CN109844104B - 重组疫苗病毒及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一些基因表达被抑制的重组痘苗病毒及其用途。本发明的重组痘苗病毒选择性地杀伤癌细胞，并且在癌细胞中具有优异的再生产性。而且，该病毒对正常细胞的毒性较低，因此具有对人体安全的优点。因此，本发明的重组痘苗病毒可以有效地用作治疗癌症的组合物。
Description
技术领域
本发明涉及一些基因表达被抑制的重组痘苗病毒及其用途。
背景技术
最近，为了开发癌症治疗剂，已经积极地进行了对通过遗传操作各种病毒而修饰的溶瘤病毒的研究。然而，溶瘤病毒的局限性尚未完全解决。例如，为了开发成抗癌剂，通过遗传操作产生具有肿瘤选择性复制能力的病毒。然而，存在以下局限性：病毒在不仅癌细胞中而且在正常细胞中复制，从而杀死正常细胞，或病毒具有不足的抗癌作用。因此，存在对于开发使得溶瘤病毒对癌细胞的选择性和功效增加同时使对正常细胞的影响最小化的技术的持续需求。
另一方面，痘苗病毒是有包膜的DNA病毒，具有编码约200个独立基因的约200kbp的双链线性基因组DNA。Edward Jenner在十八世纪首次使用痘苗病毒作为天花的预防性疫苗。从那时起，痘苗病毒已经被开发成各种预防性疫苗。在早期痘苗病毒疫苗中，使用野生型病毒，在接种疫苗的患者中观察到严重的副作用，例如全身性感染或进行性感染。因此，为了减少副作用，开发了毒性减弱的改良型痘苗病毒，例如改良型痘苗安卡拉株(MVA)、LC16m8(来自利斯特(Lister)株)和纽约痘苗病毒(NYVAC，来自哥本哈根痘苗株)。已经基于这些痘苗病毒开发了针对各种疾病的疫苗。痘苗病毒株如Western Reserve(WR)、NYVAC、Wyeth(Wyeth)和利斯特也正在被开发为溶瘤病毒。
发明内容
技术问题
本发明的目的是提供一些基因表达被抑制的重组痘苗病毒和含有作为有效成分的该重组痘苗病毒的抗癌组合物。
技术方案
为了实现上述目的，本发明提供K3L、胸苷激酶(TK)和痘苗生长因子(VGF)基因表达被抑制的重组痘苗病毒。
另外，本发明提供含有作为有效成分的重组痘苗病毒的癌症预防或治疗用药物组合物。
此外，本发明提供预防或治疗癌症的方法，所述方法包括将重组痘苗病毒给药至个体的步骤。
有益效果
本发明的重组痘苗病毒选择性地杀伤癌细胞并在癌细胞中表现出优异的复制能力。此外，重组痘苗病毒由于具有优异的癌细胞选择性杀伤能力而具有在人体中使用更安全的优点。因此，本发明的重组痘苗病毒可以有效地用作治疗癌症的组合物。
附图说明
图1是示出本发明的VGF基因表达被抑制的穿梭质粒构建体的一部分的示意图。
图2是示出本发明的TK基因表达被抑制的穿梭质粒构建体的一部分的示意图。
图3是示出本发明的K3L基因表达被抑制的穿梭质粒构建体的一部分的示意图。
图4A示出确认表1-1中所示的各种癌细胞系被VGF、TK和K3L基因表达被抑制的重组病毒杀死的结果。
[表1-1]
| 癌症 | 细胞系 |
| 肺癌 | A549 |
| 脑癌 | U-87MG |
| 乳腺癌 | T-47D |
| 卵巢癌 | A2780 |
| 胰腺癌 | MIA PaCa-2 |
| 结直肠癌 | SW620 |
图4B示出确认表1-2中所示的各种癌细胞系被VGF、TK和K3L基因表达被抑制的重组病毒杀死的结果。
[表1-2]
图5示出确认VGF、TK和K3L基因缺失或失活并且基因表达被抑制的重组IHD-W痘苗病毒诱导结肠直肠癌细胞系死亡的结果。缺失基因的缩写含义如表2所示：
[表2]
| 缩写 | 含义 |
| VTK | VGF、TK和K3L基因均缺失 |
| ViTK | VGF基因的表达失活，TK和K3L基因均缺失 |
| VTiK | TK基因的表达失活，VGF和K3L基因均缺失 |
| VTKi | K3L基因的表达失活，VGF和TK基因均缺失 |
图6是确认仅K3L基因、或VGF和TK两个基因、或VGF和TK以及K3L所有基因的表达被抑制的重组痘苗病毒对癌细胞的杀伤能力相对于对正常细胞的杀伤能力的图：
(a)是基于IHD-W-VTK值，通过比较重组IHD-WK、IHD-W-VT或IHD-W-VTK痘苗病毒对癌细胞相对于对正常细胞的杀伤能力而获得的图；及(b)是基于WR-ViTiKi值，通过比较重组WR-ViTi或WR-ViTiKi痘苗病毒对癌细胞相对于对正常细胞的杀伤能力而获得的图。
图7是通过观察向结肠直肠癌小鼠模型给药VGF和TK两个基因、或VGF和TK以及K3L所有基因的表达被抑制的重组痘苗病毒后肿瘤大小的变化而获得的图：
(a)是通过观察向结肠直肠癌小鼠模型给药重组IHD-W-VT或IHD-W-VTK痘苗病毒后肿瘤大小的变化而获得的图；及(b)是通过观察向结肠直肠癌小鼠模型给药重组WR-ViTi或WR-ViTiKi痘苗病毒后肿瘤大小的变化而获得的图。
图8是向结肠直肠癌小鼠模型给药VGF和TK两个基因、或VGF和TK以及K3L所有基因的表达均被抑制的重组痘苗病毒后以个体为基础确认小鼠体重变化的图。
(a)是向结肠直肠癌小鼠模型给药重组IHD-W-VT或IHD-W-VTK痘苗病毒后以个体为基础确认小鼠体重变化的图；及(b)是向结肠直肠癌小鼠模型给药重组WR-ViTi或WR-ViTiKi痘苗病毒后以个体为基础确认小鼠体重变化的图。
图9是确认向结肠直肠癌小鼠模型给药VGF和TK两个基因、或VGF和TK以及K3L所有基因的表达被抑制的重组痘苗病毒后小鼠死亡率的图：
(a)是确认向结肠直肠癌小鼠模型给药重组IHD-W-VT或IHD-W-VTK痘苗病毒后小鼠死亡率的图；及(b)是确认向结肠直肠癌小鼠模型给药重组WR-ViTi或WR-ViTiKi痘苗病毒后小鼠死亡率的图。
图10示出确认向结肠直肠癌小鼠模型给药VGF和TK两个基因、或VGF和TK以及K3L所有基因的表达被抑制的重组IHD-W痘苗病毒后小鼠尾部的炎症反应的结果。
(a)示出确认给药重组IHD-W-VT痘苗病毒的小鼠尾部的炎症反应的结果，和(b)示出确认给药重组IHD-W-VTK痘苗病毒的小鼠尾部的炎症反应的结果。
具体实施方式
在下文中，将详细描述本发明。
在本发明的一个方面，提供了VGF、TK和K3L基因表达被抑制的重组痘苗病毒。
本文使用的术语“VGF”是指痘苗生长因子。痘苗生长因子是表现出与上皮生长因子相似活性的酶。由VGF基因编码的痘苗生长因子在被病毒感染的情况下表现出生长因子活性，并且可以在由病毒引起的感染的初始阶段合成。VGF可以是GenBank序列：AAO89288.1、ABD52455.1或AIX98927.1，但不限于此。具体地，VGF可以是编码SEQ ID NO：67所示氨基酸序列的碱基序列，VGF基因可以是SEQ ID NO：66所示的碱基序列。VGF或其基因与SEQ ID NO：67的氨基酸序列或SEQ ID NO：66的碱基序列可具有约70％或75％或更高的同源性，优选约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、或89％、或更高的同源性。另外，VGF或其基因与SEQ ID NO：67的氨基酸序列或SEQ ID NO：66的碱基序列可具有约90％、91％、92％、93％、或94％、或更高的同源性，优选约95％、96％、97％、98％、或99％、或更高的同源性，最优选约99％或更高的同源性。
本文使用的术语“TK”是指胸苷激酶。胸苷激酶是参与核苷酸生物合成的酶。由TK基因编码的胸苷激酶使ATP的γ位磷酸与胸苷结合，使得可以产生构成病毒DNA的核苷酸。TK可以是GenBank序列：AAO89373.1、ABD52560.1或AIX99011.1，但不限于此。具体地，TK可以是编码SEQ ID NO：69所示氨基酸序列的碱基序列，TK基因可以是SEQ ID NO：68所示的碱基序列。TK或其基因与SEQ ID NO：69的氨基酸序列或SEQ ID NO：68的碱基序列可具有约70％或75％或更高的同源性，优选约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、或89％、或更高的同源性。另外，TK或其基因与SEQ ID NO：69的氨基酸序列或SEQ ID NO：68的碱基序列可具有约90％、91％、92％、93％、或94％、或更高的同源性，优选约95％、96％、97％、98％、或99％、或更高的同源性，最优选约99％或更高的同源性。
本文使用的术语“K3L”是指K3L蛋白质。由K3L基因编码的K3L蛋白质是与翻译起始因子-2α(eIF-2α)具有同源性的蛋白质，并且可以抑制作为干扰素活化剂的蛋白激酶R(PKR)的作用。K3L可以是GenBank序列：AAO89313.1、ABD52483.1或AGB75754.1，但不限于此。具体地，K3L的碱基序列可以编码SEQ ID NO：71所示氨基酸序列，K3L基因可以是SEQ IDNO：70所示的碱基序列。K3L或其基因与SEQ ID NO：71的氨基酸序列或SEQ ID NO：70的碱基序列可具有约70％或75％或更高的同源性，优选约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、或89％、或更高的同源性。另外，K3L或其基因与SEQ ID NO：71的氨基酸序列或SEQ ID NO：70的碱基序列可具有约90％、91％、92％、93％、或94％、或更高的同源性，优选约95％、96％、97％、98％、或99％、或更高的同源性，最优选约99％或更高的同源性。
根据本发明的基因的表达被抑制意味着该基因不表达或仅基因的一部分通过基因的部分或完全缺失或外源基因插入基因来表达，使得由该基因编码的蛋白不表现出活性。缺失基因或插入外源基因的方法可以通过本领域熟知的方法进行。例如，这可以通过插入以下文献所公开的外源基因的方法来进行：分子克实验手册第二版(MolecularCloning，A Laboratory Manual，Second Edition)，J.Sambrook，E.F.Fritsch andT.Maniatis(2003)，Cold Spring Harbor Laboratory Press；病毒学方法手册(VirologyMethods Manual)，Brian WJ Mahy and Hillar O Kangro编(1996)Academic Press；以及通过痘苗病毒载体表达基因和分子生物学通用方案(Expression of genes by Vacciniavirus vectors，and Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley and Son出版(1998)，第16章。具体地，在本发明的实施方式中，使用pGEM-T Easy(Promega，目录号A1360)或pGEM-T(Promega，目录号A3600)载体系统插入外源基因。
痘苗病毒可选自由Western Reserve(WR)、纽约痘苗病毒(NYVAC)、Wyeth(纽约市卫生局；NYCBOH)、LC16m8、利斯特、哥本哈根、天坛、USSR、塔什干(TashKent)、埃文斯(Evans)、国际卫生部-J(International Health Division-J，IHD-J)、国际卫生部-怀特(International Health Division-White，IHD-W)及其变体，但不限于此。具体地，痘苗病毒可以是WR、利斯特或IHD-W痘苗病毒，并且可以为GenBank序列：AY243312.1、DQ121394.1或AIX98951.1。在本发明的实施方式中，痘苗病毒可以是IHD-W。
本文使用的术语“V”或“病毒V”是指VGF即痘苗生长因子缺失并且病毒由于VGF基因的缺失而不表达VGF基因的重组痘苗病毒。
此外，本文使用的术语“Vi”或“病毒Vi”是指痘苗生长因子的表达失活并且病毒不表达VGF基因的重组痘苗病毒。痘苗生长因子的表达可以通过将外源基因插入VGF基因来抑制。
另外，本文使用的术语“T”或“病毒T”是指胸苷激酶(TK)基因缺失并且病毒由于TK基因的缺失而不表达TK基因的重组痘苗病毒。
此外，本文使用的术语“Ti”或“病毒Ti”是指胸苷激酶的表达失活并且病毒不表达TK基因的重组痘苗病毒。胸苷激酶的表达可以通过将外源基因插入TK基因来抑制。
另外，本文使用的术语“K”或“病毒K”是指K3L基因缺失并且病毒由于K3L基因的缺失而不表达K3L基因的重组痘苗病毒。
另外，本文使用的术语“Ki”或“病毒Ki”是指K3L基因的表达失活并且病毒不表达K3L基因的重组痘苗病毒。K3L蛋白的表达可以通过将外源基因插入K3L基因来抑制。
另外，本文使用的术语“VT”或“病毒VT”是指VGF和TK基因缺失的重组痘苗病毒。此外，本文使用的术语“ViTi”或“病毒ViTi”是指痘苗生长因子和胸苷激酶的表达失活的重组痘苗病毒。使痘苗生长因子和胸苷激酶表达失活的方法如上所述。
另外，本文使用的术语“VTK”或“病毒VTK”是指缺失VGF、TK和K3L基因的重组痘苗病毒。此外，本文使用的术语“ViTiKi”或“病毒ViTiKi”是指重组痘苗病毒，其中痘苗病毒生长因子，胸苷激酶和K3L蛋白的表达失活。使痘苗生长因子，胸苷激酶和K3L蛋白表达失活的方法如上所述。
另外，本文使用的术语“ViTK”或“病毒ViTK”是指痘苗生长因子的表达失活且TK和K3L基因缺失的重组痘苗病毒。另外，本文使用的术语“VTiK”或“病毒VTiK”是指胸苷激酶的表达失活且VGF和K3L基因缺失的重组痘苗病毒。另外，本文使用的术语“VTKi”或“病毒VTKi”是指K3L蛋白的表达失活且VGF和TK基因缺失的重组痘苗病毒。
另外，本发明的一个方面提供含有作为活性成分的重组痘苗病毒的用于预防或治疗癌症的药物组合物。
在此，重组痘苗病毒可以是如上所述的VGF、TK和K3L基因表达被抑制的病毒。VGF、TK和K3L基因如上所述。
作为重组痘苗病毒的实例，可提及以下内容。WR痘苗病毒的变体可以是WR-VTK、WR-ViTiKi、WR-ViTK、WR-VTiK或WR-VTKi。另外，NYVAC痘苗病毒的变体可以是NYVAC-VTK、NYVAC-ViTiKi、NYVAC-ViTK、NYVAC-VTiK或NYVAC-VTKi。此外，Wyeth痘苗病毒的变体可以是Wyeth-VTK、Wyeth-ViTiKi、Wyeth-ViTK、Wyeth-VTiK或Wyeth-VTKi。此外，LC16m8痘苗病毒的变体可以是LC16m8-VTK、LC16m8-ViTiKi、LC16m8-ViTK、LC16m8-VTiK或LC16m8-VTKi。此外，利斯特痘苗病毒的变体可以是利斯特-VTK、利斯特-ViTiKi、利斯特-ViTK、利斯特-VTiK或利斯特-VTKi。此外，哥本哈根痘苗病毒的变体可以是哥本哈根-VTK、哥本哈根-ViTiKi、哥本哈根-ViTK、哥本哈根-VTiK或哥本哈根-VTKi。此外，天坛痘苗病毒的变体可以是天坛-VTK、天坛-ViTiKi、天坛-ViTK、天坛-VTiK或天坛-VTKi。此外，USSR痘苗病毒的变体可以是USSR-VTK、USSR-ViTiKi、USSR-ViTK、USSR-VTiK或USSR-VTKi。此外，塔什干痘苗病毒的变体可以是塔什干-VTK、塔什干-ViTiKi、塔什干-ViTK、塔什干-VTiK或塔什干-VTKi。此外，埃文斯痘苗病毒的变体可以是埃文斯-VTK、埃文斯-ViTiKi、埃文斯-ViTK、埃文斯-VTiK或埃文斯-VTKi。此外，IHD-J痘苗病毒的变体可以是IHD-J-VTK、IHD-J-ViTiKi、IHD-J-ViTK、IHD-J-VTiK或IHD-J-VTKi。此外，IHD-W痘苗病毒的变体可以是IHD-W-VTK、IHD-W-ViTiKi、IHD-W-ViTK、IHD-W-VTiK或IHD-W-VTKi。
根据一种实施方式，确认了缺失VGF、TK和K3L基因的重组痘苗病毒具有针对各种癌细胞的杀伤能力(图4A和4B)。另外，通过用重组IHD-W-VTK、IHD-W-ViTK、IHD-W-VTiK和IHD-W-VTKi痘苗病毒处理结肠直肠癌细胞系来进行癌细胞杀伤能力的比较。结果，确认所有痘苗病毒都表现出优异的杀伤能力。因此，确认无论基因是否缺失或失活，VTK基因表达被抑制的所有痘苗病毒都具有抗癌活性(图5)。此外，在用重组IHD-WK、IHD-W-VT、IHD-W-VTK、WR-K、WR-ViTi、和WR-ViTiKi痘苗病毒处理正常细胞和癌细胞的情况下，确认了与仅K3L基因表达被抑制的重组IHD-W-K或WR-K痘苗病毒或VGF和TK基因表达同时被抑制的重组IHD-W-VT或WR-ViTi痘苗病毒相比，VGF、TK和K3L基因表达同时被抑制的重组IHD-W-VTK或WR-ViTiKi痘苗病毒表现出相对于正常细胞来说相对优越的对癌细胞的杀伤能力(图6)。
另外，将重组IHD-W-VT和IHD-W-VTK痘苗病毒和重组WR-ViTi和WR-ViTiKi痘苗病毒给药至肿瘤小鼠模型。结果，确认了所有病毒均抑制癌症生长(图7)。
另外，确认了给药重组IHD-W-VTK或WR-ViTiKi痘苗病毒的肿瘤小鼠模型表现出比给药重组IHD-W-VT或WR-ViTi痘苗病毒的肿瘤小鼠模型的体重减轻更少和死亡率更低(图8和图9)。另外，确认了给药重组IHD-W-VTK痘苗病毒的小鼠比给药重组IHD-W-VT痘苗病毒的小鼠在尾部区域表现出更低的炎症反应(图10)。
因此，本发明的含有K3L、TK和VGF基因表达受到抑制的作为活性成分的重组痘苗病毒的用于预防或治疗癌症的药物组合物可以有效地用于预防或治疗癌症。
如本文使用的术语“癌症”可以是实体癌或血癌。在此，实体瘤可选自肺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、甲状腺癌、乳腺癌、脑癌、头颈癌、纤维肉瘤、食道癌、皮肤癌、胸腺癌、胃癌、结肠癌、肝癌、卵巢癌、子宫癌、膀胱癌、直肠癌、胆囊癌、胆道癌、胰腺癌及其组合。根据本发明的实施方式，癌症可以是肺癌、肝癌、前列腺癌、头颈癌、纤维肉瘤、脑癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌或结肠直肠癌。另外，血癌可选自淋巴瘤、急性白血病、多发性骨髓瘤及其组合。
本发明的药物组合物还可含有一种或多种药学上可接受的添加剂，所述药学上可接受的添加剂选自赋形剂、润滑剂、润湿剂、甜味剂、芳香剂和防腐剂。
本发明的组合物可以根据常规方法来配制。本发明的组合物可以采用本领域已知的方法配制，以便提供活性成分的快速、持续或延迟释放，特别是在给药至哺乳动物后。根据该配方，可以将本发明的组合物适当地给药至个体。这种给药可以是肠胃外给药，其实例可包括癌组织内、皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、动脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。肠胃外给药的制备物形式可以是可注射制备物。
在本发明的另一方面，提供一种预防或治疗癌症的方法，包括将重组痘苗病毒给药至个体的步骤。
个体可以是哺乳动物，特别是人。本领域技术人员可以根据患者的年龄、性别、体重、疾病症状的严重程度和给药途径适当地给药本发明的组合物。给药可以是一天一次或一天数次。
本发明的重组痘苗病毒的优选剂量根据个体的状况和体重、疾病的严重程度、药物形式、给药途径和周期而变化，并且可以由本领域技术人员适当选择。具体而言，该剂量可以使得患者接受1×105至1×1018，优选1×105、2×105、5×105、1×106、2×106、5×106、1×107、2×107、5×107、1×108、2×108、5×108、1×109、2×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011、5×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1017或更多的病毒颗粒、具有感染性的病毒单位(TCID50)或空斑形成单位(pfu)，其中可以包括各个值和其间的范围。此外，病毒的剂量可以是0.1ml、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml或更多，并且可以包括所有值和其间的范围。
在下文中，将参考以下实施例详细描述本发明。然而，以下实施例旨在说明本发明，并且本发明不限于此。
I.产生重组痘苗病毒
本发明人构建了胸苷激酶(TK)、痘苗生长因子(VGF)和K3L基因缺失或其表达失活的重组痘苗病毒载体。使用这些载体，产生上述基因表达被抑制的重组痘苗病毒，并对其作为抗癌物质的性质进行比较。
实施例1.产生重组WR痘苗病毒
实施例1.1构建VGF、TK和K3L基因失活或缺失的重组WR痘苗病毒载体
实施例1.1.1构建VGF基因表达失活的重组WR痘苗病毒载体
通过PCR扩增WR痘苗病毒(ATCC，目录号VR-1354)基因组DNA中侧接在VGF基因两侧的基因，并将扩增的基因分别插入pGEM-T Easy，构建pGEM-T Easy-VGF-L(WR)和pGEM-TEasy-VGF-R(WR)。表3中示出了用于扩增侧接在VGF基因两侧的同源碱基序列的引物的信息。
[表3]
使用表达受p11启动子调控的LacZ作为筛选在VGF基因的位置上发生重组的病毒的标记。通过PCR扩增WR gDNA中的p11启动子位点，并通过PCR扩增pAAV-LacZ(Stratagene，目录号200471-52)中的LacZ基因。然后，将获得物分别插入pGEM-T Easy和pGEM-T中，以分别构建pGEM-T Easy-p11和pGEM-T-LacZ。表3中示出了关于用于扩增p11启动子和LacZ的引物的信息。
为了构建VGF基因功能部分缺失的穿梭质粒，用PvuII和PstI来处理pGEM-TEasy-VGF-L(WR)，并与用PvuII和PstI处理pSP72而获得的载体连接以构建pSP72-VGF-L(WR)。另外，用EcoRV和BamHI处理pGEM-T Easy-VGF-L-VGF-R(WR)，并与用EcoRV和BamHI处理如上构建的pSP72-VGF-L(WR)而获得的载体连接，以得到pSP72-VGF-L-VGF-R(WR)。为了导入LacZ表达盒，用SalI和NheI处理pGEM-T Easy-p11，并与用SaiI和NheI处理pSP72-VGF-L-VGF-R(WR)而获得的载体连接，以构建pSP72-VGF-L-p11-VGF-R(WR)。用EcoRI和PacI处理所构建的pSP72-VGF-L-p11-VGF-R(WR)，然后用EcoRI和PacI切割如上构建的pGEM-T-LacZ。将获得物连接以完成作为VGF穿梭质粒的pSP72-VGF-L-p11-LacZ-VGF-R(WR)(下文称为“WRVGF(i)穿梭质粒”)。
实施例1.1.2构建TK基因表达失活的重组WR痘苗病毒载体
为了得到WR痘苗病毒基因组DNA中侧接在TK基因两侧的基因，通过PCR扩增WR的gDNA，然后将侧接在TK基因的左侧和右侧并且彼此同源的碱基序列片段插入pGEM-TEasy中，以构建pGEM-T Easy-TK-L(WR)和pGEM-T Easy-TK-R(WR)。表4中示出了用于扩增TK基因两侧的同源碱基序列的引物的信息。
[表4]
使用表达受pSE/L启动子调控的EGFP和表达受p7.5启动子调控的Gpt作为筛选在TK基因的位置上发生重组的病毒的标记。使用WR gDNA作为模板通过PCR来扩增p7.5启动子位点，并且还通过PCR来扩增pEGFP-N3(Clontech，目录号6080-1)中的EGFP基因和DH5α(Takara，目录号9057)中的Gpt基因。然后，将获得物分别插入pGEM-T Easy中，分别构建pGEM-T Easy-p7.5、pGEM-T Easy-EGFP和pGEM-T Easy-Gpt。此外，通过引物退火来构建pSE/L启动子和TF。实表4中示出了验中使用的引物序列。
用BamHI和PstI对pGEM-T Easy-p7.5和退火的pSE/L启动子分别处理，并连接以构建pGEM-T Easy-pSE/L-p7.5。用BglII和XhoI对构建的pGEM-T Easy-pSE/L-p7.5和pGEM-TEasy-EGFP分别处理，然后连接以构建pGEM-T Easy-pSE/L-p7.5。
为了构建TK基因功能部分缺失的穿梭质粒，用EcoRI和BamHI处理pSP72，用EcoRI和BamHI处理pSP72-TK-R(WR)。然后，连接获得物以构建pSP72-TK-R(WR)。用XhoI和PstI处理所构建的pSP72-TK-R(WR)，并与用SalI和PstI处理而获得的pSEM-T Easy-TK-L连接，以构建pSP72-TK-L-TK-R(WR)。为了导入EGFP表达盒，用EcoRI和PstI对所构建的pSP72-TK-L-TK-R(WR)和pGEM-T Easy-EGFP-pSE/L-p7.5分别处理，并连接以构建pSP72-TK-L-EGFP-pSE/L-p7.5-TK-R(WR)。
另外，用PstI和NotI对所构建的pSP72-TK-L-EGFP-pSE/L-p7.5-TK-R(WR)和退火的TF寡聚体分别处理，并连接以构建pSP72-TK-L-TF-EGFP-pSE/L-p7.5-TK-R(WR)。为了导入Gpt表达盒，用EcoRI和SpeI对所构建的pSP72-TK-L-TF-EGFP-pSE/L-p7.5-TK-R(WR)和pGEM-TEasy-Gpt分别处理，并连接以最终构建作为TK穿梭质粒的pSP72-TK-L-TF-EGFP-pSE/L-p7.5-Gpt-TK-R(WR)(下文称为“WR TK(i)穿梭质粒”)。
实施例1.1.3构建K3L基因缺失的重组WR痘苗病毒载体
通过PCR扩增WR痘苗病毒基因组DNA中侧接在K3L基因两侧的基因。在次，表5中示出了用于扩增侧接在K3L基因两侧的同源碱基序列的引物的信息。将扩增的基因分别插入pGEM-T中，以构建pGEM-T-K3L-L(WR)和pGEM-T-K3L-R(WR)。
[表5]
为了构建K3L基因缺失的穿梭质粒，将表5中所示的TF引物退火，用EcoRI和EcoRV处理，并与用EcoRI和EcoRV处理pSP72而获得的载体连接，以构建pSP72-TF。另外，用EcoRI和BamHI处理pDsRed2(Clontech，目录号632404)，并与用EcoRI和BamHI处理pSP72-TF而获得的载体连接，以构建pSP72-DsRed-TF。如上构建的pGEM-T-K3L-R(WR)用EcoRV和BamHI处理，并与通过用EcoRV和BamHI处理pSP72-DsRed-TF而获得的载体连接，以构建pSP72-DsRed-TF-K3L-R(WR)。接下来，用XhoI和HindIII处理如上构建的pGEM-T-K3L-L(WR)，并与用XhoI和HindIII处理pSP72-DsRed-TF-K3L-R(WR)而获得的载体连接，以构建pSP72-K3L-L-DsRed-TF-K3L-R(WR)。最后，使用WR gDNA作为模板通过PCR扩增p7.5启动子，然后插入pGEM-T Easy中，以构建pGEM-T Easy-p7.5。表5中示出了关于PCR扩增中使用的引物的信息。用HindIII和BamHI处理pGEM-T Easy-p7.5，并与用HindIII和BamHI处理pSP72-K3L-L-DsRed-TF-K3L-R(WR)而获得的载体连接，以构建pSP72-K3L-L-p7.5-DsRed-TF-K3L-R(WR)(下文称为“WR K3L穿梭质粒”)。
实施例1.1.4构建K3L基因表达失活的重组WR痘苗病毒载体
通过PCR扩增WR痘苗病毒基因组DNA中侧接在K3L基因左侧的基因以及K3L基因的一部分。在此，进行扩增，K3L基因的起始密码子紧接K3L-L序列之后，表6中示出了用于扩增K3L基因的左侧的同源序列的引物。在此，获得扩增的并且包含K3L基因的除起始密码子以外的起始密码子之后的部分的K3L-L-K3Li(WR)片段，然后与pGEM-T Easy载体连接，以构建pGEM-T Easy-K3L-L-K3Li(WR)。
[表6]
| 名称 | 序列(5’→3’) | SEQ ID NO |
| K3L-Li正向 | TGTACGTATATTTAGATGTTTTCAGCT | SEQ ID NO：31 |
| K3L-Li反向 | ATAAGCTTCTTGCATTTTGTTATTCGT | SEQ ID NO：32 |
| K3L-Ri正向 | CGCAGATAAAAACATATCCTTGTTAAC | SEQ ID NO：33 |
| K3L-Ri反向 | GTTAACAAGGATATGTTTTTATCTGCG | SEQ ID NO：34 |
用SnaBI和HindIII处埋如实施例1.1.3中所构建的WR K3L穿梭质粒和pGEM-TEasy-K3L-L-K3Li(WR)，并连接以构建pSP72-K3L-L-K3Li-p7.5-DsRed--TF-K3L-R(WR)。为了将K3L的起始密码子导入构建的pSP72-K3L-L-K3Li-p7.5-DsRed--TF-K3L-R(WR)中，使用如表6所示的引物进行点突变，使得最终构建了pSP72-K3L-L-K3Li-p7.5-DsRed--TF-K3LATG-K3L-R(WR)(下文称为“WR K3L(i)穿梭质粒”)。
实施例1.2产生VGF、TK和K3L基因缺失或失活的重组WR痘苗病毒
实施例1.2.1产生K3L基因缺失的WR痘苗病毒
为了得到重组病毒，在6孔板中以3×105个细胞/孔的条件和含有2％胎牛血清的MEM培养基的状态制备HeLa(ATCC，目录号CCL-2)细胞。然后，使用ietPRIME(Polyplus，目录号114-07)用2μg如实施例1.1.3构建的WR K3L穿梭质粒来转染HeLa细胞，同时用0.05MOI的WR野生型痘苗病毒处理。孵育4小时后，培养基用含有5％胎牛血清的MEM培养基来替换，然后将细胞进一步培养48小时。最后，用500μl培养基收集感染的细胞，然后通过重复冻融三次来裂解细胞。细胞裂解物被称为粗病毒。使用产生的粗制病毒并将该粗制病毒进行6次噬斑分离，以得到纯净分离的重组WR痘苗病毒K。
实施例1.2.2产生VGF和TK基因表达失活的重组WR痘苗病毒
首先，除了使用WR VGF(i)穿梭质粒，以与实施例1.2.1相同的条件和方法获得VGF基因表达失活的重组WR痘苗病毒Vi。此后，除了使用WR TK(i)穿梭质粒和重组WR痘苗病毒Vi，以与上述相同的方法获得VGF和TK基因表达失活的重组WR痘苗病毒ViTi。
实施例1.2.3产生VGF、TK和K3L基因表达失活的重组WR痘苗病毒
首先，除了使用WR K3L(i)穿梭质粒和重组WR痘苗病毒ViTi，以与实施例1.2.1相同的条件和方法获得VGF、TK和K3L基因表达失活的重组WR疫苗病毒ViTiKi。
实施例2.产生重组IHD-W痘苗病毒
实施例2.1构建VGF、TK和K3L基因缺失的重组IHD-W痘苗病毒载体
实施例2.1.1构建VGF基因缺失的重组IHD-W痘苗病毒载体
通过PCR扩增在IHD-W痘苗病毒(ATCC，目录号VR-1441)基因组DNA中侧接在VGF基因两侧的基因。在此，表7中示出了用于扩增侧接VGF基因两侧的同源碱基序列的引物的信息。以这种方式，获得VGF-L(IHD-W)和VGF-R(IHD-W)片段，然后与pGEM-T Easy载体连接，以构建pGEM-T Easy-VGF-L(IHD-W)或pGEM-T Easy-VGF-R(IHD-W)。
[表7]
用EcoRI和BamHI处理上述pGEM-T Easy-VGF-R(IHD-W)，用EcoRI和BglII处理Psp72。然后，连接获得物以构建pSP72-VGF-R(IHD-W)。用HindIII和BamHI对所构建的pSP72-VGF-R(IHD-W)和pGEM-T Easy-VGF-L(IHD-W)分别处理，并连接以构建pSP72-VGF-L-VGF-R(IHD-W)。
接下来，为了将p11启动子和LacZ基因导入pSP72-VGF-L-VGF-R(IHD-W)，实施例1.1.1的WR VGF穿梭质粒中的p11-LacZ表达盒和pSP72-VGF-L-VGF-R(IHD-W)用NheI和PacI处理，并连接以构建pSP72-VGF-L-p11-LacZ-VGF-R(IHD-W)(以下称为“IHD-WVGF穿梭质粒”)。
实施例2.1.2构建TK基因缺失的重组IHD-W痘苗病毒载体
为了得到IHD-W痘苗病毒基因组DNA中侧接TK基因两侧的基因，进行PCR，结果获得了TK-L(IHD-W)和TK-R(IHD-W)片段。此处，表8中示出了使用的引物。用EcoRI和BglII对得到的TK-R(IHD-W)片段和pSP72载体分别处理，并连接以构建pSP72-TK-R(IHD-W)。另外，用PstI和BamHI对pSP72-TK-R(IHD-W)和TK-L(IHD-W)片段分别处理，并连接以构建pSP72-TK-L-TK-R(IHD-W)。
用EcoRI和NotI对所构建的pSP72-TK-L-TK-R(IHD-W)载体和如实施例1.1.2中构建的WR TK穿梭质粒分别处理，并连接以最终构建pSP72-TK-L-TF-EGFP-pSE/L-p7.5-Gpt-TK-R(IHD-W)(以下称为“IHD-W TK穿梭质粒”)。
[表8]
实施例2.1.3构建K3L基因缺失的重组IHD-W痘苗病毒载体
通过PCR扩增IHD-W痘苗病毒基因组DNA中侧接在K3L基因两侧的基因，并分别插入pGEM-T Easy中，以构建pGEM-T Easy-K3L-L(IHD-W)和pGEM-T Easy-K3L-R(IHD-W)。在此，表9示出了使用的引物。
为了在K3L穿梭质粒内构建基因表达盒，使用如实施例1.1.3中构建的WR K3L穿梭质粒作为模板通过PCR来扩增p7.5-DsRed基因盒，然后插入pGEM-T Easy中，以构建pGEM-TEasy-p7.5-DsRed。表9中示出了用于扩增p7.5启动子和DsRed基因的引物序列。
[表9]
用HindIII和EcoRV对构建的pGEM-T Easy-p7.5-DsRed和pSP72载体分别处理，然后连接以完成pSP72-p7.5-DsRed。另外，用EcoRV和BglII处理构建的pSP72-p7.5-DsRed，用EcoRV和BamHI处理如上构建的pGEM-T Easy-K3L-R(IHD-W)。然后，连接获得物以构建pSP72-p7.5-DsRed-K3L-R(IHD-W)。用XhoI和HindIII处理构建的pSP72-p7.5-DsRed-K3L-R(IHD-W)，用SalI和HindIII处理pGEM-T Easy-K3L-L(IHD-W)。然后，连接获得物以最终构建pSP72-K3L-L-p7.5-DsRed-K3L-R(IHD-W)(下文称为“IHD-W K3L穿梭质粒”)。
实施例2.1.4构建VGF基因表达失活的重组IHD-W痘苗病毒载体
通过PCR扩增IHD-W痘苗病毒的基因组DNA中侧接在VGF基因两侧的基因。在此，进行扩增，VGF基因的起始密码子紧接在VGF-L序列之后，并且VGF基因的其他序列置于VGF-R序列之前。表10中示出了用于扩增侧接在VGF基因两侧的同源序列的引物的信息。以这种方式，获得VGF-L-VGFATG(IHD-W)和VGFi-VGF-R(IHD-W)片段，然后进行InFusion克隆将该片段克隆到IHD-W VGF穿梭质粒中。
[表10]
用NheI和HindIII处理IHD-W VGF穿梭质粒，开将扩增的VGF-L-VGFATG(IHD-W)片段InFusion克隆到IHD-W VGF穿梭质粒中，以构建pSP72-VGF-L-VGFATG-p11-LacZ-VGF-R(IHD-W)。用PacI和BglII处理构建的pSP72-VGF-L-VGFATG-p11-LacZ-VGF-R(IHD-W)，并将扩增的VGFi-VGF-R(IHD-W)片段InFusion克隆到pSP72-VGF-L-VGFATG-p11-LacZ-VGF-R(IHD-W)中，以构建pSP72-VGF-L-VGFATG-p11-LacZ-VGFi-VGF-R(IHD-W)。
接下来，为了将VGF的起始密码子后的终止密码子导入pSP72-VGF-L-VGFATG-p11-LacZ-VGF-Ri(IHD-W)中，使用如表10所示的引物进行点突变，以构建pSP72-VGF-L-VGFATGTAA-p11-LacZ-VGFi-VGF-R(IHD-W)(以下称为“IHD-W VGF(i)穿梭质粒”)。
实施例2.1.5构建TK基因表达失活的重组IHD-W痘苗病毒载体
为了从IHD-W痘苗病毒基因组DNA和IHD-W TK穿梭质粒获取侧接在TK基因两侧的基因和TK基因，进行PCR，使用的引物在表11中示出。在此，进行扩增，TK基因的起始密码子紧接着TK-L序列之后，并且TK基因的其他序列置于TK-R序列之前。以这种方式，从IHD-W TK穿梭质粒获得TK-L-TKATG-TF-EGFP-pSE/L-p7.5-Gpt(IHD-W)片段，从IHD-W痘苗基因组DNA获得TK-TK-R(IHD-W)片段。然后，进行InFusion克隆将获得物克隆到IHD-WTK穿梭质粒中。
[表11]
用EagI处理IHD-W TK穿梭质粒，并将扩增的TKi-TK-R(IHD-W)片段InFusion克隆到IHD-W TK穿梭质粒中，以构建pSP72-TK-L-TKi-TK-R(IHD-W)。构建的pSP72-TK-L-TKi-TK-R(IHD-W)用NotI和SalI处理，将扩增的TK-L-TKATG-TF-EGFP-pSE/L-p7.5-Gpt(IHD-W)片段InFusion克隆到pSP72-TK-L-TKi-TK-R(IHD-W)中，构建pSP72-TK-L-TKATG-TF-EGFP-pSE/L-p7.5-Gpt-TKi-TK-R(IHD-W)(以下简称“IHD-W TK(i)穿梭质粒”)。
实施例2.1.6构建K3L基因表达失活的重组IHD-W痘苗病毒载体
通过PCR获得IHD-W痘苗病毒基因组DNA中侧接在K3L基因左侧的基因和K3L基因的一部分。表12中示出了使用的引物。在此，获得扩增的并且包含K3L基因的除起始密码子以外的起始密码子之后的部分的K3L-L-K3Li(WR)片段，然后进行InFusion克隆将K3L-L-K3Li(WR)片段克隆到IHD-W K3L穿梭质粒中。
[表12]
用SnaBI和HindIII处理IHD-W K3L穿梭质粒，并将扩增的K3Li-L-K3L(IHD-W)片段InFusion克隆到IHD-W K3L穿梭质粒中，以构建pSP72-K3L-L-K3Li(IHD-W)。为了将K3L的起始密码子导入构建的pSP72-K3L-L-K3Li-p7.5-DsRed-TF-K3L-R(IHD-W)中，使用如表12中所示的引物进行点突变，最终构建了pSP72-K3L-L-K3Li-p7.5-DsRed-TF-K3LATG-K3L-R(IHD-W)(下文称为“IHD-WK3L(i)穿梭质粒”)。
实施例2.2构建VGF、TK和K3L基因缺失的重组IHD-W痘苗病毒
实施例2.2.1产生K3L基因缺失的重组IHD-W痘苗病毒
使用实施例2.1.3中构建的IHD-WK3L穿梭质粒，通过以下方法产生缺失K3L基因的痘苗病毒。
为了得到重组病毒，在6孔板中以3×105个细胞/孔的条件和含有2％胎牛血清的MEM培养基的状态制备HeLa细胞。然后，使用jetPRIME用2μg的IHD-W K3L穿梭质粒转染HeLa细胞，同时用0.05M0I的IHD-W野生型痘苗病毒处理。孵育4小时后，培养基用含有5％胎牛血清的MEM培养基来替换，然后将细胞进一步培养48小时。最后，用500μl培养基收集感染的细胞，然后通过重复冻融三次来裂解细胞。将细胞裂解物反复冻融三次，以获得粗制病毒。使用粗制病毒并通过常规方法反复进行噬斑分离，从而获得纯净分离的重组IHD-W痘苗病毒K。
实施例2.2.2产生VGF和TK基因缺失的重组IHD-W痘苗病毒
分别使用实施例2.1.1和2.1.2中构建的VGF和TK穿梭质粒来产生VGF和TK基因缺失的痘苗病毒。
首先，除了使用IHD-W VGF穿梭质粒，以与实施例2.2.1相同的条件和方法获得VGF基因缺失的重组IHD-W痘苗病毒V。此后，除了使用IHD-W TK穿梭质粒和重组IHD-W痘苗病毒V，以与上述相同的方法获得其中VGF和TK基因缺失的重组IHD-W痘苗病毒VT。
实施例2.2.3产生VGF、TK和K3L基因缺失的重组IHD-W痘苗病毒
使用实施例2.1.3中构建的K3L穿梭质粒来产生VGF、TK和K3L基因缺失的重组IHD-W痘苗病毒。
除使用IHD-WK3L穿梭质粒和重组IHD-W痘苗病毒VT外，以与实施例2.2.1相同的条件和方法获得VGF、TK和K3L基因缺失的重组IHD-W痘苗病毒VTK。
实施例2.2.4产生VGF基因表达失活且TK和K3L基因缺失的重组IHD-W痘苗病毒
分别使用如实施例2.1.4、2.1.2和2.1.3中构建的VGF(i)、TK和K3L穿梭质粒来产生VGF基因表达失活且TK和K3L基因缺失的重组IHD-W痘苗病毒。
首先，除了使用IHD-WTK穿梭质粒，以与实施例2.2.1相同的条件和方法获得TK基因缺失的重组IHD-W痘苗病毒T。然后，除了使用IHD-W K3L穿梭质粒和重组IHD-W痘苗病毒T，以与上述相同的方法获得TK和K3L基因缺失的重组IHD-W痘苗病毒TK。
另外，除了使用IHD-W VGF(i)穿梭质粒和重组IHD-W痘苗病毒TK，以与上述相同的方法获得VGF基因表达失活且TK和K3L基因缺失的重组IHD-W痘苗病毒ViTK。
实施例2.2.5生产TK基因表达失活且VGF和K3L基因缺失的重组IHD-W痘苗病毒
分别使用如实施例2.1.5、2.1.1和2.1.3中构建的TK(i)、VGF和K3L穿梭质粒来产生TK基因表达失活且VGF和K3L基因缺失的重组IHD-W痘苗病毒。
首先，除了使用IHD-W VGF穿梭质粒，以与实施例2.2.1相同的条件和方法获得VGF基因缺失的重组IHD-W痘苗病毒V。此后，除了使用IHD-W K3L穿梭质粒和重组IHD-W痘苗病毒V，以与上述相同的方法获得VGF和K3L基因缺失的重组IHD-W痘苗病毒VK。
另外，除了使用IHD-W TK(i)穿梭质粒和重组IHD-W痘苗病毒VK，以与上述相同的方法获得TK基因表达失活且VGF和K3L基因缺失的重组IHD-W痘苗病毒VTiK。
实施例2.2.6生产K3L基因表达失活且VGF和TK基因缺失的重组IHD-W痘苗病毒
分别使用如实施例2.1.6、2.1.1和实施例2.1.2中构建的K3L(i)、VGF和TK穿梭质粒来产生K3L基因表达失活且VGF和TK基因缺失的重组IHD-W痘苗病毒。
首先，除了使用IHD-W VGF穿梭质粒，以与实施例2.2.1相同的条件和方法获得VGF基因缺失的重组IHD-W痘苗病毒V。此后，除了使用IHD-W TK穿梭质粒和重组IHD-W痘苗病毒V，以与上述相同的方法获得VGF和TK基因缺失的重组IHD-W痘苗病毒VT。
另外，除了使用IHD-W K3L(i)穿梭质粒和重组IHD-W痘苗病毒VT外，以与上述相同的方法获得K3L基因表达失活且VGF和TK基因缺失的重组IHD-W痘苗病毒VTKi。
实施例3.产生重组利斯特痘苗病毒
实施例3.1重组利斯特痘苗病毒载体的构建，其中VGF，TK和K3L基因缺失
实施例3.1.1K3L基因缺失的重组利斯特痘苗病毒载体的构建
通过PCR扩增在利斯特痘苗病毒(ATCC，VR-1549)的基因组DNA中侧接在K3L基因两侧的基因。在此，表13中示出了用于扩增侧接在K3L基因两侧的同源碱基序列的引物的信息。以这种方式，获得K3L-L(利斯特)和K3L-R(利斯特)片段，然后使用在IHD-W K3L穿梭质粒的构建过程中产生的pSP72-p7.5-DsRed进行K3L-L(利斯特)和K3L-R(利斯特)片段的InFusion克隆。
[表13]
用EcoRV和BglII处理pSP72-p7.5-DsRed，并将扩增的K3L-R(利斯特)片段InFusion克隆到pSP72-p7.5-DsRed中，以构建pSP72-p7.5-DsRed-K3L-R(利斯特)。用XhoI和HindIII处理构建的pSP72-p7.5-DsRed-K3L-R(利斯特)，并将扩增的K3L-L(利斯特)片段InFusion克隆入pSP72-p7.5-DsRed-K3L-R(利斯特)中，以构建作为K3L穿梭质粒的pSP72-K3L-L-p7.5-DsRed-K3L-R(利斯特)(以下称为利斯特K3L穿梭质粒)。
实施例3.2产生VGF、TK和K3L基因缺失的重组利斯特痘苗病毒的生产
实施例3.2.1产生VGF和TK基因缺失的重组利斯特痘苗病毒
为了得到重组病毒，在6孔板中以3×105个细胞/孔的条件和含有2％胎牛血清的MEM培养基的状态制备HeLa细胞。然后，使用jetPRIME用2μg如实施例2.1.1中所构建的IHDVGF穿梭质粒转染HeLa细胞，同时用0.05MOI的利斯特野生型痘苗病毒处理该HeLa细胞。孵育4小时后，培养基用含有5％胎牛血清的MEM培养基来替换，然后将细胞进一步培养48小时。最后，用500μl培养基收集感染的细胞，然后通过重复冻融三次来裂解细胞。细胞裂解物称为粗制病毒。使用产生的粗制病毒并将该粗制病毒进行6次噬斑分离，从而得到纯净分离的重组利斯特痘苗病毒V.
除了使用重组利斯特痘苗病毒V和如实施例2.1.2中构建的IHD-W TK穿梭质粒，以与上述相同的条件和方法得到VGF和TK基因缺失的重组利斯特痘苗病毒VT。
实施例3.2.2产生VGF、TK和K3L基因缺失的重组利斯特痘苗病毒
为了得到重组病毒，除了使用利斯特K3L穿梭质粒和重组利斯特痘苗病毒VT，以与实施例3.2.1相同的条件和方法获得VGF、TK和K3L基因缺失的重组利斯特痘苗病毒TK。
II.确认重组痘苗病毒的体外肿瘤杀伤能力
实验例1.确认VGF、TK和K3L基因缺失的重组痘苗病毒的癌细胞杀伤能力
进行CCK-8分析以确认如实施例I中产生的重组痘苗病毒VTK是否具有针对各种类型癌细胞的杀伤能力。
为了确认重组病毒在各种人癌细胞系中的细胞杀伤能力，癌细胞系根据表14所示来制备，在37℃和5％CO2的条件下在培养箱中培养，然后等分到96孔板中。
[表14]
在此，进行等分，使得SW620的每孔细胞数为5×104个，A2780、A549、DU145、T-47D和FaDu的每孔细胞数为2×104个，Hep3B和HT-1080的每孔细胞数为1×104个，MIA PaCa-2和U-87MG的每孔细胞数为5×103个。培养24小时后，用重组IHD-W痘苗病毒VTK、重组WR痘苗病毒ViTiKi或重组利斯特痘苗病毒VTK感染细胞系，使得每种病毒达到0.5MOI。在此，使用未用病毒处理的细胞作为对照组。3至5天后，用CCK-8(Dojindo，目录号CK04)溶液使细胞染色，以确认癌细胞系的存活率。结果如图4A和图4B所示。
如图4所示，确认在VGF、TK和K3L基因缺失或其表达失活的情况下，无论何株痘苗病毒，都表现出对各种癌细胞的杀伤能力。
实验例2.确认VGF、TK和K3L基因缺失或其表达失活的重组痘苗病毒的癌细胞杀伤能力
为了确认在重组痘苗病毒中表达被抑制的本发明的基因是否根据抑制其表达的方法而对癌细胞表现出不同的杀伤能力，确认如实施例1.2.9至1.2.12产生的重组IHD-W痘苗病毒VTK、ViTK、VTiK和VTKi导致的结肠直肠癌细胞系SW620的死亡程度。
首先，使用含有2％胎牛血清的RPMI培养基，在37℃和5％CO2的条件下在培养箱中培养人结肠直肠癌细胞系SW620，并等分到96孔板中。在此，将SW620细胞等分为每孔5×104个细胞。孵育24小时后，分别用重组IHD-W痘苗病毒VTK、ViTK、VTiK和VTKi感染细胞系，从而达到0.001、0.01、0.1或1MOI。3天后，用CCK-8溶液使细胞染色以确认ED50。结果如图5所示。
从结果可以看出，VTK基因缺失和其表达被完全抑制的病毒以及由于基因结构破坏而导致VTK基因表达失活的病毒表现出优异的癌细胞杀伤能力而没有统计学上的显著差异。
实验例3.确认VGF、TK和K3L基因缺失的重组痘苗病毒的癌细胞选择性杀伤能力
确认与VGF和TK两种基因的表达同时被抑制的重组痘苗病毒或K3L一种基因的表达被抑制的重组痘苗病毒相比，痘苗病毒在细胞中增殖所需的VGF、TK和K3L三种基因的表达被同时抑制的重组痘苗病毒对癌细胞的杀伤能力比对正常细胞的杀伤能力是否选择性增强。
首先，在37℃和5％CO2的条件下在培养箱中孵育作为正常人细胞系的NHBE(Lonza，CC-2540)和作为人结肠直肠癌细胞系的SW620，对于NHBE使用含有BEGMSingleQuot Kit Suppl.&Growth Factors(Lonza，CC-4175)的BEBM Basal培养基(Lonza，CC-2540)，对于SW620使用含有10％胎牛血清的RPMI培养基，并将上述细胞等分到96孔板中。在此，将NHBE和SW620细胞分别等分，从而每孔为5×103个和5×104个。孵育24小时后，分别用重组痘苗病毒IHD-WK、VT、VTK或WR K、ViTi、ViTiKi感染细胞系，从而达到0.001、0.01、0.1或1MOI。3天后，用CCK-8溶液使细胞染色以得到ED50值。针对癌细胞的ED50除以正常细胞的ED50，然后基于每个病毒组中对应于VTK(IHD-W)或ViTiKi(WR)的值，比较对癌细胞的选择性杀伤能力相对于对正常细胞的选择性杀伤能力。结果如图6所示。
如图6所示，在重组IHD-W痘苗病毒的情况下，可以确认与K3L一种基因表达被抑制的IHD-W K病毒相比，IHD-W VT或VTK病毒显示出对癌细胞的杀伤能力比对正常细胞的杀伤能力优异。此外，可以确认IHD-W VTK病毒相对于IHD-W VT病毒表现出优异的癌细胞选择性杀伤能力。在重组WR痘苗病毒的情况下，可以确认，与WRViTi相比，三种基因表达被抑制的WR ViTiKi的杀伤能力是优异的。在此，由于K3L一种基因表达被抑制的WRK对正常细胞和癌细胞的杀伤能力非常低，所以不能获得WR K的ED50。
总之，可以确认，与K3L基因或VGF和TK基因表达被抑制的重组痘苗病毒相比，VGF、TK和K3L三种基因的表达被抑制的重组痘苗病毒表现出优异的癌细胞选择性杀伤能力。
III.确认重组痘苗病毒的体内抗癌作用
实验例4.在肿瘤动物模型中确认VGF、TK和K3L基因表达被抑制的重组痘苗病毒的抗癌作用
在小鼠模型中确认重组IHD-W痘苗病毒VT和VTK，或实施例I中产生的重组WR痘苗病毒ViTi和ViTiKi的抗肿瘤作用。
首先，通过在含有10％胎牛血清的RPMI培养基中培养，制备作为结肠直肠癌细胞系的SW620细胞系。在37℃和5％CO2的条件下在培养箱中培养的细胞占培养皿的70％至80％的情况下，制备用于癌细胞接种的细胞。将制备的各种癌细胞在4℃下以1,500rpm离心5分钟，以除去所有上清液，并通过向其中添加赋形剂(RPMI培养基)来制备细胞。将如此制备的5×106个细胞皮下注射到裸鼠(nu/nu BALB/c小鼠；Charles River Japan(Yokohama))的右胁腹中以制备结肠直肠癌小鼠模型。一周后，在肿瘤生长至约70mm3至100mm3的大小的情况下，将制备的小鼠模型分组，每组6只小鼠将用PBS、IHD-W VT、IHD-WVTK、WR ViTi和WR ViTiKi处理，然后在5×106TCID50下将病毒一次给药到肿瘤中。给药病毒后确认癌细胞大小的结果在图7中示出。
如图7所示，与作为对照组的PBS(Welgene，目录号LB001-02)处理组相比，重组IHD-W或WR痘苗病毒处理组中癌细胞的生长受到抑制。然而，确认重组IHD-W痘苗病毒和WR痘苗病毒之间的抗癌作用没有显著差异。
实验例5.确认VGF、TK和K3L基因表达被抑制的重组痘苗病毒的安全性
为了评价实施例I中产生的IHD-W和WR株的重组痘苗病毒VT(ViTi)和VTK(ViTiKi)的安全性，确认了接受病毒的小鼠的体重变化、死亡率和炎症反应，如图8至10所示。
如图8所示，在给药重组IHD-W痘苗病毒后第49天，VT给药组显示出25％的体重减轻率，而VTK给药组显示出约5％的体重减轻率。另外，在给药重组WR痘苗病毒后第44天，ViTi处理组中的一些个体显示出45％的体重减轻率，而在ViTiKi处理组中个体没有显示出体重减轻率。另外，如图9所示，在给药重组痘苗病毒后第49天，对于IHD-W和WR株，VT(ViTi)给药组显示死亡率为34％，而在VTK(ViTiKi)给药组中所有个体存活。
另外，如图10所示，可以确认，在给药IHD-W株VT后存活的小鼠比接受IHD-W株VTK的小鼠在尾部区域显示出更大量的炎症反应。
从以上结果可以看出，与重组痘苗病毒中VGF和TK两种基因表达被抑制的情况相比，重组痘苗病毒中VGF、TK和K3L三种基因表达被抑制的情况在体内安全性方面是显著优越的。
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<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VGF-L forward primer (WR)
<400> 1
cgcagctgtg ttatcgattg atagtggtgt cct 33
<210> 2
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VGF-L reverse primer (WR)
<400> 2
ctgcagcgct agcaccgcat aatctgatag ctggaata 38
<210> 3
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VGF-R forward primer (WR)
<400> 3
cgggatccgt taattaaact cgacgaacta aactacctat ac 42
<210> 4
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VGF-R reverse primer (WR)
<400> 4
cgatatcgga aaatgtctgt tagtaaataa ccatc 35
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p11 promoter forward primer (WR)
<400> 5
cggctagctc tagaagcgat gctacgctag 30
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p11 promoter reverse primer (WR)
<400> 6
caagcttcgg ttgcctcgag gaattcattt atagcataga a 41
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LacZ forward primer (WR)
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LacZ reverse primer (WR)
<400> 8
aagcttctta attaaggatc ccccctgccc ggttattatt atttttgaca ccagaccaac 60
t 61
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TK-L forward primer (WR)
<400> 9
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TK-L reverse primer (WR)
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ttagctgcag tatgcggccg caacaatgtc tggaaagaac tgtcc 45
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TK-R forward primer (WR)
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TK-R reverse primer (WR)
<400> 12
tcgggatcct cagtctcatg ttctcaccgg 30
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<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> p7.5 promoter forward primer (WR)
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aggaagcttt ccaaacccac ccgcttttta t 31
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<212> DNA
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<220>
<223> EGFP forward primer (WR)
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cgctcgagat ggtgagcaag ggcgagg 27
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<212> DNA
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<220>
<223> EGFP reverse primer (WR)
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tgagatcttt acttgtacag ctcgtccatg 30
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gpt reverse primer (WR)
<400> 18
cggaattcgg cccactcata aatccagtt 29
<210> 19
<211> 121
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSE/L promoter forward primer (WR)
<400> 19
cgagctgcag ataaaaatta attaattacc cgggtaccag gcctagatct gtcgactcga 60
gcttatttat attccaaaaa aaaaaaataa aatttcaatt tttaagcttc gggatccgca 120
a 121
<210> 20
<211> 121
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSE/L promoter reverse primer (WR)
<400> 20
ttgcggatcc cgaagcttaa aaattgaaat tttatttttt ttttttggaa tataaataag 60
ctcgagtcga cagatctagg cctggtaccc gggtaattaa ttaattttta tctgcagctc 120
g 121
<210> 21
<211> 82
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TF forward primer (WR)
<400> 21
atcggcggcc gctttttatc tgcgcggtta accgcctttt tatccatcag gtgatctgtt 60
tttattgtgg agctgcagcg at 82
<210> 22
<211> 82
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TF reverse primer (WR)
<400> 22
atcgctgcag ctccacaata aaaacagatc acctgatgga taaaaaggcg gttaaccgcg 60
cagataaaaa gcggccgccg at 82
<210> 23
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L-L forward primer (WR)
<400> 23
tcggtcgacc atatgtttaa acgacgcatt atctg 35
<210> 24
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L-L reverse primer (WR)
<400> 24
tcgaagcttt ttttataccg aacataaaaa taaggttaat tat 43
<210> 25
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L-R forward primer (WR)
<400> 25
tcggatatcc ttgttaacgg gctcgtaaat tggg 34
<210> 26
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L-R reverse primer (WR)
<400> 26
tcgggatcct gataatacac atatttattt aggaagcg 38
<210> 27
<211> 82
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TF forward primer (WR)
<400> 27
atcggcggcc gctttttatc tgcgcggtta accgcctttt tatccatcag gtgatctgtt 60
tttattgtgg agctgcagcg at 82
<210> 28
<211> 82
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TF reverse primer (WR)
<400> 28
atcgctgcag ctccacaata aaaacagatc acctgatgga taaaaaggcg gttaaccgcg 60
cagataaaaa gcggccgccg at 82
<210> 29
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p7.5 promoter forward primer (WR)
<400> 29
aggaagcttt ccaaacccac ccgcttttta t 31
<210> 30
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p7.5 promoter reverse primer (WR)
<400> 30
cgtggatccc cgtgcaataa attagaatat a 31
<210> 31
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L-Li forward primer (WR)
<400> 31
tgtacgtata tttagatgtt ttcagct 27
<210> 32
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L-Li reverse primer (WR)
<400> 32
ataagcttct tgcattttgt tattcgt 27
<210> 33
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L-Ri forward primer (WR)
<400> 33
cgcagataaa aacatatcct tgttaac 27
<210> 34
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L-Ri reverse primer (WR)
<400> 34
gttaacaagg atatgttttt atctgcg 27
<210> 35
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VGF-L forward primer(IHD-W)
<400> 35
cgaaagcttg taagatgttt agaaaatgga tatttc 36
<210> 36
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VGF-L reverse primer(IHD-W)
<400> 36
ctgggatcct aggctagcgt gtaaataata taaaaataac aatacaatat tg 52
<210> 37
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VGF-R forward primer(IHD-W)
<400> 37
ctggaattcg atttaattaa tttttataaa ttttttttat gagtattttt acaaaaaa 58
<210> 38
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VGF-R reverse primer(IHD-W)
<400> 38
tagggatccc atcgatagta caataacttt tatgaaat 38
<210> 39
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TK-L forward primer (IHD-W)
<400> 39
gatctgcagc cctcttcaag aacccattag 30
<210> 40
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TK-L reverse primer (IHD-W)
<400> 40
tagggatcct aggcggccgc atgacaataa agaattaatt attgttcact t 51
<210> 41
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TK-R forward primer (IHD-W)
<400> 41
catgaattct attatatttt ttatctaaaa aactaaaaat aaacat 46
<210> 42
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TK-R reverse primer(IHD-W)
<400> 42
agatctatcg ctttagtagt aggaaatgtt ttattg 36
<210> 43
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L-L forward primer (IHD-W)
<400> 43
tcggtcgacc atatgtttaa acgacgcatt atctg 35
<210> 44
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L-L reverse primer (IHD-W)
<400> 44
tcgaagcttt ttttataccg aacataaaaa taaggttaat tat 43
<210> 45
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L-R forward primer (IHD-W)
<400> 45
cgcagataaa aatcacttgt taacgggctc gtaa 34
<210> 46
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L-R reverse primer (IHD-W)
<400> 46
aagcgctaac atggattagg aagcgctaac atgg 34
<210> 47
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p7.5-DsRed forward primer (IHD-W)
<400> 47
aggaagcttt ccaaacccac ccgcttttta t 31
<210> 48
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p7.5-DsRed reverse primer (IHD-W)
<400> 48
cggatatctt tttatctgcg cggttaac 28
<210> 49
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VGF-L-VGFatg forward primer (IHD-W)
<400> 49
cgagcagctg aagcttgtaa gatgtttaga aaatggatat ttcc 44
<210> 50
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VGF-L-VGFatg reverse primer (IHD-W)
<400> 50
cgcttctaga gctagccatt tttgatggat tttgtgttta tgct 44
<210> 51
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VGF-Ri forward primer (IHD-W)
<400> 51
caggggggat ccttaattaa tcgatgaaat atctgatgtt gttgtt 46
<210> 52
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VGF-Ri reverse primer (IHD-W)
<400> 52
tatagtcaat agatctggaa aatgtctgtt agtaaataac ca 42
<210> 53
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VGFatgtaa forward primer (IHD-W)
<400> 53
catcgcttct agagctagct tacatttttg atggattttg tgttta 46
<210> 54
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TK-Li forward primer (IHD-W)
<400> 54
tattgtcatg cggccgcatg gtcgacaacg gcggacatat tcagttgat 49
<210> 55
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TK-Li reverse primer (IHD-W)
<400> 55
atcatgatgg cggccgtcaa ttagcatcca tttgatgatc 40
<210> 56
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TK-Ri forward primer (IHD-W)
<400> 56
attctttatt gtcatcatgg cggccgcttt ttatctgcgc ggttaacc 48
<210> 57
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TK-Ri reverse primer (IHD-W)
<400> 57
gtccgccgtt gtcgacggcc cactcataaa tccagtt 37
<210> 58
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L-Li forward primer (IHD-W)
<400> 58
gttagatcag tgtacgtata tttagat 27
<210> 59
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L-Li reverse primer (IHD-W)
<400> 59
tgggtttgga aagcttcttg cattttgtta ttcgt 35
<210> 60
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L-Ri forward primer (IHD-W)
<400> 60
cgcagataaa aacatatcct tgttaac 27
<210> 61
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L-Ri reverse primer (IHD-W)
<400> 61
gttaacaagg atatgttttt atctgcg 27
<210> 62
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VGF-R forward primer (Lister)
<400> 62
cgcagataaa aagatatcct tgttaacggg ctcgtaaatt g 41
<210> 63
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VGF-R reverse primer (Lister)
<400> 63
ggagaccggc agatcttgat aatacacata tttatttagg aagcg 45
<210> 64
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VGF-L forward primer (Lister)
<400> 64
cactatagaa ctcgagcata tgtttaaacg acgcattatc tg 42
<210> 65
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VGF-L reverse primer (Lister)
<400> 65
tgggtttgga aagctttttt tataccgaac ataaaaataa gg 42
<210> 66
<211> 423
<212> DNA
<213> Vaccinia virus
<400> 66
atgtcgatga aatatctgat gttgttgttc gctgctatga taatcagatc attcgccgat 60
agtggtaacg ctatcgaaac gacattgcca gaaattacaa acgctacaac agatattcca 120
gctatcagat tatgcggtcc agagggagat ggatattgtt tacacggtga ctgtatccac 180
gctagagata tcgacggtat gtattgtaga tgctctcatg gttatacagg cattagatgt 240
cagcatgtag tattagtaga ctatcaacgt tcagaaaaac caaacactac aacgtcatat 300
atcccatctc ccggtattgt gcttgtatta gtaggcatta ttattatgtg ttgtctatta 360
tctgtttata ggttcactcg aagaactaat aaactacctc tacaagatat ggttgtgcca 420
taa 423
<210> 67
<211> 140
<212> PRT
<213> Vaccinia virus
<400> 67
Met Ser Met Lys Tyr Leu Met Leu Leu Phe Ala Ala Met Ile Ile Arg
1 5 10 15
Ser Phe Ala Asp Ser Gly Asn Ala Ile Glu Thr Thr Leu Pro Glu Ile
20 25 30
Thr Asn Ala Thr Thr Asp Ile Pro Ala Ile Arg Leu Cys Gly Pro Glu
35 40 45
Gly Asp Gly Tyr Cys Leu His Gly Asp Cys Ile His Ala Arg Asp Ile
50 55 60
Asp Gly Met Tyr Cys Arg Cys Ser His Gly Tyr Thr Gly Ile Arg Cys
65 70 75 80
Gln His Val Val Leu Val Asp Tyr Gln Arg Ser Glu Lys Pro Asn Thr
85 90 95
Thr Thr Ser Tyr Ile Pro Ser Pro Gly Ile Val Leu Val Leu Val Gly
100 105 110
Ile Ile Ile Met Cys Cys Leu Leu Ser Val Tyr Arg Phe Thr Arg Arg
115 120 125
Thr Asn Lys Leu Pro Leu Gln Asp Met Val Val Pro
130 135 140
<210> 68
<211> 534
<212> DNA
<213> Vaccinia virus
<400> 68
atgaacggcg gacatattca gttgataatc ggccccatgt tttcaggtaa aagtacagaa 60
ttaattagac gagttagacg ttatcaaata gctcaatata aatgcgtgac tataaaatat 120
tctaacgata atagatacgg aacgggacta tggacgcatg ataagaataa ttttgaagca 180
ttggaagcaa ctaaactatg tgatgtcttg gaatcaatta cagatttctc cgtgataggt 240
atcgatgaag gacagttctt tccagacatt gttgaattct gtgagcgtat ggcaaacgaa 300
ggaaaaatag ttatagtagc cgcactcgat gggacatttc aacgtaaacc gtttaataat 360
attttgaatc ttattccatt atctgaaatg gtggtaaaac taactgctgt gtgtatgaaa 420
tgctttaagg aggcttcctt ttctaaacga ttgggtgagg aaaccgagat agaaataata 480
ggaggtaatg atatgtatca atcggtgtgt agaaagtgtt acatcgactc ataa 534
<210> 69
<211> 177
<212> PRT
<213> Vaccinia virus
<400> 69
Met Asn Gly Gly His Ile Gln Leu Ile Ile Gly Pro Met Phe Ser Gly
1 5 10 15
Lys Ser Thr Glu Leu Ile Arg Arg Val Arg Arg Tyr Gln Ile Ala Gln
20 25 30
Tyr Lys Cys Val Thr Ile Lys Tyr Ser Asn Asp Asn Arg Tyr Gly Thr
35 40 45
Gly Leu Trp Thr His Asp Lys Asn Asn Phe Glu Ala Leu Glu Ala Thr
50 55 60
Lys Leu Cys Asp Val Leu Glu Ser Ile Thr Asp Phe Ser Val Ile Gly
65 70 75 80
Ile Asp Glu Gly Gln Phe Phe Pro Asp Ile Val Glu Phe Cys Glu Arg
85 90 95
Met Ala Asn Glu Gly Lys Ile Val Ile Val Ala Ala Leu Asp Gly Thr
100 105 110
Phe Gln Arg Lys Pro Phe Asn Asn Ile Leu Asn Leu Ile Pro Leu Ser
115 120 125
Glu Met Val Val Lys Leu Thr Ala Val Cys Met Lys Cys Phe Lys Glu
130 135 140
Ala Ser Phe Ser Lys Arg Leu Gly Glu Glu Thr Glu Ile Glu Ile Ile
145 150 155 160
Gly Gly Asn Asp Met Tyr Gln Ser Val Cys Arg Lys Cys Tyr Ile Asp
165 170 175
Ser
<210> 70
<211> 267
<212> DNA
<213> Vaccinia virus
<400> 70
ttattgatgt ctacacatcc ttttgtaatt gacatctata tatccttttg tataatcaac 60
tctaatcact ttaactttta cagttttccc taccagttta tccctatatt caacatatct 120
atccatatgc atcttaacac tctctgccaa gatagcttca gagtgaggat agtcaaaaag 180
ataaatatat agagcataat ccttctcgta tactctgccc tttattacat cgcccgcatt 240
gggcaacgaa taacaaaatg caagcat 267
<210> 71
<211> 88
<212> PRT
<213> Vaccinia virus
<400> 71
Met Leu Ala Phe Cys Tyr Ser Leu Pro Asn Ala Gly Asp Val Ile Lys
1 5 10 15
Gly Arg Val Tyr Glu Lys Asp Tyr Ala Leu Tyr Ile Tyr Leu Phe Asp
20 25 30
Tyr Pro His Ser Glu Ala Ile Leu Ala Glu Ser Val Lys Met His Met
35 40 45
Asp Arg Tyr Val Glu Tyr Arg Asp Lys Leu Val Gly Lys Thr Val Lys
50 55 60
Val Lys Val Ile Arg Val Asp Tyr Thr Lys Gly Tyr Ile Asp Val Asn
65 70 75 80
Tyr Lys Arg Met Cys Arg His Gln
85
Claims (13)
1.一种重组痘苗病毒，其中基因的表达被抑制，其中所述基因是K3L基因、TK基因和VGF基因的组合。
2.根据权利要求1所述的重组痘苗病毒，其特征在于，所述基因的表达通过所述基因的部分或完全缺失或将外源基因插入所述基因来抑制。
3.根据权利要求1所述的重组痘苗病毒，其特征在于，所述VGF基因是由SEQ ID NO:66的碱基序列组成的多核苷酸。
4.根据权利要求1所述的重组痘苗病毒，其特征在于，所述TK基因是由SEQ ID NO:68的碱基序列组成的多核苷酸。
5.根据权利要求1所述的重组痘苗病毒，其特征在于，所述K3L基因是由SEQ ID NO:70的碱基序列组成的多核苷酸。
6.根据权利要求1所述的重组痘苗病毒，其特征在于，所述痘苗病毒选自WesternReserve(WR)、纽约痘苗病毒(NYVAC)、Wyeth(纽约市卫生局)、LC16m8、利斯特、哥本哈根、天坛、USSR、塔什干、埃文斯、国际卫生部-J(IHD-J)、国际卫生部-怀特(IHD-W)及其变体中的任一种。
7.根据权利要求1所述的重组痘苗病毒，其特征在于，所述痘苗病毒是IHD-W。
8.一种预防或治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含作为活性成分的重组痘苗病毒，其中所述重组痘苗病毒是其中基因的表达被抑制的重组痘苗病毒，其中所述基因是K3L基因、TK基因和VGF基因的组合。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述癌症是实体癌或血癌。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述实体癌是选自肺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、甲状腺癌、乳腺癌、脑癌、头颈癌、食道癌、皮肤癌、胸腺癌、胃癌、结肠癌、肝癌、卵巢癌、子宫癌、膀胱癌、直肠癌、胆囊癌、胆道癌、胰腺癌及其组合中的任一种。
11.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述血癌是选自淋巴瘤、急性白血病、多发性骨髓瘤及其组合中的任一种。
12.重组痘苗病毒在制备用于预防或治疗癌症的药物中的用途，其中所述重组痘苗病毒是其中基因的表达被抑制的重组痘苗病毒，其中所述基因是K3L基因、TK基因和VGF基因的组合。
13.根据权利要求12所述的用途，其特征在于，所述癌症选自肺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、甲状腺癌、乳腺癌、脑癌、头颈癌、食道癌、皮肤癌、胸腺癌、胃癌、结肠癌、肝癌、卵巢癌、子宫癌、膀胱癌、直肠癌、胆囊癌、胆道癌、胰腺癌及其组合中的任一种。
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