gcatttcttt ccagacttgt tcaacaggcc agccattacg ctcgtcatca aaatcactcg 1440
catcaaccaa accgttattc attcgtgatt gcgcctgagc gagacgaaat acgcgatcac 1500
tgttaaaagg acaattacaa acaggaatca aatgcaaccg gcgcaggaac actgccagcg 1560
catcaacaat attttcacct gaatcaggat attcttctaa tacctggaat gctgttttcc 1620
cggggatcgc agtggtgagt aaccatgcat catcaggagt acggataaaa tgcttgatgg 1680
tcggaagagg cataaattcc gtcagccagt ttagtctgac catctcatct gtaacatcat 1740
tggcaacgct acctttgcca tgtttcagaa acaactctgg cgcatcgggc ttcccataca 1800
atcgatagat tgtcgcacct gattgcccga cattatcgcg agcccattta tacccatata 1860
aatcagcatc catgttggaa tttaatcgcg gcctcgagca agacgtttcc cgttgaatat 1920
ggctcataac accccttgta ttactgttta tgtaagcaga caggtcgacg aattcgatta 1980
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acaactcaaa catctgcgtt atcaataaat agtaaaccga tagtgtataa agattgtgca 2100
aagcttttgc gatcaataaa tggatcacaa ccagtatctc ttaacgatgt tcttcgcaga 2160
tgatgattca ttttttaagt atttggctag tcaagatgat gaatcttcat tatctgatat 2220
attgcaaatc actcaatatc tagactttct gttattatta ttgatccaat caaaaaataa 2280
attagaagcc gtgggtcatt gttatgaatc tctttcagag gaatacagac aattgacaaa 2340
attcacagac tctcaagatt ttaaaaaact gtttaacaag gtccctattg ttacagatgg 2400
aagggtcaaa cttaataaag gatatttgtt cgactttgtg attagtttga tgcgattcaa 2460
aaaagaatcc tctctagcta ccaccgcaat agatcctatt agatacatag atcctcgtcg 2520
cgatatcgca ttttctaacg tgatggatat attaaagtcg aataaagtga acaataatta 2580
attctttatt gtcatcatga acgggcgcgc ctataaaaat tgaaatttta tttttttttt 2640
ttggaatata aatatcccta tcagtgatag agatctccct atcagtgata gagagccacc 2700
atgtatcgta tgcagctgct gagctgcatc gctttatctt tagctttagt gaccaacagc 2760
gcccctacca gctcctccac caagaagacc cagctgcagc tggagcattt actgctggat 2820
ttacagatga ttttaaacgg catcaacaac tacaagaacc ccaagctgac tcgtatgctg 2880
accgccaagt tcgctatgcc caagaaggcc accgagctga agcacctcca gtgtttagag 2940
gaggagctga agcctttaga ggaggtgctg aatggagccc agagcaagaa tttccattta 3000
aggcctcgtg atttaatcag caacatcaac gtgatcgtgc tggagctgaa aggctccgag 3060
accaccttca tgtgcgagta cgccgacgag accgccacca tcgtggagtt tttaaatcgt 3120
tggatcacct tctgccagag catcatcagc actttaacct aatgagcgat cgcgtgtaga 3180
aagtgttaca tcgactcata atattatatt ttttatctaa aaaactaaaa ataaacattg 3240
attaaatttt aatataatac ttaaaaatgg atgttgtgtc gttagataaa ccgtttatgt 3300
attttgagga aattgataat gagttagatt acgaaccaga aagtgcaaat gaggtcgcaa 3360
aaaaactgcc gtatcaagga cagttaaaac tattactagg agaattattt tttcttagta 3420
agttacagcg acacggtata ttagatggtg ccaccgtagt gtatatagga tcggctcctg 3480
gtacacatat acgttatttg agagatcatt tctataattt aggaatgatt atcaaatgga 3540
tgctaattga cggacgccat catgatccta ttctaaatgg attgcgtgat gtgactctag 3600
tgactcggtt cgttgatgag gaatatctac gatccatcaa aaaacaactg catccttcta 3660
agattatttt aatttctgat gtaagatcca aacgaggagg aaatgaacct agtacggcgg 3720
atttactaag taattacgct ctacaaaatg tcatgattag tattttaaac cccgtggcat 3780
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acggtaataa aatgttacaa ccttttgctc cttcatattc agctgaaatg aattc 3895
<210> 17
<211> 1914
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 17
gattacgacg tgctaatcta gcgtgtgaag acgataaatt aatgatctat ggattaccat 60
ggatgacaac tcaaacatct gcgttatcaa taaatagtaa accgatagtg tataaagatt 120
gtgcaaagct tttgcgatca ataaatggat cacaaccagt atctcttaac gatgttcttc 180
gcagatgatg attcattttt taagtatttg gctagtcaag atgatgaatc ttcattatct 240
gatatattgc aaatcactca atatctagac tttctgttat tattattgat ccaatcaaaa 300
aataaattag aagccgtggg tcattgttat gaatctcttt cagaggaata cagacaattg 360
acaaaattca cagactctca agattttaaa aaactgttta acaaggtccc tattgttaca 420
gatggaaggg tcaaacttaa taaaggatat ttgttcgact ttgtgattag tttgatgcga 480
ttcaaaaaag aatcctctct agctaccacc gcaatagatc ctattagata catagatcct 540
cgtcgcgata tcgcattttc taacgtgatg gatatattaa agtcgaataa agtgaacaat 600
aattaattct ttattgtcat catgaacggg cgcgcctata aaaattgaaa ttttattttt 660
tttttttgga atataaatat ccctatcagt gatagagatc tccctatcag tgatagagag 720
ccaccatgta tcgaatgcaa ttactttcct gtatcgcact ttcattagcc cttgtgacca 780
actcagcgcc aacatcaagt tcgaccaaga agacgcagtt gcagctagag catttgcttt 840
tggatcttca aatgatcctt aatggtataa ataattataa gaaccccaaa ttgacgcgaa 900
tgctaacagc taaattcgca atgccaaaga aggcaaccga gttaaagcac ctacaatgct 960
tggaagaaga actaaaaccc cttgaggagg tattaaatgg tgctcagtcg aagaattttc 1020
atcttcgacc tcgagaccta atttcaaata ttaacgtaat tgttttggaa ttaaagggtt 1080
cggaaactac ttttatgtgt gagtacgcag acgagacagc tacaatagtg gagtttctta 1140
accgttggat aaccttttgt caatcaatca tttcgacttt gacctaatga gcgatcgcgt 1200
gtagaaagtg ttacatcgac tcataatatt atatttttta tctaaaaaac taaaaataaa 1260
cattgattaa attttaatat aatacttaaa aatggatgtt gtgtcgttag ataaaccgtt 1320
tatgtatttt gaggaaattg ataatgagtt agattacgaa ccagaaagtg caaatgaggt 1380
cgcaaaaaaa ctgccgtatc aaggacagtt aaaactatta ctaggagaat tattttttct 1440
tagtaagtta cagcgacacg gtatattaga tggtgccacc gtagtgtata taggatcggc 1500
tcctggtaca catatacgtt atttgagaga tcatttctat aatttaggaa tgattatcaa 1560
atggatgcta attgacggac gccatcatga tcctattcta aatggattgc gtgatgtgac 1620
tctagtgact cggttcgttg atgaggaata tctacgatcc atcaaaaaac aactgcatcc 1680
ttctaagatt attttaattt ctgatgtaag atccaaacga ggaggaaatg aacctagtac 1740
ggcggattta ctaagtaatt acgctctaca aaatgtcatg attagtattt taaaccccgt 1800
ggcatctagt cttaaatgga gatgcccgtt tccagatcaa tggatcaagg acttttatat 1860
cccacacggt aataaaatgt tacaaccttt tgctccttca tattcagctg aaat 1914
<210> 18
<211> 3895
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 18
tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg 60
cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc 120
actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt 180
gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc 240
ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa 300
acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc 360
ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg 420
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tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc 540
gtcttgagtc caacacggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca 600
ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact 660
acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg 720
gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt 780
ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct 840
tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga 900
gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa 960
tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac 1020
ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcggc gtaatgctct 1080
gccagtgtta caaccaatta accaattctg attagaaaaa ctcatcgagc atcaaatgaa 1140
actgcaattt attcatatca ggattatcaa taccatattt ttgaaaaagc cgtttctgta 1200
atgaaggaga aaactcaccg aggcagttcc ataggatggc aagatcctgg tatcggtctg 1260
cgattccgac tcgtccaaca tcaatacaac ctattaattt cccctcgtca aaaataaggt 1320
tatcaagtga gaaatcacca tgagtgacga ctgaatccgg tgagaatggc aaaagcttat 1380
gcatttcttt ccagacttgt tcaacaggcc agccattacg ctcgtcatca aaatcactcg 1440
catcaaccaa accgttattc attcgtgatt gcgcctgagc gagacgaaat acgcgatcac 1500
tgttaaaagg acaattacaa acaggaatca aatgcaaccg gcgcaggaac actgccagcg 1560
catcaacaat attttcacct gaatcaggat attcttctaa tacctggaat gctgttttcc 1620
cggggatcgc agtggtgagt aaccatgcat catcaggagt acggataaaa tgcttgatgg 1680
tcggaagagg cataaattcc gtcagccagt ttagtctgac catctcatct gtaacatcat 1740
tggcaacgct acctttgcca tgtttcagaa acaactctgg cgcatcgggc ttcccataca 1800
atcgatagat tgtcgcacct gattgcccga cattatcgcg agcccattta tacccatata 1860
aatcagcatc catgttggaa tttaatcgcg gcctcgagca agacgtttcc cgttgaatat 1920
ggctcataac accccttgta ttactgttta tgtaagcaga caggtcgacg aattcgatta 1980
cgacgtgcta atctagcgtg tgaagacgat aaattaatga tctatggatt accatggatg 2040
acaactcaaa catctgcgtt atcaataaat agtaaaccga tagtgtataa agattgtgca 2100
aagcttttgc gatcaataaa tggatcacaa ccagtatctc ttaacgatgt tcttcgcaga 2160
tgatgattca ttttttaagt atttggctag tcaagatgat gaatcttcat tatctgatat 2220
attgcaaatc actcaatatc tagactttct gttattatta ttgatccaat caaaaaataa 2280
attagaagcc gtgggtcatt gttatgaatc tctttcagag gaatacagac aattgacaaa 2340
attcacagac tctcaagatt ttaaaaaact gtttaacaag gtccctattg ttacagatgg 2400
aagggtcaaa cttaataaag gatatttgtt cgactttgtg attagtttga tgcgattcaa 2460
aaaagaatcc tctctagcta ccaccgcaat agatcctatt agatacatag atcctcgtcg 2520
cgatatcgca ttttctaacg tgatggatat attaaagtcg aataaagtga acaataatta 2580
attctttatt gtcatcatga acgggcgcgc ctataaaaat tgaaatttta tttttttttt 2640
ttggaatata aatatcccta tcagtgatag agatctccct atcagtgata gagagccacc 2700
atgtatcgaa tgcaattact ttcctgtatc gcactttcat tagcccttgt gaccaactca 2760
gcgccaacat caagttcgac caagaagacg cagttgcagc tagagcattt gcttttggat 2820
cttcaaatga tccttaatgg tataaataat tataagaacc ccaaattgac gcgaatgcta 2880
acagctaaat tcgcaatgcc aaagaaggca accgagttaa agcacctaca atgcttggaa 2940
gaagaactaa aaccccttga ggaggtatta aatggtgctc agtcgaagaa ttttcatctt 3000
cgacctcgag acctaatttc aaatattaac gtaattgttt tggaattaaa gggttcggaa 3060
actactttta tgtgtgagta cgcagacgag acagctacaa tagtggagtt tcttaaccgt 3120
tggataacct tttgtcaatc aatcatttcg actttgacct aatgagcgat cgcgtgtaga 3180
aagtgttaca tcgactcata atattatatt ttttatctaa aaaactaaaa ataaacattg 3240
attaaatttt aatataatac ttaaaaatgg atgttgtgtc gttagataaa ccgtttatgt 3300
attttgagga aattgataat gagttagatt acgaaccaga aagtgcaaat gaggtcgcaa 3360
aaaaactgcc gtatcaagga cagttaaaac tattactagg agaattattt tttcttagta 3420
agttacagcg acacggtata ttagatggtg ccaccgtagt gtatatagga tcggctcctg 3480
gtacacatat acgttatttg agagatcatt tctataattt aggaatgatt atcaaatgga 3540
tgctaattga cggacgccat catgatccta ttctaaatgg attgcgtgat gtgactctag 3600
tgactcggtt cgttgatgag gaatatctac gatccatcaa aaaacaactg catccttcta 3660
agattatttt aatttctgat gtaagatcca aacgaggagg aaatgaacct agtacggcgg 3720
atttactaag taattacgct ctacaaaatg tcatgattag tattttaaac cccgtggcat 3780
ctagtcttaa atggagatgc ccgtttccag atcaatggat caaggacttt tatatcccac 3840
acggtaataa aatgttacaa ccttttgctc cttcatattc agctgaaatg aattc 3895
<210> 19
<211> 507
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 19
atgtactcga tgcagttagc ttcctgcgtg accctaacct tagtcttgct agtgaattcg 60
gcgcccacct catcctcaac gtcatcttcc acagcggagg ctcaacagca gcagcaacag 120
cagcaacaac aacagcagca tttggaacaa ttgctaatgg acttacagga actactatca 180
agaatggaga attatcgaaa cctaaagtta cctcgaatgt tgacagcaaa atttgcgttg 240
ccaaagcagg ccacagagct aaaggaccta cagtgtcttg aagatgagct aggaccactt 300
cgtcacgttt tagacggaac acagtccaag tcttttcagt tggaagacgc cgagaacttt 360
atatctaaca tacgtgttac tgtcgtaaaa cttaaaggat cggacaatac tttcgaatgc 420
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caaagtataa tttccacttc gccacag 507
<210> 20
<211> 2204
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 20
actttaatcc tgtgtttata gagcccacgt ttaaacattc tttattaagt gtttataaac 60
acagattaat agttttattt gaagtattcg ttgtattcat tctaatatat gtatttttta 120
gatctgaatt aaatatgttc ttcatgccta aacgaaaaat acccgatcct attgatagat 180
tacgacgtgc taatctagcg tgtgaagacg ataaattaat gatctatgga ttaccatgga 240
tgacaactca aacatctgcg ttatcaataa atagtaaacc gatagtgtat aaagattgtg 300
caaagctttt gcgatcaata aatggatcac aaccagtatc tcttaacgat gttcttcgca 360
gatgatgatt cattttttaa gtatttggct agtcaagatg atgaatcttc attatctgat 420
atattgcaaa tcactcaata tctagacttt ctgttattat tattgatcca atcaaaaaat 480
aaattagaag ccgtgggtca ttgttatgaa tctctttcag aggaatacag acaattgaca 540
aaattcacag actttcaaga ttttaaaaaa ctgtttaaca aggtccctat tgttacagat 600
ggaagggtca aacttaataa aggatatttg ttcgactttg tgattagttt gatgcgattc 660
aaaaaagaat cctctctagc taccaccgca atagatcctg ttagatacat agatcctcgt 720
cgcaatatcg cattttctaa cgtgatggat atattaaagt cgaataaagt gaacaataat 780
taattcttta ttgtcatcgg cgcgcctata aaaattgaaa ttttattttt tttttttgga 840
atataaatat ccctatcagt gatagagatc tccctatcag tgatagagag ccaccatgta 900
ctcgatgcag ttagcttcct gcgtgaccct aaccttagtc ttgctagtga attcggcgcc 960
cacctcatcc tcaacgtcat cttccacagc ggaggctcaa cagcagcagc aacagcagca 1020
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ggagaattat cgaaacctaa agttacctcg aatgttgaca gcaaaatttg cgttgccaaa 1140
gcaggccaca gagctaaagg acctacagtg tcttgaagat gagctaggac cacttcgtca 1200
cgttttagac ggaacacagt ccaagtcttt tcagttggaa gacgccgaga actttatatc 1260
taacatacgt gttactgtcg taaaacttaa aggatcggac aatactttcg aatgccaatt 1320
cgatgatgaa agtgcaaccg tcgtggactt cttgcgacgt tggatcgcct tctgtcaaag 1380
tataatttcc acttcgccac agtattatat tttttatcta aaaaactaaa aataaacatt 1440
gattaaattt taatataata cttaaaaatg gatgttgtgt cgttagataa accgtttatg 1500
tattttgagg aaattgataa tgagttagat tacgaaccag aaagtgcaaa tgaggtcgca 1560
aaaaaactgc cgtatcaagg acagttaaaa ctattactag gagaattatt ttttcttagt 1620
aagttacagc gacacggtat attagatggt gccaccgtag tgtatatagg atctgctccc 1680
ggtacacata tacgttattt gagagatcat ttctataatt taggagtgat catcaaatgg 1740
atgctaattg acggccgcca tcatgatcct attttaaatg gattgcgtga tgtgactcta 1800
gtgactcggt tcgttgatga ggaatatcta cgatccatca aaaaacaact gcatccttct 1860
aagattattt taatttctga tgtgagatcc aaacgaggag gaaatgaacc tagtacggcg 1920
gatttactaa gtaattacgc tctacaaaat gtcatgatta gtattttaaa ccccgtggcg 1980
tctagtctta aatggagatg cccgtttcca gatcaatgga tcaaggactt ttatatccca 2040
cacggtaata aaatgttaca accttttgct ccttcatatt cagctgaaat gagattatta 2100
agtatttata ccggtgagaa catgagactg actcgagtta ccaaatcaga cgctgtaaat 2160
tatgaaaaaa agatgtacta ccttaataag atcgtccgta acaa 2204
<210> 21
<211> 153
<212> PRT
<213> 智人
<400> 21
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
20 25 30
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
50 55 60
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
85 90 95
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile
100 105 110
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
115 120 125
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
130 135 140
Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
145 150
<210> 22
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人
<400> 22
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser
20
<210> 23
<211> 149
<212> PRT
<213> 智人
<400> 23
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Ser Ser Ser Thr Ala Glu Ala Gln Gln
1 5 10 15
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln His Leu Glu Gln Leu Leu
20 25 30
Met Asp Leu Gln Glu Leu Leu Ser Arg Met Glu Asn Tyr Arg Asn Leu
35 40 45
Lys Leu Pro Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Leu Pro Lys Gln Ala
50 55 60
Thr Glu Leu Lys Asp Leu Gln Cys Leu Glu Asp Glu Leu Gly Pro Leu
65 70 75 80
Arg His Val Leu Asp Leu Thr Gln Ser Lys Ser Phe Gln Leu Glu Asp
85 90 95
Ala Glu Asn Phe Ile Ser Asn Ile Arg Val Thr Val Val Lys Leu Lys
100 105 110
Gly Ser Asp Asn Thr Phe Glu Cys Gln Phe Asp Asp Glu Ser Ala Thr
115 120 125
Val Val Asp Phe Leu Arg Arg Trp Ile Ala Phe Cys Gln Ser Ile Ile
130 135 140
Ser Thr Ser Pro Gln
145
<210> 24
<211> 169
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 24
Met Tyr Ser Met Gln Leu Ala Ser Cys Val Thr Leu Thr Leu Val Leu
1 5 10 15
Leu Val Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Ser Ser Ser Thr Ala
20 25 30
Glu Ala Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln His Leu
35 40 45
Glu Gln Leu Leu Met Asp Leu Gln Glu Leu Leu Ser Arg Met Glu Asn
50 55 60
Tyr Arg Asn Leu Lys Leu Pro Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Leu
65 70 75 80
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85 90 95
Leu Gly Pro Leu Arg His Val Leu Asp Leu Thr Gln Ser Lys Ser Phe
100 105 110
Gln Leu Glu Asp Ala Glu Asn Phe Ile Ser Asn Ile Arg Val Thr Val
115 120 125
Val Lys Leu Lys Gly Ser Asp Asn Thr Phe Glu Cys Gln Phe Asp Asp
130 135 140
Glu Ser Ala Thr Val Val Asp Phe Leu Arg Arg Trp Ile Ala Phe Cys
145 150 155 160
Gln Ser Ile Ile Ser Thr Ser Pro Gln
165
<210> 25
<211> 376
<212> PRT
<213> 人疱疹病毒1
<400> 25
Met Ala Ser Tyr Pro Gly His Gln His Ala Ser Ala Phe Asp Gln Ala
1 5 10 15
Ala Arg Ser Arg Gly His Ser Asn Arg Arg Thr Ala Leu Arg Pro Arg
20 25 30
Arg Gln Gln Glu Ala Thr Glu Val Arg Pro Glu Gln Lys Met Pro Thr
35 40 45
Leu Leu Arg Val Tyr Ile Asp Gly Pro His Gly Met Gly Lys Thr Thr
50 55 60
Thr Thr Gln Leu Leu Val Ala Leu Gly Ser Arg Asp Asp Ile Val Tyr
65 70 75 80
Val Pro Glu Pro Met Thr Tyr Trp Arg Val Leu Gly Ala Ser Glu Thr
85 90 95
Ile Ala Asn Ile Tyr Thr Thr Gln His Arg Leu Asp Gln Gly Glu Ile
100 105 110
Ser Ala Gly Asp Ala Ala Val Val Met Thr Ser Ala Gln Ile Thr Met
115 120 125
Gly Met Pro Tyr Ala Val Thr Asp Ala Val Leu Ala Pro His Ile Gly
130 135 140
Gly Glu Ala Gly Ser Ser His Ala Pro Pro Pro Ala Leu Thr Leu Ile
145 150 155 160
Phe Asp Arg His Pro Ile Ala Ala Leu Leu Cys Tyr Pro Ala Ala Arg
165 170 175
Tyr Leu Met Gly Ser Met Thr Pro Gln Ala Val Leu Ala Phe Val Ala
180 185 190
Leu Ile Pro Pro Thr Leu Pro Gly Thr Asn Ile Val Leu Gly Ala Leu
195 200 205
Pro Glu Asp Arg His Ile Asp Arg Leu Ala Lys Arg Gln Arg Pro Gly
210 215 220
Glu Arg Leu Asp Leu Ala Met Leu Ala Ala Ile Arg Arg Val Tyr Gly
225 230 235 240
Leu Leu Ala Asn Thr Val Arg Tyr Leu Gln Gly Gly Gly Ser Trp Arg
245 250 255
Glu Asp Trp Gly Gln Leu Ser Gly Thr Ala Val Pro Pro Gln Gly Ala
260 265 270
Glu Pro Gln Ser Asn Ala Gly Pro Arg Pro His Ile Gly Asp Thr Leu
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Phe Thr Leu Phe Arg Ala Pro Glu Leu Leu Ala Pro Asn Gly Asp Leu
290 295 300
Tyr Asn Val Phe Ala Trp Ala Leu Asp Val Leu Ala Lys Arg Leu Arg
305 310 315 320
Pro Met His Val Phe Ile Leu Asp Tyr Asp Gln Ser Pro Ala Gly Cys
325 330 335
Arg Asp Ala Leu Leu Gln Leu Thr Ser Gly Met Ile Gln Thr His Val
340 345 350
Thr Thr Pro Gly Ser Ile Pro Thr Ile Cys Asp Leu Ala Arg Thr Phe
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Ala Arg Glu Met Gly Glu Ala Asn
370 375
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<211> 376
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 26
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35 40 45
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165 170 175
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Glu Arg Leu Asp Leu Ala Met Leu Ala Ala Ile Arg Arg Val Tyr Gly
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Leu Leu Ala Asn Thr Val Arg Tyr Leu Gln Gly Gly Gly Ser Trp Arg
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 27
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1 5 10 15
Ala Arg Ser Arg Gly His Ser Asn Arg Arg Thr Ala Leu Arg Pro Arg
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Tyr Asn Val Phe Ala Trp Ala Leu Asp Val Leu Ala Lys Arg Leu Arg
305 310 315 320
Pro Met His Val Phe Ile Leu Asp Tyr Asp Gln Ser Pro Ala Gly Cys
325 330 335
Arg Asp Ala Leu Leu Gln Leu Thr Ser Gly Met Ile Gln Thr His Val
340 345 350
Thr Thr Pro Gly Ser Ile Pro Thr Ile Cys Asp Leu Ala Arg Thr Phe
355 360 365
Ala Arg Glu Met Gly Glu Ala Asn
370 375
<210> 28
<211> 376
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 28
Met Ala Ser Tyr Pro Gly His Gln His Ala Ser Ala Phe Asp Gln Ala
1 5 10 15
Ala Arg Ser Arg Gly His Ser Asn Arg Arg Thr Ala Leu Arg Pro Arg
20 25 30
Arg Gln Gln Glu Ala Thr Glu Val Arg Pro Glu Gln Lys Met Pro Thr
35 40 45
Leu Leu Arg Val Tyr Ile Asp Gly Pro His Gly Met Gly Lys Thr Thr
50 55 60
Thr Thr Gln Leu Leu Val Ala Leu Gly Ser Arg Asp Asp Ile Val Tyr
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Ile Ala Asn Ile Tyr Thr Thr Gln His Arg Leu Asp Gln Gly Glu Ile
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115 120 125
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Gly Glu Ala Gly Ser Ser His Ala Pro Pro Pro Ala Leu Thr Leu Ile
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165 170 175
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Glu Arg Leu Asp Leu Ala Met Leu Ala Ala Ile Arg Arg Val Tyr Gly
225 230 235 240
Leu Leu Ala Asn Thr Val Arg Tyr Leu Gln Gly Gly Gly Ser Trp Arg
245 250 255
Glu Asp Trp Gly Gln Leu Ser Gly Thr Ala Val Pro Pro Gln Gly Ala
260 265 270
Glu Pro Gln Ser Asn Ala Gly Pro Arg Pro His Ile Gly Asp Thr Leu
275 280 285
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Pro Met His Val Phe Ile Leu Asp Tyr Asp Gln Ser Pro Ala Gly Cys
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340 345 350
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355 360 365
Ala Arg Glu Met Gly Glu Ala Asn
370 375

Claims (46)

1.具有复制能力的重组溶瘤牛痘病毒(RVV)，其相对于相应的野生型病毒在病毒基因组中包含修饰，其中所述修饰包含在病毒基因组中的：(1)编码免疫刺激性细胞因子多肽的插入核苷酸序列；(2)编码异源胸苷激酶(TK)多肽的插入核苷酸序列。
2.权利要求1所述的RVV，其中所述RVV包含使牛痘TK缺陷的进一步修饰。
3.权利要求2所述的RVV，其中所述进一步修饰导致缺乏J2R表达和/或功能。
4.权利要求2所述的RVV，其中所述RVV是Copenhagen株牛痘病毒。
5.权利要求2所述的RVV，其中所述RVV是WR株牛痘病毒。
6.权利要求1-5中任一项所述的RVV，其中所述免疫刺激性细胞因子多肽是白细胞介素2(IL-2)多肽。
7.权利要求1-6中任一项所述的RVV，其中所述免疫刺激性细胞因子多肽是野生型IL-2多肽。
8.权利要求1-6中任一项所述的RVV，其中所述免疫刺激性细胞因子多肽是变体IL-2(IL-2v)多肽，其与相应的野生型IL-2多肽相比具有降低的不良生物活性。
9.权利要求1-8中任一项所述的RVV，其中所述异源TK多肽是HSV-TK多肽。
10.权利要求1-9中任一项所述的RVV，其中所述RVV包含含有K151E取代的A34R基因。
11.权利要求8-10中任一项所述的RVV，其中所述IL-2v多肽包含基于SEQ ID NO：1的IL-2氨基酸序列的氨基酸编号的F42、Y45和L72中的一个或多个的取代。
12.权利要求8-11中任一项所述的RVV，其中所述IL-2v多肽包含基于SEQ ID NO：1的IL-2氨基酸序列的氨基酸编号的F42L、F42A、F42G、F42S、F42T、F42Q、F42E、F42D、F42R或F42K取代的取代。
13.权利要求8-12中任一项所述的RVV，其中所述IL-2v多肽包含基于SEQ ID NO：1的IL-2氨基酸序列的氨基酸编号的Y45A、Y45G、Y45S、Y45T、Y45Q、Y45E、Y45N、Y45D、Y45R或Y45K取代。
14.权利要求8-13中任一项所述的RVV，其中所述IL-2v多肽包含基于SEQ ID NO：1的IL-2氨基酸序列的氨基酸编号的L72G、L72A、L72S、L72T、L72Q、L72E、L72N、L72R或L72K取代。
15.权利要求8-14中任一项所述的RVV，其中所述IL-2v多肽包含基于SEQ ID NO：1的IL-2氨基酸序列的氨基酸编号的F42A、Y45A和L72G取代。
16.权利要求8-14中任一项所述的RVV，其中所述IL-2v多肽编码核苷酸序列与可调节启动子可操作地连接。
17.权利要求16所述的RVV，其中所述可调节启动子受四环素或四环素类似物或衍生物调节。
18.权利要求1-17中任一项所述的RVV，其中所述异源TK多肽能够催化脱氧鸟苷的磷酸化。
19.权利要求1-18中任一项所述的RVV，其中所述异源TK多肽是变体单纯疱疹病毒(HSV)TK多肽。
20.权利要求19所述的RVV，其中所述变体HSV TK多肽包含与野生型HSV TK具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且包含基于SEQ ID NO：25的野生型HSV TK氨基酸序列的氨基酸编号的L159、I160、F161、A168和L169中的一个或多个的取代。
21.权利要求20所述的RVV，其中所述变体HSV TK多肽包含A168H取代。
22.权利要求20所述的RVV，其中所述变体HSV TK多肽包含L159I取代、I160L取代、F161A取代、A168Y取代和L169F取代。
23.权利要求20所述的RVV，其中所述变体HSV TK多肽包含L159I取代、I160F取代、F161L取代、A168F取代和L169M取代。
24.权利要求20所述的RVV，其中所述变体HSV TK多肽包含SEQ ID NO：26、27或28的氨基酸序列。
25.一种组合物，包括：
a)权利要求1-24中任一项所述的RVV；和
b)药学上可接受的承载体。
26.一种在患有肿瘤的个体中诱导溶瘤的方法，该方法包括向所述个体施用有效量的权利要求1-24中任一项所述的RVV或权利要求25所述的组合物。
27.权利要求26所述的方法，其中所述肿瘤是脑癌肿瘤、头颈癌肿瘤、食道癌肿瘤、皮肤癌肿瘤、肺癌肿瘤、胸腺癌肿瘤、胃癌肿瘤、结肠癌肿瘤、肝癌肿瘤、卵巢癌肿瘤、子宫癌肿瘤、膀胱癌肿瘤、睾丸癌肿瘤、直肠癌肿瘤、乳腺癌肿瘤或胰腺癌肿瘤。
28.权利要求26所述的方法，其中所述肿瘤是结肠直肠腺癌、非小细胞肺癌或三阴性乳腺癌。
29.权利要求26-28中任一项所述的方法，其中所述肿瘤是复发性的。
30.权利要求26-28中任一项所述的方法，其中所述肿瘤是原发性肿瘤。
31.权利要求26-28中任一项所述的方法，其中所述肿瘤是转移性的。
32.权利要求26-31中任一项所述的方法，还包括向所述个体施用第二癌症疗法。
33.权利要求32所述的方法，其中所述第二癌症疗法选自化学疗法、生物疗法、放射疗法、免疫疗法、激素疗法、抗血管疗法、冷冻疗法、毒素疗法、溶瘤病毒疗法、细胞疗法和手术。
34.权利要求32所述的方法，其中所述第二癌症疗法包括抗PD1抗体或抗PD-L1抗体。
35.权利要求26-34中任一项所述的方法，其中所述个体是免疫功能低下的。
36.权利要求26-35中任一项所述的方法，其中RVV或组合物的所述施用是肿瘤内的。
37.权利要求26-35中任一项所述的方法，其中RVV或组合物的所述施用是在肿瘤周围的。
38.权利要求26-35中任一项所述的方法，其中RVV或组合物的所述施用是静脉内的。
39.权利要求26-35中任一项所述的方法，其中RVV或组合物的所述施用是动脉内、膀胱内或鞘内的。
40.权利要求26-39中任一项所述的方法，进一步包括以有效减少牛痘病毒的副作用的量向所述个体施用更昔洛韦。
41.一种具有复制能力的重组溶瘤牛痘病毒(RVV)，在其基因组中包含：(1)编码包含SEQ ID NO：9的变体白细胞介素-2(IL-2v)多肽的核苷酸序列；(2)编码包含SEQ ID NO：28的异源TK多肽的核苷酸序列；(3)A34R基因中的K151E取代，其中RVV是Copenhagen株牛痘病毒并且是牛痘胸苷激酶缺陷的。
42.权利要求41所述的RVV，其中所述IL-2v多肽还包含信号肽。
43.权利要求42所述的RVV，其中所述信号肽包含SEQ ID NO：22。
44.权利要求8-24中任一项所述的RVV，其中编码变体IL-2v多肽的核苷酸序列包含SEQID NO：10。
45.权利要求8-24中任一项所述的RVV，其中编码变体IL-2v多肽的核苷酸序列包含SEQID NO：12。
46.一种组合物，包含：(i)权利要求41至45中任一项所述的RVV和(ii)药学上可接受的承载体。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2023014626A (ja) 2021-07-19 2023-01-31 トヨタ自動車株式会社 蓄電装置

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103492411A (zh) * 2011-02-10 2014-01-01 罗切格利卡特公司 突变体白介素-2多肽
CN105555954A (zh) * 2013-03-14 2016-05-04 伊佩尤斯生物技术公司 改进的胸苷激酶基因
CN105658795A (zh) * 2013-08-22 2016-06-08 匹兹堡大学联邦系统高等教育 免疫溶瘤疗法
WO2018234862A1 (en) * 2017-06-19 2018-12-27 Medicenna Therapeutics Inc. USES AND METHODS FOR IL-2 SUPERAGONISTS AND AGONISTS AND FUSIONS THEREOF
WO2019089755A1 (en) * 2017-10-31 2019-05-09 Western Oncolytics Ltd. Platform oncolytic vector for systemic delivery

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100562570C (zh) 2003-06-18 2009-11-25 吉恩勒克斯公司 修饰的重组痘苗病毒及其它微生物,及其应用
EP1648233A4 (en) 2003-07-08 2006-08-23 Univ Arizona VACCINE VACCINE MUTANTS INSTEAD OF ONCOLYTIC AGENTS
EP1518932A1 (en) 2003-09-29 2005-03-30 GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH Modified vaccinia virus Ankara (MVA) mutant and use thereof
WO2008100292A2 (en) * 2006-10-16 2008-08-21 Genelux Corporation Modified vaccinia virus strains for use in diagnostic and therapeutic methods
EP2300023A2 (en) * 2008-05-16 2011-03-30 Genelux Corporation Microorganisms for preventing and treating neoplasms accompanying cellular therapy
US20130071430A1 (en) 2010-04-09 2013-03-21 The University Of Tokyo Microrna-controlled recombinant vaccinia virus and use thereof
KR102197374B1 (ko) 2013-11-21 2020-12-31 코쿠리츠 다이가쿠 호우진 돗토리 다이가쿠 분열 촉진 인자 활성화 단백질 키나제 의존성 재조합 우두 바이러스(md-rvv) 및 이의 용도
TWI595006B (zh) 2014-12-09 2017-08-11 禮納特神經系統科學公司 抗ｐｄ－１抗體類和使用彼等之方法
WO2019151836A1 (en) * 2018-02-05 2019-08-08 Sillajen, Inc. Oncolytic vaccinia virus expressing an immune checkpoint protein antagonist to treat cancer

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103492411A (zh) * 2011-02-10 2014-01-01 罗切格利卡特公司 突变体白介素-2多肽
CN105555954A (zh) * 2013-03-14 2016-05-04 伊佩尤斯生物技术公司 改进的胸苷激酶基因
CN105658795A (zh) * 2013-08-22 2016-06-08 匹兹堡大学联邦系统高等教育 免疫溶瘤疗法
WO2018234862A1 (en) * 2017-06-19 2018-12-27 Medicenna Therapeutics Inc. USES AND METHODS FOR IL-2 SUPERAGONISTS AND AGONISTS AND FUSIONS THEREOF
WO2019089755A1 (en) * 2017-10-31 2019-05-09 Western Oncolytics Ltd. Platform oncolytic vector for systemic delivery

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