ES2232574T3 - Poxvirus con especialidad de infeccion dirigida. - Google Patents

Abstract

Partícula poxviral IMV que presenta una especificidad de infección dirigida hacia unas células diana en la que dicha partícula infecta preferentemente dichas células diana y en la que dicha especificidad se confiere mediante por lo menos una mitad ligando heteróloga localizada en la superficie de dicha partícula poxviral IMV y que es capaz de unirse a una molécula anti-ligando localizada en la superficie de dichas células diana.

Description

Poxvirus con especificidad de infección dirigida.

La presente invención se refiere a una partícula poxviral que presenta una especificidad de infección dirigida conferida por una mitad ligando heteróloga presente en la superficie de dicha partícula poxviral y que es capaz de reconocer y unirse específicamente a una molécula anti-ligando localizada en la superficie de células diana. La presente invención se refiere además a un vector que comprende una secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido quimérico incluyendo tal mitad ligando heteróloga y todo o parte de un polipéptido poxviral natural de superficie. La presente invención se refiere adicionalmente a unas composiciones que comprenden dicha partícula poxviral o dicho vector así como a su utilización con fines terapéuticos y profilácticos. La invención resulta de mucho interés para las aplicaciones en terapia génica, en particular en la prevención o el tratamiento del cáncer en mamíferos.

La terapia génica se puede definir como la transferencia de material genético a una célula o un organismo. La posibilidad de tratamiento de trastornos en humanos mediante la terapia génica ha cambiado en pocos años de una fase de consideraciones teóricas a la de aplicaciones clínicas. El primer protocolo aplicado a un hombre se inició en USA en septiembre de 1990 en un paciente que padecía deficiencia de adenina desaminasa (ADA). A este primer y estimulante experimento le han seguido numerosas nuevas aplicaciones y actualmente se continúa con prometedores ensayos clínicos basados en terapia génica (ver por ejemplo los ensayos clínicos presentados en http://cnetdb.nci.nih.gov/trialsrch.shtml o http://www.wiley.co.uk/genetherapy/clinical/).

Una terapia génica exitosa depende principalmente del suministro eficaz de un gen terapéutico de interés para hacer posible su expresión en el interior de las células de un organismo vivo. Los genes terapéuticos se pueden transferir a las células utilizando una gran variedad de vectores dando como resultado o bien una expresión transitoria (transfección) o una transformación permanente del genoma huésped. Durante la última década se han desarrollado un gran número de vectores virales, así como no virales, para la transferencia génica (para revisión ver por ejemplo Robbins et al., 1998, Tibtech 16, 35-40 y Rolland, 1998, Therapeutic Drug Carrier Systems 15, 143-198).

Los vectores virales más utilizados son los que derivan de los retrovirus y los adenovirus (para revisión ver Miller, 1997, Human Gene Therapy 8, 803-815). Sin embargo, otros vectores virales, tales como los vectores derivados del virus Sindbis o los vectores derivados de un poxvirus, emergen como candidatos prometedores para la transferencia génica in vivo.

Los poxvirus son un grupo de virus complejos con envuelta que se distinguen principalmente por su morfología inusual, su genoma de ADN de cadena larga y su sitio de replicación citoplasmático. Se ha trazado el mapa y se ha secuenciado el genoma de algunos miembros de los poxvirus, incluyendo la cepa del virus de vacuna Copenhague (VV) (Goebel et al., 1990, Virol. 179, 247-266 y 517-563; Johnson et al., 1993, Virol.196, 381-401) y del virus de la cepa de la vacuna Ankara modificada (MVA) (Antoine et al., 1998, Virol. 244, 365-396). El VV presenta un genoma de ADN de doble cadena de aproximadamente 192 kb que codifica para aproximadamente 200 proteínas de las que aproximadamente 100 están implicadas en la unión de los virus. El MVA es una cepa de del virus de la vacuna altamente atenuado generado por más de 500 pases seriados de la cepa del virus Ankara de vacuna (CVA) en los fibroblastos de embrión del pollo (Mayr et al., 1975, Infection 3, 6-16). El virus MVA se depositó ante la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) bajo en número de depósito 1-721. La determinación de la secuencia completa del genoma del MVA y la comparación con el genoma de Copenhague VV permite la identificación exacta de las alteraciones que tienen lugar en el genoma viral y la definición de siete deleciones (I a VII) y numerosas mutaciones que dan lugar a ORFs fragmentados (Marco de lectura abierto) (Antoine et al., 1998, Virology 244, 365-396).

El patrón natural para la absorción intracelular de los virus con envuelta implica una serie de etapas que incluyen la unión de un polipéptido viral expuesto en la superficie del virus a un receptor celular y un mecanismo de fusión entre las membranas virales y las membranas celulares que dan como resultado la liberación del genoma viral en el interior del citoplasma de la célula infectada.

Sin embargo, en el caso especial de los poxvirus, el análisis del patrón exacto de liberación es complicado debido a la existencia de dos formas morfológicamente distintas de virus infeccioso, denominadas virus intracelular maduro (IMV) y virus con envuelta extracelular (EEV). La forma IMV se caracteriza, entre otras particularidades, por la presencia de una envuelta monolípidíca alrededor del núcleo viral (Figura 1) y que se localiza principalmente en el citoplasma de las células infectadas aunque puede darse una liberación extracelular después de la lísis de las células infectadas. Se han identificado muchos de los polipéptidos naturales expuestos en la superficie de la envuelta lipídica del IMV como por ejemplo las proteínas p14 kDa y p21 kDa, codificadas respectivamente por el gen A27L (Rodriguez et al., 1985, J. Virol. 56, 482-488; Rodríguez y Estaban, 1987, J. Virol 61, 3550-3554) y el gen A17L, así como las proteínas codificadas por L1R, A14L, D8L, A9L (Yeh et al., 2000, J. Virol. 74, 9701-9711), E10R (Senkevich et al., 2000, Virol. 5, 244-252) y los genes H3L. Comparado con el IMV, la forma del EEV presenta una envuelta de membrana lipídica externa adicional (doble capa lipídica) adquirida del depósito de cisternas del complejo trans-Golgi. Corresponde a la forma viral liberada al exterior de las células infectadas. La envuelta de la membrana de superficie del EEV presenta aproximadamente 10 proteínas que no se encuentran en la superficie de la de IMV, como por ejemplo los productos de genes codificados B5R, A34R y hemaglutinina (HA) (Figura 1). La coexistencia de dichas formas IMV y EEV se ha descrito para la mayoría de las cepas utilizadas en vacuna (por ejemplo Copenhague y las variedades de MVA) así como para otros poxvirus tales como el poxvirus del ave de corral (Boulanger et al., 2000, J. Gen. Virol. 81, 675-687).

Las diferentes morfologías de IMV y de EEV sugieren la existencia de diferentes mecanismos para la penetración de dichas formas poxvirales en las células huésped. Recientemente se ha propuesto que el patrón de liberación del EEV está mediado por endocitosis y el posterior patrón de fusión de membrana pH-dependiente, mientras que la forma IMV se fusiona directamente con la membrana celular de forma pH-independiente (Vanderplasschen et al., 1998, J. Gen. Virol. 79, 877-887). Recientemente se han identificado dos receptores celulares que median en la unión del IMV y la absorción intracelular: el heparano sulfato, que es un lado de la cadena de glucosaminoglicano (GAG) de los proteoglicanos de la superficie celular (Chung et al., 1998, J. Virol. 72, 1577-1585) y otro componente del GAG, la condroitina sulfato (Hsiao et al., 1999, J. Virol. 73, 8750-8761). Ambos receptores interactúan con un polipéptido de superficie del IMV distinto, respectivamente los productos génicos p14 (enlazado con heparano sulfato) y el D8L (enlazado con condroitina sulfato) sugiriendo diferentes tipos de interacciones virus-GAG.

La proteína 14-kDa (p14) del virus de vacuna juega un papel importante en la propiedad infecciosa del virus. La proteína p14 está anclada en la envuelta lipídica del IMV por asociación con la proteína 21-kDa (p21). La proteína p14 está implicada en el patrón de liberación de IMV, probablemente por su participación en la unión con el heparano sulfato de la superficie de la célula (Chung et al., 1998, J. Virol. 72, 1577-1585). Además, se ha atribuido a dicha proteína p14 el proceso de fusión. Además, de forma general, se ha demostrado que los polipéptidos de la superficie del IMV están estrechamente relacionados con la propiedad infecciosa del IMV y que su mutación o deleción perjudica extremadamente la diseminación del IMV (Dallo et al., 1987, Virology 159, 423-432). La proteína p14 es asimismo necesaria para la formación del EEV y la difusión del virus en el exterior de las células infectadas. Recientemente, se han trazado los mapas de los dominios funcionales requeridos para el enlace al receptor de heparano sulfato de la superficie de la célula, para la fusión de las membranas virus/célula y para la liberación del virus en los 43 primeros aminoácidos N-terminales de la p14 (Vazquez y Esteban, 1999, J. Virol. 73, 9098-9109). Además, Vazquez et al. (1998, J. Virol. 72, 10126-10137) han demostrado que el dominio C-terminal de la p14 está implicado en la unión con la proteína p21.

Se han descrito en la bibliografía muchos vectores poxvirales recombinantes que expresan varios genes terapéuticos. En particular, se han propuesto para la terapia del cáncer los genes VV que expresan citoquinas (Peplinski et al., 1995, Ann. Surg. Oncol. 2, 151-159; Withman et al., 1994, Surgery 116, 183-188), el gen inmunoestimulador B7.1 (Hodge et al., 1994, Cancer Res. 54, 5552-5555) el gen ICAM-1 (Uzendoski et al., 1997, Hum. Gene Ther. 8, 851-860) o genes suicidas tales como el gen de timidina quinasa del virus del herpes simplex-1 (TK HSV-1) (Puhlmann et al., 1999, Hum. Gen. Ther. 10, 649-657) y el gen de citosina desaminasa (Gnant et al., 1999, Cancer Res. 59, 3396-3403). Además, se ha demostrado su actividad anti-tumoral en modelos animales. También se han propuesto vectores basados en la cepa del MVA (Sutter y Moss, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10847-10851; Carroll y Moss, 1995, Biotechniques 19, 352-355; Antoine et al., 1996, Gene 177, 43-46; Schleiflinger et al., 1996, Arch. Virol. 141, 663-669).

Sin embargo, el virus de la vacuna exhibe un rango muy amplio de huéspedes y puede infectar la mayoría de células de los vertebrados. De nuevo, se debe hacer constar que las formas IMV y EEV difieren con respecto a dicha propiedad de diseminación porque el EEV que presenta en su superficie una variedad más amplia de polipéptidos que en la superficie del IMV, es más propenso que el IMV a diseminarse ampliamente. Aunque, cualquiera que sea la forma considerada, dicha ausencia de selectividad de la infección podría considerarse como una desventaja para aplicaciones especiales en las que es deseable limitar los efectos adversos que podrían resultar de la expresión de los genes transferidos (es decir, genes citotóxicos) en las células que no son diana. En consecuencia, sería interesante modificar el virus para restringir su rango de huésped para dirigir la infección a las poblaciones de células diana.

La modificación del tropismo viral ya se ha conseguido con determinados virus. Por ejemplo, en el documento WO93/09221, el tropismo del virus de la gripe se ha modificado mediante la inhibición del polipéptido de la hemaglutinina viral que normalmente media la unión del virus en la célula receptora mediante un anticuerpo monoclonal y mediante la unión del virus con un anticuerpo capaz de interactuar con el receptor de transferrina expresado en las células diana.

Roux et al. (1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 9079-9083) describe la infección de células humanas con un retrovirus ecotrópico recombinante de ratón utilizando dos anticuerpos biotinilados dirigidos a la envuelta retroviral gp70 y a un antígeno celular del complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC), respectivamente.

El documento WO94/10323 describe vectores de adenovirus dirigidos que presentan en su superficie una fibra proteica modificada mediante la fusión con un anticuerpo de cadena simple para dirigir la infección adenoviral a las células que expresan el antígeno que reconoce el anticuerpo.

Sin embargo, la dirigibilidad controlada de partículas poxvirales se ha visto obstaculizada por la complejidad intrínseca de los poxvirus y la existencia de las dos formas infecciosas distintas. A este aspecto, Galmiche et al., (1997, J. Gen. Virol. 78, 3019-3027) describe la construcción de partículas de EEV dirigidas contra células tumorales. Un anticuerpo de cadena simple dirigido contra el antígeno asociado a tumor ErbB-2 se fusionó a la hemaglutinina viral (HA) para expresarse en la superficie del EEV. El ErbB-2 es un receptor del factor de crecimiento epidermal que está sobre-expresado en las células de adenocarcinoma humanas. Aunque la proteína de fusión está expuesta en la superficie de la partícula EEV y es capaz de unirse a células de adenocarcinoma humanas cultivadas in vitro, los autores no observaron una infección preferencial hacia células que expresaran el ErbB-2 del EEV que presentaba la fusión del anticuerpo-HA. Se presume que la partícula de EEV modificada todavía contiene una(s) proteína(s) sin identificar que permiten la infección de un amplio rango de células.

Por lo tanto, el problema técnico fundamental de la presente invención es el suministro de métodos mejorados y maneras para obtener la direccionalidad de las partículas poxvirales hacia células específicas. Dicho problema técnico se resuelve mediante el suministro de las formas de realización que se definen en la presente memoria.

La presente invención se refiere a una partícula poxviral IMV que presenta una especificidad de infección dirigida hacia células diana en las que dicha partícula infecta preferentemente dichas células diana y en las que dicha especificidad se confiere por al menos una mitad ligando heteróloga que está localizada en la superficie de dicha partícula poxviral IMV y que es capaz de unir una molécula anti-ligando localizada en la superficie de dichas células diana.

El término "una especificidad de infección dirigida (de una partícula poxviral IMV) hacia células diana" tal y como se utiliza en la presente memoria se refiere a una especificidad de infección controlada, en la que una partícula poxviral IMV de la presente invención se idea para manifestar un nuevo o un tropismo mejorado hacia dichas células diana, en comparación con una partícula de poxvirus IMV no modificada relacionada (es decir salvaje). Como resultado, la partícula poxviral IMV de la presente invención muestra una propensión a infectar dichas células diana al contrario que su partícula de poxvirus IMV no modificada afín, lo que significa que la partícula poxviral IMV de la presente invención infecta más eficientemente o más rápidamente sus células diana (mostrando en su superficie el anti-ligando reconocido por la mitad ligando presente en la superficie de la partícula poxviral IMV de la invención) que las células que no son diana (que no presentan en su superficie tal anti-ligando), mientras que una partícula poxviral IMV no modificada afín infectará dichas células diana con una eficacia similar o inferior comparada con células que no son diana. Dicha propiedad infecciosa preferida se puede determinar fácilmente comparando la propiedad de infección de la partícula poxviral IMV de la presente invención con la propiedad de infección de la partícula poxviral IMV no modificada afín hacia las células diana y las células que no son diana, tanto in vitro (por ejemplo células cultivadas) o in vivo (por ejemplo en modelos animales) y bajo las mismas condiciones experimentales. Las condiciones experimentales in vitro para analizar las propiedades de infección se dan a conocer en el Ejemplo 5 de la presente especificación, sin embargo, otros métodos son bien conocidos por los expertos en las técnicas y son por lo tanto utilizables en el contexto de la invención. Por ejemplo, cuando una mezcla de partículas poxvirales IMV según la invención y de partículas poxvirales IMV no modificadas afines se utilizan para infectar células diana en cultivo con un tiempo de infección relativamente corto (inferior a 30 minutos y especialmente de 1 a 10 minutos), una mayoría (por lo menos el 60%, preferentemente, por lo menos el 70% y más preferentemente, por lo menos el 80%) de las partículas poxvirales IMV según la invención comprendidas en la mezcla original son capaces de infectar dichas células diana, mientras que una minoría (como máximo el 40%, preferentemente, como máximo el 30% y más preferentemente, como máximo el 20%) de las partículas poxvirales IMV no modificadas afines comprendidas en la mezcla original son capaces de infectar dichas células diana. Esto da como resultado un enriquecimiento de la cantidad de partículas poxvirales IMV según la invención presente en la mezcla en cada ciclo de infección. Dicho enriquecimiento se puede evaluar mediante la determinación de los títulos virales de las respectivas partículas poxvirales IMV mediante las técnicas habituales.

El término "mitad ligando" tal y como se utiliza en la presente invención define cualquier mitad capaz de reconocer y unirse por lo menos a una molécula anti-ligando que se expresa o que está expuesta en la superficie de una célula diana. Proporciona la unión a la célula diana y la especificidad de infección de la partícula poxviral IMV de la invención. Resulta evidente a través de la lectura de la memoria que dicha molécula anti-ligando es distinta al receptor celular natural que media en la absorción del poxvirus IMV (por ejemplo, heparano sulfato o condroítina sulfato). Según la invención, la mitad ligando se localiza en la superficie de la partícula poxviral IMV reivindicada. Dependiendo del método de enlace utilizado (ver posteriormente), dicha mitad ligando puede ser una mitad añadida y expuesta en la superficie de la partícula viral (por ejemplo mediante enlace químico) o una mitad fusionada en la estructura de envuelta de la partícula (por ejemplo mediante enlace genético). "Heterólogo" significa que dicha mitad ligando no se encuentra en la superficie de una partícula poxviral IMV de tipo salvaje. Por extensión, "homólogo" se refiere a los polipéptidos o mitades naturales que se encuentran en la superficie de una partícula poxviral IMV de tipo salvaje. La molécula anti-ligando localizada en la superficie de una célula diana es preferentemente una a la que no se enlace la partícula poxviral IMV de tipo salvaje o una a la que se enlaza la partícula poxviral IMV de tipo salvaje pero con una especificidad inferior que a la partícula poxviral IMV de la presente invención. La especificidad de unión entre un ligando y una molécula anti-ligando dada se puede determinar según los métodos de la técnica, incluyendo ELISA, inmunofluorescencia y tecnología basada en la resonancia de plasma en la superficie (Biacore AB).

En general, las mitades ligando que se pueden utilizar en el contexto de la presente invención se han descrito ampliamente en la literatura; es una mitad capaz de conferir a la partícula poxviral IMV modificada de la invención la habilidad de enlazarse con una molécula anti-ligando dada o con un tipo de moléculas anti-ligando localizadas en la superficie de por lo menos una célula diana. Las moléculas anti-ligando adecuadas incluyen sin limitación los polipéptidos seleccionadas de entre el grupo que consta de marcadores específicos de células, marcadores específicos de tejidos, receptores celulares, antígenos virales, epítopos antigénicos y marcadores asociados a tumores. Las moléculas anti-ligando pueden consistir además en azúcar, lípido, glicolípido, anticuerpo, etc. .... Según la invención, una mitad ligando puede ser por ejemplo un lípido, un glicolípido, una hormona, un azúcar, un polímero (por ejemplo, PEG, polisilina, PEI,.), un polipéptido, un oligonucleótido, una vitamina, un antígeno, una lectina, una mitad polipéptídica que presenta unas propiedades marcadoras tales como por ejemplo JTS1 (documento WO 94/40958), un anticuerpo o sus combinaciones. Un fragmento de la mitad ligando mencionada anteriormente también se puede emplear a condición de que retenga la propiedad direccionalidad de la molécula natural.

Preferentemente, la mitad ligando utilizada en la presente invención es un polipéptido que presenta una longitud mínima de 7 aminoácidos. Es tanto un polipéptido natural como un polipéptido derivado de un polipéptido natural. "Derivado" significa que contiene (i) una o más modificaciones con respecto a la secuencia primaria (por ejemplo, adición, deleción y/o sustitución de uno o más residuos, (ii) análogos de aminoácidos, incluyendo aminoácidos que no se producen de forma natural o (iii) uniones sustituidas así como (vi) otras modificaciones que son conocidas en la técnica. Dicho término engloba polipéptidos variantes y quiméricos que se obtienen mediante la fusión de secuencias de varios orígenes. Además, la mitad ligando puede presentar una estructura lineal o cíclica (por ejemplo flanqueando ambos extremos de un polipéptido ligando mediante residuos de cisteína). Adicionalmente, la mitad ligando que se utiliza en la invención puede incluir modificaciones en su estructura original por causas de sustitución o adición de mitades químicas, por ejemplo glicosilación, alquilación, acetilación, amidación, fosforilación, adición de grupos sulfidrilos y similares). La invención contempla asimismo modificaciones que dejan la mitad ligando detectable. Para dicho propósito, se pueden prever modificaciones con una mitad detectable (es decir, escintigrafica, radioactiva, fluorescente, o teñida y similares). Los marcadores radioactivos adecuadas incluyen pero no son limitativos Tc^{99m}, I^{123} y In^{111}. Dichos marcadores detectables pueden estar unidos a la mitad ligando mediante cualquier técnica convencional y se pueden utilizar con fines diagnósticos (e. g. imágenes de células tumorales).

En una forma de realización preferida, la molécula anti-ligando es un antígeno (por ejemplo, un antígeno específico para una célula, un antígeno específico para una enfermedad, un antígeno expresado específicamente en la superficie de células diana preparadas genéticamente,) y la mitad ligando es un anticuerpo, un fragmento o su unidad mínima reconocible (es decir, un fragmento que todavía presenta una especificidad antigénica) como aquellos descritos con detalle en manuales de inmunología (ver por ejemplo, Immunology, tercera edición 1993, Roitt, Brostoff y Male, ed. Gambli, Mosby). La mitad ligando puede ser un anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos monoclonales que se pueden unir a muchos de dichos antígenos son ya conocidos pero en cualquier caso, con las técnicas actuales relacionadas con la tecnología de los anticuerpos monoclonales, los anticuerpos se pueden preparar para la mayoría de antígenos. La mitad ligando puede ser una parte de un anticuerpo (por ejemplo un fragmento Fab) o un fragmento de un anticuerpo sintético (por ejemplo ScFv).

Los anticuerpos monoclonales adecuados para antígenos seleccionados se pueden elaborar mediante técnicas conocidas, por ejemplo las descritas en "Monoclonal Antibodies: A manual of techniques", H. Zola (CRC Press, 1988) y en "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications", J. G. R. Hurrell (CRC Press, 1982). Los anticuerpos no-humanos preparados adecuadamente se pueden "humanizar" según formas conocidas, por ejemplo mediante la inserción de regiones CDR de anticuerpos de ratón en el marco de los anticuerpos humanos. Además, al estar implicados en el reconocimiento del antígeno los dominios pesado variable (VH) y ligero variable (VL) del anticuerpo, dominios variables de origen roedor se pueden fusionar con dominios constantes de origen humano de modo que el anticuerpo resultante retiene la especificidad antigénica del anticuerpo parental de roedor (Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851-6855).

La especificidad antigénica de los anticuerpos se confiere mediante dominios variables que incluyen moléculas similares a las Fab (Better et al. (1988) Science 240, 1041); moléculas Fv (Skerra et al. (1988) Science 240, 1038); moléculas ScFv en las que los dominios VH y VL correspondientes se pueden enlazar mediante un oligopéptido flexible (Bird et al. (1988) Science 242, 423; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879) y dAbs que comprenden dominios V aislados (Ward et al. (1989) Nature 341, 544). Una revisión general de las técnicas implicadas en la síntesis de fragmentos de anticuerpos que retienen sus sitios de enlace específicos se puede encontrar en Winter & Milstein (1991) Nature 349, 293-299.

Según una forma de realización ventajosa, es mejor que se seleccione la mitad ligando de entre fragmentos de anticuerpo que de entre anticuerpos completos. Se eliminan las funciones efectoras de los anticuerpos completos, tales como las uniones complementarias. Los fragmentos de anticuerpos de ScFv y dAb se pueden expresar como fusiones con otros polipéptidos. Las unidades mínimas de reconocimiento se pueden derivar de la secuencia de una o más de las regiones complementarias determinantes (CDR) del fragmento Fv. Los anticuerpos completos y los fragmentos F(ab')2 son "bivalentes". Por "bivalentes" queremos decir que dichos anticuerpos y fragmentos F(ab')2 presentan dos sitios de combinación de los antígenos. En contraste, los fragmentos de Fab, Fv, ScFv, Dab y las unidades mínimas de reconocimiento son monovalentes y presentan sólo un sitio de combinación de los antígenos.

En otra forma de realización la mitad ligando es por lo menos parte de una mitad específica implicada en la unión del receptor natural de la superficie celular. Por supuesto, dichos receptores naturales (por ejemplo, receptores de hormonas) pueden ser ellos mismos antígenos específicos de células diana y se pueden reconocer mediante mitades ligando que presentan la propiedad de cualquiera de los anticuerpos monoclonales, un ScFv, un dAb o una unidad mínima de reconocimiento.

En una forma de realización preferida, la mitad ligando permite detectar una célula viral infectada y es capaz de reconocer y unirse a un componente viral (por ejemplo, una glicoproteína de la envuelta) o capaz de interferir con la biología del virus (por ejemplo, entrada, replicación.). Por ejemplo, el marcaje de una célula infectada con VIH (Virus de Inmunodeficiencia Humana) se puede realizar con una mitad ligando específica para un epítopo de la envuelta del VIH, tal como la mitad ligando derivada del anticuerpo 2F5 (Buchacher et al., 1992, Vaccines 92, 191-195) que reconoce un epítopo altamente conservado de la glicoproteína de transmembrana gp41 o con una mitad ligando que interfiere en la unión del VIH con su receptor CD4 (por ejemplo, el dominio extracelular de la molécula CD4).

En otra forma de realización preferida, la mitad ligando permite marcar una célula tumoral y es capaz de reconocer y de unirse a una molécula relacionada con el estadio tumoral, tal como un antígeno específico de tumor, una proteína celular expresada diferencialmente o sobreexpresada en células tumorales o un gen producto de un virus asociado a un cáncer.

Ejemplos de antígenos específicos de tumores incluyen pero no se limitan a MUC-1 relacionado con el cáncer de mama (Hareuveni et al., 1990, Eur. J. Biochem 189, 475-486), los productos codificados por los genes mutados BRCA1 y BRCA2 relacionados con el cáncer de mama y el cáncer de ovarios (Miki et al. 1994, Science 226, 66-71; Futreal et al., 1994, Science 226, 120-122; Wooster et al., 1995, Nature 378, 789-792) APC relacionado con el cáncer de colon (Polakis, 1995, Curr. Opin. Genet. Dev. 5, 66-71) antígeno específico de próstata (PSA) relacionado con el cáncer de próstata, (Starney et al., 1987, New England J. Med. 317, 909), antígeno de carcinoma embrionario (CEA) relacionado con cánceres de colon (Schrewe et al., 1990, Mol. Cell. Biol. 10, 2738-2748), tirosinasa relacionada con los melanomas (Vile et al., 1993, Cancer Res. 53, 3860-3864), el receptor para la hormona estimuladora de melanocitos (MSH) que se expresa en un gran número de células de melanoma, ErbB-2 relacionado con cánceres de mama y de páncreas (Harris et al., 1994, Gene Therapy 1, 170-175), y la fetoproteína alfa relacionada con cáncer de hígado (Kanai et al., 1997, Cancer Res. 57, 461-465).

Una mitad ligando preferida utilizada en la presente invención es un fragmento de un anticuerpo capaz de reconocer y unirse al antígeno MUC-1 marcando de este modo las células tumorales MUC-1 positivo. Una mitad ligando más preferida es el fragmento del anticuerpo monoclonal SM3 que reconoce la región repetida del antígeno MUC-1 (Burshell et al., 1987, Cancer Res. 47, 5476-5482; Girling et al., 1989, Int. J. Cancer 43, 1072-1076; Dokurno et al., 1998, J. Mol. Biol., 284, 713-728).

Los ejemplos de proteínas celulares expresadas diferencialmente o sobreexpresadas en células tumorales incluyen pero no se limitan al receptor para interleucina 2 (IL-2) sobreexpresado en algunos tumores limfoides, GRP (Péptido Liberador de la Gastrina) que se sobreexpresa en células de carcinoma de pulmón, tumores de páncreas, próstata y estómago (Michael et al., 1995, Gene Therapy 2, 660-668), el receptor del TNF (Factor de Necrosis de Tumor), receptores del factor de crecimiento epidérmico, receptor Fas, receptor CD40, receptor CD30, receptor CD27, OX-40, integrinas (Brooks et al., 1994, Science 264, 569) y receptores para algunos factores de crecimiento angiogénicos (Hanahan, 1997, Science 277, 48). En base a dichas indicaciones, se sitúa dentro del alcance de los expertos en la materia el definir una mitad ligando adecuada capaz de reconocer y unirse a dichas proteínas. A modo de ilustración, IL-2 es una mitad ligando adecuada para unirse a un receptor IL-2.

Los productos de genes de virus asociados a cánceres adecuados incluyen pero no se limitan a los polipéptido tempranos E6 y E7 del virus del papiloma humano (HPV) así como a los polipéptidos tardíos L1 y L2 (documentos EP nº 0 462 187, US nº 5.744.133 y WO98/04705) que se expresan en cáncer cervical y el antígeno EBNA-1 del virus Epstein-Barr (EBV) asociado a los linfomas de Burkitt (Evans et al., 1997, Gene Therapy 4, 264-267).

En otra forma de realización preferida adicional, la mitad ligando permite marcar moléculas específicas de tejido. Por ejemplo, las mitades ligando adecuadas para marcar células del hígado incluyen pero no se limitan a las derivadas de la ApoB (apolipoproteína) capaz de unirse al receptor LDL, la alfa-2 microglobulina capaz de unirse al receptor de LPR, el ácido alfa-1 glicoprotéico capaz de unirse al receptor de asialogliprotéico y la transferrina capaz de unirse al receptor de transferrina. Una mitad ligando para marcar células endoteliales activadas se puede derivar del antígeno sialil-Lewis-X (capaz de unirse a ELAM-1), del VLA-4 (capaz de unirse al receptor de VCAM-1) o del LFA-1 (capaz de unirse al receptor del ICAM-1). Una mitad ligando derivada del CD34 es útil para marcar las células hematopoiéticas progenitoras a través de la unión con el receptor del CD34. Una mitad ligando derivada del ICAM-1 es más adecuada para marcar linfocitos a través de la unión con el receptor del LFA-1. Finalmente, la marcación de células T ayudadoras puede utilizar una mitad ligando derivada del VIH gp-120 o una clase de antígeno II CMH capaz de unirse con el receptor CD4.

Sería de gran valor para los expertos en la materia que las mitades ligando que son polipéptidos se elaboraran convenientemente utilizando técnicas de recombinación de ADN. La mitad ligando se puede fusionar a una proteína en la superficie de la partícula del virus tal y como se describe posteriormente o que se sinteticen independientemente por ejemplo por síntesis de novo o por expresión del fragmento de ADN adecuado en células eucariotas así como en procariotas y entonces enlazarlo con la partícula del virus tal y como se describe posteriormente. Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican para muchas de las mitades ligando son conocidas, por ejemplo aquellas para hormonas péptídicas, factores de crecimiento, citoquinas y similares y que se pueden encontrar fácilmente por referencia en bases de datos de secuencias nucleotídicas públicamente accesibles tales como el EMBL y el GenBank.

Una vez que se conoce la secuencia nucleotídica resulta obvio para el experto en la materia como elaborar un ADN que codifique para la mitad ligando seleccionada utilizando, por ejemplo, técnicas de síntesis química de ADN o utilizando la reacción en cadena de la polimerasa para amplificar el ADN requerido de ADN genómico o de cADN de tejido específico. Muchos cADN que codifican para hormonas peptídicas, factores de crecimiento, todos o parte de los anticuerpos, citoquinas y similares, de los que todos serán útiles como mitades ligando, están disponibles comercialmente.

Por "células diana", nos referimos a las células que la partícula poxviral IMV modificada de la invención puede infectar preferentemente. Dependiendo de la naturaleza de la mitad ligando y/o de la molécula anti-ligando, las "células diana" pueden designar un único tipo de célula o un grupo de diferentes tipos de células que presentan como característica común en su superficie molécula(s) anti-ligando reconocida por la(s) mitades ligando presentes en las partículas poxvirales IMV de la invención. Para el propósito de la invención, una célula diana consiste en cualquier célula de mamíferos (preferentemente células humanas) que se pueden infectar con una partícula poxviral según la presente invención. La célula puede ser una célula primaria, una célula transformada o una célula tumoral de cualquier origen. Las células diana adecuadas incluyen pero no se limitan a células hematopoiéticas (células madre pluripotenciales, leucocitos, linfocitos, monocitos, macrófagos, células dendríticas y similares), células musculares (satélites, miocitos, mioblastos, células musculares esqueléticas o lisas, células cardíacas), células pulmonares, células traqueales, células hepáticas, células epiteliales, células endoteliales o fibroblastos.

Por "mitad ligando (o alternativamente, molécula anti-ligando) que se localiza en la superficie de la partícula poxviral (o alternativamente, de la célula diana)", queremos decir que dicha mitad ligando (o dicha molécula anti-ligando) es accesible en la superficie de la partícula poxviral IMV (de las células diana) por unión con su molécula anti-ligando específica (o respectivamente, mitad ligando) cuando dicha partícula poxviral entra en contacto con dichas células diana. Esta accesibilidad se puede medir in vitro sin excesivos experimentos utilizando métodos ampliamente descritos en la literatura.

La partícula poxviral IMV de la presente invención se puede obtener de cualquier miembro a partir de la familia poxviridae, en particular virus de vacuna, viruela de canario, viruela de ave, viruela de vaca, viruela de insecto, viruela de mono, viruela de cerdo o viruela de pingüino. Preferentemente, es una partícula de virus de la vacuna Copenhague, Wyeth o de la cepa modificada del virus Ankara (MVA). De forma general, numerosas publicaciones dan a conocer la secuencia y la biología de los poxvirus y de las cepas poxvirales (de la viruela) citadas anteriormente. Además, están disponibles en conocidas colecciones tales como ATCC (viruela de ave ATCC VR-251, viruela de mono ATCC VR-267, viruela de cerdo ATCC VR-363, viruela de canario ATCC VR-111, viruela de vaca ATCC VR-302) o ICTV (Canberra, Australia) (Código del virus de Copenhague 58.1.1.0.001; número de acceso al Genbank M35027).

Tal como se ha indicado previamente, una partícula IMV comprende el núcleo viral incluyendo el genoma viral rodeado por de una envuelta de una monocapa lipídica con polipéptidos virales presentes en su superficie incluyendo los productos de los genes codificados por los genes A27L (proteína p14), L1R, A14L, A17L (proteína p21), D8L, A9L, E10R y H3L.

En una forma de realización ventajosa, el genoma poxviral puede ser defectuoso en por lo menos un gen implicado en la producción de partículas de EEV, y preferentemente, es defectuoso en el gen F13L (que codifica para la proteína p37). Borrego et al. (1999, J. Gen. Virol. 80, 425-432) ha demostrado que la deleción del gen F13L tiene como resultado un defecto grave en el proceso de envoltura de EEV, aunque se producen unos niveles normales IMV. Según esto, mediante la alteración del gen poxviral F13L es posible aumentar la producción IMV. Dicho gen F13L se puede alterar mediante deleción total o parcial, mutación o inserción de cualquier secuencia de la secuencia codificadora o del promotor. Opcionalmente, el genoma poxviral también se puede alterar en por lo menos un gen cuyo producto esté implicado en la interacción con el receptor celular natural que media en la absorción del poxvirus. (por ejemplo heparano sulfato o condroitina sulfato). Dichos métodos de alteración del gen son bien conocidas en la técnica y están ilustradas en Borrego et al., 1999 (supra).

La nomenclatura del gen utilizada en la presente memoria es la de la cepa del virus de la vacuna de Copenhague y se utiliza también para los genes homólogos de otro Pxviridae (por ejemplo MVA) a no ser que se indique de otro modo. Sin embargo, la nomenclatura de los genes es diferente según la cepa de la viruela. Para información, la correspondencia entre los genes de Copenhague y MVA se puede encontrar en la Tabla I de Antoine et al. (1998, Virol. 244, 365-396). Por ejemplo, el gen Copenhague A27L se menciona como 138L en MVA, ambos genes codifican una proteína p14-kDa homóloga que presenta funciones y localización similares en la superficie del IMV.

Según la invención, las partículas poxvirales IMV son enlazan operativamente a una mitad ligando heteróloga que se utiliza en la invención. "Enlazado operativamente" significa que dicha partícula y mitad ligando están en una relación que permite su funcionamiento en su forma deseada (es decir, la mitad ligando promueve la especificidad de infección dirigida de la partícula poxviral IMV hacia la célula deseada). El enlace se puede realizar de diferentes formas que son bien conocidas por los expertos en la materia y que incluye enlace covalente, no covalente o medios genéticos.

El enlace covalente de mitades ligando a la superficie de la partícula poxviral IMV se puede realizar directamente a través de grupos funcionales reactivos o indirectamente mediante un grupo separados u otra mitad activadora. En particular, el enlace se puede realizar con reactivos de entrecruzamiento (i) homobifuncionales o (ii) heterobifuncionales, con (iii) carbodiimidas, (iv) mediante animación reductora o (vi) mediante la activación de carboxilatos (ver por ejemplo Bioconjugate techniques 1996; ed G Hermanson; Academic Press).

Los agentes de entrecruzamiento homobifuncionales incluido el glutaraldehído y el bisimidoéster como el DMS (dimetilo suberimidate) se pueden utilizar para enlazar grupos aminos de la mitad ligando a estructuras lipídicas (e. g. de la envuelta IMV) que contienen diacilaminos.

Se pueden utilizar muchos agentes de entrecruzamiento heterobifuncionales en la presente invención, en particular los que presentan tanto grupos amino reactivos como grupos sulfidrilo reactivos, grupos carbonilo reactivos grupos sulfidrilo reactivos y grupos sulfidrilo reactivos y enlazantes fotoreactivos. Los agentes de entrecruzamiento heterobifuncionales adecuados están descritos en Bioconjugate techniques (1996) 229-285; ed. G Hermanson; Academic Press) y el documento WO99/40214. Los ejemplos de la primera categoría incluyen pero no se limitan a SPDP (N-succinimidil 3-(2-piridilditio) propionato), SMBP (succinimidil 4-(p-maleimidofenil) butirato), SMPT (succinimidiloxicarbonil-\forall-metil-(\forall-2-piridilditio) tolueno, MBS (m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida éster), SIAB (N-succinimidil (4-iodoacetil) aminobenzoato), GMBS (maleimidobutiriloxi) succinimida éster), SIAX (succinimidil-6-iodoacetil amino hexonato), SIAC (succinimidil-4-iodoacetil amino metil), NPIA (p-nitropfenil iodoacetato). La segunda categoría es útil para unir moléculas que contienen carbohidrato (por ejemplo, las glicoproteínas de envuelta, anticuerpos) a grupos sulfidrilo reactivos. Los ejemplos incluyen MPBH (ácido 4-(4-N maleimidofenil) butírico hidracida) y PDPH (4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxil-hidracida) (M_{2}C_{2}H y 3-2-(2-piridilditio) propionil hidracida.) A modo de ejemplo de la tercera categoría, se puede citar ASIB (1-(p-azidosalicilamido)-4-(iodoacetamido) butirato) Otra alternativa incluye los reactivos tiol reactivos descritos en Frisch et al. (Bioconjugate Chem. 7 (1996) 180-186).

El enlace (iii) implica, por ejemplo, grupos aminos de diacilaminas presentes en las estructuras lipídicas que pueden participar en la reacción de carbodiimida con grupos carboxilato de la mitad ligando.

El enlace (iv) se puede realizar, por ejemplo, vía la formación de una imina seguida de una reducción utilizando cianoborohidrato.

El enlace (vi) puede implicar, por ejemplo, un derivado éster NHS de la mitad ligando y los grupos amino de poxvirus para producir unas uniones amida estables.

Otro ejemplo utiliza un enlace maleimida-sulfidrilo que implica un grupo sulfidrilo y un grupo sulfidrilo reactivo. Por ejemplo, SATA (N-succinimidil S-acelitioacetato) se puede utilizar para introducir un grupo sulfidrilo mientras que el sulfo SMCC (sulfosuccinimidil-4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato) se puede utilizar para introducir un grupo maleimida dando lugar a un enlace covalente tioéter.

El enlace covalente también se puede realizar utilizando un polímero tal como polietilenglicol (PEG) o sus derivados. Preferentemente, el polímero presenta un peso molecular medio comprendido entre 200 y 20000 Da. Por ejemplo, se puede utilizar tresil-MPEG para enlazar un grupo amino presente en los residuos de Lys (ver por ejemplo el documento WO99/40214). Otras formas de conjugar dos partes mediante PEG están descritas en la literatura (en Bioconjugate techniques (1996) 606-618; ed G Hermanson; Academic Press y Frisch et al. Bioconjugate Chem. 7 (1996) 180-186).

El enlace no covalente incluye interacciones electroestáticas, por ejemplo entre una mitad ligando catiónica y un poxvirus IMV cargado negativamente. Otra alternativa consiste en utilizar componentes de afinidad tales como la Proteína A, biotina/avidina, anticuerpos, que son capaces de asociar de forma no covalente o por afinidad ambas partes. Por ejemplo, un enlace entre una mitad ligando péptida y una partícula viral IMV puede utilizar anticuerpos biotinilados dirigidos contra el epítopo expuesto en la superficie y anticuerpos marcados con estreptavidina dirigidos contra la mitad ligando péptidica según la técnica descrita por Roux et al. (1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 9079). Los anticuerpos bifuncionales dirigidos contra cada una de las partes de enlace también son adecuados para este propósito.

El enlace genético se destina para enlazar una mitad ligando que es un polipéptido o su fragmento. Ventajosamente, un ácido nucleico que codifica para dicha mitad ligando se fusiona con una secuencia de un ácido nucleico viral que codifica para un polipéptido poxviral homólogo localizado en la superficie de la partícula poxviral IMV no modificada. Sin embargo, la invención además se refiere a un enlace genético en el que un ácido nucleico que codifica para una mitad ligando se fusiona con una secuencia de ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido heterólogo (por ejemplo, un polipéptido anclada a una membrana) que permite localizar dicha mitad ligando en la superficie de la partícula poxviral IMV. Preferentemente, el ácido nucleico que codifica para la mitad ligando se fusiona en regiones del genoma viral que no son esenciales para la integridad del poxvirus.

Según una primera alternativa, el enlace genético tiene como resultado un polipéptido quimérico en el que se elimina por lo menos una porción del polipéptido poxviral homólogo expuesto en la superficie y se reemplaza por la mitad ligando heteróloga que se utiliza en la presente invención. Según una segunda alternativa, el enlace genético tiene como resultado un polipéptido quimérico en el que se incorpora en la superficie del polipéptido poxviral homólogo la mitad ligando polipeptídica heteróloga que se utiliza en la presente invención. La fusión de polipéptidos que resulta del enlace genético se puede realizar en cualquier lugar, en el extremo N-terminal, en el extremo C-terminal o entre dos residuos de aminoácidos del polipéptido viral. Preferentemente el lugar seleccionado para el enlace genético (es decir, el lugar del ácido nucleico viral en el que se inserta la secuencia que codifica para la mitad ligando) no altera el marco de lectura abierto correspondiente.

Debido a que la partícula poxviral de la invención es un IMV, los poliéptidos poxvirales homólogos expuestos en la superficie adecuados para estos enlaces genéticos incluyen pero no se limitan a la expresión de productos de los genes A27L (proteína p14), L1R, A14L, A17L (proteína p21), D8L, A9L, E10R y H3L. Según una forma de realización preferida, la secuencia nucleotídica que codifica para la mitad ligando se fusiona con la secuencia del gen A27L y de modo que dicha mitad ligando se localiza finalmente en el extremo N-terminal de la p14. Preferentemente, dicha mitad ligando que codifica para la secuencia nucleotídica se fusiona inmediatamente en el mismo sentido del codón iniciador del gen A27L.

Según la presente invención, la mitad ligando y la partícula poxviral IMV se pueden seguir modificando para mejorar o estabilizar el enlace. En particular, la mitad ligando puede presentar una mitad separadora en uno de sus extremos para facilitar su accesibilidad hacia las células diana. Además, la partícula poxviral IMV según la invención puede comprender una o más mitades ligando que pueden o no combinarse una con la otra, por ejemplo en una estructura tándem. Por ejemplo, cuando se desea aumentar la especificidad de la partícula poxviral IMV hacia células diana específicas, podría ser ventajoso utilizar una combinación de mitades ligando capaces de reconocer y unirse a dichas células diana.

De acuerdo con los objetivos perseguidos por la presente invención, la mitad ligando puede comprender un péptido señal que facilite su inserción en la envuelta de la partícula poxviral IMV. Aunque se puede prever la utilización de una secuencia hidrofóbica que permita el anclaje de la membrana, es preferible utilizar un péptido señal que permita la translocación del complejo trans Golgi. Dicho péptido se puede aislar o identificar en cualquier proteína presente de forma natural en los compartimentos de Golgi (ver por ejemplo Mochamer y Rose, 1987, J. Cell Biol. 105, 1205-1214; Mochamer, 1993, Curr. Opin. Cell Biol. 5, 606-612; Muesch et al., 1990, Trends Biochem sci 15, 86-88). El péptido señal puede incluir una o varias modificaciones con respecto a la secuencia primaria a condición de que su función no se altere significativamente. Un péptido señal preferido utilizado en la presente invención se deriva de la glicoproteína TGN51 de la red trans-Golgi humana (Kain et al., 1997, J. Biol. Chem. 273, 981-988). Preferentemente, se incorpora por enlace genético en el extremo N-terminal de la mitad ligando. Preferentemente la mitad ligando se une genéticamente a un polipéptido viral.

A pesar de que es posible obtener una partícula poxviral IMV vacía (también llamada partícula seudopoxviral) que manifiesta la propiedad de infección específica descrita anteriormente, según una forma de realización preferida, la partícula poxviral IMV de la invención comprende por lo menos un ácido nucleico de interés, particularmente un ácido nucleico recombinante que incluye por lo menos un gen terapéutico situado bajo el control de los elementos que permiten su expresión en células diana eucariotas. Sin embargo, las partículas poxvirales IMV vacías, o partículas seudopoxvirales, de la invención se pueden utilizar para formar complejos con el ácido nucleico de interés para facilitar su absorción celular dirigida tal y como se describe en los documentos US 5.928.944 y WO 9521259.

El término "ácido nucleico" en el presente invención se utiliza para designar cualquier posible ácido nucleico, en particular tanto ADN como ARN o una forma híbrida, de cadena simple o doble, lineal o circular, natural o sintético, modificado o no (ver documentos US 5525711, US 4711955 o EP-A 302 175 para ejemplos de modificaciones). Puede ser, inter alia, un ADN genómico, un ARN genómico, un cADN, un ARNm, un ARN antisentido, un ARN ribosómico, un ribozima, un ARN de transferencia o un ADN que codifica para dicho ARNs. El ácido nucleico puede estar en forma de un plásmido o un ácido nucleico lineal que contiene por lo menos una secuencia expresable que puede generar un polipéptido, un ribozima, un ARN antisentido u otra molécula de interés sobre la transmisión a una célula. El ácido nucleico también puede ser un oligonucleótido (es decir, un ácido nucleico con un tamaño pequeño inferior a 100 bp) que se transmite a la célula, por ejemplo, por antisentido o funciones del ribosoma. Preferentemente, el ácido nucleico está en forma de un ADN poxviral genómico.

Si el ácido nucleico contiene las informaciones genéticas apropiadas cuando se sitúa en un ambiente adecuado para la expresión del gen, su unidad de transcripción expresará de este modo el producto del gen que codifica. El nivel y la especificidad de la expresión en la célula dependerá de una extensión significativa de la fuerza y el origen del promotor asociado y la presencia y activación de un elemento potenciador asociado. De este modo en una forma de realización preferida, el elemento de control de la transcripción incluye las secuencias del promotor/potenciador tal como el promotor/potenciador CMV. Sin embargo, los expertos en la materia apreciarán que una diversidad de otras secuencias de promotores y/o potenciadores es conocida y que se pueden obtener de cualquier virus, procariótico, por ejemplo bacteriano, o eucariótico, que de forma constitutiva o regulable, son adecuados para la expresión de células eucariotas, y particularmente en células diana. Con más exactitud, dichas informaciones genéticas necesarias para la expresión por parte de células diana comprenden todos los elementos requeridos para la transcripción de dicho ADN a ARNm y, si es necesario, para la traducción del ARNm a polipéptido. Los promotores transcripcionales adecuados para la utilización en varios sistemas de vertebrados se han descrito ampliamente en la literatura. Por ejemplo, promotores adecuados incluyen promotores virales tales como RSV, MPSV, SV40, CMV o 7,5 k, promotor del virus de la vacuna, promotores inducibles, etc. Los promotores preferidos son los que se aislan de poxvirus, por ejemplo 7,5K, H5R, TK, p28, p11 o K1L de virus de vacunas. Alternativamente, se puede utilizar un promotor sintético como los descritos en Chakrabarti et al. (1997, Biotechniques 23, 1094-1097), Hammond et al. (1997, J. Virological Methods 66, 135-138) y Kumar y Boyle (1990, Virology 179, 151-158) así como promotores químicos entre promotores poxvirales tempranos y tardíos.

El ácido nucleico puede además incluir elementos funcionales adicionales, tales como secuencias intrón, secuencias de dirección, secuencias de transporte, señal de secreción, señal de localización nuclear, IRES, secuencias de terminación de transcripción poly A, secuencias principales tripartitas, secuencias implicadas en la replicación o integración. Dichas secuencias se han descrito en la literatura y se pueden obtener fácilmente por los expertos en la materia.

En una forma de realización preferida, el ácido nucleico de interés contiene por lo menos una secuencia de interés que codifica para un producto genético que es una molécula terapéutica (es decir un gen terapéutico). Una "molécula terapéutica" es una molécula que presenta una actividad farmacológica o protectora cuando se administra correctamente a un paciente, especialmente pacientes que padecen una enfermedad o una condición de trastorno o que deberían estar protegidos contra dicha enfermedad o condición. Dicha actividad farmacológica o protectiva es una que se espera esté relacionada con un efecto beneficioso en el transcurso o en un síntoma de dicha enfermedad o en dicha condición de trastorno. Cuando el experto selecciona en el transcurso de la presente invención, un gen que codifica para una molécula terapéutica, generalmente relaciona su elección con los resultados que se han obtenido previamente y que razonablemente se pueden esperar, sin realizar más experimento más que la práctica que se reivindica en la invención, para obtener dicha propiedad farmacológica. Según la invención, la secuencia de interés puede ser homóloga o heteróloga para las células diana en las que se introduce. Ventajosamente dicha secuencia de interés codifica para todo o parte de un polipéptido, especialmente un polipéptido terapéutico o profiláctico que proporciona una propiedad terapéutica o profiláctica. Se entiende que un polipéptido es cualquier producto translacional de un polinucleótido independientemente de su tamaño, y glicosilado o no, e incluye péptidos y proteínas. Polipéptidos terapéuticos incluyen como ejemplo primario aquellos polipéptidos que pueden dar lugar a una compensación en proteínas deficientes o defectuosas en un organismo animal o humano, o aquellos que pueden actuar a través de efectos tóxicos para limitar o eliminar células dañinas del cuerpo. También pueden ser polipéptidos que confieren inmunidad que actúan como antígenos endógenos para provocar una respuesta humoral o celular, o ambas.

Ejemplos de polipéptidos codificados por un gen terapéutico incluyen genes que codifican para un citoquina (interferón alfa, beta o gama, interleucina, en particular IL-2, IL-6, IL-10 o IL-12, un factor de necrosis de tumor (TNF), un factor estimulante de colonias GM-CSF, C-CSF, M-CSF.) un polipéptido inmunoestimulador (B7.1, B7.2 y similares), un factor de coagulación (FVIII, FIX.), un factor de crecimiento (Factor de Transformación de Crecimiento TGF, Factor de Crecimiento de Fibroblasto FGF y similares), un enzima (ureasa, renina, trombina, metaloproteinasa, óxido nítrico sintasa NOS, SOD, catalasa.), un inhibidor de enzimas (alfa1-antitripsina, antitrombina III, inhibidor viral de la proteasa, inhibidor de la actividad del plasminógeno PAI-1), el CFTR (Regulador de la conductancia transmembrana en la fibrosis quística) proteína, insulina, distrofina, un antígeno MHC de la clase I o II, un polipéptido que pueda modular/regular la expresión celular de los genes, un polipéptido capaz de inhibir una infección bacteriana, parasitaria o viral o su desarrollo (polipéptidos antigénicos, epítopos antigénicos, variantes transdominantes que inhiban la acción de una proteína natural mediante competición.), un inductor o inhibidor de la apoptosis (Bax, Bc12, BcIX.), un agente citostático (p21, p16, Rb...), una apolipoproteína (ApoAI, ApoAIV, ApoE...), un inhibidor de la angiogénesis (angioestatina, endoestatina.), un polipéptido angiogénico (de la familia de los Factores de Crecimiento endoteliales Vasculares VEGF, de la familia FGF, de la familia CCN incluyendo CTGF, Cyr61 y Nov), un liberador de oxígeno radical, un polipéptido que presente un efecto antitumoral, un anticuerpo, una toxina, una inmunotoxina y un marcador (beta-galactosidasa, luciferasa.) y otros genes de interés que estén reconocidos en la técnica como útiles para el tratamiento o prevención de una situación clínica.

En vistas al tratamiento de disfunciones hereditarias, se puede utilizar un alelo funcional de un gen defectuoso, por ejemplo un gen que codifique para el factor VIII o IX en el contexto de la hemofilia A o B, distrofina (o minidistrofina) en el contexto de miopatías, insulina en el contexto de la diabetes, CFTR en el contexto de fibrosis quística.

Los genes antitumorales adecuados incluyen pero no se limitan a aquellos que codifican para genes supresores de tumores (por ejemplo Rb, p53, DCC, NF-1, tumor de Wilm, NM23, BRUSH-1, p16, p21, p56, p73 así como su respectivas mutaciones), productos de genes suicidas, anticuerpos, polipéptidos inhibidores de la división celular o de señales de transducción.

En una forma de realización preferida, el gen terapéutico es un gen suicida que codifica para un producto de expresión capaz de transformar una sustancia inactiva (profármaco) en sustancia citotóxica, de este modo potenciar la muerte de la célula. El gen que codifica para el TK HSV-1 constituye el prototipo de la familia de los genes suicidas (Caruso et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7024-7028; Culver et al.,1992, Science 256, 1550-1552). A pesar de que el polipéptido TK no es tan tóxico, cataliza la transformación de análogos nucleósidos (profármaco) tales como el aciclovir o el ganciclovir. Los nucleósidos transformados se incorporan en las cadenas de ADN que están en el proceso de elongación, provoca la interrupción de dicha elongación y de este modo la inhibición de la división celular. Un gran número de combinaciones de genes suicidas/profármacos están disponibles actualmente. Los que se pueden mencionar más específicamente son el citocroma p450 de rata y ciclofosfofamida (Wei et al., 1994, Human Gene Ther. 5, 969-978), Escherichia coli (E. coli) nucleosidasa purina fosforilasa y desoxiribonucleosida 6-metilopurina (Sorscher et al., 1994, Gene Therapy 1, 223-238), E. coli fosforibosilo guanina transferasa y 6-tioxantina (Mzoz et al., 1993, Human Gene Ther. 4, 589-595). Sin embargo, en una forma de realización más preferida, la partícula poxviral de la invención comprende un gen suicida que codifica para un polipéptido que presenta una actividad de citosina desaminasa (CDasa) o una actividad fosforibosila uracilo transferasa (UPRTasa) o ambas actividades CDasa y UPRTasa, que se pueden utilizar con el profármaco 5-fluorocitosina (5-FC). También se puede prever en el contexto de la invención la utilización de una combinación de genes suicidas, por ejemplo polipéptidos codificantes que presentan actividades CDasa y UPRTasa.

Las actividades de la CDasa y la UPRTasa se han demostrado en procariotas y eucariotas inferiores, pero no están presentes en mamíferos. La CDasa está implicada normalmente en el patrón metabólico de la pirimidina por el que la citosina exógena se transforma en uracilo mediante una desaminación hidrolítica, mientras que la UPRTasa transforma el uracilo en UMP. Sin embargo, la CDasa también desamina un análogo de la citosina, 5-FC, de este modo forma 5-fluoracilo (5-FU), que es altamente tóxico cuando se convierte en 5-fluoro-UMP (5-FUMP) por reacción de la UPRTasa.

Los genes adecuados que codifican para la CDasa incluyen pero no se limitan al gen Saccharomyces cerevisiae FCY1 (Erbs et al., 1997, Curr. Genet. 31, 1-6; documento WO93/01281) y el gen E. coli codA ( documento EP 402 108). Los genes adecuados que codifican para la UPRTasa incluyen pero no se limitan a los de la E. coli (gen upp; Anderson et al., 1992, Eur. J. Biochem. 204, 51-56), Lactococcus lactis (Martinussen y Hammer, 1994, J. Bacteriol. 176, 6457-6463), Mycobacterium bovis (Kim et al., 1997, Biochem Mol. Biol. Int 41, 1117-1124), Bacillus subtilis (Martinussen et al. 1995, J. Bacteriol. 177, 271-274) y Saccharomyces cerevisiae (gen FUR-1; Kern et al., 1990, Gen 88, 149-157). Preferentemente, el gen que codifica para la CDasa se deriva del gen FCY1 y el gen que codifica para la UPRTasa se deriva del gen FUR-1.

La presente invención abarca asimismo la utilización de genes suicidas mutados, modificados por adición, deleción y/o sustitución de uno o varios nucleótidos siempre y cuando se preserve la actividad citotóxica del producto del gen. Se ha descrito en la literatura un determinado número de mutantes de CDasa y UPRTasa incluyendo una proteína fusionada que codifica para dos dominios de enzimas que poseen ambas actividades CDasa y UPRTasa (documento WO96/16183) así como un mutante de la UPRTasa codificado por el gen FUR-1 que presenta los primeros 35 residuos delecionados (mutante FCU-1 descrito en el documento WO99/54481).

Tal y como se ha mencionado anteriormente, por genes terapéuticos también se entiende que incluye unas secuencias antisentido y genes que codifican para ribozimas capaces de enlazar y destruir el ARN de genes seleccionados reguladores del crecimiento positivamente activos, tales como oncogenes y protooncogenes (c-myc, c-fos, c-jun, c-myb, c-ras, Kc y JE).

El ácido nucleico incorporado en la partícula poxviral IMV de la presente invención puede comprender uno o más genes terapéuticos. A este respecto, resulta ventajosa la combinación de genes que codifican para un producto de un gen suicida y un gen de citoquino (por ejemplo interferones \alpha, \exists, \gamma, interleucinas, preferentemente seleccionadas de entre IL-2, IL-4, IL-6, IL-10 o IL-12, factores de TNF, GM-CSF, C-CSF, M-CSF.), un gen inmunoestilador (por ejemplo B7.1, B7.2, ICAM) o un gen quimioquino (por ejemplo MIP, RANTES, MCP 1,.) es ventajoso. La expresión del gen diferente se puede controlar mediante un único promotor (cassete policistrónico) o por promotores independientes. Además, se pueden insertar un único sitio o en varios sitio a lo largo del ácido nucleico tanto en la misma dirección como en la opuesta.

En otra forma de realización, la presente invención se refiere además a un vector que comprende por lo menos una secuencia nucleotídica que codifica para una proteína quimérica que comprende (i) por lo menos una mitad ligando heteróloga como se ha descrito previamente, y (ii) todo o parte de un polipéptido viral hamólogo localizado naturalmente en la superficie de la partícula poxviral IMV tal como se ha dado a conocer previamente. Por supuesto, la secuencia nucleotídica se coloca bajo el control de elementos que son necesarios para su expresión. La elección del vector según la invención es amplia y accesible para los expertos en la materia. El vector puede ser un plásmido, o un vector viral derivado de cualquier virus animal, especialmente un adenovirus, un retrovirus, un AAV (virus asociado a adenovirus) o un poxvirus. Según una forma de realización preferida, el vector de la invención es un vector poxviral (es decir, un ADN genómico poxviral, especialmente un ADN genómico de VV o de MVA). El término "parte" tal y como se utiliza en la presente memoria se refiere a un fragmento del polipéptido viral que permite la exposición de la mitad ligando en la superficie de un vector viral. Además, un vector según la presente invención también puede incluir por lo menos una secuencia nucleotídica de interés.

La técnica básica para insertar en un genoma viral las secuencias de interés y los elementos asociados requeridos para la expresión se describen en numerosos documentos accesibles a los expertos en la materia (Piccini et al., 1987, Methods of Enzymology 153, 545-563; los documentos US nº 4.769.330; US nº 4.772.848; US nº 4.603.112; US nº 5.100.587 y US nº 5.179.993). Dicha técnica se refiere a eventos de recombinación homóloga entre secuencias sobresalientes en un genoma viral (es decir, un sitio de inserción deseado) y un plásmido que abarca la secuencia de interés.

El sitio de inserción en el genoma poxviral es preferentemente un locus no esencial para que el poxvirus recombinante permanezca viable e infeccioso. Las regiones no esenciales adecuadas incluyen pero no se limitan a regiones intergénicas no codificantes o cualquier gen cuya inactivación o deleción no perjudica significativamente el crecimiento viral, la replicación o la infección. También se puede prever la inserción en un locus viral esencial a condición de que la función defectuosa se suplante in trans durante la producción de las partículas virales, por ejemplo utilizando una línea celular de ayuda que presente las secuencias complementarias que se corresponden con las seleccionadas en el genoma poxviral.

Por ejemplo, cuando se utiliza el virus de la vacuna de Copenhague, se puede seleccionar preferentemente un sitio de inserción localizado en el gen de la timidina quinasa (tk) (Hruby et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci USA 80, 3411-3415; Weir et al., 1983, J. Virol. 46, 530-537). Sin embargo, otros sitios de inserción también son apropiados, como el gen hemaglutinina (Guo et al., 1989, J. Virol. 63, 4189-4198), en el locus K1L, en el gen u (Zhou et al., 1990, J. Gen. Virol. 71, 2185-2190) o en el extremo izquierdo del genoma del virus de la vacuna en el que se han descrito en la literatura una variedad de deleciones espontáneas o provocadas (Altenburger et al., 1989, Archives Virol. 105, 15-27; Moss et al., 1981, J. Virol. 40, 387-395; Panicali et al., 1981, J. Virol. 37, 1000-1010 ; Perkus et al., 1989, J. Virol. 63, 3829-3836; Perkus et al., 1990, Virol. 179, 276-286; Perkus et al., 1991, Virol. 180, 406-410).

Cuando se utiliza MVA, se seleccionará preferentemente un sitio de inserción localizado en cualquiera de las deleciones identificadas I a VII, y preferentemente en la deleción II o III (Meyer et al., 1991, J. Gen. Virol. 72, 1031-1038; Sutter et al., 1994, Vaccine 12, 1032-1040) así como en el locus D4R.

Cuando se utiliza el virus de la viruela de las aves de corral, aunque se considere la inserción en el gen timidina quinasa, la secuencia de interés se introduce preferentemente en una región intergénica no codificante, por ejemplo la región intergénica situada entre ORFs7 y 9 del fragmento HindIII de 1,3 kb del genoma del virus de la viruela de aves de corral (ver por ejemplo EP 314 569 y el documento US 5.180.675).

La presente invención proporciona además un procedimiento para la producción de una partícula poxviral IMV según la invención que comprende las etapas de:

a) obtención de una semilla de dicha partícula poxviral,

b) preparación de un cultivo de células permisivas,

c) infección de dichas células en cultivo con dicha semilla de la partícula poxviral,

d) cultivo de dichas células infectadas durante un periodo de tiempo adecuado,

e) recuperación de las partículas poxvirales IMV producidas en las células en cultivo y/o el sobrenadante de cultivo y

f) opcionalmente, purificación de las partículas poxvirales recuperadas.

Según una forma de realización especial, es posible combinar la etapa a) y c). En este caso, el procedimiento de la invención comprende las etapas de:

a)

preparación de un cultivo de células permisivas,

b)

infección de dicha célula en cultivo con un tipo de partícula poxviral salvaje y transfección de dicha célula con un plásmido que comprende una secuencia de interés flanqueada por secuencias sobresalientes capaces de recombinación homóloga con el ADN genómico de dicho poxvirus,

c)

cultivo de dichas células durante un período de tiempo adecuado,

d)

recuperación de las partículas poxvirales producidas en las células en cultivo y/o el sobrenadante del cultivo y

e)

opcionalmente, purificación de las partículas poxvirales recuperadas.

En una forma de realización preferida, las "células permisivas" son fibroblastos primarios de embrión de pollo (CEF) preparado a partir de embriones de pollo obtenidos de huevos fertilizados. Según la forma de realización particular en la que el genoma poxviral de la partícula es defectuosa para una o más funciones vitales (por ejemplo defectuosa por lo menos en un gen implicado en la producción de partículas EEV) sería ventajoso utilizar células de ayuda que proporcionen la función defectuosa in trans. En particular, los poxvirus defectuosos para la función codificada por el gen F13L se cultivan preferentemente en una línea celular que expresa el producto de expresión F13L. Dicha línea celular se puede generar por transfección de un vector apropiado que expresa el polipéptido F13L como se describe en Borrego et al.: (1999, J. Gen. Virol. 80, 425-432). Según una forma de realización ventajosa, el aislamiento y la propagación de una partícula poxviral de la presente invención se puede realizar en una línea celular diana que presenta en su superficie la molécula anti-ligando reconocida por la mitad ligando de la presente invención. Esto permite minimizar la posible contaminación con el genoma tipo salvaje. Por ejemplo, una partícula poxviral que presenta una mitad ligando específica para el polipéptido MUC-1 se propaga preferentemente en células diana que expresen MUC-1. La construcción de dichas líneas celulares que expresan en su superficie una molécula anti-ligando está al alcance del experto en la materia.

La "semilla de partícula poxviral" se obtiene según las técnicas habituales al final de las fases de recombinación homóloga entre el genoma poxviral y el plásmido incorporando la secuencia de interés. A este respecto, uno se puede remitir por ejemplo a la sección Experimental de la presente invención.

En el caso de que se requiera la transfección adicional de las células con un plásmido, se pueden utilizar métodos de transfección celular ampliamente utilizados (por ejemplo (precipitación de ADN con calcio, electrotransfección.) combinados opcionalmente con un glicerol que puede facilitar la obsorción del plásmido. Adicionalmente, se puede incluir una etapa de selección en la que el virus recombinante contiene un gen seleccionado (por ejemplo gen E. coli gpt), por ejemplo, mediante la utilización de un medio de cultivo selectivo que contiene una mezcla de ácido micofenólico, xantina hipoxatina en la fase c).

Mientras las partículas virales se pueden recuperar del sobrenadante del cultivo, también se pueden recuperar de las células. Uno de los métodos comúnmente utilizados consiste en la lisis de las células de cualquier modo (químico, enfriamiento/descongelación, shock osmótico, shock mecánico, sonicación y similares). La partícula poxviral IMV de la invención se puede aislar mediante ciclos sucesivos de purificación de la placa y después purificada utilizando los métodos de la técnica (métodos cromatográficos, ultracentrifugación en cloruro de cesio o gradiente de sacarosa). Alternativamente, se puede utilizar la afinidad entre la mitad ligando expuesta en la superficie viral y su anti-ligando para purificar la partícula poxviral IMV de la presente invención. Por ejemplo, la purificación se puede realizar mediante a) inmovilización del anti-ligando estudiado en un soporte sólido, b) contacto de la preparación viral con el anti-ligando inmovilizado por un periodo de tiempo suficiente para permitir la unión específica entre el anti-ligando y la mitad ligando, c) eliminación del material no unido y d) elución del material unido y e) recuperación del material eluido. Dicha purificación puede ser ventajosa para reducir una eventual contaminación de las partícula poxvirales IMV de la invención con de tipo salvaje poxvirus o de soporte.

El procedimiento de la invención se puede utilizar para elaborar tanto partículas poxvirales IMV como de EEV. Según una forma de realización preferida de la invención, el procedimiento incluye una etapa suplementaria que permite la rotura de la envuelta adicional del EEV y la producción selectiva IMV. Preferentemente, dicha etapa adicional consiste en una etapa de sonicación o una etapa de solubilización en un detergente suave (por ejemplo Brij-58).

La invención se refiere asimismo a una composición que comprende por lo menos una partícula poxviral IMV y/o por lo menos un vector según la invención. En un caso especial, la composición comprende dos o más partículas poxvirales IMV y/o dos o más vectores de la invención, en los que se diferencian el uno del otro por (i) la naturaleza de la mitad ligando heteróloga y/o (ii) la naturaleza del ácido nucleico o de la secuencia de interés y/o (iii) el origen poxviral. Dicha composición se puede presentar en varias formas, por ejemplo, en forma sólida, líquida, en polvo, acuosa, liofilizada. En una forma de realización preferida, dicha composición comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable, que permite su utilización en un método para el tratamiento terapéutico en humanos o animales. En este caso particular, el vehículo es preferentemente un vehículo inyectable farmacéuticamente adecuado o diluyente (para ejemplos ver Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª ed. 1980, Mack Publishing Co.). Dicho vehículo o diluyente es farmacéuticamente aceptable, es decir, no es tóxico a la dosis y la concentración empleadas en un receptor. Es preferentemente isotónico, hipotónico o ligeramente hipertónico y presenta una fuerza iónica relativamente baja, como la producida por una solución de sacarosa. Además, puede contener cualquier solvente relevante, vehículos líquidos acuosos o parcialmente acuosos que comprenden agua estéril apirógena, medios de dispersión, recubrimientos y equivalentes, o diluyentes (por ejemplo, Tris-HCl, acetato, fosfato), emulsionantes, solubilizadores o adyuvantes. El pH de la preparación farmacéutica se ajusta y tampona adecuadamente con el fin de ser útil en aplicaciones in vivo. Se puede preparar bien como una solución líquida o en forma sólida (por ejemplo, liofilizada) que se puede resuspender en una solución antes de la administración. Los ejemplos representativos de vehículos o diluyentes para una composición inyectable incluyen agua, soluciones salinas isotónicas que se tamponan preferentemente a un pH fisiológico (tal como salino tamponado con fosfato o salino tamponado con Tris), manitol, dextrosa, glicerol y etanol, así como polipéptidos o proteínas tales como albúmina sérica humana. Por ejemplo, dicha composición puede comprender 10 mg/ml de manitol, 1 mg/ml de HSA, 20 mM de Tris pH 7,2 y 150 mM de NaCl.

Se puede preparar una composición según la invención de un modo convencional para la administración local, sistémica, oral, rectal o tópica. Las vías de administración adecuadas incluyen pero no se limitan a las vías intragástrica, subcutánea, aerosol, instilación, inhalación, intracardíaca, intramuscular, endovenosa, intraarterial, intraperitoneal, intratumoral, intranasal, intrapulmonar o intratraqueal. La administración se puede realizar en una dosis única o en dosis repetidas una o varias veces después de un determinado intervalo de tiempo. La vía de administración y la dosis adecuadas varían según varios parámetros, por ejemplo, con la condición o enfermedad implicada, la necesidad para prevención o terapia, el estado al que ha progresado y el gen terapéutico a transferir. A modo de indicación, las partículas poxvirales se pueden formular a unas dosis de entre 10^{4} y 10^{14} ufc (unidades formadoras de colonias), ventajosamente entre 10^{5} y 10^{13} ufc y preferentemente entre 10^{6} y 10^{12} ufc. El título se puede determinar mediante las técnicas convencionales. Las dosis de vector están comprendidas preferentemente entre 0,01 y 10 mg/kg, más especialmente entre 0,1 y 2 mg/kg.

Además, una composición según la presente invención puede incluir una o más sustancias estabilizantes, tales como lípidos (por ejemplo, lípidos catiónicos, liposomas, lípidos como se describe en el documento WO98/44143), inhibidores de nucleasa, polímeros, agentes quelantes con el fin de preservar su degradación en el cuerpo animal/humano.

En otra forma de realización, la presente invención proporciona la utilización de una partícula poxviral IMV o de un vector según la invención, para la preparación de un fármaco destinado al tratamiento de un organismo humano o animal mediante terapia génica. Dentro del alcance de la presente invención, "terapia génica" se debe entender como un método para la introducción de cualquier gen terapéutico en el interior de una célula. De este modo, incluye asimismo la inmunoterapia que se refiere a la introducción de un epítopo potencialmente antigénico en el interior de la célula para inducir una respuesta inmune que puede ser celular o humoral o ambas.

La utilización según la invención depende de las propiedades de direccionalidad de la mitad ligando que se muestra en la superficie de la partícula poxviral IMV o expresada por el vector de la invención. De este modo, una mitad ligando capaz de reconocer y unirse a una molécula presente en la superficie de una célula infectada por un agente patógeno (bacteria, virus o parásito) es adecuada para el tratamiento o prevención de cualquier condición o enfermedad causada por tal infección. Una mitad ligando dirigida a un tumor es más adecuada para el tratamiento o la prevención de un cáncer. El término "cáncer" engloba cualquier condición cancerosa incluyendo tumores difusos o localizados, metástasis, pólipos cancerosos y lesiones preneoclásicas (por ejemplo, displasias) así como enfermedades que resultan de una proliferación no deseada de las células. Se pueden citar más particularmente cánceres de mama, cérvix (en particular, los inducidos por un papilomavirus), próstata, pulmón, vejiga, hígado, colorectal, páncreas, estómago, esófago, laringe, sistema nervioso central, sangre (linfomas, leucemia, et), melanomas y mastocitoma.

La utilización según la invención para el tratamiento de u organismo humano o animal, comprende la administración a dicho organismo de una cantidad terapéuticamente eficaz de una partícula poxviral IMV, de un vector o de una composición según la invención. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" es una dosis suficiente para el alivio de uno o más síntomas normalmente asociados con la enfermedad o la condición que se desea tratar. Cuando se trata de una utilización profiláctica, dicho térmico significa una dosis suficiente para prevenir o retrasar el establecimiento de una enfermedad o condición.

La utilización de la presente invención, para aplicaciones terapéuticas está relacionada con las enfermedades o condiciones indicadas anteriormente. La presente utilización, es particularmente útil para prevenir el establecimiento de tumores o para revertir tumores existentes de cualquier tipo, utilizando un enfoque similar al descrito en la presente memoria. Se debe entender que la presente utilización se puede llevar a cabo por o mediante una variedad de enfoques. Ventajosamente, la partícula poxviral IMV, el vector o la composición de la invención se puede administrar directamente in vivo mediante cualquier vía de administración convencional y fisiológicamente aceptable, por ejemplo por inyección intravenosa, en un tumor accesible, en los pulmones mediante un aerosol, o por instilación, en el sistema vascular utilizando un catéter adecuado, etc. Se puede aplicar asimismo para un enfoque ex vivo que consiste en la extracción de células de un paciente (células de médula ósea, linfocitos de sangre periférica, mioblastos y similares.), introduciendo la partícula poxviral IMV o le vector de la invención de acuerdo con las técnicas del método y readministrándolas al paciente.

En el caso del tratamiento in vivo, para mejorar la proporción de transfección, el paciente debe sufrir un tratamiento de depleción de macrófagos previo a la administración de los preparados farmacéuticos descritos anteriormente. Dicha técnica se describe en la literatura (referirse particularmente a Van Rooijen et al., 1997, TibTech 15, 178-184).

Según una forma de realización preferida, cuando en la invención se utiliza una partícula poxviral IMV recombinante que presenta las características de la invención y que expresa un gen suicida, puede resultar ventajoso administrar adicionalmente una cantidad farmacéuticamente aceptable de profármaco que es específica para el producto del gen suicida expresado. Las dos administraciones se puede realizar simultáneamente o consecutivamente, pero preferentemente se administra el profármaco después de la partícula poxviral IMV de la invención. A modo de ilustración, es posible utilizar una dosis de profármaco de 50 a 500 mg/Kg/día, siendo preferida una dosis de 200 mg/kg/día. El profármaco se administra de acuerdo con la práctica habitual. Se prefiere la vía oral. Es posible administrar una dosis única, o dosis que se repiten durante un tiempo suficientemente largo para permitir que se produzca el metabolito tóxico en el interior del organismo huésped o de la célula diana. Tal como se menciona anteriormente, el profármaco ganciclovir o aciclovir se puede utilizar en combinación con el producto de gen TK HSV-1 y 5-FC en combinación con FCY1, FUR 1 y/o producto de gen FCU1.

Para ilustrar una utilización destinada al tratamiento de tumor, se puede administrar primero una partícula poxviral IMV que exprese un gen suicida que presenta en su superficie una mitad ligando capaz de reconocer y unirse a un antígeno de tumor expresado por las células tumorales. Una vez infectadas, las células cancerosas expresaran el gen suicida. La destrucción de las células infectadas se puede llevar a cabo mediante la administración del profármaco metabolizado por el producto del gen suicida seleccionado. En individuos en los que se desea una prevención o regresión del cáncer de mama MUC-1 positivo, se puede utilizar una partícula poxviral IMV que exprese FCU-1 y que alberque en su superficie un ligando un scFV SM3 capaz de reconocer y unirse a un antígeno de tumor MUC-1. Se puede conseguir la destrucción de las células infectadas con el MUC-1 con administración adicional del profármaco 5-FC.

Además, una característica particular del método de la invención es que la partícula poxviral IMV de la invención se puede producir in vivo en el organismo tratado.

La prevención o el tratamiento de una enfermedad o una condición se puede llevar a cabo utilizando tan sólo la presente utilización o, si se desea, conjuntamente con métodos disponibles actualmente (por ejemplo, radiación, quimioterapia y cirugía).

Estas u otras formas de realización se dan a conocer o resultan evidentes y están englobadas en la descripción y ejemplos de la presente invención. Se puede encontrar bibliografía adicional en referencia a cualquiera de los métodos, utilizaciones y compuestos que se van a emplear según la presente invención en las bibliotecas públicas, utilizando por ejemplo dispositivos electrónicos. Por ejemplo, se puede utilizar la base de datos pública "Medline" que está disponible en internet, por ejemplo bajo el nombre http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Pubmed/medline.html. Otras bases de datos y direcciones son conocidas por el experto en la materia, tales como http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, http://www.infobiogen.fr, http://www.fmi.ch/biology/research_tools.html, http://www.tigr.org, y se pueden obtener también utilizando, por ejemplo http://www.lycos.com. Una revisión de la información de patentes en biotecnología y una revisión de las fuentes relevantes de la información de patentes útil para una búsqueda retrospectiva y para conocimiento actualizado se encuentra en Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364.

La presente invención se refiere asimismo a un método para la purificación de una partícula poxviral IMV de la invención a partir de una preparación viral que contiene tanto partículas poxvirales IMV de la invención como una partícula poxviral IMV del tipo salvaje que comprende las etapas de unión de dicha preparación viral a un soporte sólido cubierto con una molécula anti-ligando capaz de unir dicha mitad ligando heteróloga y recuperar dicha partícula poxviral. Preferentemente, la etapa de unión se realiza mediante resonancia de plasma en la superficie, preferentemente utilizando un sistema biosensor BIAcore X^{TM}(BIAcore AB, Uppsala, Suecia) según las instrucciones del fabricante. Según una forma de realización preferida, la estreptavidina se une covalentemente al soporte sólido de un dispositivo sensor SA mediante un enlace amino utilizando un equipo de enlace amino (BIAcore AB, Uppsala, Suecia). Después, se inmoviliza la molécula anti-ligando biotinilada en un flujo de células en el dispositivo sensor SA recubierto con estreptavidina. El flujo celular 1 sirve como ejemplo. La unión de partículas poxvirales en fase fluida de la invención se determinó en un rango de 1 x 10^{4}-1x10^{10} ufc ml. Los volúmenes de inyección están comprendidos entre 5 y 100 \mul y la velocidad de flujo está comprendida entre 2 y 0 \mul/min. La superficie se regenera con NaOH (2 a 50 mM) para recuperar las partículas específicas marcadas. Preferentemente, el soporte sólido es un soporte de dextrano. Preferentemente, la molécula anti-ligando es un péptido derivado de MUC-1, y especialmente un 60 mer que representa 3 repeticiones tándem de MUC-1.

El método de la invención comprende además la etapa de infección de una célula permisiva con dicha partícula poxviral IMV recuperada. Dicha etapa se realiza según la tecnología convencional. Preferentemente, la etapa de infección se realiza en presencia de EDTA (0,1 a 10 mM preferentemente 1 mM).

La invención se ha descrito de un modo ilustrativo, y se debe entender que la terminología que se ha utilizado se desea que sea del tipo de palabras más de descripción que de limitación. Obviamente, a la luz de los descubrimientos anteriores algunas modificaciones y variaciones de la presente invención son posibles. Por lo tanto se entiende que dentro del alcance de las reivindicaciones anexadas, se puede realizar la invención de una forma diferente de la que se describe específicamente en la presente memoria.

Leyendas de las figuras

La figura 1 ilustra la organización de una partícula poxviral. La envuelta IMV se representa con una línea fina que presenta en su superficie el producto del gen D8L y el complejo de proteína p21-kDa (p21) y p14-kDa (p14). La envuelta EEV se representa por una línea gruesa que presenta en su superficie los productos del gen A34R, HA y B5R.

La Figura 2 representa esquemáticamente el plásmido pTG14552.

La Figura 3 representa un análisis por citometría de flujo después de la infección de P815; MUC-1 que expresa P815 (P815-MUC1), BHK-21 y MUC-1 que expresa BHK-21 (BHK-21-MUC1) mediante MVATG14552 (A) o el control MVAN33 (B).

Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la presente invención.

Ejemplos

Las construcciones descritas a continuación se llevan a cabo según las técnicas de ingeniería genética general y clonación molecular descritas en Maniatis et al., (1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY) o según las recomendaciones del fabricante cuando se utiliza un equipo comercial. Las técnicas de amplificación por PCR son conocidas por el experto en la materia (ver por ejemplo, PCR protocols-A guide to methods and applications, 1990, publicado por Innis, Gelfand, Sninsky y White, Academic Press).

Los bacteriófagos recombinantes M13 se hacen crecer en una cepa de E. coli NM522 (Stratagene) en un medio mínimo de agar o en un medio líquido enriquecido LBM. Los plásmidos recombinantes que presentan el gen de resistencia a la ampicilina se replican en E. coli C600 (Stratagene), BJ5183 (Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166, 557-580) y NM522 en agar o en medio líquido enriquecido con 100 \mug/ml de antibiótico. Se utiliza preferentemente la cepa BJ5183 cuando se lleva a cabo la clonación mediante recombinación homóloga (Bubek et al., 1993, Nucleic acid Res. 21, 3601-3602).

Las construcciones de los virus de vacuna recombinante se realizan según la tecnología convencional en el campo en los documentos descritos anteriormente y en Mackett et al., (1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 7415-7419) y en Mackett et al., (1984, J. Virol. 49, 857-864). El gen de selección gpt (xantina guanina fosforibosiltransferasa) de E. coli (Falkner y Moss, 1988, J. Virol. 62, 1849-1854) se utiliza para facilitar la selección de los virus de vacuna recombinante.

Ejemplo 1 Construcción de un MVA dirigido a células MUC-1 positivo

Se han ideado dos construcciones diferentes:

MVATG14519 es un vector MVA ideado para marcar células tumorales MUC-1 positivo que expresan una proteína quimérica p14 en la que la cadena scFv del anticuerpo monoclonal SM3 se fusiona con su forma natural en el extremo N terminal de MVA 138L ORF (p14-kDa).

MVATG14552 (Figura 2) es un vector MVA ideado para marcar células tumorales MUC-1 positivo y que es similar al vector MVATG14519 con la excepción de la presencia de un péptido señal de la glicoproteína TGN51 del complejo trans-golgi humano (secuencia descrita por Kain et al., 1997, J. Biol. Chem 273, 981-988) fusionada al extremo N terminal de la cadena scFv del anticuerpo monoclonal SM3.

A. Modificación del gen MVA138L

Se ha ensamblado un vector de clonación para la inserción de secuencias scFv utilizando una estrategia basada en PCR. Se ha amplificado el extremo 3' del gen MVA138L y la región flanqueante 3' utilizando unos los cebadores OTG12340 (SEC ID nº: 1) y OTG12343 (SEC ID nº:2) para producir un fragmento C. El casete de expresión para la selección del marcador que codifica para E. coli gpt colocado bajo el control de un promotor temprano pH5R (Goebel et al., 1990, Virol. 179, 247-266, 517-563) se aisla mediante PCR a partir de un plásmido de ADN de una técnica anterior, tal como pH5R-GPT (documento FR 98 13279) (designado posteriormente en la presente memoria como pTG9996), utilizando los cebadores OTG12342 (SEC ID nº:3) y OTG12341 (SEC ID nº:4) para producir el fragmento E. La fusión entre los fragmentos C y E se realiza mediante PCR mezclando ambos fragmentos y los cebadores OTG12340 y 12342 (Fragmento F).

La región contraria de MVA138L se amplifica utilizando el conjunto cebador OTG12338 (SEC ID nº:5) y
OTG12359 (SEC ID nº:6) en el caso en el que el fragmento scFv se fusiona con la p14-kDa natural para generar el fragmento A y que se clona a continuación entre los sitios EcoRI y HindIII de M13TG6131 (Ejemplo 7 del documento WO99/03885) para proporcionar el M13TG14025. En el caso en el que scFv se fusiona en su extremo N terminal a la señal de translocación TGN51 de la glicoproteína del complejo trans-golgi, la amplificación se realiza con los cebadores OTG12338 (SEC ID nº:5) y OTG12346 (SEC ID nº:7). El fragmento resultante (Fragmento Asp) se clona entre los sitios EcoRI y HindIII de M13TG6131, para proporcionar M13TG14027. Ambas construcciones incluyen un único sitio HindIII en sentido contrario de la secuencia codificadora MVA138L.

El MVA138L y la región en el mismo sentido de MVA138L se amplifican utilizando los cebadores OTG12380 (SEC ID nº:8) y OTG12339 (SEC ID nº:9). El fragmento resultante (fragmento D) se clona entre los sitios EcoR1 y HindIII de M13TG6131, para dar M13TG14026. los fragmentos A/D o Asp/D se aislan mediante digestión con HindIII y EcoR1 y se insertan en el sitio EcoR1 del vector pTG1E (Ejemplo 2 del documento WO99/03885), para proporcionar respectivamente pTG14359 (que contiene el fragmento A/D) y pTG14358 (que contiene el fragmento Asp/D). Entonces se inserta el fragmento F bien en el pTG14359 o bien en el pTG14358 en el sitio PacI. Los constructos finales se denominan pTG14366 y pTG14365.

B. Aislamiento de SM3 scFv

El hibridoma SM3 ha sido descrito por Burschell et al. (1987, Cancer Res. 47, 5476-5482), Girling et al. (1989, Int. J. Cancer 43, 1072-1076) y Dokurno et al. (1998, J. Mol. Biol. 284, 713-728). El epítopo reconocido en la forma MUC-1 asociado a tumor es P-D-T-R-P. SM3 scFV comprende la región variable de la cadena pesada del anticuerpo SM3 (referenciada en GenBank bajo los números de acceso AF042142) unido a 10 residuos separadores seguido por la región variable de la cadena ligera del anticuerpo SM3 (referenciada en el GenBank bajo los números de acceso AF042143). Cada región variable se puede aislar mediante PCR a partir de un plásmido de la técnica anterior, tal como pMAL-SM3 utilizando o bien el par de cebadores OTG12360 (SEC ID nº:10) y OTG12361 (SEC ID nº:11) para la inserción de la secuencia SM3-scFv en el sitio HindIII de pTG14366 o bien el par de cebadores OTG12344 (SEC ID nº:12) y OTG12361 (SEC ID nº:11) para la inserción de la secuencia SM3-scFv en el sitio HindIII de pTG14365. los constructos resultantes se denominan pTG14519 y pTG14552 (figura 2).

C. Aislamiento de las partículas MVA infecciosas

Se ha aislado un subclon de MVA en unas condiciones GMP a partir de un material crudo tal como se ha descrito en Stickl et al. (1974, Deutsch Med Wochenschr 99, 2386-2392; Mayr et al., 1978, Zentralbl Bakteriol 167, 375-390). Dicho subclon se denomina MVATGN33.1. Este MVA parental se propaga y se titula de forma rutinaria en CEFs.

Las CEFs se preparan a partir de embriones de pollo obtenidos de huevos fertilizados previamente e incubados durante 11 días a una temperatura de 37ºC en una atmósfera húmeda. Los embriones de pollo se cortan en trozos pequeños y se tratan con una solución de tripsina al 2,5% (p/v). Las CEF entonces se siembran en unas placas petri de plástico Falcon 3001 a una densidad celular de 1,5x10^{6} células por placa en un medio Eagle (MBE)/triptosa (Gibco BRL) complementada con suero bovino al 10%. Después de 48 horas, se infectan las células monocapa con el MVATGN33.1 durante 30 minutos en PBS más cationes (acetato de magnesio y CaCl_{2} a 1 mg/ml cada uno) más el 1% de suero bovino con el fin de adsorber el virus en las células. Entonces se cultivan las células infectadas durante una hora en MBE más suero bovino al 5% a una temperatura de 37ºC al 5% de CO_{2}. Entonces se precipitan de 1 a 5 gramos de plásmido (pTG14519 o pTG14552) en una solución de Hepes y CaCl_{2}. El ADN precipitado se extiende sobre las células infectadas en monocapa y se incuba durante 2 horas a una temperatura de 37ºC y 5% de CO_{2}. Se puede realizar un shock de glicerol durante 1 minuto para facilitar la entrada del plásmido. Para dicho propósito, se extiende sobre la monocapa celular una solución de glicerol al 10% en MBE/triptosa durante 1 minuto. Entonces se lavan las monocapas con PBS más cationes y se incuban en MBE más el 5% del suero bovino a una temperatura de 37ºC y 5% de CO_{2}. Después de 48 horas se congelan las placas de Petri.

El aislamiento de las placas recombinantes se realiza tal como sigue: las placas de Petri se descongelan, se recogen las células infectadas y se sonican en MBE/suero bovino. Entonces se aislan los virus recombinantes mediante ciclos consecutivos de purificación de placa en CEFs bajo la presión del marcador de selección en presencia de 250 \mug/ml de xantina, 15 \mug/ml de hipoxantina, y 25 \mug de ácido micofenólico tal como se ha descrito anteriormente por Falkner y Moss (1988, J. Virol. 62, 1849-1854).

Se puede preparar un depósito (semillas virales) en frascos F175 que contienen 10^{8} CEFs que se infectan con el MVA. Los virus se propagan durante un periodo de tiempo de 48 a 72 horas. Se mezclan las células infectadas y el medio de cultivo y se sonica la suspensión. Los extractos crudos se fraccionan primero en unas bandas de sacarosa al 36%. Entonces el pellet viral se fracciona en gradiente discontinuo de sacarosa, tal como se describe en Joklik (1962, Virology 18, 9-18).

Ejemplo 2 Construcción de MVA recombinante que expresa FCU-1 y dirigido a células MUC-1 positivo

Se aisló el gen FCU-1 mediante digestión con HindIII/KpnI del plásmido de ADN pTG13046 (referenciado como pCI-neoFCU1 en el documento WO99/54481). El vector de transferencia que contiene las secuencias homólogas de las regiones flanqueantes de la deleción III denominada pTG6019 (ejemplo 2 del documento WO99/03885) se modificó tal como sigue:

El casete de expresión que codifica para E. coli gpt colocado bajo el control del promotor temprano del virus de la vacuna pH5R se aisla a partir de un plásmido de ADN pTG9996 mediante una digestión con SacI. Dicho fragmento de ADN se inserta posteriormente en el sitio SacI del plásmido de ADN pTG6019, para proporcionar pTG14033. El promotor tardío sintético p11K75 (SEC ID nº:13) se aisla mediante PCR a partir del molde M13TG4052 con los cebadores OTG122271 (SEC ID nº:14) y OTG12272 (SEC ID nº:15). M13TG4052 se basa en M13TG130 (Kieny et al., 1983, Gene 26, 91-99). El promotor 11K7,5 contiene desde el extremo 5' al 3' la secuencia del promotor tardío 11k (Goebel et al., 1990, supra) hasta nucleótido +4 del sitio de inicio de transcripción, la secuencia del promotor TK de los nucleótidos -28 a -13 que presenta una C en lugar de una A en la posición -18 y la región entre los nucleótidos -12 a +6 del promotor temprano 7,5k.

El fragmento amplificado se digiere con los enzimas de restricción BamHI y BglII antes de ser insertado en el sitio BamHI de pTG14033, para proporcionar pTG14084. El gen FCU-1 se clona en sentido contrario del promotor p11K75 por recombinación homóloga tal como sigue. Primero, se insertan las secuencias sintéticas entre los sitios PstI y BamHI de pTG14084 utilizando OTG12522 (SEC ID nº:16) y OTG12523 (SEC ID nº:17). Entonces se alinea el plásmido de ADN mediante XhoI y se efectúa la recombinación homóloga con el gen FCU-1 en E. coli. El plásmido de ADN resultante se denomina pTG14322.

La recombinación homóloga en CEFs infectadas con MVATG14552 y transfectadas con pTG14322 da como resultado la obtención de MVA dirigido a MUC-1 que expresa el gen suicida FCU-1.

Ejemplo 3 Producción de MVA en un Knockout del gen F13L

El extremo 5' de la región flanqueante F13L se aisla del ADN viral MVATGN33 mediante un ensayo de PCR convencional utilizando el par de cebadores OTG13192 (SEC ID nº:18) y OTG13194 (SEC ID nº:19) y se inserta entre los sitios BamHI y EcoRI de pBS (Stratagene) (pTG14746). El extremo 3' de la región flanqueante F13L se aisla del ADN viral MVATGN33 mediante un ensayo de PCR convencional utilizando el par de cebadores OTG13190 (SEC ID nº:20) y OTG13191 (SEC ID nº:21) y se inserta entre los sitios BamHI y EcoRI de M13TG6131 para proporcionar M13TG14101. Las regiones flanqueantes 5' y 3' de F13L se clonan posteriormente en el sitio EcoRI de pTG1E. El constructo resultante se denomina pTG14783.

Ejemplo 4 Generación de una línea celular productora que se expresa para el antígeno MUC-1

Tal como se ha mencionado anteriormente, la inserción de la mitad ligando scFv de SM3 en la proteína p14-Kda puede afectar la producción de virus (rendimiento reducido de virus). De este modo, el MVA marcado del ejemplo 1 se aisla preferentemente y se propaga en una línea celular que presenta en la superficie celular el antígeno MUC-1 que es reconocido por en anticuerpo SM3 presente en la superficie viral, para reducir la contaminación por el tipo salvaje MVATGN33.1.

El cADN que codifica para la membrana de la forma anclada del antígeno MUC-1 se aisla a partir de pPOLYII-ETAtm (Hareuveni et al., 1990, Eur. J. Biochem. 189, 475-486) mediante una digestión doble con los enzimas de restricción BglII y EcoRI y se insertan entre los sitios BamHI y EcoRI del vector de expresión pcDNA3 (InVitrogen, USA) en el mismo sentido del promotor CMV. El plásmido resultante se denomina pTG5077.

1x10^{6} células BHK-21 (ATCC CCL-10) se transfectan con 5 \mug de pTG5077 y a continuación se cultivan en medio GMEM (Glasgow Modified Eagle Medium, Gibco BRL) que contiene 20 g/l de Gentamicina y 10% de suero bovino fetal. Después de 24 h a una temperatura de 37ºC y una atmósfera al 5% de CO_{2}, se añade 1 mg/ml de G418 (Gibco BRL). Entonces se aislan los clones resistentes a neomicina mediante dilución límite y se comprueba mediante FACS la expresión de MUC-1 en la superficie celular utilizando el anticuerpo monoclonal H23 (Tsarfaty et al., 1989, in Breast cancer inmunodiagnosis and Immunoterapia, Ed Ceriani, Plenum NY). Interesantemente, la mayoría de los clones MUC-1 positivo pierden la propiedad de adherencia plástica de la línea celular parental BHK-21 y empiezan a crecer en suspensión. Dicha observación facilitará la propagación y la producción farmacéutica de los virus recombinantes de la invención en un biorreactor.

Ejemplo 5 Evaluación de las propiedades de dirigibilidad

Se aislan los clones de MVATG14552 del ejemplo 1 mediante ciclos consecutivos de purificación de placas en CEFs bajo condición selectiva en presencia de xantina, hipoxantina y ácido micofenólico tal como se ha descrito anteriormente.

Un determinado número de clones se analizó primero mediante PCR para detectar en el genoma viral la presencia del gen quimérico que codifica para la proteína de fusión TG51/SM3scFv/p14kDa. Se seleccionaron nueve clones y se analizaron más mediante Western Blot para confirmar la expresión de la proteína de fusión en la superficie de las partículas poxvirales. La detección se realizó con un equipo ECL (Amersham) mediante inmunomarcaje con suero policlonal de conejo específico para p14-kDa en extracto crudo obtenido a partir de células infectadas o sobrenadantes. La proteína p14-kDa purificada se utiliza como control. Con la excepción del clon C5, todos los clones seleccionados expresan la proteína de fusión quimérica que presenta una masa molecular de 46 kDa. Tal como se esperaba, la intensidad del marcaje es más intensa en los extractos crudos que en los sobrenadantes del cultivo reflejando el estado intracelular de las partículas poxvirales. Dichos resultados indican que la mayoría de los poxvirales que presentan en su superficie la proteína de fusión TG51/SM3scFv/p14kDa son partículas IMV. La detección de una pequeña cantidad de proteína de fusión en el sobrenadante de cultivo se puede explicar tanto por una rotura de la envuelta EEV como mediante una lisis celular durante la preparación del clon.

Entonces se han estudiado las propiedades de infección de MVATG14552 en diferentes líneas celulares:

-

El mastocito murino P815 (ATCC CRL6448),

-

P815 que expresa el antígeno MUC-1 (P815-MUC1) obtenido mediante transfección de las células parentales P815 con un vector que expresa la forma anclada a la membrana del antígeno MUC-1,

-

BHK 21 (Baby Hamster Kidney),

-

BHK 21 que expresa el antígeno MUC-1 (BHK 21-MUC1) obtenido mediante transfección de las células parentales BHK 21 con un vector que expresa la forma anclada a la membrana del antígeno MUC-1.

Las células se infectan con el clon 9 del MVATG14552 o con un virus control (MVAN33) a un MOI de aproximadamente 0,1 durante 24 h. La eficacia de infección se determina mediante citometría de flujo (FACS) después de la incubación con un suero murino policlonal después de la inmunización de MVA a una tasa de dilución de 1/100. Se produce una revelación mediante la incubación con un monoclonal de cabra FITC IgG antirratón (Pharmingen, 10 \mug/ml). Tal como muestra la figura 3A, el MVATG14552 infecta preferentemente las células que expresan MUC-1 comparado con las células parentales P815 y BHK-21. Por el contrario, el control MVA infecta tanto las células que expresan MUC-1 como las que no expresan con una eficacia similar (Fig. 3B).

En conjunto, dichos resultados indican que la mitad ligando SM3 scFv se expresa en la superficie de las partículas poxvirales (IMV) y que es capaz de reconocer y unirse a su diana (el antígeno MUC-1) conduciendo a una infección específica de dichas células por el virus modificado.

Se estudiaron las interacciones entre dos clones que expresan SM3 scFv (A3 y C9) con el péptido MUC-1 60 mer por resonancia de plasma en superficie (SPR), utilizando un sistema biosensor BIAcore XTM (BIAcore AB, Uppsala, Suecia). Todos los experimentos se realizaron a una temperatura de 25ºC. La esteptavidina se unió covalentemente a la matriz dextrano carboxilada de un dispositivo sensor SA mediante enlace amino utilizando el equipo de enlace amino (BIAcore AB, Uppsala, Suecia). Entonces se inmovilizó el péptido 60 mer biotinilado que representa 3 pares de repeticiones de MUC-1 (10 \mug/ml en tampón HBSS) en una célula de flujo 2 en el dispositivo sensor SA recubierto con esteptavidina. La célula de flujo 1 sirvió como referencia. La unión de recombinante SM3 en fase líquida se utilizó como control positivo. La unión de virus recombinantes de fase fluida se determinó en un rango de 1x10^{6}-1x10^{8} ufc/ml en tampón HBSS. Para dicho propósito, los fibroblastos primarios de pollo se infectaron a una MOI de 1 durante 24 h. con las suspensiones virales. Los volúmenes de inyección fueron 15 \mul y la velocidad de flujo de 5 \mul/min. La superficie se regeneró con NaOH 10 mM. El análisis cinético se realizó utilizando un programa informático BIAevaluation 3.0. Se observó una interacción específica y reproducible entre los virus recombinantes y el péptido 60 mer MUC-1. Se encontró que las mediciones se correlacionaron con las concentraciones de virus. Nunca se observó la unión del control MVA (MVAN33) al mismo péptido.

Dichos resultados demuestran que la proteína de fusión SM3 scFv/p14 se asocia con partículas MVA y que los virus recombinantes reconocen específicamente un péptido derivado de MUC-1.

Ejemplo 6 Purificación de partículas virales que expresan SM3 scFv

Con el fin de separar las partículas virales de tipo salvaje no-recombinantes de las recombinantes, se realizó un protocolo de selección mediante la técnica BIAcore para purificar las partículas virales que expresan SM3 scFv recombinante basada en su capacidad para unir un péptido MUC-1. Una preparación viral elaborada a partir del clon A3 se inyectó en el sistema BIAcore X tal como se ha descrito anteriormente. Los virus que muestran una alta afinidad por el péptido 60 mer MUC-1 se recuperaron en la superficie durante la fase de regeneración utilizando NaOH 20 mM, tal como se describe en el manual de instrucciones de BIAcore X. Entonces se infectaron las células permisivas con los virus recuperados, en presencia de EDTA (1 mM) para permitir la formación de agregados virales y se seleccionaron los virus recombinantes mediante selección doble GUS/GPT. Se evaluó la ausencia de virus no recombinante salvaje en clones aislados mediante PCR. Dicha nueva purificación y protocolo de selección permitió la obtención de muchos clones libres de virus tipo salvaje contaminantes.

<110> TRANSGENE S.A

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<120> Poxvirus con especificidad de infección marcada

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<130> D18836

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> EP 00 44 0109

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<151> 2000-04-14

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<150> EP 01 44 0009

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<151> 2001-01-22

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<150> US 60/246080

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<151> 2000-11-07

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<160> 21

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR para amplificar el gen MVA 138L y la región flanqueante.

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<400> 1

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\hskip-.1em\dddseqskip

cagactggac ggcgtccata tgag

\hfill

24

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<210> 2

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<211> 61

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<221> Gen

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<222> Complemento ((1)..(61))

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR antisentido para amplificar el extremo 3' del gen MVA 138L y la región flanqueante 3'.

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<400> 2

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\hskip-.1em\dddseqskip

cattttttaa gtatagaata aaagatcccg ggagtaccat cgtgattctt accagatatt

\hfill

60

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\hskip-.1em\dddseqskip

a

\hfill

61

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<210> 3

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<211> 61

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR para amplificar el gen gpt E.coli y el promotor H5R.

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<220>

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<221> Gen

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<222> (1).. (61)

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<400> 3

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taatatctgg taagaatcac gatggtactc ccgggatctt ttattctata cttaaaaaat

\hfill

60

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\hskip-.1em\dddseqskip

g

\hfill

61

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<210> 4

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<211> 35

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador antisentido de PCR para amplificar el gen gpt E.coli y el promotor pH5R.

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<400> 4

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\hskip-.1em\dddseqskip

ggggttaatt aaggaagtta aaaagaacaa cgccc

\hfill

35

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<210> 5

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<211> 38

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR para amplificar la región antisentido del gen MVA 138L.

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<400> 5

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\hskip-.1em\dddseqskip

gggggaattc gagcttatag cgtttagttc aggtacgg

\hfill

38

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<210> 6

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<211> 44

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador antisentido para amplificar la región antisentido del gen MVA 138L.

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<400> 6

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\hskip-.1em\dddseqskip

ggggaagctt ttaaagtaca gattttagaa actgacactc tgcg

\hfill

44

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<210> 7

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<211> 68

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\newpage

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador antisentido de PCR para amplificar la región antisentido del gen MVA 138L.

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<400> 7

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ggggaagctt caagagcggc acggctcccg ccgctgcgac gttcaggagg accaaggcaa

\hfill

60

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\hskip-.1em\dddseqskip

ccacgaac

\hfill

68

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<210> 8

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<211> 31

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR para amplificar el gen MVA 138L y su región sentido

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<400> 8

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\hskip-.1em\dddseqskip

ggggaagctt atggacggaa ctcttttccc c

\hfill

31

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<210> 9

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<211> 37

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador antisentido de PCR para amplificar el gen MVA 138L y su región sentido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

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\hskip-.1em\dddseqskip

gggggaattc gcttatcgtt atcgggttta gcttctg

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR para amplificar la secuencia scFv SM3.

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

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\hskip-.1em\dddseqskip

cgcagagtgt cagtttctaa aatctgtact ttaaatggtg cagctgcagg agtctggagg

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggcttgg

\hfill

68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 58

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador antisentido de PCR para amplificar la secuencia scFv SM3.

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<400> 11

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\hskip-.1em\dddseqskip

gatcgtcatc tccggggaaa agagttccgt ccatcagttt ggttcctcca ccgaacac

\hfill

58

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

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<211> 57

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR para amplificar la secuencia scFv SM3.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

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\hskip-.1em\dddseqskip

cctgaacgtc gcagcggcgg gagccgtgcc gctcttggtg cagctgcagg agtctgg

\hfill

57

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

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<211> 111

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia del promotor sintético p11K7,5.

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

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\hskip-.1em\dddseqskip

ataaaaatat agtagaattt catttgtttt tttctatgct ataaatagga tccgataaag

\hfill

60

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\hskip-.1em\dddseqskip

tgaaaaataa ttctaattta ttgcacggta aggaagtaga atcataaaga a

\hfill

111

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 53

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR para amplificar el promotor p11K7,5

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

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\hskip-.1em\dddseqskip

gggggatccc ccgggctgca gagcttttc tttatgattc tacttcctta ccg

\hfill

53

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

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<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador antisentido de PCR para amplificar el promotor p11K7,5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

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\hskip-.1em\dddseqskip

ggggggagat ctaagcttgt cgacataaaa atatagtaga atttcatttg

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

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<211> 77

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia sintética

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<400> 16

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\hskip-.1em\dddseqskip

gatggtgaca gggggaatgg caagcaagtg ggatctcgag ttgggtgact ttggtgacag

\hfill

60

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\hskip-.1em\dddseqskip

atactactgt gtttaag

\hfill

77

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

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<211> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

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\hskip-.1em\dddseqskip

gatccttaaa cacagtagta tctgtcacca aagtcaccca actcgagatc ccacttgctt

\hfill

60

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\hskip-.1em\dddseqskip

gccattcccc ctgtcaccat ctgca

\hfill

85

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

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<211> 32

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR para amplificar la región flanqueante 5' F13L del MVA

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<400> 18

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gagaggatcc gggtatctag ccacagtaaa tc

\hfill

32

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<210> 19

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<211> 32

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Descripción de la secuencia artificial: cebador antisentido de PCR para amplificar la región flanqueante 5' F13L del MVA

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<400> 19

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tttcgaattc ggaatctgta ttctcaatac cg

\hfill

32

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<210> 20

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<211> 33

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR para amplificar la región flanqueante 3' F13L del MVA

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<400> 20

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atctgaattc gtggagatga tgatagttta agc

\hfill

33

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

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<211> 34

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador antisentido de PCR para amplificar la región flanqueante 3' F13L del MVA

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<400> 21

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aacaggatcc cttatacatc ctgttctatc aacg

\hfill

34

Claims (22)

1. Partícula poxviral IMV que presenta una especificidad de infección dirigida hacia unas células diana en la que dicha partícula infecta preferentemente dichas células diana y en la que dicha especificidad se confiere mediante por lo menos una mitad ligando heteróloga localizada en la superficie de dicha partícula poxviral IMV y que es capaz de unirse a una molécula anti-ligando localizada en la superficie de dichas células diana.

2. Partícula poxviral IMV según la reivindicación 1, en la que dicha partícula poxviral IMV es un virus de vacuna o una partícula de virus de la viruela de canario, viruela de ave, viruela de vaca, viruela de insecto, viruela de mono, viruela de cerdo o viruela de pingüino.

3. Partícula poxviral IMV según la reivindicación 1 ó 2, en la que dicho virus de vacuna se selecciona de entre el grupo que consta de las cepas de Copenhague, Wyeth y Ankara modificada (MVA).

4. Partícula poxviral IMV según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dichas células diana son células tumorales y dicha mitad ligando heteróloga es capaz de unirse a un antígeno específico de tumor, una proteína celular expresada diferencialmente o sobreexpresada en dichas células tumorales o un producto de gen de un virus asociado a cáncer.

5. Partícula poxviral IMV según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicha mitad ligando heteróloga es un fragmento de un anticuerpo capaz de reconocer y unirse al antígeno MUC-1.

6. Partícula poxviral IMV según la reivindicación 5, en la que dicha mitad ligando heteróloga es el fragmento scFv del anticuerpo monoclonal SM3.

7. Partícula poxviral IMV según la reivindicación 1, en la que dicha mitad ligando heteróloga es un polipéptido y en la que la misma forma parte de una proteína quimérica incluyendo dicha mitad ligando heteróloga y un polipéptido poxviral.

8. Partícula poxviral IMV según la reivindicación 7, en la que dicho polipéptido poxviral se selecciona de entre el grupo que consta de los productos de expresión de los genes A27L, L1R, A14L, A17L, D8L y H3L.

9. Partícula poxviral IMV según las reivindicaciones 7 y 8, en la que dicha mitad ligando heteróloga se fusiona con el extremo N terminal de los productos de expresión del gen A27L.

10. Partícula poxviral IMV según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que dicha mitad ligando heteróloga comprende un péptido señal que facilita su inserción en la envuelta de dicha partícula poxviral IMV.

11. Partícula poxviral IMV según la reivindicación 10, en la que dicho péptido señal permite la translocación de dicha mitad ligando heteróloga en el complejo trans Golgi.

12. Partícula poxviral IMV según la reivindicación 11, en la que dicho péptido de señal deriva de la glicoproteína TGN51 del complejo trans-golgi humano.

13. Partícula poxviral IMV según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que dicha partícula poxviral IMV comprende por lo menos un ácido nucleico de interés.

14. Partícula poxviral IMV según la reivindicación 13, en la que dicho ácido nucleico de interés es un gen suicida.

15. Vector que comprende por lo menos una secuencia nucleotídica que codifica para una proteína quimérica que comprende (i) por lo menos una mitad ligando heteróloga tal como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 y 4 a 7, y (ii) todo o parte de un polipéptido viral homólogo que se localiza naturalmente en la superficie de una partícula poxviral IMV.

16. Vector según la reivindicación 15, en la que dicho polipéptido viral homólogo es tal como se define en la reivindicación 8.

17. Composición que comprende por lo menos una partícula poxviral IMV según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 o por lo menos un vector según la reivindicación 15 a 16 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

18. Utilización de una partícula poxviral IMV según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 o de un vector según las reivindicaciones 15 a 16 para la preparación de un fármaco destinado al tratamiento de un organismo humano o animal mediante terapia génica.

19. Método para la purificación de una partícula poxviral IMV según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 de una preparación viral que contiene tanto dicha partícula poxviral IMV como una partícula poxviral IMV tipo salvaje, comprendiendo las etapas de unión de dicha preparación viral a un soporte sólido recubierto con una molécula anti-ligando capaz de unirse a dicha mitad ligando heteróloga y la recuperación de dicha partícula poxviral IMV.

20. Método según la reivindicación 19, en el que dicha etapa de unión se realiza mediante resonancia de plasma en la superficie en un soporte de dextrano.

21. Método según las reivindicaciones 19 ó 20, que comprende además la etapa de infección de una célula permisiva con dicha partícula poxviral IMV recuperada.

22. Método según la reivindicación 21, en la que dicha etapa de infección se realiza en presencia de EDTA.