KR20180033498A - 폭스바이러스에서 발현을 증강하기 위한 프로모터 - Google Patents

폭스바이러스에서 발현을 증강하기 위한 프로모터 Download PDF

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Abstract

본 발명은 이종성 유전자, 예를 들면, 브라큐리의 발현을 증강하는데 이용될 수 있는 하나 또는 그 이상의 프로모터 및/또는 발현 카세트에 관계한다. 특히, 하나 또는 그 이상의 프로모터 및/또는 발현 카세트는 바이러스 벡터, 예를 들면, 폭스바이러스의 일부로서 이종성 유전자의 발현을 증강한다.

Description

폭스바이러스에서 발현을 증강하기 위한 프로모터
발명의 분야
본 발명은 폭스바이러스, 특히 조류폭스바이러스, 예를 들면, 계두바이러스 및 카나리아두바이러스에서 단백질 발현의 하나 또는 그 이상의 신규한 프로모터에 관계한다. 본 발명은 상기 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 특히 상기 프로모터 및 발현되는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 이를 포함하는 벡터; 상기 구조체를 포함하는 숙주 세포; 및 상기 중에서 한 가지를 포함하는 조성물에 더욱 관계한다. 추가적으로, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 또는 그 이상의 신규한 폴리펩티드에 관계한다. 더욱 구체적으로, 하나 또는 그 이상의 신규한 폴리펩티드는 브라큐리 단백질에 관련된다.
발명의 배경
재조합 폭스바이러스는 감염성 생물체 및 더욱 최근에, 종양에 대한 백신으로서 이용되었다. Mastrangelo et al. J Clin Invest. 2000;105(8):1031-1034. 이들 폭스바이러스 군 중에서 2가지, 조류폭스바이러스 및 오소폭스바이러스는 종양과 싸우는데 효과적인 것으로 나타났고 잠재적 암 치료와 관련되었다. 동일 저자.
한 가지 예시적인 조류폭스바이러스 종, 계두는 인간 투여를 위한 안전한 운반제인 것으로 나타났는데, 그 이유는 계두바이러스가 포유류 세포에 들어가고 단백질을 발현하지만, 불현적으로 복제하기 때문이다. Skinner et al. Expert Rev Vaccines. 2005 Feb;4(1):63-76. 추가적으로, 발현을 위한 운반제로서 계두바이러스의 이용은 암, 말라리아, 결핵, AIDS, 그리고 EBOLA에 대항하여 백신의 다양한 임상 시험에서 평가되고 있다. 동일 저자.
재조합 폭스바이러스, 예를 들면, 계두는 여러 감염성 질환 및 종양 연관된 유전자, 예를 들면, p97, HER-2/neu, p53 및 ETA를 비롯한 넓은 범위의 삽입된 유전자를 발현하는데 이용되었다 (Paoletti, et al., 1993). 최근에 연구되는 한 가지 예시적인 종양 항원은 브라큐리 ("T"로서 또한 알려져 있음)이다.
브라큐리는 생쥐에서, 또한 열성 치사성인 지배적인 짧은 꼬리 돌연변이체로서 확인되었다; 동형접합성 T/T 배아는 뒤쪽 중배엽 형성의 실패로 인해 임신 중기에서 죽는다 (Chesley, J. Exp. Zool., 70: 429-459, 1935). 뮤린 브라큐리 유전자 (Herrmann et al., Nature (Lond.), 343: 617-622, 1990)뿐만 아니라 다른 종, 예를 들면, 인간에서 동족체가 클로닝되었다. 생쥐 브라큐리의 인간 동족체의 발현은 임신 14-15 주에 인간 낙태아의 척삭 잔존물, 수질핵에서 RT-PCR에 의해 검출되었다 (Edwards et al., Genome Res., 6: 226-233, 1996).
브라큐리는 중배엽 분화의 인식을 위한 귀중한 마커인 것으로 일반적으로 입증되었다 (Herrmann et al., Trends Genet., 10: 280-286, 1994). 가령, 배아 그들 자체에서 발현과는 별개로, 브라큐리는 시험관내에서 중배엽 계통을 따라서 분화하는 일정한 뮤린 EC 및 ES 세포주의 분화 동안 활성화되는 것으로 보고되었다 (가령, Bain et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 223: 691-694, 1996을 참조한다). 인간에서, 브라큐리는 기형암종 (Gokhele et al., Cell Growth and Differentiation 11:157-62, 2000), 척삭종 (Vujovic et al., J. Pathol. 2: 157-65, 2006) 및 혈관모세포종 (Glasker et al., Cancer Res. 66: 4167-4172, 2006)에서 발현되는 것으로 밝혀졌다.
더욱 최근에, 브라큐리를 발현하는 폭스바이러스는 종양에 대항하여 활성 면역치료제로서 효과적일 수 있는 것으로 설명되었다. (WO 2014/043535를 참조한다).
활성 면역요법 및 백신을 비롯하여, 감염성 질환 및 암 치료를 향상시키기 위한 실제적인 충족되지 않은 의료 수요가 분명히 존재한다. 상기에 근거하여, 활성 면역요법에서 이용되는, 브라큐리와 같은 항원의 발현을 향상시키기 위한 요구가 당분야에서 존재한다. 본 발명은 이러한 필요를 충족시킨다.
발명의 짧은 요약
본 발명은 폭스바이러스의 일부로서 통합된 코딩 서열 및 항원의 발현에서 증강과 연관된 하나 또는 그 이상의 프로모터, 핵산, 발현 카세트, 재조합 펩티드 및 재조합 폭스바이러스를 제공한다.
본 발명의 한 양상에서, 다음을 포함하는 발현 카세트가 제시된다:
a. 서열 번호: 1-10 및 77 중에서 한 가지에 최소한 70% 동일성을 갖는 핵 서열을 포함하는 프로모터; 및
b. 상기 프로모터에 작동가능하게 연결된 코딩 서열;
여기서 상기 코딩 서열의 발현이 상기 프로모터에 의해 제어된다.
본 발명의 추가의 양상에서, 발현 카세트는 그 안에 코딩 서열의 증강된 발현을 위한 벡터, 예를 들면, 바이러스 또는 플라스미드의 일부로서 통합될 수 있다. 바람직하게는, 발현 카세트는 폭스바이러스, 예를 들면, 하지만 제한 없이, 오소폭스바이러스 및 조류폭스바이러스의 일부이다. 더욱 바람직하게는, 발현 카세트는 조류폭스바이러스, 예를 들면, 계두바이러스이다. 다른 추가의 양상에서, 발현 카세트는 폭스바이러스의 유전체에서 자연적으로 발생하는 발현 카세트가 아니다.
추가의 양상에서, a) 서열 번호: 1-10으로 구성된 군에서 선택되는 핵산 서열, b) 서열 번호: 1-10 및 77 중에서 한 가지의 하위서열, 또는 c) 서열 번호: 1-10 및 77 중에서 한 가지의 유도체 서열을 포함하거나 또는 이것으로 구성되는 하나 또는 그 이상의 프로모터가 제시되고, 여기서 상기 유도체는 하나 또는 그 이상의 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고, 그리고 여기서 상기 유도체 서열은 폭스바이러스 프로모터로서 활성적이고 및/또는 폭스바이러스 감염된 세포에서 활성적이다.
다른 추가 양상에서, 본 발명은 다음과 같이 구성된 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 신규한 브라큐리 단백질을 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 핵산 서열을 포함한다: 서열 번호: 18-19, 22-23, 26-27, 30-31, 34-35, 38-39, 42-43, 46-47, 50-51, 54-55, 58-59, 62-63, 66-67, 70 및 71. 다른 추가 양상에서, 본 발명은 다음과 같이 구성된 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 신규한 핵산 서열을 포함한다: 16-17, 20-21, 24-25, 28-29, 32-33, 36-37, 40-41, 44-45, 48-49, 52-53, 56-57, 60-61, 64-65, 68 및 69.
다른 추가의 양상에서, 본 발명은 다음을 포함하는 발현 카세트를 포함한다:
a. 서열 번호: 1-10 및 77 중에서 한 가지에 최소한 70% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 프로모터; 및
b. 상기 프로모터에 작동가능하게 연결된 코딩 서열, 여기서 상기 코딩 서열은 i) 서열 번호: 11, 13, 18-19, 22-23, 26-27, 30-31, 34-35, 38-39, 42-43, 46-47, 50-51, 54-55, 58-59, 62-63, 66-67, 70 및 71로 구성된 군에서 선택되는 브라큐리 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하거나, 또는 ii) 서열 번호: 12, 14-17, 20-21, 24-25, 28-29, 32-33, 36-37, 40-41, 44-45, 48-49, 52-53, 56-57, 60-61, 64-65, 68 및 69로 구성된 군에서 선택되는 핵산 중에서 한 가지에 최소한 70% 동일성을 갖는 핵산을 포함하거나 또는 이것으로 구성되고;
여기서 상기 코딩 서열의 발현이 상기 프로모터에 의해 제어된다.
본 발명의 추가 목적과 이점이 부분적으로, 아래의 설명에서 진술될 것이고, 그리고 부분적으로, 이러한 설명으로부터 명백할 것이고, 또는 본 발명의 실시에 의해 학습될 수 있다. 본 발명의 목적과 이점은 특히 첨부된 청구항에서 지적된 요소와 조합에 의하여 실현되고 획득될 것이다.
전술한 일반적인 설명 및 다음의 상세한 설명 둘 모두 단지 예시적이고 설명적이며 청구된 발명을 제한하지 않는 것으로 이해된다.
도면의 간단한 설명
도면 1은 비재조합 바이러스 FPV-WT, 또는 재조합 바이러스 FPV-mBN343A, FPV-mBN344A 또는 FPV-mBN345A로 감염된 인간 수지상 세포 (DCs)에서 브라큐리 단백질의 발현을 도해한다. 실시예 1에서 상술된 바와 같은 토끼 단일클론 항-브라큐리 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 분석이 수행되었다.
도면 2는 비재조합 바이러스 MVA-WT 또는 FPV-WT, 또는 재조합 바이러스 MVA-브라큐리-TRICOM, FPV-mBN249B, FPV-mBN281A 클론 32, FPV-mBN281A 클론 35, FPV-mBN343A, FPV-mBN344A, FPV-mBN345A, FPV-mBN354A 또는 FPV-mBN355A로 감염된 인간 수지상 세포 (DCs)에서 브라큐리 단백질의 발현을 도해한다. 실시예 2에서 상술된 바와 같은 토끼 단일클론 항-브라큐리 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 분석이 수행되었다.
도면 3은 실시예 2에서 상술된 바와 같이, 비재조합 바이러스 MVA-WT 또는 FPV-WT, 또는 재조합 바이러스 MVA-브라큐리-TRICOM, FPV-mBN249B, FPV-mBN281A 클론 32, FPV-mBN281A 클론 35, FPV-mBN343A, FPV-mBN344A, FPV-mBN345A, FPV-mBN354A 또는 FPV-mBN355A로 감염된 인간 수지상 세포 (DCs)의 웨스턴 블롯 분석으로부터 GAPDH와 비교하여 브라큐리 단백질의 상대적 발현을 묘사한다.
도면 4는 실시예 3에서 설명된 바와 같이, 각 단백질에 특정한 형광으로 표지화된 항체를 이용한 유세포분석법에 의해 사정된, 재조합 바이러스 MVA-브라큐리-TRICOM, FPV-mBN249B, FPV-mBN343A 또는 FPV-mBN345A로 감염된 CMMT 세포 (히말라야 원숭이 유방 종양 세포주)에서 브라큐리 및 TRICOM 단백질의 발현을 도해한다.
도면 5는 실시예 3에서 설명된 바와 같이, 유세포분석법에 의해 사정된, 재조합 바이러스 MVA-브라큐리-TRICOM, FPV-mBN249B, FPV-mBN343A 또는 FPV-mBN345A로 감염된 CMMT 세포 (히말라야 원숭이 유방 종양 세포주)에서 브라큐리 단백질의 중앙 발현 수준을 묘사한다.
도면 6은 실시예 4에서 설명된 바와 같이, 유세포분석법에 의해 사정된, 재조합 바이러스 FPV-mBN345B로 감염된 CMMT 세포 (히말라야 원숭이 유방 종양 세포주)에서 브라큐리 및 TRICOM 단백질의 발현을 묘사한다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 서열 번호:1-10 및 77에서 명시된 바와 같은 프로모터 서열이 종양 항원 브라큐리의 발현을 증강한다는 놀라운 결정에 근거된다. 도면 1-6에서 도시되고 본원에서 더욱 상세하게 설명된 바와 같이, 브라큐리 항원의 발현은 본 발명의 프로모터를 이용할 때 증강된다. 발현은 이들 프로모터 및 브라큐리 항원이 재조합 폭스바이러스의 일부로서 이용될 때 더욱 증강된다.
최소한 하나의 양상에서, 본 발명의 다양한 구체예는 공지된 우두 프로모터, 예를 들면, PrS 및 우두바이러스 40k (VV-40K)를 이용할 때 브라큐리 단백질의 불충분한 발현 수준의 결과로서 창출되었다. 브라큐리 발현 수준을 증강하려는 시도에서, 본 발명자들은 FPV에서 다양한 우두 프로모터 및 연관된 단백질 (가령, VV-40k, I3 등) 및 임의의 가능한 동족체를 분석하였다. 본 발명자들은 일부 FPV 상동성 서열이 이전에 발견되었다는 것을 인식하였다. 가령, Zantinge, J Gen Virol. 1996 Apr;77 ( Pt 4):603-14 및 NCBI 참고 서열: NP_039051.1에서 유전자 FPV 088, Afonso,C.L et al., J. Virol. 74 (8), 3815-3831 (2000)을 참조한다.
브라큐리 발현을 증강하려는 초기 시도에서, NCBI 참고 서열: NP_039051.1에서 유전자 FPV 088의 가능한 프로모터 영역이 본 발명자들에 의해 브라큐리로 작제되고 시험되어 바람직하지 않은 결과 (가령, mBN344A에서 도면 1 및 2를 참조한다) 프로모터가 산출되었다. 본 발명자들은 유전자 FPV 088의 ORF로부터 뉴클레오티드의 부가로 차후 프로모터를 창출하였는데, 이것은 바람직하지 않은 결과를 유사하게 산출하였다. (가령, mBN354A에서 도면 1 및 2를 참조한다). 유전자 FPV 088의 ORF로부터 다른 추가 뉴클레오티드로 본 발명자들에 의해 추가 구조체가 창출되었는데, 이들은 본원에서 설명되고 예증된 바와 같이, 종양 항원 브라큐리의 발현을 증강한다.
따라서, 다양한 구체예에서, 본 발명은 발현 벡터, 예를 들면, 하지만 제한 없이, 플라스미드, 재조합 바이러스 기타 등등에서 코딩 서열 및/또는 핵산의 증강/발현을 위한 하나 또는 그 이상의 핵산 서열, 이들 핵산 서열을 포함하는 하나 또는 그 이상의 프로모터, 이들 핵산을 포함하는 하나 또는 그 이상의 발현 카세트, 하나 또는 그 이상의 펩티드 및/또는 펩티드 서열에 관계한다. 추가 구체예에서, 본 발명은 본원에서 설명된 핵산 서열, 프로모터, 발현 카세트, 및/또는 펩티드 및/또는 펩티드 서열 중에서 하나 또는 그 이상을 포함하는 하나 또는 그 이상의 재조합 폭스바이러스에 관계한다.
추가적으로, 본 발명의 다양한 구체예에서, 브라큐리 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 핵산 서열이 제시된다. 한 구체예에서, 브라큐리 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 핵산은 다음과 같이 구성된 군에서 선택된다: 서열 번호: 11, 13, 18-19, 22-23, 26-27, 30-31, 34-35, 38-39, 42-43, 46-47, 50-51, 54-55, 58-59, 62-63, 66-67, 70 및 71. 본 발명에 따른 브라큐리 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 다음과 같이 구성된 군에서 선택된다: 서열 번호: 12, 14-17, 20-21, 24-25, 28-29, 32-33, 36-37, 40-41, 44-45, 48-49, 52-53, 56-57, 60-61, 64-65, 68 및 69.
정의
본원에서 이용된 바와 같이, 단수 형태 ("a", "an" 및 "the")는 문맥에서 달리 지시되지 않으면, 복수 지시대상을 포함하는 것으로 유의되어야 한다. 따라서, 예로서, "에피토프"에 대한 언급은 에피토프 중에서 하나 또는 그 이상을 포함하고, 그리고 "방법"에 대한 언급은 본원에서 설명된 방법에 대해 변형되거나 또는 이를 대체할 수 있는, 당업자에게 공지된 동등한 단계 및 방법에 대한 언급을 포함한다.
달리 지시되지 않으면, 일련의 요소를 선행하는 용어 "최소한"은 일련 내에 모든 요소를 지칭하는 것으로 이해된다. 당업자는 단지 일과적인 실험을 이용하여, 본원에서 설명된 발명의 특정한 구체예에 대한 많은 등가물을 인식하거나, 또는 확인할 수 있을 것이다. 이런 등가물은 본 발명에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.
본 명세서 및 하기의 청구항 전반에서, 문맥에서 달리 요구되지 않으면, 단어 "포함한다" 및 변이, 예를 들면, "포함한다" 및 "포함하는"은 언급된 완전체 또는 단계, 또는 완전체 또는 단계의 군의 포함, 하지만 임의의 다른 완전체 또는 단계, 또는 완전체 또는 단계의 군의 배제하지 않음을 암시하는 것으로 이해될 것이다. 본원에서 이용될 때, 용어 "포함하는"은 용어 "내포하는" 또는 "포함하는" 또는 때때로, 본원에서 이용될 때 용어 "갖는"으로 치환될 수 있다. 비록 덜 바람직하긴 하지만, 임의의 전술한 용어 (포함하는, 내포하는, 포함하는, 갖는)은 본 발명의 양상 또는 구체예의 맥락에서 본원에서 이용될 때는 언제든지, 용어 "구성되는"으로 치환될 수 있다. 본원에서 이용될 때, "구성되는"은 청구항 요소에서 특정되지 않은 임의의 원소, 단계, 또는 성분을 배제한다. 본원에서 이용될 때, "본질적으로 구성되는"은 청구항의 기본 특징 및 신규한 특징에 실질적으로 영향을 주지 않는 물질 또는 단계를 배제하지 않는다.
본원에서 이용된 바와 같이, 복수의 언급된 요소 사이에 연결 용어 "및/또는"은 개별 옵션 및 합동된 옵션 둘 모두를 포괄하는 것으로 이해된다. 가령, 2개의 원소가 "및/또는"에 의해 연합되는 경우에, 첫 번째 옵션은 두 번째 요소 없이 첫 번째 요소의 적용가능성을 지칭한다. 두 번째 옵션은 첫 번째 요소 없이 두 번째 요소의 적용가능성을 지칭한다. 세 번째 옵션은 첫 번째와 두 번째 요소 공동의 적용가능성을 지칭한다. 이들 옵션 중에서 한 가지가 상기 의미 내에 들어가는 것으로 이해되고, 그리고 이런 이유로, 본원에서 이용된 바와 같은 용어 "및/또는"의 요건을 충족시킨다. 이들 옵션 중에서 하나 이상의 동시 적용가능성 또한, 상기 의미 내에 들어가는 것으로 이해되고, 그리고 이런 이유로, 용어 "및/또는"의 요건을 충족시킨다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "프로모터"는 예로서, 증진되는 유전자의 코딩 영역으로부터 RNA를 합성하는 것을 책임지는 단백질 전사 인자 및 중합효소에 의해 인식되고 결합되는 특정한 DNA 서열 요소를 내포하는, 발현되는 핵산의 서열의 상류에 위치된 핵산, 통상적으로 DNA의 조절 영역을 표시한다. 프로모터가 전형적으로, 문제되는 유전자에 바로 인접하기 때문에, 프로모터에서 위치는 특정 유전자에 대한 DNA의 전사가 시작되는 전사 시작 부위에 상대적으로 지정된다 (다시 말하면, 상류 위치는 -1로부터 역으로 계수되는 음수이다, 예를 들면, -100은 100개 염기쌍 상류 위치이다). 따라서, 프로모터 서열은 위치 -1까지 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 하지만, 위치 +1로부터 뉴클레오티드는 프로모터의 일부가 아니다, 다시 말하면, 이점에 관하여 주목해야 할 것은 번역 개시 코돈 (ATG 또는 AUG)이 프로모터의 일부가 아니라는 점이다. 따라서, 서열 번호: 1-10 및 77은 본 발명의 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드이다.
본원에서 이용된 바와 같이, 코딩 서열, 핵산, 단백질 및/또는 항원의 발현 수준에 대하여 이용될 때 용어 "증강하는" 또는 "증강된"은 당분야에서 공지된 프로모터 중에서 하나 또는 그 이상, 예를 들면 PrS 또는 VV-40k와 연관될 때 및/또는 이것의 일부로서 코딩 서열, 핵산, 단백질 및/또는 항원의 발현 수준에 비하여, 본 발명의 프로모터, 발현 카세트, 핵산, 단백질 및/또는 벡터 중에서 하나 또는 그 이상과 연관될 때 및/또는 이것의 일부로서 코딩 서열, 핵산, 단백질 및/또는 항원의 발현에서 증가를 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 서열 번호: 1-10 및 77에서 명시된 뉴클레오티드 서열과 "본질적으로 동일한 발현 특징"을 갖는 뉴클레오티드 서열은 생산된 재조합 단백질의 양에 의해 계측될 때, 서열 번호: 1-10 및 77의 프로모터 활성의 최소한 70%, 바람직하게는 최소한 80%, 이보다 더욱 바람직하게는 최소한 90%를 전시할 것이다. 문제되는 프로모터 서열이 서열 번호: 1-10 및 77 중에서 한 가지와 "본질적으로 동일한 발현 특징"을 갖는 지의 여부는 본 출원의 실시예 1-4에서 진술된 방법을 이용하여 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 프로모터는 바람직하게는, 폭스바이러스 프로모터, 바람직하게는 조류폭스바이러스로서 활성적이거나, 또는 폭스바이러스 감염된 세포, 바람직하게는 조류폭스바이러스 감염된 세포에서 프로모터로서 활성적이다. 조류폭스바이러스는 바람직하게는 계두바이러스이다. "폭스바이러스 프로모터로서 활성적"은 프로모터가 폭스바이러스로 세포의 감염 후 상기 폭스바이러스 내에서 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 주도할 수 있다는 것을 의미한다. 세포는 바람직하게는, 폭스바이러스의 후기 및/또는 초기 및/또는 초기/후기 발현을 허용하는 세포이다. "폭스바이러스 감염된 세포에서 활성적인 프로모터"는 프로모터가 폭스바이러스 유전체의 일부가 아닌, 예를 들면, 플라스미드 또는 선형 폴리뉴클레오티드 또는 비-폭스바이러스 바이러스 유전체의 일부인 환경을 또한 포함한다; 이런 환경에서 본 발명에 따른 프로모터는 상기 프로모터를 포함하는 세포가 폭스바이러스 유전체를 또한 포함하면, 예를 들면, 상기 세포가 폭스바이러스로 감염되면 활성적이다. 이들 환경 하에, 바이러스 RNA 중합효소는 본 발명에 따른 프로모터를 인식하고, 그리고 상기 프로모터에 연결된 유전자/코딩 서열의 발현이 활성화된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "서열 번호: 1-10 및 77에서 명시된 핵산으로부터 유래된"은 서열 번호: 1-10 및 77의 뉴클레오티드 서열이 특정된 뉴클레오티드 변형, 예를 들면, 최소한 하나의 뉴클레오티드 부가, 결실, 치환 및/또는 전도를 달성하기 위한 기초로서 받아들여진다는 것을 의미한다. 용어 "유래된"은 예로서, 공지된 방법, 예를 들면, 오류 가능성 PCR에 의해 서열 번호: 1-10 및 77에 상응하는 물리적 서열을 실질적으로 변형하는 가능성을 포함한다. 용어 "유래된"은 서열 번호: 1-10 및 77의 서열에서 변형을 인실리코 수행하고, 그리고 이후, 이렇게 결정된 서열을 물리적 핵산으로서 합성하는 가능성을 부가적으로 포함한다. 가령, 용어 "유래된"은 예로서, 혼성화 안정성에 대하여 핵산 서열의 분석을 위해 임의의 공지된 컴퓨터 프로그램을 이용하는 가능성, 그리고 서열 번호: 1-10 및 77의 시작 서열을 변형함에 있어서 임의의 이차 핵산 구조의 가능성을 포괄한다. 바람직하게는, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개보다 많지 않은 뉴클레오티드가 서열 번호: 1-10 및 77의 핵산에 부가되고, 이들로부터 결실되고, 치환되고 및/또는 반전되었다. 게다가, 최소한 하나의 뉴클레오티드의 부가, 삽입 또는 결실은 핵산의 개시 코돈이 발현되도록 유발하지 않아야 한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "발현된", "발현하다", "발현" 등은 관심되는 서열의 전사 단독뿐만 아니라 전사 및 번역 둘 모두를 표시한다. 따라서, DNA의 형태로 존재하는 핵산의 발현을 지칭함에 있어서, 이러한 발현으로부터 발생하는 산물은 RNA (발현되는 서열의 전사 단독으로부터 발생) 또는 폴리펩티드 서열 (발현되는 서열의 전사 및 번역 둘 모두로부터 발생)일 수 있다. 용어 "발현"은 따라서, RNA 및 폴리펩티드 산물 둘 모두 상기 발현으로부터 발생하고 동일한 공유된 환경 내에 함께 남아있는 가능성을 또한 포함한다. 가령, mRNA가 폴리펩티드 산물로의 번역 이후에 존속할 때의 사례가 여기에 해당한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "발현 카세트"는 클로닝 및/또는 형질전환에 전형적으로 이용되는 벡터 또는 재조합 바이러스의 부분으로서 규정된다. 발현 카세트는 전형적으로, a) 하나 또는 그 이상의 코딩 서열 (가령, 개방 해독틀 (ORF), 유전자, 단백질 및/또는 항원을 인코딩하는 핵산), 그리고 b) 하나 또는 그 이상의 코딩 서열의 발현을 제어하는 서열로 구성된다. 추가적으로, 발현 카세트는 진핵생물에서 폴리아데닐화 부위를 통상적으로 내포하는 3' 비번역 영역을 포함할 수 있다.
용어 "재조합"은 자연에서 발생하지 않거나, 또는 자연에서 발견되지 않는 배열에서 다른 폴리뉴클레오티드에 연결된 반합성, 또는 합성 기원의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 의미한다.
본 발명의 한 가지 양상은 서열 번호: 1-10 및 77과 최소한 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일성을 갖고, 그리고 서열 번호: 1-10 및 77과 본질적으로 동일한 발현 특징을 갖는 핵산을 포함하는 프로모터를 포함한다.
본원에서 설명된 핵산 서열에 대하여 "퍼센트 (%) 서열 상동성 또는 동일성"은 최대 퍼센트 서열 동일성이 달성되도록 서열을 정렬하고 필요하면 갭을 도입한 후, 그리고 임의의 보존성 치환을 서열 동일성의 일부로서 고려하지 않고, 참고 서열 (다시 말하면, 이것이 유래되는 핵산 서열)에서 뉴클레오티드와 동일한, 후보 서열 내에 뉴클레오티드의 백분율로서 규정된다. 퍼센트 뉴클레오티드 서열 동일성 또는 상동성을 결정하는 목적을 위한 정렬은 당분야의 기술 범위 안에 있는 다양한 방식으로, 예를 들면, 공개적으로 가용한 컴퓨터 소프트웨어, 예를 들면, BLAST, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 이용하여 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여, 정렬을 계측하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다.
가령, 핵산 서열에 대한 적절한 정렬은 Smith and Waterman, (1981 ), Advances in Applied Mathematics 2:482- 489의 국부 상동성 알고리즘에 의해 제공된다. 이러한 알고리즘은 Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USA에 의해 개발되고, 그리고 Gribskov (1986), Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763에 의해 정규화된 채점 매트릭스를 이용함으로써 아미노산 서열에 적용될 수 있다. 서열의 퍼센트 동일성을 결정하기 위한 이러한 알고리즘의 예시적인 실행은 Genetics Computer Group (Madison, Wis.)에 의해 "BestFit" 유틸리티 응용프로그램에서 제공된다. 이러한 방법에 대한 디폴트 파라미터는 Wisconsin 서열 분석 패키지 프로그램 매뉴얼, 버전 8 (1995)에서 설명된다 (Genetics Computer Group, Madison, Wis.로부터 가용함). 본 발명의 맥락에서 퍼센트 동일성을 확립하는 바람직한 방법은 University of Edinburgh에 의해 저작권이 소유되고, John F. Collins 및 Shane S. Sturrok에 의해 개발되고, 그리고 IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, Calif)에 의해 배포된 프로그램의 MPSRCH 패키지를 이용하는 것이다. 패키지의 이러한 스위트로부터, Smith-Waterman 알고리즘이 이용될 수 있는데, 여기서 디폴트 파라미터가 채점 표에 이용된다 (가령, 12의 갭 열린 페널티, 1의 갭 연장 페널티, 그리고 6의 갭). 산출된 데이터로부터, "정합" 값은 "서열 동일성"을 반영한다. 서열 사이에 퍼센트 동일성 또는 유사성을 계산하기 위한 다른 적합한 프로그램은 당분야에서 전반적으로 공지되어 있다, 예를 들면, 다른 정렬 프로그램은 디폴트 파라미터에서 이용된 BLAST이다. 가령, BLASTN 및 BLASTp가 다음의 디폴트 파라미터를 이용하여 이용될 수 있다: 유전자 코드 = 표준; 필터 = 없음; 가닥 = 양쪽; 컷오프 = 60; 기대 = 10; 매트릭스 = BLOSUM62; 설명 = 50 서열; 분류 = 높은 점수; 데이터베이스 = 비다중, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+ GenBank CDS 번역+Swiss 단백질+Spupdate+PIR. 이들 프로그램의 상세는 다음의 인터넷 주소: http:// http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/에서 발견될 수 있다.
프로모터 및 핵산 서열
한 구체예에서, 본 발명은 서열 번호: 1-10 및 77로 구성된 군에서 선택되는 핵산 서열을 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 서열 번호: 1-10 및 77로 구성된 군에서 선택되는 핵산과 최소한 70% 동일성을 갖고, 그리고 서열 번호: 1-10 및 77로 구성된 군에서 선택되는 핵산 서열과 본질적으로 동일한 발현 특징을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 추가 구체예에서, 서열 번호: 1-10 및 77로 구성된 군에서 선택되는 핵산과 최소한 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 갖고, 그리고 서열 번호: 1-10 및 77로 구성된 군에서 선택되는 핵산 서열과 본질적으로 동일한 발현 특징을 갖는 핵산 서열이 제시된다.
다른 추가 구체예에서, 서열 번호: 1-10 및 77의 뉴클레오티드 서열과 비교하여 최소한 하나의 뉴클레오티드 부가, 결실, 치환 및/또는 전도를 포함하는, 서열 번호: 1-10 및 77에서 명시된 핵산으로부터 유래된 뉴클레오티드 서열을 갖고, 그리고 서열 번호: 1-10 및 77의 핵산과 본질적으로 동일한 발현 특징을 갖는 핵산이 제시된다.
다른 추가 구체예에서, 서열 번호: 1-10 및 77로 구성된 군에서 선택되는 핵산 서열에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 갖고, 그리고 서열 번호: 1-10 및 77로 구성된 군에서 선택되는 핵산 서열과 본질적으로 동일한 발현 특징을 갖는 핵산이 제시된다.
본 발명의 한 양상에서, 코딩 및/또는 유전자 서열의 발현을 증강하기 위한 프로모터가 제시되고, 상기 프로모터는 다음과 같이 구성된 군에서 선택된다:
a) 서열 번호: 1-10 및 77로 구성된 군에서 선택되는 핵산 서열 또는 이의 하위서열;
b) (a)의 뉴클레오티드 서열과 비교하여 최소한 하나의 뉴클레오티드 부가, 결실, 치환 및/또는 전도를 포함하는, (a)에서 명시된 핵산으로부터 유래된 뉴클레오티드 서열을 갖고, 그리고 (a)의 핵산과 본질적으로 동일한 발현 특징을 갖는 핵산;
c) (a)의 핵산과 최소한 70% 동일성을 갖고, 그리고 (a)의 핵산과 본질적으로 동일한 발현 특징을 갖는 핵산 서열; 및
d) (a), (b) 또는 (c)의 핵산 서열에 혼성화할 수 있고, 그리고 (a)의 핵산과 본질적으로 동일한 발현 특징을 갖는 핵산.
e) 서열 번호:3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9를 포함하는 핵산 서열, 여기서 상기 핵산 서열은 최대 245개 뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 추가 양상은 (a), (b) 또는 (c)의 핵산 서열에 혼성화할 수 있고, 그리고 (a)의 핵산과 본질적으로 동일한 발현 특징을 갖는 핵산에 관계한다. 용어 "혼성화할 수 있는"은 (a), (b) 또는 (c)의 핵산의 임의의 부분이 (a)의 핵산과 본질적으로 동일한 발현 특징을 갖는 임의의 DNA 서열의 검출 및 단리를 허용하도록 다른 DNA 서열에 혼성화할 수 있는 조건에서 혼성화를 의미한다. 혼성화는 엄격한 조건에서 실행된다; 조건이 더욱 엄격할수록, 부분적으로 상보성 서열이 떨어지도록 강제될 가능성이 더욱 높다, 다시 말하면, 더욱 높은 엄격함은 혼성화의 확률을 낮춘다. 실제로, 용어 "엄격한 조건"은 높은 온도 (가령, 65℃) 및/또는 낮은 염 농도 (가령, 0.1xSSC)를 갖는 혼성화 조건을 의미한다. 온도를 증가시키고 및/또는 염 농도를 감소시키는 것은 엄격함을 증가시킨다. 엄격한 조건 하에 혼성화는 서열 사이에 최소한 70% 또는 바람직하게는 최소한 75, 80, 85, 90 또는 95% 동일성이 존재하는 경우에만 발생할 것이다. 혼성화는 Ausubel et al. (2002) Short Protocols in Molecular Biology Vol. 1 5th ed. Canada에서 명시된 바와 같이 실행될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 프로모터 및/또는 핵산은 245 또는 242개 뉴클레오티드까지의 길이를 갖는다. 또한, 본 발명의 프로모터 및/또는 핵산은 232 또는 215개 뉴클레오티드까지의 길이를 갖는다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 프로모터는 212, 200개까지의 길이, 또는 195개 뉴클레오티드까지의 길이, 또는 183개까지의 길이, 또는 170 또는 167개 뉴클레오티드까지의 길이를 갖는다. 한 구체예에서, 상기에서 명시된 바와 같이 (b), (c) 또는 (d)의 핵산은 약 50-250개 뉴클레오티드, 약 60-220개 뉴클레오티드, 약 70-200개 뉴클레오티드, 약 80-190개 뉴클레오티드, 또는 약 90-180개 뉴클레오티드를 포함한다.
대안으로, 이들 프로모터의 유도체를 이용하는 것이 본 발명의 범위 안에 있는데, 이것은 서열 번호: 1-10 및 77 중에서 한 가지에서 규정된 바와 같은 서열의 하위서열일 수 있다. 용어 "서열 번호: 1-10 및 77 중에서 한 가지에 따른 서열의 하위서열"은 프로모터로서, 특히 오소폭스바이러스, 예를 들면, FPV에서, 또는 오소폭스바이러스, 예를 들면, FPV 감염된 세포에서 프로모터로서 여전히 활성적인 서열 번호: 1 내지 10 및 77 중에서 한 가지의 더욱 짧은 단편을 지칭한다.
다양한 구체예에서, 서열 번호:9의 예시적인 하위서열은 서열 번호:2-8에서 선택된다. 한 양상에서, 서열 번호: 4 또는 5는 서열 번호: 9의 선호되는 하위서열이다. 다른 양상에서, 서열 번호: 8의 하위서열은 서열 번호: 2-7을 포함하고, 서열 번호:7의 하위서열은 서열 번호: 2-6을 포함하고, 서열 번호:6의 하위서열은 서열 번호: 2-5를 포함하고, 서열 번호:5의 하위서열은 서열 번호: 2-4를 포함하고, 서열 번호:6의 하위서열은 서열 번호: 2-5를 포함하고, 서열 번호:5의 하위서열은 서열 번호: 2-4를 포함하고, 서열 번호: 4의 하위서열은 서열 번호: 2-3을 포함하고, 그리고 서열 번호: 3의 하위서열은 서열 번호: 2를 포함한다.
서열 번호: 1-10 및 77 중에서 한 가지 또는 이의 하위서열의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 이것으로 구성되는 프로모터의 유도체는 또한, 서열 번호: 1-10 및 77의 서열 중에서 한 가지에 대하여 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 서열일 수 있다. 본 발명에 따른 유도체는 프로모터로서, 특히 오소폭스바이러스 및/또는 조류폭스바이러스 바이러스 감염된 세포에서 오소폭스바이러스 및/또는 조류폭스바이러스 프로모터로서, 더욱 바람직하게는 조류폭스바이러스 감염된 세포에서 조류폭스바이러스 프로모터로서 여전히 활성적이다. 본 발명에 따른 유도체에서 결실, 치환 및 삽입이 한 서열에서 합동될 수 있다.
바람직하게는, 유도체는 본원에서 설명된 바와 같은 서열 번호: 1-10 및 77의 서열 중에서 한 가지 또는 이의 하위서열과 비교할 때 최소한 40%, 더욱 바람직하게는 최소한 60%, 이보다 더욱 바람직하게는 최소한 80%, 가장 바람직하게는 최소한 90%의 상동성을 갖는다.
브라큐리 단백질
본 발명의 여러 양상에서, 본 발명자들은 본원에서 설명된 다양한 프로모터를 합성한 결과로서, 본 발명자들이 하나 또는 그 이상의 재조합 브라큐리 단백질을 창출했다는 것을 확정하였다. 특히, 하나 또는 그 이상의 재조합 브라큐리 단백질은 본 발명의 프로모터 중에서 하나 또는 그 이상 및 브라큐리 단백질의 조합으로부터 발생하는 융합 단백질이다. 이들 재조합 브라큐리 단백질 중에서 하나 또는 그 이상이 백신, 약제 또는 다른 치료 조성물의 일부로서 유용할 수 있을 것으로 예기된다.
따라서, 다양한 양상에서, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 합성 및 신규한 재조합 브라큐리 단백질 및/또는 재조합 브라큐리 단백질을 인코딩하는 합성 및 신규한 핵산을 포함한다.
한 구체예에서, 브라큐리 단백질을 인코딩하는 핵산과 최소한 70% 동일성을 갖는 하나 또는 그 이상의 핵산 서열이 제시되고, 여기서 브라큐리 단백질은 다음과 같이 구성된 군에서 선택된다: 서열 번호: 18-19, 22-23, 26-27, 30-31, 34-35, 38-39, 42-43, 46-47, 50-51, 54-55, 58-59, 62-63, 66-67, 70 및 71. 추가 구체예에서, 브라큐리 단백질을 인코딩하는 핵산과 최소한 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 갖는 하나 또는 그 이상의 핵산이 제시되고, 여기서 브라큐리 단백질은 다음과 같이 구성된 군에서 선택된다: 서열 번호: 18-19, 22-23, 26-27, 30-31, 34-35, 38-39, 42-43, 46-47, 50-51, 54-55, 58-59, 62-63, 66-67, 70 및 71.
본 발명의 다양한 다른 구체예에서, 다음과 같이 구성된 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 브라큐리 단백질이 제시된다: 서열 번호: 18-19, 22-23, 26-27, 30-31, 34-35, 38-39, 42-43, 46-47, 50-51, 54-55, 58-59, 62-63, 66-67, 70 및 71. 추가 구체예에서, 다음과 같이 구성된 군에서 선택되는 펩티드와 최소한 70% 동일성을 갖는 하나 또는 그 이상의 브라큐리 단백질이 제시된다: 서열 번호: 18-19, 22-23, 26-27, 30-31, 34-35, 38-39, 42-43, 46-47, 50-51, 54-55, 58-59, 62-63, 66-67, 70 및 71. 또 다른 추가의 구체예에서, 서열 번호: 18-19, 22-23, 26-27, 30-31, 34-35, 38-39, 42-43, 46-47, 50-51, 54-55, 58-59, 62-63, 66-67, 70 및 71로 구성된 군에서 선택되는 펩티드와 최소한 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 갖는 펩티드가 제시된다.
다른 구체예에서, 브라큐리 단백질을 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 핵산 서열이 제시되고, 상기 핵산 서열은 다음과 같이 구성된 군에서 선택된다: 서열 번호: 16-17, 20-21, 24-25, 28-29, 32-33, 36-37, 40-41, 44-45, 48-49, 52-53, 56-57, 60-61, 64-65, 68 및 69.
다른 구체예에서, 서열 번호: 16-17, 20-21, 24-25, 28-29, 32-33, 36-37, 40-41, 44-45, 48-49, 52-53, 56-57, 60-61, 64-65, 68 및 69로 구성된 군에서 선택되는 핵산과 최소한 70% 동일성을 갖고, 그리고 서열 번호: 16-17, 20-21, 24-25, 28-29, 32-33, 36-37, 40-41, 44-45, 48-49, 52-53, 56-57, 60-61, 64-65, 68 및 69로 구성된 군에서 선택되는 핵산 서열과 본질적으로 동일한 발현 특징을 갖는 하나 또는 그 이상의 핵산 서열이 제시된다. 추가 구체예에서, 서열 번호: 16-17, 20-21, 24-25, 28-29, 32-33, 36-37, 40-41, 44-45, 48-49, 52-53, 56-57, 60-61, 64-65, 68 및 69로 구성된 군에서 선택되는 핵산과 최소한 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 갖고, 그리고 서열 번호: 16-17, 20-21, 24-25, 28-29, 32-33, 36-37, 40-41, 44-45, 48-49, 52-53, 56-57, 60-61, 64-65, 68 및 69로 구성된 군에서 선택되는 핵산 서열과 본질적으로 동일한 발현 특징을 갖는 핵산 서열이 제시된다.
바람직한 구체예에서, 서열 번호: 16-17, 20-21, 24-25, 28-29, 32-33, 36-37, 40-41, 44-45, 48-49, 52-53, 56-57, 60-61, 64-65, 68 및 69로 구성된 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 핵산 서열이 제시된다.
발현 카세트
추가 구체예에 따라, 본 발명은 이들 프로모터 중에서 하나 또는 그 이상 및/또는 브라큐리 재조합 단백질 및/또는 핵산을 포함하는 본 발명에 따른 발현 카세트를 제시한다.
한 구체예에서, 서열 번호: 1-10으로 구성된 군에서 선택되는 핵산과 최소한 70% 동일성을 갖는 프로모터, 그리고 서열 번호: 11, 13, 18-19, 22-23, 26-27, 30-31, 34-35, 38-39, 42-43, 46-47, 50-51, 54-55, 58-59, 62-63, 66-67, 70 및 71로 구성된 군에서 선택되는 브라큐리 펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 카세트가 제시된다. 다른 구체예에서, 서열 번호: 1-10 및 77로 구성된 군에서 선택되는 프로모터 및/또는 브라큐리 펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 카세트가 제시되고, 여기서 상기 핵산은 다음과 같이 구성된 군에서 선택된다: 서열 번호: 12, 14-17, 20-21, 24-25, 28-29, 32-33, 36-37, 40-41, 44-45, 48-49, 52-53, 56-57, 60-61, 64-65, 68 및 69.
바람직한 구체예에서, 서열 번호: 72-76으로 구성된 군에서 선택되는 핵산 서열에 최소한 70% 상동한 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트가 제시된다. 추가 구체예에서, 서열 번호:72-76으로 구성된 군에서 선택되는 핵산과 최소한 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트가 제시된다.
더욱 바람직한 구체예에서, 서열 번호: 72를 포함하는 발현 카세트가 제시된다.
더욱 바람직한 구체예에서, 서열 번호: 73을 포함하는 발현 카세트가 제시된다.
더욱 바람직한 구체예에서, 서열 번호: 74를 포함하는 발현 카세트가 제시된다.
재조합 폭스바이러스
추가 구체예에 따라, 본 발명에 따른 핵산, 프로모터, 재조합 단백질 및/또는 발현 카세트는 벡터의 일부일 수 있다. 용어 "벡터"는 당업자에게 공지된 임의의 벡터를 지칭한다. 벡터는 플라스미드 벡터, 예를 들면, pBR322 또는 pUC 시리즈의 벡터일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 벡터는 재조합 바이러스이다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "바이러스" 또는 "재조합 바이러스"는 바이러스 유전체를 포함하는 감염성 바이러스를 지칭한다. 이 경우에 있어서, 본 발명의 핵산, 프로모터, 재조합 단백질 및/또는 발현 카세트는 개별 재조합 바이러스의 바이러스 유전체의 일부이다. 재조합 바이러스 유전체는 포장되고, 그리고 획득된 재조합 바이러스는 세포 및 세포주의 감염, 특히 인간을 비롯한 살아있는 동물의 감염에 이용될 수 있다. 본 발명에 따라서 이용될 수 있는 전형적인 재조합 바이러스는 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 또는 아데노 연관된 바이러스 2 (AAV2)의 기초에서 벡터이다. 폭스바이러스 벡터가 가장 바람직하다.
여러 구체예에서, 본 발명에 따른 핵산, 프로모터, 폴리펩티드 및 발현 카세트는 바람직하게는, 폭스바이러스 프로모터로서 활성적이거나, 또는 폭스바이러스 감염된 세포에서 프로모터로서 활성적이다. 폭스바이러스는 바람직하게는 조류폭스바이러스 또는 오소폭스바이러스이다. 더욱 바람직하게는, 폭스바이러스는 조류폭스바이러스이다.
용어 "조류폭스바이러스"는 임의의 조류폭스바이러스, 예를 들면, 계두바이러스, 카나리아두바이러스, 운코폭스바이러스, 미나흐폭스바이러스, 구두바이러스, 프시타신폭스바이러스, 큐알리폭스바이러스, 피아콕폭스바이러스, 펭귄폭스바이러스, 스패로우폭스바이러스, 스탈링폭스바이러스 및 터키폭스바이러스를 지칭한다. 바람직한 조류폭스바이러스는 카나리아두바이러스 및 계두바이러스이다.
카나리아두바이러스의 실례는 균주 렌슬러 (Rentschler)이다. ALVAC로 명명된 플라크 정제된 카나리아 두창 균주 (U.S. 특허 번호 5,766,598)는 부다페스트 조약의 규정 하에, 수탁 번호 VR-2547로 American Type Culture Collection (ATCC)에 기탁되었다. 다른 카나리아 두창 균주는 Institute Merieux, Inc.로부터 가용한, LF2 CEP 524 24 10 75로서 지정된 상업적인 카나리아 두창 백신 균주이다.
계두바이러스의 실례는 균주 FP-1, FP-5, TROVAC (U.S. 특허 번호 5,766,598), 그리고 POXVAC-TC (U.S. 특허 7,410,644)이다. FP-1는 1일령 닭에서 백신으로서 이용되도록 변형된 Duvette 균주이다. 상기 균주는 O DCEP 25/CEP67/2309 October 1980으로서 지정된 상업적인 계두바이러스 백신 균주이고 Institute Merieux, Inc로부터 가용하다. FP-5는 American Scientific Laboratories (Division of Schering Corp.) Madison, Wis., 미국 수의학적 면허 번호 165, 일련 번호 30321로부터 가용한 닭 배아 기원의 상업적인 계두바이러스 백신 균주이다.
일정한 구체예에서, 재조합 FPV는 서열 번호: 1-10 및 77로 구성된 군에서 선택되는 핵산 서열을 포함한다. 다양한 추가 구체예에서, 재조합 FPV는 서열 번호: 72-76에서 선택되는 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함한다. 더욱 바람직한 구체예에서, 재조합 FPV는 서열 번호: 72, 73 및 74에서 선택되는 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함한다.
다른 구체예에서, 재조합 FPV는 다음과 같이 구성된 군에서 선택되는 브라큐리 항원을 인코딩하는 핵산을 포함한다: 서열 번호: 11, 13, 18-19, 22-23, 26-27, 30-31, 34-35, 38-39, 42-43, 46-47, 50-51, 54-55, 58-59, 62-63, 66-67, 70 및 71. 추가 구체예에서, 재조합 FPV는 다음과 같이 구성된 군에서 선택되는 브라큐리 펩티드를 포함한다: 서열 번호: 11, 13, 18-19, 22-23, 26-27, 30-31, 34-35, 38-39, 42-43, 46-47, 50-51, 54-55, 58-59, 62-63, 66-67, 70 및 71. 추가 구체예에서, 재조합 FPV는 다음과 같이 구성된 군에서 선택되는 핵산을 포함한다: 서열 번호: 12, 14-17, 20-21, 24-25, 28-29, 32-33, 36-37, 40-41, 44-45, 48-49, 52-53, 56-57, 60-61, 64-65, 68 및 69. 더욱 바람직한 구체예에서, 재조합 FPV는 서열 번호: 18-19, 22-23, 26-27, 30-31, 34-35, 38-39, 42-43, 46-47, 50-51, 54-55, 58-59, 62-63, 66-67, 70 및 71로 구성된 군에서 선택되는 브라큐리 펩티드 및/또는 서열 번호: 16-17, 20-21, 24-25, 28-29, 32-33, 36-37, 40-41, 44-45, 48-49, 52-53, 56-57, 60-61, 64-65, 68 및 69로 구성된 군에서 선택되는 핵산을 포함한다.
본 발명의 다양한 다른 구체예에서, 재조합 폭스바이러스는 오소폭스바이러스, 예를 들면, 하지만 제한 없이, 우두바이러스, 변형된 우두바이러스 앙카라 (MVA), 또는 MVA-BN이다.
우두바이러스 균주의 실례는 균주 Temple of Heaven, Copenhagen, Paris, Budapest, Dairen, Gam, MRIVP, Per, Tashkent, TBK, Tom, Bern, Patwadangar, BIEM, B-15, Lister, EM-63, New York City Board of Health, Elstree, Ikeda 및 WR이다. 바람직한 우두바이러스 (VV) 균주는 Wyeth (DRYVAX) 균주 (U.S. 특허 7,410,644)이다. 다른 바람직한 VV 균주는 MVA (Sutter, G. et al. [1994], Vaccine 12: 1032-40)이다. 다른 바람직한 VV 균주는 MVA-BN이다.
본 발명의 실시에서 유용하고 부다페스트 조약의 규정에 따라 기탁된 MVA 바이러스 균주의 실례는 1994년 1월 27일자 수탁 번호 ECACC 94012707로 European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Vaccine Research and Production Laboratory, Public Health Laboratory Service, Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, United Kingdom에 기탁된 균주 MVA 572, 그리고 2000년 12월 7일자에 ECACC 00120707 하에 기탁된 MVA 575이다. 2000년 8월 30일자에 번호 V00083008 하에 European Collection of Cell Cultures (ECACC)에 기탁된 MVA-BN, 그리고 이의 유도체가 추가 예시적인 균주이다.
비록 MVA-BN이 이의 더욱 높은 안전성 (더욱 적은 복제 적격성)으로 인해 선호되긴 하지만, 모든 MVA가 본 발명에 적합하다. 본 발명의 한 구체예에 따라, MVA 균주는 MVA-BN 및 이의 유도체이다. MVA-BN 및 이의 유도체의 정의는 본원에 참조로서 편입되는 PCT/EP01/13628에서 제공된다.
한 구체예에서, 본 발명은 암 요법을 위한 재조합 오소폭스바이러스, 바람직하게는 우두바이러스 (VV), Wyeth 균주, ACAM 1000, ACAM 2000, MVA, 또는 MVA-BN을 포괄한다. 재조합 오소폭스바이러스는 오소폭스바이러스 내로 이종성 서열의 삽입에 의해 산출된다.
일정한 구체예에서, MVA는 2000년 8월 30일자에 번호 V00083008 하에 European Collection of Cell Cultures (ECACC)에 기탁되고, 그리고 국제 PCT 공보 WO2002042480 (예로서, U.S. 특허 번호 6,761,893 및 6,913,752를 또한 참조한다)에서 설명된 MVA-BN이고, 이들 문헌은 본원에 참조로서 편입된다.
일정한 구체예에서, 재조합 MVA는 MVA-BN의 유도체이다. 이런 "유도체"는 기탁된 균주 (ECACC 번호 V00083008)와 본질적으로 동일한 복제 특징을 전시하지만, 이의 유전체의 하나 또는 그 이상의 부분에서 차이를 전시하는 바이러스를 포함한다. 기탁된 바이러스와 동일한 "복제 특징"을 갖는 바이러스는 CEF 세포 및 세포주, HeLa, HaCat 및 143B에서 기탁된 균주와 유사한 증폭 비율로 복제하고; 그리고 생체내에서, 예를 들면, AGR129 유전자도입 생쥐 모형에서 결정될 때 유사한 복제 특징을 보여주는 바이러스이다.
일정한 구체예에서, 재조합 오소폭스바이러스는 서열 번호: 1-10 및 77로 구성된 군에서 선택되는 핵산을 포함한다. 다양한 추가 구체예에서, 재조합 오소폭스바이러스는 서열 번호: 72-76에서 선택되는 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함한다. 더욱 바람직한 구체예에서, 재조합 오소폭스바이러스는 서열 번호: 72, 73 및 74에서 선택되는 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함한다.
다른 구체예에서, 재조합 오소폭스바이러스는 다음과 같이 구성된 군에서 선택되는 브라큐리 항원을 인코딩하는 핵산을 포함한다: 서열 번호: 11, 13, 18-19, 22-23, 26-27, 30-31, 34-35, 38-39, 42-43, 46-47, 50-51, 54-55, 58-59, 62-63, 66-67, 70 및 71. 추가 구체예에서, 재조합 오소폭스바이러스는 다음과 같이 구성된 군에서 선택되는 핵산을 포함한다: 서열 번호: 12, 14-17, 20-21, 24-25, 28-29, 32-33, 36-37, 40-41, 44-45, 48-49, 52-53, 56-57, 60-61, 64-65, 68 및 69. 더욱 바람직한 구체예에서, 재조합 오소폭스바이러스는 서열 번호: 18-19, 22-23, 26-27, 30-31, 34-35, 38-39, 42-43, 46-47, 50-51, 54-55, 58-59, 62-63, 66-67, 70 및 71로 구성된 군에서 선택되는 브라큐리 펩티드 및/또는 서열 번호: 16-17, 20-21, 24-25, 28-29, 32-33, 36-37, 40-41, 44-45, 48-49, 52-53, 56-57, 60-61, 64-65, 68 및 69로 구성된 군에서 선택되는 핵산을 포함한다.
본 발명에 따른 발현 카세트 또는 프로모터가 바이러스 유전체 내로, 특히 폭스바이러스의 유전체 내로, 가장 바람직하게는 오소폭스바이러스 및/또는 FPV의 유전체 내로 삽입될 수 있는 방법은 당업자에게 알려져 있다. 가령, 본 발명에 따른 발현 카세트 또는 프로모터 또는 이의 유도체는 상동성 재조합에 의해 폭스바이러스의 유전체 내로 삽입될 수 있다. 이를 위해, 핵산은 허용적 세포주, 예를 들면, CEF 또는 BHK 세포 내로 형질감염되고, 여기서 상기 핵산은 본 발명에 따른 발현 카세트 또는 프로모터 또는 이의 유도체가 삽입되는 폭스바이러스 유전체의 영역에 상동하는 뉴클레오티드 스트레치에 의해 측면에서 접하는 본 발명에 따른 발현 카세트 또는 프로모터 또는 이의 유도체를 포함한다. 세포는 폭스바이러스에 의해 감염되고, 그리고 감염된 세포에서 상동성 재조합은 핵산 및 바이러스 유전체 사이에 일어난다. 대안으로, 세포를 폭스바이러스로 먼저 감염시키고, 그리고 이후, 핵산을 감염된 세포 내로 형질감염시키는 것도 가능하다. 이번에도, 재조합이 세포 내에서 발생한다. 재조합 폭스바이러스는 이후, 선행 기술에서 공지된 방법에 의해 선별된다. 재조합 폭스바이러스의 작제는 이러한 특정 방법에 한정되지 않는다. 그 대신에, 당업자에게 공지된 임의의 적합한 방법이 이러한 목적으로 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 발현 카세트 또는 프로모터는 바이러스 또는 바이러스 벡터의 임의의 적합한 부분 내로, 특히 바이러스 유전체 내로 도입될 수 있다. 오소폭스바이러스 및 조류폭스바이러스의 경우에, 삽입은 바이러스 유전체의 비필수적인 부분 내로 또는 바이러스 유전체의 유전자간 영역 내로 만들어질 수 있다. 용어 "유전자간 영역"은 바람직하게는, 코딩 서열을 포함하지 않는 2개의 인접한 유전자 사이에 위치된 바이러스 유전체의 부분을 지칭한다. 바이러스가 오소폭스바이러스 및 조류폭스바이러스이면, 삽입은 또한, 바이러스 유전체의 결실 부위 내로 만들어질 수 있다. 용어 "결실 부위"는 자연발생 오소폭스바이러스 또는 조류폭스바이러스의 유전체에 대하여 결실되는 바이러스 유전체의 부분을 지칭한다. 하지만, 삽입 부위는 오소폭스바이러스 및 조류폭스바이러스 유전체 내에 이들 바람직한 삽입 부위에 한정되지 않는데, 그 이유는 최소한 하나의 세포 배양 시스템, 예를 들면, 닭 배아 섬유모세포 (CEF 세포)에서 증폭되고 증식될 수 있는 재조합체를 획득하는 것이 가능하기만 하면, 발현 카세트가 바이러스 유전체 내에 어디든지 삽입될 수 있다는 것이 본 발명의 범위 안에 있기 때문이다.
본 발명에 따른 프로모터는 벡터, 예를 들면, 오소폭스바이러스 및/또는 조류폭스바이러스의 유전체의 이미 일부인 유전자를 발현하는데 이용될 수 있다. 이런 유전자는 바이러스 유전체의 자연적으로 일부인 유전자 또는 벡터 내로 이미 삽입된 외래 유전자일 수 있다. 이들 사례에서, 본 발명에 따른 프로모터는 벡터 내에 유전자의 상류에 삽입되고, 이의 발현은 상기 프로모터에 의해 제어된다.
백신 및/또는 조성물
추가 구체예에 따라, 본 발명은 백신 또는 약제로서 본 발명에 따른 벡터에 관계한다. 더욱 일반적인 용어에서 본 발명은 본 발명에 따른 발현 카세트, DNA 또는 벡터를 포함하는 백신 또는 제약학적 조성물에 관계한다. 백신 또는 제약학적 조성물이 동물 또는 인체에 투여될 수 있는 방법은 당업자에게 알려져 있다. DNA 및 재조합 플라스미드 벡터의 경우에, DNA 및 벡터는 주사에 의해 간단히 투여될 수 있다. 백신 또는 조성물이 재조합 바이러스, 예를 들면, 오소폭스바이러스 또는 조류폭스바이러스, 특히 재조합 MVA 또는 재조합 FPV이면, 이것은 또한, 당업자의 지식에 따라, 예를 들면, 정맥내, 근육내, 비내, 피내 또는 피하 투여에 의해 동물 또는 인체에 투여될 수 있다. 투여되는 바이러스의 양에 관한 추가 상세는 아래에 제공된다.
제약학적 조성물 또는 백신은 일반적으로, 본 발명에 따른 프로모터, 발현 카세트 또는 벡터에 더하여, 하나 또는 그 이상의 제약학적 허용되는 및/또는 승인된 담체, 첨가제, 항생제, 보존제, 어쥬번트, 희석제 및/또는 안정제를 포함할 수 있다. 이런 보조 물질은 물, 식염수, 글리세롤, 에탄올, 적심제 또는 유화제, pH 완충 물질, 또는 기타 유사한 것일 수 있다. 적합한 담체는 전형적으로 크고, 천천히 물질대사되는 분자, 예를 들면, 단백질, 다당류, 폴리유산, 폴리글리콜산, 중합성 아미노산, 아미노산 공중합체, 지질 응집체, 또는 기타 유사한 것이다.
제약학적 조성물 또는 백신의 제조를 위해, 본 발명에 따른 DNA, 발현 카세트 또는 벡터, 특히 재조합 오소폭스바이러스 또는 조류폭스바이러스, 예를 들면, 재조합 MVA 또는 재조합 FPV는 생리학적으로 허용되는 형태로 전환된다. MVA 및 FPV의 경우에, 이것은 천연두에 대항하여 예방접종에 이용된 폭스바이러스 백신의 제조에서 경험에 근거하여 행위될 수 있다 (Stickl, H. et al. [1974] Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392)에 의해 설명된 바와 같이). 가령, 정제된 바이러스는 약 10 mM Tris, 140 mM NaCl pH 7.4에서 조제된 5x108 TCID50/ml의 역가로 -80℃에서 보관된다. 예방 주사의 제조를 위해, 예로서 101-109 입자의 본 발명에 따른 재조합 바이러스가 앰풀, 바람직하게는 유리 앰풀 내에 2% 펩톤 및 1% 인간 알부민의 존재에서 인산염 완충된 식염수 (PBS)에서 동결건조된다. 대안으로, 예방 주사는 제제에서 바이러스의 단계별, 동결건조에 의해 생산될 수 있다. 이러한 제제는 추가 첨가제, 예를 들면, 만니톨, 덱스트란, 당, 글리신, 락토오스 또는 폴리비닐피롤리돈, 또는 생체내 투여에 적합한 다른 첨가제, 예를 들면, 항산화제 또는 불활성 가스, 안정제 또는 재조합 단백질 (가령, 인간 혈청 알부민)을 내포할 수 있다. 동결건조에 적합한 전형적인 바이러스 내포 제제는 10 mM Tris-완충액, 140 mM NaCl, 18.9 g/l 덱스트란 (MW 36000-40000), 45 g/l 수크로오스, 0.108 g/l L-글루탐산 모노 칼륨 염 일수화물 pH 7.4를 포함한다. 유리 앰풀은 이후, 밀봉되고 4℃ 및 실온 사이에서 수개월 동안 보관될 수 있다. 하지만, 더 이상 필요하지 않으면, 앰풀은 바람직하게는 -20℃ 미만의 온도에서 보관된다.
예방접종 또는 요법을 위해, 동결건조물 또는 동결건조된 산물은 0.1 내지 0.5 ml의 수성 용액, 바람직하게는 물, 생리 식염수 또는 Tris 완충액에서 용해되고, 그리고 전신적으로 또는 국부적으로, 다시 말하면, 비경구, 근육내 또는 당업자에게 알려진 임의의 다른 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. 투여 방식, 투여 용량 및 투여 횟수는 당업자에 의해 공지된 방식으로 최적화될 수 있다.
하나 또는 그 이상의 구체예에서, 본 발명은 치료적 목적을 위해 코딩 서열을 표적 세포, 예를 들면, 인간 세포 내로 도입하기 위한 방법에 더욱 관계하고, 상기 방법은 본 발명에 따른 핵산, 프로모터, 재조합 단백질 및/또는 발현 카세트의 표적 세포 내로의 도입을 포함한다. 예시적인 인간 표적 세포는 항원 제시 세포 (APCs), 예를 들면, 수지상 세포, 대식세포 및 다른 비 APC, 예를 들면, 섬유모세포, 종양 세포 등을 포함할 수 있다.
본 발명은 본 발명에 따른 재조합 바이러스로 숙주 세포의 감염, 그 이후에 적합한 조건 하에 감염된 숙주 세포의 배양, 그리고 그 이후에, 상기 숙주 세포에 의해 생산된 펩티드 및/또는 단백질 및/또는 바이러스의 단리 및/또는 농축을 포함하는 펩티드, 단백질 및/또는 바이러스를 생산하기 위한 방법에 더욱 관계한다. 본 발명에 따른 바이러스를 생산하는, 다시 말하면, 증폭하는 것이 의도되면, 세포는 바이러스가 복제할 수 있는 세포이어야 한다. 폭스바이러스, 특히 MVA의 경우에, 적합한 세포는 CEF (닭 배아 섬유모세포) 또는 BHK (아기 햄스터 신장) 세포이다. 조류폭스바이러스, 예를 들면, 계두바이러스의 경우에, 적합한 세포는 CEF 또는 CED (닭 배아 진피) 세포를 포함한다. 본 발명에 따른 재조합 바이러스에 의해 인코딩된 펩티드/단백질을 생산하는 것이 의도되면, 세포는 재조합 바이러스 벡터에 의해 감염될 수 있고, 그리고 바이러스 인코딩된 단백질/펩티드의 발현을 허용하는 임의의 세포일 수 있다.
본 발명은 본 발명에 따른 발현 카세트, 핵산, 프로모터, 재조합 단백질 및/또는 발현 카세트 DNA로 세포의 형질감염, 그 이후에 폭스바이러스로 상기 세포의 감염을 포함하는 펩티드, 단백질 및/또는 바이러스를 생산하기 위한 방법에 더욱 관계한다. 감염된 숙주 세포는 적합한 조건 하에 배양된다. 추가 단계는 상기 숙주 세포에 의해 생산된 펩티드 및/또는 단백질 및/또는 바이러스의 단리 및/또는 농축을 포함한다. 이들 세포를 폭스바이러스로 감염시키는 단계는 세포의 형질감염의 단계 전후에 이루질 수 있다.
본 발명은 본 발명에 따른 핵산, 프로모터, 재조합 단백질 및/또는 발현 카세트를 포함하는 세포에 더욱 관계한다. 특히, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 바이러스로 감염된 세포에 관계한다.
실시예
다음 실시예는 본 발명을 더욱 예증한다. 제공된 실시예는 기술의 적용가능성을 제한하는 것으로 결코 해석될 수 없는 것으로 당업자에 의해 이해될 것이다.
실시예 1: 재조합 계두바이러스로 감염된 인간 DCs에서 브라큐리의 발현
브라큐리 단백질의 발현을 확인하기 위해, 인간 수지상 세포 (DC)는 2.5의 감염 다중도 (MOI)에서 양성 대조 바이러스, 브라큐리 및 TRICOM을 포함하는 재조합 MVA로 감염되었다. 인간 DCs는 또한, 본 발명에 따른 브라큐리 발현 카세트 및 TRICOM을 포함하는 음성 대조 비재조합 계두 (FPV-WT) 또는 재조합 계두바이러스 균주로 감염되었다. FPV-WT, FPV-mBN343A, FPV-mBN344A 및 FPV-mBN345A를 비롯한 각 FPV 균주 (표 1에서 더욱 상세하게 열거됨)가 20의 MOI에서 DCs를 감염시키는데 이용되었다. FPV브라큐리 발현은 토끼 단일클론 항-브라큐리 항체로 수행된 웨스턴 블롯 분석을 통해 검출되었다. 하우스키핑 단백질 글리세르알데히드 3-인산염 탈수소효소 (GAPDH) 또한, 부하 대조로서 웨스턴 블롯 분석을 통해 검출되었다.
표 1. 브라큐리 발현 카세트 및 TRICOM을 포함하는 재조합 계두바이러스 균주
재조합 FPV 균주 발현 카세트
FPV-mBN343A 서열 번호: 74
FPV-mBN344A 서열 번호: 75
FPV-mBN345A 서열 번호: 72
FPV-mBN354A 서열 번호: 76
FPV-mBN355A 서열 번호: 73
결과는 도면 1에서 도시된다. 브라큐리의 발현은 FPV-mBN343A 및 FPVmBN345 재조합 FPVs로 검출되었지만, FPV-mBN344A 재조합 FPV를 이용하여 검출되지 않았다. 브라큐리 발현은 또한, MVA-브라큐리-TRICOM으로 검출되었다. 표본의 유사한 부하는 GAPDH 발현에 의해 증명되었다.
실시예 2: 재조합 계두바이러스로 감염된 인간 DCs에서 브라큐리의 발현
브라큐리 단백질의 발현-수준은 또한, 상이한 프로모터로 브라큐리를 발현하는 추가 재조합 FPV 균주 사이에 비교되었다. 인간 수지상 세포 (DC)는 5의 MOI에서 브라큐리 및 TRICOM을 포함하는 양성 대조 재조합 MVA, 그리고 음성 대조 비재조합 균주 MVA-WT로 감염되었다. 인간 DCs는 또한, 본 발명에 따른 브라큐리 발현 카세트 및 TRICOM을 포함하는 재조합 FPVs (가령, FPV-mBN343A, FPV-mBN344A, FPV-mBN345A, FPV-mBN354A, FPV-mBN355A, 표 1을 참조한다)로 감염되었다. 인간 DCs는 우두바이러스 (VV)-40k 프로모터 또는 PrS 프로모터를 갖는 브라큐리 발현 카세트를 포함하는 재조합 계두바이러스 (FPV)로 부가적으로 감염되었다. 비재조합 FPV-WT 균주는 음성 대조로서 역할을 하였다. 이들 FPVs 모두 40의 MOI에서 이용되었다. 브라큐리 발현은 토끼 단일클론 항-브라큐리 항체로 수행된 웨스턴 블롯 분석을 통해 검출되었다. GAPDH는 또한, 부하 대조로서 검출되었다.
결과는 도면 2에서 도시된다. 브라큐리의 발현은 FPV-mBN343A 및 FPV-mBN345A 재조합 FPVs로 검출되었지만, FPV-mBN344A 및 FPV-mBN354A 재조합 FPV를 이용하여 검출되지 않았다. 더욱 구체적으로, 브라큐리를 주동하는 VV-40k 또는 PrS 프로모터를 갖는 재조합 FPVs (다시 말하면, FVP-mBN281A, FVP-mBN249B)의 경우에 브라큐리의 발현이 더욱 낮은 수준에서 검출되었다. 음성 대조 (감염되지 않은 DCs, MVA-WT, 또는 FPV-WT)에서는 브라큐리 발현이 검출되지 않았다. 표본의 유사한 부하는 GAPDH 발현에 의해 증명되었다.
실시예 2에서 도시된 웨스턴 블롯으로부터 브라큐리 발현 수준은 세포 사이에서 동등한 수준에서 발현될 것으로 예상되는 하우스키핑 유전자 GAPDH의 발현에 상대적으로 정규화되었다. 각 브라큐리 및 GAPDH 띠의 강도가 계측되었고, 그리고 동일한 표본 내에서 브라큐리 및 GAPDH 띠의 강도 사이에 비율이 계산되었다.
결과는 도면 3에서 도시된다. FPV 구조체 중에서, GAPDH에 비하여 브라큐리의 가장 높은 발현은 FPV-mBN355A로 감염된 DCs에서 검출되었다. 중간의 상대적 브라큐리 발현은 FPV-mBN343A 또는 FPV-mBN345A로 감염된 DCs에서 검출되었다. 가장 낮은 상대적 브라큐리 발현은 브라큐리를 주동하는 VV-40k 또는 PrS 프로모터를 갖는 재조합 FPVs (다시 말하면, FVP-mBN281A, FVP-mBN249B)로부터 검출되었다. 브라큐리의 가장 높은 상대적 발현은 양성 대조 바이러스 MVA-브라큐리-TRICOM으로 감염으로부터 관찰되었다; 음성 대조 표본에서는 브라큐리 발현이 검출되지 않았다. 이런 이유로, 재조합 FPV 균주 중에서, 브라큐리의 우수한 발현은 FPV-mBN355, FPV-mBN345, 또는 FPV-mBN344 프로모터로부터 브라큐리 발현을 주동하는 벡터에 의해 유도되었다.
실시예 3: 재조합 계두바이러스로 감염된 CMMT 세포에서 브라큐리 및 TRICOM의 발현
브라큐리 및 TRICOM 단백질의 발현 역시 각 단백질에 특정한 형광으로 표지화된 항체를 이용한 유세포분석법에 의해 사정되었다. CMMT 세포 (히말라야 원숭이 유방 종양 세포주)는 브라큐리 및 TRICOM을 포함하는 양성 대조 재조합 MVA로, 또는 본 발명에 따른 브라큐리 발현 카세트 및 TRICOM을 포함하는 재조합 FPVs (가령, FPV-mBN343A, FPV-mBN345A)로, 또는 브라큐리를 주동하는 PrS 프로모터를 갖는 재조합 FPV (FVP-mBN249B)로 감염되었다. 세포는 감염되지 않은 세포 및 감염된 세포의 혼합물이 분석되도록, 1 미만의 MOI에서 감염되었다. 감염되지 않은 CMMT 세포는 음성 대조로서 역할을 하였다.
FACS 표본은 BD LSRII 또는 Fortessa에서 획득되었고 BD FACSDIVA 소프트웨어 (BD Bioscience, San Jose, CA) 또는 FlowJo (TreeStar Inc., Ashland, OR)를 이용하여 분석되었다.
결과는 도면 4에서 도시된다. 브라큐리 및 3가지 TRICOM 단백질 (CD80, CD54 및 CD58)에 대해 검출된 신호의 히스토그램은 플롯팅되었고, 그리고 양성 신호가 검출된 게이트가 뽑혔다 (흑색 라인). FPV 구조체 중에서, 브라큐리의 가장 높은 발현 (x 축을 따라서 신호에서 가장 큰 이동에 의해 도시됨)은 FPV-mBN343A 또는 FPV-mBN345A로 감염된 CMMT 세포에서 검출되었다. 가장 낮은 브라큐리 발현은 브라큐리를 주동하는 PrS 프로모터를 갖는 재조합 FPV (다시 말하면, FVP-mBN281A, FVP-mBN249B)로부터 검출되었다. 이들 FPV 구조체 사이에서 TRICOM 단백질의 유사한 발현 수준이 검출되었다. 브라큐리 및 TRICOM 단백질의 발현은 또한, 양성 대조 바이러스 MVA-브라큐리-TRICOM으로 감염으로부터 관찰되었다.
감염된 세포에서 브라큐리의 발현 수준을 정량하기 위해, 도면 4에서 게이팅된 브라큐리-양성 세포에 대한 중앙 형광 강도 (MFI)가 계산되었다.
결과는 도면 5에서 도시된다. FPV 구조체 중에서, 가장 높은 브라큐리 MFI는 FPV-mBN343A 또는 FPV-mBN345A로 감염된 CMMT 세포에서 검출되었다. 가장 낮은 브라큐리 MFI는 브라큐리를 주동하는 PrS 프로모터를 갖는 재조합 FPV (FVP-mBN249B)로부터 검출되었다. 모든 시험된 구조체 중에서 가장 높은 브라큐리 MFI는 양성 대조 바이러스 MVA-브라큐리-TRICOM으로 감염된 세포에서 관찰되었다. 이런 이유로, 감염된 CMMT 세포에서 브라큐리의 중앙 발현 수준은 PrS 프로모터로부터 보다는 FPV-mBN345 또는 FPV-mBN344 프로모터로부터 브라큐리 발현을 주동하는 벡터로부터 더욱 높았다.
실시예 4: FPV-mBN345B로부터 브라큐리의 발현
재조합 FPV-mBN345A 균주를 초기에 산출하는데 이용된 약물 선별 카세트는 임상적 개발에 적합한 재조합 벡터를 산출하기 위해 제거되었다. 이것은 약물 선별 없이 상기 바이러스를 닭 배아 섬유모세포 (CEF) 세포 상에서 계대배양하고, 개별 클론을 플라크 정제하고, 그리고 선별 카세트를 결여하는 클론을 PCR 및 DNA 염기서열결정에 의해 확인함으로써 달성되었다. 이것은 I3+15aa 프로모터에 의해 주동된 브라큐리 발현 카세트 및 TRICOM을 포함하지만, 약물 선별 카세트를 내포하지 않는 FPV-mBN345B의 산출을 유발하였다.
FPV-mBN345B로부터 브라큐리 및 TRICOM 단백질의 발현은 세포의 부분집합을 감염시키는 경우에 0.625, 또는 모든 세포를 감염시키는 경우에 40의 MOI에서 FPV-BN345B로 이들을 감염시킴으로써 CMMT 세포에서 확증되었다.
결과는 도면 6에서 도시된다. 브라큐리 및 3가지 TRICOM 단백질 (CD80, CD54 및 CD58)에 대해 검출된 신호의 히스토그램은 0.625의 MOI에서 감염된 표본의 경우 적색선 및 40의 MOI에서 감염된 표본의 경우 청색선으로 플롯팅되었다. 감염되지 않은 세포는 음성 대조로서 역할을 하였다 (흑색 라인). 0.625의 MOI에서, 브라큐리 및 3가지 TRICOM 단백질의 발현은 감염되지 않은 세포로부터 더욱 높은 피크의 오른쪽으로 이동된 피크로서 검출되었다. 40의 MOI에서, 브라큐리 및 TRICOM의 발현은 모든 세포에서, 감염되지 않은 세포의 오른쪽으로 이동된 피크로서 검출되었다.
본 발명의 다른 구체예는 본 명세서의 고려 및 본원에서 개시된 발명의 실시로부터 당업자에게 명백할 것이다. 본 명세서와 실시예는 단지 예시로서 고려되고, 본 발명의 진정한 범위와 사상은 아래 청구항에 의해 지시되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> BAVARIAN NORDIC A/S <120> PROMOTERS FOR ENHANCING EXPRESSION IN POXVIRUSES <130> BNIT0010PCT <140> 62/199681 <141> 2015-07-31 <160> 77 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 167 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Promoter Sequence with nucleotides 5' of Gene FPV 088 <400> 1 tatccgtaca ggtttgtttc tgaaattcac tttgtaagat acataattaa caaattcagg 60 gggaaaaatc tttacaaaat tagtatagaa gctatagata tatcaaaagg tagacaacaa 120 ataatcagaa cctaattttt ttatcaaaaa attaaaatat aaataaa 167 <210> 2 <211> 170 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Promoter Sequence with nucleotides 5' of Gene FPV 088 + atc sequence <400> 2 tatccgtaca ggtttgtttc tgaaattcac tttgtaagat acataattaa caaattcagg 60 gggaaaaatc tttacaaaat tagtatagaa gctatagata tatcaaaagg tagacaacaa 120 ataatcagaa cctaattttt ttatcaaaaa attaaaatat aaataaaatc 170 <210> 3 <211> 183 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Promoter Sequence with nucleotides 5' of Gene FPV 088 plus addition of 16 nucleotides of FPV 088 <400> 3 tatccgtaca ggtttgtttc tgaaattcac tttgtaagat acataattaa caaattcagg 60 gggaaaaatc tttacaaaat tagtatagaa gctatagata tatcaaaagg tagacaacaa 120 ataatcagaa cctaattttt ttatcaaaaa attaaaatat aaataaaatg aaaaataact 180 tgt 183 <210> 4 <211> 194 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Promoter Sequence with region from Gene FPV 088 plus addition of 27 nucleotides <400> 4 tatccgtaca ggtttgtttc tgaaattcac tttgtaagat acataattaa caaattcagg 60 gggaaaaatc tttacaaaat tagtatagaa gctatagata tatcaaaagg tagacaacaa 120 ataatcagaa cctaattttt ttatcaaaaa attaaaatat aaataaaatg aaaaataact 180 tgtatgaaga aaaa 194 <210> 5 <211> 200 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Promoter Sequence with region from Gene FPV 088 plus addition of 33 nucleotides <400> 5 tatccgtaca ggtttgtttc tgaaattcac tttgtaagat acataattaa caaattcagg 60 gggaaaaatc tttacaaaat tagtatagaa gctatagata tatcaaaagg tagacaacaa 120 ataatcagaa cctaattttt ttatcaaaaa attaaaatat aaataaaatg aaaaataact 180 tgtatgaaga aaaaatgaac 200 <210> 6 <211> 212 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Promoter Sequence with region from Gene FPV 088 plus addition of 45 nucleotides <400> 6 tatccgtaca ggtttgtttc tgaaattcac tttgtaagat acataattaa caaattcagg 60 gggaaaaatc tttacaaaat tagtatagaa gctatagata tatcaaaagg tagacaacaa 120 ataatcagaa cctaattttt ttatcaaaaa attaaaatat aaataaaatg aaaaataact 180 tgtatgaaga aaaaatgaac atgagtaaga aa 212 <210> 7 <211> 232 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Promoter Sequence with region from Gene FPV 088 plus addition of 65 nucleotides <400> 7 tatccgtaca ggtttgtttc tgaaattcac tttgtaagat acataattaa caaattcagg 60 gggaaaaatc tttacaaaat tagtatagaa gctatagata tatcaaaagg tagacaacaa 120 ataatcagaa cctaattttt ttatcaaaaa attaaaatat aaataaaatg aaaaataact 180 tgtatgaaga aaaaatgaac atgagtaaga aacaagtaaa aactcaaagt aa 232 <210> 8 <211> 242 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Promoter Sequence with region from Gene FPV 088 plus addition of 75 nucleotides <400> 8 tatccgtaca ggtttgtttc tgaaattcac tttgtaagat acataattaa caaattcagg 60 gggaaaaatc tttacaaaat tagtatagaa gctatagata tatcaaaagg tagacaacaa 120 ataatcagaa cctaattttt ttatcaaaaa attaaaatat aaataaaatg aaaaataact 180 tgtatgaaga aaaaatgaac atgagtaaga aacaagtaaa aactcaaagt aaatgtaata 240 at 242 <210> 9 <211> 245 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Promoter Sequence with region from Gene FPV 088 plus addition of 78 nucleotides <400> 9 tatccgtaca ggtttgtttc tgaaattcac tttgtaagat acataattaa caaattcagg 60 gggaaaaatc tttacaaaat tagtatagaa gctatagata tatcaaaagg tagacaacaa 120 ataatcagaa cctaattttt ttatcaaaaa attaaaatat aaataaaatg aaaaataact 180 tgtatgaaga aaaaatgaac atgagtaaga aacaagtaaa aactcaaagt aaatgtaata 240 atatc 245 <210> 10 <211> 119 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Promoter Sequence with nucleotides 5' of the Gene FPV L2R <400> 10 ttaatgtata gaactaattt ataataaaca tagtaaatat gggtaacttc ttaatagcca 60 taattaaaat tgaaaaaaaa atatcattat aaaacgtaaa cgaacaaaaa acattaatt 119 <210> 11 <211> 435 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Brachyury protein Isoform 1 from GenBank Accession No. O15178.1 <400> 11 Met Ser Ser Pro Gly Thr Glu Ser Ala Gly Lys Ser Leu Gln Tyr Arg 1 5 10 15 Val Asp His Leu Leu Ser Ala Val Glu Asn Glu Leu Gln Ala Gly Ser 20 25 30 Glu Lys Gly Asp Pro Thr Glu Arg Glu Leu Arg Val Gly Leu Glu Glu 35 40 45 Ser Glu Leu Trp Leu Arg Phe Lys Glu Leu Thr Asn Glu Met Ile Val 50 55 60 Thr Lys Asn Gly Arg Arg Met Phe Pro Val Leu Lys Val Asn Val Ser 65 70 75 80 Gly Leu Asp Pro Asn Ala Met Tyr Ser Phe Leu Leu Asp Phe Val Ala 85 90 95 Ala Asp Asn His Arg Trp Lys Tyr Val Asn Gly Glu Trp Val Pro Gly 100 105 110 Gly Lys Pro Glu Pro Gln Ala Pro Ser Cys Val Tyr Ile His Pro Asp 115 120 125 Ser Pro Asn Phe Gly Ala His Trp Met Lys Ala Pro Val Ser Phe Ser 130 135 140 Lys Val Lys Leu Thr Asn Lys Leu Asn Gly Gly Gly Gln Ile Met Leu 145 150 155 160 Asn Ser Leu His Lys Tyr Glu Pro Arg Ile His Ile Val Arg Val Gly 165 170 175 Gly Pro Gln Arg Met Ile Thr Ser His Cys Phe Pro Glu Thr Gln Phe 180 185 190 Ile Ala Val Thr Ala Tyr Gln Asn Glu Glu Ile Thr Ala Leu Lys Ile 195 200 205 Lys Tyr Asn Pro Phe Ala Lys Ala Phe Leu Asp Ala Lys Glu Arg Ser 210 215 220 Asp His Lys Glu Met Met Glu Glu Pro Gly Asp Ser Gln Gln Pro Gly 225 230 235 240 Tyr Ser Gln Trp Gly Trp Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr Leu Cys Pro 245 250 255 Pro Ala Asn Pro His Pro Gln Phe Gly Gly Ala Leu Ser Leu Pro Ser 260 265 270 Thr His Ser Cys Asp Arg Tyr Pro Thr Leu Arg Ser His Arg Ser Ser 275 280 285 Pro Tyr Pro Ser Pro Tyr Ala His Arg Asn Asn Ser Pro Thr Tyr Ser 290 295 300 Asp Asn Ser Pro Ala Cys Leu Ser Met Leu Gln Ser His Asp Asn Trp 305 310 315 320 Ser Ser Leu Gly Met Pro Ala His Pro Ser Met Leu Pro Val Ser His 325 330 335 Asn Ala Ser Pro Pro Thr Ser Ser Ser Gln Tyr Pro Ser Leu Trp Ser 340 345 350 Val Ser Asn Gly Ala Val Thr Pro Gly Ser Gln Ala Ala Ala Val Ser 355 360 365 Asn Gly Leu Gly Ala Gln Phe Phe Arg Gly Ser Pro Ala His Tyr Thr 370 375 380 Pro Leu Thr His Pro Val Ser Ala Pro Ser Ser Ser Gly Ser Pro Leu 385 390 395 400 Tyr Glu Gly Ala Ala Ala Ala Thr Asp Ile Val Asp Ser Gln Tyr Asp 405 410 415 Ala Ala Ala Gln Gly Arg Leu Ile Ala Ser Trp Thr Pro Val Ser Pro 420 425 430 Pro Ser Met 435 <210> 12 <211> 1308 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence for Brachyury protein Isoform 1 GenBank Accession No. O15178.1 <400> 12 atgagctccc ctggcaccga gagcgcggga aagagcctgc agtaccgagt ggaccacctg 60 ctgagcgccg tggagaatga gctgcaggcg ggcagcgaga agggcgaccc cacagagcgc 120 gaactgcgcg tgggcctgga ggagagcgag ctgtggctgc gcttcaagga gctcaccaat 180 gagatgatcg tgaccaagaa cggcaggagg atgtttccgg tgctgaaggt gaacgtgtct 240 ggcctggacc ccaacgccat gtactccttc ctgctggact tcgtggcggc ggacaaccac 300 cgctggaagt acgtgaacgg ggaatgggtg ccggggggca agccggagcc gcaggcgccc 360 agctgcgtct acatccaccc cgactcgccc aacttcgggg cccactggat gaaggctccc 420 gtctccttca gcaaagtcaa gctcaccaac aagctcaacg gagggggcca gatcatgctg 480 aactccttgc ataagtatga gcctcgaatc cacatagtga gagttggggg tccacagcgc 540 atgatcacca gccactgctt ccctgagacc cagttcatag cggtgactgc ttatcagaac 600 gaggagatca cagctcttaa aattaagtac aatccatttg caaaagcttt ccttgatgca 660 aaggaaagaa gtgatcacaa agagatgatg gaggaacccg gagacagcca gcaacctggg 720 tactcccaat gggggtggct tcttcctgga accagcaccc tgtgtccacc tgcaaatcct 780 catcctcagt ttggaggtgc cctctccctc ccctccacgc acagctgtga caggtaccca 840 accctgagga gccaccggtc ctcaccctac cccagcccct atgctcatcg gaacaattct 900 ccaacctatt ctgacaactc acctgcatgt ttatccatgc tgcaatccca tgacaattgg 960 tccagccttg gaatgcctgc ccatcccagc atgctccccg tgagccacaa tgccagccca 1020 cctaccagct ccagtcagta ccccagcctg tggtctgtga gcaacggcgc cgtcaccccg 1080 ggctcccagg cagcagccgt gtccaacggg ctgggggccc agttcttccg gggctccccc 1140 gcgcactaca cacccctcac ccatccggtc tcggcgccct cttcctcggg atccccactg 1200 tacgaagggg cggccgcggc cacagacatc gtggacagcc agtacgacgc cgcagcccaa 1260 ggccgcctca tagcctcatg gacacctgtg tcgccacctt ccatgtga 1308 <210> 13 <211> 435 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Brachyury protein Isoform 1 (L254V) <400> 13 Met Ser Ser Pro Gly Thr Glu Ser Ala Gly Lys Ser Leu Gln Tyr Arg 1 5 10 15 Val Asp His Leu Leu Ser Ala Val Glu Asn Glu Leu Gln Ala Gly Ser 20 25 30 Glu Lys Gly Asp Pro Thr Glu Arg Glu Leu Arg Val Gly Leu Glu Glu 35 40 45 Ser Glu Leu Trp Leu Arg Phe Lys Glu Leu Thr Asn Glu Met Ile Val 50 55 60 Thr Lys Asn Gly Arg Arg Met Phe Pro Val Leu Lys Val Asn Val Ser 65 70 75 80 Gly Leu Asp Pro Asn Ala Met Tyr Ser Phe Leu Leu Asp Phe Val Ala 85 90 95 Ala Asp Asn His Arg Trp Lys Tyr Val Asn Gly Glu Trp Val Pro Gly 100 105 110 Gly Lys Pro Glu Pro Gln Ala Pro Ser Cys Val Tyr Ile His Pro Asp 115 120 125 Ser Pro Asn Phe Gly Ala His Trp Met Lys Ala Pro Val Ser Phe Ser 130 135 140 Lys Val Lys Leu Thr Asn Lys Leu Asn Gly Gly Gly Gln Ile Met Leu 145 150 155 160 Asn Ser Leu His Lys Tyr Glu Pro Arg Ile His Ile Val Arg Val Gly 165 170 175 Gly Pro Gln Arg Met Ile Thr Ser His Cys Phe Pro Glu Thr Gln Phe 180 185 190 Ile Ala Val Thr Ala Tyr Gln Asn Glu Glu Ile Thr Ala Leu Lys Ile 195 200 205 Lys Tyr Asn Pro Phe Ala Lys Ala Phe Leu Asp Ala Lys Glu Arg Ser 210 215 220 Asp His Lys Glu Met Met Glu Glu Pro Gly Asp Ser Gln Gln Pro Gly 225 230 235 240 Tyr Ser Gln Trp Gly Trp Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr Val Cys Pro 245 250 255 Pro Ala Asn Pro His Pro Gln Phe Gly Gly Ala Leu Ser Leu Pro Ser 260 265 270 Thr His Ser Cys Asp Arg Tyr Pro Thr Leu Arg Ser His Arg Ser Ser 275 280 285 Pro Tyr Pro Ser Pro Tyr Ala His Arg Asn Asn Ser Pro Thr Tyr Ser 290 295 300 Asp Asn Ser Pro Ala Cys Leu Ser Met Leu Gln Ser His Asp Asn Trp 305 310 315 320 Ser Ser Leu Gly Met Pro Ala His Pro Ser Met Leu Pro Val Ser His 325 330 335 Asn Ala Ser Pro Pro Thr Ser Ser Ser Gln Tyr Pro Ser Leu Trp Ser 340 345 350 Val Ser Asn Gly Ala Val Thr Pro Gly Ser Gln Ala Ala Ala Val Ser 355 360 365 Asn Gly Leu Gly Ala Gln Phe Phe Arg Gly Ser Pro Ala His Tyr Thr 370 375 380 Pro Leu Thr His Pro Val Ser Ala Pro Ser Ser Ser Gly Ser Pro Leu 385 390 395 400 Tyr Glu Gly Ala Ala Ala Ala Thr Asp Ile Val Asp Ser Gln Tyr Asp 405 410 415 Ala Ala Ala Gln Gly Arg Leu Ile Ala Ser Trp Thr Pro Val Ser Pro 420 425 430 Pro Ser Met 435 <210> 14 <211> 1308 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence encoding Brachyury protein Isoform 1 with L254V <400> 14 atgagctccc ctggcaccga gagcgcggga aagagcctgc agtaccgagt ggaccacctg 60 ctgagcgccg tggagaatga gctgcaggcg ggcagcgaga agggcgaccc cacagagcgc 120 gaactgcgcg tgggcctgga ggagagcgag ctgtggctgc gcttcaagga gctcaccaat 180 gagatgatcg tgaccaagaa cggcaggagg atgtttccgg tgctgaaggt gaacgtgtct 240 ggcctggacc ccaacgccat gtactccttc ctgctggact tcgtggcggc ggacaaccac 300 cgctggaagt acgtgaacgg ggaatgggtg ccggggggca agccggagcc gcaggcgccc 360 agctgcgtct acatccaccc cgactcgccc aacttcgggg cccactggat gaaggctccc 420 gtctccttca gcaaagtcaa gctcaccaac aagctcaacg gagggggcca gatcatgctg 480 aactccttgc ataagtatga gcctcgaatc cacatagtga gagttggggg tccacagcgc 540 atgatcacca gccactgctt ccctgagacc cagttcatag cggtgactgc ttatcagaac 600 gaggagatca cagctcttaa aattaagtac aatccatttg caaaggcttt ccttgatgca 660 aaggaaagaa gtgatcacaa agagatgatg gaggaacccg gagacagcca gcaacctggg 720 tactcccaat gggggtggct tcttcctgga accagcaccg tttgtccacc tgcaaatcct 780 catcctcagt ttggaggtgc cctctccctc ccctccacgc acagctgtga caggtaccca 840 accctgagga gccaccggtc ctcaccctac cccagcccct atgctcatcg gaacaattct 900 ccaacctatt ctgacaactc acctgcatgt ttatccatgc tgcaatccca tgacaattgg 960 tccagccttg gaatgcctgc ccatcccagc atgctccccg tgagccacaa tgccagccca 1020 cctaccagct ccagtcagta ccccagcctg tggtctgtga gcaacggcgc cgtcaccccg 1080 ggctcccagg cagcagccgt gtccaacggg ctgggggccc agttcttccg gggctccccc 1140 gcgcactaca cacccctcac ccatccggtc tcggcgccct cttcctcggg atccccactg 1200 tacgaagggg cggccgcggc cacagacatc gtggacagcc agtacgacgc cgcagcccaa 1260 ggccgcctca tagcctcatg gacacctgtg tcgccacctt ccatgtga 1308 <210> 15 <211> 1305 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence encoding Brachyury protein Isoform 1 with L254V without 5' atg sequence <400> 15 agctcccctg gcaccgagag cgcgggaaag agcctgcagt accgagtgga ccacctgctg 60 agcgccgtgg agaatgagct gcaggcgggc agcgagaagg gcgaccccac agagcgcgaa 120 ctgcgcgtgg gcctggagga gagcgagctg tggctgcgct tcaaggagct caccaatgag 180 atgatcgtga ccaagaacgg caggaggatg tttccggtgc tgaaggtgaa cgtgtctggc 240 ctggacccca acgccatgta ctccttcctg ctggacttcg tggcggcgga caaccaccgc 300 tggaagtacg tgaacgggga atgggtgccg gggggcaagc cggagccgca ggcgcccagc 360 tgcgtctaca tccaccccga ctcgcccaac ttcggggccc actggatgaa ggctcccgtc 420 tccttcagca aagtcaagct caccaacaag ctcaacggag ggggccagat catgctgaac 480 tccttgcata agtatgagcc tcgaatccac atagtgagag ttgggggtcc acagcgcatg 540 atcaccagcc actgcttccc tgagacccag ttcatagcgg tgactgctta tcagaacgag 600 gagatcacag ctcttaaaat taagtacaat ccatttgcaa aggctttcct tgatgcaaag 660 gaaagaagtg atcacaaaga gatgatggag gaacccggag acagccagca acctgggtac 720 tcccaatggg ggtggcttct tcctggaacc agcaccgttt gtccacctgc aaatcctcat 780 cctcagtttg gaggtgccct ctccctcccc tccacgcaca gctgtgacag gtacccaacc 840 ctgaggagcc accggtcctc accctacccc agcccctatg ctcatcggaa caattctcca 900 acctattctg acaactcacc tgcatgttta tccatgctgc aatcccatga caattggtcc 960 agccttggaa tgcctgccca tcccagcatg ctccccgtga gccacaatgc cagcccacct 1020 accagctcca gtcagtaccc cagcctgtgg tctgtgagca acggcgccgt caccccgggc 1080 tcccaggcag cagccgtgtc caacgggctg ggggcccagt tcttccgggg ctcccccgcg 1140 cactacacac ccctcaccca tccggtctcg gcgccctctt cctcgggatc cccactgtac 1200 gaaggggcgg ccgcggccac agacatcgtg gacagccagt acgacgccgc agcccaaggc 1260 cgcctcatag cctcatggac acctgtgtcg ccaccttcca tgtga 1305 <210> 16 <211> 1323 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence encoding fusion protein comprising Brachyury (L254V) Protein plus addition of 15 nucleotides from Gene FPV 088 <400> 16 atgaaaaata acttgatgag ctcccctggc accgagagcg cgggaaagag cctgcagtac 60 cgagtggacc acctgctgag cgccgtggag aatgagctgc aggcgggcag cgagaagggc 120 gaccccacag agcgcgaact gcgcgtgggc ctggaggaga gcgagctgtg gctgcgcttc 180 aaggagctca ccaatgagat gatcgtgacc aagaacggca ggaggatgtt tccggtgctg 240 aaggtgaacg tgtctggcct ggaccccaac gccatgtact ccttcctgct ggacttcgtg 300 gcggcggaca accaccgctg gaagtacgtg aacggggaat gggtgccggg gggcaagccg 360 gagccgcagg cgcccagctg cgtctacatc caccccgact cgcccaactt cggggcccac 420 tggatgaagg ctcccgtctc cttcagcaaa gtcaagctca ccaacaagct caacggaggg 480 ggccagatca tgctgaactc cttgcataag tatgagcctc gaatccacat agtgagagtt 540 gggggtccac agcgcatgat caccagccac tgcttccctg agacccagtt catagcggtg 600 actgcttatc agaacgagga gatcacagct cttaaaatta agtacaatcc atttgcaaag 660 gctttccttg atgcaaagga aagaagtgat cacaaagaga tgatggagga acccggagac 720 agccagcaac ctgggtactc ccaatggggg tggcttcttc ctggaaccag caccgtttgt 780 ccacctgcaa atcctcatcc tcagtttgga ggtgccctct ccctcccctc cacgcacagc 840 tgtgacaggt acccaaccct gaggagccac cggtcctcac cctaccccag cccctatgct 900 catcggaaca attctccaac ctattctgac aactcacctg catgtttatc catgctgcaa 960 tcccatgaca attggtccag ccttggaatg cctgcccatc ccagcatgct ccccgtgagc 1020 cacaatgcca gcccacctac cagctccagt cagtacccca gcctgtggtc tgtgagcaac 1080 ggcgccgtca ccccgggctc ccaggcagca gccgtgtcca acgggctggg ggcccagttc 1140 ttccggggct cccccgcgca ctacacaccc ctcacccatc cggtctcggc gccctcttcc 1200 tcgggatccc cactgtacga aggggcggcc gcggccacag acatcgtgga cagccagtac 1260 gacgccgcag cccaaggccg cctcatagcc tcatggacac ctgtgtcgcc accttccatg 1320 tga 1323 <210> 17 <211> 1320 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence encoding fusion protein comprising Brachyury (L254V) Protein plus addition of 15 nucleotides from Gene FPV 088 without Brachyury protein atg start codon <400> 17 atgaaaaata acttgagctc ccctggcacc gagagcgcgg gaaagagcct gcagtaccga 60 gtggaccacc tgctgagcgc cgtggagaat gagctgcagg cgggcagcga gaagggcgac 120 cccacagagc gcgaactgcg cgtgggcctg gaggagagcg agctgtggct gcgcttcaag 180 gagctcacca atgagatgat cgtgaccaag aacggcagga ggatgtttcc ggtgctgaag 240 gtgaacgtgt ctggcctgga ccccaacgcc atgtactcct tcctgctgga cttcgtggcg 300 gcggacaacc accgctggaa gtacgtgaac ggggaatggg tgccgggggg caagccggag 360 ccgcaggcgc ccagctgcgt ctacatccac cccgactcgc ccaacttcgg ggcccactgg 420 atgaaggctc ccgtctcctt cagcaaagtc aagctcacca acaagctcaa cggagggggc 480 cagatcatgc tgaactcctt gcataagtat gagcctcgaa tccacatagt gagagttggg 540 ggtccacagc gcatgatcac cagccactgc ttccctgaga cccagttcat agcggtgact 600 gcttatcaga acgaggagat cacagctctt aaaattaagt acaatccatt tgcaaaggct 660 ttccttgatg caaaggaaag aagtgatcac aaagagatga tggaggaacc cggagacagc 720 cagcaacctg ggtactccca atgggggtgg cttcttcctg gaaccagcac cgtttgtcca 780 cctgcaaatc ctcatcctca gtttggaggt gccctctccc tcccctccac gcacagctgt 840 gacaggtacc caaccctgag gagccaccgg tcctcaccct accccagccc ctatgctcat 900 cggaacaatt ctccaaccta ttctgacaac tcacctgcat gtttatccat gctgcaatcc 960 catgacaatt ggtccagcct tggaatgcct gcccatccca gcatgctccc cgtgagccac 1020 aatgccagcc cacctaccag ctccagtcag taccccagcc tgtggtctgt gagcaacggc 1080 gccgtcaccc cgggctccca ggcagcagcc gtgtccaacg ggctgggggc ccagttcttc 1140 cggggctccc ccgcgcacta cacacccctc acccatccgg tctcggcgcc ctcttcctcg 1200 ggatccccac tgtacgaagg ggcggccgcg gccacagaca tcgtggacag ccagtacgac 1260 gccgcagccc aaggccgcct catagcctca tggacacctg tgtcgccacc ttccatgtga 1320 <210> 18 <211> 440 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein comprising Brachyury (L254V) Protein encoded by SEQ ID NO:16 <400> 18 Met Lys Asn Asn Leu Met Ser Ser Pro Gly Thr Glu Ser Ala Gly Lys 1 5 10 15 Ser Leu Gln Tyr Arg Val Asp His Leu Leu Ser Ala Val Glu Asn Glu 20 25 30 Leu Gln Ala Gly Ser Glu Lys Gly Asp Pro Thr Glu Arg Glu Leu Arg 35 40 45 Val Gly Leu Glu Glu Ser Glu Leu Trp Leu Arg Phe Lys Glu Leu Thr 50 55 60 Asn Glu Met Ile Val Thr Lys Asn Gly Arg Arg Met Phe Pro Val Leu 65 70 75 80 Lys Val Asn Val Ser Gly Leu Asp Pro Asn Ala Met Tyr Ser Phe Leu 85 90 95 Leu Asp Phe Val Ala Ala Asp Asn His Arg Trp Lys Tyr Val Asn Gly 100 105 110 Glu Trp Val Pro Gly Gly Lys Pro Glu Pro Gln Ala Pro Ser Cys Val 115 120 125 Tyr Ile His Pro Asp Ser Pro Asn Phe Gly Ala His Trp Met Lys Ala 130 135 140 Pro Val Ser Phe Ser Lys Val Lys Leu Thr Asn Lys Leu Asn Gly Gly 145 150 155 160 Gly Gln Ile Met Leu Asn Ser Leu His Lys Tyr Glu Pro Arg Ile 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370 375 380 Pro Ala His Tyr Thr Pro Leu Thr His Pro Val Ser Ala Pro Ser Ser 385 390 395 400 Ser Gly Ser Pro Leu Tyr Glu Gly Ala Ala Ala Ala Thr Asp Ile Val 405 410 415 Asp Ser Gln Tyr Asp Ala Ala Ala Gln Gly Arg Leu Ile Ala Ser Trp 420 425 430 Thr Pro Val Ser Pro Pro Ser Met 435 440 <210> 19 <211> 439 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein comprising Brachyury (L254V) Protein encoded by SEQ ID NO:17 plus addition of 15 nucleotides from Gene FPV 088 without Brachyury atg start codon. <400> 19 Met Lys Asn Asn Leu Ser Ser Pro Gly Thr Glu Ser Ala Gly Lys Ser 1 5 10 15 Leu Gln Tyr Arg Val Asp His Leu Leu Ser Ala Val Glu Asn Glu Leu 20 25 30 Gln Ala Gly Ser Glu Lys Gly Asp Pro Thr Glu Arg Glu Leu Arg Val 35 40 45 Gly Leu Glu Glu Ser Glu Leu Trp Leu Arg Phe Lys Glu Leu Thr Asn 50 55 60 Glu Met Ile Val Thr Lys Asn Gly Arg Arg Met Phe Pro Val Leu Lys 65 70 75 80 Val Asn Val Ser Gly Leu Asp Pro Asn Ala Met Tyr Ser Phe Leu Leu 85 90 95 Asp Phe Val Ala Ala Asp Asn His Arg Trp Lys Tyr Val Asn Gly Glu 100 105 110 Trp Val Pro Gly Gly Lys Pro Glu Pro Gln Ala Pro Ser Cys Val Tyr 115 120 125 Ile His Pro Asp Ser Pro Asn Phe Gly Ala His Trp Met Lys Ala Pro 130 135 140 Val Ser Phe Ser Lys Val Lys Leu Thr Asn Lys Leu Asn Gly Gly Gly 145 150 155 160 Gln Ile Met Leu Asn Ser Leu His Lys Tyr Glu Pro Arg Ile His Ile 165 170 175 Val Arg Val Gly Gly Pro Gln Arg Met Ile Thr Ser His Cys Phe Pro 180 185 190 Glu Thr Gln Phe Ile Ala Val Thr Ala Tyr Gln Asn Glu Glu Ile Thr 195 200 205 Ala Leu Lys Ile Lys Tyr Asn Pro Phe Ala Lys Ala Phe Leu Asp Ala 210 215 220 Lys Glu Arg Ser Asp His Lys Glu Met Met Glu Glu Pro Gly Asp Ser 225 230 235 240 Gln Gln Pro Gly Tyr Ser Gln Trp Gly Trp Leu Leu Pro Gly Thr Ser 245 250 255 Thr Val Cys Pro Pro Ala Asn Pro His Pro Gln Phe Gly Gly Ala Leu 260 265 270 Ser Leu Pro Ser Thr His Ser Cys Asp Arg Tyr Pro Thr Leu Arg Ser 275 280 285 His Arg Ser Ser Pro Tyr Pro Ser Pro Tyr Ala His Arg Asn Asn Ser 290 295 300 Pro Thr Tyr Ser Asp Asn Ser Pro Ala Cys Leu Ser Met Leu Gln Ser 305 310 315 320 His Asp Asn Trp Ser Ser Leu Gly Met Pro Ala His Pro Ser Met Leu 325 330 335 Pro Val Ser His Asn Ala Ser Pro Pro Thr Ser Ser Ser Gln Tyr Pro 340 345 350 Ser Leu Trp Ser Val Ser Asn Gly Ala Val Thr Pro Gly Ser Gln Ala 355 360 365 Ala Ala Val Ser Asn Gly Leu Gly Ala Gln Phe Phe Arg Gly Ser Pro 370 375 380 Ala His Tyr Thr Pro Leu Thr His Pro Val Ser Ala Pro Ser Ser Ser 385 390 395 400 Gly Ser Pro Leu Tyr Glu Gly Ala Ala Ala Ala Thr Asp Ile Val Asp 405 410 415 Ser Gln Tyr Asp Ala Ala Ala Gln Gly Arg Leu Ile Ala Ser Trp Thr 420 425 430 Pro Val Ser Pro Pro Ser Met 435 <210> 20 <211> 1353 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence encoding fusion protein comprising Brachyury (L254V) Protein plus addition of 45 nucleotides from Gene FPV 088 <400> 20 atgaaaaata acttgtatga agaaaaaatg aacatgagta agaaaatgag ctcccctggc 60 accgagagcg cgggaaagag cctgcagtac cgagtggacc acctgctgag cgccgtggag 120 aatgagctgc aggcgggcag cgagaagggc gaccccacag agcgcgaact gcgcgtgggc 180 ctggaggaga gcgagctgtg gctgcgcttc aaggagctca ccaatgagat gatcgtgacc 240 aagaacggca ggaggatgtt tccggtgctg aaggtgaacg tgtctggcct ggaccccaac 300 gccatgtact ccttcctgct ggacttcgtg gcggcggaca accaccgctg gaagtacgtg 360 aacggggaat gggtgccggg gggcaagccg gagccgcagg cgcccagctg cgtctacatc 420 caccccgact cgcccaactt cggggcccac tggatgaagg ctcccgtctc cttcagcaaa 480 gtcaagctca ccaacaagct caacggaggg ggccagatca tgctgaactc cttgcataag 540 tatgagcctc gaatccacat agtgagagtt gggggtccac agcgcatgat caccagccac 600 tgcttccctg agacccagtt catagcggtg actgcttatc agaacgagga gatcacagct 660 cttaaaatta agtacaatcc atttgcaaag gctttccttg atgcaaagga aagaagtgat 720 cacaaagaga tgatggagga acccggagac agccagcaac ctgggtactc ccaatggggg 780 tggcttcttc ctggaaccag caccgtttgt ccacctgcaa atcctcatcc tcagtttgga 840 ggtgccctct ccctcccctc cacgcacagc tgtgacaggt acccaaccct gaggagccac 900 cggtcctcac cctaccccag cccctatgct catcggaaca attctccaac ctattctgac 960 aactcacctg catgtttatc catgctgcaa tcccatgaca attggtccag 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tcctgctgga cttcgtggcg gcggacaacc accgctggaa gtacgtgaac 360 ggggaatggg tgccgggggg caagccggag ccgcaggcgc ccagctgcgt ctacatccac 420 cccgactcgc ccaacttcgg ggcccactgg atgaaggctc ccgtctcctt cagcaaagtc 480 aagctcacca acaagctcaa cggagggggc cagatcatgc tgaactcctt gcataagtat 540 gagcctcgaa tccacatagt gagagttggg ggtccacagc gcatgatcac cagccactgc 600 ttccctgaga cccagttcat agcggtgact gcttatcaga acgaggagat cacagctctt 660 aaaattaagt acaatccatt tgcaaaggct ttccttgatg caaaggaaag aagtgatcac 720 aaagagatga tggaggaacc cggagacagc cagcaacctg ggtactccca atgggggtgg 780 cttcttcctg gaaccagcac cgtttgtcca cctgcaaatc ctcatcctca gtttggaggt 840 gccctctccc tcccctccac gcacagctgt gacaggtacc caaccctgag gagccaccgg 900 tcctcaccct accccagccc ctatgctcat cggaacaatt ctccaaccta ttctgacaac 960 tcacctgcat gtttatccat gctgcaatcc catgacaatt ggtccagcct tggaatgcct 1020 gcccatccca gcatgctccc cgtgagccac aatgccagcc cacctaccag ctccagtcag 1080 taccccagcc tgtggtctgt gagcaacggc gccgtcaccc cgggctccca ggcagcagcc 1140 gtgtccaacg ggctgggggc ccagttcttc cggggctccc ccgcgcacta cacacccctc 1200 acccatccgg tctcggcgcc ctcttcctcg ggatccccac tgtacgaagg ggcggccgcg 1260 gccacagaca tcgtggacag ccagtacgac gccgcagccc aaggccgcct catagcctca 1320 tggacacctg tgtcgccacc ttccatgtga 1350 <210> 22 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein comprising Brachyury (L254V) Protein encoded by SEQ ID NO:20 <400> 22 Met Lys Asn Asn Leu Tyr Glu Glu Lys Met Asn Met Ser Lys Lys Met 1 5 10 15 Ser Ser Pro Gly Thr Glu Ser Ala Gly Lys Ser Leu Gln Tyr Arg Val 20 25 30 Asp His Leu Leu Ser Ala Val Glu Asn Glu Leu Gln Ala Gly Ser Glu 35 40 45 Lys Gly Asp Pro Thr Glu Arg Glu Leu Arg Val Gly Leu Glu Glu Ser 50 55 60 Glu Leu Trp Leu Arg Phe Lys Glu Leu Thr Asn Glu Met Ile Val Thr 65 70 75 80 Lys Asn Gly Arg Arg Met Phe Pro Val Leu Lys Val Asn Val Ser Gly 85 90 95 Leu Asp Pro Asn Ala Met Tyr Ser Phe Leu Leu Asp Phe Val Ala Ala 100 105 110 Asp Asn His Arg Trp Lys Tyr Val Asn Gly Glu Trp Val Pro Gly Gly 115 120 125 Lys Pro Glu Pro Gln Ala 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cacaatgcca gcccacctac cagctccagt cagtacccca gcctgtggtc tgtgagcaac 1080 ggcgccgtca ccccgggctc ccaggcagca gccgtgtcca acgggctggg ggcccagttc 1140 ttccggggct cccccgcgca ctacacaccc ctcacccatc cggtctcggc gccctcttcc 1200 tcgggatccc cactgtacga aggggcggcc gcggccacag acatcgtgga cagccagtac 1260 gacgccgcag cccaaggccg cctcatagcc tcatggacac ctgtgtcgcc accttccatg 1320 tga 1323 <210> 26 <211> 441 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein comprising Brachyury (L254V) Protein encoded by SEQ ID NO:24 <400> 26 Met Asn Met Ser Lys Lys Met Ser Ser Pro Gly Thr Glu Ser Ala Gly 1 5 10 15 Lys Ser Leu Gln Tyr Arg Val Asp His Leu Leu Ser Ala Val Glu Asn 20 25 30 Glu Leu Gln Ala Gly Ser Glu Lys Gly Asp Pro Thr Glu Arg Glu Leu 35 40 45 Arg Val Gly Leu Glu Glu Ser Glu Leu Trp Leu Arg Phe Lys Glu Leu 50 55 60 Thr Asn Glu Met Ile Val Thr Lys Asn Gly Arg Arg Met Phe Pro Val 65 70 75 80 Leu Lys Val Asn Val Ser Gly Leu Asp Pro Asn Ala Met Tyr Ser Phe 85 90 95 Leu Leu Asp Phe Val Ala Ala Asp Asn His 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Protein plus addition of 12 nucleotides from Gene FPV 088 <400> 28 atgagtaaga aaatgagctc ccctggcacc gagagcgcgg gaaagagcct gcagtaccga 60 gtggaccacc tgctgagcgc cgtggagaat gagctgcagg cgggcagcga gaagggcgac 120 cccacagagc gcgaactgcg cgtgggcctg gaggagagcg agctgtggct gcgcttcaag 180 gagctcacca atgagatgat cgtgaccaag aacggcagga ggatgtttcc ggtgctgaag 240 gtgaacgtgt ctggcctgga ccccaacgcc atgtactcct tcctgctgga cttcgtggcg 300 gcggacaacc accgctggaa gtacgtgaac ggggaatggg tgccgggggg caagccggag 360 ccgcaggcgc ccagctgcgt ctacatccac cccgactcgc ccaacttcgg ggcccactgg 420 atgaaggctc ccgtctcctt cagcaaagtc aagctcacca acaagctcaa cggagggggc 480 cagatcatgc tgaactcctt gcataagtat gagcctcgaa tccacatagt gagagttggg 540 ggtccacagc gcatgatcac cagccactgc ttccctgaga cccagttcat agcggtgact 600 gcttatcaga acgaggagat cacagctctt aaaattaagt acaatccatt tgcaaaggct 660 ttccttgatg caaaggaaag aagtgatcac aaagagatga tggaggaacc cggagacagc 720 cagcaacctg ggtactccca atgggggtgg cttcttcctg gaaccagcac cgtttgtcca 780 cctgcaaatc ctcatcctca gtttggaggt gccctctccc tcccctccac gcacagctgt 840 gacaggtacc caaccctgag gagccaccgg tcctcaccct accccagccc ctatgctcat 900 cggaacaatt ctccaaccta ttctgacaac tcacctgcat gtttatccat gctgcaatcc 960 catgacaatt ggtccagcct tggaatgcct gcccatccca gcatgctccc cgtgagccac 1020 aatgccagcc cacctaccag ctccagtcag taccccagcc tgtggtctgt gagcaacggc 1080 gccgtcaccc cgggctccca ggcagcagcc gtgtccaacg ggctgggggc ccagttcttc 1140 cggggctccc ccgcgcacta cacacccctc acccatccgg tctcggcgcc ctcttcctcg 1200 ggatccccac tgtacgaagg ggcggccgcg gccacagaca tcgtggacag ccagtacgac 1260 gccgcagccc aaggccgcct catagcctca tggacacctg tgtcgccacc ttccatgtga 1320 <210> 29 <211> 1317 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence encoding Fusion protein comprising Brachyury (L254V) Protein plus addition of 12 nucleotides from Gene FPV 088 without Brachyury atg start codon <400> 29 atgagtaaga aaagctcccc tggcaccgag agcgcgggaa agagcctgca gtaccgagtg 60 gaccacctgc tgagcgccgt ggagaatgag ctgcaggcgg gcagcgagaa gggcgacccc 120 acagagcgcg aactgcgcgt gggcctggag gagagcgagc tgtggctgcg cttcaaggag 180 ctcaccaatg agatgatcgt gaccaagaac ggcaggagga tgtttccggt gctgaaggtg 240 aacgtgtctg gcctggaccc caacgccatg tactccttcc tgctggactt cgtggcggcg 300 gacaaccacc gctggaagta cgtgaacggg gaatgggtgc cggggggcaa gccggagccg 360 caggcgccca gctgcgtcta catccacccc gactcgccca acttcggggc ccactggatg 420 aaggctcccg tctccttcag caaagtcaag ctcaccaaca agctcaacgg agggggccag 480 atcatgctga actccttgca taagtatgag cctcgaatcc acatagtgag agttgggggt 540 ccacagcgca tgatcaccag ccactgcttc cctgagaccc agttcatagc ggtgactgct 600 tatcagaacg aggagatcac agctcttaaa attaagtaca atccatttgc aaaggctttc 660 cttgatgcaa aggaaagaag tgatcacaaa gagatgatgg aggaacccgg agacagccag 720 caacctgggt actcccaatg ggggtggctt cttcctggaa ccagcaccgt ttgtccacct 780 gcaaatcctc atcctcagtt tggaggtgcc ctctccctcc cctccacgca cagctgtgac 840 aggtacccaa ccctgaggag ccaccggtcc tcaccctacc ccagccccta tgctcatcgg 900 aacaattctc caacctattc tgacaactca cctgcatgtt tatccatgct gcaatcccat 960 gacaattggt ccagccttgg aatgcctgcc catcccagca tgctccccgt gagccacaat 1020 gccagcccac ctaccagctc cagtcagtac cccagcctgt ggtctgtgag caacggcgcc 1080 gtcaccccgg gctcccaggc agcagccgtg tccaacgggc tgggggccca gttcttccgg 1140 ggctcccccg cgcactacac acccctcacc catccggtct cggcgccctc ttcctcggga 1200 tccccactgt acgaaggggc ggccgcggcc acagacatcg tggacagcca gtacgacgcc 1260 gcagcccaag gccgcctcat agcctcatgg acacctgtgt cgccaccttc catgtga 1317 <210> 30 <211> 439 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein comprising Brachyury (L254V) Protein encoded by SEQ ID NO:28 <400> 30 Met Ser Lys Lys Met Ser Ser Pro Gly Thr Glu Ser Ala Gly Lys Ser 1 5 10 15 Leu Gln Tyr Arg Val Asp His Leu Leu Ser Ala Val Glu Asn Glu Leu 20 25 30 Gln Ala Gly Ser Glu Lys Gly Asp Pro Thr Glu Arg Glu Leu Arg Val 35 40 45 Gly Leu Glu Glu Ser Glu Leu Trp Leu Arg Phe Lys Glu Leu Thr Asn 50 55 60 Glu Met Ile Val Thr Lys Asn Gly Arg Arg Met Phe Pro Val Leu Lys 65 70 75 80 Val Asn Val Ser Gly Leu Asp Pro Asn Ala Met Tyr Ser Phe Leu Leu 85 90 95 Asp Phe Val Ala Ala Asp Asn His Arg Trp Lys Tyr Val Asn Gly Glu 100 105 110 Trp Val Pro Gly Gly Lys Pro Glu Pro Gln Ala Pro Ser Cys Val Tyr 115 120 125 Ile His Pro Asp Ser Pro Asn Phe Gly Ala His Trp Met Lys Ala Pro 130 135 140 Val Ser Phe Ser Lys Val Lys Leu Thr Asn Lys Leu Asn Gly Gly Gly 145 150 155 160 Gln Ile Met Leu Asn Ser Leu His Lys Tyr Glu Pro Arg Ile His Ile 165 170 175 Val Arg Val Gly Gly Pro Gln Arg Met Ile Thr Ser His Cys Phe Pro 180 185 190 Glu Thr Gln Phe Ile Ala Val Thr Ala Tyr Gln Asn Glu Glu Ile Thr 195 200 205 Ala Leu Lys Ile Lys Tyr Asn Pro Phe Ala Lys Ala Phe Leu Asp Ala 210 215 220 Lys Glu Arg Ser Asp His Lys Glu Met Met Glu Glu Pro Gly Asp Ser 225 230 235 240 Gln Gln Pro Gly Tyr Ser Gln Trp Gly Trp Leu Leu Pro Gly Thr Ser 245 250 255 Thr Val Cys Pro Pro Ala Asn Pro His Pro Gln Phe Gly Gly Ala Leu 260 265 270 Ser Leu Pro Ser Thr His Ser Cys Asp Arg Tyr Pro Thr Leu Arg Ser 275 280 285 His Arg Ser Ser Pro Tyr Pro Ser Pro Tyr Ala His Arg Asn Asn Ser 290 295 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Leu Arg Val Gly 35 40 45 Leu Glu Glu Ser Glu Leu Trp Leu Arg Phe Lys Glu Leu Thr Asn Glu 50 55 60 Met Ile Val Thr Lys Asn Gly Arg Arg Met Phe Pro Val Leu Lys Val 65 70 75 80 Asn Val Ser Gly Leu Asp Pro Asn Ala Met Tyr Ser Phe Leu Leu Asp 85 90 95 Phe Val Ala Ala Asp Asn His Arg Trp Lys Tyr Val Asn Gly Glu Trp 100 105 110 Val Pro Gly Gly Lys Pro Glu Pro Gln Ala Pro Ser Cys Val Tyr Ile 115 120 125 His Pro Asp Ser Pro Asn Phe Gly Ala His Trp Met Lys Ala Pro Val 130 135 140 Ser Phe Ser Lys Val Lys Leu Thr Asn Lys Leu Asn Gly Gly Gly Gln 145 150 155 160 Ile Met Leu Asn Ser Leu His Lys Tyr Glu Pro Arg Ile His Ile Val 165 170 175 Arg Val Gly Gly Pro Gln Arg Met Ile Thr Ser His Cys Phe Pro Glu 180 185 190 Thr Gln Phe Ile Ala Val Thr Ala Tyr Gln Asn Glu Glu Ile Thr Ala 195 200 205 Leu Lys Ile Lys Tyr Asn Pro Phe Ala Lys Ala Phe Leu Asp Ala Lys 210 215 220 Glu Arg Ser Asp His Lys Glu Met Met Glu Glu Pro Gly Asp Ser Gln 225 230 235 240 Gln Pro Gly Tyr Ser Gln Trp Gly Trp Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr 245 250 255 Val Cys Pro Pro Ala Asn Pro His Pro Gln Phe Gly Gly Ala Leu Ser 260 265 270 Leu Pro Ser Thr His Ser Cys Asp Arg Tyr Pro Thr Leu Arg Ser His 275 280 285 Arg Ser Ser Pro Tyr Pro Ser Pro Tyr Ala His Arg Asn Asn Ser Pro 290 295 300 Thr Tyr Ser Asp Asn Ser Pro Ala Cys Leu Ser Met Leu Gln Ser His 305 310 315 320 Asp Asn Trp Ser Ser Leu Gly Met Pro Ala His Pro Ser Met Leu Pro 325 330 335 Val Ser His Asn Ala Ser Pro Pro Thr Ser Ser Ser Gln Tyr Pro Ser 340 345 350 Leu Trp Ser Val Ser Asn Gly Ala Val Thr Pro Gly Ser Gln Ala Ala 355 360 365 Ala Val Ser Asn Gly Leu Gly Ala Gln Phe Phe Arg Gly Ser Pro Ala 370 375 380 His Tyr Thr Pro Leu Thr His Pro Val Ser Ala Pro Ser Ser Ser Gly 385 390 395 400 Ser Pro Leu Tyr Glu Gly Ala Ala Ala Ala Thr Asp Ile Val Asp Ser 405 410 415 Gln Tyr Asp Ala Ala Ala Gln Gly Arg Leu Ile Ala Ser Trp Thr Pro 420 425 430 Val Ser Pro Pro Ser Met 435 <210> 32 <211> 1386 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence encoding Fusion protein comprising Brachyury (L254V) Protein plus addition of 75 nucleotides from Gene FPV 088 and an atc <400> 32 atgaaaaata acttgtatga agaaaaaatg aacatgagta agaaacaagt aaaaactcaa 60 agtaaatgta ataatatcat gagctcccct ggcaccgaga gcgcgggaaa gagcctgcag 120 taccgagtgg accacctgct gagcgccgtg gagaatgagc tgcaggcggg cagcgagaag 180 ggcgacccca cagagcgcga actgcgcgtg ggcctggagg agagcgagct gtggctgcgc 240 ttcaaggagc tcaccaatga gatgatcgtg accaagaacg gcaggaggat gtttccggtg 300 ctgaaggtga acgtgtctgg cctggacccc aacgccatgt actccttcct gctggacttc 360 gtggcggcgg acaaccaccg ctggaagtac gtgaacgggg aatgggtgcc ggggggcaag 420 ccggagccgc aggcgcccag ctgcgtctac atccaccccg actcgcccaa cttcggggcc 480 cactggatga aggctcccgt ctccttcagc aaagtcaagc tcaccaacaa gctcaacgga 540 gggggccaga tcatgctgaa ctccttgcat aagtatgagc ctcgaatcca catagtgaga 600 gttgggggtc cacagcgcat gatcaccagc cactgcttcc ctgagaccca gttcatagcg 660 gtgactgctt atcagaacga ggagatcaca gctcttaaaa ttaagtacaa tccatttgca 720 aaggctttcc ttgatgcaaa ggaaagaagt gatcacaaag agatgatgga ggaacccgga 780 gacagccagc aacctgggta ctcccaatgg gggtggcttc ttcctggaac cagcaccgtt 840 tgtccacctg caaatcctca tcctcagttt ggaggtgccc tctccctccc ctccacgcac 900 agctgtgaca ggtacccaac cctgaggagc caccggtcct caccctaccc cagcccctat 960 gctcatcgga acaattctcc aacctattct gacaactcac ctgcatgttt atccatgctg 1020 caatcccatg acaattggtc cagccttgga atgcctgccc atcccagcat gctccccgtg 1080 agccacaatg ccagcccacc taccagctcc agtcagtacc ccagcctgtg gtctgtgagc 1140 aacggcgccg tcaccccggg ctcccaggca gcagccgtgt ccaacgggct gggggcccag 1200 ttcttccggg gctcccccgc gcactacaca cccctcaccc atccggtctc ggcgccctct 1260 tcctcgggat ccccactgta cgaaggggcg gccgcggcca cagacatcgt ggacagccag 1320 tacgacgccg cagcccaagg ccgcctcata gcctcatgga cacctgtgtc gccaccttcc 1380 atgtga 1386 <210> 33 <211> 1383 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence encoding Fusion protein comprising Brachyury (L254V) Protein plus addition of 75 nucleotides from Gene FPV 088 and an atc, without Brachyury atg start codon <400> 33 atgaaaaata acttgtatga agaaaaaatg aacatgagta agaaacaagt aaaaactcaa 60 agtaaatgta ataatatcag ctcccctggc accgagagcg cgggaaagag cctgcagtac 120 cgagtggacc acctgctgag cgccgtggag aatgagctgc aggcgggcag cgagaagggc 180 gaccccacag agcgcgaact gcgcgtgggc ctggaggaga gcgagctgtg gctgcgcttc 240 aaggagctca ccaatgagat gatcgtgacc aagaacggca ggaggatgtt tccggtgctg 300 aaggtgaacg tgtctggcct ggaccccaac gccatgtact ccttcctgct ggacttcgtg 360 gcggcggaca accaccgctg gaagtacgtg aacggggaat gggtgccggg gggcaagccg 420 gagccgcagg cgcccagctg cgtctacatc caccccgact cgcccaactt cggggcccac 480 tggatgaagg ctcccgtctc cttcagcaaa gtcaagctca ccaacaagct caacggaggg 540 ggccagatca tgctgaactc cttgcataag tatgagcctc gaatccacat agtgagagtt 600 gggggtccac agcgcatgat caccagccac tgcttccctg agacccagtt catagcggtg 660 actgcttatc agaacgagga gatcacagct cttaaaatta agtacaatcc atttgcaaag 720 gctttccttg atgcaaagga aagaagtgat cacaaagaga tgatggagga acccggagac 780 agccagcaac ctgggtactc ccaatggggg tggcttcttc ctggaaccag caccgtttgt 840 ccacctgcaa atcctcatcc tcagtttgga ggtgccctct ccctcccctc cacgcacagc 900 tgtgacaggt acccaaccct gaggagccac cggtcctcac cctaccccag cccctatgct 960 catcggaaca attctccaac ctattctgac aactcacctg catgtttatc catgctgcaa 1020 tcccatgaca attggtccag ccttggaatg cctgcccatc ccagcatgct ccccgtgagc 1080 cacaatgcca gcccacctac cagctccagt cagtacccca gcctgtggtc tgtgagcaac 1140 ggcgccgtca ccccgggctc ccaggcagca gccgtgtcca acgggctggg ggcccagttc 1200 ttccggggct cccccgcgca ctacacaccc ctcacccatc cggtctcggc gccctcttcc 1260 tcgggatccc cactgtacga aggggcggcc gcggccacag acatcgtgga cagccagtac 1320 gacgccgcag cccaaggccg cctcatagcc tcatggacac ctgtgtcgcc accttccatg 1380 tga 1383 <210> 34 <211> 461 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein comprising Brachyury (L254V) Protein encoded by SEQ ID NO: 32 <400> 34 Met Lys Asn Asn Leu Tyr Glu Glu Lys Met Asn Met Ser Lys Lys Gln 1 5 10 15 Val Lys Thr Gln Ser Lys Cys Asn Asn Ile Met Ser Ser Pro Gly Thr 20 25 30 Glu Ser Ala Gly Lys Ser Leu Gln Tyr Arg Val Asp His Leu Leu Ser 35 40 45 Ala Val Glu 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Ser Gln Gln Pro Gly Tyr Ser Gln Trp Gly Trp 260 265 270 Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr Val Cys Pro Pro Ala Asn Pro His Pro 275 280 285 Gln Phe Gly Gly Ala Leu Ser Leu Pro Ser Thr His Ser Cys Asp Arg 290 295 300 Tyr Pro Thr Leu Arg Ser His Arg Ser Ser Pro Tyr Pro Ser Pro Tyr 305 310 315 320 Ala His Arg Asn Asn Ser Pro Thr Tyr Ser Asp Asn Ser Pro Ala Cys 325 330 335 Leu Ser Met Leu Gln Ser His Asp Asn Trp Ser Ser Leu Gly Met Pro 340 345 350 Ala His Pro Ser Met Leu Pro Val Ser His Asn Ala Ser Pro Pro Thr 355 360 365 Ser Ser Ser Gln Tyr Pro Ser Leu Trp Ser Val Ser Asn Gly Ala Val 370 375 380 Thr Pro Gly Ser Gln Ala Ala Ala Val Ser Asn Gly Leu Gly Ala Gln 385 390 395 400 Phe Phe Arg Gly Ser Pro Ala His Tyr Thr Pro Leu Thr His Pro Val 405 410 415 Ser Ala Pro Ser Ser Ser Gly Ser Pro Leu Tyr Glu Gly Ala Ala Ala 420 425 430 Ala Thr Asp Ile Val Asp Ser Gln Tyr Asp Ala Ala Ala Gln Gly Arg 435 440 445 Leu Ile Ala Ser Trp Thr Pro Val Ser Pro Pro Ser Met 450 455 460 <210> 35 <211> 460 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein comprising Brachyury (L254V) Protein encoded by SEQ ID NO: 33 <400> 35 Met Lys Asn Asn Leu Tyr Glu Glu Lys Met Asn Met Ser Lys Lys Gln 1 5 10 15 Val Lys Thr Gln Ser Lys Cys Asn Asn Ile Ser Ser Pro Gly Thr Glu 20 25 30 Ser Ala Gly Lys Ser Leu Gln Tyr Arg Val Asp His Leu Leu Ser Ala 35 40 45 Val Glu Asn Glu Leu Gln Ala Gly Ser Glu Lys Gly Asp Pro Thr Glu 50 55 60 Arg Glu Leu Arg Val Gly Leu Glu Glu Ser Glu Leu Trp Leu Arg Phe 65 70 75 80 Lys Glu Leu Thr Asn Glu Met Ile Val Thr Lys Asn Gly Arg Arg Met 85 90 95 Phe Pro Val Leu Lys Val Asn Val Ser Gly Leu Asp Pro Asn Ala Met 100 105 110 Tyr Ser Phe Leu Leu Asp Phe Val Ala Ala Asp Asn His Arg Trp Lys 115 120 125 Tyr Val Asn Gly Glu Trp Val Pro Gly Gly Lys Pro Glu Pro Gln Ala 130 135 140 Pro Ser Cys Val Tyr Ile His Pro Asp Ser Pro Asn Phe Gly Ala His 145 150 155 160 Trp Met Lys Ala Pro Val Ser Phe Ser Lys Val Lys Leu Thr Asn Lys 165 170 175 Leu Asn Gly Gly Gly Gln Ile Met Leu Asn Ser Leu His Lys 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cagctgcgtc 420 tacatccacc ccgactcgcc caacttcggg gcccactgga tgaaggctcc cgtctccttc 480 agcaaagtca agctcaccaa caagctcaac ggagggggcc agatcatgct gaactccttg 540 cataagtatg agcctcgaat ccacatagtg agagttgggg gtccacagcg catgatcacc 600 agccactgct tccctgagac ccagttcata gcggtgactg cttatcagaa cgaggagatc 660 acagctctta aaattaagta caatccattt gcaaaggctt tccttgatgc aaaggaaaga 720 agtgatcaca aagagatgat ggaggaaccc ggagacagcc agcaacctgg gtactcccaa 780 tgggggtggc ttcttcctgg aaccagcacc gtttgtccac ctgcaaatcc tcatcctcag 840 tttggaggtg ccctctccct cccctccacg cacagctgtg acaggtaccc aaccctgagg 900 agccaccggt cctcacccta ccccagcccc tatgctcatc ggaacaattc tccaacctat 960 tctgacaact cacctgcatg tttatccatg ctgcaatccc atgacaattg gtccagcctt 1020 ggaatgcctg cccatcccag catgctcccc gtgagccaca atgccagccc acctaccagc 1080 tccagtcagt accccagcct gtggtctgtg agcaacggcg ccgtcacccc gggctcccag 1140 gcagcagccg tgtccaacgg gctgggggcc cagttcttcc ggggctcccc cgcgcactac 1200 acacccctca cccatccggt ctcggcgccc tcttcctcgg gatccccact gtacgaaggg 1260 gcggccgcgg ccacagacat cgtggacagc cagtacgacg ccgcagccca aggccgcctc 1320 atagcctcat ggacacctgt gtcgccacct tccatgtga 1359 <210> 37 <211> 1356 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence encoding Fusion protein comprising Brachyury (L254V) Protein plus addition of 48 nucleotides from Gene FPV 088 and an atc, without Brachyury atg start codon <400> 37 atgaacatga gtaagaaaca agtaaaaact caaagtaaat gtaataatat cagctcccct 60 ggcaccgaga gcgcgggaaa gagcctgcag taccgagtgg accacctgct gagcgccgtg 120 gagaatgagc tgcaggcggg cagcgagaag ggcgacccca cagagcgcga actgcgcgtg 180 ggcctggagg agagcgagct gtggctgcgc ttcaaggagc tcaccaatga gatgatcgtg 240 accaagaacg gcaggaggat gtttccggtg ctgaaggtga acgtgtctgg cctggacccc 300 aacgccatgt actccttcct gctggacttc gtggcggcgg acaaccaccg ctggaagtac 360 gtgaacgggg aatgggtgcc ggggggcaag ccggagccgc aggcgcccag ctgcgtctac 420 atccaccccg actcgcccaa cttcggggcc cactggatga aggctcccgt ctccttcagc 480 aaagtcaagc tcaccaacaa gctcaacgga gggggccaga tcatgctgaa ctccttgcat 540 aagtatgagc ctcgaatcca catagtgaga gttgggggtc cacagcgcat gatcaccagc 600 cactgcttcc ctgagaccca gttcatagcg gtgactgctt atcagaacga ggagatcaca 660 gctcttaaaa ttaagtacaa tccatttgca aaggctttcc ttgatgcaaa ggaaagaagt 720 gatcacaaag agatgatgga ggaacccgga gacagccagc aacctgggta ctcccaatgg 780 gggtggcttc ttcctggaac cagcaccgtt tgtccacctg caaatcctca tcctcagttt 840 ggaggtgccc tctccctccc ctccacgcac agctgtgaca ggtacccaac cctgaggagc 900 caccggtcct caccctaccc cagcccctat gctcatcgga acaattctcc aacctattct 960 gacaactcac ctgcatgttt atccatgctg caatcccatg acaattggtc cagccttgga 1020 atgcctgccc atcccagcat gctccccgtg agccacaatg ccagcccacc taccagctcc 1080 agtcagtacc ccagcctgtg gtctgtgagc aacggcgccg tcaccccggg ctcccaggca 1140 gcagccgtgt ccaacgggct gggggcccag ttcttccggg gctcccccgc gcactacaca 1200 cccctcaccc atccggtctc ggcgccctct tcctcgggat ccccactgta cgaaggggcg 1260 gccgcggcca cagacatcgt ggacagccag tacgacgccg cagcccaagg ccgcctcata 1320 gcctcatgga cacctgtgtc gccaccttcc atgtga 1356 <210> 38 <211> 452 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein comprising Brachyury (L254V) Protein encoded by SEQ ID NO:36 <400> 38 Met Asn Met Ser Lys Lys Gln Val Lys Thr Gln Ser Lys Cys Asn Asn 1 5 10 15 Ile Met Ser Ser Pro Gly Thr Glu Ser Ala Gly Lys Ser Leu Gln Tyr 20 25 30 Arg Val Asp His Leu Leu Ser Ala Val Glu Asn Glu Leu Gln Ala Gly 35 40 45 Ser Glu Lys Gly Asp Pro Thr Glu Arg Glu Leu Arg Val Gly Leu Glu 50 55 60 Glu Ser Glu Leu Trp Leu Arg Phe Lys Glu Leu Thr Asn Glu Met Ile 65 70 75 80 Val Thr Lys Asn Gly Arg Arg Met Phe Pro Val Leu Lys Val Asn Val 85 90 95 Ser Gly Leu Asp Pro Asn Ala Met Tyr Ser Phe Leu Leu Asp Phe Val 100 105 110 Ala Ala Asp Asn His Arg Trp Lys Tyr Val Asn Gly Glu Trp Val Pro 115 120 125 Gly Gly Lys Pro Glu Pro Gln Ala Pro Ser Cys Val Tyr Ile His Pro 130 135 140 Asp Ser Pro Asn Phe Gly Ala His Trp Met Lys Ala Pro Val Ser Phe 145 150 155 160 Ser Lys Val Lys Leu Thr Asn Lys Leu Asn Gly Gly Gly Gln Ile Met 165 170 175 Leu Asn Ser Leu His Lys Tyr Glu Pro Arg Ile His Ile Val 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tgtgacaggt acccaaccct gaggagccac cggtcctcac cctaccccag cccctatgct 900 catcggaaca attctccaac ctattctgac aactcacctg catgtttatc catgctgcaa 960 tcccatgaca attggtccag ccttggaatg cctgcccatc ccagcatgct ccccgtgagc 1020 cacaatgcca gcccacctac cagctccagt cagtacccca gcctgtggtc tgtgagcaac 1080 ggcgccgtca ccccgggctc ccaggcagca gccgtgtcca acgggctggg ggcccagttc 1140 ttccggggct cccccgcgca ctacacaccc ctcacccatc cggtctcggc gccctcttcc 1200 tcgggatccc cactgtacga aggggcggcc gcggccacag acatcgtgga cagccagtac 1260 gacgccgcag cccaaggccg cctcatagcc tcatggacac ctgtgtcgcc accttccatg 1320 tga 1323 <210> 45 <211> 1320 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence encoding fusion protein comprising Brachyury protein Isoform 1 plus addition of 15 nucleotides from Gene FPV 088 without Brachyury protein atg start codon <400> 45 atgaaaaata acttgagctc ccctggcacc gagagcgcgg gaaagagcct gcagtaccga 60 gtggaccacc tgctgagcgc cgtggagaat gagctgcagg cgggcagcga gaagggcgac 120 cccacagagc gcgaactgcg cgtgggcctg gaggagagcg agctgtggct gcgcttcaag 180 gagctcacca atgagatgat cgtgaccaag aacggcagga ggatgtttcc ggtgctgaag 240 gtgaacgtgt ctggcctgga ccccaacgcc atgtactcct tcctgctgga cttcgtggcg 300 gcggacaacc accgctggaa gtacgtgaac ggggaatggg tgccgggggg caagccggag 360 ccgcaggcgc ccagctgcgt ctacatccac cccgactcgc ccaacttcgg ggcccactgg 420 atgaaggctc ccgtctcctt cagcaaagtc aagctcacca acaagctcaa cggagggggc 480 cagatcatgc tgaactcctt gcataagtat gagcctcgaa tccacatagt gagagttggg 540 ggtccacagc gcatgatcac cagccactgc ttccctgaga cccagttcat agcggtgact 600 gcttatcaga acgaggagat cacagctctt aaaattaagt acaatccatt tgcaaaagct 660 ttccttgatg caaaggaaag aagtgatcac aaagagatga tggaggaacc cggagacagc 720 cagcaacctg ggtactccca atgggggtgg cttcttcctg gaaccagcac cgtttgtcca 780 cctgcaaatc ctcatcctca gtttggaggt gccctctccc tcccctccac gcacagctgt 840 gacaggtacc caaccctgag gagccaccgg tcctcaccct accccagccc ctatgctcat 900 cggaacaatt ctccaaccta ttctgacaac tcacctgcat gtttatccat gctgcaatcc 960 catgacaatt ggtccagcct tggaatgcct gcccatccca gcatgctccc cgtgagccac 1020 aatgccagcc cacctaccag ctccagtcag taccccagcc tgtggtctgt gagcaacggc 1080 gccgtcaccc cgggctccca ggcagcagcc gtgtccaacg ggctgggggc ccagttcttc 1140 cggggctccc ccgcgcacta cacacccctc acccatccgg tctcggcgcc ctcttcctcg 1200 ggatccccac tgtacgaagg ggcggccgcg gccacagaca tcgtggacag ccagtacgac 1260 gccgcagccc aaggccgcct catagcctca tggacacctg tgtcgccacc ttccatgtga 1320 <210> 46 <211> 440 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein comprising Brachyury protein Isoform 1 encoded by SEQ ID NO:44 <400> 46 Met Lys Asn Asn Leu Met Ser Ser Pro Gly Thr Glu Ser Ala Gly Lys 1 5 10 15 Ser Leu Gln Tyr Arg Val Asp His Leu Leu Ser Ala Val Glu Asn Glu 20 25 30 Leu Gln Ala Gly Ser Glu Lys Gly Asp Pro Thr Glu Arg Glu Leu Arg 35 40 45 Val Gly Leu Glu Glu Ser Glu Leu Trp Leu Arg Phe Lys Glu Leu Thr 50 55 60 Asn Glu Met Ile Val Thr Lys Asn Gly Arg Arg Met Phe Pro Val Leu 65 70 75 80 Lys Val Asn Val Ser Gly Leu Asp Pro Asn Ala Met Tyr Ser Phe Leu 85 90 95 Leu Asp Phe Val Ala 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addition of 18 nucleotides from Gene FPV 088 without brachyury atg <400> 53 atgaacatga gtaagaaaag ctcccctggc accgagagcg cgggaaagag cctgcagtac 60 cgagtggacc acctgctgag cgccgtggag aatgagctgc aggcgggcag cgagaagggc 120 gaccccacag agcgcgaact gcgcgtgggc ctggaggaga gcgagctgtg gctgcgcttc 180 aaggagctca ccaatgagat gatcgtgacc aagaacggca ggaggatgtt tccggtgctg 240 aaggtgaacg tgtctggcct ggaccccaac gccatgtact ccttcctgct ggacttcgtg 300 gcggcggaca accaccgctg gaagtacgtg aacggggaat gggtgccggg gggcaagccg 360 gagccgcagg cgcccagctg cgtctacatc caccccgact cgcccaactt cggggcccac 420 tggatgaagg ctcccgtctc cttcagcaaa gtcaagctca ccaacaagct caacggaggg 480 ggccagatca tgctgaactc cttgcataag tatgagcctc gaatccacat agtgagagtt 540 gggggtccac agcgcatgat caccagccac tgcttccctg agacccagtt catagcggtg 600 actgcttatc agaacgagga gatcacagct cttaaaatta agtacaatcc atttgcaaaa 660 gctttccttg atgcaaagga aagaagtgat cacaaagaga tgatggagga acccggagac 720 agccagcaac ctgggtactc ccaatggggg tggcttcttc ctggaaccag caccgtttgt 780 ccacctgcaa 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protein Isoform 1 encoded by SEQ ID NO:60 <400> 62 Met Lys Asn Asn Leu Tyr Glu Glu Lys Met Asn Met Ser Lys Lys Gln 1 5 10 15 Val Lys Thr Gln Ser Lys Cys Asn Asn Ile Met Ser Ser Pro Gly Thr 20 25 30 Glu Ser Ala Gly Lys Ser Leu Gln Tyr Arg Val Asp His Leu Leu Ser 35 40 45 Ala Val Glu Asn Glu Leu Gln Ala Gly Ser Glu Lys Gly Asp Pro Thr 50 55 60 Glu Arg Glu Leu Arg Val Gly Leu Glu Glu Ser Glu Leu Trp Leu Arg 65 70 75 80 Phe Lys Glu Leu Thr Asn Glu Met Ile Val Thr Lys Asn Gly Arg Arg 85 90 95 Met Phe Pro Val Leu Lys Val Asn Val Ser Gly Leu Asp Pro Asn Ala 100 105 110 Met Tyr Ser Phe Leu Leu Asp Phe Val Ala Ala Asp Asn His Arg Trp 115 120 125 Lys Tyr Val Asn Gly Glu Trp Val Pro Gly Gly Lys Pro Glu Pro Gln 130 135 140 Ala Pro Ser Cys Val Tyr Ile His Pro Asp Ser Pro Asn Phe Gly Ala 145 150 155 160 His Trp Met Lys Ala Pro Val Ser Phe Ser Lys Val Lys Leu Thr Asn 165 170 175 Lys Leu Asn Gly Gly Gly Gln Ile Met Leu Asn Ser Leu His Lys Tyr 180 185 190 Glu Pro Arg Ile His Ile Val Arg Val Gly Gly Pro 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425 430 Ala Gln Gly Arg Leu Ile Ala Ser Trp Thr Pro Val Ser Pro Pro Ser 435 440 445 Met <210> 72 <211> 1516 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Expression Cassette found in mBN345 - Promoter + cDNA encoding Fusion protein comprising Brachyury (L254V) Protein <400> 72 atccgtacag gtttgtttct gaaattcact ttgtaagata cataattaac aaattcaggg 60 ggaaaaatct ttacaaaatt agtatagaag ctatagatat atcaaaaggt agacaacaaa 120 taatcagaac ctaatttttt tatcaaaaaa ttaaaatata aataaaatga aaaataactt 180 gtatgaagaa aaaatgaaca tgagtaagaa aagctcccct ggcaccgaga gcgcgggaaa 240 gagcctgcag taccgagtgg accacctgct gagcgccgtg gagaatgagc tgcaggcggg 300 cagcgagaag ggcgacccca cagagcgcga actgcgcgtg ggcctggagg agagcgagct 360 gtggctgcgc ttcaaggagc tcaccaatga gatgatcgtg accaagaacg gcaggaggat 420 gtttccggtg ctgaaggtga acgtgtctgg cctggacccc aacgccatgt actccttcct 480 gctggacttc gtggcggcgg acaaccaccg ctggaagtac gtgaacgggg aatgggtgcc 540 ggggggcaag ccggagccgc aggcgcccag ctgcgtctac atccaccccg actcgcccaa 600 cttcggggcc cactggatga aggctcccgt ctccttcagc aaagtcaagc tcaccaacaa 660 gctcaacgga gggggccaga tcatgctgaa ctccttgcat aagtatgagc ctcgaatcca 720 catagtgaga gttgggggtc cacagcgcat gatcaccagc cactgcttcc ctgagaccca 780 gttcatagcg gtgactgctt atcagaacga ggagatcaca gctcttaaaa ttaagtacaa 840 tccatttgca aaggctttcc ttgatgcaaa ggaaagaagt gatcacaaag agatgatgga 900 ggaacccgga gacagccagc aacctgggta ctcccaatgg gggtggcttc ttcctggaac 960 cagcaccgtt tgtccacctg caaatcctca tcctcagttt ggaggtgccc tctccctccc 1020 ctccacgcac agctgtgaca ggtacccaac cctgaggagc caccggtcct caccctaccc 1080 cagcccctat gctcatcgga acaattctcc aacctattct gacaactcac ctgcatgttt 1140 atccatgctg caatcccatg acaattggtc cagccttgga atgcctgccc atcccagcat 1200 gctccccgtg agccacaatg ccagcccacc taccagctcc agtcagtacc ccagcctgtg 1260 gtctgtgagc aacggcgccg tcaccccggg ctcccaggca gcagccgtgt ccaacgggct 1320 gggggcccag ttcttccggg gctcccccgc gcactacaca cccctcaccc atccggtctc 1380 ggcgccctct tcctcgggat ccccactgta cgaaggggcg gccgcggcca cagacatcgt 1440 ggacagccag tacgacgccg cagcccaagg ccgcctcata gcctcatgga cacctgtgtc 1500 gccaccttcc atgtga 1516 <210> 73 <211> 1552 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Expression Cassette found in mBN355 - Promoter + cDNA encoding Fusion protein comprising Brachyury (L254V) Protein <400> 73 atccgtacag gtttgtttct gaaattcact ttgtaagata cataattaac aaattcaggg 60 ggaaaaatct ttacaaaatt agtatagaag ctatagatat atcaaaaggt agacaacaaa 120 taatcagaac ctaatttttt tatcaaaaaa ttaaaatata aataaaatga aaaataactt 180 gtatgaagaa aaaatgaaca tgagtaagaa acaagtaaaa actcaaagta aatgtaataa 240 tatcatgagc tcccctggca ccgagagcgc gggaaagagc ctgcagtacc gagtggacca 300 cctgctgagc gccgtggaga atgagctgca ggcgggcagc gagaagggcg accccacaga 360 gcgcgaactg cgcgtgggcc tggaggagag cgagctgtgg ctgcgcttca aggagctcac 420 caatgagatg atcgtgacca agaacggcag gaggatgttt ccggtgctga aggtgaacgt 480 gtctggcctg gaccccaacg ccatgtactc cttcctgctg gacttcgtgg cggcggacaa 540 ccaccgctgg aagtacgtga acggggaatg ggtgccgggg ggcaagccgg agccgcaggc 600 gcccagctgc gtctacatcc accccgactc gcccaacttc ggggcccact ggatgaaggc 660 tcccgtctcc ttcagcaaag tcaagctcac caacaagctc aacggagggg gccagatcat 720 gctgaactcc ttgcataagt atgagcctcg aatccacata gtgagagttg ggggtccaca 780 gcgcatgatc accagccact gcttccctga gacccagttc atagcggtga ctgcttatca 840 gaacgaggag atcacagctc ttaaaattaa gtacaatcca tttgcaaagg ctttccttga 900 tgcaaaggaa agaagtgatc acaaagagat gatggaggaa cccggagaca gccagcaacc 960 tgggtactcc caatgggggt ggcttcttcc tggaaccagc accgtttgtc cacctgcaaa 1020 tcctcatcct cagtttggag gtgccctctc cctcccctcc acgcacagct gtgacaggta 1080 cccaaccctg aggagccacc ggtcctcacc ctaccccagc ccctatgctc atcggaacaa 1140 ttctccaacc tattctgaca actcacctgc atgtttatcc atgctgcaat cccatgacaa 1200 ttggtccagc cttggaatgc ctgcccatcc cagcatgctc cccgtgagcc acaatgccag 1260 cccacctacc agctccagtc agtaccccag cctgtggtct gtgagcaacg gcgccgtcac 1320 cccgggctcc caggcagcag ccgtgtccaa cgggctgggg gcccagttct tccggggctc 1380 ccccgcgcac tacacacccc tcacccatcc ggtctcggcg ccctcttcct cgggatcccc 1440 actgtacgaa ggggcggccg cggccacaga catcgtggac agccagtacg acgccgcagc 1500 ccaaggccgc ctcatagcct catggacacc tgtgtcgcca ccttccatgt ga 1552 <210> 74 <211> 1464 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Expression Cassette found in mBN343 - Promoter + cDNA encoding Fusion protein comprising Brachyury (L254V) Protein <400> 74 taatgtatag aactaattta taataaacat agtaaatatg ggtaacttct taatagccat 60 aattaaaatt gaaaaaaaaa tatcattata aaacgtaaac gaacaaaaaa cattaattga 120 tcccccccct gtctcccccc tccagattga gcaatcatga gctcccctgg caccgagagc 180 gcgggaaaga gcctgcagta ccgagtggac cacctgctga gcgccgtgga gaatgagctg 240 caggcgggca gcgagaaggg cgaccccaca gagcgcgaac tgcgcgtggg cctggaggag 300 agcgagctgt ggctgcgctt caaggagctc accaatgaga tgatcgtgac caagaacggc 360 aggaggatgt ttccggtgct gaaggtgaac gtgtctggcc tggaccccaa cgccatgtac 420 tccttcctgc tggacttcgt ggcggcggac aaccaccgct ggaagtacgt gaacggggaa 480 tgggtgccgg ggggcaagcc ggagccgcag gcgcccagct gcgtctacat ccaccccgac 540 tcgcccaact tcggggccca ctggatgaag gctcccgtct ccttcagcaa agtcaagctc 600 accaacaagc tcaacggagg gggccagatc atgctgaact ccttgcataa gtatgagcct 660 cgaatccaca tagtgagagt tgggggtcca cagcgcatga tcaccagcca ctgcttccct 720 gagacccagt tcatagcggt gactgcttat cagaacgagg agatcacagc tcttaaaatt 780 aagtacaatc catttgcaaa ggctttcctt gatgcaaagg aaagaagtga tcacaaagag 840 atgatggagg aacccggaga cagccagcaa cctgggtact cccaatgggg gtggcttctt 900 cctggaacca gcaccgtttg tccacctgca aatcctcatc ctcagtttgg aggtgccctc 960 tccctcccct ccacgcacag ctgtgacagg tacccaaccc tgaggagcca ccggtcctca 1020 ccctacccca gcccctatgc tcatcggaac aattctccaa cctattctga caactcacct 1080 gcatgtttat ccatgctgca atcccatgac aattggtcca gccttggaat gcctgcccat 1140 cccagcatgc tccccgtgag ccacaatgcc agcccaccta ccagctccag tcagtacccc 1200 agcctgtggt ctgtgagcaa cggcgccgtc accccgggct cccaggcagc agccgtgtcc 1260 aacgggctgg gggcccagtt cttccggggc tcccccgcgc actacacacc cctcacccat 1320 ccggtctcgg cgccctcttc ctcgggatcc ccactgtacg aaggggcggc cgcggccaca 1380 gacatcgtgg acagccagta cgacgccgca gcccaaggcc gcctcatagc ctcatggaca 1440 cctgtgtcgc caccttccat gtga 1464 <210> 75 <211> 1478 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Expression Cassette found in mBN344 - Promoter + cDNA encoding Fusion protein comprising Brachyury (L254V) Protein <400> 75 tatccgtaca ggtttgtttc tgaaattcac tttgtaagat acataattaa caaattcagg 60 gggaaaaatc tttacaaaat tagtatagaa gctatagata tatcaaaagg tagacaacaa 120 ataatcagaa cctaattttt ttatcaaaaa attaaaatat aaataaaatc atgagctccc 180 ctggcaccga gagcgcggga aagagcctgc agtaccgagt ggaccacctg ctgagcgccg 240 tggagaatga gctgcaggcg ggcagcgaga agggcgaccc cacagagcgc gaactgcgcg 300 tgggcctgga ggagagcgag ctgtggctgc gcttcaagga gctcaccaat gagatgatcg 360 tgaccaagaa cggcaggagg atgtttccgg tgctgaaggt gaacgtgtct ggcctggacc 420 ccaacgccat gtactccttc ctgctggact tcgtggcggc ggacaaccac cgctggaagt 480 acgtgaacgg ggaatgggtg ccggggggca agccggagcc gcaggcgccc agctgcgtct 540 acatccaccc cgactcgccc aacttcgggg cccactggat gaaggctccc gtctccttca 600 gcaaagtcaa gctcaccaac aagctcaacg gagggggcca gatcatgctg aactccttgc 660 ataagtatga gcctcgaatc cacatagtga gagttggggg tccacagcgc atgatcacca 720 gccactgctt ccctgagacc cagttcatag cggtgactgc ttatcagaac gaggagatca 780 cagctcttaa aattaagtac aatccatttg caaaggcttt ccttgatgca aaggaaagaa 840 gtgatcacaa agagatgatg gaggaacccg gagacagcca gcaacctggg tactcccaat 900 gggggtggct tcttcctgga accagcaccg tttgtccacc tgcaaatcct catcctcagt 960 ttggaggtgc cctctccctc ccctccacgc acagctgtga caggtaccca accctgagga 1020 gccaccggtc ctcaccctac cccagcccct atgctcatcg gaacaattct ccaacctatt 1080 ctgacaactc acctgcatgt ttatccatgc tgcaatccca tgacaattgg tccagccttg 1140 gaatgcctgc ccatcccagc atgctccccg tgagccacaa tgccagccca cctaccagct 1200 ccagtcagta ccccagcctg tggtctgtga gcaacggcgc cgtcaccccg ggctcccagg 1260 cagcagccgt gtccaacggg ctgggggccc agttcttccg gggctccccc gcgcactaca 1320 cacccctcac ccatccggtc tcggcgccct cttcctcggg atccccactg tacgaagggg 1380 cggccgcggc cacagacatc gtggacagcc agtacgacgc cgcagcccaa ggccgcctca 1440 tagcctcatg gacacctgtg tcgccacctt ccatgtga 1478 <210> 76 <211> 1486 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Expression Cassette found in mBN354 - Promoter + cDNA encoding Fusion protein comprising Brachyury (L254V) Protein <400> 76 atccgtacag gtttgtttct gaaattcact ttgtaagata cataattaac aaattcaggg 60 ggaaaaatct ttacaaaatt agtatagaag ctatagatat atcaaaaggt agacaacaaa 120 taatcagaac ctaatttttt tatcaaaaaa ttaaaatata aataaaatga aaaataactt 180 gagctcccct ggcaccgaga gcgcgggaaa gagcctgcag taccgagtgg accacctgct 240 gagcgccgtg gagaatgagc tgcaggcggg cagcgagaag ggcgacccca cagagcgcga 300 actgcgcgtg ggcctggagg agagcgagct gtggctgcgc ttcaaggagc tcaccaatga 360 gatgatcgtg accaagaacg gcaggaggat gtttccggtg ctgaaggtga acgtgtctgg 420 cctggacccc aacgccatgt actccttcct gctggacttc gtggcggcgg acaaccaccg 480 ctggaagtac gtgaacgggg aatgggtgcc ggggggcaag ccggagccgc aggcgcccag 540 ctgcgtctac atccaccccg actcgcccaa cttcggggcc cactggatga aggctcccgt 600 ctccttcagc aaagtcaagc tcaccaacaa gctcaacgga gggggccaga tcatgctgaa 660 ctccttgcat aagtatgagc ctcgaatcca catagtgaga gttgggggtc cacagcgcat 720 gatcaccagc cactgcttcc ctgagaccca gttcatagcg gtgactgctt atcagaacga 780 ggagatcaca gctcttaaaa ttaagtacaa tccatttgca aaggctttcc ttgatgcaaa 840 ggaaagaagt gatcacaaag agatgatgga ggaacccgga gacagccagc aacctgggta 900 ctcccaatgg gggtggcttc ttcctggaac cagcaccgtt tgtccacctg caaatcctca 960 tcctcagttt ggaggtgccc tctccctccc ctccacgcac agctgtgaca ggtacccaac 1020 cctgaggagc caccggtcct caccctaccc cagcccctat gctcatcgga acaattctcc 1080 aacctattct gacaactcac ctgcatgttt atccatgctg caatcccatg acaattggtc 1140 cagccttgga atgcctgccc atcccagcat gctccccgtg agccacaatg ccagcccacc 1200 taccagctcc agtcagtacc ccagcctgtg gtctgtgagc aacggcgccg tcaccccggg 1260 ctcccaggca gcagccgtgt ccaacgggct gggggcccag ttcttccggg gctcccccgc 1320 gcactacaca cccctcaccc atccggtctc ggcgccctct tcctcgggat ccccactgta 1380 cgaaggggcg gccgcggcca cagacatcgt ggacagccag tacgacgccg cagcccaagg 1440 ccgcctcata gcctcatgga cacctgtgtc gccaccttcc atgtga 1486 <210> 77 <211> 182 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Promoter Sequence with nucleotides 5' of Gene FPV 088 + 15 nucleotides <400> 77 tatccgtaca ggtttgtttc tgaaattcac tttgtaagat acataattaa caaattcagg 60 gggaaaaatc tttacaaaat tagtatagaa gctatagata tatcaaaagg tagacaacaa 120 ataatcagaa cctaattttt ttatcaaaaa attaaaatat aaataaaatg aaaaataact 180 tg 182

Claims (49)

  1. 코딩 서열의 발현을 위한 발현 카세트에 있어서, 상기 발현 카세트는 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 카세트:
    a. 서열 번호: 1-10 및 77 중에서 한 가지에 최소한 70% 동일성을 갖는 핵 서열을 포함하는 프로모터; 및
    b. 상기 프로모터에 작동가능하게 연결된 코딩 서열;
    여기서 상기 코딩 서열의 발현이 상기 프로모터에 의해 제어된다.
  2. 청구항 1에 있어서, 프로모터는 서열 번호: 1-10 및 77 중에서 한 가지에 최소한 75%, 80%, 85%, 또는 90% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 카세트.
  3. 청구항 1 내지 2 중에서 어느 한 항에 있어서, 프로모터는 서열 번호:1-10 및 77 중에서 한 가지에 혼성화할 수 있는 핵산 서열에서 선택되는 것을 특징으로 하는 발현 카세트.
  4. 청구항 1 내지 3 중에서 어느 한 항에 있어서, 발현 카세트는 폭스바이러스의 유전체에서 자연적으로 발생하는 발현 카세트가 아닌 것을 특징으로 하는 발현 카세트.
  5. 청구항 1 내지 4 중에서 어느 한 항에 있어서, 프로모터는 서열 번호:4 및 서열 번호:5 중에서 한 가지에 최소한 70% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 카세트.
  6. 청구항 1 내지 4 중에서 어느 한 항에 있어서, 프로모터는 서열 번호:4 및 서열 번호:5로 구성된 군에서 선택되는 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 카세트.
  7. 청구항 1 내지 4 중에서 어느 한 항에 있어서, 프로모터는 서열 번호:9 또는 이의 하위서열인 것을 특징으로 하는 발현 카세트.
  8. 청구항 7에 있어서, 하위서열은 서열 번호: 4 및 5에서 선택되는 것을 특징으로 하는 발현 카세트.
  9. 청구항 1 내지 8 중에서 어느 한 항에 있어서, 코딩 서열은 (a) 치료적 단백질 또는 펩티드, 항원, 항원성 에피토프, 안티센스 RNA, 종양-연관된 항원 또는 에피토프, 또는 리보자임 중에서 최소한 하나를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 발현 카세트.
  10. 청구항 1 내지 8 중에서 어느 한 항에 있어서, 코딩 서열은 최소한 하나의 종양-연관된 항원 (TAA)을 인코딩하는 것을 특징으로 하는 발현 카세트.
  11. 청구항 1 내지 10 중에서 어느 한 항에 있어서, 코딩 서열은 CEA, MUC-1, PAP, PSA, HER-2, 서바이빈, 티로신 관련된 단백질 1 (tyrp1), 티로신 관련된 단백질 2 (tyrp2), 브라큐리 항원, 또는 이들의 조합에서 선택되는 최소한 하나의 TAA를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 발현 카세트.
  12. 청구항 1 내지 11 중에서 어느 한 항에 있어서, 코딩 서열은 브라큐리 항원을 인코딩하는 것을 특징으로 하는 발현 카세트.
  13. 청구항 12에 있어서, 브라큐리 항원은 브라큐리 L254V인 것을 특징으로 하는 발현 카세트.
  14. 청구항 12에 있어서, 코딩 서열은 다음과 같이 구성된 군에서 선택되는 브라큐리 항원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 카세트: 서열 번호: 11 및 서열 번호:13.
  15. 청구항 12에 있어서, 코딩 서열은 다음과 같이 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 발현 카세트: 서열 번호: 12, 서열 번호:14 및 서열 번호:15.
  16. 청구항 1 내지 11 중에서 어느 한 항에 있어서, 코딩 서열은 다음과 같이 구성된 군에서 선택되는 브라큐리 항원을 인코딩하는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 카세트: 서열 번호: 11, 13, 18-19, 22-23, 26-27, 30-31, 34-35, 38-39, 42-43, 46-47, 50-51, 54-55, 58-59, 62-63, 66-67, 70 및 71.
  17. 청구항 1 내지 11 중에서 어느 한 항에 있어서, 코딩 서열은 다음과 같이 구성된 군에서 선택되는 브라큐리 항원을 인코딩하는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 카세트: 서열 번호: 13, 18-19, 22-23, 26-27, 30-31, 34-35, 38-39, 42 및 43.
  18. 청구항 1 내지 11 중에서 어느 한 항에 있어서, 코딩 서열은 다음과 같이 구성된 군에서 선택되는 브라큐리 항원을 인코딩하는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 카세트: 서열 번호: 26-27, 30-31, 38-39, 42 및 43.
  19. 청구항 1 내지 11 중에서 어느 한 항에 있어서, 코딩 서열은 다음과 같이 구성된 군에서 선택되는 핵산에 최소한 70% 동일성을 갖는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 카세트: 서열 번호: 24-25, 28-29, 36-37, 40 및 41.
  20. 청구항 1 내지 11 중에서 어느 한 항에 있어서, 코딩 서열은 서열 번호: 25 또는 29, 또는 이들의 하위서열에 최소한 70% 동일성을 갖는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 카세트.
  21. 청구항 1 내지 11 중에서 어느 한 항에 있어서, 코딩 서열은 다음과 같이 구성된 군에서 선택되는 핵산에 최소한 70% 서열 동일성을 갖는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 카세트: 12, 14-17, 20-21, 24-25, 28-29, 32-33, 36-37, 40-41, 44-45, 48-49, 52-53, 56-57, 60-61, 64-65, 68 및 69.
  22. 다음과 같이 구성된 군에서 선택되는 핵산을 포함하는 발현 카세트: 서열 번호: 72-76.
  23. 다음과 같이 구성된 군에서 선택되는 핵산을 포함하는 발현 카세트: 서열 번호:72, 서열 번호: 73 및 서열 번호:74.
  24. 코딩 서열의 발현을 증강하기 위한 프로모터에 있어서, 상기 프로모터는 서열 번호: 1-10 및 77로 구성된 군에서 선택되는 핵산 서열, 또는 서열 번호: 1-10 및 77 중에서 한 가지의 유도체 서열을 포함하거나 또는 이것으로 구성되고, 여기서 상기 유도체는 하나 또는 그 이상의 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고, 그리고 여기서 상기 유도체 서열은 폭스바이러스 프로모터로서 활성적이고 및/또는 폭스바이러스 감염된 세포에서 활성적인 것을 특징으로 하는 프로모터.
  25. 코딩 서열의 발현을 증강하기 위한 프로모터에 있어서, 상기 프로모터는 서열 번호: 1-10 및 77로 구성된 군에서 선택되는 핵산 서열 또는 이의 하위서열을 포함하거나 또는 이것으로 구성되는 것을 특징으로 하는 프로모터.
  26. 코딩 서열의 발현을 증강하기 위한 프로모터에 있어서, 상기 프로모터는 서열 번호:9 또는 이의 하위서열과 최소한 70% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나 또는 이것으로 구성되는 것을 특징으로 하는 프로모터.
  27. 청구항 26에 있어서, 하위서열은 서열 번호: 3-8로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 프로모터.
  28. 서열 번호: 18-19, 22-23, 26-27, 30-31, 34-35, 38-39, 42-43, 46-47, 50-51, 54-55, 58-59, 62-63, 66-67, 70 및 71로 구성된 군에서 선택되는 브라큐리 항원을 인코딩하는 핵산 또는 이의 하위서열과 최소한 70% 동일성을 갖는 합성 핵산.
  29. 서열 번호: 16-17, 20-21, 24-25, 28-29, 32-33, 36-37, 40-41, 44-45, 48-49, 52-53, 56-57, 60-61, 64-65, 68 및 69로 구성된 군에서 선택되는 합성 핵산 또는 이의 하위서열.
  30. 서열 번호: 18-19, 22-23, 26-27, 30-31, 34-35, 38-39, 42-43, 46-47, 50-51, 54-55, 58-59, 62-63, 66-67, 70 및 71로 구성된 군에서 선택되는 합성 단백질 또는 이의 하위서열.
  31. 청구항 1 내지 23 중에서 어느 한 항의 발현 카세트, 청구항 24 내지 27 중에서 어느 한 항의 프로모터, 청구항 28 내지 29 중에서 어느 한 항의 핵산 및/또는 청구항 30의 단백질을 포함하는 벡터.
  32. 청구항 31에 있어서, 벡터는 플라스미드인 것을 특징으로 하는 벡터.
  33. 청구항 31에 있어서, 벡터는 재조합 바이러스인 것을 특징으로 하는 벡터.
  34. 청구항 33에 있어서, 재조합 바이러스는 폭스바이러스인 것을 특징으로 하는 벡터.
  35. 청구항 34에 있어서, 폭스바이러스는 조류폭스바이러스인 것을 특징으로 하는 벡터.
  36. 청구항 35에 있어서, 조류폭스바이러스는 계두바이러스인 것을 특징으로 하는 벡터.
  37. 청구항 31 내지 36 중에서 어느 한 항에 있어서, 발현 카세트는 폭스바이러스 유전체의 결실 부위 내로 삽입된 것을 특징으로 하는 벡터.
  38. 청구항 31 내지 35 중에서 어느 한 항에 있어서, 발현 카세트는 폭스바이러스 유전체의 유전자간 영역 내로 삽입된 것을 특징으로 하는 벡터.
  39. 청구항 33 내지 34 중에서 어느 한 항에 있어서, 벡터는 오소폭스바이러스인 것을 특징으로 하는 벡터.
  40. 청구항 39에 있어서, 오소폭스바이러스는 우두바이러스, 변형된 앙카라 바이러스 (MVA), 또는 MVA-BN에서 선택되는 것을 특징으로 하는 벡터.
  41. a) 청구항 1 내지 23 중에서 어느 한 항에 따른 발현 카세트, b) 청구항 24 내지 27 중에서 어느 한 항의 프로모터, c) 청구항 28 내지 29 중에서 어느 한 항의 핵산, d) 청구항 30의 단백질, 또는 e) 청구항 31 내지 40 중에서 어느 한 항에 따른 벡터를 포함하는 백신, 약제, 또는 제약학적 조성물.
  42. a) 청구항 1 내지 23 중에서 어느 한 항에 따른 발현 카세트, b) 청구항 24 내지 27 중에서 어느 한 항의 프로모터, c) 청구항 28 내지 29 중에서 어느 한 항의 핵산, d) 청구항 30의 단백질, 또는 e) 청구항 31 내지 40 중에서 어느 한 항에 따른 벡터를 포함하는 세포.
  43. 코딩 서열을 표적 세포 내로 도입하기 위한 방법에 있어서, a) 청구항 1 내지 23 중에서 어느 한 항에 따른 발현 카세트, b) 청구항 24 내지 27 중에서 어느 한 항의 프로모터, c) 청구항 28 내지 29 중에서 어느 한 항의 핵산, 또는 d) 청구항 31 내지 40 중에서 어느 한 항에 따른 벡터를 표적 세포 내로 도입하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 펩티드, 단백질, 또는 바이러스를 생산하기 위한 방법에 있어서, a) 청구항 1 내지 23 중에서 어느 한 항에 따른 발현 카세트, b) 청구항 24 내지 27 중에서 어느 한 항의 프로모터, c) 청구항 28 내지 29 중에서 어느 한 항의 핵산, 또는 d) 청구항 31 내지 40 중에서 어느 한 항에 따른 벡터로 숙주 세포의 감염을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 핵산을 발현하기 위한 방법에 있어서, 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    a. a) 청구항 1 내지 23 중에서 어느 한 항에 따른 발현 카세트, b) 청구항 24 내지 27 중에서 어느 한 항의 프로모터, c) 청구항 28 내지 29 중에서 어느 한 항의 핵산을 포함하는 발현 벡터 또는 바이러스를 제공하고; 그리고
    b. 상기 발현 벡터 또는 바이러스를 상기 발현 카세트, 프로모터, 또는 핵산의 발현을 증진하는 조건에 종속시킨다.
  46. 약제, 바람직하게는 백신의 제조에서 a) 청구항 1 내지 23 중에서 어느 한 항에 따른 발현 카세트, b) 청구항 24 내지 27 중에서 어느 한 항의 프로모터, c) 청구항 28 내지 29 중에서 어느 한 항의 핵산, d) 청구항 30의 단백질, 또는 e) 청구항 31 내지 40 중에서 어느 한 항에 따른 벡터의 용도.
  47. 핵산을 발현하기 위한 a) 청구항 1 내지 23 중에서 어느 한 항에 따른 발현 카세트, b) 청구항 24 내지 27 중에서 어느 한 항의 프로모터, c) 청구항 28 내지 29 중에서 어느 한 항의 핵산, d) 청구항 30의 단백질, 또는 e) 청구항 31 내지 40 중에서 어느 한 항에 따른 벡터의 용도.
  48. 약제, 바람직하게는 백신으로서 이용을 위한 a) 청구항 1 내지 23 중에서 어느 한 항에 따른 발현 카세트, b) 청구항 24 내지 27 중에서 어느 한 항의 프로모터, c) 청구항 28 내지 29 중에서 어느 한 항의 핵산, d) 청구항 30의 단백질, 또는 e) 청구항 31 내지 40 중에서 어느 한 항에 따른 벡터.
  49. 코딩 서열을 표적 세포 내로 도입하기 위한 방법에서 이용을 위한 a) 청구항 1 내지 23 중에서 어느 한 항에 따른 발현 카세트, b) 청구항 24 내지 27 중에서 어느 한 항의 프로모터, c) 청구항 28 내지 29 중에서 어느 한 항의 핵산, 또는 d) 청구항 31 내지 40 중에서 어느 한 항에 따른 벡터.

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