CN115843313A - 用于多重靶向的重组单纯疱疹病毒及其用途 - Google Patents

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Abstract

公开了用于多重靶向的重组单纯疱疹病毒及其用途。具体地，公开了一种能够通过接头的多重表达进行多重靶向的重组单纯疱疹病毒，接头是癌细胞靶向结构域和HVEM的细胞外结构域的融合蛋白；以及一种重组单纯疱疹病毒，其除了能够表达作为癌细胞靶向结构域和HVEM的细胞外结构域的融合蛋白的接头之外，还通过具有经修饰的糖蛋白而能够进行多重靶向，从而能够重靶向；还公开了病毒用于抗炎治疗的用途。

Description

用于多重靶向的重组单纯疱疹病毒及其用途
技术领域
本公开涉及用于多重靶向(multiple retargeting)的重组单纯疱疹病毒及其用途。
背景技术
在癌症的治疗中，手术疗法、抗癌化疗(anticancer chemotherapy)、放射疗法(radiotherapy)等已被广泛应用，但是这些疗法中的大部分存在副作用，不完全的治疗效果以及诸如癌症复发和转移的问题。因此，需要不断开发新的和有效的癌症疗法，近年来，在抗癌免疫疗法领域已经取得了快速进展，其例子包括溶瘤病毒疗法、嵌合抗原受体T(chimeric antigen receptor T，CAR-T)细胞疗法等。
在抗癌免疫疗法中，溶瘤病毒是一种通过操作活病毒的基因并在癌细胞中选择性繁殖而被赋予裂解癌细胞能力的病毒，并且其在正常细胞中的增殖是有限的。癌细胞裂解释放的病毒能够连续感染周围的癌细胞，从而提供连续和协同的治疗效果。此外，溶瘤病毒能够通过在裂解癌细胞的过程中释放免疫原性肿瘤抗原来刺激人体的免疫应答，从而增加抗癌作用。此外，可以通过人工操作来增强这种抗癌效果，从而表达细胞因子、趋化因子等。
目前开发的溶瘤病毒可分为10种或更多种类型，包括腺病毒、单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)、牛痘病毒(vaccinia virus)等。其中，单纯疱疹病毒是一种含有152kb大小的线性双链DNA的具有包膜的二十面体病毒体，包括HSV-1和HSV-2型。HSV具有许多非必需基因，并且其基因组很大，使得易于用于操作或运输外部基因，并且其复制周期短，此外，HSV具有高感染效率，理想地能够通过容易操作与细胞附着和感染的糖蛋白而表现出改善的癌细胞靶向效率。
T-VEC(Talimogene laherparepvec，产品名：Imlygic)于2015年10月获得美国FDA批准，是一种利用HSV-1的恶性黑色素瘤的溶瘤病毒治疗剂。T-VEC是一种减毒的HSV-1病毒，其中ICP34.5和ICP47基因被删除以减弱其致病性，并且其表达GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)以促进人类免疫反应。然而，T-VEC的缺点在于其有限的病毒增殖导致治疗效果低，这是由于一些基因的缺失。
HSV是一种具有包膜的病毒，HSV进入细胞是通过涉及其包膜中存在的gD、gB、gH/gL和gC糖蛋白的复杂相互作用实现的。首先，当gB和gC连接到细胞表面的3-O-S HS(3-O-硫酸化的硫酸乙酰肝素)上时，gD与细胞受体例如HVEM(疱疹病毒入侵介质，HveA)、连接蛋白-1(nectin-1)(HveC)和连接蛋白-2(HveB)中的至少一种受体结合，从而诱导病毒和细胞膜之间的融合，由此HSV进入细胞(Hiroaki Uchida等人，疱疹病毒入侵介质(HVEM)-限制性单纯疱疹病毒1型突变病毒的产生：HVEM表达细胞的抗性和拯救连接蛋白-1识别的突变的鉴定，J.Virol.2009年4月；83(7):2951-61)。
T-VEC(Talimogene laherparepvec，产品名：Imlygic)于2015年10月获得美国FDA批准，是一种利用HSV-1的恶性黑色素瘤的溶瘤病毒治疗剂。T-VEC是一种减毒的HSV-1病毒，其中ICP34.5和ICP47基因被删除以减弱其致病性，并且其表达GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)以促进人类免疫反应。然而，T-VEC的缺点在于其有限的病毒增殖导致治疗效果低，这是由于一些基因的缺失。
为了克服这种限制，已经尝试通过操作参与HSV进入细胞的包膜糖蛋白gD、gB、gH和gC来执行靶向癌细胞的重靶向，而不削弱病毒。这种重靶向是将编码癌细胞靶分子的靶向结构域的外源序列引入糖蛋白gD、gB、gH或gC序列，并使用具有嵌合糖蛋白的重组病毒，其中外源序列的靶向结构域(也称为配体)插入糖蛋白，而不是野生型糖蛋白。这种重组病毒能够进入具有被靶向结构域特异性识别并结合的靶分子的癌细胞。靶向结构域通常是scFvI(单链可变片段)，目前重靶向的靶分子有EpCAM(上皮细胞粘附分子)、HER2(人表皮生长因子受体2)等，并且作为糖蛋白的gB、gH、gC等已经被修饰。
同时，在HSV的细胞受体中，HVEM属于肿瘤坏死因子受体蛋白家族(TNFR家族)，主要在T/B淋巴细胞、巨噬细胞、DC细胞、感觉神经元和粘膜上皮细胞中表达(Shui J.W.，Kronenberg M.，2013，肠微生物(Gut Microbes)，4(2):146-151)，但已知其在各种肿瘤组织(例如B/T淋巴瘤、黑色素瘤、结肠直肠癌、肝细胞癌、乳腺癌、卵巢浆液性腺癌、透明肾细胞癌和成胶质细胞瘤)中大量表达(Pasero C.等人，Curr.Opin.Pharmacol.，2012.2(4):478-85；Malissen N.等人，肿瘤免疫学(ONCOIMMUNOLOGY)，2019，第8卷(12):e1665976)。HVEM具有四个CRD(富含半胱氨酸的结构域)，这是TNFR家族的特征，四个CRD中的两个与HSV的gD连接，从而诱导HSV-1和HSV-2进入细胞(Sarah A Connolly等人，单纯疱疹病毒进入介质HveA(HVEM)上存在的糖蛋白D结合位点的基于结构的分析，J.Virol.，2002年11月，76(21):10894-904)。
如本公开的发明人已经报道的，制备了针对CEA(癌胚抗原)的scFv(单链可变片段)和HVEM(HSV细胞表面受体之一)的细胞外结构域的融合蛋白(CEAscFv-HveA)，当融合蛋白与HSV一起用于处理表达CEA的细胞系时，融合蛋白充当接头(adapter)，以诱导HSV靶向并感染相应细胞系(韩国专利KR10-0937774和美国专利US8318662)。
本公开的发明人已经确定，当编码融合蛋白(HER2scFv-HveA、EpCAM2scFv-HveA)的基因(其是能够靶向HER2(人表皮生长因子受体2)或EpCAM的接头)插入到HSV的基因组中，使得融合蛋白在感染HSV的细胞中表达时，融合蛋白起诱导HSV靶向和感染表达HER2或EpCAM的细胞系的作用。此外，证实了，为了能够使用接头进行多重靶向，当能够表达融合蛋白(HER2scFv-HveA)(其为对HER2具有靶向功能的接头)的表达盒和能够表达融合蛋白(EpCAM-HveA)(其为对EpCAM具有靶向功能的接头)表达盒，经双重插入HSV基因组，使得融合蛋白在HSV感染的细胞中表达时，证实了融合蛋白通过多重靶向诱导HSV病毒体感染表达HER2和/或EpCAM的细胞系。此外，证实了重组HSV通过多重靶向感染表达HER2和/或EpCAM的细胞系，所述重组HSV能够通过将这种接头的表达盒插入HSV的基因组并进一步修饰糖蛋白而重靶向HER2和/或EpCAM。
发明内容
技术问题
因此，本公开考虑了相关技术中遇到的问题，并且本公开的目的是提供一种能够通过接头的多重表达进行多重靶向的重组HSV，所述接头是癌细胞靶向结构域和HVEM的细胞外结构域的融合蛋白。
本公开的另一个目的是提供一种重组HSV，其除了能够表达作为癌细胞靶向结构域和HVEM的细胞外结构域的融合蛋白的接头之外，还通过具有经修饰的糖蛋白而能够进行多重靶向，从而能够重靶向。
本公开的还一个目的是提供一种用于治疗癌症的药物组合物，该药物组合物含有重组HSV作为活性成分。
本公开的再一个目的是提供一种预防或治疗癌症的方法，该方法包括给对象(例如患者)施用有效量的药物组合物。
下面将阐述本公开的其它或具体目的。
技术方案
本公开的一个方面涉及能够多重靶向的重组HSV。在一个示例性方面，根据本公开的能够多重靶向的重组HSV可以被构建成，使得表达癌细胞靶向结构域(即特异性结合癌细胞表面上的靶分子的结构域)和HVEM的细胞外结构域的融合蛋白(即接头)的至少一个表达盒，被插入到单纯疱疹病毒的基因组中，从而以两种或更多种方式表达融合蛋白，即，不抑制单纯疱疹病毒增殖的多种方式。
在根据本公开的用于多重靶向的重组HSV中，融合蛋白以两种或更多种方式表达，即多种方式，由此以多种方式表达的融合蛋白的靶向结构域能够以多种方式靶向相同的靶分子或以多种方式靶向不同的靶分子。靶分子是融合蛋白的靶向结构域特异性识别和结合的癌细胞表面上存在的任何抗原或任何受体。本公开的重组HSV可以被构建成使得能够多重表达能够靶向靶分子(例如HER2)的融合蛋白的至少一个表达盒被插入其基因组中，或者使得能够表达能够靶向不同靶分子(例如HER2和EpCAM)中的每一个的融合蛋白的至少一个表达盒被插入其基因组中。
当本公开的重组HSV感染作为癌细胞的靶细胞并进入靶细胞时，HSV增殖，并且作为融合蛋白的接头以两种或更多种方式表达，即在细胞中以多种方式表达，并在细胞裂解时与增殖的HSV病毒体一起被释放到细胞外。或者，在接头具有前导序列的情况下，由于细胞裂解，它甚至可以在病毒体释放之前被释放。然后，以多种方式表达的接头被释放到细胞外，并以多种方式诱导HSV病毒体感染周围的癌细胞，所述癌细胞表达由接头的癌细胞靶向结构域识别的靶分子。由此，与单一靶向重组HSV(即仅含有一个能够表达癌细胞靶向结构域和HVEM的细胞外结构域的融合蛋白的表达盒的重组HSV)相比，其感染效率进一步提高，并且对周围癌细胞的连续增殖效率进一步提高，最终导致更有效的癌细胞死亡。
在另一个示例性方面，根据本公开的能够多重靶向的重组HSV可以是能够多重靶向的重组HSV，(i)其中至少一个能够表达接头的表达盒被插入到单纯疱疹病毒的基因组中，而不抑制单纯疱疹病毒的增殖，所述接头是癌症细胞靶向结构域和HVEM的细胞外结构域的融合蛋白，和(ii)其中癌细胞靶向结构域被插入并融合到其糖蛋白中。
根据本公开的用于多重靶向的重组HSV具有经修饰的糖蛋白，其能够通过插入和融合癌细胞靶向结构域而重新靶向，从而除了通过接头靶向之外，还能够通过糖蛋白实现额外的靶向。与上述具有能够以多种方式表达接头的表达盒的重组HSV一样，用于多重靶向的重组HSV对于用病毒体感染癌细胞、病毒体向周围癌细胞的连续增殖和癌细胞死亡的效率是更有效的。
通常，重组HSV是指，与野生型HSV相比，经基因操作，能够通过引入人工突变(通过删除、取代或插入一些核酸序列)而丧失或改变某些功能或表达感兴趣的靶蛋白的HSV。在本公开中，重组HSV是重组HSV是能够在感染的癌细胞中表达接头的HSV，并且通过将接头表达盒(即构建体，其中接头基因(adapter gene)与能够表达它的启动子序列和聚腺苷酸化信号序列可操作地连接)引入(即插入)HSV基因组中而不抑制HSV的增殖，从而提供用于重靶向的修饰的糖蛋白。
重组病毒生产技术，如病毒的基因操作和病毒体的生产是本领域众所周知的，可以参考Sandri-Goldin R.M.等人，[α疱疹病毒：分子和细胞生物学，Caister AcademicPress,2006],Robin H.Lachmann[单纯疱疹病毒基载体，国际实验病理学杂志(Int.J.Exp.Pathol.)，2004年8月；85(4):177-190]等。本说明书中引用的所有文献，包括上述文献，都被认为是本说明书的一部分。
特别地，除了被操作以表达接头之外，本公开的重组HSV还可以被操作以仅通过作为进入受体的HVEM受体，而非连接蛋白-1(nectin-1)进入细胞。在本公开的以下实施例中，操作HSV包膜糖蛋白gD的序列，以允许HSV仅通过HVEM受体进入细胞。具体地，gD的第222位的精氨酸(R)和gD的第223位的苯丙氨酸(F)分别被天冬酰胺(N)和异亮氨酸(I)取代，从而改变gD的功能。具有如此改变的gD功能的重组HSV可以仅通过HVEM(HveA)受体进入宿主细胞(Hiroaki Uchida等人，疱疹病毒入侵介质(HVEM)限制性单纯疱疹病毒1型突变病毒的产生：表达HVEM的细胞的抗性和拯救连接蛋白-1识别的突变的鉴定。病毒学杂志(J.Virol.)，2009年4月；83(7):2951-61)。HVEM(HveA)受体很少存在于正常细胞中，仅存在于淋巴瘤等中，而连接蛋白-1通常存在于正常细胞中，因此具有改变的gD功能的重组HSV(其只能通过HVEM受体而非连接蛋白-1受体进入细胞)不感染正常细胞，因此在抗癌治疗中的安全性方面是有利的。
此外，本发明的重组HSV经操作后，除了通过接头靶向之外，还能通过将癌细胞靶向结构域插入和融合到糖蛋白中实现额外的靶向。能够用于额外靶向的糖蛋白可以包括gB、gC、gH等，并且其中插入癌细胞靶向结构域并融合到糖蛋白中的HSV可以通过删除或不删除糖蛋白的一些基因，并将癌细胞靶向结构域的基因插入到开放阅读框来进行制备。在癌细胞靶向结构域的基因被插入到这种糖蛋白gH的基因中的情况下，当重组HSV以与糖蛋白融合的状态产生于细胞中时，癌细胞靶向结构域被整合到病毒体的包膜中。
癌细胞靶向结构域到糖蛋白中的插入和融合可以发生在糖蛋白中，例如gB、gC、gD、gH等，发生在糖蛋白的氨基酸序列未被删除的氨基酸序列的任何位置，发生在具有一定长度(特别是1至40个连续氨基酸)的氨基酸序列被删除的位置，或者发生在尽管具有一定长度的氨基酸序列被删除或取代但氨基酸序列未被删除或取代的氨基酸序列的任何位置。这里，为了使糖蛋白与特定细胞受体如HVEM、连接蛋白-1等的结合位点失活，可以对具有一定长度的氨基酸进行删除或取代。
当将癌细胞靶向结构域插入并融合到gB糖蛋白中时，其位置可以是包括N-端在内的位置，但是在HSV-1中，优选的位置可以是gB氨基酸序列(SEQ ID NO:1基因库登记号：ASM47779)中氨基酸9至896的区域内的任何位置。此外，优选的位置可以是氨基酸31至78的区域内的任何位置，氨基酸80至363的区域内的任何位置，或氨基酸408至896的区域内的任何位置。此外，优选的位置可以是氨基酸43之后的位置、氨基酸52之后的位置、氨基酸70之后的位置、氨基酸76之后的位置、氨基酸80之后的位置、氨基酸81之后的位置、氨基酸95之后的位置、氨基酸100之后的位置、氨基酸137之后的位置、氨基酸185之后的位置、氨基酸187之后的位置、氨基酸241之后的位置、氨基酸261之后的位置、氨基酸265之后的位置、氨基酸304之后的位置、氨基酸334之后的位置、氨基酸361之后的位置、氨基酸408之后的位置、氨基酸419之后的位置、氨基酸430之后的位置、氨基酸458之后的位置、氨基酸470之后的位置、氨基酸481之后的位置、氨基酸495之后的位置、氨基酸497之后的位置、氨基酸546之后的位置、氨基酸608之后的位置、氨基酸630之后的位置、氨基酸663之后的位置、氨基酸664之后的位置、氨基酸665之后的位置、氨基酸671之后的位置、氨基酸673之后的位置、氨基酸690之后的位置、氨基酸725之后的位置、氨基酸730之后的位置、氨基酸732之后的位置、氨基酸742之后的位置、氨基酸772之后的位置、氨基酸868之后的位置、氨基酸869之后的位置、氨基酸886之后的位置、氨基酸893之后的位置、氨基酸894之后的位置，或氨基酸895之后的位置。这里，该位置是基于gB的SEQ ID NO:1氨基酸序列，但是在gB序列有一些差异的突变菌株的情况下，它是基于与其对应的同源序列。
细胞靶向结构域被额外插入并融合到gC糖蛋白中时，其位置可以是包括N-端的任何位置，但在HSV-1中，优选的位置可以是gC氨基酸序列(SEQ ID NO:2基因库登记号(GenBank Accession No.)：ASM47796)中氨基酸1至442区域内的任何位置，此外，优选的位置可以是氨基酸33至154的区域内的任何位置。此外，优选的位置可以是gC的氨基酸33之后的位置、氨基酸82之后的位置、氨基酸148之后的位置、氨基酸149之后的位置，或氨基酸153之后的位置。这里，该位置是基于gC的SEQ ID NO:2氨基酸序列，但是在gC序列有一些差异的突变菌株的情况下，它是基于与之对应的同源序列。
将癌细胞靶向结构域插入并融合到gH糖蛋白中时，其位置可以是任何位置，包括N-端、H1A结构域的N-端等，但在HSV-1中，优选的位置可以是gH的氨基酸序列(SEQ ID NO:3，基因库登记号：ASM47773)中，氨基酸12至88区域内的位置，氨基酸116至137的区域内的位置，或氨基酸209至839的区域内的位置。此外，优选的位置可以是氨基酸12至49的区域内的位置，或氨基酸116至137的区域内的位置。此外，优选的位置可以是氨基酸12之后的位置，氨基酸22之后的位置，氨基酸23之后的位置，氨基酸29之后的位置、氨基酸83之后的位置、氨基酸116之后的位置、氨基酸209之后的位置、氨基酸215之后的位置、氨基酸225之后的位置、氨基酸277之后的位置、氨基酸386之后的位置、氨基酸437之后的位置、氨基酸447之后的位置、氨基酸472之后的位置、氨基酸636之后的位置、氨基酸637之后的位置、氨基酸666之后的位置、氨基酸731之后的位置、氨基酸763之后的位置、氨基酸764之后的位置、氨基酸775之后的位置、氨基酸806之后的位置、氨基酸824之后的位置，或氨基酸838之后的位置。这里，该位置是基于gH的SEQ ID NO:3的氨基酸序列，但是在gH序列有一些差异的突变菌株的情况下，它是基于与之对应的同源序列。
关于糖蛋白的优选插入位点的更具体信息，可以参见：JOHN R.GALLAGHER等人，[单纯疱疹病毒gB中的功能性荧光蛋白插入对执行膜融合前后gB构象的报告，PLOSPathog.，2014年9月，18,10(9):e1004373]；Gatta V.等人，[gH中新型配体的工程化赋予HSV扩增的趋向性，而与其受体的gD活化无关，PLOS Pathog.，2015年5月21日；11(5):e1004907]；Tina M.Cairns等人，[单纯疱疹病毒1型gD和gH-gL的结构-功能分析：来自gDgH嵌合体的线索，JOURNAL OF VIROLOGY，2003年6月,p.6731-6742]；E.U.Lorentzen等人，[表达自发荧光糖蛋白H融合蛋白的具有复制能力的单纯疱疹病毒1型突变体，Intervirology，2001；44:232-242]；Qing Fan等人，[单纯疱疹病毒1型糖蛋白B(gB)突变对细胞融合活性的不同影响取决于gD受体或gB受体是否过表达，JOURNAL OF VIROLOGY，2009年8月，83(15):7384-7390]；Erick Lin等人，[随机连接子插入诱变以识别单纯疱疹病毒1型糖蛋白B的功能结构域，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，2007年8月，104(32):13140-13145]；JuliaO.Jackson等人，[单纯疱疹病毒1型糖蛋白H的插入突变会降低细胞表面表达、减缓细胞融合速率，或消除细胞融合和病毒进入的功能，JOURNAL OF VIROLOGY，2010年2月，84(4):2038-2046]；Guoying Zhou等人，[工程化的单纯疱疹病毒1依赖于IL13R*2受体进入细胞，而不依赖于糖蛋白D受体的相互作用，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，2002年11月,99(23):15124-15129]；AR Frampton Jr.等人，[单纯疱疹病毒的运输和基因治疗载体的开发及其在神经系统中的应用，Gene Therapy，2005,12:891-901]；Paola Grandi等人，[为特异性结合细胞表面受体而设计的HSV-1病毒体，MOLECULAR THERAPY，2004年3月，9(3):419-427]；William F Goins等人，[单纯疱疹病毒(HSV)载体的重靶向，Curr.Opin.Virol.，2016年12月，21:93-101]；Xiaodan Wang等人，[通过含有嵌合HSV-1糖蛋白C-GDNF或gC-BDNF蛋白的无辅助病毒HSV-1载体颗粒将靶向基因转移至大鼠脑中的黑质纹状体神经元，BrainRes.Mol.Brain.Res.，2005年9月，139(1):88-102]等。
当癌细胞靶向结构域被插入并融合到糖蛋白中时，连接子肽(linker peptide)可以存在于癌细胞靶向结构域的N-端和C-端。连接子肽旨在确保癌细胞靶向结构域和糖蛋白之间的距离，使得与糖蛋白融合的癌细胞靶向结构域不会由于与糖蛋白融合而干扰其固有三维结构的形成。连接子肽可以是具有任何长度和任何序列的连接子肽，只要它具有特异性结合靶分子的能力。考虑到柔韧性(flexibility)、溶解性和对蛋白水解的抗性，连接子优选包含选自氨基酸如Ser、Gly、Ala、Thr等中的至少一个，其长度可以是1至30个氨基酸，优选3至25个氨基酸，更优选8至20个氨基酸。
本公开的重组HSV可以突变，从而删除HSV增殖(即存活和复制)所不需要的非必需基因，或使其不显示功能(即转录或翻译中断)。非必需基因的具体示例可以包括UL3基因(例如基因库登记号：AFE62830.1)、UL4基因(例如基因库登记号：AFE62831.1)、UL14基因(例如基因库登记号：AFE62841.1)、UL16基因(例如基因库登记号：AFE62843.1)、UL21基因(例如基因库登记号：AFE62848.1)、UL24基因(例如基因库登记号：AFE62851.1)、UL31基因(例如基因库登记号：AFE62859.1)、UL32基因(例如基因库登记号：AFE62860.1)、US3基因(例如基因库登记号：AFE62891.1)、UL51基因(例如基因库登记号：AFE62880.1)、UL55基因(例如基因库登记号：AFE62884.1)、UL56基因(例如基因库登记号：AFE62885.1、US2基因(例如基因库登记号：AFE62890.1)、US12基因(例如基因库登记号：AFE62901.1；ICP47基因)、LAT基因(例如基因库登记号：JQ673480.1)、gB基因(例如基因库登记号：GU734771.1的52996和55710之间的序列)、gL基因(例如基因库登记号：AFE62828.1)、gH基因(例如基因库登记号：AFE62849.1)、gD基因(例如基因库登记号：AFE62894.1)等。
关于HSV的非必需基因的更具体的信息，可以参见：D.M.Knipe和P.M.Howley(编辑)[野地病毒学(FieldsVirology)(第2卷)Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,Pa.，2001年，2399-2460页]；Subak-Sharpe J.H.和Dargan D.J.[HSV分子生物学：单纯疱疹病毒分子生物学病毒基因概述，1998,16(3):239-251]；Travis J.Taylor和David M.Knipe[单纯疱疹病毒复制室的蛋白质组学：细胞DNA复制、修复、重组和染色质重塑蛋白与ICP8的关联，J.Virol.，2004年6月；78(11):5856-5866]等。
本公开的重组HSV可以是重组HSV-1病毒、重组HSV-2病毒、或HSV-1/HSV-2嵌合病毒(即重组HSV，其中基因组含有衍生自HSV-1的DNA和衍生自HSV-2的DNA)，优选重组HSV-1病毒，更优选衍生自HSV-1KOS株的重组HSV-1。HSV-1KOS菌株可获自ATCC(目录号(Cat No)：VR1493TM)，该菌株的整个基因组序列被完全分析并表示于基因库登记号：JQ673480.1(Stuart J.Macdonald等人，单纯疱疹病毒1型Kos株的基因组序列，J.Virol.，2012年6月，86(11):6371-2)。
HSV-1病毒的基因组由152kb的双链线性DNA组成，该双链线性DNA编码总共84个基因，并包括彼此连接的两个片段，特别是长片段(L区)和短片段(S区)。长片段(L区)约占基因组的82％，短片段(S区)约占基因组的18％，长片段和短片段经由两个IRLs(中间反向重复序列)连接，它们是连接区域，并且TRL(末端反向重复片段)存在于每个片段的末端。L区(UL)包含56个UL1-UL56基因和10个基因(UL8.5、9.5、10.5、12.5、15.5、20.5、26.5、27.5、43.5和49.5)，S区(US)包含12个US1-US12基因和2个基因(US1.5和8.5)，作为连接区的两个IRL包含4个基因(ICP4、ICP34.5、ICP0和LAT)。
在本公开中，接头表达盒构被构建成使得接头基因与能够表达它的基因的启动子序列和聚腺苷酸化信号序列可操作地连接，所述聚腺苷酸化信号序列是转录终止信号序列。这里，“可操作地连接”是指能够转录和/或翻译经表达的接头基因的连接。例如，当任何启动子影响与其连接的接头基因的转录时，该启动子被认为与接头基因可操作地连接。
通常，启动子是具有控制一个或多个基因转录功能的核酸序列，位于基因转录起始位点的上游(5'侧)，并包括与DNA依赖性RNA聚合酶结合的位点、转录起始位点、转录因子结合位点等。在真核生物来源的情况下，启动子包括转录起始位点上游的TATA盒(通常位于转录起始位点(+1)的-20至-30位)、CAAT盒(通常位于转录起始位点的-75位)、增强子、转录因子结合位点等。
只要启动子能够表达与其连接的靶基因，可以使用所有组成型启动子(其在所有时间诱导基因表达)、诱导型启动子(其响应于特定外部刺激诱导靶基因的表达)、组织特异性启动子(其在特定组织或细胞中诱导基因表达)、组织非特异性启动子(其在所有组织或细胞中诱导基因表达)、内源启动子(来源于病毒感染细胞)和外源启动子(来源于病毒感染细胞以外的细胞)。许多启动子是本领域已知的，可以从中选择并使用合适的启动子。例如，有用的是CMV(cytomegalovirus，巨细胞病毒)启动子、RSV(Rous sarcoma virus，劳斯肉瘤病毒)启动子、HSV(herpes simplex virus，单纯疱疹病毒)TK(thymidine kinase，胸苷激酶)启动子、腺病毒晚期启动子、牛痘病毒75K启动子、SV40启动子、金属硫蛋白启动子、CD45启动子(造血干细胞特异性启动子)、CD14启动子(单核细胞特异性启动子)，和癌细胞特异性启动子(肿瘤特异性启动子)，例如Survivin、Midkine、TERT、CXCR4等。特别地，当使用癌细胞特异性启动子时，仅在癌细胞中诱导靶基因的表达，从而抑制靶基因在正常细胞中的表达，从而增加了本公开的重组HSV的安全性。
接头表达盒被构建为包括除启动子之外的转录终止信号序列，所述转录终止信号序列是充当聚(A)添加信号(聚腺苷酸化信号)以增加转录的完整性和效率的序列。许多转录终止信号序列是本领域已知的，可以从中选择并使用合适的序列，例如SV40转录终止信号序列、HSV TK(单纯疱疹病毒胸苷激酶)转录终止信号序列等。
将接头表达盒插入HSV基因组中，用于其表达而不抑制HSV的增殖，并且可以在不删除HSV基因组的情况下进行这种插入，或者可以插入到删除了HSV基因组中一些或所有非必需基因的基因位点中。当接头表达盒被插入到没有删除的HSV基因组时，可以被插入到基因之间。插入基因位点的优选示例包括UL3和UL4基因之间的基因位点、UL26和UL27基因之间的基因位点、UL37和UL38基因之间的基因位点、UL48和UL49基因之间的基因位点、UL53和UL54基因之间的基因位点、US1和US2基因之间的基因位点等。
当接头表达盒被插入到删除了HSV基因组中一些或所有非必需基因的基因位点中时，被删除的非必需基因可以是任何非必需基因，如上所述。
为了以多种方式表达接头，可以将至少一个具有多顺反子构型的接头表达盒插入HSV基因组中，或者可以将至少两个具有单顺反子构型的接头表达盒插入HSV基因组中。
除了启动子和转录终止信号序列之外，具有多顺反子构型的接头表达盒在其间包括至少两个接头基因，并且在这些基因之间，定位编码IRES(内部核糖体进入位点)或2A肽的核酸序列以便能够表达每种蛋白质。这里，2A肽是从小核糖核酸病毒和昆虫病毒C型轮状病毒中识别的，2A肽的优选示例包括东亚细亚病毒(Thosea asigna virus)的2A(T2A)、猪捷申病毒1型(porcine teschovirus-1)的2A(P2A)、ERAV的2A(马鼻炎A病毒)(E2A)、FMDV(口蹄疫病毒)的2A(F2A)等。关于IRES或2A肽的具体信息，可以参见：Renaud-Gabardos等人编辑，[用于联合基因治疗的基于内部核糖体进入位点的载体，World J.Exp.Med.，2015年2月，20；5(1):11-20]；Szymczak等人，[在多顺反子载体的设计中开发基于2A肽的策略，(2005)Expert Opin.Biol.Ther.，5:627-638]；Kim等人，[在人细胞系、斑马鱼和小鼠中对来自猪捷申病毒1型的2A肽的高切割效率，(2011)PLOS One，6(4):e18556]等。
为了以多种方式表达接头，当接头表达盒具有单顺反子构型时，将至少两个接头表达盒插入HSV基因组中。这里，至少两个接头表达盒可以连续插入HSV基因组中的相同基因位点，或者可以插入不同的相应基因位点处。例如，靶分子HER2的接头表达盒和靶分子EpCAM的接头表达盒可插入UL3和UL4基因之间的相同基因位点，或者，靶分子HER2的接头可插入UL3和UL4基因之间，靶分子EpCAM的接头可插入UL26和UL27基因之间，作为不同的基因位点。当至少两个接头表达盒在相同的位点被连续插入时，可以在表达盒之间插入非编码区。非编码区用于防止至少两个表达盒干扰表达(转录和/或翻译)，并且非编码区可以包含3-60个核苷酸。
在本公开中，当需要以多种方式表达三种或更多种类型的接头时，可以将具有能够表达两种类型接头的多顺反子构型的接头表达盒和具有能够表达其余接头的单顺反子构型的接头表达盒一起插入HSV基因组中的相同位点或不同位点。
在本公开的重组HSV中，接头的癌细胞靶向结构域是特异性识别并结合癌细胞的靶分子的位点，所述癌细胞是靶细胞，并且由癌细胞靶向结构域识别的靶分子是存在于癌细胞表面上的任何抗原或任何受体。
抗原或受体优选是仅在癌细胞中表达或与正常细胞相比在癌细胞中过表达的抗原或受体。抗原或受体的示例可包括靶分子，例如在成胶质细胞瘤中表达的EGFRvIII(表皮生长因子受体变体III)；在未分化型甲状腺癌、乳腺癌、肺癌、神经胶质瘤等中过表达的EGFR(表皮生长因子受体)；在乳头状甲状腺癌等中过表达的转移素受体(转移素受体)；在乳腺癌等中过表达的基于ErbB的受体酪氨酸激酶；在乳腺癌、膀胱癌、胆囊癌、胆管癌、食道胃交界部癌(esophagogastric junction cancer)等中过表达的HER2(人表皮生长因子受体2)；在肉瘤样肾癌等中过表达的酪氨酸激酶-18-受体(tyrosine kinase-18-receptor，c-Kit)；在食管腺癌等中过表达的HGF受体c-Met；在乳腺癌等中过表达的CXCR4或CCR7；在前列腺癌中过表达的内皮素-A受体；在直肠癌等中过表达的PPAR-δ(过氧化物酶体增殖物激活受体δ)；在卵巢癌等中过表达的PDGFR-α(血小板衍生生长因子受体α)；在肝癌、多发性骨髓瘤等中过表达的CD133；在肺癌、结肠直肠癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、直肠癌、结肠癌、甲状腺髓样癌等中过表达的CEA(癌胚抗原)；在肝癌、胃癌、结肠直肠癌、胰腺癌、乳腺癌等中过表达的EpCAM(上皮细胞粘附分子)；在肺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌等中过表达的MSLN(间皮素)；在神经母细胞瘤等中过表达的GD2(二唾液酸神经节苷脂)；在肝细胞癌等中过表达的GPC3(磷脂酰肌醇蛋白聚糖3)；在前列腺癌等中过表达的PSMA(前列腺特异性膜抗原)；在卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、胰腺癌等中过表达的TAG-72(肿瘤相关糖蛋白72)；在黑色素瘤等中度表达的GD3(二唾液酸神经节苷脂)；在血癌、实体癌等中过表达的HLA-DR(人白细胞抗原-DR)；在晚期实体癌等中过表达的MUC1(粘蛋白1)；在晚期非小细胞肺癌等中过表达的NY-ESO-1(纽约食管鳞状细胞癌1)；在鼻咽肿瘤等中过表达的LMP1(潜伏膜蛋白1)；在肺癌、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、结肠癌、结肠直肠癌、胰腺癌等中过表达的TRAILR2(肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体)；在肝细胞癌等中度表达的作为血管生成因子受体的VEGFR2(血管内皮生长因子受体2)和HGFR(肝细胞生长因子受体)。此外，癌症干细胞的表面抗原，例如CD44、CD166等，可以是靶分子。与正常细胞相比，在癌细胞中过表达的许多靶分子是本领域已知的，对于除上述示例之外的其它靶分子，可以参见Anne T.Collins等人，[致瘤性前列腺癌干细胞的前瞻性鉴定，Cancer Res.，2005年12月1日，65(23):10946-51]；Chenwei Li等人，[胰腺癌干细胞的鉴定，Cancer Res.，2007年2月1日，67(3):1030-7]；Shuo Ma等人，[CAR-T细胞治疗实体肿瘤的研究进展，Int.J.Biol.Sci.，2019年9月，7；15(12):2548-2560]；Dhaval S.Sanchala等人，[溶瘤性单纯疱疹病毒治疗：朝着选择性靶向癌细胞的方向迈进，Front Pharmacol.，2017年5月16日，8:270]等。
特别地，在本公开中，靶分子优选是HER2或EpCAM。
由本公开的重组HSV的接头靶向的靶细胞是具有能够被本公开的接头的癌细胞靶向结构域靶向的靶分子的任何癌细胞。癌细胞可以是任何类型的癌，例如食道癌、胃癌、结肠直肠癌、直肠癌、口腔癌、鼻咽癌(pharyngeal cancer)、喉癌(laryngeal cancer)、肺癌、结肠癌、乳腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、黑色素瘤、膀胱癌、肾癌、肝癌、胰腺癌、骨癌、结缔组织癌、皮肤癌、脑癌、甲状腺癌、白血病、霍奇金病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、血癌等。
在本公开中，除了具有特异性结合靶分子的能力的完整抗体之外，接头的细胞靶向结构域可以是抗体衍生物或抗体类似物。抗体衍生物是完整抗体的片段，其包括至少一个具有特异性结合靶分子的能力的抗体可变区，或者是修饰的抗体。抗体衍生物的示例可包括抗体片段，例如Fab、scFv、Fv、VhH、VH、VL等，多价或多特异性修饰的抗体，如Fab2、Fab3、微抗体、双抗体、三抗体、四抗体，双scFv等。抗体类似物是一种人工肽或多肽，其具有与靶分子(如抗体)特异性结合的能力，但在结构上与抗体不同，并且通常具有比抗体更低的分子量。抗体类似物的示例可以包括ABD、Adhiron、affibodies、affilins、affimers、阿尔法体(alphabodies)、Anticalin、armadillo重复蛋白、centririns、DARPins、fynomers、Kunitz区域、ProNectin、repebody等。
本领域中已经发表了大量关于抗体、抗体衍生物、抗体类似物及其生产的文献，其示例包括Renate Kunert&David Reinhart[Readvances in recombinant antibodymanufacturing。重组抗体制造进展，Appl.Microbiol.Biotechnol.，2016年4月，100(8):3451-61]；Holliger P.和Hudson P.J.[工程化抗体片段和单结构域的出现，Nat.Biotechnol.，2005年9月，23(9):1126-36]；Xiaowen Yu等人，[除了抗体作为结合配偶体：抗体模拟物在生物分析中的作用，Annual Review of Analytical Chemistry，2017,10:293-320]；Abdul Rasheed Baloch等人，[抗体模拟物：动物来源的抗体的有希望的互补剂，Critical Reviews in Biotechnology，2016,36:268-275]等。
在本公开中，接头的细胞靶向结构域优选是scFv(单链可变片段)。scFv是一种单链抗体，其中免疫球蛋白的重链可变区(heavy-chain variable region，VH)和轻链可变区(light-chain variable region，VL)经由短连接子肽连接。在scFv中，VH的C-端与VL的N-端连接，或者VL的C-端与VH的N-端连接。在scFv中，连接子肽可以是具有任何长度和任何序列的连接子肽，只要它不干扰重链和轻链的固有三维结构，并能使重链和轻链在空间上彼此相邻，从而具有特异性结合靶分子的能力。考虑到柔韧性(flexibility)、溶解性和对蛋白水解的抗性，连接子优选包含选自氨基酸如Ser、Gly、Ala、Thr等中的至少一个，其长度可以是1至30个氨基酸，优选3至25个氨基酸，更优选8至20个氨基酸。
在本公开中，scFv靶向的靶分子是HER2或EpCAM。具体而言，HER2的scFv优选被构建成使得SEQ ID NO:4的VH和SEQ ID NO:5的VL经由连接子肽按照VH、连接子肽和VL的顺序连接(即VH的C-端经由连接子肽连接到VL的N-端)，EpCAM的scFv优选被构建成使得SEQ IDNO:6的VL和SEQ ID NO:7的VH经由连接子肽按照VL、连接子肽和VH的顺序连接(即，VL的C-端经由连接子肽连接到VH的N-端)。
在本公开中，HVEM的细胞外结构域可以是SEQ ID NO：10的HveA87(包含前导序列的HveA87序列在SEQ ID NO：11中表示)、SEQ ID NO：12的HveA102(包含前导序列的HveA102序列在SEQ ID NO：13中表示)，或SEQ ID NO：14的HveA107(包含前导序列的HveA107序列在SEQ ID NO：15中表示)，这在韩国专利KR10-0937774和美国专利US8318662中公开(这些文献被认为是本说明书的一部分)，此外还有SEQ ID NO:8的HveA82(包含前导序列的HveA82序列在SEQ ID NO:9中表示)，用于以下实施例。包含在SEQ ID NOs:9、11、13和15序列中的前导序列是HveA的信号肽序列。HveA87、HveA102和HveA107分别进一步包含比HveA82多5个、20个和25个氨基酸，所有这些可以用作接头的HSV受体，如在上述韩国专利和美国专利中所证实的。
在本公开中，连接子序列可以插入HVEM的癌细胞靶向结构域和细胞外结构域之间，并且该连接子序列可以是具有任何长度和任何序列的连接子，只要它不抑制接头的每个结构域的功能。优选地，连接子包含四个氨基酸Ser、Gly、Ala、Thr中的至少一个氨基酸，其长度可以是1至30个氨基酸，优选3至25个氨基酸，更优选8至20个氨基酸。
此外，本公开的接头可以按照NH2/癌细胞靶向结构域/HVEM的细胞外结构域/COOH的顺序被构建，或按照与其相反的顺序被构建。当连接子肽插入其间时，接头可以按照NH2/癌细胞靶向结构域/HVEM的细胞外结构域/COOH的被构建，或按照与其相反的顺序被构建。
本公开的接头可以被被构建成使得前导序列(即分泌诱导信号序列)可以进一步连接到其N-端，特别是在接头构型中，按照NH2/癌细胞靶向结构域/连接子肽/HVEM的细胞外结构域/COOH的顺序连接到癌细胞靶向结构域的N-端(当使用scFv时是VH或VL的N-端)，或是在接头构型中，按照NH2/HVEM的细胞外结构域/连接子肽/癌细胞靶向结构域的顺序连接到HVEM的细胞外结构域的N-端。前导序列是具有诱导在细胞质中表达的蛋白质通过细胞膜分泌到细胞外的功能的序列，通常包含约15至30个连续的疏水性氨基酸残基。可以使用的前导序列没有特别限制，但是可以是存在于分泌到细胞膜外的蛋白质的N-端的任何序列，例如HveA的前导序列、抗体可变区VL(kaapa)的前导序列、组织纤溶酶原激活物(t-PA)的前导序列、血清白蛋白的前导序列、乳铁蛋白的前导序列、α-酪蛋白的前导序列、包括人生长激素在内的各种激素的前导序列、酵母或细菌分泌的多肽的前导序列等。
前导序列是用于诱导接头在靶细胞中的表达并将接头释放到细胞外的序列，可以被省略，因为接头仅在靶细胞裂解和HSV释放后才用于HSV诱导相邻靶细胞的感染。
在本公开中，为了便于克隆，当靶分子的scFv用作细胞靶向结构域时，可以将对应于任意限制性内切酶位点的氨基酸插入VH和VL之间；当连接子肽位于VH和VL之间时，可以将对应于任意限制性内切酶位点的氨基酸插入到VH或VL和连接子肽之间；当连接子肽位于scFv和HVEM之间，或位于连接子和HVEM之间时，可以将对应于任意限制性内切酶位点的氨基酸插入到scFv和HVEM之间，或插入到scFv和连接子之间。例如，限制性内切酶EcoRI作用于其上的EF(碱基序列：GAATTC)，或BamHI作用于其上的GS(碱基序列：GGATCC)，或XhoI作用于其上的LEE1(碱基序列：CTCGAGGAGCTC)可以插入其间。
在本公开中，为了单独或以任何组合形式表达用于诱导或增强对癌细胞的免疫应答的因子，重组HSV可以被构建成使得相应因子的基因被插入HSV基因组中。可以操作这些因子以表达细胞因子、趋化因子、免疫检查点拮抗剂(例如抗体、抗体衍生物或抗体类似物，尤其是scFv)；能够诱导免疫细胞(T细胞或NK细胞)活化的共刺激因子；能够抑制TGFβ功能的拮抗剂，其抑制对癌细胞(例如抗体、抗体衍生物或抗体类似物，尤其是scFv)的免疫应答；能够降解用于实体肿瘤微环境的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的肝素酶；能够抑制血管生成因子受体VEGFR-2(VEGF受体-2)功能的拮抗剂(例如抗体、抗体衍生物或抗体类似物，尤其是scFv)等。
作为细胞因子，例如，白介素如IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-24等，干扰素如IFNα、IFNβ、IFNγ等，肿瘤坏死因子如TNFα等，以及集落刺激因子如GM-CSF、G-CSF、FLT3L等，可以单独使用或以其两种或多种的任意组合使用，以便在重组HSV中表达。
作为趋化因子，例如，CCL2(C-C基序趋化因子配体2)、CCL5(RANTES)、CCL7、CCL9、CCL10、CCL12、CCL15、CCL19、CCL21、CCL20和XCL-1(X-C基序趋化因子配体1)，可以单独或结合使用，以便在重组HSV中表达。
作为免疫检查点抗体、PD-1(程序性死亡受体1(programmed cell death 1))、PD-L1(程序性死亡受体配体1(programmed cell death ligand 1))、PD-L2(程序性死亡受体配体2)、CD27(分化簇27)、CD28(分化簇28)、CD70(分化簇70)、CD80(分化簇80)、CD86(分化簇86)、CD137(分化簇137)、CD276(分化簇276)、KIR(杀伤细胞免疫球蛋白样受体)、LAG3(淋巴细胞活化基因3)、GITR(糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白)、GITRL(糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白配体)和CTLA-4(溶细胞性T淋巴细胞相关抗原-4)的拮抗剂，可以单独或结合使用，以便在重组HSV中表达。
作为共刺激因子，CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、LFA-1(淋巴细胞功能相关抗原-1)、ICOS(诱导型T细胞共刺激物)、CD3γ、CD3δ和CD3ε，可以单独或结合使用，以便在重组HSV中表达。
在本公开中，可以操作重组HSV以表达一种前药活化酶，该酶将前药转化为对癌细胞显示毒性的药物。前药活化酶的示例可包括胞嘧啶脱氨酶，其将作为前药的5-FC(5-氟胞嘧啶)转化为作为药物的5-FU(5-氟尿嘧啶)；大鼠细胞色素P450(CYP2B1)，其将作为前药的CPA(环磷酰胺)转化为作为药物的PM(磷酰胺芥)；羧酸酯酶，其将作为前药的依立替康(SN-38150)转化为作为药物的SN-38；细菌硝基还原酶，其将作为前药的BC1954转化为作为DNA交联剂的4-羟胺151；分离自大肠杆菌的PNP(嘌呤核苷磷酸化酶)，其将作为前药的6-甲基嘌呤-2’-脱氧核糖苷转化为作为药物的6-甲基嘌呤，等等。
此外，在本公开中，可以操作重组HSV以表达TRAIL(TNF相关的细胞凋亡诱导配体)。已知TRAIL通过与其受体结合来诱导癌细胞的死亡，该受体在癌细胞中过表达(KaoruTamura等人，多机制肿瘤靶向溶瘤病毒克服脑肿瘤中的耐药性，Mol.Ther.，2013年1月，21(1):68-77)。
关于使用因子或前药活化酶来诱导或增强这些免疫应答的更多细节，可以参见如下文献：Michele ardolino等人，[癌症免疫疗法中的细胞因子治疗，J.Oncotarget,Oncotarget.，2015年8月14日，6(23)]；Bernhard Homey等人，[趋化因子：癌症免疫治疗的试剂，Nat.Rev.Immunol.，2002年3月，2(3):175-84]；Marianela Candolfi等人，[评估在多形性胶质母细胞瘤(GBM)的免疫刺激基因治疗方法中与Flt3L结合使用的促凋亡转基因，J.FASEB J.，2008,22:107713]；Danny N Khalil等人，[癌症治疗的未来：免疫调节、CARs和联合免疫治疗，Nat.Rev.Clin.Oncol.，2016年5月，13(5):273-90]；Paul E.Hughes等人，[靶向疗法和检查点免疫疗法结合用于癌症治疗的]，Trends Immunol.，2016年7月，37(7):462-476]；Cole Peters和Samuel D.Rabkin[将疱疹病毒设计成溶瘤剂，Mol.Ther.Oncolytics.，2015；2:15010]等。
在本公开中，如在前述接头中，用于诱导或增强免疫应答的因子或前药活化酶被构建成使得其基因的表达盒(expression cassette)(即，其中其基因与启动子序列(使其能够表达)和多聚腺苷酸化信号序列可操作地连接的构建体)被插入HSV基因组中而不抑制HSV的增殖。这种插入可以在不删除HSV基因组的情况下进行，或者可以插入到删除了HSV基因组中一些或所有非必需基因的基因位点中。这里，在没有删除HSV基因组的情况下插入时，可以在基因之间进行插入，优选的插入位点是例如UL3和UL4之间、UL26和UL27之间、UL37和UL38之间、UL48和UL49之间、UL53和UL54之间以及US1和US2之间。当插入删除了非必需基因的基因位点或没有删除非必需基因的基因中时，如上所述，这种非必需基因可以选自任何非必需基因。
本公开的另一方面涉及一种用于治疗癌症的药物组合物，其含有上述重组HSV作为活性成分。
本公开的药物组合物对表达由重组HSV表达的接头的靶向结构域靶向的靶分子的癌具有抗癌作用。癌瘤的示例如上文关于靶分子所述。
特别地，优选本公开的组合物对具有表达HER2或EpCAM的肿瘤细胞的癌具有抗癌作用。表达HER2的肿瘤细胞的示例包括乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、胃癌细胞、肺癌细胞、头颈癌细胞、骨肉瘤细胞、多形性胶质母细胞瘤细胞、唾液腺肿瘤细胞等。此外，表达EpCAM的肿瘤细胞的示例包括肝癌细胞、前列腺癌细胞、乳腺癌细胞、结肠直肠癌细胞、肺癌细胞、胆囊癌细胞、胰腺癌细胞、胃癌细胞等。
在本公开中，抗癌作用包括癌细胞的死亡、癌细胞的生存力降低、由于抑制癌细胞增殖而导致的癌症的病理学症状的抑制或延迟、抑制或延迟这种病理学症状的发作、抑制癌症转移和抑制癌症复发。
除了作为活性成分的重组HSV之外，本公开的药物组合物还可以包括重组接头分子(recombinant adapter molecule)。重组接头分子是这样的分子，其中通过重组过程产生具有癌细胞靶向结构域的融合蛋白，如在重组HSV表达的接头中，或更确切地，如在癌细胞靶向结构域和HVEM的细胞外结构域的融合蛋白中。这里，在重组HSV表达的接头中具有癌细胞靶向结构域是指，当HSV表达的接头的癌细胞靶向结构域靶向的靶分子是HER2时，接头分子的癌细胞靶向结构域靶向的靶分子也是HER2。使用重组方法生产感兴趣的靶蛋白的方法通常包括制备能够表达靶蛋白的表达载体，并将该表达载体转化为宿主细胞，例如大肠杆菌、酵母或动物细胞(CHO细胞、NSO细胞、BHK细胞、Sp2细胞或HEK-293细胞)，随后培养，然后分离靶蛋白，使用重组方法生产感兴趣的靶蛋白的方法是本领域众所周知的(Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor LaboratoryPress)，(2001))。特别地，关于本公开中使用的重组接头分子的生产，可以参考如下文献：韩国专利KR10-0937774和美国专利US8318662。本公开的药物组合物还包括这样的重组接头分子，因此，当作为本公开的活性成分的重组HSV和重组接头分子一起施用于患者时，有效地提高了重组HSV的初始癌细胞感染效率。
此外，本公开的药物组合物可以与批准的抗癌剂结合使用或混合使用。抗癌剂的示例可包括任何抗癌剂、任何细胞因子药物、任何抗体药物、任何免疫检查点抑制剂药物，和任何对癌细胞表现出细胞毒性的细胞治疗剂(用于嵌合抗原受体T细胞疗法(嵌合抗原受体T细胞疗法)或CAR-NK细胞疗法)，例如代谢拮抗剂、烷化剂、拓扑异构酶拮抗剂、微管拮抗剂和植物衍生的生物碱。其具体示例可包括紫杉醇、氮芥、伊马替尼、奥沙利铂、吉非替尼、硼替佐米、舒尼替尼、卡铂、顺铂、利妥昔单抗、埃罗替尼、索拉非尼、IL-2药物、IFN-α药物、IFN-γ药物、曲妥单抗、博纳吐单抗(blinatumomab)、伊匹木单抗(ipilimumab)、帕博利珠单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)、阿替利珠单抗(atezolizumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、替沙仑赛(tisagenlecleucel)(Kymriah)、阿基仑赛(axicabgene ciloleucel)(YESCARTA)等。除了示例性抗癌剂之外，本领域已知的其它抗癌剂可以可以无限制地与本公开的药物组合物结合或混合使用。
本公开的药物组合物可以包括药学上可接受的载体或赋形剂，因此可以根据给药途径通过本领域已知的典型方法制备成口服制剂或肠胃外制剂的形式。
这种药学上可接受的载体或赋形剂不会损害药物的活性或性质，并且其本身对人体没有毒性，其示例可以包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水(例如盐水和无菌水)、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油、林格氏溶液、缓冲液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇、葡聚糖、白蛋白及其任意组合。特别地，当将本公开的药物组合物配制成液体溶液的形式时，合适的载体或赋形剂可以包括盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、白蛋白注射溶液、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油和乙醇，其可以单独或结合使用。如果需要，可以加入并使用其它典型的药物添加剂，例如抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂等。
当将本公开的药物组合物制备成口服制剂时，其可以制成片剂、锭剂、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂、糯米纸囊剂(wafer)等形式，当制备成肠胃外制剂，尤其是注射剂时，其可以制成单位剂量安瓿或多剂量形式。本公开的药物组合物还可以制备成溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂等的形式。
根据制药领域的典型方法，本公开的药物组合物可以配制成适于施用至患者身体的单位剂型，并且可以通过口服给药途径或肠胃外给药途径给药，例如皮肤、病灶内、静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、肺部、透皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下、阴道内和直肠途径，使用本领域中常用的任何给药方法。
本公开的药物组合物的剂量(有效量)可以根据诸如配制方法、给药方式、患者的年龄、体重和性别、病理学状况、饮食、给药时间、给药途径、排泄率和反应敏感性等因素而变化，可以由本领域技术人员考虑这些因素而适当地确定。在一个优选的实施方式中，本公开的药物组合物被制备成单位剂型的注射剂。当制备成单位剂型的注射剂时，每单位剂量的本公开的药物组合物中包含的重组HSV的量可以为102至1014pfu，特别是104至1011pfu。
本公开的又一方面涉及治疗或预防癌症(肿瘤)的方法，包括将有效量的含有上述重组HSV的药物组合物施用于对象如患者。
通过裂解和杀死具有由重组HSV的接头的癌细胞-靶向结构域靶向的靶分子的癌细胞，使得治疗癌症的方法成为可能。因此，本公开的治疗方法可应用于具有这种靶分子的任何癌症。特别地，本公开的治疗方法优选地应用于表达HER2或EpCAM的癌。
本公开的治疗方法可以无限制地与上述其他癌症治疗方法结合使用。例如，如上所述，细胞毒性抗癌剂、细胞因子药物、抗体药物、免疫检查点抑制剂药物、细胞治疗剂(用于CAR-T细胞疗法或CAR-NK细胞疗法)，放射疗法、手术等，可以在施用本公开的药物组合物之前或之后使用，或者以与本公开的药物组合物组合同时施用的方式使用。
在本公开的治疗方法中，有效量是当基于医学专家的建议在给药期间将本公开的药物组合物施用于对象(例如患者)时，施用本公开的药物组合物以表现预期的医学效果(例如，癌症治疗或预防效果)的量。如上所述，这种有效量可以由本领域技术人员(例如医学专家等)适当地确定，这取决于患者的年龄、体重和性别、病理状况等，如上所述。
在本公开的治疗方法中，药物组合物优选以注射的形式以肠胃外给药的方式施用于患者，例如病灶内(肿瘤内)、静脉内、肌内或动脉内给药等。
有益效果
根据本公开，有可能提供一种通过接头(其是癌细胞靶向结构域和HVEM细胞外结构域的融合蛋白)的多重表达而能够多重靶向的重组HSV，还可以提供一种重组HSV，除了能够表达作为癌细胞靶向结构域和HVEM的细胞外结构域的融合蛋白的接头之外，还能够通过具有经修饰的糖蛋白进行多重靶向，从而能够进行重靶向。
此外，根据本公开，可以提供一种用于癌症治疗或预防的药物组合物，该药物组合物包含能够多重靶向的重组HSV作为活性成分，以及预防或治疗癌症的方法，该方法包括给对象(例如患者)施用有效量的药物组合物。
与单一靶向HSV相比，根据本公开的能够多重靶向的重组HSV具有高癌细胞感染效率和高癌细胞杀伤功能。
附图简要说明
图1示意性地示出了KOS-37BAC的基因组结构；
图2示意性地示出了HVEM限制性HSV-1病毒的基因组结构；
图3示意性地示出了表达EmGFP的HVEM限制性HSV-1病毒的基因组结构；
图4显示表达EmGFP的HVEM限制性HSV-1病毒的荧光表达和具有HVEM受体的细胞的特异性感染的结果；
图5示意性地示出了表达HER2-靶向接头的HSV-1病毒、表达EpCAM-靶向接头的HSV-1病毒和表达HER2/EpCAM双靶向接头的HSV-1病毒中的每一个的基因组结构；
图6示出了HER2scFv-HveA接头和EpCAMscFv-HveA接头的完整序列以及相应序列的构型；
图7示意性地示出了(i)具有HER2-靶向修饰的糖蛋白gH的单一靶向病毒和(ii)具有HER2靶向修饰的糖蛋白gH并表达HER2-靶向接头的HER2双靶向HSV-1病毒中的每一个的基因组结构；
图8示出了插入并融合到gH中的HER2scFv配体的完整氨基酸序列和相应序列的构型；
图9示意性地示出了(i)具有EpCAM-靶向修饰的糖蛋白gH的单一靶向病毒和(ii)具有EpCAM-靶向修饰的糖蛋白gH并表达EpCAM-靶向接头的EpCAM双靶向HSV-1病毒中的每一个的基因组结构；
图10示出了插入并融合到gH中的EpCAMscFv配体的完整氨基酸序列和相应序列的构型；
图11示出了在Vero-HVEM细胞和SK-OV-3细胞中，表达荧光蛋白EmGFP并仅使用HVEM作为细胞受体使细胞进入的的病毒(gDm)、表达HER2scFv-HveA接头的病毒(HADa-S)、在gH中具有HER2scFv配体的病毒(HgH-S)，以及在gH中具有HER2scFv配体并表达HER2scFv-HveA接头的双靶向病毒(HADa-HgH-D)的增殖的测量结果；
图12示出了在Vero-HVEM细胞中，表达荧光蛋白EmGFP并仅使用HVEM作为细胞受体使细胞进入的的病毒(gDm)、表达HER2scFv-HveA接头的病毒(HADa-S)、在gH中具有HER2scFv配体的病毒(HgH-S)，以及在gH中具有HER2scFv配体并表达HER2scFv-HveA接头的双靶向病毒(HADa-HgH-D)的增殖的测量结果；
图13示出了在Vero-HVEM细胞和SK-OV-3细胞中，表达荧光蛋白EmGF并仅使用HVEM作为细胞受体使细胞进入的的病毒(gDm)、表达HER2scFv-HveA接头的病毒(HADa-S)、在gH中具有HER2scFv配体的病毒(HgH-S)，以及在gH中具有HER2scFv配体并表达HER2scFv-HveA接头的双靶向病毒(HADa-HgH-D)的表达水平的测量结果；
图14示出了特异性感染的结果，该特异性感染取决于在SK-OV-3细胞等中，表达荧光蛋白EmGF并仅使用HVEM作为细胞受体使细胞进入的的病毒(gDm)、表达HER2scFv-HveA接头的病毒(HADa-S)、在gH中具有HER2scFv配体的病毒(HgH-S)，以及在gH中具有HER2scFv配体并表达HER2scFv-HveA接头的双靶向病毒(HADa-HgH-D)的HER2的表达；
图15示出了特异性细胞死亡的结果，该特异性细胞死亡取决于在SK-OV-3细胞等中，表达荧光蛋白EmGF并仅使用HVEM作为细胞受体使细胞进入的的病毒(gDm)、表达HER2scFv-HveA接头的病毒(HADa-S)、在gH中具有HER2scFv配体的病毒(HgH-S)，以及在gH中具有HER2scFv配体并表达HER2scFv-HveA接头的双靶向病毒(HADa-HgH-D)的HER2的表达；
图16示出了在动物实验中，通过在gH中具有HER2scFv配体并表达HER2scFv-HveA接头的双靶向病毒(HADa-HgH-D)抑制肿瘤的结果；
图17示出了特异性感染的结果，该特异性感染取决于在BT-474细胞等中，表达荧光蛋白EmGF并仅使用HVEM作为细胞受体使细胞进入的的病毒(gDm)、表达EpCAMscFv-HveA接头的病毒(EADa-S)、在gH中具有EpCAMscFv配体的病毒(EgH-S)，以及在gH中具有EpCAMscFv配体并表达EpCAMscFv-HveA接头的双靶向病毒(EADa-EgH-D)的EpCAM的表达；
图18示出了特异性细胞死亡的结果，该特异性细胞死亡取决于在BT-474细胞等中，表达荧光蛋白EmGF并仅使用HVEM作为细胞受体使细胞进入的的病毒(gDm)、表达EpCAMscFv-HveA接头的病毒(EADa-S)、在gH中具有EpCAMscFv配体的病毒(EgH-S)，以及在gH中具有EpCAMscFv配体并表达EpCAMscFv-HveA接头的双靶向病毒(EADa-EgH-D)的EpCAM的表达；
图19示意性地示出了具有HER2-靶向修饰的糖蛋白gH并表达EpCAM-靶向接头的双靶向HSV-1病毒(EADa-HgH-D)的基因组结构；
图20示出了双靶向的结果，该双靶向取决于在CHO-K1细胞等中，具有HER2-靶向修饰的糖蛋白gH并表达EpCAM-靶向接头的双靶向HSV-1病毒(EADa-HgH-D)的HER2和EpCAM的表达；和
图21示出了双靶向的结果，该双靶向取决于在CHO-K1细胞等中，表达HER2/EpCAM双靶向接头的HSV-1病毒(EADA-hada-D)的HER2和EpCAM的表达。
最佳实施方式
通过以下实施例将更好地理解本公开。然而，这些实施例不应被解释为限制本公开的范围。
<实施例1>生产HVEM限制的HSV-1病毒
HSV-1基因由大约152kb大小的大基因组成，因此使用KOS-37/BAC(基因库登记号：MF156583)(Gierasch W.W.等人，J.Virol.Methods.，2006.135:197-206)在特定基因位点插入外源基因或突变。HSV-1KOS菌株是一种主要用于实验室的HSV-1菌株，因为其众所周知的特性及其在基因功能和病因学研究中的有用性(Smith KO.Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，1964.115:814-816)。通过将BAC质粒插入到KOS基因组中而制备的KOS-37/BAC能够通过转化DH10B细菌(Invitrogen公司)在细菌水平进行克隆(Gierasch W.W.等人，J.Virol.Methods.，2006.135:197-206)。在KOS-37/BAC中，BAC(细菌人工染色体)连同其两侧的LoxP位点一起插入到HSV-1KOS基因组的UL37和UL38之间的基因位点中。这是为了在随后的过程中使用Cre-Lox系统去除BAC基因。其示意图在图1中示出。
为了制备仅通过HVEM细胞受体进入细胞的HVEM限制性HSV-1，需要一种gD-R222N/F223I HSV-1病毒，其中HSV-1gD氨基酸序列(基因库登记号：ASM47818，SEQ ID NO:16)的第222位的精氨酸(R)和第223位的苯丙氨酸(F)分别被天冬酰胺(N)和异亮氨酸(I)取代。
通过突变制备的gD-R222N/F223I HSV-1病毒只能通过HVEM(HveA)，而非连接蛋白-1作为细胞进入受体来感染宿主细胞(Uchida H.等人，J.Virol.，2009.83(7):2951-2961)，因此，在安全性方面是有利的，因为它不能感染具有连接蛋白-1受体的正常细胞。
HVEM-限制性KOS-gD-R222N/F223I病毒的基因组结构示意性地显示在图2中。
KOS-gD-R222N/F223I HSV-1病毒是根据制造商的方案，使用反向选择BAC修饰试剂盒(GeneBridges Inc.公司)，通过将R222N/F2231突变引入KOS-37/BAC的gD位点而制备的。
具体地，用表达RecE和RecT的pRed/ET质粒转化含有KOS-37/BAC的大肠杆菌克隆，所述RecE和RecT能够执行同源重组的功能(Muyrers J.P.等人，Nucleic Acids Res.，1999.27(6):1555-1557)。使用一组同源区引物(正向引物gD-rpsL For：SEQ ID NO:17，反向引物gD-rpsL Rev：SEQ ID NO:18)制备gD-rpsL-neo/kan盒，所述引物包括将突变引入gD的基因位点。gD-rpsL-neo/kan盒由位于插入位点(insertion locus)的gD同源区、rpsL基因和neo/kan基因组成，其中，rpsL基因是赋予链霉素敏感性的选择性标记，neo/kan基因赋予卡那霉素抗性。当插入gD-rpsL-neo/kan盒时，制备了由于rpsL基因而对链霉素抗生素具有敏感性和由于neo/kan基因而具有卡那霉素抗性的大肠杆菌。通过向含有KOS37/BAC和pRed/ET的大肠杆菌克隆中加入L-阿拉伯糖(Sigma-Aldrich公司)来激活pRed/ET(MuyrersJ.P.等人，Nucleic Acids Res.，1999.27(6):1555-1557)的功能，从而诱导RecE和RecT的表达以实现同源重组之后，用200ng制备的gD-rpsL-neo/kan盒进行转化。通过同源重组，将gD-rpsL-neo/kan盒插入到KOS-37/BAC大肠杆菌的gD基因位点中，其中，插入了gD-rpsL-neo/kan的KOS-37/BAC大肠杆菌表现出卡那霉素抗性，但是链霉素抗性被rpsL基因阻断。对于从卡那霉素培养基获得的大肠杆菌，推断gD-rpsL-neo/kan被插入其中，并进行插入基因的最后步骤。通过向含有KOS 37-BAC gD-rpsL-neo/kan克隆的大肠杆菌中加入L-阿拉伯糖(Sigma-Aldrich公司)来激活pRed/ET的功能，从而诱导RecE和RecT的表达以实现同源重组之后，用100pmol的R222N_F2231_突变体(SEQ ID NO:19)转化，R222N_F2231_突变体是一种寡核苷酸，其中gD的第222和第223位的R和F分别被N和I取代。在用插入的寡核苷酸替换现有的gD-rpsL-neo/kan盒时，rpsL阻断的链霉素抗性被激活，基于这一原理，在链霉素培养基中选择候选物(Heermann R.等人，Microb.Cell Fact.，2008，14:doi:10.1186)。使用DNA制备方法从选定的候选者中分离DNA(Horsburgh B.C.等人，Methods Enzymol.，1999.306:337-352)，并通过PCR(聚合酶链式反应)和DNA测序证实了gD的相应位置第222和第223处的N和I的取代。
接下来，为了生产病毒，使用大型构建体DNA纯化试剂盒(Macherey-Nagel公司)提取完整的KOS-37/BAC-gD-R222N/F223I DNA，之后使用Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen公司)，用1μg DNA转染2×105Cre-Vero-HVEM细胞。然后，使用含有100U/ml青霉素/100μg/ml链霉素(Welgene公司)和10％ FBS(胎牛血清，Welgene公司)的DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium，达尔伯克改良伊格尔培养基)(Welgene公司)进行细胞培养。Cre-Vero-HVEM细胞系是通过将HVEM基因插入Cre-Vero细胞系来诱导HVEM蛋白表达的细胞系(Gierasch W.W.等人，J.Virol.Methods.，2006.135:197-206)。使用Cre-Vero-HVEM的原因是，可以使用细胞的Cre重组酶去除KOS-37/BAC-gD-R222N/F223I的BAC基因，并且由于HVEM过表达而被KOS-gD-R222N/F223I病毒感染也是有效的，因此病毒的大量生产变得容易。基因导入3-4天后，确认细胞噬斑的形成，然后收集含病毒的细胞，进行三次冻融过程(Gierasch W.W.et al.等人，J.Virol.Methods.，2006.135:197-206)，并进行超声处理，最终获得KOS-gD-R222N/F223I病毒。
<实施例2>制备表达EmGFP的HVEM限制性HSV-1病毒
为了生产表达EmGFP的HVEM限制性HSV-1，将能够表达EmGFP(翠绿色荧光蛋白)的表达盒插入实施例1中制备的KOS-37/BAC-gD-R222N/F223I DNA的UL26/UL27位点中(Tiffany A.等人，J.Virol.Methods.，2015.231:18-25)。这有助于使用EmGFP作为标记物观察病毒的产生和感染。使用pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR质粒(Invitrogen公司)制备EmGFP盒。
表达EmGFP的KOS-EmGFP-gD-R222N/F223I的基因组结构示意性地显示于图3中。
对于EmGFP表达，将使用pCMV作为巨细胞病毒的基因启动子和tkpA作为HSV TK(单纯疱疹病毒胸苷激酶)的聚腺苷酸化信号的pCMV-EmGFP-tkpA插入到KOS-37/BAC-gD-R222N/F223I DNA。
所有插入方法都是根据制造商的方案，使用反向选择BAC修饰试剂盒(GeneBridges Inc.公司)，如实施例1中所述。
具体地，用表达RecE和RecT的pRed/ET质粒转化含有KOS-37/BAC-gD-R222N/F223I的克隆，所述pRed/ET质粒能够执行同源重组的功能(Muyrers J.P.等人，Nucleic AcidsRes.，1999.27(6):1555-1557)。使用一组同源区引物(正向引物UL26/27-rpsL_For：SEQ IDNO:20，反向引物UL26/27-rpsL_Rev：SEQ ID NO:21)制备UL26/27-rpsL-neo/kan盒，所述引物包括在UL26和UL27之间引入靶基因的位点。向含有KOS-37/BAC-gD-R222N/F223I DNA和pRed/ET的克隆中加入L-阿拉伯糖(Sigma-Aldrich公司)，以诱导同源重组，然后用200ng制备的UL26/27-rpsL-neo/kan盒转化。通过同源重组大肠杆菌将UL26/27-rpsL-neo/kan盒插入到KOS-37/BAC的UL26/27位点，其中插入了UL26/27-rpsL-neo/kan的同源重组大肠杆菌表现出卡那霉素抗性，但链霉素抗性被rpsL基因阻断。对于从卡那霉素培养基获得的大肠杆菌，推断gD-rpsL-neo/kan被插入其中，并进行插入基因的最后步骤。
向含有UL26/27-rpsL-neo/kan盒的大肠杆菌中加入激活pRed/ET的功能的L-阿拉伯糖(Sigma-Aldrich公司)，从而诱导同源重组，然后用200ng的UL26/27-tkpA-EmGFP-pCMV盒转化。UL26/27-tkpA-EmGFP-pCMV盒是使用正向引物UL26/27-tkpA_For(SEQ ID NO:22)和反向引物UL26/27-pCMV_Rev(SEQ ID NO:23)以pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR质粒(Invitrogen公司)为模板制备的。
在用插入的UL26/27tkpA-EmGFP-pCMV替换现有的UL26/27-rpsL-neo/kan盒时，被rpsL阻断的链霉素抗性被激活，基于这一原理，在链霉素培养基中选择候选物(HeermannR.等人，Microb.Cell Fact.，7,14,2008.14:doi:10.1186)。使用DNA制备方法从选定的候选者中分离DNA(Horsburgh B.C.等人，Methods Enzymol.，1999.306:337-352)。通过限制性内切酶EcoRI和XhoI处理和PCR(聚合酶链式反应)证实了在UL26/27处引入tkpA-EmGFP-pCMV，并通过PCR产物的测序识别了确切的基因序列。
对荧光蛋白的正常表达和病毒的产生进行了实验。使用大型构建体DNA纯化试剂盒(Macherey-Nagel公司)提取完整的KOS-37/BAC-gD-R222N/F223I DNA，之后使用Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen公司)，用1μg DNA转染2×105Cre-Vero-HVEM细胞，以使用Cre重组酶去除BAC基因。转染3天后，用荧光显微镜观察EmGFP蛋白的表达，并通过形成Cre-Vero-HVEM细胞噬斑观察病毒的产生。在确认噬斑形成后，收集含病毒的细胞，进行三次冻融过程(Gierasch W.W.et al.等人，J.Virol.Methods.，2006.135:197-206)，并进行超声处理，最终获得KOS-gD-R222N/F223I病毒。
为了感染KOS-EmGFP-gD-R222N/F223I病毒及其荧光表达，使用无HVEM的细胞系(J1和J-Nectin)和表达HVEM的细胞系(J-HVEM)。J1细胞是缺乏病毒HSV-1受体HVEM和连接蛋白-1的幼仓鼠肾细胞系(Petrovic B.等人，2017.PLOS Pathog.19；13(4):e1006352)。J-Nectin和J-HVEM细胞系是在J1细胞中分别过表达连接蛋白-1和HVEM的细胞系(PetrovicB.等人，2017.PLOS Pathog.19；13(4):e1006352)。将各细胞系在含有100U/ml青霉素/100μg/ml链霉素(Welgene公司)和10％ FBS(胎牛血清，Welgene公司)的DMEM(Welgene公司)中培养。用上述获得的KOS-EmGFP-gD-R222N/F223I病毒，以10MOI(感染复数)感染1×104个细胞，24小时后，使用荧光显微镜观察荧光蛋白表达和病毒感染(Baek H.J.等人，Mol.Ther.，2011.19(3):507-514)。
其结果显示在图4中，使用荧光显微镜和光学显微镜分别拍摄其上部图像和下部图像。参见图4的上部荧光显微镜图像，可以看出JI细胞系和J-Nectin细胞系未被感染，只有J-HVEM细胞系被感染。
基于上述结果，证实了KOS-EmGFP-gD-R222N/F223I病毒(gDm)的增殖如预期的那样，通过荧光蛋白的表达容易观察到，并且仅使用HVEM作为细胞进入受体，而不使用连接蛋白-1，细胞进入成为可能。
<实施例3>生产表达HER2-靶向接头的HSV-1病毒、表达EpCAM-靶向接头的HSV-1病毒和表达HER2/EpCAM双靶向接头的HSV-1病毒
将表达HER2scFv-HveA的接头表达盒、表达EpCAM-HveA的接头表达盒，和表达HER2scFv-HveA和EpCAM-HveA两者的接头表达盒中的每一个插入到KOS-37/BAC-EmGFP-gD-R222N/F223I DNA的UL3/UL4位点中，其中插入了实施例2中制备的EmGFP表达盒(pCMV-EmGFP-tkpA)。
图5示意性地示出了插入了pCMV-HER2scFv-HveA-bGHpA作为表达HER2scFv-HveA接头表达盒的KOS-UL3/4-HER2scFv-HveA-EmGFP-gD/R222N/F223I病毒的基因组结构、插入了pCMV-EpCAMscFv-HveA-bGHpA作为表达EpCAMscFv-HveA的接头表达盒的KOS-UL3/4-EpCAMscFv-HveA-EmGFP-gD/R222N/F223I病毒的基因组结构、插入了pCMV-EpCAMscFv-HveA-P2A-HER2scFv-HveA-bGHpA作为表达EpCAM-HveA和HER2scFv-HveA两者的接头表达盒的KOS-UL3/4-EpCAMscFv-HveA-HER2scFv-HveA-EmGFP-gD/R222N/F223I病毒的基因组结构，图6示出了HER2scFv-HveA接头和EpCAMscFv-HveA接头的完整序列和相应序列的构建。
这里，HER2的scFv被构建成使得SEQ ID NO:4的VH和SEQ ID NO:5的VL经由SEQ IDNO:24的连接子肽连接，EpCAM的scFv被构建成使得SEQ ID NO:6的VL和SEQ ID NO:7的VH经由SEQ ID NO:25的连接子肽连接，并且HveA是HER2scFv-HveA接头和EpCAMscFv-HveA接头中SEQ ID NO:8的HveA82。此外，在HER2scFv-HveA接头和EpCAMscFv-HveA接头中，SEQ IDNO:26的前导序列包含在其N-端，特别是在HER2scFv的VH之前和EpCAMscFv的VL之前。
在HER2或EpCAM的scFv序列和NH2-GGGGS序列(HveA序列的连接子序列)之后添加EF(碱基序列：GAATTC)，其是易于克隆的限制性内切酶EcoRI位点。此外，pCMV是巨细胞病毒的基因启动子，bGH-pA是bGH-polyA(牛生长激素多聚腺苷酸化)信号序列，并且表达HER2scFv-HveA和EpCAM-HveA两者的接头表达盒pCMV-HER2scFv-HveA-P2A-EpCAMscFv-HveA-bGHpA中的P2A是猪捷申病毒1型(P2A)的2A。
在本实施例中使用的，HER2scFv-HveA接头(包括前导序列)全长的氨基酸序列和基因序列分别表示在SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28中，EpCAMscFv-HveA(包括前导序列)全长的氨基酸序列和基因序列分别表示在SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30中。
HER2scFv-HveA接头表达盒、EpCAMscFv-HveA接头表达盒和EpCAM-HveA-HER2scFv-HveA双接头表达盒的插入是根据制造商的方案，使用反向选择BAC修饰试剂盒(GeneBridges Inc.公司)，如在实施例1和2中所述。
具体地，用表达RecE和RecT的pRed/ET质粒转化实施例2中制备的含有KOS-37/BACEmGFP-gD-R222N/F223I基因组的大肠杆菌克隆，所述RecE和RecT能够执行同源重组的功能(Muyrers J.P.等人；Nucleic Acids Res.，1999.27(6):1555-1557)。使用一组同源区引物(正向引物UL3/4-rpsL-neo_for：SEQ ID NO:31，反向引物UL3/4-rpsL-neo_rev：SEQID NO:32)制备UL3/4-rpsL-neo/kan盒，所述引物包括在UL3和UL4之间引入靶基因的位点。向含有KOS-37/BAC-EmGFP-gD-R222N/F223I和pRedET的克隆中加入L-阿拉伯糖(Sigma-Aldrich公司)以诱导同源重组，然后用200ng如上所述制备的UL3/4-rpsL-neo/kan盒转化。通过这种同源重组，将UL3/4-rpsL-neo/kan盒插入KOS-37/BAC-EmGFP-gD-R222N/F223I大肠杆菌的UL3/4位点，插入了UL3/4-rpsL-neo/kan的KOS-37/BAC-EmGFP-gD-R222N/F223I大肠杆菌表现出卡那霉素抗性，但链霉素抗性被rpsL基因阻断。对于从卡那霉素培养基获得的大肠杆菌，推断UL3/4-rpsL-neo/kan被插入其中，并进行插入靶基因的最后步骤。
向含有UL3/4-rpsL-neo/kan盒的大肠杆菌中加入激活pRed/ET功能的L-阿拉伯糖(Sigma-Aldrich公司)，从而诱导同源重组，然后用200ng的UL3/4-pCMV-HER2scFv-HveA-bGHpA盒、UL3/4-pCMV-EpCAMscFv-HveA-bGHpA盒和UL3/4-pCMV-EpCAMscFv-HveA-P2A-HER2scFv-HveA-bGHpA盒中的每一个转化。UL3/4-pCMV-HER2scFv-HveA-bGHpA盒、UL3/4-pCMV-EpCAMscFv-HveA-bGHpA盒和UL3/4-pCMV-EpCAMscFv-HveA-P2A-HER2scFv-HveA-bGHpA盒是使用正向引物UL3/4_pCMV_For(SEQ ID NO:33)和反向引物UL3/4_bGH_poly_R(SEQ ID NO:34)，以pCDNA3.1-HER2scFv-HveA质粒、pCDNA3.1-EpCAMscFv-HveA质粒和pCDNA3.1-pCMV-EpCAMscFv-HveA-P2A-HER2scFv-HveA为各自的模板制备的(Baek H.J.等人，Mol.Ther.，2011.19(3):507-514；Carter P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1992,15；89(10):4285-9；Willuda J.等人，Cancer Res.1999,15；59(22):5758-67)。
在用上述插入的UL3/4-pCMV-HER2scFv-HveA-bGHpA、UL3/4-pCMV-EpCAMscFv-HveA-bGHpA和UL3/4-pCMV-EpCAMscFv-HveA-P2A-HER2scFv-HveA-bGHpA替换常规插入的UL3/4-rpsL-neo/kan盒时，被rpsL阻断的链霉素抗性被激活，基于这一原理，在链霉素培养基中选择候选物(Heermann R.等人，Microb.Cell Fact.，2008.14:doi:10.1186)。使用DNA制备方法从选定的候选者中分离DNA(Horsburgh B.C.等人，Methods Enzymol.，1999.306:337-352)。通过限制性内切酶EcoRI和XhoI处理和PCR(聚合酶链式反应)证实了在UL3/4处引入了UL3/4-pCMV-HER2scFv-HveA-bGHpA、UL3/4-pCMV-EpCAMscFv-HveA-bGHpA和UL3/4-pCMV-EpCAMscFv-HveA-P2A-HER2scFv-HveA-bGHpA，并通过PCR产物的测序识别了确切的基因序列。
使用大型构建体DNA纯化试剂盒(Macherey-Nagel公司)提取完整的KOS-37/BAC-UL3/4_HER2scFv-HveA-EmGFP-gD-R222N/F223I、KOS-37/BAC-UL3/4_EpCAMscFv-HveA-EmGFP-gD/R222N/F223I和KOS-37/BAC-UL3/4_EpCAMscFv-HveA-P2A-HER2scFv-HveA-EmGFP-gD/R222N/F223I DNA，之后使用Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen公司)，用1μgDNA转染2×105Cre-Vero-HVEM细胞。转染3天后，用荧光显微镜观察EmGFP蛋白的荧光表达和细胞斑的形成。在确认噬斑形成后，收集含病毒的细胞，进行三次冻融过程(GieraschW.W.et al.等人；J.Virol.Methods.，2006.135:197-206)，并进行超声处理，最终获得表达HER2-靶向接头的KOS-UL3/4_HER2scFv-HveA-EmGFP-gD-R222N/F223I病毒(HADa-S)、表达EpCAM-靶向接头的KOS-UL3/4_EpCAMscFv-HveA-EmGFP-gD/R222N/F223I病毒(EADa-S)，和表达HER2/EpCAM双靶向接头的KOS-UL3/4_EpCAMscFv-HveA-P2A-HER2scFv-HveA-EmGFP-gD/R222N/F223I病毒(EADa-HADa-D)。
<实施例4>生产具有HER2-靶向修饰的糖蛋白gH的HSV-1病毒和具有EpCAM-靶向修饰的糖蛋白gH的HSV-1病毒以及表达HER2-靶向接头的HSV-1病毒
为了生产能够靶向在特定癌症中表达的靶分子的重靶向HSV，将识别在癌细胞中特异性表达的HER2的配体(HER2 scFv)插入到gH氨基酸序列(基因库登记号：ASM47773,SEQID NO:3)的氨基酸29和30之间，gH是HSV-1的糖蛋白。将能够表达HER2scFv的基因插入实施例2和3中制备的KOS-37/BAC-EmGFP-gD-R222N/F223I DNA和KOS-37/BAC-UL3/4_HER2scFv-HveA-EmGFP-gD/R222N/F223I DNA中糖蛋白gH的氨基酸29和30之间。
图7示出了KOS-gH/HER2scFv-EmGFP-gD/R222N/F223I病毒(HgH-S)和KOS-UL3/4_HER2scFv-HveA-gH/HER2scFv-EmGFP-gD/R222N/F223I病毒(HADa-HgH-D)的基因组结构，其中HER2scFv配体插入到HSV-1的gH中，图8示出了gH-HER2scFv配体的完整序列和相应序列的构建。这里，HER2的scFv被构建成使得SEQ ID NO:4的VH和SEQ ID NO:5的VL经由SEQ IDNO:24的连接子肽连接，SEQ ID NO:35的连接子肽与scFv的N-端连接，并且SEQ ID NO:36的连接子肽与其C-端连接。
本实施例中使用的HER2scFv全长的氨基酸序列和基因序列分别表示在SEQ IDNO:37和SEQ ID NO:38中。
gH-HER2scFv配体的插入是根据制造商的方案，使用反向选择BAC修饰试剂盒(GeneBridges Inc.公司)，如在实施例1、2和3中所述。
具体地，用表达RecE和RecT的pRed/ET质粒转化实施例2和3中制备的含有KOS-37/BAC-EmGFP-gD-R222N/F223I DNA和KOS-37/BAC-UL3/4_HER2scFv-HveA-EmGFP-gD-R222N/F223I DNA的大肠杆菌克隆，所述RecE和RecT能够执行同源重组的功能(Muyrers J.P.等人；Nucleic Acids Res.，1999.27(6):1555-1557)。使用一组同源区引物(正向引物gH29/30-rpsL-neo_for：SEQ ID NO:39，反向引物gH29/30-rpsL-neo_rev：SEQ ID NO:40)制备gH29/30-rpsL-neo/kan盒，所述引物包括在gH的氨基酸29和30之间引入靶基因的位点。向含有KOS-37/BAC-EmGFP-gD-R222N/F223I DNA和KOS-37/BAC-UL3/4_HER2scFv-HveA-EmGFP-gD-R222N/F223I DNA以及pRed/ET中的每一个的克隆中加入L-阿拉伯糖(Sigma-Aldrich公司)，以诱导同源重组，然后用200ng如上所述制备的gH29/30-rpsL-neo/kan盒转化。通过这种同源重组，将gH29/30-rpsL-neo/kan盒插入gH大肠杆菌的氨基酸29和30之间的位置，插入了gH29/30-rpsL-neo/kan盒的gH大肠杆菌表现出卡那霉素抗性，但链霉素抗性被rpsL基因阻断。对于从卡那霉素培养基获得的大肠杆菌，推断gH29/30-rpsL-neo/kan被插入其中，并进行插入靶基因的最后步骤。
向含有gH29/30-rpsL-neo/kan盒的大肠杆菌中加入激活pRed/ET的功能的L-阿拉伯糖(Sigma-Aldrich公司)，从而诱导同源重组，然后用200ng的gH29/30-HER2scFv配体转化。gH29/30-HER2scFv配体是使用正向引物gH29/30-scFv_For(SEQ ID NO:41)和反向引物gH29/30-scFv_Rev(SEQ ID NO:42)，以pCAGGSMCS-gH-HER2scFv质粒为模板制备的。pCAGGSMCS-gH-HER2scFv质粒是通过将HER2scFv插入到pCAGGSMCS质粒中而制备的(Atanasiu D.等人，J.Virol.，2013年11月，87(21):11332-11345)，具体而言，是通过用NotI限制性内切酶(NEB，R3189)处理pCAGGSMCS质粒和经由PCR(Carter P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1992,15；89(10):4285-9)扩增的HER2scFv，并使用T4 DNA连接酶(NEB，M0202)连接被NotI切割的pCAGGSMCS质粒和HER2scFv而制备的。
在用上述插入的gH29/30-HER2scFv替换常规插入的gH29/30-rpsL-neo/kan盒时，被rpsL阻断的链霉素抗性被激活，基于这一原理，在链霉素培养基中选择候选物(HeermannR.等人，Microb.Cell Fact.，2008.14:doi:10.1186)。使用DNA制备方法从选定的候选者中分离DNA(Horsburgh B.C.等人，Methods Enzymol.，1999.306:337-352)，通过限制性内切酶EcoRI和XhoI处理和PCR(聚合酶链式反应)证实了在gH29/30处引入了HER2scFv，并通过PCR产物的测序识别了确切的基因序列。
使用大型构建体DNA纯化试剂盒(Macherey-Nagel公司)提取完整的KOS-37/BAC-gH/HER2scFv-EmGFP-gD-R222N/F223I DNA和KOS-37/BAC-UL3/4_HER2scFv-HveA-gH/HER2scFv-EmGFP-gD-R222N/F223I DNA，之后使用Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen公司)，用1μg DNA转染2×105Cre-Vero-HVEM细胞，以使用Cre重组酶去除BAC基因。转染3天后，用荧光显微镜观察EmGFP蛋白的荧光表达和细胞斑的形成。在确认噬斑形成后，收集含病毒的细胞，进行三次冻融过程(Gierasch W.W.et al.等人；J.Virol.Methods.，2006.135:197-206)，并进行超声处理，最终获得KOS-gH/HER2scFv-EmGFP-gD-R222N/F223I病毒(HgH-S)和KOS-UL3/4_HER2scFv-HveA-gH/HER2scFv-EmGFP-gD-R222N/F223I病毒(HADa-HgH-D)。
<实施例5>生产具有EpCAM-靶向修饰的糖蛋白gH的HSV-1病毒和具有EpCAM-靶向修饰的糖蛋白gH的HSV-1病毒以及表达EpCAM-靶向接头的HSV-1病毒
为了生产能够靶向在特定癌症中表达的靶分子的重靶向HSV，将识别在癌细胞中特异性表达的EpCAM的配体(EpCAM scFv)插入到gH氨基酸序列(基因库登记号：ASM47773,SEQ ID NO:3)的氨基酸29和30之间，gH是HSV-1的糖蛋白。将能够表达EpCAMscFv的基因插入实施例2和3中制备的KOS-37/BAC-EmGFP-gD-R222N/F223I DNA和KOS-37/BAC-UL3/4_EpCAMscFv-HveA-EmGFP-gD/R222N/F223I(EADa-S)DNA中糖蛋白gH的氨基酸29和30之间。
图9示出了KOS-gH/EpCAMscFv-EmGFP-gD/R222N/F223I病毒(EgH-S)和KOS-UL3/4_EpCAMscFv-HveA-gH/EpCAMscFv-EmGFP-gD/R222N/F223I病毒(EADa-EgH-D)的基因组结构，其中EpCAMscFv配体被插入到HSV-1的gH中，图10示出了gH-EpCAMscFv配体的完整序列和相应序列的构建。这里，EpCAM的scFv被构建成使得SEQ ID NO:6的VL和SEQ ID NO:7的VH经由SEQ ID NO:25的连接子肽连接，SEQ ID NO:43的连接子肽与scFv的N-端连接，并且SEQ IDNO:44的连接子肽与其C-端连接。
本实施例中使用的EpCAMscFv的氨基酸序列和基因序列分别表示在SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46中。
gH-EpCAMscFv配体的插入是根据制造商的方案，使用反向选择BAC修饰试剂盒(GeneBridges Inc.公司)，如在实施例4中所述。
具体地，用表达RecE和RecT的pRed/ET质粒转化实施例2和3中制备的含有KOS-37/BAC-EmGFP-gD-R222N/F223I DNA和KOS-37/BAC-UL3/4_EpCAMscFv-HveA-EmGFP-gD-R222N/F223I DNA的大肠杆菌克隆，所述RecE和RecT能够执行同源重组的功能(Muyrers J.P.等人；Nucleic Acids Res.，1999.27(6):1555-1557)。使用一组同源区引物(正向引物gH29/30-rpsL-neo_for：SEQ ID NO:40，反向引物gH29/30-rpsL-neo_rev：SEQ ID NO:41)制备gH29/30-rpsL-neo/kan盒，所述引物包括在gH的氨基酸29和30之间引入靶基因的位点。向含有KOS-37/BAC-EmGFP-gD-R222N/F223I DNA和KOS-37/BAC-UL3/4_EpCAMscFv-HveA-EmGFP-gD-R222N/F223I DNA以及pRed/ET中的每一个的克隆中加入L-阿拉伯糖(Sigma-Aldrich公司)，以诱导同源重组，然后用200ng如上所述制备的gH29/30-rpsL-neo/kan盒转化。通过这种同源重组，将gH29/30-rpsL-neo/kan盒插入gH大肠杆菌的氨基酸29和30之间，插入了gH29/30-rpsL-neo/kan的gH大肠杆菌表现出卡那霉素抗性，但链霉素抗性被rpsL基因阻断。对于从卡那霉素培养基获得的大肠杆菌，推断gH29/30-rpsL-neo/kan被插入其中，并进行插入靶基因的最后步骤。
向含有gH29/30-rpsL-neo/kan盒的大肠杆菌中加入激活pRed/ET功能的L-阿拉伯糖(Sigma-Aldrich公司)，从而诱导同源重组，然后用200ng gH29/30-EpCAMscFv配体转化。gH29/30-EpCAMscFv配体是使用正向引物gH29/30-scFv_For(SEQ ID NO:42)和反向引物gH29/30_scFv_Rev(SEQ ID NO:43)，以pCAGGSMCS-gH-EpCAMscFv质粒为模板制备的。pCAGGSMCS-gH-EpCAMscFv质粒是通过将EpCAMscFv插入到pCAGGSMCS质粒中而制备的(Atanasiu D.等人，J.Virol.，2013年11月，87(21):11332-11345)，具体而言，是通过用NotI限制性内切酶(NEB，R3189)处理pCAGGSMCS质粒和经由PCR(Willuda J.等人，CancerRes.1999,15；59(22):5758-67)扩增的EpCAMscFv，并使用T4 DNA连接酶(NEB，M0202)连接被NotI切割的pCAGGSMCS质粒和EpCAMscFv而制备的。
在用上述插入的gH29/30-EpCAMscFv替换常规插入的gH29/30-rpsL-neo/kan盒时，被rpsL阻断的链霉素抗性被激活，基于这一原理，在链霉素培养基中选择候选物(Heermann R.等人，Microb.Cell Fact.，2008.14:doi:10.1186)。使用DNA制备方法从选定的候选者中分离DNA(Horsburgh B.C.等人，Methods Enzymol.，1999.306:337-352)。通过限制性内切酶EcoRI和XhoI处理和PCR(聚合酶链式反应)证实了在gH29/30处引入了EpCAMscFv，并通过PCR产物的测序识别了确切的基因序列。
使用大型构建体DNA纯化试剂盒(Macherey-Nagel公司)提取完整的KOS-37/BAC-gH_EpCAMscFv-EmGFP-gD-R222N/F223I和KOS-37/BAC-UL3/4_EpCAMscFv-HveA-gH/EpCAMscFv-EmGFP-gD-R222N/F223I DNA，之后使用Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen公司)，用1μg DNA转染2×105Cre-Vero-HVEM细胞，以使用Cre重组酶去除BAC基因。转染2天后，用荧光显微镜观察EmGFP蛋白的荧光表达和细胞斑的形成。在确认噬斑形成后，收集含病毒的细胞，进行三次冻融过程(Gierasch W.W.et al.等人；J.Virol.Methods.，2006.135:197-206)，并进行超声处理，最终获得KOS-gH/EpCAMscFv-EmGFP-gD-R222N/F223I病毒(EgH-S)和KOS-gH/EpCAMscFv-UL3/4_EpCAMscFv-HveA-EmGFP-gD-R222N/F223I病毒(EADa-EgH-D)。
<实施例6>测量HER2双靶向溶瘤病毒的活性
为了确认HER2scFv-HveA接头的表达水平，以及实施例3和4中所制备的，表达HER2scFv-HveA接头的KOS-UL3/4_HER2scFv-HveA-EmGFP-gD-R222N/F223I病毒(HADa-S)、在gH中表达HER2scFv的KOS-gH/HER2scFv-EmGFP-gD-R222N/F223I病毒(HgH-S)，和在gH中表达HER2scFv-HveA接头和HER2scFv的UL3/4_HER2scFv-HveA-gH/HER2scFv-EmGFP-gD-R222N/F223I(HADa-HgH-D)双靶向病毒的病毒增殖和扩增，进行了以下实验。
为了进行病毒增殖实验，将2.0×105个Vero-HVEM细胞和SK-OV-3细胞施用于12孔板上。
将HSV-1野生型病毒(KOS)、实施例2中制备的表达荧光蛋白EmGFP并仅使用HVEM作为细胞受体使细胞进入的病毒gDm、实施例3中制备的表达HER2scFv-HveA接头的病毒HADa-S、实施例4中制备的在gH中具有HER2scFv配体的病毒HgH-S、以及实施例4中制备的在gH中具有HER2scFv配体并表达HER2scFv-HveA接头的双靶向病毒HADa-HgH-D稀释并用于感染，使得一个孔中含有20至50种病毒。90分钟后，为了除去剩余的初始病毒并防止病毒增殖，用含有0.2％甲基纤维素的培养基替换所用的培养基。3天后，使用荧光显微镜通过病毒噬斑的大小来测量病毒增殖。
其结果如图11所示。从图11可以明显看出，在Vero-HVEM细胞系中，gDm、HgH-S、HADa-S和HADa-HgH-D的噬菌斑大小分别比野生型病毒(KOS)小18％、49％、4％和29％。在作为表达HER2的细胞系的SK-OV-3细胞中，与野生型病毒(KOS)相比，HgH-S的噬菌斑大小降低了53％，而HADa-S和HADa-HgH-D病毒分别增加了20％和19％。HgH-S的噬菌斑大小降低的原因被认为是，当gD与进入受体结合时，gH通过这种结合向gB传递激活信号而在诱导细胞融合中起作用，并且通过与整联蛋白(integrins)结合而诱导内吞作用，因此判断病毒增殖或复制通过影响这种信号传递或内吞作用而被抑制，这是由于scFv插入gH引起的结构变化。
为了进行病毒复制实验，将1.0×104个Vero-HVEM细胞施用于96孔板上。gDm、在gH中表达HER2scFv配体的HgH-S、表达HER2scFv-HveA接头的HADa-S和双靶向HADa-HgH-D病毒用于以0.1MOI进行感染。90分钟后，用新鲜培养基替换所用的培养基，以除去剩余的初始病毒。在感染3、24和48小时后，获得病毒培养液，并测量培养液中病毒的数量。
其结果示于图12中。从图12可以明显看出，尽管在Vero-HVEM细胞系中，gDm、HADa-S和HADa-HgH-D的病毒增殖活性是相似的，但证实了在HgH-S中的病毒增殖活性由于病毒增殖能力降低而降低，如图11的结果所示。
为了进行测定接头表达水平的实验，将2.0×105Vero-HVEM和SK-OV-3细胞施用于12孔板上。然后，gDm、在gH中表达HER2scFv配体的HgH-S、表达HER2scFv-HveA接头的HADa-S和双靶向HADa-HgH-D病毒用于以0.1MOI进行感染。90分钟后，用不含FBS的新鲜培养基替换所用的培养基，以除去剩余的初始病毒。感染48小时后，获得病毒培养液，并通过蛋白质印迹测定蛋白质表达水平，从而测定培养液中的接头。
其结果如图13所示。从图13可以明显看出，在Vero-HVEM细胞系中，与仅表达接头的HADa-S病毒相比，HADa-HgH-D双靶向病毒表达的接头的量至少大了3倍。然而，在没有接头的gDm和HgH-S病毒培养液中没有测量到接头。在表达HER2的SK-OV-3细胞中，仅检测到HADa-HgH-D双靶向病毒的接头。这是因为与HADa-S病毒相比，HADa-HgH-D双靶向病毒在表达HER2的细胞系中表现出更高的感染率，因此接头的表达成比例地更高。
因此，与其他病毒相比，HADa-HgH-D双靶向病毒被证实在病毒增殖和扩增以及接头表达水平方面得到了相对改善。
<实施例7>使用HER2双靶向溶瘤病毒对表达HER2的癌细胞的感染和细胞毒性
使用实施例2、3和4中制备的gDm、在gH中表达HER2scFv配体的HgH-S、表达HER2scFv-HveA接头的HADa-S和在gH中表达HER2scFv-HveA接头和HER2scFv配体的双靶向HADa-HgH-D病毒，在表达HER2的癌细胞系中进行实验。为了证实每种病毒是否由于在糖蛋白gH中表达的HER2scFv配体或由于接头而诱导病毒感染到周围的癌细胞中，以及其是否诱导感染后的细胞毒性，进行了以下实验。
实验中使用的细胞系是不表达HER2的细胞系(MDA-MB-231)和表达HER2的细胞系(SK-OV-3、MCF-7、MDA-MB-453和BT-474)。对于乳腺癌细胞系MDA-MB-231(ATCC、HTB-26)、MCF-7(ATCC、HTB-22)和BT-474(ATCC、HTB-20)，以及卵巢癌细胞系SK-OV-3(ATCC、HTB-77)，使用含有100U/ml青霉素/100μg/ml链霉素(Welgene公司)和10％ FBS的DMEM进行培养，对于乳腺癌细胞系MDA-MB-453(ATCC、HTB-131)，使用含有100U/ml青霉素/100μg/ml链霉素(Welgene公司)和10％ FBS的RPMI1640培养基进行培养。
对于HER2-特异性病毒感染实验，使用2MOl的8×103SK-0V-3和MDA-MB-231、4.0×104MCF-7、8.0×104MDA-MB-453和7.0×104BT-474细胞系，并用在gH中表达HER2scFv配体的HgH-S、表达HER2scFv-HveA接头的HADa-S、双靶向HADa-HgH-D病毒，和作为对照的HER2-非靶向gDm病毒进行感染。90分钟后，用新鲜培养基替换所用的培养基，以除去剩余的初始病毒。感染2天后，通过每个细胞系中的EmGFP荧光表达确认病毒感染(Baek H.J.等人，Mol.Ther.2011.19(3):507-514)。此外，为了测量感染4天后的细胞毒性，使用ELISA阅读器，并使用EZ-Cytox(DoGenBio)试剂在450nm处测量甲臜的显色程度，甲臜是仅在活细胞中形成的显色材料。对吸光度进行定量，以确定每种病毒对癌细胞系的细胞毒性。
其结果如图14所示。从图14可以明显看出，表达接头的HADa-S病毒在SK-OV-3和MCF7细胞中具有高感染率，但在MDA-MB-453和BT-474中观察到低感染率。在gH中表达HER2scFv配体的HgH-S病毒在SK-OV-3、MCF7和MDA-MB-453细胞中具有高感染率，但在BT-474中观察到低感染率。与表达配体和接头中每一个的病毒不同，观察到双靶向HADa-HgH-D病毒在所有表达HER2的细胞中都表现出高感染率。然而，gDm病毒不感染癌细胞系，因为它不靶向HER2，并且作为对照，在不表达HER2的MDA-MB-231细胞中没有观察到所有病毒的感染。MDA-MB-453和BT-474的低感染率被认为是由于MDA-MB-453和BT-474的细胞形态和特征以及HADa-S病毒的初始低感染率。
此外，图15示出了在感染4天后观察由病毒引起的癌细胞的细胞毒性的结果。HgH-S、HADa-S和HADa-HgH-D病毒在SK-OV-3中分别表现出41％、27％和25％的细胞活力值，在MCF-7中分别表现出61％、52％和39％的细胞活力值，在MDA-MB-453中分别表现出49％、100％和23％的细胞活力值。在表达HER2的三种细胞系中，观察到由双靶向HADa-HgH-D病毒感染引起的细胞毒性最高。然而，由于gDm病毒不靶向HER2，没有观察到细胞毒性，并且不表达HER2的MDA-MB-231不能感染，因此观察到三种病毒不涉及细胞毒性。对MDA-MB-453细胞的生存力没有影响的原因似乎是，与其它病毒相比，HADa-S病毒的初始感染率非常低。
<实施例8>HER2双靶向溶瘤病毒对小鼠肿瘤细胞生长的抑制作用
为了证实实施例4中制备的双靶向HADa-HgH-D病毒是否诱导对小鼠中表达HER2的癌细胞生长的抑制，进行了以下实验。
将SK-OV-3以5×106细胞/小鼠进行皮下注射到5周龄Balb/c裸鼠(Orient Bio公司)中后，观察肿瘤直到其大小变为100mm3。将HER2双靶向HADa-HgH-D病毒以2×107pfu/小鼠进行瘤内注射到具有肿瘤的5只小鼠中，并将PBS注射到5只小鼠中作为对照。注射病毒后，观察小鼠体内产生的肿瘤大小28天。
其结果示于图16中28天的肿瘤大小的图中。在使用PBS的对照组中，肿瘤从初始阶段的116.46±11.21mm3生长到815.28±141.36mm3，而在注射了HER2双靶向HADa-HgH-D病毒的小鼠中，观察到肿瘤从108.85±15.54mm3生长到110.02±55.44mm3，这被认为与对照相比受到抑制。
<实施例9>使用EpCAM双靶向溶瘤病毒对表达EpCAM的癌细胞的感染和细胞毒性
使用实施例3和5中制备的表达EpCAMscFv-HveA接头的EADa-S病毒、在gH中表达EpCAMscFv配体的EgH-S病毒，和在gH中表达EpCAMscFv-HveA接头和EpCAMscFv配体的双靶向EADa-EgH-D病毒进行实验。
为了证实每种病毒是否由于在糖蛋白gH中表达的EpCAMscFv配体或由于接头而诱导病毒感染到周围的癌细胞中，以及其诱导感染后的细胞毒性，进行了以下实验。
实验中使用的细胞系是不表达EpCAM的细胞系(Mia-PaCa-2)和表达EpCAM的细胞系(MCF-7、MDA-MB-453和BT-474)。对于乳腺癌细胞系MCF-7(ATCC、HTB-22)和BT-474(ATCC、HTB-20)和胰腺癌细胞系Mia-PaCa-2(ATCC、CRL-1420)，使用含有100U/ml青霉素/100μg/ml链霉素(Welgene公司)和10％ FBS的DMEM进行培养。对于乳腺癌细胞系MDA-MB-453(ATCC、HTB-131)，使用含有100U/ml青霉素/100μg/ml链霉素(Welgene公司)和10％ FBS的RPMI培养基进行培养。
对于EpCAM-特异性病毒感染实验，使用1MOI的4.0×104MCF-7、8.0×104MDA-MB-453和7.0×104BT-474细胞系，并用实施例3中制备的表达EpCAMscFv-HveA接头的EADa-S、实施例4中制备的在gH中表达EpCAMscFv配体的EgH-S病毒、表达接头和配体两者的双靶向EADa-EgH-D病毒，以及作为对照的实施例2中制备的HER2-非靶向gDm病毒进行感染。90分钟后，用新鲜培养基替换所用的培养基，以除去剩余的初始病毒。感染2天后，通过每个细胞系中的EmGFP荧光表达确认病毒感染(Baek H.J.等人，Mol.Ther.，2011.19(3):507-514)。此外，为了测量5天的细胞死亡，使用荧光显微镜观察在用EZ-Cytox(DogenBio)试剂处理后由每种病毒引起的癌细胞系的细胞毒性。此外，为了测量感染5天后的细胞毒性，使用ELISA阅读器，并使用EZ-Cytox(DoGenBio)试剂在450nm处测量甲臜的显色程度，甲臜是仅在活细胞中形成的显色材料。对吸光度进行定量，以确定每种病毒对癌细胞系的细胞毒性。
其结果示于图17中。从图17可以明显看出，通过荧光观察到，BT-474、MDA-MB-453和MCF7细胞被所有仅表达EpCAM-HveA接头的EADa-S病毒、在gH中表达EpCAMscFv配体的EgH-S病毒和表达接头和配体两者的双靶向EADa-EgH-D病毒所感染，并且观察到，与EADa-S和EgH-S病毒相比，双靶向EADa-EgH-D病毒表现出高感染率。由于gDm病毒不靶向EpCAM，所以观察到癌细胞系未被感染，并且在不表达EpCAM的Mia-PaCa-2细胞中也没有病毒感染。
此外，图18示出了在感染5天后观察由病毒引起的癌细胞的细胞毒性的结果。EgH-S、EADa-S和EADa-EgH-D病毒在BT-474中分别表现出35％、34％和26％的细胞活力值，在MDA-MB-453中分别表现出22％、19％和17％的细胞活力值，在MCF-7中分别表现出36％、31％和20％的细胞活力值。在表达EpCAM的三种细胞系中，观察到由EADa-EgH-D双靶向病毒感染引起的细胞毒性最高。然而，由于gDm病毒不靶向EpCAM，因此没有观察到细胞毒性，并且不表达EpCAM的Mia-PaCa-2未被感染，因此任何病毒都未参与细胞毒性。
<实施例10>生产具有HER2-靶向修饰的糖蛋白gH并表达EpCAM-靶向接头的HSV-1
为了产生能够双靶向在特定癌症中表达的两种靶分子(HER2/EpCAM)的HSV，将识别在癌细胞中特异性表达的HER2的配体(HER2 scFv)插入到gH氨基酸序列(基因库登记号：ASM47773,SEQ ID NO:35)的氨基酸29和30之间，gH是表达EpCAMscFv-HveA接头的KOS-UL3/4_EpCAMscFv-HveA-EmGFP-gD-R222N/F223I(EADa-S)病毒的糖蛋白。
将能够表达HER2scFv的基因插入实施例3中制备的KOS-37/BAC-UL3/4_EpCAMscFv-HveA-EmGFP-gD/R222N/F223I(EADa-S)DNA中糖蛋白gH的氨基酸29和30之间。
图19示出了KOS-UL3/4_EpCAMscFv-HveA-gH/HER2scFv-EmGFP-gD/R222N/F223I病毒的基因组结构，其中HER2scFv配体被插入到HSV-1的gH中，图8示出了gH-HER2scFv配体的完整序列和相应序列的构建。这里，HER2的scFv被构建成使得SEQ ID NO:4的VH和SEQ IDNO:5的VL经由SEQ ID NO:24的连接子肽连接，SEQ ID NO:36的连接子肽连接与该scFv的N-端连接，并且SEQ ID NO:37的连接子肽与其C-端连接。
本实施例中使用的HER2scFv全长的氨基酸序列和基因序列分别表示在SEQ IDNO:38和SEQ ID NO:39中。
gH-HER2scFv配体的插入是根据制造商的方案，使用反向选择BAC修饰试剂盒(GeneBridges Inc.公司)，如在实施例4中所述。
具体地，用表达RecE和RecT的pRed/ET质粒转化实施例3中制备的含有KOS-37/BAC-UL3/4_EpCAMscFv-HveA-EmGFP-gD-R222N/F223I DNA的大肠杆菌克隆，所述RecE和RecT能够执行同源重组的功能(Muyrers J.P.等人；Nucleic Acids Res.，1999.27(6):1555-1557)。使用一组同源区引物(正向引物gH29/30-rpsL-neo_for：SEQ ID NO:40，反向引物gH29/30-rpsL-neo_rev：SEQ ID NO:41)制备gH29/30-rpsL-neo/kan盒，所述引物包括在gH的氨基酸29和30之间引入靶基因的位点。
向含有KOS-37/BAC-UL3/4_EpCAMscFv-HveA-EmGFP-gD-R222N/F223I DNA和pRed/ET的克隆中加入L-阿拉伯糖(Sigma-Aldrich公司)，以诱导同源重组，然后用200ng如上所述制备的gH29/30-rpsL-neo/kan盒转化。通过这种同源重组，将gH29/30-rpsL-neo/kan盒插入gH大肠杆菌的氨基酸29和30之间，插入了gH29/30-rpsL-neo/kan盒的大肠杆菌表现出卡那霉素抗性，但链霉素抗性被rpsL基因阻断。对于从卡那霉素培养基获得的大肠杆菌，推断gH29/30-rpsL-neo/kan被插入其中，并进行插入靶基因的最后步骤。
向含有gH29/30-rpsL-neo/kan盒的大肠杆菌中加入激活pRed/ET功能的L-阿拉伯糖(Sigma-Aldrich公司)，从而诱导同源重组，然后用200ng gH29/30-HER2scFv配体转化。gH29/30-HER2scFv配体是使用正向引物gH29/30-scFv_For(SEQ ID NO:42)和反向引物gH29/30scFv_Rev(SEQ ID NO:43)，以pCAGGSMCS-gH-HER2scFv质粒为模板制备的。
在用上述插入的gH29/30-HER2scFv替换常规插入的gH29/30-rpsL-neo/kan盒时，被rpsL阻断的链霉素抗性被激活，基于这一原理，在链霉素培养基中选择候选物(HeermannR.等人，Microb.Cell Fact.，2008.14:doi:10.1186)。使用DNA制备方法从选定的候选者中分离DNA(Horsburgh B.C.等人，Methods Enzymol.，1999.306:337-352)。通过限制性内切酶EcoRI和XhoI处理和PCR(聚合酶链式反应)证实了在gH29/30处引入了HER2scFv，并通过PCR产物的测序鉴定了确切的基因序列。
使用大型构建体DNA纯化试剂盒(Macherey-Nagel公司)提取完整的KOS-37/BAC-gH/HER2scFv-UL3/4_EpCAMscFv-HveA-EmGFP-gD-R222N/F223I DNA，之后使用Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen公司)，用1μg DNA转染2×105Cre-Vero-HVEM细胞，以使用Cre重组酶去除BAC基因。转染3天后，用荧光显微镜观察EmGFP蛋白的荧光表达和细胞斑的形成。在确认噬斑形成后，收集含病毒的细胞，进行三次冻融过程(Gierasch W.W.etal.等人；J.Virol.Methods.，2006.135:197-206)，并进行超声处理，最终获得在gH中表达EpCAMscFv-HveA接头和HER2scFv配体的KOS-UL3/4_EpCAMscFv-HveA-gH_HER2scFv-EmGFP-gD-R222N/F223I双靶向病毒(EADa-HgH-D)。
<实施例11>具有HER2-靶向修饰的糖蛋白gH并表达EpCAM-靶向接头的HSV-1的双靶向作用的实验
为了证实用实施例10中制备的在gH中表达EpCAMscFv-HveA接头和HER2scFv配体的KOS-UL3/4_EpCAMscFv-HveA-gH/HER2scFv-EmGFP-gD-R222N/F223I双靶向病毒(EADa-HgH-D)诱导表达HER2和EpCAM蛋白的细胞感染，进行了以下实验。
实验中使用的细胞系是不表达HER2和EpCAM的细胞系(CHO-K1)、表达HER2的细胞系(CHO-HER2)和表达EpCAM的细胞系(CHO-EpCAM)。用含有100U/ml青霉素/100μg/ml链霉素(Welgene公司)和10％ FBS(胎牛血清)的HaM's F-12K培养基(Welgene公司)培养中国仓鼠卵巢细胞系CHO-K1、CHO-HER2和CHO-EpCAM(Kuroki M.等人，J Biol.Chem.，1991，74:10132-10141)。
对于特异性病毒感染，将2.5×104CHO-K1、CHO-HER2和CHO-EpCAM细胞系施用于96孔板上。24小时后，将实施例4中制备的HER2双靶向病毒(HADa-HgH-D)、实施例5中制备的EpCAM双靶向病毒(EADa-EgH-D)和实施例10中制备的HER2/EpCAM双靶向病毒(EADa-HgH-D)用于以5MOI进行感染。90分钟后，用新鲜培养基替换所用的培养基，以除去剩余的初始病毒。感染2天后，通过每个细胞系中的荧光表达观察病毒感染(Baek H.J.等人，Mol.Ther.，2011.19(3):507-514)。
其结果示于图20中。从图20可以明显看出，示出了被病毒感染的细胞系的荧光显微镜图像。观察到没有病毒感染不表达HER2和EpCAM的CHO-K1细胞系。HER2双靶向病毒(HADa-HgH-D)仅感染CHO-HER2,EpCAM双靶向病毒(EADa-EgH-D)仅感染CHO-EpCAM。然而，证实了HER2/EpCAM双靶向病毒(EADa-HgH-D)感染所有CHO-HER2和CHO-EpCAM细胞。基于上述结果，可以确认使用能够一起靶向两种靶分子的病毒来靶向至少两种靶分子的策略的可能性。
<实施例12>表达HER2/EpCAM双靶向接头的HSV-1的双靶向作用的实验
为了证实用实施例3中制备的表达EpCAMscFv-HveA接头和HER2scFv-HveA两者的HER2和EpCAM双靶向病毒(EADA-hada-D)诱导表达HER2和EpCAM蛋白的细胞感染，进行了以下实验。
实验中使用的细胞系是不表达HER2和EpCAM的细胞系(CHO-K1)、表达HER2的细胞系(CHO-HER2)和表达EpCAM的细胞系(CHO-EpCAM)。用含有100U/ml青霉素/100μg/ml链霉素(Welgene公司)和10％ FBS(胎牛血清)的HaM's F-12K培养基(Welgene公司)培养中国仓鼠卵巢细胞系CHO-K1、CHO-HER2和CHO-EpCAM(Kuroki M.等人，J Biol.Chem.，1991，74:10132-10141)。
对于特异性病毒感染，将2.5×104CHO-K1、CHO-HER2和CHO-EpCAM细胞系施用于96孔板上。24小时后，将实施例3中制备的仅表达HER2scFv-HveA接头的病毒(HADa-S)、仅表达EpCAMscFv-HveA接头的病毒(EADa-S)和表达EpCAMscFv-HveA接头和HER2scFv-HveA接头两者的双靶向病毒(EADa-HADa-D)用于以5MOI进行感染。90分钟后，用新鲜培养基替换所用的培养基，以除去剩余的初始病毒和接头。感染2天后，使用荧光显微镜通过每个细胞系中的荧光表达观察病毒感染(Baek H.J.等人，Mol.Ther.，2011.19(3):507-514)。
结果，图21示出了用各种病毒感染的细胞系的荧光显微镜图像。观察到没有病毒感染不表达HER2和EpCAM的CHO-K1细胞系。仅表达HER2scFv-HveA接头的病毒(HADa-S)仅感染CHO-HER2，而仅表达EpCAMscFv-HveA接头的病毒(EADa-S)仅感染CHO-EpCAM。然而，证实了表达EpCAMscFv-HveA接头和HER2scFv-HveA接头的双靶向病毒(EADa-HADa-D)感染所有CHO-HER2和CHO-EpCAM细胞。
基于上述结果，可以确认使用能够一起靶向两种靶分子的病毒来靶向至少两种靶分子的策略的可能性。
<110> 吉赛尔美德公司（KOREA, Gencellmed）
<120> 含有表达肿瘤细胞靶向结构域和HVEM的细胞外结构域的融合蛋白的
表达盒的重组单纯疱疹病毒及其用途
（Recombinant Herpes Simplex Virus Containing Expression Cassette
Expressing a Fused Protein of Tumor Cell-targeting Domain and
Extracellular Damain of HVEM and Use of the Same）
<130> PP20-000
<160> 46
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 904
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gB
<400> 1
Met His Gln Gly Ala Pro Ser Trp Gly Arg Arg Trp Phe Val Val Trp
1 5 10 15
Ala Leu Leu Gly Leu Thr Leu Gly Val Leu Val Ala Ser Ala Ala Pro
20 25 30
Ser Ser Pro Gly Thr Pro Gly Val Ala Ala Ala Thr Gln Ala Ala Asn
35 40 45
Gly Gly Pro Ala Thr Pro Ala Pro Pro Ala Leu Gly Ala Ala Pro Thr
50 55 60
Gly Asp Pro Lys Pro Lys Lys Asn Lys Lys Pro Lys Asn Pro Thr Pro
65 70 75 80
Pro Arg Pro Ala Gly Asp Asn Ala Thr Val Ala Ala Gly His Ala Thr
85 90 95
Leu Arg Glu His Leu Arg Asp Ile Lys Ala Glu Asn Thr Asp Ala Asn
100 105 110
Phe Tyr Val Cys Pro Pro Pro Thr Gly Ala Thr Val Val Gln Phe Glu
115 120 125
Gln Pro Arg Arg Cys Pro Thr Arg Pro Glu Gly Gln Asn Tyr Thr Glu
130 135 140
Gly Ile Ala Val Val Phe Lys Glu Asn Ile Ala Pro Tyr Lys Phe Lys
145 150 155 160
Ala Thr Met Tyr Tyr Lys Asp Val Thr Val Ser Gln Val Trp Phe Gly
165 170 175
His Arg Tyr Ser Gln Phe Met Gly Ile Phe Glu Asp Arg Ala Pro Val
180 185 190
Pro Phe Glu Glu Val Ile Asp Lys Ile Asn Ala Lys Gly Val Cys Arg
195 200 205
Ser Thr Ala Lys Tyr Val Arg Asn Asn Leu Glu Thr Thr Ala Phe His
210 215 220
Arg Asp Asp His Glu Thr Asp Met Glu Leu Lys Pro Ala Asn Ala Ala
225 230 235 240
Thr Arg Thr Ser Arg Gly Trp His Thr Thr Asp Leu Lys Tyr Asn Pro
245 250 255
Ser Arg Val Glu Ala Phe His Arg Tyr Gly Thr Thr Val Asn Cys Ile
260 265 270
Val Glu Glu Val Asp Ala Arg Ser Val Tyr Pro Tyr Asp Glu Phe Val
275 280 285
Leu Ala Thr Gly Asp Phe Val Tyr Met Ser Pro Phe Tyr Gly Tyr Arg
290 295 300
Glu Gly Ser His Thr Glu His Thr Ser Tyr Thr Ala Asp Arg Phe Lys
305 310 315 320
Gln Val Asp Gly Phe Tyr Ala Arg Asp Leu Thr Thr Lys Ala Arg Ala
325 330 335
Thr Ala Pro Thr Thr Arg Asn Leu Leu Thr Thr Pro Lys Phe Thr Val
340 345 350
Ala Trp Asp Trp Val Pro Lys Arg Pro Ser Val Cys Thr Met Thr Lys
355 360 365
Trp Gln Glu Val Asp Glu Met Leu Arg Ser Glu Tyr Gly Gly Ser Phe
370 375 380
Arg Phe Ser Ser Asp Ala Ile Ser Thr Thr Phe Thr Thr Asn Leu Thr
385 390 395 400
Glu Tyr Pro Leu Ser Arg Val Asp Leu Gly Asp Cys Ile Gly Lys Asp
405 410 415
Ala Arg Asp Ala Met Asp Arg Ile Phe Ala Arg Arg Tyr Asn Ala Thr
420 425 430
His Ile Lys Val Gly Gln Pro Gln Tyr Tyr Leu Ala Asn Gly Gly Phe
435 440 445
Leu Ile Ala Tyr Gln Pro Leu Leu Ser Asn Thr Leu Ala Glu Leu Tyr
450 455 460
Val Arg Glu His Leu Arg Glu Gln Ser Arg Lys Pro Pro Asn Pro Thr
465 470 475 480
Pro Pro Pro Pro Gly Ala Ser Ala Asn Ala Ser Val Glu Arg Ile Lys
485 490 495
Thr Thr Ser Ser Ile Glu Phe Ala Arg Leu Gln Phe Thr Tyr Asn His
500 505 510
Ile Gln Arg His Val Asn Asp Met Leu Gly Arg Val Ala Ile Ala Trp
515 520 525
Cys Glu Leu Gln Asn His Glu Leu Thr Leu Trp Asn Glu Ala Arg Lys
530 535 540
Leu Asn Pro Asn Ala Ile Ala Ser Val Thr Val Gly Arg Arg Val Ser
545 550 555 560
Ala Arg Met Leu Gly Asp Val Met Ala Val Ser Thr Cys Val Pro Val
565 570 575
Ala Ala Asp Asn Val Ile Val Gln Asn Ser Met Arg Ile Ser Ser Arg
580 585 590
Pro Gly Ala Cys Tyr Ser Arg Pro Leu Val Ser Phe Arg Tyr Glu Asp
595 600 605
Gln Gly Pro Leu Val Glu Gly Gln Leu Gly Glu Asn Asn Glu Leu Arg
610 615 620
Leu Thr Arg Asp Ala Ile Glu Pro Cys Thr Val Gly His Arg Arg Tyr
625 630 635 640
Phe Thr Phe Gly Gly Gly Tyr Val Tyr Phe Glu Glu Tyr Ala Tyr Ser
645 650 655
His Gln Leu Ser Arg Ala Asp Ile Thr Thr Val Ser Thr Phe Ile Asp
660 665 670
Leu Asn Ile Thr Met Leu Glu Asp His Glu Phe Val Pro Leu Glu Val
675 680 685
Tyr Thr Arg His Glu Ile Lys Asp Ser Gly Leu Leu Asp Tyr Thr Glu
690 695 700
Val Gln Arg Arg Asn Gln Leu His Asp Leu Arg Phe Ala Asp Ile Asp
705 710 715 720
Thr Val Ile His Ala Asp Ala Asn Ala Ala Met Phe Ala Gly Leu Gly
725 730 735
Ala Phe Phe Glu Gly Met Gly Asp Leu Gly Arg Ala Val Gly Lys Val
740 745 750
Val Met Gly Ile Val Gly Gly Val Val Ser Ala Val Ser Gly Val Ser
755 760 765
Ser Phe Met Ser Asn Pro Phe Gly Ala Leu Ala Val Gly Leu Leu Val
770 775 780
Leu Ala Gly Leu Ala Ala Ala Phe Phe Ala Phe Arg Tyr Val Met Arg
785 790 795 800
Leu Gln Ser Asn Pro Met Lys Ala Leu Tyr Pro Leu Thr Thr Lys Glu
805 810 815
Leu Lys Asn Pro Thr Asn Pro Asp Ala Ser Gly Glu Gly Glu Glu Gly
820 825 830
Gly Asp Phe Asp Glu Ala Lys Leu Ala Glu Ala Arg Glu Met Ile Arg
835 840 845
Tyr Met Ala Leu Val Ser Ala Met Glu Arg Thr Glu His Lys Ala Lys
850 855 860
Lys Lys Gly Thr Ser Ala Leu Leu Ser Ala Lys Val Thr Asp Met Val
865 870 875 880
Met Arg Lys Arg Arg Asn Thr Asn Tyr Thr Gln Val Pro Asn Lys Asp
885 890 895
Gly Asp Ala Asp Glu Asp Asp Leu
900
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<211> 511
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gC
<400> 2
Met Ala Pro Gly Arg Val Gly Leu Ala Val Val Leu Trp Ser Leu Leu
1 5 10 15
Trp Leu Gly Ala Gly Val Ala Gly Gly Ser Glu Thr Ala Ser Thr Gly
20 25 30
Pro Thr Ile Thr Ala Gly Ala Val Thr Asn Ala Ser Glu Ala Pro Thr
35 40 45
Ser Gly Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser Pro Glu Val Thr Pro Thr Ser
50 55 60
Thr Pro Asn Pro Asn Asn Val Thr Gln Asn Lys Thr Thr Pro Thr Glu
65 70 75 80
Pro Ala Ser Pro Pro Thr Thr Pro Lys Pro Thr Ser Thr Pro Lys Ser
85 90 95
Pro Pro Thr Ser Thr Pro Asp Pro Lys Pro Lys Asn Asn Thr Thr Pro
100 105 110
Ala Lys Ser Gly Arg Pro Thr Lys Pro Pro Gly Pro Val Trp Cys Asp
115 120 125
Arg Arg Asp Pro Leu Ala Arg Tyr Gly Ser Arg Val Gln Ile Arg Cys
130 135 140
Arg Phe Arg Asn Ser Thr Arg Met Glu Phe Arg Leu Gln Ile Trp Arg
145 150 155 160
Tyr Ser Met Gly Pro Ser Pro Pro Ile Ala Pro Ala Pro Asp Leu Glu
165 170 175
Glu Val Leu Thr Asn Ile Thr Ala Pro Pro Gly Gly Leu Leu Val Tyr
180 185 190
Asp Ser Ala Pro Asn Leu Thr Asp Pro His Val Leu Trp Ala Glu Gly
195 200 205
Ala Gly Pro Gly Ala Asp Pro Pro Leu Tyr Ser Val Thr Gly Pro Leu
210 215 220
Pro Thr Gln Arg Leu Ile Ile Gly Glu Val Thr Pro Ala Thr Gln Gly
225 230 235 240
Met Tyr Tyr Leu Ala Trp Gly Arg Met Asp Ser Pro His Glu Tyr Gly
245 250 255
Thr Trp Val Arg Val Arg Met Phe Arg Pro Pro Ser Leu Thr Leu Gln
260 265 270
Pro His Ala Val Met Glu Gly Gln Pro Phe Lys Ala Thr Cys Thr Ala
275 280 285
Ala Ala Tyr Tyr Pro Arg Asn Pro Val Glu Phe Val Trp Phe Glu Asp
290 295 300
Asp Arg Gln Val Phe Asn Pro Gly Gln Ile Asp Thr Gln Thr His Glu
305 310 315 320
His Pro Asp Gly Phe Thr Thr Val Ser Thr Val Thr Ser Glu Ala Val
325 330 335
Gly Gly Gln Val Pro Pro Arg Thr Phe Thr Cys Gln Met Thr Trp His
340 345 350
Arg Asp Ser Val Met Phe Ser Arg Arg Asn Ala Thr Gly Leu Ala Leu
355 360 365
Val Leu Pro Arg Pro Thr Ile Thr Met Glu Phe Gly Val Arg His Val
370 375 380
Val Cys Thr Ala Gly Cys Val Pro Glu Gly Val Thr Phe Ala Trp Phe
385 390 395 400
Leu Gly Asp Asp Pro Ser Pro Ala Ala Lys Ser Ala Val Thr Ala Gln
405 410 415
Glu Ser Cys Asp His Pro Gly Leu Ala Thr Val Arg Ser Thr Leu Pro
420 425 430
Ile Ser Tyr Asp Tyr Ser Glu Tyr Ile Cys Arg Leu Thr Gly Tyr Pro
435 440 445
Ala Gly Ile Pro Val Leu Glu His His Gly Ser His Gln Pro Pro Pro
450 455 460
Arg Asp Pro Thr Glu Arg Gln Val Ile Glu Ala Ile Glu Trp Val Gly
465 470 475 480
Ile Gly Ile Gly Val Leu Ala Ala Gly Val Leu Val Val Thr Ala Ile
485 490 495
Val Tyr Val Val Arg Thr Ser Gln Ser Arg Gln Arg His Arg Arg
500 505 510
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gH
<400> 3
Met Gly Asn Gly Leu Trp Phe Val Gly Val Ile Leu Leu Gly Val Ala
1 5 10 15
Trp Gly Gln Val His Asp Trp Thr Glu Gln Thr Asp Pro Trp Phe Leu
20 25 30
Asp Gly Leu Gly Met Asp Arg Met Tyr Trp Arg Asp Thr Asn Thr Gly
35 40 45
Arg Leu Trp Leu Pro Asn Thr Pro Asp Pro Gln Lys Pro Pro Arg Gly
50 55 60
Phe Leu Ala Pro Pro Asp Glu Leu Asn Leu Thr Thr Ala Ser Leu Pro
65 70 75 80
Leu Leu Arg Trp Tyr Glu Glu Arg Phe Cys Phe Val Leu Val Thr Thr
85 90 95
Ala Glu Phe Pro Arg Asp Pro Gly Gln Leu Leu Tyr Ile Ser Lys Thr
100 105 110
Tyr Leu Leu Gly Arg Pro Pro Asn Ala Ser Leu Pro Ala Pro Ile Thr
115 120 125
Val Glu Pro Thr Ala Gln Pro Pro Pro Ala Val Ala Pro Leu Lys Gly
130 135 140
Leu Leu His Asn Pro Thr Ala Ser Val Leu Leu Arg Ser Arg Ala Trp
145 150 155 160
Val Thr Phe Ser Ala Val Pro Asp Pro Glu Ala Leu Thr Phe Pro Arg
165 170 175
Gly Asp Asn Val Ala Thr Ala Ser His Pro Ser Gly Pro Arg Asp Thr
180 185 190
Pro Pro Pro Arg Pro Pro Val Gly Ala Arg Arg His Pro Thr Thr Glu
195 200 205
Leu Asp Ile Thr His Leu His Asn Ala Ser Thr Thr Trp Leu Ala Thr
210 215 220
Arg Gly Leu Leu Arg Ser Pro Gly Arg Tyr Val Tyr Phe Ser Pro Ser
225 230 235 240
Ala Ser Thr Trp Pro Val Gly Ile Trp Thr Thr Gly Glu Leu Val Leu
245 250 255
Gly Cys Asp Ala Ala Leu Val Arg Ala Arg Tyr Gly Arg Glu Phe Met
260 265 270
Gly Leu Val Ile Ser Met His Asp Ser Pro Pro Val Glu Val Met Val
275 280 285
Val Pro Ala Gly Gln Thr Leu Asp Arg Val Gly Asp Pro Ala Asp Glu
290 295 300
Asn Pro Pro Gly Ala Leu Pro Gly Pro Pro Gly Gly Pro Arg Tyr Arg
305 310 315 320
Val Phe Val Leu Gly Ser Leu Thr Arg Ala Asp Asn Gly Ser Ala Leu
325 330 335
Asp Ala Leu Arg Arg Val Gly Gly Tyr Pro Glu Glu Gly Thr Asn Tyr
340 345 350
Ala Gln Phe Leu Ser Arg Ala Tyr Ala Glu Phe Phe Ser Gly Asp Ala
355 360 365
Gly Ala Glu Gln Gly Pro Arg Pro Pro Leu Phe Trp Arg Leu Thr Gly
370 375 380
Leu Leu Ala Thr Ser Gly Phe Ala Phe Val Asn Ala Ala His Ala Asn
385 390 395 400
Gly Ala Val Cys Leu Ser Asp Leu Leu Gly Phe Leu Ala His Ser Arg
405 410 415
Ala Leu Ala Gly Leu Ala Ala Arg Gly Ala Ala Gly Cys Ala Ala Asp
420 425 430
Ser Val Phe Phe Asn Val Ser Val Leu Asp Pro Thr Ala Arg Leu Gln
435 440 445
Leu Glu Ala Arg Leu Gln His Leu Val Ala Glu Ile Leu Glu Arg Glu
450 455 460
Gln Ser Leu Ala Leu His Ala Leu Gly Tyr Gln Leu Ala Phe Val Leu
465 470 475 480
Asp Ser Pro Ser Ala Tyr Asp Ala Val Ala Pro Ser Ala Ala His Leu
485 490 495
Ile Asp Ala Leu Tyr Ala Glu Phe Leu Gly Gly Arg Val Leu Thr Thr
500 505 510
Pro Val Val His Arg Ala Leu Phe Tyr Ala Ser Ala Val Leu Arg Gln
515 520 525
Pro Phe Leu Ala Gly Val Pro Ser Ala Val Gln Arg Glu Arg Ala Arg
530 535 540
Arg Ser Leu Leu Ile Ala Ser Ala Leu Cys Thr Ser Asp Val Ala Ala
545 550 555 560
Ala Thr Asn Ala Asp Leu Arg Thr Ala Leu Ala Arg Ala Asp His Gln
565 570 575
Lys Thr Leu Phe Trp Leu Pro Asp His Phe Ser Pro Cys Ala Ala Ser
580 585 590
Leu Arg Phe Asp Leu Asp Glu Ser Val Phe Ile Leu Asp Ala Leu Ala
595 600 605
Gln Ala Thr Arg Ser Glu Thr Pro Val Glu Val Leu Ala Gln Gln Thr
610 615 620
His Gly Leu Ala Ser Thr Leu Thr Arg Trp Ala His Tyr Asn Ala Leu
625 630 635 640
Ile Arg Ala Phe Val Pro Glu Ala Ser His Arg Cys Gly Gly Gln Ser
645 650 655
Ala Asn Val Glu Pro Arg Ile Leu Val Pro Ile Thr His Asn Ala Ser
660 665 670
Tyr Val Val Thr His Ser Pro Leu Pro Arg Gly Ile Gly Tyr Lys Leu
675 680 685
Thr Gly Val Asp Val Arg Arg Pro Leu Phe Leu Thr Tyr Leu Thr Ala
690 695 700
Thr Cys Glu Gly Ser Thr Arg Asp Ile Glu Ser Lys Arg Leu Val Arg
705 710 715 720
Thr Gln Asn Gln Arg Asp Leu Gly Leu Val Gly Ala Val Phe Met Arg
725 730 735
Tyr Thr Pro Ala Gly Glu Val Met Ser Val Leu Leu Val Asp Thr Asp
740 745 750
Asn Thr Gln Gln Gln Ile Ala Ala Gly Pro Thr Glu Gly Ala Pro Ser
755 760 765
Val Phe Ser Ser Asp Val Pro Ser Thr Ala Leu Leu Leu Phe Pro Asn
770 775 780
Gly Thr Val Ile His Leu Leu Ala Phe Asp Thr Gln Pro Val Ala Ala
785 790 795 800
Ile Ala Pro Gly Phe Leu Ala Ala Ser Ala Leu Gly Val Val Met Ile
805 810 815
Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ile Leu Lys Val Leu Arg Thr Ser Val Pro
820 825 830
Phe Phe Trp Arg Arg Glu
835
<210> 4
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HER2 VH
<400> 4
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 5
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HER2 VL
<400> 5
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 6
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EpCAM VL
<400> 6
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn
85 90 95
Leu Glu Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys
100 105 110
Arg
<210> 7
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EpCAM VH
<400> 7
Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Val
1 5 10 15
Arg Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met
20 25 30
Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp
35 40 45
Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Thr Tyr Ala Asp Ser Phe Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Ala Ser Ala Ala Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Ile Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
85 90 95
Phe Ala Ile Lys Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Leu Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 8
<211> 82
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HveA 82
<400> 8
Leu Pro Ser Cys Lys Glu Asp Glu Tyr Pro Val Gly Ser Glu Cys Cys
1 5 10 15
Pro Lys Cys Ser Pro Gly Tyr Arg Val Lys Glu Ala Cys Gly Glu Leu
20 25 30
Thr Gly Thr Val Cys Glu Pro Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Ile Ala His
35 40 45
Leu Asn Gly Leu Ser Lys Cys Leu Gln Cys Gln Met Cys Asp Pro Ala
50 55 60
Met Gly Leu Arg Ala Ser Arg Asn Cys Ser Arg Thr Glu Asn Ala Val
65 70 75 80
Cys Gly
<210> 9
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> leader sequence _ HveA82
<400> 9
Met Glu Pro Pro Gly Asp Trp Gly Pro Pro Pro Trp Arg Ser Thr Pro
1 5 10 15
Arg Thr Asp Val Leu Arg Leu Val Leu Tyr Leu Thr Phe Leu Gly Ala
20 25 30
Pro Cys Tyr Ala Pro Ala Leu Pro Ser Cys Lys Glu Asp Glu Tyr Pro
35 40 45
Val Gly Ser Glu Cys Cys Pro Lys Cys Ser Pro Gly Tyr Arg Val Lys
50 55 60
Glu Ala Cys Gly Glu Leu Thr Gly Thr Val Cys Glu Pro Cys Pro Pro
65 70 75 80
Gly Thr Tyr Ile Ala His Leu Asn Gly Leu Ser Lys Cys Leu Gln Cys
85 90 95
Gln Met Cys Asp Pro Ala Met Gly Leu Arg Ala Ser Arg Asn Cys Ser
100 105 110
Arg Thr Glu Asn Ala Val Cys Gly
115 120
<210> 10
<211> 87
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HveA 87
<400> 10
Leu Pro Ser Cys Lys Glu Asp Glu Tyr Pro Val Gly Ser Glu Cys Cys
1 5 10 15
Pro Lys Cys Ser Pro Gly Tyr Arg Val Lys Glu Ala Cys Gly Glu Leu
20 25 30
Thr Gly Thr Val Cys Glu Pro Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Ile Ala His
35 40 45
Leu Asn Gly Leu Ser Lys Cys Leu Gln Cys Gln Met Cys Asp Pro Ala
50 55 60
Met Gly Leu Arg Ala Ser Arg Asn Cys Ser Arg Thr Glu Asn Ala Val
65 70 75 80
Cys Gly Cys Ser Pro Gly His
85
<210> 11
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> leader sequence - HveA 87
<400> 11
Met Glu Pro Pro Gly Asp Trp Gly Pro Pro Pro Trp Arg Ser Thr Pro
1 5 10 15
Arg Thr Asp Val Leu Arg Leu Val Leu Tyr Leu Thr Phe Leu Gly Ala
20 25 30
Pro Cys Tyr Ala Pro Ala Leu Pro Ser Cys Lys Glu Asp Glu Tyr Pro
35 40 45
Val Gly Ser Glu Cys Cys Pro Lys Cys Ser Pro Gly Tyr Arg Val Lys
50 55 60
Glu Ala Cys Gly Glu Leu Thr Gly Thr Val Cys Glu Pro Cys Pro Pro
65 70 75 80
Gly Thr Tyr Ile Ala His Leu Asn Gly Leu Ser Lys Cys Leu Gln Cys
85 90 95
Gln Met Cys Asp Pro Ala Met Gly Leu Arg Ala Ser Arg Asn Cys Ser
100 105 110
Arg Thr Glu Asn Ala Val Cys Gly Cys Ser Pro Gly His
115 120 125
<210> 12
<211> 102
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HveA 102
<400> 12
Leu Pro Ser Cys Lys Glu Asp Glu Tyr Pro Val Gly Ser Glu Cys Cys
1 5 10 15
Pro Lys Cys Ser Pro Gly Tyr Arg Val Lys Glu Ala Cys Gly Glu Leu
20 25 30
Thr Gly Thr Val Cys Glu Pro Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Ile Ala His
35 40 45
Leu Asn Gly Leu Ser Lys Cys Leu Gln Cys Gln Met Cys Asp Pro Ala
50 55 60
Met Gly Leu Arg Ala Ser Arg Asn Cys Ser Arg Thr Glu Asn Ala Val
65 70 75 80
Cys Gly Cys Ser Pro Gly His Phe Cys Ile Val Gln Asp Gly Asp His
85 90 95
Cys Ala Ala Cys Arg Ala
100
<210> 13
<211> 140
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> leader sequence - HveA 102
<400> 13
Met Glu Pro Pro Gly Asp Trp Gly Pro Pro Pro Trp Arg Ser Thr Pro
1 5 10 15
Arg Thr Asp Val Leu Arg Leu Val Leu Tyr Leu Thr Phe Leu Gly Ala
20 25 30
Pro Cys Tyr Ala Pro Ala Leu Pro Ser Cys Lys Glu Asp Glu Tyr Pro
35 40 45
Val Gly Ser Glu Cys Cys Pro Lys Cys Ser Pro Gly Tyr Arg Val Lys
50 55 60
Glu Ala Cys Gly Glu Leu Thr Gly Thr Val Cys Glu Pro Cys Pro Pro
65 70 75 80
Gly Thr Tyr Ile Ala His Leu Asn Gly Leu Ser Lys Cys Leu Gln Cys
85 90 95
Gln Met Cys Asp Pro Ala Met Gly Leu Arg Ala Ser Arg Asn Cys Ser
100 105 110
Arg Thr Glu Asn Ala Val Cys Gly Cys Ser Pro Gly His Phe Cys Ile
115 120 125
Val Gln Asp Gly Asp His Cys Ala Ala Cys Arg Ala
130 135 140
<210> 14
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HveA 107
<400> 14
Leu Pro Ser Cys Lys Glu Asp Glu Tyr Pro Val Gly Ser Glu Cys Cys
1 5 10 15
Pro Lys Cys Ser Pro Gly Tyr Arg Val Lys Glu Ala Cys Gly Glu Leu
20 25 30
Thr Gly Thr Val Cys Glu Pro Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Ile Ala His
35 40 45
Leu Asn Gly Leu Ser Lys Cys Leu Gln Cys Gln Met Cys Asp Pro Ala
50 55 60
Met Gly Leu Arg Ala Ser Arg Asn Cys Ser Arg Thr Glu Asn Ala Val
65 70 75 80
Cys Gly Cys Ser Pro Gly His Phe Cys Ile Val Gln Asp Gly Asp His
85 90 95
Cys Ala Ala Cys Arg Ala Tyr Ala Thr Ser Ser
100 105
<210> 15
<211> 145
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> leader sequence - HveA 107
<400> 15
Met Glu Pro Pro Gly Asp Trp Gly Pro Pro Pro Trp Arg Ser Thr Pro
1 5 10 15
Arg Thr Asp Val Leu Arg Leu Val Leu Tyr Leu Thr Phe Leu Gly Ala
20 25 30
Pro Cys Tyr Ala Pro Ala Leu Pro Ser Cys Lys Glu Asp Glu Tyr Pro
35 40 45
Val Gly Ser Glu Cys Cys Pro Lys Cys Ser Pro Gly Tyr Arg Val Lys
50 55 60
Glu Ala Cys Gly Glu Leu Thr Gly Thr Val Cys Glu Pro Cys Pro Pro
65 70 75 80
Gly Thr Tyr Ile Ala His Leu Asn Gly Leu Ser Lys Cys Leu Gln Cys
85 90 95
Gln Met Cys Asp Pro Ala Met Gly Leu Arg Ala Ser Arg Asn Cys Ser
100 105 110
Arg Thr Glu Asn Ala Val Cys Gly Cys Ser Pro Gly His Phe Cys Ile
115 120 125
Val Gln Asp Gly Asp His Cys Ala Ala Cys Arg Ala Tyr Ala Thr Ser
130 135 140
Ser
145
<210> 16
<211> 369
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gD (ASM47818)
<400> 16
Lys Tyr Ala Leu Ala Asp Ala Ser Leu Lys Met Ala Asp Pro Asn Arg
1 5 10 15
Phe Arg Gly Lys Asp Leu Pro Val Leu Asp Gln Leu Thr Asp Pro Pro
20 25 30
Gly Val Arg Arg Val Tyr His Ile Gln Ala Gly Leu Pro Asp Pro Phe
35 40 45
Gln Pro Pro Ser Leu Pro Ile Thr Val Tyr Tyr Ala Val Leu Glu Arg
50 55 60
Ala Cys Arg Ser Val Leu Leu Asn Ala Pro Ser Glu Ala Pro Gln Ile
65 70 75 80
Val Arg Gly Ala Ser Glu Asp Val Arg Lys Gln Pro Tyr Asn Leu Thr
85 90 95
Ile Ala Trp Phe Arg Met Gly Gly Asn Cys Ala Ile Pro Ile Thr Val
100 105 110
Met Glu Tyr Thr Glu Cys Ser Tyr Asn Lys Ser Leu Gly Ala Cys Pro
115 120 125
Ile Arg Thr Gln Pro Arg Trp Asn Tyr Tyr Asp Ser Phe Ser Ala Val
130 135 140
Ser Glu Asp Asn Leu Gly Phe Leu Met His Ala Pro Ala Phe Glu Thr
145 150 155 160
Ala Gly Thr Tyr Leu Arg Leu Val Lys Ile Asn Asp Trp Thr Glu Ile
165 170 175
Thr Gln Phe Ile Leu Glu His Arg Ala Lys Gly Ser Cys Lys Tyr Ala
180 185 190
Leu Pro Leu Arg Ile Pro Pro Ser Ala Cys Leu Ser Pro Gln Ala Tyr
195 200 205
Gln Gln Gly Val Thr Val Asp Ser Ile Gly Met Leu Pro Arg Phe Ile
210 215 220
Pro Glu Asn Gln Arg Thr Val Ala Val Tyr Ser Leu Lys Ile Ala Gly
225 230 235 240
Trp His Gly Pro Lys Ala Pro Tyr Thr Ser Thr Leu Leu Pro Pro Glu
245 250 255
Leu Ser Glu Thr Pro Asn Ala Thr Gln Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Asp Ser Ala Leu Leu Glu Asp Pro Val Gly Thr Val Ala Pro
275 280 285
Gln Ile Pro Pro Asn Trp His Ile Pro Ser Ile Gln Asp Ala Ala Thr
290 295 300
Pro Tyr His Pro Pro Ala Thr Pro Asn Asn Met Gly Leu Ile Ala Gly
305 310 315 320
Ala Val Gly Gly Ser Leu Leu Ala Ala Leu Val Ile Cys Gly Ile Val
325 330 335
Tyr Trp Met His Arg Arg Thr Arg Lys Ala Pro Lys Arg Ile Arg Leu
340 345 350
Pro His Ile Arg Glu Asp Asp Gln Pro Ser Ser His Gln Pro Leu Phe
355 360 365
Tyr
<210> 17
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gD-rpsL For
<400> 17
cccaggccta ccagcagggg gtgacggtgg acagcatcgg gatgctgccc ggcctggtga 60
60
<210> 18
<211> 88
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gD-rpsL Rev
<400> 18
ccggcgatct tcaagctgta tacggcgacg gtgcgctggt tctcggggat tcagaagaac 60
tcgtcaagaa ggcgtgatgg cgggatcg 88
<210> 19
<211> 106
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gD R222N_F223I_mutant
<400> 19
cccaggccta ccagcagggg gtgacggtgg acagcatcgg gatgctgccc aatatcatcc 60
ccgagaacca gcgcaccgtc gccgtataca gcttgaagat cgccgg 106
<210> 20
<211> 74
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> UL26/27-rpsL_For
<400> 20
gcgtgggggg gaggaaatcg gcactgacca agggggtccg ttttgtcacg tcagaagaac 60
tcgtcaagaa ggcg 74
<210> 21
<211> 74
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> UL26/27-rpsL_Rev
<400> 21
aacacataaa ctcccccggg tgtccgcggc ctgtttcctc tttcctttcc ggcctggtga 60
tgatggcggg atcg 74
<210> 22
<211> 74
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> UL26/27-tkpA_For
<400> 22
gcgtgggggg gaggaaatcg gcactgacca agggggtccg ttttgtcacg gcctcagaag 60
ccatagagcc cacc 74
<210> 23
<211> 74
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> UL26/27-pCMV_Rev
<400> 23
aacacataaa ctcccccggg tgtccgcggc ctgtttcctc tttcctttcc tatacgcgtt 60
gacattgatt attg 74
<210> 24
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HER2 Linker
<400> 24
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 25
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EpCAM Linker
<400> 25
Ala Thr Pro Ser His Asn Ser His Gln Val Pro Ser Ala Gly Gly Pro
1 5 10 15
Thr Ala Asn Ser Gly Thr Ser Gly Ser Glu Val
20 25
<210> 26
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> scFv leader sequence
<400> 26
Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
1 5 10 15
Gly Ala Arg Cys
20
<210> 27
<211> 351
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Whole sequence _ HER2scFv-HveA adapter
<400> 27
Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
1 5 10 15
Gly Ala Arg Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
20 25 30
Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn
35 40 45
Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
50 55 60
Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr
65 70 75 80
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys
85 90 95
Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp
115 120 125
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr
145 150 155 160
Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile
165 170 175
Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln
180 185 190
Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe
195 200 205
Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr
210 215 220
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr
225 230 235 240
Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly
245 250 255
Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Glu Phe Leu Pro Ser
260 265 270
Cys Lys Glu Asp Glu Tyr Pro Val Gly Ser Glu Cys Cys Pro Lys Cys
275 280 285
Ser Pro Gly Tyr Arg Val Lys Glu Ala Cys Gly Glu Leu Thr Gly Thr
290 295 300
Val Cys Glu Pro Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Ile Ala His Leu Asn Gly
305 310 315 320
Leu Ser Lys Cys Leu Gln Cys Gln Met Cys Asp Pro Ala Met Gly Leu
325 330 335
Arg Ala Ser Arg Asn Cys Ser Arg Thr Glu Asn Ala Val Cys Gly
340 345 350
<210> 28
<211> 1053
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Whole sequence _ HER2scFv-HveA adapter
<400> 28
atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacagg tgccagatgt 60
gaggtgcagc tggttgaatc tggcggagga ctggttcagc ctggcggatc tctgagactg 120
tcttgtgccg ccagcggctt caacatcaag gacacctaca tccactgggt ccgacaggcc 180
cctggcaaag gacttgaatg ggtcgccaga atctacccca ccaacggcta caccagatac 240
gccgactctg tgaagggcag attcaccatc agcgccgaca ccagcaagaa caccgcctac 300
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac accgccgtgt actactgttc tagatgggga 360
ggcgacggct tctacgccat ggattattgg ggccagggca ccctggtcac agtttctagc 420
ggaggcggag gttctggcgg cggaggaagt ggtggcggag gctctgatat ccagatgaca 480
cagagcccca gcagcctgtc tgcctctgtg ggagacagag tgaccatcac ctgtagagcc 540
agccaggacg tgaacacagc cgtggcttgg tatcagcaga agcctggcaa ggcccctaag 600
ctgctgatct acagcgccag ctttctgtac agcggcgtgc ccagcagatt cagcggctct 660
agaagcggca ccgacttcac cctgaccata agcagtctgc agcccgagga cttcgccacc 720
tactactgtc agcagcacta caccacacct ccaaccttcg gacagggcac caaggtggaa 780
atcaagggtg gtggcggttc agaattcctg ccgtcctgca aggaggacga gtacccagtg 840
ggctccgagt gctgccccaa gtgcagtcca ggttatcgtg tgaaggaggc ctgcggggag 900
ctgacgggca cagtgtgtga accctgccct ccaggcacct acattgccca cctcaatggc 960
ctaagcaagt gtctgcagtg ccaaatgtgt gacccagcca tgggcctgcg cgcgagccgg 1020
aactgctcca ggacagagaa cgccgtgtgt ggc 1053
<210> 29
<211> 369
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Whole sequence _ EpCAMscFv-HveA adapter
<400> 29
Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
1 5 10 15
Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys Ser
35 40 45
Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys
50 55 60
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala
65 70 75 80
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
85 90 95
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
100 105 110
Cys Ala Gln Asn Leu Glu Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
115 120 125
Val Glu Leu Lys Arg Ala Thr Pro Ser His Asn Ser His Gln Val Pro
130 135 140
Ser Ala Gly Gly Pro Thr Ala Asn Ser Gly Thr Ser Gly Ser Glu Val
145 150 155 160
Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Val
165 170 175
Arg Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met
180 185 190
Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp
195 200 205
Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Thr Tyr Ala Asp Ser Phe Lys Gly
210 215 220
Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Ala Ser Ala Ala Tyr Leu Gln
225 230 235 240
Ile Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
245 250 255
Phe Ala Ile Lys Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Leu Thr Val
260 265 270
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Phe Leu Pro Ser Cys Lys Glu Asp
275 280 285
Glu Tyr Pro Val Gly Ser Glu Cys Cys Pro Lys Cys Ser Pro Gly Tyr
290 295 300
Arg Val Lys Glu Ala Cys Gly Glu Leu Thr Gly Thr Val Cys Glu Pro
305 310 315 320
Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Ile Ala His Leu Asn Gly Leu Ser Lys Cys
325 330 335
Leu Gln Cys Gln Met Cys Asp Pro Ala Met Gly Leu Arg Ala Ser Arg
340 345 350
Asn Cys Ser Arg Thr Glu Asn Ala Val Cys Gly His His His His His
355 360 365
His
<210> 30
<211> 1089
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Whole sequence _ EpCAMscFv-HveA adapter
<400> 30
atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacagg tgccagatgt 60
gatatccaga tgacccagtc cccgtcctcc ctgagtgctt ctgttggtga ccgtgttacc 120
atcacctgcc gttccaccaa atccctcctg cactccaacg gtatcaccta cctttattgg 180
tatcaacaga aaccgggtaa agctccgaaa cttctgatct accagatgtc caacctggct 240
tccggtgttc cgtctcgttt ctccagttct ggttctggta ccgacttcac cctgaccatc 300
tcttctctgc agccggaaga cttcgctacc tactactgcg ctcagaacct ggaaatcccg 360
cgtaccttcg gtcagggtac caaagttgaa cttaagcgcg ctaccccgtc tcacaactcc 420
caccaggttc catccgcagg cggtccgact gctaactctg gaactagtgg atccgaagta 480
cagctggttc agtccggccc gggtcttgtt caaccgggtg gttccgttcg tatctcttgc 540
gctgcttctg gttacacgtt caccaactac ggcatgaact gggtcaaaca ggctccgggt 600
aaaggcctgg aatggatggg ctggatcaac acctacaccg gtgaatccac ctacgctgac 660
tccttcaaag gtcgcttcac tttctccctc gacacaagtg ctagtgctgc atacctccaa 720
atcaactcgc tgcgtgcaga ggatacagca gtctattact gcgcccgttt cgctatcaaa 780
ggtgactact ggggtcaagg cacgctgctg accgtttcct cgggtggtgg cggttcagaa 840
ttcctgccgt cctgcaagga ggacgagtac ccagtgggct ccgagtgctg ccccaagtgc 900
agtccaggtt atcgtgtgaa ggaggcctgc ggggagctga cgggcacagt gtgtgaaccc 960
tgccctccag gcacctacat tgcccacctc aatggcctaa gcaagtgtct gcagtgccaa 1020
atgtgtgacc cagccatggg cctgcgcgcg agccggaact gctccaggac agagaacgcc 1080
gtgtgtggc 1089
<210> 31
<211> 79
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> UL3/4-rpsL-neo_for
<400> 31
taaataacac ataaatttgg ctggttgttt gttgtcttta atggaccgcc cgcaaggcct 60
ggtgatgatg gcgggatcg 79
<210> 32
<211> 78
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> UL3/4-rpsL-neo_rev
<400> 32
taggatcccg gccggatcgc gctcgtcacc cgacactgaa acgccccccc cccctcagaa 60
gaactcgtca agaaggcg 78
<210> 33
<211> 79
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> UL3/4-HM_pCMV_For
<400> 33
taaataacac ataaatttgg ctggttgttt gttgtcttta atggaccgcc cgcaatatac 60
gcgttgacat tgattattg 79
<210> 34
<211> 78
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> UL3/4_bGH_poly_R
<400> 34
taggatcccg gccggatcgc gctcgtcacc cgacactgaa acgccccccc ccccgcctca 60
gaagccatag agcccacc 78
<210> 35
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HER2scFv _ N terminus linker
<400> 35
Ala Ala Ala Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly
1 5 10
<210> 36
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HER2scFv _ C terminus linker
<400> 36
Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ala Ala Ala
1 5 10
<210> 37
<211> 267
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Whole sequence _ HER2scFv ligand
<400> 37
Ala Ala Ala Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Glu Val Gln
1 5 10 15
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg
20 25 30
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His
35 40 45
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile
50 55 60
Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
65 70 75 80
Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met
85 90 95
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp
100 105 110
Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
115 120 125
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
145 150 155 160
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp
165 170 175
Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
180 185 190
Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser
195 200 205
Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
210 215 220
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr
225 230 235 240
Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser
245 250 255
Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ala Ala Ala
260 265
<210> 38
<211> 801
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Whole sequence _ HER2scFv ligand
<400> 38
gcggccgcca gtagtggcgg tggctctggt tccggtggag aggtgcagct ggttgaatct 60
ggcggaggac tggttcagcc tggcggatct ctgagactgt cttgtgccgc cagcggcttc 120
aacatcaagg acacctacat ccactgggtc cgacaggccc ctggcaaagg acttgaatgg 180
gtcgccagaa tctaccccac caacggctac accagatacg ccgactctgt gaagggcaga 240
ttcaccatca gcgccgacac cagcaagaac accgcctacc tgcagatgaa cagcctgaga 300
gccgaggaca ccgccgtgta ctactgttct agatggggag gcgacggctt ctacgccatg 360
gattattggg gccagggcac cctggtcaca gtttctagcg gaggcggagg ttctggcggc 420
ggaggaagtg gtggcggagg ctctgatatc cagatgacac agagccccag cagcctgtct 480
gcctctgtgg gagacagagt gaccatcacc tgtagagcca gccaggacgt gaacacagcc 540
gtggcttggt atcagcagaa gcctggcaag gcccctaagc tgctgatcta cagcgccagc 600
tttctgtaca gcggcgtgcc cagcagattc agcggctcta gaagcggcac cgacttcacc 660
ctgaccataa gcagtctgca gcccgaggac ttcgccacct actactgtca gcagcactac 720
accacacctc caaccttcgg acagggcacc aaggtggaaa tcaagggtgg aggctctggt 780
tccggtggat ccgcggccgc g 801
<210> 39
<211> 73
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gH29/30-rpsL-neo_For
<400> 39
tcgtgggggt tattcttttg ggcgttgcgt ggggtcaggt ccacgactgg ggcctggtga 60
tgatggcggg atc 73
<210> 40
<211> 74
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gH29/30-rpsL-neo_Rev
<400> 40
ttcgtgtcgc gccagtacat gcggtccatg cccaggccat ccaaaaacca tcagaagaac 60
tcgtcaagaa ggcg 74
<210> 41
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gH29/30-scFv_For
<400> 41
tcgtgggggt tattcttttg gg 22
<210> 42
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gH29/30-scFv_Rev
<400> 42
ttcgtgtcgc gccagtacat g 21
<210> 43
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EpCAMscFv - N terminus linker
<400> 43
Ala Ala Ala Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10
<210> 44
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EpCAMscFv - C terminus linker
<400> 44
Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Ala Ala Ala
1 5 10
<210> 45
<211> 280
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Whole sequence - EpCAMscFv ligand
<400> 45
Ala Ala Ala Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Asp Ile Gln Met
1 5 10 15
Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr
20 25 30
Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr
35 40 45
Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
50 55 60
Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
65 70 75 80
Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
85 90 95
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn Leu Glu Ile Pro
100 105 110
Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys Arg Ala Thr Pro
115 120 125
Ser His Asn Ser His Gln Val Pro Ser Ala Gly Gly Pro Thr Ala Asn
130 135 140
Ser Gly Thr Ser Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Gly
145 150 155 160
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Val Arg Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly
165 170 175
Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly
180 185 190
Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser
195 200 205
Thr Tyr Ala Asp Ser Phe Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr
210 215 220
Ser Ala Ser Ala Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
225 230 235 240
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Phe Ala Ile Lys Gly Asp Tyr Trp
245 250 255
Gly Gln Gly Thr Leu Leu Thr Val Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly Ser
260 265 270
Gly Ser Gly Gly Ser Ala Ala Ala
275 280
<210> 46
<211> 840
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Whole sequence - EpCAMscFv ligand
<400> 46
gcggccgcca gtagtggcgg tggctctggt tccggtgata tccagatgac ccagtccccg 60
tcctccctga gtgcttctgt tggtgaccgt gttaccatca cctgccgttc caccaaatcc 120
ctcctgcact ccaacggtat cacctacctt tattggtatc aacagaaacc gggtaaagct 180
ccgaaacttc tgatctacca gatgtccaac ctggcttccg gtgttccgtc tcgtttctcc 240
agttctggtt ctggtaccga cttcaccctg accatctctt ctctgcagcc ggaagacttc 300
gctacctact actgcgctca gaacctggaa atcccgcgta ccttcggtca gggtaccaaa 360
gttgaactta agcgcgctac cccgtctcac aactcccacc aggttccatc cgcaggcggt 420
ccgactgcta actctggaac tagtggatcc gaagtacagc tggttcagtc cggcccgggt 480
cttgttcaac cgggtggttc cgttcgtatc tcttgcgctg cttctggtta cacgttcacc 540
aactacggca tgaactgggt caaacaggct ccgggtaaag gcctggaatg gatgggctgg 600
atcaacacct acaccggtga atccacctac gctgactcct tcaaaggtcg cttcactttc 660
tccctcgaca caagtgctag tgctgcatac ctccaaatca actcgctgcg tgcagaggat 720
acagcagtct attactgcgc ccgtttcgct atcaaaggtg actactgggg tcaaggcacg 780
ctgctgaccg tttcctcgtc ttccggtgga ggctctggtt ccggtggatc cgcggccgcg 840
840

Claims (46)

1.一种用于多重靶向的重组单纯疱疹病毒，其中将特异性结合癌细胞靶分子的靶向结构域和HVEM的细胞外结构域的融合蛋白的至少一个表达盒插入到单纯疱疹病毒的基因组中，从而能够多重表达所述融合蛋白而不抑制所述单纯疱疹病毒的繁殖。
2.根据权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述融合蛋白的所述表达盒具有多顺反子构型，其中包含至少两种融合蛋白基因，并且编码IRES(内部核糖体进入位点)或2A肽的核酸序列位于所述基因之间。
3.根据权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述融合蛋白的所述表达盒具有单顺反子构型，其中至少两种表达盒被插入到所述病毒的所述基因组中。
4.根据权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其中，以多种方式表达的所述融合蛋白具有(i)特异性结合相同靶分子的靶向结构域，或(ii)特异性结合不同靶分子的不同靶向结构域。
5.根据权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其中，HVEM的所述细胞外结构域是包含SEQ ID NO:8或9的氨基酸序列的HveA82、包含SEQ ID NO:10或11的氨基酸序列的HveA87、包含SEQ ID NO:12或13的氨基酸序列的HveA102，或包含SEQ ID NO:14或15的氨基酸序列的HveA107。
6.根据权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述融合蛋白是这样一种融合蛋白：其中癌细胞靶向结构域和HVEM(HveA)的所述细胞外结构域经由包含1至30个氨基酸的连接子肽连接，并且
所述连接子肽包含至少一个选自Ser、Gly、Ala和Thr的氨基酸。
7.根据权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述靶分子是癌细胞表面上的抗原或受体，与正常细胞相比，其仅在癌细胞中表达或在癌细胞中过表达。
8.根据权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述抗原或所述受体是EGFRvIII、EGFR、metastin受体、受体酪氨酸激酶、HER2(人表皮生长因子受体2)、酪氨酸激酶-18-受体(c-Kit)、HGF受体c-Met、CXCR4、CCR7、内皮素-A受体、PPAR-δ(过氧化物酶体增殖物激活受体δ)、PDGFR-α(血小板衍生生长因子受体α)、CD133、CEA(癌胚抗原)、EpCAM(上皮细胞粘附分子)、MSLN(间皮素)、GD2(二唾液酸神经节苷脂)、GPC3(磷脂酰肌醇聚糖3)、PS MA(前列腺特异性膜抗原)、TAG-72(肿瘤相关糖蛋白72)、GD3(二唾液酸神经节苷脂)、HLA-DR(人白细胞抗原-DR)、MUC1(粘蛋白1)、NY-ESO-1(纽约食管鳞状细胞癌1)、LMP1(潜伏膜蛋白1)、TRAILR2(肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体)、VEGFR2(血管内皮生长因子受体2)、HGFR(肝细胞生长因子受体)、CD44或CD166。
9.根据权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述靶分子是HER2，并且
所述靶向结构域是scFv，被构建成使得SEQ ID NO:4的VH和SEQ ID NO:5的VL按照VH、连接子肽和VL的顺序经由所述连接子肽连接。
10.根据权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述靶分子是EpCAM，并且
所述靶向结构域是scFv，被构建成使得SEQ ID NO:6的VL和SEQ ID NO:7的VH按照VL、连接子肽和VH的顺序经由所述连接子肽连接。
11.根据权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述重组单纯疱疹病毒被构建成使得SEQ ID NO:16的gD(糖蛋白D)的氨基酸序列的第222位的精氨酸(R)和第223位的苯丙氨酸(F)分别被天冬酰胺(N)和异亮氨酸(I)取代。
12.根据权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述重组单纯疱疹病毒是重组HSV-1病毒、重组HSV-2病毒或HSV-1和HSV-2嵌合病毒。
13.根据权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述重组单纯疱疹病毒是衍生自HSV-1KOS株的重组HSV-1。
14.根据权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述重组单纯疱疹病毒被构建成使得，表达选自以下任意一种的表达盒：(i)细胞因子，(ii)趋化因子，(iii)免疫检查点的拮抗剂，(iv)诱导免疫细胞活化的共刺激因子，(v)TGFβ的拮抗剂，其抑制对癌细胞的免疫应答，(vi)乙酰肝素酶，其降解用于实体肿瘤微环境的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，(vii)拮抗剂，其抑制血管生成因子受体VEGFR-2(VEGF受体-2)的功能，和(viii)前药活化酶，其将前药转化为对癌细胞表现毒性的药物，被进一步插入到所述单纯疱疹病毒的所述基因组中而不抑制所述单纯疱疹病毒的增殖。
15.根据权利要求14所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述细胞因子是选自以下的至少一种：白介素，包括IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18和IL-24；干扰素，包括IFNα、IFNβ和IFNγ；肿瘤坏死因子，包括TNFα、GM-CSF、G-CSF和FLT3L，
所述趋化因子是选自CCL2、RANTES、CCL7、CCL9、CCL10、CCL12、CCL15、CCL19、CCL21、CCL20和XCL-1中的至少一种，
所述免疫检查点是选自以下的至少一种：PD-1(程序性死亡受体1)、PD-L1(程序性死亡受体配体1)、PD-L2(程序性死亡受体配体2)、CD27(分化簇27)、CD28(分化簇28)、CD70(分化簇70)、CD80(分化簇80)、CD86(分化簇86)、CD137(分化簇137)、CD276(分化簇276)、KIR(杀伤细胞免疫球蛋白样受体)、LAG3(淋巴细胞活化基因3)、GITR(糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白)、GITRL(糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白配体)和CTLA-4(溶细胞T淋巴细胞相关抗原-4)，
所述共刺激因子是选自以下的至少一种：CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、LFA-1(淋巴细胞功能相关抗原-1)、ICOS(诱导型T细胞共刺激物)、CD3γ、CD3δ和CD3ε，以及
所述前药活化酶是选自从大肠杆菌分离的胞嘧啶脱氨酶、大鼠细胞色素P450(CYP2B1)羧酸酯酶、细菌硝基还原酶和PNP(嘌呤核苷磷酸化酶)中的至少一种。
16.根据权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述融合蛋白的所述表达盒被插入所述病毒的所述基因组中的UL3和UL4基因之间、UL26和UL27基因之间、UL37和UL38基因之间、UL48和UL49基因之间、UL53和UL54基因之间，或US1和US2基因之间。
17.根据权利要求14所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述表达盒被插入所述病毒的所述基因组中的UL3和UL4基因之间、UL26和UL27基因之间、UL37和UL38基因之间、UL48和UL49基因之间、UL53和UL54基因之间，或US1和US2基因之间，其中其插入位点不同于所述融合蛋白的所述表达盒的插入位点。
18.根据权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述融合蛋白按照NH2/癌细胞靶向结构域/HVEM的细胞外结构域/COOH的顺序被构建，或按照与其相反的顺序被构建。
19.根据权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述融合蛋白被构建成使得癌细胞靶向结构域和HVEM的所述细胞外结构域经由连接子肽连接，并且所述融合蛋白按照NH2/癌细胞靶向结构域/连接子肽/HVEM的细胞外结构域/COOH的顺序被构建，或按照与其相反的顺序被构建。
20.一种用于多重靶向的重组单纯疱疹病毒，其中(i)至少一个能够表达接头的表达盒被插入到单纯疱疹病毒的基因组中，而不抑制所述单纯疱疹病毒的增殖，所述接头是特异性结合癌细胞靶分子的靶向结构域和HVEM的细胞外结构域的融合蛋白，和(ii)特异性结合癌细胞靶分子的靶向域被插入并融合到其糖蛋白中。
21.根据权利要求20所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述糖蛋白是gB、gC、gD或gH。
22.根据权利要求20所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述糖蛋白是gB，并且
被插入并融合到所述糖蛋白中的所述靶向结构域，被插入并融合到N-端，位于SEQ IDNO:1的gB的氨基酸序列中的氨基酸31至78的区域内的任何位置、氨基酸80至363的区域内的任何位置，或氨基酸408至896的区域内的任何位置。
23.根据权利要求20所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述糖蛋白是gB，并且
被插入并融合到所述糖蛋白中的所述靶向结构域，被插入并融合到N-端，位于SEQ IDNO:1的gB的氨基酸序列中的氨基酸43之后的位置、氨基酸52之后的位置、氨基酸70之后的位置、氨基酸76之后的位置、氨基酸80之后的位置、氨基酸81之后的位置、氨基酸95之后的位置、氨基酸100之后的位置、氨基酸137之后的位置、氨基酸185之后的位置、氨基酸187之后的位置、氨基酸241之后的位置、氨基酸261之后的位置、氨基酸265之后的位置、氨基酸304之后的位置、氨基酸334之后的位置、氨基酸361之后的位置、氨基酸408之后的位置、氨基酸419之后的位置、氨基酸430之后的位置、氨基酸458之后的位置、氨基酸470之后的位置、氨基酸481之后的位置、氨基酸495之后的位置、氨基酸497之后的位置、氨基酸546之后的位置、氨基酸608之后的位置、氨基酸630之后的位置、氨基酸663之后的位置、氨基酸664之后的位置、氨基酸665之后的位置、氨基酸671之后的位置、氨基酸673之后的位置、氨基酸690之后的位置、氨基酸725之后的位置、氨基酸730之后的位置、氨基酸732之后的位置、氨基酸742之后的位置、氨基酸772之后的位置、氨基酸868之后的位置、氨基酸869之后的位置、氨基酸886之后的位置、氨基酸893之后的位置、氨基酸894之后的位置，或氨基酸895之后的位置。
24.根据权利要求20所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述糖蛋白是gC，并且
被插入并融合到所述糖蛋白中的所述靶向结构域，被插入并融合到位于SEQ ID NO:2的gC的氨基酸序列中的氨基酸33至154的区域内的位置。
25.根据权利要求20所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述糖蛋白是gC，并且
被插入并融合到所述糖蛋白中的所述靶向结构域，被插入并融合到位于SEQ ID NO:2的gC的氨基酸序列中的氨基酸33之后的位置、氨基酸82之后的位置、氨基酸148之后的位置、氨基酸149之后的位置，或氨基酸153之后的位置。
26.根据权利要求20所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述糖蛋白是gH，并且
被插入并融合到所述糖蛋白中的所述靶向结构域，被插入并融合到N-端，位于SEQ IDNO:3的gD的氨基酸序列中的氨基酸12至88的区域内的位置、氨基酸116至137的区域内的位置，或氨基酸209至839的区域内的位置。
27.根据权利要求20所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述糖蛋白是gH，并且
被插入并融合到所述糖蛋白中的所述靶向结构域，被插入并融合到N-端，位于SEQ IDNO:3的gD的氨基酸序列中的氨基酸12至49的区域内的位置，或氨基酸116至137的区域内的位置，优选地，位于氨基酸12之后的位置、氨基酸22之后的位置、氨基酸23之后的位置、氨基酸29之后的位置、氨基酸83之后的位置、氨基酸116之后的位置、氨基酸209之后的位置、氨基酸215之后的位置、氨基酸225之后的位置、氨基酸277之后的位置、氨基酸386之后的位置、氨基酸437之后的位置、氨基酸447之后的位置、氨基酸472之后的位置、氨基酸636之后的位置、氨基酸637之后的位置、氨基酸666之后的位置、氨基酸731之后的位置、氨基酸763之后的位置、氨基酸764之后的位置、氨基酸775之后的位置、氨基酸806之后的位置、氨基酸824之后的位置，或氨基酸838之后的位置。
28.根据权利要求20所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述融合蛋白的所述靶向结构域和被插入并融合的所述靶向结构域，具有(i)特异性结合相同靶分子的靶向结构域，或(ii)特异性结合不同靶分子的不同靶向结构域。
29.根据权利要求20所述的重组单纯疱疹病毒，其中，HVEM的所述细胞外结构域是包含SEQ ID NO:8或9的氨基酸序列的HveA82、包含SEQ ID NO:10或11的氨基酸序列的HveA87、包含SEQ ID NO:12或13的氨基酸序列的HveA102，或包含SEQ ID NO:14或15的氨基酸序列的HveA107。
30.根据权利要求20所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述融合蛋白是这样一种融合蛋白，其中癌细胞靶向结构域和HVEM(HveA)的所述细胞外结构域经由包含1至30个氨基酸的连接子肽连接，并且
所述连接子肽包含至少一个选自Ser、Gly、Ala和Thr的氨基酸。
31.根据权利要求20所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述靶分子是癌细胞表面上的抗原或受体，与正常细胞相比，其仅在癌细胞中表达或在癌细胞中过表达。
32.根据权利要求31所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述抗原或所述受体是EGFRvIII、EGFR、metastin受体、受体酪氨酸激酶、HER2(人表皮生长因子受体2)、酪氨酸激酶-18-受体(c-Kit)、HGF受体c-Met、CXCR4、CCR7、内皮素-A受体、PPAR-δ(过氧化物酶体增殖物激活受体δ)、PDGFR-α(血小板衍生生长因子受体α)、CD133、CEA(癌胚抗原)、EpCAM(上皮细胞粘附分子)、MSLN(间皮素)、GD2(二唾液酸神经节苷脂)、GPC3(磷脂酰肌醇聚糖3)、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、TAG-72(肿瘤相关糖蛋白72)、GD3(二唾液酸神经节苷脂)、HLA-DR(人白细胞抗原-DR)、MUC1(粘蛋白1)、NY-ESO-1(纽约食管鳞状细胞癌1)、LMP1(潜伏膜蛋白1)、TRAILR2(肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体)、VEGFR2(血管内皮生长因子受体2)、HGFR(肝细胞生长因子受体)、CD44或CD166。
33.根据权利要求20所述的重组单纯疱疹病毒，其中，被插入并融合到所述糖蛋白中的所述靶向结构域特异性结合的所述靶分子是HER2，并且
被插入并融合到所述糖蛋白中的所述靶向结构域是scFv，被构建成使得SEQ ID NO:4的VH和SEQ ID NO:5的VL按照VH、连接子肽和VL的顺序经由所述连接子肽连接。
34.根据权利要求20所述的重组单纯疱疹病毒，其中，被插入并融合到所述糖蛋白中的所述靶向结构域特异性结合的所述靶分子是EpCAM，并且
所述靶向结构域是scFv，被构建成使得SEQ ID NO:6的VL和SEQ ID NO:7的VH按照VL、连接子肽和VH的顺序经由所述连接子肽连接。
35.根据权利要求20所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述重组单纯疱疹病毒被构建成使得SEQ ID NO:16的gD(糖蛋白D)的氨基酸序列的第222位的精氨酸(R)和第223位的苯丙氨酸(F)分别被天冬酰胺(N)和异亮氨酸(I)取代。
36.根据权利要求20所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述重组单纯疱疹病毒是重组HSV-1病毒、重组HSV-2病毒或HSV-1和HSV-2嵌合病毒
37.根据权利要求20所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述重组单纯疱疹病毒是衍生自HSV-1KOS株的重组HSV-1。
38.根据权利要求20所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述重组单纯疱疹病毒被构建成使得，表达选自以下任意一种的表达盒：(i)细胞因子，(ii)趋化因子，(iii)免疫检查点的拮抗剂，(iv)诱导免疫细胞活化的共刺激因子，(v)TGFβ的拮抗剂，其抑制对癌细胞的免疫应答，(vi)乙酰肝素酶，其降解用于实体肿瘤微环境的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，(vii)拮抗剂，其抑制血管生成因子受体VEGFR-2(VEGF受体-2)的功能，和(viii)前药活化酶，其将前药转化为对癌细胞表现毒性的药物，被进一步插入到所述单纯疱疹病毒的所述基因组中而不抑制所述单纯疱疹病毒的增殖。
39.根据权利要求38所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述细胞因子是选自以下的至少一种：白介素，包括IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18和IL-24；干扰素，包括IFNα、IFNβ和IFNγ；肿瘤坏死因子，包括TNFα、GM-CSF、G-CSF和FLT3L，
所述趋化因子是选自CCL2、RANTES、CCL7、CCL9、CCL10、CCL12、CCL15、CCL19、CCL21、CCL20和XCL-1中的至少一种，
所述免疫检查点是选自以下的至少一种：PD-1(程序性死亡受体1)、PD-L1(程序性死亡受体配体1)、PD-L2(程序性死亡受体配体2)、CD27(分化簇27)、CD28(分化簇28)、CD70(分化簇70)、CD80(分化簇80)、CD86(分化簇86)、CD137(分化簇137)、CD276(分化簇276)、KIR(杀伤细胞免疫球蛋白样受体)、LAG3(淋巴细胞活化基因3)、GITR(糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白)、GITRL(糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白配体)和CTLA-4(溶细胞T淋巴细胞相关抗原-4)，
所述共刺激因子是选自以下的至少一种：CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、LFA-1(淋巴细胞功能相关抗原-1)、ICOS(诱导型T细胞共刺激物)、CD3γ、CD3δ和CD3ε，以及
所述前药活化酶是选自从大肠杆菌分离的胞嘧啶脱氨酶、大鼠细胞色素P450(CYP2B1)羧酸酯酶、细菌硝基还原酶和PNP(嘌呤核苷磷酸化酶)中的至少一种。
40.根据权利要求20所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述融合蛋白的所述表达盒被插入所述病毒的所述基因组中的UL3和UL4基因之间、UL26和UL27基因之间、UL37和UL38基因之间、UL48和UL49基因之间、UL53和UL54基因之间，或US1和US2基因之间。
41.根据权利要求38所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述表达盒被插入所述病毒的所述基因组中的UL3和UL4基因之间、UL26和UL27基因之间、UL37和UL38基因之间、UL48和UL49基因之间、UL53和UL54基因之间，或US1和US2基因之间，其中其插入位点不同于所述融合蛋白的所述表达盒的插入位点。
42.根据权利要求20所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述融合蛋白按照NH2/癌细胞靶向结构域/HVEM的细胞外结构域/COOH的顺序被构建，或按照与其相反的顺序被构建。
43.根据权利要求20所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述融合蛋白被构建成使得癌细胞靶向结构域和HVEM的所述细胞外结构域经由连接子肽连接，并且所述融合蛋白按照NH2/癌细胞靶向结构域/连接子肽/HVEM的细胞外结构域/COOH的顺序被构建，或按照与其相反的顺序被构建。
44.根据权利要求20所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述融合蛋白的所述表达盒具有多顺反子构型，其中包含至少两种融合蛋白基因，编码IRES(内部核糖体进入位点)或2A肽的核酸序列位于所述基因之间，并且插入了一个表达盒。
45.一种用于治疗癌症的药物组合物，包含权利要求1-44中任一项所述的重组单纯疱疹病毒作为活性成分。
46.根据权利要求45所述的药物组合物，还包含重组接头分子，在所述重组接头分子中融合了癌细胞靶向结构域和HVEM的细胞外结构域。
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