ES2810800T3 - Vector de HSV oncolítico - Google Patents

Abstract

Un virus del herpes simple (oHSV) oncolítico recombinante, que comprende una o más copias de las secuencias diana para uno o más microARN (miARN) insertadas en uno o más genes del HSV esenciales para la replicación del HSV, en donde el oHSV comprende una superficie, en donde dicha superficie comprende uno o más ligandos que no son de HSV y en donde el oHSV comprende una deleción de la región de repetición interna (unión) en el genoma del HSV que comprende una copia de los genes de ICP0, ICP34.5, LAT e ICP4 y el promotor de ICP47.

Description

DESCRIPCIÓN

Vector de HSV oncolítico

Antecedentes de la invención

El glioblastoma multiforme (GBM) es una enfermedad siempre mortal a pesar de que se puedan aplicar los tratamientos de combinación disponibles. Los estudios preclínicos sugieren que los virus capaces de replicarse, lo que incluye los vectores de HSV oncolíticos ("oHSV"), representan una alternativa terapéutica prometedora, pero la eficacia del tratamiento en los ensayos con pacientes ha sido escasa. El logro de vectores seguros se ha basado en mutaciones atenuantes de los vectores que también pueden comprometer la replicación lítica en las células tumorales.

H. Uchida et al. describen un tratamiento eficaz de un modelo de xenoinjerto ortotópico del glioblastoma humano con el uso de un virus del herpes simple oncolítico redirigido hacia el EGFR, en: Molecular Therapy 21 (2012) 561-569.

C. Lee et al. describen que la regulación por microARN del virus del herpes simple 1 oncolítico consigue la destrucción selectiva de las células de cáncer de próstata, en: Clinical Cáncer Research 15 (2009) 5126-5135.

R. Edge et al. describen que un virus de la estomatitis vesicular sensible al microARN let-7 muestra una replicación específica del tumor, en: Molecular Therapy 16 (2008) 1437-1443.

En la patente de los EE. UU. US 2013/071430 A1 se describe un virus de la variolovacuna controlado por microARN, en el que una secuencia diana de un microARN que se expresa menos en una célula cancerosa que en una célula normal está insertada en una región sin traducir en 3' del gen de B5R asociado a la proliferación vírica del virus de la variolovacuna.

L. Menotti et al. describen que se produce la inhibición del crecimiento de un tumor humano en los ratones gracias a un virus del herpes simple oncolítico diseñado para actuar únicamente sobre las células que expresan HER-2, en: Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (2009) 9039-9044.

R. Cattaneo et al. describen virus reprogramados como tratamientos contra el cáncer, en: Nature Reviews-Microbiology 6 (2008) 529-540.

En la solicitud de patente internacional WO 2009/111892 A1 se describen métodos para destruir preferiblemente las células destinatarias en un hospedador mediante la infección de las células con una o más cepas de un virus lítico que ha sido manipulado genéticamente para que sea sensible a la represión traduccional mediada por microARN.

S. Varghese et al. describen vectores del virus del herpes simple oncolíticos para la viroterapia del cáncer, en Cancer Gene Therapy 9 (2002) 967-978.

En la solicitud de patente internacional 2001/130749 A2 se describen los vectores de1HSV modificado que entran mejor en las células, bien a través de la infección directa y/o por diseminación lateral.

Compendio de la invención

La presente invención da a conocer un oHSV capaz de replicarse selectivamente en un tumor sin atenuación mediante la combinación del redireccionamiento del vector a receptores de la superficie celular asociados a tumores a la vez que se inhibe la replicación del vector por medio de un microARN ("miR") celular que se expresa mucho en el cerebro normal, pero que está prácticamente ausente en las células tumorales. Los elementos que confieren sensibilidad al miR impiden la patogenia del vector en el cerebro de los ratones atímicos sin impedir la replicación lítica del vector en las células tumorales primarias in vitro o en un modelo de tumor cerebral xenógeno. Este nuevo diseño de vector debe proporcionar una plataforma más segura y eficaz de vectores, y puede además seguir desarrollándose para su aplicación sobre tumores en los pacientes.

Breve descripción de las figuras

En la figura 1 se presentan los datos de los resultados de los experimentos que se ocupan de a la eficacia y la especificidad del elemento T124. Los plásmidos de expresión con la luciferasa de luciérnaga (fLuc) que contienen el T124 (pfLuc-T124) o una secuencia de control (pfLuc-Ctrl) en la UTR en 3' se cotransfectaron con un plásmido de control interno con la luciferasa de Renilla (prLuc) introducido en las células HEK293AD transfectadas 24 h antes con pre-miR-124 o pre-miR-21 sintéticos. La actividad luciferasa se les midió 48 h más tarde. Los resultados se muestran como la media ± desviación estándar de tres determinaciones de la actividad fLuc normalizada por la actividad rLuc. Las diferencias estadísticamente significativas entre las parejas se indican mediante corchetes debajo de los correspondientes valores de P (prueba de la t para datos independientes).

En la figura 2 se presentan los datos de los resultados de experimentos que se ocupan de la replicación del virus en las células de glioma. (A) Diagramas de los vectores. El BAC KOS-37 original contiene el BAC flanqueado por loxP, la resistencia al cloranfenicol y las secuencias de lacZ ("BAC") entre los genes víricos de UL37 y UL38 (Gierasch et al, 2006). Las modificaciones para generar el KGBAC y el KG4:T 124BAC se ilustran como sigue: gB:NT, mutación doble en el gen de gB para mejorar la entrada del virus; gC-eGFP, fusión del ORF completo de gC a GFP a través de una secuencia peptídica 2A; Aunión, deleción de la región repetida interna completa, que incluye una copia del gen de ICP4; ICP4:T124, inserción de T124 en la UTR en 3' del gen de ICP4 restante. UL, segmento largo único del genoma del virus; US, segmento corto único. (B) Efecto de T124 sobre la replicación del virus en las células de glioma en cultivo procedentes del paciente. Las células Gli68 y GBM30 se infectaron con los virus KG o KG4:T124 por triplicado a una MDI de 0,01. En los puntos de tiempo indicados después de la infección, se recogieron los lisados celulares y los sobrenadantes, y se titularon en las células U2OS. Los valores son media ± desviación estándar. (C) Expresión de miR-124 en las células Gli68 infectadas con LV124. Las células se infectaron a 5 ufc/célula, se seleccionaron a partir del día siguiente durante 3 días en medio que contenía puromicina, y se recogieron para la extracción de ARN total. Los ARN de control fueron de células Gli68 y U2OS sin infectar. La cantidad de miR-124 se determinó por triplicado mediante qRT-PCR y se normalizó por la cantidad de RNU43. Se muestra las veces que aumenta ± desviación estándar con respecto a las células U2OS. P < 0,05 para todas las parejas (prueba de la t para datos independientes). (D) Replicación de los virus KG y KG4:T 124 en las células GBM30 y Gli68 de control y transducidas con miR-124. Las células se infectaron con LV124 o LV137R a 5 ufc/célula, se seleccionaron con puromicina durante 3 d, y se sobreinfectaron a una MDI de 0,01 con KG o KG4:T124. El HSV infeccioso en los lisados celulares combinados y los sobrenadantes recogidos 72 y 96 h después se tituló en las células U2OS. Los resultados son los valores de media ± desviación estándar de infecciones por el HSV por triplicado. Los corchetes indican las parejas significativamente diferentes, y se muestran los correspondientes valores de P (prueba de la t para datos independientes).

En la figura 3 se presentan los datos de los resultados de los experimentos que se ocupan de la replicación del virus KG4:T124 y la toxicidad en el cerebro de los ratones atímicos. Se inyectaron por vía intracraneal 4,8 x 109 copias del genoma de cada uno de KG o KG4:T 124 en 4 ratones BALB/c atímicos (n = 4/grupo). (A) Peso de los animales con el tiempo tras la inyección del vector. Izquierda, los animales a los que se les inyectó el KG; X, muerte del animal. Derecha, ratones a los que se les inyectó el KG4:T124; los círculos rellenos indican el sacrificio del animal. (B) Copias totales del genoma del virus a lo largo del tiempo en el cerebro de los ratones después de la inyección del vector. Se recogió el cerebro de los ratones a los que solo se inyectó el KG4:T124 sacrificados los días 5, 14, 21 y 33 después de la inyección del vector y el último animal superviviente del grupo al que se inyectó el KG se sacrificó el día 5 con síntomas graves de la enfermedad, se les aisló el ADN, y se determinó por qPCR el número total de genomas del vector vírico por cerebro. (C) Gráfica de supervivencia de Kaplan-Meier de los animales en este experimento. Las flechas indican los días de sacrificio de cada uno de los animales del grupo al que se inyectó el KG4:T124. P = 0,0058, prueba del orden logarítmico.

En la figura 4 se presentan los datos de los resultados de los experimentos que se ocupan del tratamiento de un modelo de ratón atímico con glioblastoma humano con el vector del HSV sensible al miR-124 redirigido hacia el EGFR. Las células GBM30 trituradas se implantaron por vía intracraneal y, 5 días más tarde, se le inyectó PBS o 1,8 x 108 cg del virus KGE o del virus KGE-4:T124 en las mismas coordenadas. (A) Gráfica de supervivencia de Kaplan-Meier. Estadística de la prueba del orden logarítmico: KGE frente a PBS, P = 0,0188; KGE-4:T 124 frente a PBS, P = 0,0009; KGE frente a KGE-4:T 124, P = 0,8327. (B) Peso de los animales a lo largo del tiempo después del implante de células tumorales. X, muerte o sacrificio del animal.

En la figura 5 se presentan datos que demuestran que el KMMP9 interviene en la sobreexpresión de la MMP9 enzimáticamente activa. (A) La estructura de KMMP9 y KGw. (B) Análisis de inmunotransferencia de tipo Western de los lisados celulares de las células Vero infectadas con uno de KMMP9, KGw o KG (MOI = 0,1). La tubulina p y la glucoproteína B del HSV se visualizaron como control de células y control de carga vírica, respectivamente. Las líneas celulares primarias GBM (C) o las células Vero (D) se infectaron con KGw o KMMP9 a una MDI = 1. El lisado celular y el sobrenadante se recogieron 24 h después de la infección y se combinaron (C) o se cargaron por separado (D) en un gel de poliacrilamida al 10%/gelatina al 0,1%. Después de la electroforesis, el gel se incubó durante una noche a 37 °C, se tiñó con azul de Coomassie al 0,05% y se destiñó, y se capturó la imagen. Abreviaturas: M, KMMP9; G, KGw; Con., control de virus; sin i., sin infectar; gB, glucoproteína B; Sob., sobrenadante.

En la figura 6 se presentan los datos que demuestran que KMMP9 y KGw presentan patrones comparables con respecto a la entrada y al crecimiento de las células. (A) Las células que aparecen a la izquierda del panel se infectaron con el virus con la multiplicidad en cg/célula que aparece encima de los paneles. Al cabo de 6 horas, se fijaron las células y se inmunotiñeron para ICP4. Se disociaron las células GBM30 (B) y GBM169 (C), y se infectaron con KMMP9 o KGw a 200 cg/célula. Los lisados celulares se recogieron a 1, 2, 4, y 6 dpi y el título de las copias del genoma del virus se determinó por qPCR. No se observaron diferencias significativas entre los dos virus en ninguna de las líneas celulares hospedadoras (GBM30: P = 0,20; GBM169: P = 0,11).

En la figura 7 se presentan los datos que demuestren que las células tumorales se destruyen de forma similar o mejor in vitro con el KMMP9 que con el KGw. Las células U87, SNB19 o GBM30 se infectaron a 10 o 100 cg/célula durante 3 o 7 días. El porcentaje de supervivencia celular con respecto a las células sin infectar se determinó mediante el ensayo con MTT (n = 3; asterisco: P < 0,05, prueba de la t de Student para datos independientes).

En la figura 8 se presentan los datos que demuestran que la MMP9 mejora la infectividad del oHSV en los esferoides. Las células GBM30 se hicieron crecer en suspensión y se infectaron con 1 x 103 ufp de KMMP9 o bien de KGw. La fluorescencia verde del casete gC-T2a-eGFP en ambos vectores se visualizó todos los días a 2-6 dpi en las preparaciones con esferoides completos. (A) Imágenes representativas a los 3 y 5 dpi. (B) La cuantificación promedio de la señal de eGFP en 6 esferoides por vector demostró un incremento de la infectividad de KMMP9 de aproximadamente 2 veces más que KGw (P = 0,006). (C-E) Se infectaron dos grupos de esferoides de GBM30 con KMMP9 o KGw a 4 x 107 copias del genoma por esferoide. Los esferoides se fijaron, se tiñeron con DAPI, y se tomaron imágenes confocales de la sección Z en intervalos de 5 pm. El panel (C) muestra 2 esferoides representativos de cada uno de los grupos con KMMP9 y con KGw después de la reconstrucción 3D a partir de 0 pm a 150 pm. Azul, DAPI; verde, eGFP. El panel (D) muestra las secciones Z de 2 esferoides de cada grupo a Z = 100 pm. (E) Cada esferoide se dividió en 5 segmentos en términos de profundidad en el eje Z (de abajo hacia arriba: 0-20 pm, 25-50 pm, 55-80 pm, 85-100 pm, 105-120 pm, y 125-140 pm). La intensidad relativa de la señal en cada segmento del esferoide se calculó mediante el promedio de la señal de eGFP dividida por la señal de DAPI. n = 7; asterisco: P < 0,05.

En la figura 9 se presentan los datos relativos al tratamiento con el KMMP9 de un modelo de GBM en ratón atímico. Las células GBM30 se implantaron por vía intracraneal y se le inyectaron KMMP9, KGw o PBS 5 días más tarde en las mismas coordenadas (0,5 mm anterior, 2 mm lateral (derecha), 3 mm de profundidad con respecto a la bregma). Los animales se vigilaron cada día y se sacrificaron cuando aparecían signos de morbilidad. Los datos se presentan como una gráfica de supervivencia de Kaplan-Meier. Los animales tratados con KMMP9 o con KGw sobrevivieron significativamente más tiempo que los tratados con PBS (P < 0,01). No se encontró ninguna diferencia significativa entre el KMMP9 y el KGw (n = 4; P = 0,61, prueba del orden logarítmico).

En la figura 10 se representan las imágenes de RMN del cerebro ponderadas en T2 de un animal por tratamiento de los animales con GBM30 tratados con virus o con simulación de tratamiento (PBS). (A) Los tratamientos se llevaron a cabo 10 días después de la implantación de GBM30 y las imágenes se recogieron 1 día antes del tratamiento (día -1) y los días 3, 6, 9 y 13 después del tratamiento. (B) Volumen tumoral calculado para los mismos días.

Descripción detallada de la invención

La invención está definida por las reivindicaciones adjuntas

El ligando no-HSV del oHSV de la invención está incorporado en una glucoproteína expuesta en la superficie del oHSV, tal como gD o gC, para facilitar en envío a la célula deseada con el ligando. Por ejemplo, el ligando puede estar incorporado entre los residuos 1 y 25 de la gD. Los ligandos preferidos para actuar selectivamente sobre el GBM y otras células de cáncer incluyen los dirigidos a EGFR y EGFRvlII, CD133, CXCR4, antígeno carcinoembrionario (CEA), CLC-3/anexina-2/MMP-2, receptor de la transferrina humana y EpCAM, y el ligando puede actuar selectivamente sobre tal receptor o molécula de la superficie celular, es decir, el ligando puede ser capaz de fijarse específicamente a tal receptor o molécula de la superficie celular. Se han descrito ligandos específicos de EGFR y EGFRvIII, tales como los anticuerpos, scFv (anticuerpos monocatenarios) y VHH (anticuerpos con un único dominio) en la bibliografía (Kuan et al., Int. J. Cáncer, 88, 962-69 (2000); Wickstrand et al., Cancer Res, 55(14): 3140-8 (1995); Omidfar et al., Tumor Biology, 25: 296-305 (2004); véase también Uchida et al., Molecular Therapy, 21: 561-9 (2013); véase también Braidwood et al., Gene Ther., 15, 1579-1592 (2008)).

El oHSV también, o como alternativa, puede ser dirigido por medio de la incorporación de ligandos a otras moléculas o receptores de la superficie celular que no están necesariamente asociados al cáncer. Por ejemplo, los ligandos pueden incluir los dominios de fijación de ligandos naturales (por ejemplo, factores de crecimiento (tales como EGF, que puede dirigirse selectivamente sobre el EGFR, NGF, que puede dirigirse selectivamente sobre trkA, y similares), hormonas peptídicas o no peptídicas, selección de péptidos por su fijación a una molécula destinataria (por ejemplo, proteínas diseñadas con la repetición de las anquirinas (DARPins)), etc. El oHSV de la invención también puede incluir una forma mutante de gB y/o gH que facilita la entrada del vector a través de los receptores no canónicos (y preferiblemente también tienen tales mutaciones en uno o ambos de estos genes en el genoma del oHSV).

Una secuencia diana de microARN preferida para su inclusión en el vector de la invención (preferiblemente en forma de varias copias en tándem de la misma) es miR-124, que tiene aplicación concreta para las aplicaciones neuronales (por ejemplo, para proteger las neuronas no cancerosas cuando se emplea el oHSV de la invención para el tratamiento de tumores del sistema nervioso, tales como el GBM). Otras secuencias diana de microARN pueden emplearse como alternativa para proteger otros tipos de tejidos, y se encuentra dentro de los conocimientos del campo de la técnica la selección de una secuencia diana idónea de microARN para proteger un tejido o tipo de célula deseados. Por ejemplo, el miR-122 y el miR-199 se expresan en los hepatocitos normales, pero no en el cáncer de hígado primario; así pues, en una realización del oHSV de la invención se puede emplear uno, o una combinación de las secuencias diana de los microARN miR-122 y/o miR-199, para el tratamiento del cáncer de hígado. De igual forma, las secuencias diana para los microARN miR-128 y/o miR-137 se pueden emplear en el oHSV para proteger el cerebro normal. Una secuencia diana ejemplar de microARN puede ser la inversa complementaria del microARN.

La secuencia o secuencias diana de microARN están incluidas preferiblemente en la región no traducida (“UTR”) en 3' de un gen del HSV para silenciar dicho gen en presencia del microARN. Preferiblemente, se insertan en tándem numerosas copias (tal como dos copias, tres copias, cuatro copias, cinco copias, seis copias, o más) de la secuencia diana del microARN. Preferiblemente, las numerosas copias de la secuencia diana del microARN están separadas por espaciadores de cuatro o más nucleótidos (más preferiblemente con ocho o más nucleótidos). Sin quererse ver limitados por la teoría, se cree que una mayor separación (por ejemplo, de más de aproximadamente 8 nucleótidos) proporciona mayor estabilidad.

Más preferiblemente, para ayudar a proteger las células no cancerosas del efecto lítico de la infección por HSV, las numerosas copias de la secuencia diana del microARN se insertan en la UTR en 3' de un gen de1HSV que es esencial para la replicación en las células no cancerosas, lo cual conocen los expertos en la técnica. Preferiblemente, el sitio es la UTR en 3' del gen destinatario del microARN en su locus normal (o nativo) dentro del genoma de1HSV. Un oHSV preferido de la presente invención incluye numerosas copias de la secuencia diana del microARN insertado en la UTR en 3' del gen de ICP4, tal como una o ambas copias del gen de ICP4, en los vectores que tienen ambas copias nativas del gen de ICP4.

El genoma del vector del HSV de la invención que comprende adicionalmente uno o más casetes de expresión exógenos (es decir, que contienen secuencias codificantes en unión operativa con promotores, potenciadores y otros elementos reguladores idóneos), tal como los que codifican una proteína delatora (tal como la proteína fluorescente verde), un factor o agente oncolítico que potencia la actividad destructora del tumor (tal como el factor de necrosis tumoral (“TNF”) o el ligando inductor de la apoptosis relacionada con el TNF (“TRAIL”)), u otro producto génico de importancia terapéutica (por ejemplo, péptidos, enzimas activadoras de fármacos, anticuerpos, ARN terapéuticos y similares). Un casete de expresión exógeno preferido codifica una metaloproteinasa de la matriz, tal como la metaloproteinasa de la matriz 9 ("MMP9"), que degrada el colágeno de tipo IV, un componente principal de la matriz extracelular (MEC) y la membrana basal de los glioblastomas (Mammato et al., Am J. Pathol, 183(4): 1293-1305 (2013), doi: 10.1016/j.ajpath.2013.06.026 Epub de 5 de agosto de 2013), con lo que se mejora así la infección de las células tumorales por el vector de la invención debido a la propagación lateral y a la potenciación de la actividad destructora del tumor. También se prefieren los casetes de expresión que codifican otros genes que potencian la propagación lateral del HSV de la invención.

Otros casetes de expresión exógenos preferibles codifican proteínas o polipéptidos que inducen la respuesta inmunitaria del paciente contra el cáncer o tumor contra el que se va a emplear como tratamiento e1HSV de la invención. Por ejemplo, tales casetes de expresión pueden incluir uno o más ácidos nucleicos que codifican factores tales como citocinas (por ejemplo, IL-2 e IFN B), un anticuerpo dirigido contra la proteína 4 asociada a los linfocitos T citotóxicos ("CTLA-4") (Hodi et al., N. Engl J. Med, 363 (8): 711 -23 (2010)), un anticuerpo dirigido contra el ligando de la proteína 1 de la muerte celular programada ("PD1") o el propio receptor (Topalian et al., N. Engl. J. Med., 366(26): 2443-54 (2012)), y la molécula de adhesión celular epitelial ("EpCAM") (Patriarca et al., Cáncer Treatment Rev., 38: 68-75 (2012)). Tal y como se señaló anteriormente, la EpCAM también puede servir como marcador destinatario que será reconocido por el vector de la invención. De igual forma, cuando el cáncer a tratar es distinto de un cáncer del SNC, y más específicamente que no sea glioma ni glioblastoma, otro transgén puede codificar el factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos ("GM-CSF").

Otros casetes de expresión preferidos codifican proteínas o polipéptidos que catalizan la conversión de los profármacos en agentes activos. Por ejemplo, tales casetes de expresión pueden codificar enzimas tales como la citosina desaminasa, que es capaz de convertir la 5-fluorocitosina ("5-FC") en 5-fluorouracilo ("5-FU'') en el propio tumor o en las células cancerosas infectadas con el vector de la invención (véase, por ejemplo, Akimoto et al., J. Ophthalmol., 86(5): 581-86 (2002)), con el fin de permitir que el 5-FU actúe de forma local dentro de tales células o tumores, mientras que se reduce al mínimo la exposición sistémica al 5-FU. Del mismo modo, dicho casete de expresión puede codificar la timidina cinasa (tk) (por ejemplo, operativamente unida a un promotor inmediato temprano del HSV o un promotor constitutivo fuerte), que puede activar el ganciclovir o la fosforilasa de nucleósidos purínicos (PNP), que puede bloquear o atenuar la actividad de la ribonucleótido reductasa. En determinadas realizaciones, los vectores de la invención también pueden contener un gen nativo funcional de la tk de1HSV.

Dentro de los vectores de la invención, las secuencias codificantes dentro de los casetes de expresión exógenos pueden estar en unión operativa con cualquier secuencia genética reguladora deseada, tales como promotores constitutivos o promotores inducibles o específicos de tejido, muchos ejemplos de los cuales se conocen en la técnica. Por ejemplo, un promotor constitutivo empleado con frecuencia es el promotor del citomegalovirus humano (hCMV), y también se pueden utilizar otros promotores, por ejemplo, el promotor de la actina p de pollo (CAG)con el potenciador temprano del CMV, y el promotor inmediato temprano del HSV (por ejemplo, el promotor de ICP4), y similares.

De igual forma, el genoma del vector de la invención contiene una deleción de la región de la repetición interna (unión) que comprende una copia de cada uno de los genes diploides ICP0, ICP34.5, LAT e ICP4, junto con el promotor para el gen de ICP47.

El vector de la invención se puede producir mediante métodos estándares conocidos por los expertos en la técnica en el ámbito de la virología del HSV. Sin embargo, para facilitar la manipulación del genoma de1HSV y la producción del vector de la invención, la invención también da a conocer un ácido nucleico que codifica el vector de la invención. Un ácido nucleico preferido es un cromosoma artificial bacteriano ("BAC") que codifica el vector de la invención, lo que facilita la manipulación del HSV en un sistema bacteriano.

Se debe reconocer que el oHSV de la invención puede utilizarse para dirigirse selectivamente a las células cancerosas y destruirlas, ya sea in vivo o in vitro. Una aplicación preferida es la de emplear el vector de la invención con fines terapéuticos, en concreto con los pacientes humanos y/o contra tumores o células de humano (que pueden ser xenoinjertos en diversas especies de mamíferos). No obstante, el método también puede emplearse en animales, tales como mascotas (por ejemplo, gatos y perros), o animales de importancia agrícola (por ejemplo, ganado vacuno, ovejas, caballos, y similares), o de importancia zoológica. Los tumores y células cancerosas de ejemplo, en cuyo tratamiento pueden emplearse los vectores de la invención, son los cánceres del sistema nervioso central y, en particular, el glioblastoma multiforme.

Por lo general, el vector oHSV de la invención es más útil cuando se puede introducir en una población de células suficiente cantidad del virus para asegurar que las células se enfrenten a un número adecuado de virus. Así pues, la presente invención da a conocer una reserva concentrada, preferiblemente una reserva concentrada homogénea, que comprende el vector oHSV de la invención. La preparación y el análisis de las reservas concentradas de HSV se conoce bien en la técnica. Por ejemplo, se puede fabricar una reserva concentrada de virus en botellas rodantes que contienen células transducidas con el vector oHSV. La reserva concentrada de virus puede entonces purificarse en un gradiente Nycodenz® continuo, que se reparte en alícuotas y se almacena hasta que se necesite. Las reservas concentradas de virus tienen un título muy variable que depende en gran medida del genotipo del virus y del protocolo y las líneas celulares utilizadas para prepararlas. Preferiblemente, tal reserva concentrada tiene un título de virus de al menos aproximadamente 105 unidades formadoras de placa (ufp), tales como al menos aproximadamente 106 ufp o incluso más preferiblemente al menos aproximadamente 107 ufp. En las realizaciones aún más preferidas, el título puede ser de al menos aproximadamente 108 ufp, o de al menos aproximadamente 109 ufp, y las reservas concentradas de título más alto de al menos aproximadamente 1010 ufp o de al menos aproximadamente 1011 ufp son las más preferidas. Tales títulos se pueden determinar con el uso de células que expresan un receptor sobre el que el vector actúa selectivamente, por ejemplo.

La invención da a conocer adicionalmente una composición que comprende el vector oHSV de la invención y un vehículo, preferentemente un vehículo fisiológicamente aceptable. El vehículo de la composición puede ser cualquier vehículo adecuado para el vector. El vehículo será típicamente líquido, pero también puede ser sólido, o una combinación de componentes líquidos y sólidos. El vehículo es deseablemente un vehículo (por ejemplo, excipiente o diluyente) farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, uno fisiológica o farmacológicamente aceptable). Los vehículos farmacéuticamente aceptables son bien conocidos y de fácil acceso. La elección del vehículo se determinará, al menos en parte, por el vector concreto y el método concreto usados para administrar la composición. La composición puede comprender además cualquier otro componente idóneo, sobre todo para la mejora de la estabilidad de la composición y/o su uso final. En consecuencia, existe una amplia variedad de formulaciones idóneas de la composición de la invención. Las siguientes formulaciones y métodos son meramente ejemplares y no son en modo alguno limitantes.

Las formulaciones idóneas para la administración parenteral incluyen soluciones isotónicas estériles acuosas y no acuosas para inyección, que pueden contener antioxidantes, tamponantes, bacteriostáticos, y solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor deseado, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizantes, espesantes, estabilizantes y conservantes. Las formulaciones se pueden presentar en envases sellados de dosis unitaria o para dosis múltiples, tales como ampollas y viales, y pueden almacenarse en un estado liofilizado que requiere sólo la adición de un excipiente líquido estéril, por ejemplo agua, para hacerlas inyectables inmediatamente antes de su uso. Las soluciones y suspensiones para inyección extemporánea se pueden preparar a partir de polvos estériles, gránulos y comprimidos del tipo descrito previamente.

Además, la composición puede comprender otros agentes terapéuticos o biológicamente activos. Por ejemplo, pueden estar presentes los factores terapéuticos útiles para el tratamiento de una indicación concreta. Los factores que controlan la inflamación, tales como el ibuprofeno o los esteroides, pueden formar parte de la composición para reducir la hinchazón y la inflamación asociadas a la administración in vivo del vector y las molestias fisiológicas. Los supresores del sistema inmunitario se pueden administrar con el método de composición para reducir cualquier respuesta inmunitaria contra el propio vector o asociada a un trastorno. Como alternativa, se pueden incluir potenciadores inmunitarios en la composición para inducir las defensas naturales del cuerpo contra la enfermedad, en concreto contra el cáncer o tumor contra el cual se va a utilizar el vector de la invención. Los antibióticos, es decir, los microbicidas y los fungicidas, pueden estar presentes para reducir el riesgo de infección asociado a los procedimientos de transferencia de genes y otros trastornos.

Ejemplos

Ejemplo 1

Propósito: El glioblastoma multiforme (GBM) es un tumor cerebral agresivo sin tratamiento eficaz. Los vectores oHSV se han diseñado para el tratamiento de modelos de GBM de humano en los animales, pero la eficacia en los ensayos con pacientes ha resultado decepcionante. Hemos querido desarrollar un nuevo diseño de oHSV que logre lisar el tumor con gran selectividad y sin atenuación del vector.

Diseño experimental: Se presenta un oHSV manipulado genéticamente para que infecte las células tumorales y se replique selectivamente en ellas mediante el total redireccionamiento de la infección a través del EGFR y el bloqueo de la replicación del vector en las neuronas normales gracias a la introducción de varias copias de la secuencia reconocida por el miR-124 específico de las neuronas en la UTR en 3' del gen inmediato temprano y esencial ICP4 del HSV. Se eligió el miR-124 porque se expresa mucho en las neuronas, pero es casi indetectable en el GBM. La eficacia del vector se comprobó en experimentos de tratamiento de tumores cerebrales xenógenos.

Resultados: La inoculación intracraneal en ratones atímicos de altas dosis del virus sensible al miR-124 no produjo ningún indicio de patogenia ni replicación del virus, en consonancia con el bloqueo de la replicación del virus en el cerebro normal mediante la interacción del miR-124 con el mRNA de ICP4. El tratamiento de un modelo ortotópico de GBM primario de humano en los ratones atímicos con el HSV sensible al miR124 y redirigido hacia el EGFR, mostró supervivencia a largo plazo (>50%) similar a la del tratamiento con el virus original redirigido hacia el EGFR, lo que indica que los elementos de reconocimiento del miR-124 no le hicieron disminuir su eficacia.

Conclusiones: Concluimos que la especificidad del oHSV sin atenuar se puede aumentar al máximo mediante la combinación de envío selectivo sobre el tumor de la infección del vector con la eliminación de la replicación inespecífica del vector por medio de microARN celulares que están ausentes en los tumores, pero que se expresan mucho en el tejido normal.

Introducción

El GBM es una de las formas más malignas de cáncer para los que el tratamiento eficaz sigue siendo difícil de alcanzar. La práctica médica estándar, tal como la cirugía, y las radio- y quimioterapia, han mostrado un escaso beneficio clínico a largo plazo. Los vectores oncolíticos, entre ellos los derivados del virus del herpes simple de tipo 1 (oHSV-1), están en desarrollo en una serie de laboratorios como una posible estrategia terapéutica alternativa (1). Se ha demostrado que los vectores oHSV son prometedores para el tratamiento de los modelos animales de GBM primario, pero además de proporcionar un buen perfil de seguridad, los resultados de las primeras fases de los ensayos clínicos no han mostrado una eliminación eficaz del tumor ni mejoras acordes con la supervivencia del paciente (2) (3).

El método más habitual para lograr la atenuación del HSV ha sido la deleción funcional de los genes no esenciales que eluden la respuesta inmunitaria innata del hospedador contra la infección, lo que proporciona una fuente de nucleótidos para la replicación en las células que no se dividen, tales como las neuronas, e impiden la apoptosis celular (2). La replicación del virus en las células cancerosas se ve facilitada por la pérdida de determinadas respuestas inmunitarias innatas (4), así como por la rápida división celular y la inactividad de las vías apoptósicas (2). Sin embargo, estas propiedades no son siempre suficientes para la replicación vigorosa de los oHSV actuales en los tumores.

A modo de una primera etapa para mejorar la eficacia del vector, hemos desarrollado previamente métodos para la reorientación completa del HSV con el fin de redirigir la infección desde los receptores canónicos de entrada de1HSV a los receptores de la superficie celular de tumores que se expresan mucho (por ejemplo, EGFR y EGFRvIII) (5). El oHSV reorientado mostró una actividad oncolítica robusta y una enorme especificidad por las células de GBM de humano, lo que da como resultado un alto nivel de destrucción de los tumores de humano en un modelo de ratón ortotópico. Además, este vector para tratamiento produjo supervivencia a largo plazo en la mayoría de los animales tratados sin intoxicación achacable al vector. Sin embargo, los marcadores de la superficie celular asociados a tumores que se expresan en mayor cantidad los comparten hasta cierto punto con los tipos de células normales y, así pues, tratamos de incrementar la seguridad de un vector sin atenuar y dirigido contra el tumor con el uso de un mecanismo independiente para bloquear la replicación del virus en el cerebro normal sin reducir la replicación en el tumor.

Los estudios recientes se han aprovechado de las diferencias en los perfiles de expresión de los microARN (miARN) entre las células normales y las cancerosas como estrategia alternativa para la acción selectiva sobre el tumor (6). Se han identificado al menos 30 miARN que se expresan diferencialmente en el glioblastoma, las neuronas y las células precursoras neurales (CPN) (7) (8), lo que sugiere que estas diferencias se pueden usar para limitar la replicación del virus en las células normales del cerebro, al mismo tiempo que se permite la replicación sin obstáculos en las células tumorales. En el presente documento se demuestra que la incorporación de los elementos de reconocimiento del miR-124 en el gen esencial de ICP4 del virus de tipo esencialmente silvestre impidió la replicación de1HSV en el tejido de cerebro normal donde el miR-124 se expresa mucho. Además, demostramos que los elementos de respuesta al miR-124 no redujeron la actividad oncolítica de un vector redirigido hacia el EGFR. Es importante destacar que, ya que el fenotipo tumoral depende de la continua ausencia del miR-124, la posible inducción del miR-124 a modo de mecanismo mediante el cual la célula se escapará de la replicación lítica del virus limitará la capacidad de proliferación incontrolada de la célula, y gracias a ello no comprometerá la eficacia del vector. La producción del vector se lleva a cabo en las células que carecen de miR-124 y, por lo tanto, no hay presión selectiva para producir mutantes del virus resistentes al miR-124 durante la preparación de las reservas concentradas. En conjunto, estas características dan a conocer la seguridad del vector y la selectividad por el tumor, y sugieren una estrategia general para el diseño de vectores oncolíticos idóneos para una amplia gama de tipos de tumores.

Resultados

Validación de un elemento de respuesta al miR-124. Entre los numerosos miARN que se expresan en mayor cantidad en las neuronas que en las células de GBM, el miR-124 es el más abundante con una expresión mínima en el GBM (6). Se ha diseñado un elemento de respuesta al miR-124 (T124) que consiste en 4 copias en tándem del complemento inverso del miR-124 maduro separado por 8 nucleótidos (nt) espaciadores diferentes. Para valorar la funcionalidad de esta secuencia, la insertamos en la UTR en 3' de la luciferasa de luciérnaga (fLuc) en un plásmido de expresión y se realizaron experimentos de cotransfección con un miRNA precursor específico (pre-miR-124) o inespecífico (pre-miR-21) en la células de osteosarcoma U2OS que se ha descrito que expresan poco o nada del miR-124 (9); se incluyó un plásmido de expresión con la luciferasa de Renilla (rLuc) para la normalización. Los resultados (pfLuc-T 124, figura 1) mostraron una intensa reducción de la actividad de fLuc a las 24 h en las células cotransfectadas con el pre-miR-124 en comparación con las células con una cotransfección simulada o las células cotransfectadas con el pre-miR-21. En cambio, se observó poca diferencia de expresión de fLuc entre las células transfectadas con un plásmido con fLuc de control que contiene 4 copias de la secuencia de miR-21 en sentido inverso (pfLuc-Ctrl, simulación) y las cotransfecciones de pfLuc-Ctrl con el pre-miR-21 o bien con el pre-miR-124 (figura 1). Estos resultados demostraron la funcionalidad del elemento T124 a modo de diana eficaz y específica para la restricción de la expresión génica mediada por el miR-124.

Sensibilidad a la expresión del miR-124 que presenta la replicación del HSV modificado con T124. Utilizamos la doble recombinación Red en E. coli (10) para introducir una serie de modificaciones en el BAC KOS-37, un clon genómico completo de la cepa KOS de HSV-1 en un cromosoma artificial bacteriano (BAC) (11). El producto, KGBAC (figura 2A), tiene delecionada la región de la repetición interna (unión) que contiene una copia de cada uno de los genes diploides ICP0, ICP34.5, LAT e ICP4 junto con el promotor del gen de ICP47. Esta deleción facilita la manipulación de las copias restantes de los 4 genes delecionados, proporciona abundante espacio para la posible incorporación de transgenes que potencien la actividad oncolítica de los virus, y aumenta la especificidad por el tumor al reducir la expresión del factor de neurovirulencia ICP34.5 (12); la eliminación de la expresión de ICP47 beneficia el reconocimiento inmunitario de las células cancerosas infectadas por los linfocitos T específicos del virus (4). El KGBAC también contiene el marco abierto de lectura (ORF) de GFP fusionado al ORF de la glucoproteína C (gC) a través de una secuencia del péptido 2A (13) (14) para permitir el seguimiento de la expresión génica vírica tardía (después de la replicación). Finalmente, el KGBAC contiene un par de mutaciones en el gen de la gB que hemos demostrado que potencia la entrada del HSV a través de receptores no canónicos (15) (16). Recombinamos la secuencia de T124 en la UTR en 3' del gen de ICP4 restante del KGBAC para generar el KG4:T124BAC (figura 2A). Ambas construcciones de BAC se convirtieron en partículas de virus con la eliminación simultánea de las secuencias del BAC localizadas entre los sitios loxP mediante la transfección de las células U2OS-Cre. Después de la purificación de las placas, se prepararon las reservas concentradas de virus de KG y KG4:T124, y se titularon en las células U2OS.

Se determinó en primer lugar si la inclusión de los 4 sitios diana del miR-124 en la UTR en 3' de ICP4 afectaba a la replicación del virus en las células humanas en cultivo de GBM. Los resultados (figura 2B) demostraron que el KG4:T 124 se replicaba con una cinética similar a la del KG en los esferoides de dos líneas primarias de glioblastoma, Gli68 y GBM30, y el rendimiento de los dos virus no era sustancialmente diferente en cada punto de tiempo. A continuación, se determinó si la replicación y el rendimiento del virus eran sensibles a la transducción de estas líneas con un lentivirus que expresaba el miR-124 de humano (LV124). En la figura 2C se muestra la cantidad relativa de miR-124 en las células U2OS, Gli68 y Gli68-LV124 medida por qPCR en tiempo real con respecto los ARN pequeños retrotranscritos y normalizados por los niveles endógenos de RNU43. El KG creció igualmente bien y hasta títulos similares en las células Gli68 y Gli68-LV124 transducidas con una construcción lentivírica que expresa el complemento inverso del miR-137 de humano (LV137R) (figura 2D). Por el contrario, el KG4:T124 creció poco en el primero en comparación con este último y se obtuvieron resultados similares con las células GBM30 transducidas con el LV124 frente a las transducidas con el LV137R (figura 2D). En conjunto, estas observaciones indican con firmeza que (i) el elemento T124 en el gen de ICP4 era eficaz a la hora de limitar la replicación de1HSV de una manera dependiente de miR-124, y (ii) la cantidad de miR-124 endógeno en las dos líneas de GBM era lo suficientemente baja como para reducir al mínimo este efecto. Además, los datos de qRT-PCR confirmaron la idoneidad de las células U2OS para no alterar el crecimiento ni la titulación de KG4:T 124 en comparación con KG.

KG4:T124 no se replica en el cerebro de ratón ni provoca enfermedad. Después de haber demostrado que la expresión del miR-124 exógeno en las células de glioma primario en cultivo es muy eficaz para la impedir el crecimiento del vector KG4:T 124, a continuación comprobamos si los niveles endógenos de miR-124 en el cerebro de ratón eran suficientes para impedir la replicación del vector y la neuropatogenia típica asociada al virus de tipo silvestre; nos dimos cuenta de que el miR-124 maduro de humano y de ratón tienen la misma secuencia (17). Utilizamos ratones atímicos para estos experimentos con el fin de limitar el efecto de la respuesta antivírica del hospedador y de ese modo facilitar la identificación de los efectos directos de la inserción de T124 en el virus. Elegimos los ratones BALB/cnu/nu porque estos animales son muy sensibles a la replicación y patogenia de1HSV (18) (19) (20) y se han utilizado anteriormente para los experimentos de eficacia del tratamiento de tumor con células tumorales de humano (21) (12, 22) (5). Comparamos el vector de control KG y el vector problema KG4:T124 sensible al miR-124 por su capacidad tanto para replicarse en el cerebro de los ratones atímicos como para provocar una infección letal después de la inoculación intracraneal del mismo número de copias del genoma (cg) (4,8 x 109 cg) en el hemisferio derecho. Los resultados demostraron que la inyección del vector de control dio como resultado la muerte rápida de los animales en menos de 5 días (figura 3A y 3C) con un incremento del doble del número total de cg presentes dentro de cada cerebro infectado (figura 3B). Por el contrario, no hubo ningún cambio observable en la salud de los ratones infectados con KG4:T124 durante el periodo de observación de 33 días, como se ejemplifica por el aumento de peso con normalidad hasta el sacrificio (figura 3A), y el contenido de cg del virus disminuyó de manera constante a lo largo de este período de tiempo a aproximadamente el 0,4% de lo inoculado (figura 3B). La diferencia de supervivencia entre los animales inoculados con el vector de control o el problema (figura 3C) fue muy significativa (P = 0,0058, prueba del orden logarítmico), lo que indica que las 4 copias de la secuencia de reconocimiento del miR-124 insertadas en la UTR en 3' del gen de ICP4 eran capaces de bloquear la replicación letal del vector en el cerebro de los ratones atímicos muy sensibles al HSV. Así pues, estas secuencias por sí solas eran suficientes para impedir la toxicidad del vector en el cerebro.

Para confirmar lo que sugieren estos resultados sobre la pérdida o la inactivación mutacional de los sitios diana del miR-124 durante la preparación de la reserva concentrada del virus era infrecuente en el mejor de los casos, se aisló el ADN de la reserva concentrada del virus KG4:T124 y se sometió a una PCR que abarcaba el sitio de inserción de T124 en la UTR en 3' de ICP4. El análisis de los productos por electroforesis en gel y la secuenciación del ADN no mostró tamaños anómalos de los productos de PCR ni ninguna prueba de variabilidad de los nucleótidos (no se muestran los datos). Del mismo modo, la PCR y los análisis de secuencia del ADN total aislado de cerebro a las 3 h o 21 días después de la inoculación intracraneal en los ratones BALB/c normales con el virus KG4:T 124 (1,5 x 1010 cg) no mostraron anomalías a lo largo de la región del T124 (no se muestran los datos). Estos resultados disiparon los problemas relacionados con la posibilidad de que se seleccionen las variantes insensibles al miR-124 durante el crecimiento del virus KG4:T124 o in vivo.

Los elementos de respuesta al miR-124 no menoscaban la actividad oncolítica de1HSV dirigido selectivamente al EGFR. A continuación, tratamos de determinar si los elementos de protección que reconoce el miR-124 afectaron adversamente a la actividad oncocida del virus en un modelo de ratón atímico con el GBM de humano. Ya que el KG era muy tóxico cuando se inoculaba en el cerebro de estos animales (figura 3C), el uso de este virus como control del tratamiento en los experimentos de supervivencia de los ratones portadores de tumores podría dar lugar a la muerte de los animales debido al virus en lugar del tumor y, por tanto, no parecía buena idea. En su lugar introdujimos las 4 copias del sitio de fijación del miR-124 en un derivado de KG totalmente redirigido hacia el EGFR basado en nuestras observaciones publicadas en las que el KOS de HSV-1 de tipo silvestre totalmente redirigido hacia el EGFR no es tóxico para el cerebro de los ratones atímicos, pero es eficaz en el tratamiento del GBM ortotópico de humano en los ratones atímicos (5). Así pues, la comparación de las versiones de KG y KG4:T124 redirigidas hacia el EGFR, denominadas aquí KGE y KGE-4:T124, respectivamente, deberían identificar cualquier efecto limitante de los sitios de miR-124 sobre la actividad oncolítica del virus. Utilizamos las células GBM30 formadoras de esferas procedentes de pacientes para consolidar tumores intracraneales agresivos en los ratones atímicos (5). Se observaron cada día los animales y se sacrificaron en cuanto presentaban signos de morbilidad. En consonancia con nuestros resultados publicados, los ratones que recibieron PBS 5 d después de la inoculación de las células del tumor en las mismas coordenadas estereotácticas murieron a las semanas de la implantación de las células tumorales (mediana: 21,5 d; figuras 4A y 4B). Por el contrario, el tratamiento de los tumores con el virus de control redirigido hacia el EGFR, KGE, o el vector redirigido que contiene el T124, KGE-4:T124, protegió a la mitad de los animales mientras duró el experimento (90 d) y la mediana de la duración de la supervivencia para estos dos grupos resultó ser comparable (79,5 y 85,5 d, respectivamente, P = 0,83, prueba del orden logarítmico). Estos resultados indican que los sitios de miR-124 en el gen de ICP4 del KGE-4:T 124 no alteraban la eficacia del tratamiento del tumor GBM30.

Discusión

Nuestro objetivo era manipular genéticamente un vector de HSV oncolítico que expresara el complemento completo de funciones víricas, pero sólo pudiera infectar las células que expresan un receptor asociado al GBM y replicarse con gran eficacia sólo en el tumor, y no en las células normales del cerebro. La infección selectiva del tumor y el crecimiento lítico del virus se fundamentan en una combinación de la completa reorientación de la entrada del virus (5) y la restricción celular mediada por miARN ejercida sobre la replicación del virus en el tejido cerebral normal. Esta combinación de selectividad transduccional y postranscripcional del tumor promete proporcionar un oHSV muy seguro y eficaz, ya que la infección lítica requiere dos características independientes por parte de la célula diana que son importantes para el mantenimiento del fenotipo del tumor, el receptor diana y un miARN cuyo perfil de expresión es específico del tumor. Esta estrategia general se puede aplicar de manera general con el uso de elementos de direccionamiento y de respuesta a miARN adaptados a los diferentes tipos de cáncer; su aplicación puede optimizarse para el tratamiento personalizado si se tienen en cuenta las posibles diferencias de expresión del antígeno específico y del miARN entre cada uno de los tumores del mismo tipo.

En el GBM, la alteración de la expresión génica incluye la represión sustancial de numerosos miARN en comparación con tejido cerebral normal (23-25), y presenta varios posibles miARN que se podrían usar para atenuar preferiblemente en el cerebro normal la replicación del virus manipulado genéticamente. Debido a que se sabe que el miR-124 es un potente inductor de la diferenciación neuronal (26) y está entre los miARN con mayor represión en el GBM (6), nos centramos en este miARN como medio para bloquear la replicación del oHSV en el tejido cerebral normal. La repetición de los sitios de reconocimiento de miR-124 (T124) se introdujo en la UTR en 3' del gen de ICP4 del virus cuyo producto es absolutamente necesario para poner en marcha el ciclo lítico del HSV. Se encontró que, en las células de glioma, el virus T124+ puede replicarse esencialmente con la misma robustez que el virus de control que carece de T124, mientras que la expresión lentivírica del miR-124 bloquea selectivamente su replicación. Además, el elemento T124 fue suficiente para proteger completamente a los ratones atímicos ante dosis intracraneales de vector muy altas (4,8 x 109 partículas), mientras que el vector de control mató a todos los animales al cabo de menos de cinco días. Determinación del número de copias totales del genoma del virus en el cerebro de estos animales no mostró ningún signo de replicación del vector T124+, sino más bien una disminución gradual del contenido de genomas del virus con el tiempo. La secuencia T124 fue estable según la valoración del tamaño y del análisis de la secuencia de la UTR en 3' de ICP4 amplificada en el ADN purificado a partir de las reservas concentradas del virus y de los animales infectados, en concordancia con la falta de neuropatogenia manifiesta en los animales libres de tumor o supervivientes a largo plazo de nuestro experimento de tratamiento del tumor. Finalmente, se utilizó un virus redirigido que no consigue infectar las células de ratón para demostrar que el elemento T124 no redujo la eficacia oncolítica de este virus en un modelo de GBM de humano en ratones atímicos.

La combinación del envío del virus hacia los receptores del tumor y el bloqueo, mediante miARN, de la replicación del virus en las células normales realza la especificidad de diana que presenta el virus lítico mediante el bloqueo de la infección productiva de las células normales que pueden compartir el receptor destinatario con el tumor (por ejemplo, EGFR). Aunque nuestros resultados muestran que la inserción de cuatro copias de la secuencia diana para el miR-124 en la UTR en 3' del gen de ICP4 bloquea completamente la neuropatogenia del virus en dosis muy altas en los ratones atímicos, no todas las células cerebrales expresan el miR-124. No se espera que, por ejemplo, las células precursoras neuronales (CPN), situadas en el hipocampo y en la zona subventricular (ZSV), estuvieran protegidas por las secuencias diana del miR-124, ya que los miARN de estas células tienen un perfil de expresión muy parecido al de las células de GBM, incluida la expresión mínima del miR-124 (27). No obstante, varios miARN se expresan hasta 100 veces más en las CPN que en los gliomas (27) (28) (29) (30), lo que sugiere la posibilidad de utilizar los sitios con las dianas de otros miARN manipulados genéticamente del mismo u otros genes esenciales del mismo virus para bloquear la replicación en una gama más amplia de células cerebrales, sin comprometer la replicación del virus específica del tumor.

Aunque nuestro estudio sugiere que la combinación de virus que reconocen selectivamente un antígeno tumoral y de la replicación restringida por miARN en el tejido normal es una estrategia atractiva para viroterapia eficaz y muy específica del tumor, es probable que cada uno de los tumores difieran en su respuesta al tratamiento debido a la variabilidad de la concentración del antígeno tumoral y, tal vez, del contenido de miARN. Por ejemplo, hay diferencias significativas entre los tumores clasificados como GBM, e incluso dentro de los subtipos de GBM definidos desde el punto de vista molecular, siguen siento heterogéneos los perfiles de expresión génica (31). Así pues, un único virus reorientado no será eficaz contra todos los GBM ni todos los GBM del mismo subtipo. Además, se puede anticipar que pueden surgir poblaciones de células resistentes en los tumores muy sensibles al oHSV como consecuencia de la variabilidad intercelular preexistente, o inducida por tratamiento, dentro del tumor. Los acontecimientos de los últimos años sugieren que la pequeña población de células madre del cáncer (CSC) autorrenovables, quimiorresistentes y radiorresistentes identificadas en muchos tipos diferentes de tumores son las dianas más relevantes para el tratamiento (32). Aunque la comparación de cada una de las CSC de un tumor dado es problemática, es probable que su variabilidad intratumoral esté limitada con respecto a la de la población completa de células tumorales. En los resultados que aparecen en la bibliografía se describen diferentes marcadores de células madre de glioma (GSC) (33) y se pueden utilizar los virus oncolíticos reorientados para distinguir el significado de cada uno de ellos para el establecimiento y mantenimiento del GBM de humano en los ratones atímicos. Anticipamos que los tumores que muestran respuestas parciales contra diferentes vectores redirigidos se pueden tratar de manera más eficaz con combinaciones de vectores redirigidos contra diferentes marcadores candidatos de GSC. Como cada uno de estos vectores puede reconocer selectivamente también ciertas células normales, al igual que nuestros virus redirigidos hacia el EGFR, el bloqueo mediado por miARN de la replicación del virus en estas células normales tendrá una importancia cada vez mayor. Además, podría ocurrir que se alcance una mayor especificidad con el uso de promotores específicos de la etapa de desarrollo o específicos del tipo celular para controlar la expresión de las funciones clave para la replicación del virus, como avanzaron en el campo del oHSV Kambara y sus colegas (34). Aunque estas características pueden proporcionar cócteles de vectores oncolíticos muy activos y específicos, hay que destacar que en los vectores como KGE-4:T124 queda mucho sitio para acomodar transgenes que pueden potenciar la eficacia terapéutica, tales como genes que codifican moduladores inmunitarios, inhibidores de la migración de las células tumorales, o enzimas proteolíticas que degradan la matriz extracelular del tumor, y con ello facilitar la propagación intratumoral del virus.

En resumen, el vector KGE-4:T124 descrito en este ejemplo representa un nuevo tipo de oHSV que contiene el complemento completo para las funciones replicativas del virus, pero obtiene la especificidad tumoral a partir de una combinación de envoltura del virus que lo reorienta hacia los receptores asociados a tumores, y de replicación sensible a los miARN que se expresan en el tejido normal, pero no en el tumor. Esta combinación de sistemas de control se puede aplicar a otros tipos de tumores, pero no se ha descrito previamente en los vectores oncolíticos. Las ventajas clave de nuestra estrategia son (i) que el vector no contiene ningún gen defectuoso, lo que permite la replicación máxima del virus en los tumores para proporcionar la viroterapia oncolítica óptima, y (ii) que la replicación del vector requiere marcadores importantes de la superficie celular que se expresen asociados al tumor así como miARN con un perfil de expresión específico de tumor que difiere sustancialmente del observado en el tejido normal. El argumento más convincente para nuestra estrategia es que los miARN elegidos para controlar la replicación del vector en el cerebro normal no se pueden activar en el glioblastoma sin comprometer el fenotipo tumoral (7, 25, 35); la pérdida del receptor diana, tal como la variante específica de tumor EGFRvIII reconocida por nuestro vector, podría tener un efecto similar. Así pues, mientras que en la mayoría de los tratamientos contra el cáncer el tumor desarrolla la capacidad de eludir el tratamiento, este resultado es menos probable con los virus regulados por miARN dirigidos hacia un antígeno específico de tumor. En conjunto, estos argumentos apoyan la expectativa de que nuestra estrategia proporcionará sistemas de vectores de HSV oncolíticos muy selectivos, seguros y eficaces para el tratamiento del GBM y de otros tipos de cáncer.

Material y métodos

Cultivo de células. Las células U2OS, HEK293T y HEK293AD proceden de la ATCC (Manassas, VA) y se hicieron crecer en una incubadora con CO2 al 5 % a 37 °C en el medio recomendado por la ATCC suplementado con suero fetal bovino (FBS, Sigma, St. Louis, MO) del 5 al 10 % (v/v). Se generó una línea celular U2OS que expresaba de forma estable la recombinasa Cre (U2OS-Cre) por transducción retrovírica (Y. M. y J. C. G., resultados sin publicar).

Las líneas de esferoides de glioma primario GBM30 y Gli68 procedentes de pacientes, generosamente proporcionadas por E. A. Chiocca (Harvard Medical School, MA), se hicieron crecer en el medio neurobasal (Gibco/Invitrogen/Life Technologies, Carlsbad, CA) más un 2 % (v/v) de B27 sin vitamina A, 2 mg/ml de amfotericina B (Lonza, Walkersville, MD), 100 pg/ml de gentamicina (Lonza), 2 mM de L-glutamina (Cellgro, Manassas, VA), además del factor de crecimiento epidérmico de humano recombinante (rhEGF) a 10 ng/ml y del factor de crecimiento de fibroblastos básico de humano recombinante (bFGF) a 10 ng/ml (ambos de Shenandoah Biotechnology, Warwick, PA).

Plásmidos. El pfLuc-T124 contiene cuatro repeticiones en tándem del complemento inverso de la secuencia de hsamiR-124 separadas por 8 nt, mientras que el pfLuc-Ctrl contiene cuatro repeticiones en tándem de la secuencia inversa de hsa-miR-21 separadas por 8 nt. Ambos plásmidos se construyeron por inserción de oligonucleótidos complementarios hibridados en la UTR en 3' del gen de la luciferasa en pMIR-REPORT™ (sistema de vector indicador de la expresión del miARN; Ambion, Austin, TX). Los oligonucleótidos fueron T124-F, T124-R, TconF y TconR (tabla 1). Los oligonucleótidos hibridados se digirieron con SpeI y SacI, y se ligaron al pMIR-REPORT™ digerido con SpeI y SacI.

Manipulación genética del genoma del HSV. El BAC KOS-37 (11), que contiene el genoma completo de1HSV-1 de la cepa KOS en un cromosoma artificial bacteriano (BAC), fue proporcionado amablemente por David Leib (Dartmouth Medical School, NH). La región única (U^s) corta del HSV en este BAC está en la orientación inversa con respecto a la secuencia publicada (posiciones 132275 a 145608) del HSV-1 KOS (36) (número de acceso del GenBank JQ673480). Las modificaciones que se detallan más adelante se introdujeron por doble recombinación Red, esencialmente tal y como describen Tischer et al. (10). Los plásmidos pEPkan-S y pBAD-/-sce/ (10) fueron generosamente proporcionados por Nikolaus Osterrieder (Universidad Libre de Berlín, Alemania). Los cambios se verificaron mediante análisis por PCR, análisis por FIGE de digestiones con enzimas de restricción, y secuenciación local del ADN.

Los vectores utilizados en este estudio se obtuvieron de forma secuencial como sigue. El KGBAC se derivó del BAC KOS-37 mediante la deleción de la región completa de la repetición interna de1HSV o «unión» (IR^l, IR^s), fusión del marco abierto de lectura (ORF) de la proteína verde fluorescente (GFP) al ORF de la glucoproteína C (gC) a través de la secuencia de terminación/reinicio de la traducción del virus 2A de Thosea asigna (T2A) (13) (37), y la introducción de dos mutaciones de aminoácido en la secuencia codificante de gB (gB:N/T) (15). Se creó el KG4:T124BAC a partir del KGBAC mediante la inserción del elemento T124 de pfLuc-T 124 en la UTR en 3' del gen de ICP4. El vector KGEBAC redirigido se derivó del KGBAC mediante la sustitución de la región del extremo amino del gen de gD con la correspondiente región de gD-scEGFR que contiene la secuencia para un anticuerpo de cadena sencilla específico contra el EGFR de humano entre las posiciones 1 y 25 de la gD, y una mutación de aminoácido en el codón 38 (5). El KGE-4:T124BAC combina las modificaciones de KG4:T124BAC y KGe ^bac.

Crecimiento y purificación del virus . El ADN de los BAC se convirtió en virus infecciosos mediante la transfección de las células U2OS-Cre con el uso del reactivo de LTX Lipofectamine™ (Invitrogen); la recombinasa de Cre expresada en estas células permitió la retirada de los elementos del BAC inhibidores del crecimiento del virus y el gen lacZ adyacente localizado en el BAC KOS-37 y los derivados entre las señales de recombinación de loxP (11). Se aislaron placas individualizadas por dilución límite y se comprobó la eliminación del gen lacZ mediante la tinción con X-gal (38). Las placas incoloras se sometieron a dos rondas adicionales de dilución límite y se confirmó la retirada exacta de la región de BAC/lacZ por secuenciación local de ADN aplicada al ADN del virión purificado. El título biológico de las reservas concentradas del virus (ufp/ml) se determinó en las células U2OS; el título físico en copias de genoma (cg) por mililitro se determinó por PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) para el gen de gD del virus, tal y como se describe a continuación.

Ensayo de la luciferasa. Las células HEK293AD se transfectaron con el plásmido prLuc que expresa la luciferasa de Renilla junto con combinaciones de diferentes plásmidos que expresan la luciferasa de luciérnaga y precursores del miARN pre-miR™ (Ambion) con el uso de Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Al día siguiente, las células se lisaron y los cocientes de expresión de la luciferasa de luciérnaga entre la de Renilla se determinaron con un luminómetro AutoLumat LB-953 de Berthold (Berthold Technologies USA, Oak Ridge, TN).

Expresión de los miARN en lentivirus. El ADN genómico de las células de glioblastoma humano U-87 se utilizó como molde para la amplificación por PCR de la secuencia del pri-miR-124 de humano a partir del gen de hsa-miR-124-3 con el uso de la polimerasa High Fidelity AccuPrime (Invitrogen) para DNA rico en GC y el par de cebadores de miR-124 que aparece en la tabla 1. El producto de 320 pb se digirió con BamHI y NheI, se clonó entre los sitios correspondientes en el intrón del vector pEP-miR miRNASelect (Cell Biolabs, San Diego, CA), y se confirmó la secuencia. La región promotor-intrón-pri-miR-124 se transfirió posteriormente al pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro (System Biosciences, Mountain View, CA) mediante el reemplazo del promotor EF1 residente para generar plásmido de expresión para lentivirus pCDH-miR-124. Se utilizaron los mismos procedimientos para construir el plásmido lentivírico de control (pCDH-miR-137R) que contiene la secuencia de pri-miR-137 en la orientación inversa; los cebadores de PCR utilizados para la clonación de pri-miR-137 se recogen en la tabla 1. Los lentivirus LV124 y LV137R se produjeron por cotransfección de pCDH-miR-124 o pCDH-miR-137R, respectivamente, con los plásmidos de empaquetamiento pLP1, pLP2, pLP-VSVG (Invitrogen) en las células HEK293T. Los sobrenadantes se recogieron 72 h después, se pasaron a través de un filtro de 0,45 pm (Millipore, Billerica, MA), y se concentraron por centrifugación durante 16 horas a 4 °C y 6800 x g. Los sedimentos se resuspendieron en DMEM y se titularon como unidades formadoras de colonias (ufc) resistentes a la puromicina por mililitro en las células HEK293T.

Se infectaron 2 x 105 células Gli68 o GBM30 trituradas en suspensión, ya sea con LV124 o con LV137R a 5 ufc/célula en presencia de 8 pg/ml de polibreno durante 90 min y se sembraron en placas. Las células se alimentaron al día siguiente con medio recién preparado que contenía 30 pg/ml de puromicina y se superinfectaron 72 h más tarde, ya sea con el virus KG o el KG4:T124 a una MDI de 0,01 ufp/célula. A las 72 y 96 h después de la infección de1HSV, se recogieron las partículas de virus infecciosos de las células y los sobrenadantes, y se titularon en las células U2OS. Se aisló el ARN a partir de cultivos paralelos de células Gli68 infectadas con LV124 después de 72 h de selección con puromicina para la determinación de la cantidad de miR-124 por qRT-PCR, tal y como se describe a continuación.

Aislamiento de ARN y retrotranscripción (RT) acoplada a qPCR. El ARN total se extrajo de las células U2OS, Gli68, y Gli68 infectadas con LV124 con el uso del reactivo TRIzol (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Las muestras de ARN se trataron con DNasa I (Invitrogen), se cuantificaron con un espectrofotómetro NanoDrop 2000c (Thermo-Fisher, Pittsburgh, PA) y se visualizaron en un gel con MOPS-formaldehído para garantizar la calidad. La cantidad de hsa-miR-124 maduro se determinó con respecto a RNU43 de acuerdo con el protocolo de ensayos de ARN pequeños con TaqMan (Applied Biosystems/Life Technologies, Carlsbad, CA). Los cebadores TaqMan y las sondas fueron de Applied Biosystems. Todas las reacciones de PCR con TaqMan se realizaron por triplicado.

Animales. Se compraron ratones nu/nu atímicos BALB/c de 3 a 4 semanas de edad a Charles River Laboratory (Wilmington, MA) y alojaron en una instalación con nivel de bioseguridad 2. Todos los procedimientos con los animales se realizaron de acuerdo con los requisitos y recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Instituto para la Investigación con Animales de Laboratorio, 1985) aprobado por el Comité Institucional para el Uso y Cuidado de los Animales (IACUC) de la Universidad de Pittsburgh.

Toxicidad intracraneal. Se realizaron inoculaciones intracraneales de virus tal y como está descrito (5). Los ratones recibieron 4,8 x 109 cg del virus KG o KG4:T 124 (n = 4/grupo). Los animales se vigilaron cada día para detectar signos de morbilidad y se pesaron cada dos días. Todos los ratones del grupo con KG murieron el día 5 y un ratón del otro grupo se sacrificó el mismo día. Los demás animales del grupo con KG4:T124 se sacrificaron los días 14, 21 y 33. Se recogió el cerebro entero de los ratones sacrificados para la extracción del ADN total y qPCR para los genomas víricos, tal y como se describe a continuación.

qPCR para los genomas víricos . Se extrajo el ADN a partir del cerebro de los ratones o de las reservas concentradas de virus con el uso del kit DNeasy para sangre y tejidos (Qiagen, Valencia, CA) de acuerdo con el procedimiento del fabricante. Se generó una curva estándar para la qPCR con el ADN de un plásmido pENTR1A (Invitrogen) que contiene la secuencia completa codificante de gD del HSV-1 (cepa KOS) (pE-gD18) con el uso del protocolo descrito en el manual de sistemas de PCR en tiempo real StepOne™ y StepOnePlus™ de Applied Biosystems. Las secuencias de los cebadores y de la sonda se recogen en la tabla 1.

Modelo de tumor y su tratamiento. La implantación intracraneal de células GBM30 de humano en los ratones atímicos se realizó tal y como está descrito (5). A los 5 d, se les inocularon los virus (1,8 x 108 cg de KGE o KGE-4:T124, n = 8/grupo) o PBS (n = 2) en las mismas coordenadas, también tal y como está descrito (5). La salud del animal y su bienestar se vigilaron como se ha descrito anteriormente en "Toxicidad intracraneal". Los animales se sacrificaron al mostrar signos de morbilidad.

El análisis estadístico. La prueba de la t para datos independientes con la corrección de Welch se realizó con GraphPad Prism versión 6.01 para Windows (GraphPad Software, La Jolla, CA; www.graphpad.com). Los datos de supervivencia de los animales se representaron como gráficos de Kaplan-Meier y se compararon mediante la prueba del orden logarítmico de Mantel-Cox con el uso del mismo programa informático.

Referencias para el Ejemplo 1

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Ejemplo 2

Este ejemplo describe cómo se construye un oHSV de tipo 1 dirigido al tumor con la metaloproteinasa 9 de la matriz para potenciar la distribución del vector y su actividad destructora.

Material y métodos

Líneas celulares. Las células de glioblastoma humano SNB19, U251, U87 (proporcionadas amablemente por el Dr. H Okada, Universidad de Pittsburgh), J/A, J/C, J/EGFR [9], Vero de riñón del mono verde africano y 7b [15] se cultivaron por métodos estándares.

Las células se cultivaron en el medio de Eagle modificado por Dulbecco (Life Technologies, Grand Island, NY) suplementado con suero bovino fetal (Sigma. St. Louis, MO) al 10%. Las líneas celulares de glioblastoma primario GBM169, OG2 (proporcionadas amablemente por el Dr. Balveen Kaur, Universidad del Estado de Ohio) y GBM30 se cultivaron como esferoides en el medio neurobasal complementado con Glutamax, B27, FGF p de humano, EGF, heparina y penicilina-estreptomicina.

Plásmidos. Se generó el BAC KGw a partir del KGE-4:T124BAC mediante la inserción de un casete Gatway amplificado a partir del pcDNA3.1GW con los cebadores 5'-TGCCCGTCGCGCGTGTTTGATGTTAATAAATAACACATAAATTTGGCTGGCCACTAGTCCAGTGTGGTGG-3' (SEQ ID n.2 12) y 5'-CTGAAATGCCCCCCCCCCCTTGCGGGCGGTCCATTAAAGACAACAAACAAATCCCCAGCATGCCTGCTATTGT-3' (SEQ ID n.213).

El pEnCM se hizo por clonación del promotor de CAG a partir del plásmido pCAGH [10] en el pEntr-MMP9. El pEntr-MMP9 se hizo por clonación del cADN de mmp9 desde un plásmido descrito anteriormente, el pCMV6-XL4-MMP9, en el plásmido pEntr1A [13].

Manipulación genética del genoma del HSV. El BAC KOS-37 [14], que contiene el genoma completo de HSV-1 de la cepa KOS en un cromosoma artificial bacteriano (BAC), fue proporcionado amablemente por David Leib (Dartmouth Medical School, NH). La doble recombinación Red en E. c o li[24] se utilizó para introducir una serie de modificaciones en el BAC KOS-37, un clon del genoma completo de la cepa KOS del HSV-1 en un cromosoma artificial bacteriano (BAC) [14]. Al producto, KGBAC (figura 5), se le delecionó la región de repetición interna (unión) que contiene una copia de cada uno de los genes diploides ICP0, ICP34.5, LAT e ICP4 junto con el promotor para el gen de ICP47.

El KGwG4:T124BAC (denominado también KGw) se creó a partir del KGE-4:T124BAC (explicado en el ejemplo 1) mediante la inserción del casete Gateway (a partir del pcDNA3.1GW) y la secuencia de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina en la región intergénica de UL3-UL4 gracias a la tecnología de recombinación Red/ET (Gene Bridges GmbH, Heidelberg). El vector KMMP9G4:T124BAC que expresa la MMP9 (denominado también KMMP9) se derivó del KGwG4:T124BAC mediante la sustitución del casete de Gw con el casete promotor de CAG-MMP9 a partir del pEnCM por reacción de la LR Clonase. Con el fin de producir los virus, las células Vero 7b se transfectaron con el KGwG4:T124BAC o bien con el KMMP9G4:T124BAC. Todos los vectores recombinantes se confirmaron mediante mapeo en FIGE, PCR y secuenciación del ADN a lo largo de las regiones modificadas pertinentes.

Crecimiento y purificación del virus . El ADN de los BAC se convirtió en virus infecciosos mediante la transfección de las células Vero 7b con el uso del reactivo Lipofectamine™ LTX (Invitrogen). Los títulos biológicos de las reservas concentradas de virus (ufp/ml) se determinaron en las células Vero; los títulos físicos en copias de genoma (cg) por mililitro se determinaron mediante PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) para el gen vírico de gD, tal y como se describe a continuación.

qPCR para los genomas víricos . Se extrajo el ADN de las reservas concentradas de virus mediante el kit para sangre y tejidos DNeasy (Qiagen, Valencia, CA) de acuerdo con el procedimiento del fabricante. Se generó una curva estándar para la qPCR con el ADN del plásmido pENTR1A (Invitrogen) que contiene la secuencia codificante completa de gD del HSV-1 (cepa KOS) (pE-gD18) con el uso del protocolo descrito en el manual de los sistemas de PCR en tiempo real de Applied Biosystems StepOne™ y StepOnePlus™. Aquí aparece la secuencia de los cebadores y de la sonda: gD directo: 5'-CCCCGCTGGAACTACTATGACA-3' (SEQ ID n.214); gD inverso: 5'-GCATCAGGAACCCCAGGTT-3' (SEQ ID n.215); sonda: 5' FAM-TTCAGCGCCGTCAGCGAGGA-TAMRA-3' (SEQ ID n.216).

Inmunotransferencia de tipo Western. Las células se lisaron en el tampón con NP40 al 1 %, los lisados se sometieron a electroforesis en de geles de poliacrilamida con SDS al 10 %, y las transferencias de proteínas se hicieron reaccionar con el anticuerpo policlonal anti-MMP-9 (dilución 1:1000) (Abcam, Cambridge, MA) o con el anticuerpo antigD (1:2000) (Santa Cruz, CA) y el anticuerpo secundario anticonejo conjugado con HRP (Sigma, St. Louis, MO). Las transferencias se revelaron con el sustrato de quimioluminiscencia (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ). La porción inferior de cada transferencia se hizo reaccionar con el anticuerpo policlonal anti-tubulina p (1:3000) (Sigma, St. Louis, MO) para detectar las diferencias de carga. Las transferencias se revelaron con el sustrato quimioluminiscente SuperSignal West Dura (Thermo Scientific, Rockford, IL).

Zimografía en gelatina. Las muestras no se trataron con el agente reductor ni se calentaron antes de separarlas en un gel de poliacrilamida con SDS al 10 % que contiene gelatina al 0,2 %. El gel se lavó en el tampón de lavado de zimografías (Tris a 10 mM, pH 7,5, Triton X-100 al 2,5 %), se incubaron a 37 °C durante 16 h en el tampón de incubación (Tris a 50 mM, pH 7,5, CaCl2 a 5 mM, ZnCl2 a 1 pM), se tiñeron con azul brillante de Coomassie R-250 al 1 % y se destiñó con el tampón de destinción (metanol al 4 %, ácido acético al 8 %) [13].

Ensayo de entrada. Se infectaron las células J/A, J/C y J/EGFR a 10000, 1000 o 100 cg/célula con KMMP9, KGw o KG (que expresa la gD de tipo silvestre) durante 6 horas y se inmunotiñeron con anti-ICP4 monoclonal de ratón (1:300; Santa Cruz Biotechnology) e IgG antirratón de oveja conjugado a Cy3 (1:400; Sigma) [9].

Ensayo con MTT. Las células se sembraron en placas de 48 pocillos y se infectaron a 100 cg/célula (MOI de 0,2) durante 3 o 6 días. A continuación, las células se trataron con 0,5 mg/ml de MTT (Sigma) en solución a 37 °C durante 3 h. Después de la eliminación de la solución de MTT, se le añadió DMSO al 100 % y se grabó la DO570 mediante un lector de microplacas Wallac (Perkin Elmer, Waltham, MA). El porcentaje de supervivencia celular se calculó como 100 % x DO(infectado)/DO(sin infectar).

Cultivo de esferoides y toma de imágenes confocales. Los esferoides se disociaron y se contaron. Se hicieron crecer 3 000 células sueltas en suspensión durante 2 días hasta que se formaron los esferoides. Se infectó cada esferoide con 1000 ufp o 4 x 107 cg de KMMP9 o KGw por separado en placas de microensayo. Las imágenes de eGFP se adquirieron todos los días con un microscopio de fluorescencia. Para la toma de imágenes confocales, se transfirieron los esferoides a placas con fondo de cristal (pocillos Willco, Amsterdam, Países Bajos) después de la infección. A cabo de 5 dpi, se fijaron los esferoides en paraformaldehído al 4 %, se trataron con el medio de montaje con DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA) y se obtuvieron imágenes de las secciones Z con el sistema de toma de imágenes confocales FV1000 (Olympus, Miami, FL).

Modelo de tumor y su tratamiento. Los ratones nu/nu atímicos BALB/c de 3 a 4 semanas de edad se compraron a Charles River Laboratory (Wilmington, MA) y se alojaron en una instalación con nivel de bioseguridad 2. Todos los procedimientos con los animales se realizaron de acuerdo con los requisitos y recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Instituto para la Investigación con Animales de Laboratorio, 1985) según aprobó el Comité Institucional para el Uso y Cuidado de los Animales (IACUC) de la Universidad de Pittsburgh.

La implantación intracraneal de 2 x 105 células GBM30 de humano en los ratones atímicos se realizó tal y como está descrito [9]. A los 5 o 10 dpi, se les inocularon 5,65 x 109 copias del genoma de KMMP9, KGw, o PBS (n = 3 o 4/grupo) en las mismas coordenadas en las que se habían inyectado las células tumorales (0,5 mm anterior, 2 mm lateral (derecha), 3 mm de profundidad con respecto a la bregma), tal y como también está descrito [9]. Se vigiló la salud y el bienestar de los animales y se sacrificaron los animales al mostrar signos de morbilidad.

Resonancia magnética. Se seleccionaron varios ratones al azar de cada grupo de tratamiento (KMMP9, KGw, PBS). Se tomaron imágenes de los animales 1 día antes del tratamiento (9 días después de la implantación de GBM30) y los días 3, 6, 9 y 13 después del tratamiento. La toma de imágenes se realizó mediante un imán Bruker BioSpec 94/30 (Bruker BioSpin, Karlsruhe, Alemania), una espiral de cerebro de ratón de recepción solamente de 2,0 cm de diámetro y espiral de volumen lineal con un diámetro de 70 mm. A los ratones anestesiados se les inyectó 0,1 mmol/kg de Magnevist (Bayer Health Care Pharmaceuticals, Wayne, NJ) por vía intraperitoneal y las imágenes ponderadas en T2 (tiempo de repetición = 3500 ms, tiempo de eco = 12 ms, factor infrecuente = 8, navgs = 4) se adquirieron desde la perspectiva coronal a través de la región de interés en un imán perforado horizontal Bruker de 400 MHz que funcionaba con Paravision 4.0 (Bruker Biospin, Billerica, MA).

Análisis estadístico. La prueba de la t para datos independientes con corrección de Welch se realizó con GraphPad Prism versión 6.01 para Windows (GraphPad Software, La Jolla, CA; www.graphpad.com). Los datos de supervivencia de los animales se representaron como gráficos de Kaplan-Meier y se compararon mediante la prueba del orden logarítmico de Mantel-Cox con el mismo programa informático.

Resultados

Construcción y caracterización de los vectores redirigidos que expresan la MMP9 y están controlados con miR

La manipulación genética y el diseño de vectores para este estudio se esquematiza en la figura 5A e incluye numerosas modificaciones que están destinadas a impedir la alteración de las funciones líticas del virus y, así pues, incrementar al máximo la replicación y la actividad lítica en las células tumorales, mientras que se impide el crecimiento del virus en el cerebro normal.

Entre los locus UL3 y UL4 de KGE-4:T124 (descrito en el ejemplo 1) se insertaron un casete Gateway (Gw) y la secuencia de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina para crear el KGwG4:T 124BAC (denominado aquí también KGw, vector de control); el vector oncolítico que expresa la MMP9 se obtuvo mediante la sustitución del casete Gateway con el gen de la MMP9 impulsado por el promotor de CAG (actina p del CMV de pollo) (KMMP9G4:T124BAC que se denomina también KMMP9 en el presente documento).

El análisis de inmunotransferencia de tipo Western de las células Vero infectadas con el KMMP9 confirmó la expresión correcta de la MMP9 (figura 5B). La zimografía en gelatina mostró una mayor actividad gelatinasa en tres líneas de GBM primario, GBM 30, GBM169 y OG2, infectadas con el KMMP9 en comparación con las células infectadas con el vector de control (figura 5C) y en el sobrenadante de las células Vero infectadas por el KMMP9 en comparación con las células Vero infectadas con el control (figura 5D).

Esto nos permitió determinar si la expresión de la MMP9 afectaba a la entrada del virus a través del reconocimiento del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). Las líneas celulares en las que se analizó la entrada del virus incluyeron las células J1.1-2 transducidas con el EGFR (J/EGFR) (Nakano et al., Virol., 413: 12-18 (2011)) que son resistentes al HSV de tipo silvestre debido a la ausencia de los receptores de gD, las células J/A que expresan el HVEM de humano (Uchida et al., J. Virol. 83: 2951 -2961 (2009)), y las células J/C que expresan la nectina-1 de humano (Frampton et al., J. Virol., 81: 10879-889 (2007)); el HVEM y la nectina-1 son los receptores naturales para la gD de tipo silvestre. La entrada del virus se detectó por inmunotinción de la proteína ICP4 inmediata temprana de1HSV 6 horas después de la infección. Como se muestra en la figura 6A, la entrada al interior de las células J/EGFR que presentan los virus KMMP9 y KGw redirigidos hacia el EGFR fue tan eficaz como la entrada del vector de1HSV-1 original que expresa la gD de tipo silvestre en las células J/A o J/C. Ninguno de los virus redirigidos entraron de manera detectable en las células J/C o J/A incluso con cargas víricas altas (10 000 cg/célula), lo que demuestra que la expresión de la MMP9 no altera la eficacia ni a la especificidad de la infección del vector redirigido.

También se valoró si la expresión de la MMP9 podría afectar a la replicación del virus en las células de GBM de humano en cultivo. Los resultados (figura 6B y 6C) demostraron que el KMMP9 se replicaba con una cinética similar a la de KGw en los esferoides de dos líneas de glioblastoma primario, GBM169 y GBM30, y qu el rendimiento de los 2 virus (medido por qPCR) no era sustancialmente distinto en cualquier punto de tiempo.

Para evaluar la actividad oncolítica del KMMP9, las líneas de glioma humano permisivas para e1HSV que se sabe que expresan el EGFR, incluidas U87MG, SNB19, y GBM30, se infectaron a una MDI de 0,005 (100 cg/célula) y se determinó la viabilidad celular con el ensayo del bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) al cabo de 3 (figura 7A) y 7 (figura 7B) días posteriores a la infección. En el último punto de tiempo, el KMMP9 mostró una capacidad destructiva significativamente mayor de 2 las líneas celulares en comparación con la del KGw, lo que sugiere que la MMP9 podría aumentar la oncólisis mediada por el vector.

La MMP-9 aumenta la infectividad del HSV en el cultivo de esferoides

Para valorar el efecto de incrementar la expresión celular de la MMP-9 en la propagación de1HSV en los esferoides de células tumorales, las células GBM30 y GBM169 se cultivaron como esferoides individuales y se infectaron con el virus KMMP9 o el KGw (figura 8A). A los 5 dpi, con KMMP9 se observó una mayor distribución de la eGFP expresada por el vector en comparación con el KGw. La cuantificación de células positivas para eGFP en cada esferoide demostró que se incrementaba aproximadamente 1,5 veces a los 6 dpi en los esferoides infectados con el KMMP9 con respecto a los infectados con el KGw (figura 8B; P = 0,006).

Para cuantificar aún más el efecto de la MMP9 en la infectividad del HSV sobre los esferoides primarios derivados del tumor, las células GBM30 se infectaron con el KMMP9 o bien con el KGw, y la eGFP expresada por el vector se fotografió por microscopía confocal para valorar la penetración y la infectividad del virus. La reconstrucción 3D a partir de las pilas de secciones de 5 gm en Z reveló una infectividad relativa mejorada del KMMP9 en comparación con el KGw en el interior de los esferoides (figura 8C). También se examinó la diferencia de infectividad en 5 segmentos de cada esferoide en términos de profundidad en el eje Z (figura 8D y 8E) (de abajo hacia arriba 0-20 gm, 25-50 gm, 55­ 80 gm, 85-100 gm, 105-120 gm y 125-140 gm). Si bien no se encontraron diferencias en el segmento más externo (0­ 20 gm) (figura 8d y 8E), el KMMP9 mostró una infectividad significativamente mayor que el KGw a más profundidad en los esferoides (25-50 y 50-85 gm, P < 0,05), lo que sugiere que la MMP9 potenciaba la diseminación del vector por los esferoides. También se encontró una diferencia significativa cuando todos los segmentos se compararon entre los esferoides (prueba de la t para datos emparejados, P = 0,013).

El vector oncolítico con la MMP9 es muy eficaz a la hora de tratar el GBM en los ratones

Más arriba se ha puesto de manifiesto que las GBM30 consolidaban constantemente un tumor letal en los ratones atímicos que llevaba a la muerte de los animales en menos de 20 días desde la inoculación de las células del tumor [9]. Utilizamos las células GBM30 procedentes de pacientes, y que forman esferas, para consolidar tumores intracraneales agresivos en los ratones atímicos [9]. Los animales se observaron cada día y se sacrificaron cuando mostraban signos de morbilidad. En línea con los resultados que hemos publicado, los ratones en los que se inyectó PBS 5 d después de la inoculación de las células del tumor en las mismas coordenadas estereotácticas murieron a las semanas de la implantación de las células tumorales (mediana de 18 d; figura 9). Por el contrario, los tratamientos tumorales ya sea con el virus que expresa la MMP9, KMMP9, o el virus de control, KGw, protegieron a la mitad de los animales durante al menos 35 días y la mediana del tiempo de supervivencia para estos dos grupos fueron comparables (29 y 31,5 d, respectivamente; P = 0,61, prueba del rango logarítmico). Estos resultados mostraron que el 50 % de los animales tratados con la MMP9 sobrevivieron hasta 35 días en comparación con los 18 días cuando no recibieron tratamiento (figura 9).

En un experimento independiente en paralelo, la eficacia antitumoral de KMMP9 y KGw se comparó con el tratamiento simulado (PBS) en el modelo ortotópico de xenoinjerto de GBM30 mediante la inyección de los vectores 10 días después de la inoculación del tumor. Se tomaron imágenes de los ratones por resonancia magnética (MRI) para ver el cambio de tamaño del tumor 1 día antes del tratamiento y de nuevo los días 3, 6, 9 y 13 posteriores al tratamiento. En la figura 10A se muestran las imágenes ponderadas en T2 de un ejemplo de cada grupo. Al comparar los animales sueltos de cada grupo que tenían un volumen tumoral comparable en el momento de inicio del tratamiento, resulta evidente que la MMP9 tenía un efecto oncolítico más fuerte que el vector KGw (figura 10B).

Referencias para el ejemplo 2

1. Grossman, S.A., et al., Survival o f patients with newly diagnosed glioblastoma treated with radiation and temozolomide in research studies in the United States. Clin Cancer Res, 2010. 16(8): p. 2443-9.

2. Assi, H., et al., Gene therapy forbrain tumors: basic developments and clinicalimplementation. Neurosci Lett, 2012.

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3. Friedman, G.K., et al., Herpes simplex virus oncolytic therapy forpediatric malignancies. Mol Ther, 2009. 17(7): p.

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4. Mohyeldin, A. y E.A. Chiocca, Gene and viral therapy for glioblastoma: a review of clinical trials and future directions. Cancer J, 2012. 18(1): p. 82-8.

5. Campadelli-Fiume, G., et al., Rethinking herpes simplex virus: the way to oncolytic agents. Rev Med Virol, 2011.

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8. Navaratnarajah, C.K., et al., Targeted entry o f enveloped viruses: measles and herpes simplex virus I. Curr Opin Virol, 2012. 2(1): p. 43-9.

9. Uchida, H., et al., Effective treatment o f an orthotopic xenograft model o f human glioblastoma using an EGFR-retargeted oncolytic herpes simplex virus. Mol Ther, 2013. 21(3): p. 561-9.

10. Uchida, H., et al., A double mutation in glycoprotein gB compensates for ineffective gD-dependent initiation of herpes simplex virus type 1 infection. J Virol, 2010. 84(23): p. 12200-9.

11. Payne, L.S. y P.H. Huang, The pathobiology o f collagens in glioma. Mol Cancer Res, 2013. 11 (10): p. 1129- 40.

12. Mok, W., Y. Boucher, y R.K. Jain, Matrix metalloproteinases-1 and -8 improve the distribution and efficacy o f an oncolytic virus. Cancer Res, 2007. 67(22): p. 10664-8.

13. Hong, C.S., et al., Ectopic matrix metalloproteinase-9 expression in human brain tumor cells enhances oncolytic HSV vector infection. Gene Ther, 2010. 17(10): p. 1200-5.

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16. Szymczak, A.L. y D.A. Vignali, Development o f 2A peptide-based strategies in the design o f multicistronic vectors. Expert Opin Biol Ther, 2005. 5(5): p. 627-38.

17. Miao, H., et al., EphA2 promotes infiltrative invasion o f glioma stem cells in vivo through cross-talk with Akt and regulates stem cellproperties. Oncogene, 2014.

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22. Yun, C.O., Overcoming the extracellular matrix barrier to improve intratumoral spread and therapeutic potential of oncolytic virotherapy. Curr Opin Mol Ther, 2008. 10(4): p. 356-61.

23. Dmitrieva, N., et al., Chondroitinase ABC I-mediated enhancement of oncolytic virus spread and antitumor efficacy. Clin Cancer Res, 2011. 17(6): p. 1362-72.

24. Tischer, B.K., et al., Two-step red-mediated recombination for versatile high-efficiency markerless ADN manipulation in Escherichia coli. Biotechniques, 2006. 40(2): p. 191-7.

25. Ishida, D., et al., Enhanced cytotoxicity with a novelsystem combining the paclitaxel-2’-ethylcarbonate prodrug and an HSVamplicon with an attenuated replication-competent virus, HF10 as a helper virus. Cancer Lett, 2010. 288(1): p.

17-27.

El uso de los términos "un" "una" y "el/la" y referentes parecidos en el contexto de la descripción de la invención (sobre todo en el contexto de las reivindicaciones que vienen a continuación) debe interpretarse que cubre tanto el singular como el plural, a menos que se indique otra cosa es el presente documento o que se contradiga claramente en el contexto. Los términos "que comprende", "que tiene", "que incluye" y "que contiene" deben interpretarse como términos abiertos (es decir, que significan "que incluye, pero sin limitación") a menos que se indique otra cosa. La recitación de los intervalos de valores en el presente documento está meramente destinada a servir como un método abreviado de referirse individualmente a cada uno de los valores que cae dentro del intervalo, a menos que se indique otra cosa en el presente documento, y cada valor por separado se incorpora en la especificación como si se hubiera recitado individualmente en el presente documento.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un virus del herpes simple (oHSV) oncolítico recombinante, que comprende una o más copias de las secuencias diana para uno o más microARN (miARN) insertadas en uno o más genes de1HSV esenciales para la replicación del HSV, en donde el oHSV comprende una superficie, en donde dicha superficie comprende uno o más ligandos que no son de HSV y en donde el oHSV comprende una deleción de la región de repetición interna (unión) en el genoma del HSV que comprende una copia de los genes de ICP0, ICP34.5, LAT e ICP4 y el promotor de ICP47.

2. El oHSV de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el gen del HSV esencial para la replicación de1HSV es ICP4.

3. El oHSV de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que comprende una deleción de la región de repetición interna (unión) que comprende una copia de cada uno de ICP0, ICP34.5, LAT e ICP4 junto con el promotor para el gen de ICP47.

4. El oHSV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dos o más (2, 3, 4, 5 o 6 en tándem) copias de la secuencia diana del miARN están insertadas en las secuencias codificantes o no codificantes de uno o más genes del HSV esenciales o no esenciales para la replicación de1HSV.

5. El oHSV de acuerdo con la reivindicación 4, en donde las copias de la secuencia diana del miRNA están separadas entre sí por espaciadores de cuatro o más u ocho o más nucleótidos.

6. El oSHV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde las secuencias diana para uno o más miARN están insertadas en la UTR en 3' de uno o más genes del HSV esenciales o no esenciales para la replicación del HSV.

7. El oHSV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el miARN se selecciona de miR-124, miR-122, miR-199, miR-128 o miR-137 o una combinación de dos o más de los mismos.

8. El oHSV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el miARN es uno o más miARN expresados en mayor cantidad en las células neuronales y en las células no cancerosas que en las células del glioma.

9. El oHSV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la secuencia diana para un miARN es el complemento inverso de dicho miARN.

10. El oHSV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el oHSV comprende cuatro copias en tándem del complemento inverso de miR-124, miR-122, miR-199, miR-128 y/o miR-137 separadas por espaciadores de ocho nucleótidos insertados en la UTR en 3' de ICP4, ICP0, ICP34.5, La T o ICP47.

11. Un ácido nucleico que codifica el oHSV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que es preferiblemente un cromosoma artificial bacteriano.

12. Una reserva concentrada de virus que comprende el oHSV de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

13. Una composición farmacéutica que comprende el oHSV de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

14. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 13, en donde el vector está presente en la composición en una cantidad eficaz para destruir las células tumorales en un sujeto humano al cual hay que administrar la composición farmacéutica.

15. El oHSV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o la composición farmacéutica de la reivindicación 13 o 14 para ser usado para el tratamiento de un paciente humano que tiene cáncer.