WO2011125469A1 - マイクロrna制御組換えワクシニアウイルス及びその使用 - Google Patents

マイクロrna制御組換えワクシニアウイルス及びその使用 Download PDF

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WO2011125469A1
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microrna
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中村貴史
引地美奈
田原秀晃
志田壽利
木所稔
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国立大学法人東京大学
国立大学法人北海道大学
国立感染症研究所長が代表する日本国
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    • C12N2840/10—Vectors comprising a special translation-regulating system regulates levels of translation
    • C12N2840/102—Vectors comprising a special translation-regulating system regulates levels of translation inhibiting translation

Definitions

  • the present invention relates to a novel vaccinia virus and a virus vector using the same. Specifically, it is a microRNA-controlled virus in which a microRNA target sequence whose expression is reduced in cancer cells compared to normal cells is inserted into the 3 ′ untranslated region of a gene involved in virus growth,
  • the present invention relates to a vaccinia virus and a vaccinia virus vector that destroys cancer cells by expressing a gene involved in virus growth and propagating the virus only in cancer cells in synchronization with regulation of gene expression by an RNA control mechanism.
  • vaccinia viruses as viruses used for such treatment.
  • the LC16m8 strain a pressure ulcer vaccine strain developed in Japan, is a strain that has been attenuated by loss of function due to a frameshift mutation in the B5R gene involved in viral spread and pathogenicity in the host body. .
  • the vaccine strain has been used in Japan in the past as a pressure ulcer vaccine to about 100,000 infants.
  • Non-Patent Document 1 LC16m8 ⁇ is an improved vaccine whose genetic stability is further improved by completely deleting the B5R gene of this LC16m8 strain (see Patent Document 1).
  • vaccinia virus has been used as a multivalent vaccine for infectious diseases (HIV and SARS) as an expression vector into which a foreign gene has been introduced because of its wide host range and high expression efficiency.
  • microRNA microRNA
  • cancer microRNA
  • An object of the present invention is to provide a vaccinia virus that specifically propagates in cancer cells and destroys the cancer cells, and to use the virus for cancer treatment.
  • a vaccinia virus that specifically propagates in cancer cells and destroys the cancer cells, and to use the virus for cancer treatment.
  • preclinical research and clinical trials regarding cancer virus therapy for treating cancer using live viruses are being actively carried out around the world.
  • the most important point in this virus therapy is how to eliminate the pathogenicity to normal tissues that the virus originally has.
  • the present inventors Based on the LC16m8 ⁇ vaccine strain, which has been established with high safety, the present inventors have developed a recombinant vaccinia virus that proliferates and destroys cancer cells in a specific manner by genetic recombination technology while maintaining this high safety. Created and established cancer-specific viral therapy that attacks only cancer tissue.
  • the B5R gene involved in the growth and pathogenicity of vaccinia virus and the 3 'untranslated region of the LC5m8 ⁇ were inserted into the 3' untranslated region of the target sequence of the microRNA whose expression in cancer cells was lower than that of normal cells.
  • the expression of the B5R gene of vaccinia virus was suppressed by the control of microRNA, and vaccinia virus could not grow and did not damage normal cells, but the expression of microRNA was low
  • B5R gene expression was not suppressed in cancer cells, and vaccinia virus efficiently propagated, so that only cancer cells were specifically damaged.
  • the present inventors have completed a method for treating cancer using a recombinant vaccinia virus whose growth is controlled by microRNA. That is, the present invention is as follows. [1] A vaccinia virus in which a target sequence of microRNA whose expression is reduced in cancer cells compared to normal cells is inserted into the 3 ′ untranslated region of the B5R gene involved in virus growth, A microRNA-regulated vaccinia virus that has oncolytic properties that specifically grows and specifically destroys cancer cells. [2] The microRNA-controlled vaccinia virus according to [1], wherein the expression of the B5R gene is suppressed by the microRNA expressed in normal cells, and the proliferation in normal cells is reduced.
  • MicroRNAs whose expression is decreased in cancer cells compared to normal cells are let-7a (SEQ ID NO: 1), let-7b (SEQ ID NO: 2), let-7c (SEQ ID NO: 3), let- 7d (SEQ ID NO: 4), let-7e (SEQ ID NO: 5), let-7f (SEQ ID NO: 6), miR-9 (SEQ ID NO: 7), miR-15a (SEQ ID NO: 8), miR-16-1 (sequence) No.
  • miR-21 SEQ ID NO: 10
  • miR-20a SEQ ID NO: 11
  • miR-26a SEQ ID NO: 12
  • miR-27b SEQ ID NO: 13
  • miR-29a SEQ ID NO: 14
  • miR -29b SEQ ID NO: 15
  • miR-29c SEQ ID NO: 16
  • miR-30a SEQ ID NO: 17
  • miR-30d SEQ ID NO: 18
  • miR-32 SEQ ID NO: 19
  • miR-33a SEQ ID NO: 20
  • MiR-34a SEQ ID NO: 21
  • miR-92a SEQ ID NO: 22
  • miR-95 SEQ ID NO: 23
  • miR-101 SEQ ID NO: 24
  • miR-122 SEQ ID NO: 25
  • miR-124 SEQ ID NO: 26
  • miR-125a SEQ ID NO: 27
  • miR-125b SEQ ID NO: 28
  • miR-126 SEQ ID NO: 29
  • MicroRNA-controlled vaccinia virus Any one of [1] to [6], in which one or more genes that are deficient in functional cells can be compensated for in cancer cells but are not compensated for in functional cells.
  • MicroRNA-controlled vaccinia virus [8] The microRNA-controlled vaccinia virus according to [7], wherein at least the thymidine kinase gene is deleted. [9] The microRNA-controlled vaccinia virus according to [8], wherein the hemagglutinin (HA) gene is further deleted. [10] The microRNA-controlled vaccinia virus according to [9], further lacking an F fragment. [11] The microRNA-controlled vaccinia virus according to [8], further lacking the VGF gene.
  • a pharmaceutical composition for treating cancer comprising the microRNA-controlled vaccinia virus of any one of [1] to [11].
  • a pharmaceutical composition for treating cancer comprising the microRNA-controlled vaccinia virus vector of [13] or [14] or for use as a vaccine against cancer, virus, bacteria or protozoa.
  • microRNA-controlled vaccinia virus has a fusion gene of a B5R gene and a marker gene, and the cancer therapeutic effect is evaluated by expression of the marker.
  • the growth of the microRNA-controlled vaccinia virus of the present invention is controlled depending on the expression level of a specific microRNA. In the cells in which the expression of the specific microRNA is increased, the expression of the B5R gene is suppressed, so that the cell cannot proliferate, while in the cells in which the expression of the microRNA is decreased, the expression of the B5R gene is induced, The virus grows and damages its cells.
  • vaccinia virus is efficiently propagated in the cancer cells and exerts a strong antitumor effect. Therefore, by examining microRNA expression in individual cancer patient specimens in advance and analyzing microRNA in cancer tissue, it is possible to select an appropriate microRNA, and a microRNA-controlled vaccinia virus that attacks only cancer cells. Can be custom-made drug discovery.
  • the LC16m8 ⁇ vaccine strain which is a vaccinia virus strain that has been established with high safety, as a base, it is possible to proliferate in a cancer cell-specific manner by genetic recombination technology while maintaining this high safety.
  • a microRNA-controlled recombinant virus that destroys can be provided. Furthermore, since vaccinia virus has a wide host range and high expression efficiency, it also functions as a vector for introducing other foreign genes. A microRNA-controlled recombinant vaccinia virus that expresses luciferase or GFP can easily and rapidly identify infected cells. Further, by expressing a therapeutic gene having a cytotoxic effect or an immunostimulatory effect, it can be used in combination with other therapeutic methods.
  • This specification includes the contents described in the specification and / or drawings of Japanese Patent Application No. 2010-090662, which is the basis for the priority of the present application.
  • FIG. 1 is a photograph showing the antitumor effect of attenuated vaccinia virus in a human BxPC-3 pancreatic cancer peritoneal seeding mouse model.
  • FIG. 2 is a graph showing attenuated vaccinia virus pathogenicity in a mouse model of human BxPC-3 pancreatic cancer peritoneal dissemination ( ⁇ : death).
  • 2A shows the result of Mock
  • FIG. 2B shows the result of LC16mO
  • FIG. 2C shows the result of LC16m8 ⁇ .
  • FIG. 3 is a diagram showing the structure of the genome of a recombinant B5R gene insertion virus.
  • FIG. 1 is a photograph showing the antitumor effect of attenuated vaccinia virus in a human BxPC-3 pancreatic cancer peritoneal seeding mouse model.
  • FIG. 2 is a graph showing attenuated vaccinia virus pathogenicity in a mouse model of human BxPC-3 pancreatic cancer peritoneal dissemination
  • FIG. 4 is a diagram showing the cell killing effect of recombinant B5R gene deletion virus and recombinant B5R gene insertion virus in human cancer cells.
  • FIG. 5 is a diagram showing a new strategy for developing cancer-specific viral therapy using the characteristics of cancer microRNA.
  • FIG. 6 is a diagram showing the relative expression level of let7a in human cancer cells.
  • FIG. 7 shows the genomic structure of the recombinant GFP tag B5R let7a control virus.
  • FIG. 8 is a photograph showing B5R expression and cytopathic effect of recombinant GFP-tagged B5R let7a regulatory virus in human cancer cells.
  • FIG. 9 is a diagram showing the growth of recombinant GFP-tagged B5R let7a regulatory virus in human cancer cells.
  • FIG. 9 is a diagram showing the growth of recombinant GFP-tagged B5R let7a regulatory virus in human cancer cells.
  • FIG. 10 shows the genomic structure of a recombinant let7a regulatory virus that expresses two types of foreign genes.
  • FIG. 11 is a figure which shows the cell killing effect of the recombinant let7a control virus in a cancer cell.
  • FIG. 12A is a photograph showing the biodistribution of recombinant let7a control virus in SCID mice.
  • FIG. 12B is a diagram showing the results of quantification of proliferating virus in SCID mice.
  • FIG. 13A is a figure which shows the effect (tumor growth curve) of the cancer virus therapy by the recombinant let7a control virus in a mouse model inoculated subcutaneously with human BxPC-3.
  • FIG. 13B is a graph showing the effect (survival curve) of cancer virus therapy with recombinant let7a control virus in a human BxPC-3 subcutaneously inoculated mouse model.
  • FIG. 14A is a diagram showing the effect (tumor growth curve) of cancer virus therapy using recombinant let7a control virus in a human A549 lung cancer subcutaneously inoculated mouse model.
  • FIG. 14B is a graph showing the effect (survival curve) of cancer virus therapy using recombinant let7a control virus in a human A549 lung cancer subcutaneously inoculated mouse model.
  • FIG. 14A is a diagram showing the effect (tumor growth curve) of cancer virus therapy using recombinant let7a control virus in a human A549 lung cancer subcutaneously inoculated mouse model.
  • FIG. 14B is a graph showing the effect (survival curve) of cancer virus therapy using recombinant let7a control virus in a human A549 lung cancer
  • FIG. 15 is a graph showing the biodistribution and antitumor effect of recombinant let7a control virus in a human BxPC-3 subcutaneously inoculated mouse model.
  • FIG. 16 is a photograph showing the biodistribution of recombinant let7a control virus in C57BL / 6 mice.
  • FIG. 17 is a diagram showing the effect (survival curve) of cancer virus therapy with recombinant let7a control virus in a human BxPC-3 intraperitoneally inoculated mouse model.
  • FIG. 18 shows the genomic structure of a recombinant TK-deficient let7a control virus that expresses two types of foreign genes.
  • FIG. 19 is a graph showing the effect (survival curve) of cancer virus therapy with recombinant TK-deficient let7a control virus in a human BxPC-3 intraperitoneally inoculated mouse model.
  • FIG. 20 is a photograph showing the biodistribution of recombinant TK-deficient let7a control virus in a human BxPC-3 intraperitoneally inoculated mouse model.
  • the strain of vaccinia virus for producing the vaccinia virus of the present invention is not limited, but Lister strain, LC16 strain established from Lister strain, LC16mO strain, LC16m8 strain (Soh Hashizume, Clinical and Virus vol. 3, No. 3,269, 1975), strains such as NYBH strain, Wyeth strain, Copenhagen strain and the like.
  • the LC16mO strain is a strain produced from the Lister strain via the LC16 strain
  • the LC16m8 strain is a strain further produced from the LC16mO strain (Protein Nucleic Acid Enzyme Vol. 48 No. 12 (2003), p. 1693-). 1700).
  • the vaccinia virus used in the present invention is preferably attenuated and non-pathogenic in that safety when administered to humans has been established.
  • attenuated strains include strains in which the B5R gene is partially or completely deleted.
  • the B5R gene encodes a protein present in the envelope of vaccinia virus, and the B5R gene product is involved in virus infection and propagation.
  • the B5R gene product is present on the surface of infected cells and the envelope of the virus, and acts to increase the infection efficiency when the virus infects and spreads to adjacent cells or to other parts of the host body. Also involved in the region.
  • the plaque size is reduced when the animal cell is infected, and the pock size is also reduced.
  • a vaccinia virus in which the B5R gene is partially or completely deleted does not have the normal function of the gene product of the B5R gene, has low skin growth, and does not cause side effects even when administered to humans.
  • the attenuated strain lacking the B5R gene include the m8 ⁇ strain (also referred to as the LC16m8 ⁇ strain) established by completely deleting the B5R gene from the LC16m8 strain described above.
  • an mO ⁇ strain also referred to as an LCmO ⁇ strain established by completely deleting the B5R gene from the LC16mO strain can also be used.
  • Attenuated vaccinia virus strains partially or completely deleted of these B5R genes are described in International Publication No. WO2005 / 054451 and can be obtained based on the description. Whether vaccinia virus is partially or completely deleted of the B5R gene and the function of the B5R protein is deleted, for example, plaque size, pock size, Vero cells formed when RK13 cells are infected Indices can be determined based on the virus growth in, and skin pathogenicity in rabbits. In addition, the gene sequence of vaccinia virus may be examined.
  • the vaccinia virus used in the present invention expresses the B5R gene in cancer cells and causes cancer cell injury by the action of the B5R protein.
  • the vaccinia virus used in the present invention needs to have a complete B5R gene.
  • a complete B5R gene is newly introduced into the vaccinia virus lacking the B5R gene.
  • the B5R gene containing the untranslated region, particularly the 3 ′ untranslated region is inserted into the vaccinia virus genome, and the material for producing the vaccinia virus of the present invention May be used.
  • the B5R gene can be inserted into the vaccinia virus by any method, for example, a known homologous recombination method.
  • the position where the B5R gene is inserted may be between the B4R gene and the B6R gene where the B5R gene originally existed, or may be an arbitrary site in the genome of the vaccinia virus.
  • a B5R gene having a target sequence inserted into the 3 ′ untranslated region may be constructed as a DNA construct in advance and introduced into vaccinia virus.
  • SEQ ID NO: 87 shows the sequence of a portion containing the B4R gene, B5R gene, and B6R gene sequence of the vaccinia virus genome.
  • the 1780th a to 2733th a of SEQ ID NO: 87 represent the orf portion encoding the B5R protein, and a 3 ′ untranslated region exists downstream of this stop codon.
  • Homologous recombination is a phenomenon in which two DNA molecules recombine with each other via the same base sequence in a cell, and is a method often used for recombination of viruses having a large genomic DNA such as vaccinia virus. is there.
  • a replacement occurs between the viral DNA that becomes naked during the viral replication process and the same sequence portion on the transfer vector, and the inserted B5R gene is integrated into the viral genome.
  • Examples of cells used at this time include BSC-1 cells, HTK-143 cells, Hep2 cells, MDCK cells, Vero cells, HeLa cells, CV1 cells, COS cells, RK13 cells, BHK-21 cells, primary rabbit kidney cells and other vaccinia viruses. Can be used.
  • the vector may be introduced into cells by a known method such as a calcium phosphate method, a cationic ribosome method, or an electroporation method.
  • MicroRNA is a low molecular weight RNA consisting of 19 to 23 bases.
  • the miRNA binds to a target site present in the 3 ′ untranslated region of a messenger RNA (mRNA) of a specific gene, and Protein expression is suppressed by inhibiting translation or degrading its mRNA.
  • the target sequence of the target site includes a sequence that is completely or partially complementary to the sequence of the miRNA, the miRNA binds to the target sequence and controls the expression of a specific gene.
  • miRNA whose expression is reduced in cancer cells compared to normal cells is used.
  • the target sequence of miRNA whose expression is reduced in cancer cells compared to normal cells is inserted into the 3 ′ untranslated region of the B5R gene of the vaccinia virus to be used.
  • the miRNA In normal cells, the miRNA binds to the target sequence and suppresses the expression of the B5R gene, so that vaccinia virus does not show pathogenicity in normal cells. On the other hand, since the expression of the miRNA is reduced in cancer cells, the miRNA does not bind to the target sequence, and the expression of the B5R gene is not suppressed. Therefore, in cancer cells, the B5R protein functions normally, and vaccinia virus grows specifically in cancer cells, destroying cancer cells and causing injury. That is, the vaccinia virus of the present invention has oncolytic properties specific to cancer cells.
  • the miRNA whose expression is reduced in cancer cells as compared to normal cells is not limited, and includes all miRNAs that are currently known and that will be found in the future.
  • miRNAs in Cancer Anun. Rev. Pathol. Mech, DIs, 2009.4: 199-227; MiRNAs that are down-regulated in cancer cells described in Croce, NATURE REVIEWS, Volume 10, October 2009, 704-714 and the like can be selected.
  • miRBBase sequence database http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/index.shtml.
  • experimental medicine Vol. 27, no. 8 (May issue) 2009, p. 1188-1193 and p. 1218-1222; Yong Sun Lee and Annyta Dutta, “MicroRNAs in Cancer”, Anun. Rev. Pathol. Mech, DIs, 2009.4: 199-227; MiRNAs that are down-regulated in cancer cells described in Croce, NATURE REVIEWS, Volume 10, October 2009, 704-714 and the like can be selected.
  • Examples of human-derived miRNA whose expression is reduced in cancer cells compared to normal cells include the following, and shows the miRNA name and the sequence of mature miRNA of each miRNA. The sequence below is shown as 5 ′ ⁇ 3 ′.
  • let-7 miR-15a, miR-16, miR-125a in breast cancer, miR-125b, miR-127, miR145, miR-204, etc.
  • let-7 miR-9, miR-26a, miR-27b, miR-29b, miR32, miR-33, miR-30a, miR-95 MiR-101, miR-124, miR-125a, miR-126, miR-140, miR-143, miR-145, miR-198, miR-192, miR-199b, miR-218, miR-219, miR -220, miR-224, miR-203, miR-205, etc.
  • miRNAs whose expression is specifically down-regulated in the specific cancer types described above can also be used.
  • each miRNA is not necessarily down-regulated only in the above-mentioned specific cancer, and to some extent, a certain miRNA is down-regulated in cells of various cancer types. Therefore, any miRNA can be used for the treatment of cancer regardless of the cancer type.
  • let-7a is down-regulated in clinical specimens such as lung cancer, pancreatic cancer, melanoma, etc., and establishment of a novel therapeutic method for refractory malignant tumors exhibiting extremely high resistance to current therapeutic methods It is preferable in that it contributes to
  • miRNA such as miR-15, miR-16, miR-143, miR-145, and the like, whose expression is significantly reduced in cancer cells compared to normal cells, can also be suitably used.
  • a miRNA binds to an mRNA containing a sequence that is partially or completely complementary to the miRNA sequence in the 3 ′ untranslated region, thereby inhibiting the translation of the mRNA or degrading the mRNA, thereby reducing the expression of a specific gene. Suppress. Therefore, in the present invention, the above-described miRNA target sequence is inserted into the 3 ′ untranslated region (3′-UTR) of the B5R gene of vaccinia virus as a miRNA binding site.
  • the insertion position is not limited and may be any site in the 3 ′ terminal region including both ends of the 3 ′ untranslated region. For example, it may be inserted immediately after the stop codon of orf of B5R protein.
  • the 1780th a to the 2733th a are base sequences encoding the orf of the B5R protein, and the target sequence of miRNA may be inserted into the part after the stop codon of orf.
  • the target sequence is a partial sequence of the miRNA sequence or a complementary sequence to the entire sequence, and the base length is 7 to 25 bases, preferably 15 to 25 bases, more preferably 19 to 23 bases.
  • it consists of a completely complementary sequence to each miRNA sequence.
  • the hybridization conditions in this case are in vivo conditions when the vaccinia virus of the present invention is administered in vivo and used as a medicine, and in the case of using the vaccinia virus of the present invention as a reagent in vitro, Stringent conditions or highly stringent conditions, such as 400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6.4, 1 mM EDTA, hybridization at 50 ° C. to 70 ° C. for 12-16 hours Conditions are mentioned.
  • the completely complementary sequence and the target sequence of the miRNA of the present invention are BLAST [J. Mol. Biol. , 215, 403-410 (1990)], FASTA [Methods. Enzymol.
  • a numerical value calculated by using a default (initial setting) parameter of a homology search program known to those skilled in the art is 95% or more, preferably 96, 97, 98 or 99. % Sequence identity. Further, 1 to several, for example, 1 to 3, 1 or 2, or 1 base may be added to one or both ends of the completely complementary sequence. Since miRNA binds to mRNA transcribed from DNA, the target sequence to be inserted into the 3 ′ untranslated region of the B5R gene of vaccinia virus is DNA containing thymine (T) in a reverse complement relationship with the miRNA sequence.
  • T thymine
  • a DNA sequence that is a sequence and has a reverse complement relationship may be inserted into the 3 ′ untranslated region of the B5R gene of vaccinia virus.
  • let-7a which is 5′-UGAGGUAGUAGGUUGUAAUGUUU-3 ′ (SEQ ID NO: 1)
  • 5′-AACTATACAACCACTACTCACTCA-3 ′ SEQ ID NO: 64
  • a target sequence consisting of can be inserted.
  • a person skilled in the art can appropriately set the sequence of the binding site to be inserted into the 3 ′ untranslated region of the B5R gene of vaccinia virus.
  • the target sequence may be at least one in the 3 ′ untranslated region of the B5R gene of vaccinia virus. Further, it may be a repeating sequence of a plurality of target sequences. In the case of a plurality of repeating sequences, the number of repetitions is 2 to 20, preferably 2 to 10, more preferably 2 to 5, and further preferably 2 to 4. Furthermore, not only a target sequence for the same miRNA but also a plurality of target sequences for different miRNAs may be inserted. At this time, a spacer sequence may be inserted between the miRNA sequence and the sequence. The length and base of the spacer sequence are not limited. For example, the base sequence is 3 to 10 bases, preferably 3 to 5 bases long. Can be inserted.
  • the present invention uses miRNAs whose expression is reduced in cancer cells compared to normal cells
  • the degree of downregulation of specific miRNAs may vary from patient to patient.
  • the degree of down-regulation of a specific miRNA may vary depending on the cancer type. By selecting miRNAs that are specifically down-regulated in cancer cells for each patient in advance, or by selecting miRNAs that are specifically down-regulated in specific cancer types, specific for each patient or for each cancer type Effective treatment can be performed.
  • a vaccinia virus containing a miRNA target sequence as a binding site in the 3 ′ untranslated region of the B5R gene of the present invention is called a miRNA-controlled vaccinia virus or a miRNA-controlled proliferating vaccinia virus.
  • the miRNA-controlled vaccinia virus of the present invention can be used for cancer treatment. That is, this invention includes the pharmaceutical composition for cancer treatment containing miRNA control type
  • the target cancer is not limited. For example, when classified according to the organ of development, skin cancer, stomach cancer, lung cancer, liver cancer, colon cancer, pancreatic cancer, anal / rectal cancer, esophageal cancer, uterine cancer, breast cancer, bladder cancer, prostate All cancer types such as cancer, esophageal cancer, ovarian cancer, brain / nerve tumor, lymphoma / leukemia, bone / osteosarcoma, leiomyoma, rhabdomyosarcoma are targeted.
  • the pharmaceutical composition for cancer treatment containing the miRNA-controlled vaccinia virus of the present invention contains a pharmaceutically effective amount of the vaccinia virus vaccine of the present invention as an active ingredient, and is a sterile aqueous or non-aqueous solution or suspension. Or in the form of an emulsion. Furthermore, it may contain pharmaceutically acceptable diluents such as salts, buffers, adjuvants, auxiliaries, carriers and the like. Administration may be by various parenteral routes, for example, subcutaneous route, intravenous route, intradermal route, intramuscular route, intraperitoneal route, intranasal route, transdermal route. The effective dose can be determined as appropriate according to the age, sex, health, weight, etc. of the subject.
  • the miRNA-controlled vaccinia virus of the present invention may contain a foreign gene (foreign DNA or foreign polynucleotide).
  • a foreign gene foreign DNA or foreign polynucleotide
  • examples of the foreign gene include a marker gene, a therapeutic gene encoding a product having cytotoxicity or immunostimulatory effect, and further encodes a protein antigen such as cancer, virus, bacteria, protozoa, etc. DNA to be used.
  • the marker gene is also referred to as a reporter gene, such as a luciferase (LUC) gene, a fluorescent protein gene such as green fluorescent protein (GFP), a fluorescent protein gene such as red fluorescent protein (DsRed), a ⁇ -glucuronidase (GUS) gene, Examples include ramphenicol acetyltransferase (CAT) gene and ⁇ -galactosidase (LacZ) gene.
  • miRNA-controlled vaccinia viruses containing these foreign genes can also be referred to as miRNA-controlled vaccinia virus vectors.
  • the miRNA-controlled vaccinia virus inserted as a fusion gene of the B5R gene and the marker gene can be used for evaluation of miRNA control. That is, a specific miRNA target sequence is inserted to infect a specific cancer cell.
  • the marker gene is expressed together with the B5R gene in the cancer cells. A marker gene product is produced in the cell. It becomes possible to evaluate the effectiveness of the miRNA used by measuring the marker.
  • the present invention includes a system and a method for evaluating miRNA using a miRNA-regulated vaccinia virus containing a marker gene.
  • miRNA suitable for a specific cancer patient is to be selected, cancer cells and normal cells are collected from the patient, and both cells are infected with miRNA-regulated vaccinia viruses each containing various miRNA target sequences.
  • the miRNA may be selected such that vaccinia virus grows in cancer cells and does not grow in normal cells.
  • the therapeutic gene is a gene that can be used for the treatment of specific diseases such as cancer and infectious diseases.
  • Tumor suppressor genes such as p53 and Rb, interleukin 1 (IL-1), IL-2, IL-3, IL -4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, ⁇ -interferon , ⁇ -interferon, ⁇ -interferon, angiostatin, thrombospondin, endostatin, METH-1, METH-2, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, and tumor necrosis factor Genes and the like.
  • vaccinia virus vectors introduced with foreign genes as vaccines against various viruses, bacteria, protozoa and cancer by introducing DNA encoding antigens such as viruses, bacteria, protozoa and cancer as foreign genes (foreign DNA)
  • DNA encoding antigens such as viruses, bacteria, protozoa and cancer as foreign genes (foreign DNA)
  • foreign genes foreign DNA
  • a gene that encodes a protective antigen (neutralizing antigen) such as human immunodeficiency virus, hepatitis virus, herpes virus, mycobacteria, malaria parasite, severe acute respiratory syndrome (SARS) virus, or cancer antigen do it.
  • a protective antigen neutralizing antigen
  • SARS severe acute respiratory syndrome
  • These foreign genes can be introduced, for example, by using a homologous recombination technique. Homologous recombination may be performed by the method described above.
  • a plasmid in which a foreign gene to be introduced is ligated into the DNA sequence of the site to be introduced is prepared, and this is introduced into a cell infected with vaccinia virus.
  • transfer vectors include pSFJ1-10, pSFJ2-16, pMM4, pGS20, pSC11, pMJ601, p2001, pBCB01-3,06, pTKgpt-F1-3s, pTM1, pTM3, pPR34,35, pgpt-ATA18-2, pHES1. -3 etc. can be used.
  • the introduction region of the foreign gene is preferably in a gene that is not essential for the vaccinia virus life cycle.
  • the function deficiency can be compensated for by an enzyme or the like that is abundant in cancer cells, but the function deficiency is not compensated for in normal cells. Or may be inserted into a specific area.
  • the miRNA-controlled vaccinia virus of the present invention can proliferate in cancer cells and destroys cancer cells due to the action of miRNA, but does not proliferate in normal cells and destroys normal cells. And will not cause injury.
  • genes include hemagglutinin (HA) gene; thymidine kinase (TK) gene; F fragment; F3 gene; VGF gene (US Patent Application Publication No.
  • Body region (US Pat. No. 6,596,279); Hind III F, F13L or Hind III M region (US Pat. No. 6,548,068); A33R, A34R or A36R gene (Katz et al , J. Virology 77: 12266-12275 (2003)); SalF7L gene (Moore et al., EMBO J. 1992 11: 1973-1980); N1L gene (Kotwal et al., Virology 1989 171: 579-58).
  • TK gene HA gene, F fragment, and VGF gene are preferable. For example, when the TK gene loses its function, the ability of vaccinia virus to grow in normal cells decreases.
  • cancer cells are rich in enzymes that supplement the function of this gene, the proliferation ability of cancer cells does not decrease. Decreasing proliferation ability in normal cells means that pathogenicity against normal cells is reduced, that is, safety when applied to a living body is improved.
  • Examples of cells to be infected with vaccinia virus include Vero cells, HeLa cells, CV1 cells, COS cells, RK13 cells, BHK-21 cells, primary rabbit kidney cells, BSC-1 cells, HTK-143 cells, Hep2 cells, MDCK cells and the like. Cells that can be infected by vaccinia virus can be used.
  • the function deficiency may be compensated for by the above-mentioned enzymes and the like that are abundant in cancer cells.
  • miRNA-controlled vaccinia virus grows in cancer cells and destroys cancer cells by the action of miRNA, but cannot grow in normal cells, It destroys normal cells and does not cause injury.
  • the loss of the normal function of a gene means that the gene is not expressed or that the expressed protein does not maintain a normal function even if expressed, and is also referred to as the loss of the gene.
  • a foreign gene may be inserted into the gene as described above, or the gene may be partially deleted or completely deleted. .
  • the insertion of a foreign gene and the deletion of a gene can be performed by homologous recombination, for example.
  • genes whose functional deficiency can be compensated for by enzymes etc. abundant in cancer cells but whose functional deficiency is not compensated for in normal cells include the above-mentioned genes.
  • One or more of these genes may be deleted.
  • deletion of the TK gene is preferable because virus growth in normal tissues is suppressed and the therapeutic index of microRNA-controlled growth vaccinia virus is increased.
  • the HA gene and F fragment may be deleted in addition to the TK gene, or the VGF gene may be deleted in addition to the TK gene.
  • an appropriate promoter is linked upstream of the foreign gene in such a way that it can function.
  • the promoter is not limited, but the above-mentioned PSFJ1-10, PSFJ2-16, p7.5K promoter, p11K promoter, T7.10 promoter, CPX promoter, HF promoter, H6 promoter, T7 hybrid promoter, etc. can be used.
  • the method of introducing a foreign gene into the vaccinia virus vector of the present invention can be carried out by a known method for constructing a recombinant vaccinia virus vector. For example, separate experimental medicine The Protocol Series Gene Introduction & Expression Analysis Experiment Method Izumi Saito et al.
  • LC16mO strain of plaque forming unit (pfu) intermediate strain in the process of separating LC16m8 strain from Lister strain, which is characterized by a decrease in central neuropathogenicity
  • LC16m8 ⁇ LC16m8 strain
  • the recombinant virus with improved genetic stability of the C16m8 strain which has been used in humans without any side effects as a vaccine, was administered intraperitoneally to a peritoneally seeded mouse model.
  • the cancer cells in the mouse body were monitored as described above on the 18th and 29th days after the administration of BxPC-3Luc cells (FIG. 1; after treatment).
  • LC16mO-administered mice showed a sudden weight loss due to the development of virus throughout the body, and all mice were on the 21st to 28th days. Died in between.
  • pB5R Amplified and cloned into TA vector pCRII (Invitrogen) to construct pB5R.
  • TA vector pCRII Invitrogen
  • transfer vector plasmid DNA (pB5R) mixed with FuGENE HD (Roche) was added to the cells according to the manual and incorporated, and cultured at 37 ° C. for 2 to 5 days.
  • the cells were freeze-thawed, sonicated, and appropriately inoculated into RK13 cells that were almost confluent, inoculated, Eagle MEM containing 0.8% methylcellulose, 5% FBS medium, and 2-5 at 37 ° C. Cultured for days. The medium was removed, and the large plaque was scraped off at the tip of the chip and suspended in Opti-MEM medium (Invitrogen). This operation was repeated three more times with RK13 cells to purify the plaque. After suspension of plaque collected after plaque purification, 200 ⁇ L of the suspension was centrifuged at 15,000 rpm for 30 minutes, and 50 ⁇ L of sterile distilled water or 10 mM Tris-HCl (PH7.5) was added to the sediment.
  • Opti-MEM medium Invitrogen
  • genomic DNA was extracted by heating at 95 ° C. for 10 minutes and subjected to screening by PCR.
  • PCR was performed with two primers 5′-cgtataatagtgtggtcttat-3 ′ (SEQ ID NO: 67) and 5′-gatgtgtcccatagtagtta-3 ′ (SEQ ID NO: 68), and a clone in which a PCR product of a predetermined size was detected
  • the base sequence was confirmed by direct sequencing. A virus clone having no problem in the base sequence was selected and cultured in large quantities in RK13 cells, and then the virus titer was measured in RK13 cells and subjected to experiments.
  • the LC16mO strain expressing B5R and the recombinant LC16m8 ⁇ -B5R showed equivalent tumor solubility to all cancer cells, and when the number of living cells in the mock control group was 100%, about 60 to 95 % Cells were killed.
  • LC16m8 ⁇ that does not express B5R showed tumor solubility in some cell lines, but only killed 0-50% of cells. From these results, it was shown that the oncolytic property that vaccinia virus is killed while proliferating after infecting tumor cells is dramatically enhanced by the expression of B5R.
  • the former PCR product was cleaved with restriction enzymes HpaI and NheI, and the latter PCR product was cleaved with restriction enzymes NheI and HindII. These two types of DNA fragments were cloned into pB5R cleaved with restriction enzymes HpaI and HindII to construct pTN-B5R.
  • B5R from which the stop codon had been removed was amplified by two primers 5′-caaaattttttcgtgtgcgaaga-3 ′ (SEQ ID NO: 73) and 5′-CACCCATGGTAGCAATTTATGGAACT-3 ′ (SEQ ID NO: 74).
  • NheI restriction enzyme was added with NheI restriction enzyme by using two primers 5′-GCGGCCCGACACCGGCCACCATGGTGAGCAAGGGGCGA-3 ′ (SEQ ID NO: 75) and 5′-gcgctagcTTACTTGTACACCTCGTCCA-3 ′ (SEQ ID NO: 76).
  • the EGFP (green fluorescent protein) gene was amplified.
  • the former PCR product was cleaved with restriction enzymes HpaI and NcoI, and the latter PCR product was cleaved with restriction enzymes NcoI and NheI.
  • RNA including small RNA was collected from human tumor cells by mirVana miRNA Isolation kit (Applied Biosystems) according to the manual. Using 10 ng of each recovered RNA, let7a microRNA (Product ID; 000377) of each tumor cell was quantified by TaqMan method using TaqMan (registered trademark) MicroRNA Assays (Applied Biosystems) according to the manual. For the endogenous control, RNU6B (Product ID; 001093) was used. The relative expression level of let7a microRNA was calculated using the comparative Ct method based on HeLa cells.
  • each infected cell was collected, freeze-thawed, sonicated, and the supernatant after centrifugation (2,000 rpm, 5 minutes) was collected as a virus solution.
  • the virus titer of each virus solution (1 ml) was measured in RK13 cells.
  • LC16m8 ⁇ -B5Rgfp, LC16m8 ⁇ -B5Rgfp let7a and LC16m8 ⁇ -B5Rgfp let7a mut grew equally, which was higher than LC16m8 ⁇ and almost comparable to the growth of LC16mO.
  • a recombinant virus that expresses two foreign genes (firefly luciferase gene and EGFP gene) inserted into the hemagglutinin (HA) gene, pGL4 .20 plasmid (Promega) as a template with two primers 5'-GCGGCCCGACCCGCCCACCATGGGAAGATGCCAAAAA-3 '(SEQ ID NO: 85) and 5'-ATGGCCGGCCCTTACACGGCGGATCTTGCCCGC-3' (SEQ ID NO: 86), Sfi I and FseI restriction at both ends The luciferase gene was amplified.
  • This PCR product was cleaved with restriction enzymes SfiI and FseI and cloned into the same restriction enzyme site of pVNC110 (Suzuki H et al., Vaccine. 2009 11; 27 (7): 966-971) to construct pVNC110-Luc. .
  • An EGFP gene fragment obtained by cutting the restriction enzymes SmaI and NotI from the pEGFP-N1 plasmid was cloned into the same restriction enzyme site of pIRES (Clontech) to construct pIRES-EGFP.
  • each recombinant virus (FIG. 10) was prepared by using RK13 cells with vaccinia virus (LC16mO strain, LC16m8 ⁇ , LC16m8 ⁇ -B5R produced in Reference Example 2, LC16m8 ⁇ - produced in Example 1).
  • B5R let7a or LC16m8 ⁇ -B5R let7a mut )) and transfer cell plasmid DNA pVNC110-Luc / IRES / EGFP is taken into the cell, and plaque purification is performed using plaque size or EGFP expression as a guide. After that, it was confirmed by PCR and direct sequencing. A virus clone having no problem in the base sequence was selected and cultured in large quantities in RK13 cells, and then the virus titer was measured in RK13 cells and subjected to experiments.
  • luciferin was administered 1 day, 4 days, and 10 days later, and luciferase expression in cells infected and propagated with virus was monitored non-invasively (FIG. 16).
  • the growth of LC16m8 ⁇ -B5R let7a / LG was slightly expressed in the abdominal cavity even after 1 day of virus administration, and could not be confirmed after 4 days.
  • the proliferation of LC16mO / LG and LC16m8 ⁇ -B5R let7a mut / LG was confirmed to be strongly expressed in the abdominal cavity one day after the virus administration, and spread to the whole body not only in the abdominal cavity of the administration site after 4 days. In the tail, limbs and oral cavity.
  • LC16mO / LG, LC16m8 ⁇ -B5R let7a / LG, or LC16m8 ⁇ -B5R let7a mut / LG showed a strong anticancer activity in BxPC3 tumor-bearing mice, and 21- A very significant difference in tumor volume after 35 days was confirmed by two-way ANOVA statistical analysis (FIG. 13A).
  • FIG. 13A In the LC16m8 ⁇ group, it was confirmed that there was a very significant difference in the tumor volume after 32 to 35 days compared to the simulated control group, but the tumor volume reached 2500 mm 3 in all mice by 56 days after treatment. He was euthanized.
  • mice treated with LC16mO / LG or LC16m8 ⁇ -B5R let7a mut / LG all mice died or were euthanized by 59 days after treatment due to rapid weight loss with generalized bruising .
  • LC16m8 ⁇ -B5R let7a / LG showed a very significant difference in survival rate compared to other groups by the Log-rank test, and 100% of mice survived 59 days after treatment. Complete tumor disappearance was observed in 4 of the mice (FIG. 13B).
  • virus growth in the mouse body was monitored non-invasively by administering luciferin 27 days and 52 days after treatment in BxPC3 tumor-bearing mice.
  • luciferin 27 days and 52 days after treatment were administered with LC16mO / LG and LC16m8 ⁇ -B5R let7a mut / LG.
  • virus growth was observed in the normal tissues of the whole body after 27 days of treatment, and the virus growth increased with the passage of time after 52 days. Weight loss was confirmed.
  • virus growth after 27 days of treatment was limited to the transplanted tumor mass only, and no virus growth was observed in normal tissues including mice in which the tumor completely disappeared.
  • mice where tumors disappeared after the day the virus growth also disappeared (FIG. 15).
  • BxPC-3 cells (5 ⁇ 10 6 cells) were administered intraperitoneally to SCID mice, and 7 days later, 10 7 pfu of each virus was administered intraperitoneally (10 mice per group).
  • the mice treated with LC16mO / LG or LC16m8 ⁇ -B5R let7a mut / LG the simulated control mice without virus administration died or were euthanized by the tumor, and systemically by 24 to 43 days after treatment. All mice died or were euthanized due to a sudden weight loss with the occurrence of ulcers.
  • LC16m8 ⁇ -B5R let7a / LG was confirmed by the Log-rank test to have a very significant difference in survival rate compared to LC16mO / LG or LC16m8 ⁇ -B5R let7a mut / LG-treated mice. All mice died or euthanized due to similar viral virulence seen in mice treated with LC16mO / LG or LC16m8 ⁇ -B5R let7a mut / LG. (FIG. 17).
  • two types of foreign genes are inserted into the hemagglutinin (HA) gene.
  • TK-deficient let7a control virus LC16m8 ⁇ -B5R let7a / LG TK- was prepared by inserting two foreign genes into the thymidine kinase (TK) gene.
  • TK thymidine kinase
  • the PCR product was cleaved with the restriction enzyme PvuII and cloned into the same restriction enzyme site of the pUC19 vector to construct pTK. Furthermore, two synthetic DNAs (5′-aattgcatgcgtcgacattaatGGCCGGGACCGGCCttcgaag-3 ′ (SEQ ID NO: 90) and 5′-aattcttgagaGGCCGGTCCCGCCCattatatgtcgagcatgc-3 ′ (SEQ ID NO: 91)) were cleaved with restriction enzyme and digested with T. pTK-MSC was constructed.
  • Synthetic vaccinia virus promoter (Hammond et al, Journal of Virological Methods.1997 66:. 135-138) for inserting a 5'-CGGCCgtgcaataaattagaatagtttttcaatttttGGTACCtcgaccttatttatatgccaaaaaaaaaaaaaaaaaagctgatccaatt- 2 one synthetic DNA (5'-TCGAaattggatcagcttttttttttttttttttttggcatataaataaggtcgaGGTACCaaaattgaaaactattctaatttattgcacGGCCGGAC-3 '(SEQ ID NO: 92) 3 ′ (SEQ ID NO: 93)), which is subjected to restriction enzymes SfiI and Sal.
  • pTK-SP-LG a transfer vector plasmid DNA
  • pTK-SP-LG a transfer vector plasmid DNA
  • LC16m8 ⁇ -B5R let7a / LG TK- was confirmed by the Log-rank test to have a very significant difference in the survival rate compared to the mice without the virus administration and the mice with LC16m8 ⁇ -B5R let7a / LG administration. No side effects due to viral toxicity were observed (FIG. 19).
  • the virus growth in the mouse was then monitored non-invasively as described in Example 4 by administering luciferin after 29 days.
  • the miRNA-controlled vaccinia virus of the present invention can be used for cancer treatment.

Abstract

　癌細胞において特異的に増殖し、癌細胞を破壊するワクシニアウイルスの提供及び該ウイルスの癌治療への利用の提供。正常細胞に比べて癌細胞で発現が低下しているマイクロRNAの標的配列を、ウイルス増殖に関るB5R遺伝子の3'非翻訳領域に挿入したワクシニアウイルスであって、前記癌細胞内で特異的に増殖し、癌細胞を破壊する腫瘍溶解性を有するマイクロRNA制御型ワクシニアウイルス。

Description

マイクロＲＮＡ制御組換えワクシニアウイルス及びその使用
　本発明は、新規なワクシニアウイルス及びそれを利用したウイルスベクターに関する。具体的には、正常細胞に比べて癌細胞で発現が低下しているマイクロＲＮＡの標的配列を、ウイルス増殖に関る遺伝子の３’非翻訳領域に挿入したマイクロＲＮＡ制御型ウイルスであり、マイクロＲＮＡ制御機構による遺伝子発現調節と同調して癌細胞においてのみ、ウイルス増殖に関わる遺伝子を発現させウイルスが増殖することによって、癌細胞を破壊するワクシニアウイルス及びワクシニアウイルスベクターに関する。
　近年、ウイルスを癌治療に用いる癌ウイルス治療に関する種々の技術が開発されている。このような治療に用いるウイルスとして、アデノウイルス、レトロウイルスの他、ワクシニアウイルスがある。
　ワクシニアウイルスに関しては、日本国で開発された痘瘡ワクチン株であるＬＣ１６ｍ８株は、宿主体内でのウイルス拡散や病原性に関わるＢ５Ｒ遺伝子がフレームシフト変異によって機能を失うことによって弱毒化された株である。該ワクチン株は日本では過去に痘瘡ワクチンとして約１０万人の乳幼児に接種された実績がある。その際、死亡等の重篤な副作用は一例もなく、一方で従来のワクチンと同等の免疫応答が認められ、その高い有効性と安全性が証明されている（非特許文献１を参照）。このＬＣ１６ｍ８株のＢ５Ｒ遺伝子を完全に欠失させることによって遺伝的安定性をさらに向上させた改良型ワクチンがＬＣ１６ｍ８Δである（特許文献１を参照）。
　近年ワクシニアウイルスは、その広い宿主域と高い発現効率という特性から、外来遺伝子を導入した発現ベクターとして感染症（ＨＩＶやＳＡＲＳ）のための多価ワクチンとしても用いられている。
　一方、近年マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）と癌の関連が注目されており、特定のマイクロＲＮＡが癌細胞でダウンレギュレート又はアップレギュレートされていることが報告されている（非特許文献２及び３等を参照）。
国際公開第ＷＯ２００５／０５４４５１号国際公開パンフレット
橋爪壮、臨床とウイルスｖｏｌ．３，Ｎｏ．３，２６９，１９７５ Ｓｔｅｖｅｎ　Ｍ．Ｊｏｈｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　１２０：６３５−６４７，２００５ Ｃａｒｌｏ　Ｍ．Ｃｒｏｃｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１０：７０４−７１４，２００９
　本発明は、癌細胞において特異的に増殖し、癌細胞を破壊するワクシニアウイルスの提供及び該ウイルスの癌治療への利用を目的とする。
　現在世界中において、生きたウイルスを利用して癌を治療する癌ウイルス療法に関する前臨床研究、及び臨床治験が積極的に行われている。このウイルス療法における最大のキーポイントは、ウイルスが元来持っている正常組織に対する病原性をいかに排除するかという点にある。
　本発明者らは、高い安全性が確立しているＬＣ１６ｍ８Δワクチン株をベースに、遺伝子組換え技術によって、この高い安全性はそのままに、癌細胞特異的に増殖し、破壊する組換えワクシニアウイルスを作出し、癌組織のみを攻撃する癌特異的ウイルス療法を確立した。すなわち、ＬＣ１６ｍ８Δにワクシニアウイルスの増殖や病原性に関与するＢ５Ｒ遺伝子とその３’非翻訳領域中に癌細胞において正常細胞に比べ発現が低下しているマイクロＲＮＡの標的配列を挿入した。その結果、正常細胞ではマイクロＲＮＡの制御によりワクシニアウイルスのＢ５Ｒ遺伝子の発現が抑制され、ワクシニアウイルスは増殖することができず正常細胞を傷害することはなかったが、一方、マイクロＲＮＡの発現が少ない癌細胞ではＢ５Ｒ遺伝子の発現が抑制されず、ワクシニアウイルスが効率よく増殖するために、癌細胞のみを特異的に傷害することを見出した。本発明者らは、このような知見に基づき、マイクロＲＮＡにより増殖が制御される組換えワクシニアウイルスを用いて癌を治療する方法を完成させた。
　すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］　正常細胞に比べて癌細胞で発現が低下しているマイクロＲＮＡの標的配列を、ウイルス増殖に関るＢ５Ｒ遺伝子の３’非翻訳領域に挿入したワクシニアウイルスであって、前記癌細胞内で特異的に増殖し、癌細胞を特異的に破壊する腫瘍溶解性を有するマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルス。
［２］　正常細胞で発現するマイクロＲＮＡによって、Ｂ５Ｒ遺伝子の発現が抑制され、正常細胞での増殖性が低下している、［１］のマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルス。
［３］　Ｂ５Ｒ遺伝子を部分的に又は完全に欠失した弱毒化ワクシニアウイルスに、３’非翻訳領域にマイクロＲＮＡの標的配列を挿入したＢ５Ｒ遺伝子を導入した、［１］又は［２］のマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルス。
［４］　ワクシニアウイルスが、ＬＣ１６株又はＬＣ１６ｍＯ株である、［１］又は［２］のマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルス。
［５］　ワクシニアウイルスが、Ｂ５Ｒ遺伝子を部分的に欠失したＬＣ１６ｍ８株又はＢ５Ｒ遺伝子を完全に欠失したｍ８Δ株である、［３］のマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルス。
［６］　正常細胞に比べて癌細胞で発現が低下しているマイクロＲＮＡが、ｌｅｔ−７ａ（配列番号１）、ｌｅｔ−７ｂ（配列番号２）、ｌｅｔ−７ｃ（配列番号３）、ｌｅｔ−７ｄ（配列番号４）、ｌｅｔ−７ｅ（配列番号５）、ｌｅｔ−７ｆ（配列番号６）、ｍｉＲ−９（配列番号７）、ｍｉＲ−１５ａ（配列番号８）、ｍｉＲ−１６−１（配列番号９）、ｍｉＲ−２１（配列番号１０）、ｍｉＲ−２０ａ（配列番号１１）、ｍｉＲ−２６ａ（配列番号１２）、ｍｉＲ−２７ｂ（配列番号１３）、ｍｉＲ−２９ａ（配列番号１４）、ｍｉＲ−２９ｂ（配列番号１５）、ｍｉＲ−２９ｃ（配列番号１６）、ｍｉＲ−３０ａ（配列番号１７）、ｍｉＲ−３０ｄ（配列番号１８）、ｍｉＲ−３２（配列番号１９）、ｍｉＲ−３３ａ（配列番号２０）、ｍｉＲ−３４ａ（配列番号２１）、ｍｉＲ−９２ａ（配列番号２２）、ｍｉＲ−９５（配列番号２３）、ｍｉＲ−１０１（配列番号２４）、ｍｉＲ−１２２（配列番号２５）、ｍｉＲ−１２４（配列番号２６）、ｍｉＲ−１２５ａ（配列番号２７）、ｍｉＲ−１２５ｂ（配列番号２８）、ｍｉＲ−１２６（配列番号２９）、ｍｉＲ−１２７（配列番号３０）、ｍｉＲ−１２８（配列番号３１）、ｍｉＲ−１３３ｂ（配列番号３２）、ｍｉＲ−１３９−５ｐ（配列番号３３）、ｍｉＲ−１４０（配列番号３４）、ｍｉＲ−１４１（配列番号３５）、ｍｉＲ−１４２（配列番号３６）、ｍｉＲ−１４３（配列番号３７）、ｍｉＲ−１４４（配列番号３８）、ｍｉＲ−１４５（配列番号３９）、ｍｉＲ−１５５（配列番号４０）、ｍｉＲ−１８１ａ（配列番号４１）、ｍｉＲ−１８１ｂ（配列番号４２）、ｍｉＲ−１８１ｃ（配列番号４３）、ｍｉＲ−１９２（配列番号４４）、ｍｉＲ−１９５（配列番号４５）、ｍｉＲ−１９８（配列番号４６）、ｍｉＲ−１９９ａ（配列番号４７）、ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ（配列番号４８）、ｍｉＲ−２００ａ（配列番号４９）、ｍｉＲ−２０３（配列番号５０）、ｍｉＲ−２０４（配列番号５１）、ｍｉＲ−２０５（配列番号５２）、ｍｉＲ−２１７（配列番号５３）、ｍｉＲ−２１８（配列番号５４）、ｍｉＲ−２１９−５ｐ（配列番号５５）、ｍｉＲ−２２０ａ（配列番号５６）、ｍｉＲ−２２０ｂ（配列番号５７）、ｍｉＲ−２２０ｃ（配列番号５８）、ｍｉＲ−２２２（配列番号５９）、ｍｉＲ−２２３（配列番号６０）、ｍｉＲ−２２４（配列番号６１）、ｍｉＲ−３４５（配列番号６２）、及びｍｉＲ−３７５（配列番号６３）からなる群から選択される、［１］~［５］のいずれかのマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルス。
［７］　癌細胞において欠損した場合にはその機能欠損が補償され得るが、正常細胞では機能欠損が補償されない遺伝子の１つ又は複数を欠損させた、［１］~［６］のいずれかのマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルス。
［８］　少なくともチミジンキナーゼ遺伝子を欠損させた、［７］のマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルス。
［９］　さらに、赤血球凝集素（ＨＡ）遺伝子を削除させた、［８］のマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルス。
［１０］　さらに、Ｆフラグメントを欠損させた、［９］のマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルス。
［１１］　さらに、ＶＧＦ遺伝子を欠損させた、［８］のマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルス。
［１２］　［１］~［１１］のいずれかのマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスを含む癌治療のための医薬組成物。
［１３］　［１］~［１２］のいずれかのマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスに外来ＤＮＡを導入した、マイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスベクター。
［１４］　外来ＤＮＡがマーカーＤＮＡ、細胞毒性効果若しくは免疫賦活効果を有する治療用遺伝子、又は癌、ウイルス、細菌若しくは原虫の抗原をコードするＤＮＡである、［１３］のマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスベクター。
［１５］　［１３］又は［１４］のマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスベクターを含む癌治療のための、又は癌、ウイルス、細菌若しくは原虫に対するワクチンとして使用するための医薬組成物。
［１６］　［１］~［１１］のいずれかのマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスの癌患者における癌治療効果を評価する方法であって、
（ｉ）　前記癌患者より採取した癌細胞及び正常細胞に前記マイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスを接触させる工程、及び
（ｉｉ）　癌細胞及び正常細胞におけるマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスの増殖を測定する工程
を含み、前記マイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスが癌細胞で増殖し、正常細胞で増殖しない場合に、癌治療効果があると判断する方法。
［１７］　マイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスがＢ５Ｒ遺伝子とマーカー遺伝子の融合遺伝子を有し、マーカーの発現により、癌治療効果を評価する、［１６］の方法。
　本発明のマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスは、特定のマイクロＲＮＡの発現程度により、増殖が制御される。該特定のマイクロＲＮＡの発現が増大している細胞中ではＢ５Ｒ遺伝子の発現が抑制されるため増殖できず、一方、マイクロＲＮＡの発現が低下している細胞中ではＢ５Ｒ遺伝子の発現が誘導され、ウイルスが増殖しその細胞を傷害する。従って、特定のマイクロＲＮＡとして癌細胞で正常細胞に比べて発現が低下しているものを選択することにより、癌細胞中でワクシニアウイルスが効率良く増殖し、強力な抗腫瘍効果を発揮する。従って、あらかじめ個々の癌患者検体におけるマイクロＲＮＡ発現を調べ、癌組織におけるマイクロＲＮＡを解析することにより、適切なマイクロＲＮＡを選択することができ、癌細胞のみを攻撃するマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスを選択できるオーダーメイド創薬となり得る。
　また、本発明においては高い安全性が確立しているワクシニアウイルス株であるＬＣ１６ｍ８Δワクチン株等をベースにすることにより、遺伝子組換え技術によって、この高い安全性はそのままに、癌細胞特異的に増殖破壊するマイクロＲＮＡ制御組換えウイルスを提供することができる。
　さらに、ワクシニアウイルスは、広い宿主域と高い発現効率を有しているため、他の外来遺伝子を導入するベクターとしても機能する。ルシフェラーゼやＧＦＰを発現するマイクロＲＮＡ制御組換えワクシニアウイルスは、その感染細胞を簡便、迅速に同定することが可能となる。また、細胞毒性効果や免疫賦活効果を有する治療遺伝子を発現させることによって、他の治療法との併用も可能となる。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０１０−０９０６６２号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
　図１は、ヒトＢｘＰＣ−３膵癌腹膜播種マウスモデルにおける弱毒化ワクシニアウイルスの抗腫瘍効果を示す写真である。
　図２は、ヒトＢｘＰＣ−３膵癌腹膜播種マウスモデルにおける弱毒化ワクシニアウイルス病原性を示す図である（†：死亡）。図２ＡはＭｏｃｋの結果、図２ＢはＬＣ１６ｍＯの結果、図２ＣはＬＣ１６ｍ８Δの結果を示す。
　図３は、組換えＢ５Ｒ遺伝子挿入ウイルスのゲノムの構造を示す図である。
　図４は、ヒト癌細胞における組換えＢ５Ｒ遺伝子欠失ウイルスと組換えＢ５Ｒ遺伝子挿入ウイルスの殺細胞効果を示す図である。
　図５は、癌マイクロＲＮＡの特性を利用した癌特異的ウイルス療法開発の新戦略を示す図である。
　図６は、ヒト癌細胞におけるｌｅｔ７ａの相対的発現レベルを示す図である。
　図７は、組換えＧＦＰタグＢ５Ｒ　ｌｅｔ７ａ制御ウイルスのゲノム構造を示す図である。
　図８は、ヒト癌細胞における組換えＧＦＰタグＢ５Ｒ　ｌｅｔ７ａ制御ウイルスのＢ５Ｒ発現と細胞変性効果を示す写真である。
　図９は、ヒト癌細胞における組換えＧＦＰタグＢ５Ｒ　ｌｅｔ７ａ制御ウイルスの増殖性を示す図である。
　図１０は、２種類の外来遺伝子を発現する組換えｌｅｔ７ａ制御ウイルのゲノム構造を示す図である。
　図１１は、癌細胞における組換えｌｅｔ７ａ制御ウイルスの殺細胞効果を示す図である。
　図１２Ａは、ＳＣＩＤマウスにおける組換えｌｅｔ７ａ制御ウイルスの体内分布を示す写真である。
　図１２Ｂは、ＳＣＩＤマウスにおける増殖ウイルスの数値化の結果を示す図である。
　図１３Ａは、ヒトＢｘＰＣ−３皮下接種マウスモデルにおける組換えｌｅｔ７ａ制御ウイルスによる癌ウイルス療法の効果（腫瘍増殖曲線）を示す図である。
　図１３Ｂは、ヒトＢｘＰＣ−３皮下接種マウスモデルにおける組換えｌｅｔ７ａ制御ウイルスによる癌ウイルス療法の効果（生存曲線）を示す図である。
　図１４Ａは、ヒトＡ５４９肺癌皮下接種マウスモデルにおける組換えｌｅｔ７ａ制御ウイルスによる癌ウイルス療法の効果（腫瘍増殖曲線）を示す図である。
　図１４Ｂは、ヒトＡ５４９肺癌皮下接種マウスモデルにおける組換えｌｅｔ７ａ制御ウイルスによる癌ウイルス療法の効果（生存曲線）を示す図である。
　図１５は、ヒトＢｘＰＣ−３皮下接種マウスモデルにおける組換えｌｅｔ７ａ制御ウイルスの体内分布及び抗腫瘍効果を示す図である。
　図１６は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける組換えｌｅｔ７ａ制御ウイルスの体内分布を示す写真である。
　図１７は、ヒトＢｘＰＣ−３腹腔内接種マウスモデルにおける組換えｌｅｔ７ａ制御ウイルスによる癌ウイルス療法の効果（生存曲線）を示す図である。
　図１８は、２種類の外来遺伝子を発現する組換えＴＫ欠失ｌｅｔ７ａ制御ウイルスのゲノム構造を示す図である。
　図１９は、ヒトＢｘＰＣ−３腹腔内接種マウスモデルにおける組換えＴＫ欠失ｌｅｔ７ａ制御ウイルスによる癌ウイルス療法の効果（生存曲線）を示す図である。
　図２０は、ヒトＢｘＰＣ−３腹腔内接種マウスモデルにおける組換えＴＫ欠失ｌｅｔ７ａ制御ウイルスの体内分布を示す写真である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明のワクシニアウイルスを製造するためのワクシニアウイルスの株は限定されないが、リスター（Ｌｉｓｔｅｒ）株、リスター株から確立されたＬＣ１６株、ＬＣ１６ｍＯ株、ＬＣ１６ｍ８株（橋爪　壮、臨床とウイルスｖｏｌ．３，Ｎｏ．３，２６９，１９７５等）、ＮＹＢＨ株等の株、Ｗｙｅｔｈ株、コペンハーゲン株等が挙げられる。ＬＣ１６ｍＯ株は、Ｌｉｓｔｅｒ株からＬＣ１６株を経て作出された株であり、ＬＣ１６ｍ８株は、さらにＬＣ１６ｍＯ株から作出された株である（蛋白質　核酸　酵素　Ｖｏｌ．４８　Ｎｏ．１２（２００３），ｐ．１６９３−１７００）。
　ヒトに投与する場合の安全性が確立されているという点で、本発明において用いるワクシニアウイルスは弱毒化され、病原性を有していないものが好ましい。このような弱毒化された株として、Ｂ５Ｒ遺伝子を部分的に又は完全に欠失した株が挙げられる。Ｂ５Ｒ遺伝子は、ワクシニアウイルスのエンベロープに存在するタンパク質をコードしており、Ｂ５Ｒ遺伝子産物は、ウイルスの感染・増殖に関与している。Ｂ５Ｒ遺伝子産物は感染細胞表面及びウイルスのエンベロープに存在し、隣接の細胞、あるいは宿主体内の他の部位にウイルスが感染・伝播するときに、感染効率を高める働きをし、ウイルスのプラークサイズ及び宿主域にも関与している。Ｂ５Ｒ遺伝子を欠失させると、動物細胞に感染させた場合のプラークサイズが小さくなり、ポックサイズも小さくなる。また、皮膚増殖能が低下し、皮膚病原性が低下する。Ｂ５Ｒ遺伝子が部分的に又は完全に欠失したワクシニアウイルスは、Ｂ５Ｒ遺伝子の遺伝子産物がその正常機能を有さず、皮膚増殖性も小さく、ヒトに投与した場合でも副作用を起こさない。Ｂ５Ｒ遺伝子を欠失している弱毒化株として、例えば上記のＬＣ１６ｍ８株からＢ５Ｒ遺伝子を完全に欠失させて確立されたｍ８Δ株（ＬＣ１６ｍ８Δ株とも呼ぶ）、が挙げられる。また、ＬＣ１６ｍＯ株からＢ５Ｒ遺伝子を完全に欠失して確立されたｍＯΔ株（ＬＣｍＯΔ株とも呼ぶ）を用いることもできる。これらのＢ５Ｒ遺伝子を部分的に又は完全に欠失した弱毒されたワクシニアウイルス株は国際公開第ＷＯ２００５／０５４４５１号国際公開パンフレットに記載されており、その記載に基づいて入手することができる。ワクシニアウイルスがＢ５Ｒ遺伝子を部分的に又は完全に欠失し、Ｂ５Ｒタンパク質の機能が欠失しているかどうかは、例えば、ＲＫ１３細胞に感染させたときに形成されるプラークサイズ、ポックサイズ、Ｖｅｒｏ細胞でのウイルス増殖性、ウサギにおける皮膚病原性等を指標に判断することができる。また、ワクシニアウイルスの遺伝子配列を調べてもよい。
　本発明において用いるワクシニアウイルスは、Ｂ５Ｒ遺伝子を癌細胞中で発現させ、Ｂ５Ｒタンパク質の作用により、癌細胞の傷害をもたらす。従って、本発明において用いるワクシニアウイルスは完全なＢ５Ｒ遺伝子を保持している必要性がある。上記のようにＢ５Ｒ遺伝子を有しておらず、弱毒化され安全性が確立されているワクシニアウイルスを用いる場合、該Ｂ５Ｒ遺伝子を欠失したワクシニアウイルスにあらためて完全なＢ５Ｒ遺伝子を導入する。Ｂ５Ｒ遺伝子を部分的に又は完全に欠失したワクシニアウイルスを用いる場合、該ワクシニアウイルスゲノムに、非翻訳領域特に３’非翻訳領域を含むＢ５Ｒ遺伝子を挿入して、本発明のワクシニアウイルス製造の材料として用いればよい。Ｂ５Ｒ遺伝子のワクシニアウイルスへの挿入は如何なる方法で行ってもよいが、例えば公知の相同組換え法により行うことができる。また、この場合のＢ５Ｒ遺伝子を挿入する位置は、もともとＢ５Ｒ遺伝子が存在していたＢ４Ｒ遺伝子とＢ６Ｒ遺伝子の間でもよいし、ワクシニアウイルスのゲノムの任意の部位であってもよい。さらに、あらかじめ、３’非翻訳領域に標的配列を挿入したＢ５Ｒ遺伝子をＤＮＡコンストラクトとして構築し、それをワクシニアウイルスに導入してもよい。配列番号８７にワクシニアウイルスゲノムのＢ４Ｒ遺伝子、Ｂ５Ｒ遺伝子及びＢ６Ｒ遺伝子配列を含む部分の配列を示す。配列番号８７の１７８０番目のａから２７３３番目のａがＢ５Ｒタンパク質をコードするｏｒｆ部分を示し、この停止コドンの下流に３’非翻訳領域が存在する。
　相同組換えとは、細胞内で２つのＤＮＡ分子が同じ塩基配列を介して相互に組換えを起こす現象で、ワクシニアウイルスのような巨大なゲノムＤＮＡを持つウイルスの組換えにしばしば用いられる方法である。まず、標的とするワクシニアウイルス遺伝子部位の配列を中央で分断する形で、Ｂ５Ｒ遺伝子を連結したプラスミド（これをトランスファーベクターという）を構築し、これを、ワクシニアウイルスを感染させた細胞に導入してやると、ウイルス複製の過程で裸になったウイルスＤＮＡとトランスファーベクター上の同じ配列部分との間で入れ換えが起こり、挟み込まれたＢ５Ｒ遺伝子がウイルスゲノム中に組み込まれる。このとき用いる細胞としては、ＢＳＣ−１細胞、ＨＴＫ−１４３細胞、Ｈｅｐ２細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＶ１細胞、ＣＯＳ細胞、ＲＫ１３細胞、ＢＨＫ−２１細胞、初代ウサギ腎臓細胞等ワクシニアウイルスが感染し得る細胞を用い得る。また、ベクターの細胞への導入は、リン酸カルシウム法、カチオニックリボゾーム法、エレクトロポレーション法等の公知の方法で行えばよい。
　マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、１９~２３塩基からなる低分子ＲＮＡであり、多くの場合、特定の遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の３’非翻訳領域に存在する標的部位に結合し、そのｍＲＮＡの翻訳を阻害するか、又はそのｍＲＮＡを分解することによりタンパク質の発現を抑制する。この際、標的部位の標的配列は、ｍｉＲＮＡの配列と完全に又は部分的に相補的な配列を含んでいるので、ｍｉＲＮＡが標的配列に結合し、特定の遺伝子の発現を制御する。
　本発明においては、正常細胞に比べて癌細胞で発現が低下しているｍｉＲＮＡを利用する。用いるワクシニアウイルスのＢ５Ｒ遺伝子の３’非翻訳領域に正常細胞に比べて癌細胞で発現が低下しているｍｉＲＮＡの標的配列を挿入する。正常細胞では前記ｍｉＲＮＡが標的配列に結合し、Ｂ５Ｒ遺伝子の発現が抑制されるので、ワクシニアウイルスは正常細胞には病原性を示さない。一方、癌細胞においては前記ｍｉＲＮＡの発現が低下しているので、標的配列にｍｉＲＮＡが結合せず、Ｂ５Ｒ遺伝子の発現は抑制されず、産生される。このため、癌細胞においては、Ｂ５Ｒタンパク質が正常に機能し、ワクシニアウイルスが癌細胞特異的に増殖し、癌細胞を破壊し傷害をもたらす。すなわち、本発明のワクシニアウイルスは癌細胞特異的な腫瘍溶解性を有する。
　正常細胞に比べて癌細胞で発現が低下しているｍｉＲＮＡは限定されず、現在知られているｍｉＲＮＡも今後見いだされるであろうｍｉＲＮＡもすべて包含する。ｍｉＲＮＡの配列や由来は、ｍｉＲＮＡに関するデータベース、例えばｍｉＲＢａｓｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌ）を検索して確認することができる。また、実験医学、Ｖｏｌ．２７，Ｎｏ．８（５月号）２００９，ｐ．１１８８−１１９３及びｐ．１２１８−１２２２；Ｙｏｎｇ　Ｓｕｎ　Ｌｅｅ　ａｎｄ　Ａｎｉｎｄｙａ　Ｄｕｔｔａ，″ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ　ｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ″，Ａｎｕｎ．Ｒｅｖ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｍｅｃｈ，ＤＩｓ，２００９．４：１９９−２２７；Ｃａｒｌｏ　Ｍ．Ｃｒｏｃｅ，ＮＡＴＵＲＥ　ＲＥＶＩＥＷＳ，Ｖｏｌｕｍｅ　１０，Ｏｃｔｏｂｅｒ　２００９，７０４−７１４等に記載の癌細胞でダウンレギュレートされているｍｉＲＮＡを選択することができる。
　正常細胞に比べて癌細胞で発現が低下しているヒト由来のｍｉＲＮＡの例として、以下のものが挙げられ、ｍｉＲＮＡ名及び各ｍｉＲＮＡの成熟ｍｉＲＮＡの配列を示す。下記の配列は５’→３’で示してある。
ｌｅｔ−７ａ
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
ｌｅｔ−７ｂ
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
ｌｅｔ−７ｃ
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
ｌｅｔ−７ｄ
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
ｌｅｔ−７ｅ
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
ｌｅｔ−７ｆ
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
ｍｉＲ−９
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
ｍｉＲ−１５ａ
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008
ｍｉＲ−１６−１
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000009
ｍｉＲ−２１
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000010
ｍｉＲ−２０ａ
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000011
ｍｉＲ−２６ａ
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000012
ｍｉＲ−２７ｂ
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000013
ｍｉＲ−２９ａ
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000014
ｍｉＲ−２９ｂ
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000015
ｍｉＲ−２９ｃ
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000016
ｍｉＲ−３０ａ
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000017
ｍｉＲ−３０ｄ
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000018
ｍｉＲ−３２
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000019
ｍｉＲ−３３ａ
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000020
ｍｉＲ−３４ａ
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000021
ｍｉＲ−９２ａ
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000022
ｍｉＲ−９５
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000023
ｍｉＲ−１０１
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000024
ｍｉＲ−１２２
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000025
ｍｉＲ−１２４
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000026
ｍｉＲ−１２５ａ
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000027
ｍｉＲ−１２５ｂ
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000028
ｍｉＲ−１２６
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000029
ｍｉＲ−１２７
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000030
ｍｉＲ−１２８
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000031
ｍｉＲ−１３３ｂ
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000032
ｍｉＲ−１３９−５ｐ
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000033
ｍｉＲ−１４０
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000034
ｍｉＲ−１４１
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000035
ｍｉＲ−１４２
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000036
ｍｉＲ−１４３
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000037
ｍｉＲ−１４４
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000038
ｍｉＲ−１４５
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000039
ｍｉＲ−１５５
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000040
ｍｉＲ−１８１ａ
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000041
ｍｉＲ−１８１ｂ
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000042
ｍｉＲ−１８１ｃ
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000043
ｍｉＲ−１９２
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000044
ｍｉＲ−１９５
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000045
ｍｉＲ−１９８
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000046
ｍｉＲ−１９９ａ
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000047
ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000048
ｍｉＲ−２００ａ
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000049
ｍｉＲ−２０３
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000050
ｍｉＲ−２０４
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000051
ｍｉＲ−２０５
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000052
ｍｉＲ−２１７
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000053
ｍｉＲ−２１８
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000054
ｍｉＲ−２１９−５ｐ
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000055
ｍｉＲ−２２０ａ
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000056
ｍｉＲ−２２０ｂ
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000057
ｍｉＲ−２２０ｃ
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000058
ｍｉＲ−２２２
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000059
ｍｉＲ−２２３
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000060
ｍｉＲ−２２４
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000061
ｍｉＲ−３４５
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000062
ｍｉＲ−３７５
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000063
　また、癌の種類により、発現が低下しているｍｉＲＮＡに違いがあり、例えば、脳腫瘍ではｍｉＲ−１２８，ｍｉＲ−１８１等、乳癌ではｌｅｔ−７，ｍｉＲ−１５ａ，ｍｉＲ−１６，ｍｉＲ−１２５ａ，ｍｉＲ−１２５ｂ，ｍｉＲ−１２７，ｍｉＲ１４５，ｍｉＲ−２０４等、肺癌ではｌｅｔ−７，ｍｉＲ−９，ｍｉＲ−２６ａ，ｍｉＲ−２７ｂ，ｍｉＲ−２９ｂ，ｍｉＲ３２，ｍｉＲ−３３，ｍｉＲ−３０ａ，ｍｉＲ−９５，ｍｉＲ−１０１，ｍｉＲ−１２４，ｍｉＲ−１２５ａ，ｍｉＲ−１２６，ｍｉＲ−１４０，ｍｉＲ−１４３，ｍｉＲ−１４５，ｍｉＲ−１９８，ｍｉＲ−１９２，ｍｉＲ−１９９ｂ，ｍｉＲ−２１８，ｍｉＲ−２１９，ｍｉＲ−２２０，ｍｉＲ−２２４，ｍｉＲ−２０３，ｍｉＲ−２０５等、食道癌ではｍｉＲ−２０３，ｍｉＲ−２０５等、胃癌ではｌｅｔ−７等、結腸直腸癌ではｌｅｔ−７，ｍｉＲ−３４，ｍｉＲ−１２７，ｍｉＲ−１３３ｂ，ｍｉＲ−１４３，ｍｉＲ−１４５等、肝細胞癌ではｌｅｔ−７，ｍｉＲ−１０１，ｍｉＲ１２２，ｍｉＲ１２５ａ，ｍｉＲ−１９５，ｍｉＲ−１９９ａ，ｍｉＲ２００ａ等、膵臓癌ではｍｉＲ−１３９，ｍｉＲ−１４２，ｍｉＲ−３４５，ｍｉＲ−３７５等、前立腺癌ではｍｉＲ−１５ａ，ｍｉＲ−１６，ｍｉＲ−１４３，ｍｉＲ−１４５，ｍｉＲ−２１８等、子宮頸癌ではｍｉＲ−１４３，ｍｉＲ−１４５等、Ｂ−ＣＣＬ（Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病）ではｍｉＲ−１５ａ，ｍｉＲ−１６，ｍｉＲ−１４３，ｍｉＲ−１４５，ｍｉＲ−１９２，ｍｉＲ−２２０等の発現が正常細胞に比べて低下している。従って、本発明のワクシニアウイルスを特定の癌種の治療に用いる場合は、上記の特定の癌種で特に発現がダウンレギュレートされているｍｉＲＮＡを用いることもできる。ただし、必ずしも各々のｍｉＲＮＡが上記の特定の癌のみにおいてダウンレギュレートされているのではなく、程度の差こそあれ、あるｍｉＲＮＡは種々の癌種の細胞でダウンレギュレートされている。従って、いずれのｍｉＲＮＡも癌種を問わずに癌の治療に利用することができる。
　上記のｍｉＲＮＡの中でも、ｌｅｔ−７ａは、肺癌、膵臓癌、メラノーマなどの臨床検体で発現が低下しており、現行の治療法に極めて高い抵抗性を示す難治性悪性腫瘍に対する新規治療法の確立に貢献する点で好ましい。また、正常細胞に比べて癌細胞での発現低下が著しいｍｉＲ−１５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５などのｍｉＲＮＡも好適に利用することができる。
　ｍｉＲＮＡは３’非翻訳領域にｍｉＲＮＡの配列と部分的に又は完全に相補的な配列を含むｍＲＮＡに結合して、そのｍＲＮＡの翻訳を阻害、又はｍＲＮＡを分解することによって、特定の遺伝子発現を抑制する。従って、本発明においては、上記ｍｉＲＮＡの標的配列をワクシニアウイルスのＢ５Ｒ遺伝子の３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）にｍｉＲＮＡの結合部位として挿入する。挿入する位置は限定されず、３’非翻訳領域の両末端を含む３’末端領域中ならばどの部位でもよく、例えば、Ｂ５Ｒタンパク質のｏｒｆの停止コドンの直後に挿入すればよい。配列番号８７に示す塩基配列中、１７８０番目のａから２７３３番目のａがＢ５Ｒタンパク質のｏｒｆをコードする塩基配列であり、ｍｉＲＮＡの標的配列をｏｒｆの停止コドンより後の部分に挿入すればよい。
　標的配列は、ｍｉＲＮＡ配列の一部配列又は全配列に対する相補配列からなり、塩基長は７~２５塩基長、好ましくは１５~２５塩基長、さらに好ましくは１９~２３塩基長である。好ましくは、各々のｍｉＲＮＡ配列に対して完全相補配列からなる。但し、ｍｉＲＮＡとハイブリダイズする限り、１~数個、例えば、１~３個、１若しくは２個、あるいは１個のミスマッチがあってもよい。この場合のハイブリダイズする条件は、本発明のワクシニアウイルスを生体内に投与して医薬として用いる場合は、生体内の条件であり、本発明のワクシニアウイルスを試薬としてｉｎ　ｖｉｔｒｏで用いる場合は、中度のストリンジェントな条件又は高度なストリンジェントな条件であり、このような条件として、例えば、４００ｍＭ　ＮａＣｌ、４０ｍＭ　ＰＩＰＥＳ　ｐＨ６．４、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、５０℃から７０℃で１２~１６時間でのハイブリダイズ条件が挙げられる。また、本発明のｍｉＲＮＡの完全相補配列と標的配列は、ＢＬＡＳＴ［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３−４１０（１９９０）］、ＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３−９８（１９９０）］等の当業者に公知の相同性検索プログラムをデフォルト（初期設定）のパラメータを用いて算出される数値で９５％以上、好ましくは９６、９７、９８又は９９％以上の配列同一性を有する。また、完全相補配列の一端又は両端に１~数個、例えば、１~３個、１若しくは２個、あるいは１個の塩基が付加されていてもよい。
　ｍｉＲＮＡは、ＤＮＡから転写されたｍＲＮＡに結合するので、ワクシニアウイルスのＢ５Ｒ遺伝子の３’非翻訳領域に挿入する標的配列は、ｍｉＲＮＡ配列に対して逆相補の関係にあるチミン（Ｔ）を含むＤＮＡ配列であり、逆相補の関係にあるＤＮＡ配列をワクシニアウイルスのＢ５Ｒ遺伝子の３’非翻訳領域に挿入すればよい。例えば、ｍｉＲＮＡとして５’−ＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＵＡＵＡＧＵＵ−３’（配列番号１）であるｌｅｔ−７ａを利用する場合、ワクシニアウイルスのＢ５Ｒ遺伝子の３’非翻訳領域に５’−ＡＡＣＴＡＴＡＣＡＡＣＣＴＡＣＴＡＣＣＴＣＡ−３’（配列番号６４）からなる標的配列を挿入すればよい。当業者ならば、ワクシニアウイルスのＢ５Ｒ遺伝子の３’非翻訳領域に挿入すべき結合部位の配列を適宜設定することができる。
　標的配列は、ワクシニアウイルスのＢ５Ｒ遺伝子の３’非翻訳領域に少なくとも１つあればよい。また、複数の標的配列の繰り返し配列であってもよい。複数の繰り返し配列である場合、繰り返しの数は、２~２０個、好ましくは２~１０個、より好ましくは２~５個、さらに好ましくは２~４個である。さらに、同一のｍｉＲＮＡに対する標的配列ばかりでなく、異なるｍｉＲＮＡに対する複数の標的配列が挿入されていてもよい。この際、ｍｉＲＮＡ配列と配列の間には、スペーサー配列を挿入してもよい、スペーサー配列の長さ、塩基は限定されないが、例えば、３~１０塩基、好ましくは３~５塩基長の塩基配列を挿入すればよい。
　本発明は、癌細胞で正常細胞に比べて発現が低下しているｍｉＲＮＡを利用するが、患者によって、特定のｍｉＲＮＡのダウンレギュレーションの程度が異なる場合がある。また、癌種によっても特定のｍｉＲＮＡのダウンレギュレーションの程度が異なる場合がある。あらかじめ、患者ごとに癌細胞で特にダウンレギュレートされているｍｉＲＮＡを選択し、或いは特定の癌種で特にダウンレギュレートされているｍｉＲＮＡを選択することにより、患者ごとに、又は癌種ごとにより特異的に効果的な治療を行うことが可能である。
　本発明の、Ｂ５Ｒ遺伝子の３’非翻訳領域にｍｉＲＮＡの標的配列を結合部位として含むワクシニアウイルスをｍｉＲＮＡ制御型ワクシニアウイルス又はｍｉＲＮＡ制御増殖型ワクシニアウイルスと呼ぶ。
　本発明のｍｉＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスは癌治療のために用いることができる。すなわち、本発明はｍｉＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスを含む癌治療用の医薬組成物を包含する。
　対象とする癌は限定されず、例えば発生臓器別に分類した場合、皮膚癌、胃癌、肺癌、肝臓癌、結腸癌、膵臓癌、肛門・直腸癌、食道癌、子宮癌、乳癌、膀胱癌、前立腺癌、食道癌、卵巣癌、脳・神経腫瘍、リンパ腫・白血病、骨・骨肉腫、平滑筋腫、横紋筋腫等あらゆる癌種が対象となる。
　本発明のｍｉＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスを含む癌治療用医薬組成物は、医薬的に有効量の本発明のワクシニアウイルスワクチンを有効成分として含んでおり、無菌の水性又は非水性の溶液、懸濁液、又はエマルションの形態であってもよい。さらに、塩、緩衝剤、アジュバント等の医薬的に許容できる希釈剤、助剤、担体等を含んでいてもよい。投与は種々の非経口経路、例えば、皮下経路、静脈内経路、皮内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、鼻内経路、経皮経路によればよい。有効投与量は被験体の年齢、性別、健康、及び体重等により適宜決定することができる。例えば、限定されないが、ヒト成人に対して、投与当たり約１０２~１０１０プラーク形成単位（ＰＦＵ）、好ましくは１０５~１０６プラーク形成単位（ＰＦＵ）である。
　さらに、本発明のｍｉＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスは、外来遺伝子（外来ＤＮＡ又は外来ポリヌクレオチド）を含んでいてもよい。外来遺伝子（外来ＤＮＡ又は外来ポリヌクレオチド）としては、マーカー遺伝子、細胞毒性や免疫賦活効果を有する産物をコードする治療用遺伝子が挙げられ、さらに、癌、ウイルス、細菌、原虫等のタンパク質抗原をコードするＤＮＡが挙げられる。マーカー遺伝子はレポーター遺伝子ともいい、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）遺伝子、緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ；ＧＦＰ）等の蛍光タンパク質遺伝子、赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）等の蛍光タンパク質遺伝子、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）遺伝子等が挙げられる。本発明において、これらの外来遺伝子を含むｍｉＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスをｍｉＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスベクターということもできる。
　これらのマーカー遺伝子をＢ５Ｒ遺伝子のプロモーターの制御下に挿入した場合、すなわちＢ５Ｒ遺伝子とマーカー遺伝子の融合遺伝子として挿入したｍｉＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスは、ｍｉＲＮＡ制御の評価のために用いることができる。すなわち、特定のｍｉＲＮＡの標的配列を挿入し、特定の癌細胞に感染させる。用いたｍｉＲＮＡがワクシニアウイルスの増殖制御に有効な場合、すなわち、用いたｍｉＲＮＡが癌細胞において発現が低下している場合、前記癌細胞中でＢ５Ｒ遺伝子と共にマーカー遺伝子が発現するので、蛍光タンパク質等のマーカー遺伝子産物が細胞中で産生される。マーカーを測定することにより用いたｍｉＲＮＡの有効性を評価することが可能になる。本発明は、マーカー遺伝子を含むｍｉＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスを用いてｍｉＲＮＡを評価する系及び評価する方法を包含する。例えば、特定の癌患者に適したｍｉＲＮＡを選択しようとする場合、該患者から癌細胞及び正常細胞を採取し、両細胞に、それぞれ種々のｍｉＲＮＡの標的配列を含むｍｉＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスを感染させ、ワクシニアウイルスが癌細胞で増殖し、正常細胞で増殖しなくなるｍｉＲＮＡを選択すればよい。
　治療用遺伝子は、癌や感染症等の特定の疾患の治療に用い得る遺伝子であり、ｐ５３、Ｒｂ等の腫瘍抑制遺伝子、インターロイキン１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、アンジオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、ＭＥＴＨ−１、ＭＥＴＨ−２、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、腫瘍壊死因子等の生理活性物質をコードする遺伝子等が挙げられる。
　外来遺伝子（外来ＤＮＡ）としてウイルス、細菌、原虫及び癌等の抗原をコードするＤＮＡを導入することにより、外来遺伝子を導入したワクシニアウイルスベクターを種々のウイルス、細菌、原虫及び癌に対するワクチンとして用いることができる。例えば、ヒト免疫不全ウイルス、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、ミコバクテリア、マラリア原虫、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ＝サーズ）ウイルス等の感染防御抗原（中和抗原）、あるいは癌抗原をコードする遺伝子を導入すればよい。
　これらの外来遺伝子は、例えば、相同組換えの手法を用いることにより導入することができる。相同組換えは上述の方法で行えばよい。例えば、導入したい部位のＤＮＡ配列中に導入すべき外来遺伝子を連結したプラスミド（トランスファーベクター）を作製し、これを、ワクシニアウイルスを感染させた細胞の中に導入すればよい。トランスファーベクターとして、例えばｐＳＦＪ１−１０、ｐＳＦＪ２−１６、ｐＭＭ４、ｐＧＳ２０、ｐＳＣ１１、ｐＭＪ６０１、ｐ２００１、ｐＢＣＢ０１−３，０６、ｐＴＫｇｐｔ−Ｆ１−３ｓ、ｐＴＭ１、ｐＴＭ３、ｐＰＲ３４，３５、ｐｇｐｔ−ＡＴＡ１８−２、ｐＨＥＳ１−３等を用いることができる。外来遺伝子の導入領域は、ワクシニアウイルスの生活環に必須でない遺伝子中が好ましい。あるいは、例えば、癌細胞においては、外来遺伝子の挿入により機能が欠損した場合であっても、癌細胞が豊富に有する酵素等によりその機能欠損が補償され得るが正常細胞では機能欠損が補償されない遺伝子や特定の領域中に挿入しても良い。この場合、本発明のｍｉＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスは癌細胞中では増殖することができ、ｍｉＲＮＡの作用により癌細胞を破壊し傷害をもたらすが、正常細胞では増殖することができず、正常細胞を破壊し、傷害をもたらすことはない。このような遺伝子として、例えば赤血球凝集素（ＨＡ）遺伝子；チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子；Ｆフラグメント；Ｆ３遺伝子；ＶＧＦ遺伝子（米国特許出願公開第２００３／００３１６８１号明細書）；出血領域又はＡ型封入体領域（米国特許第６，５９６，２７９号明細書）；Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ　Ｆ、Ｆ１３Ｌ若しくはＨｉｎｄ　ＩＩＩ　Ｍ領域（米国特許第６，５４８，０６８号明細書）；Ａ３３Ｒ、Ａ３４Ｒ若しくはＡ３６Ｒ遺伝子（Ｋａｔｚ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　７７：１２２６６−１２２７５（２００３））；ＳａｌＦ７Ｌ遺伝子（Ｍｏｏｒｅ　ｅｔ　ａｌ．，ＥＭＢＯ　Ｊ．１９９２　１１：１９７３−１９８０）；Ｎ１Ｌ遺伝子（Ｋｏｔｗａｌ　ｅｔ　ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１９８９　１７１：５７９−５８）；Ｍ１遺伝子（Ｃｈｉｌｄ　ｅｔ　ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９０　１７４：６２５−６２９）；ＨＲ、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＭＫ、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＭＫＦ、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＣＮＭ、ＲＲ若しくはＢａｍＦ領域（Ｌｅｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ　Ｖｉｒｏｌ．１９９２　６６：２６１７−２６３０）；Ｃ２１Ｌ遺伝子（Ｉｓａａｃｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ．１９９２　８９：６２８−６３２）等が挙げられる。これらの遺伝子の中でも、ＴＫ遺伝子、ＨＡ遺伝子、Ｆフラグメント、ＶＧＦ遺伝子が好ましい。例えば、ＴＫ遺伝子が機能を失うと、正常細胞におけるワクシニアウイルスの増殖能が低下する。一方、癌細胞にはこの遺伝子の機能を補う酵素が豊富に存在するため癌細胞では増殖能は低下しない。正常細胞において増殖能が低下することは正常細胞に対する病原性が低下することを意味し、すなわち、生体に適用した場合の安全性が向上する。ワクシニアウイルスを感染させる細胞としては、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＶ１細胞、ＣＯＳ細胞、ＲＫ１３細胞、ＢＨＫ−２１細胞、初代ウサギ腎細胞、ＢＳＣ−１細胞、ＨＴＫ−１４３細胞、Ｈｅｐ２細胞、ＭＤＣＫ細胞等、ワクシニアウイルスが感染し得る細胞を用い得る。
　また、本発明のｍｉＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスにおいて上記の癌細胞が豊富に有する酵素等によりその機能欠損が補償され得るが正常細胞では機能欠損が補償されない遺伝子の機能を失わせてもよい。このような遺伝子の正常な機能を失わせることにより、ｍｉＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスは癌細胞中で増殖しｍｉＲＮＡの作用により癌細胞を破壊し傷害をもたらすが、正常細胞では増殖することができず、正常細胞を破壊し、傷害をもたらすことはない。ここで、遺伝子の正常な機能を失わせるとは、該遺伝子が発現しないか、あるいは発現してもその発現タンパク質が正常な機能を保持していないことをいい、遺伝子を欠損させるともいう。遺伝子の正常な機能を失わせるためには、上記のように該遺伝子中に外来遺伝子を挿入してもよく、また、遺伝子を部分的に欠失させても、完全に欠失させてもよい。外来遺伝子の挿入や遺伝子の欠失は例えば相同組換えにより行うことができる。癌細胞が豊富に有する酵素等によりその機能欠損が補償され得るが正常細胞では機能欠損が補償されない遺伝子としては、上記の遺伝子が挙げられ、この中でも、ＴＫ遺伝子、ＨＡ遺伝子、Ｆフラグメント、ＶＧＦ遺伝子が好ましい。これらの遺伝子の１つ又は複数を欠損させればよい。この中でもＴＫ遺伝子を欠損させた場合、正常組織におけるウイルス増殖が抑制され、マイクロＲＮＡ制御増殖型ワクシニアウイルスの治療指数が高まり、好ましい。さらに、ＴＫ遺伝子に加えてＨＡ遺伝子及びＦフラグメントを欠損させてもよく、あるいはＴＫ遺伝子に加えてＶＧＦ遺伝子を欠損させてもよい。
　また、外来遺伝子を導入する際、外来遺伝子の上流に適当なプロモーターを機能し得る形で連結させるのが望ましい。プロモーターは、限定はないが、上述のＰＳＦＪ１−１０や、ＰＳＦＪ２−１６、ｐ７．５Ｋプロモーター、ｐ１１Ｋプロモーター、Ｔ７．１０プロモーター、ＣＰＸプロモーター、ＨＦプロモーター、Ｈ６プロモーター、Ｔ７ハイブリッドプロモーター等を用いることができる。本発明のワクシニアウイルスベクターに外来遺伝子を導入する方法は、組換えワクシニアウイルスベクターを構築する公知の方法により行うことができ、例えば別冊　実験医学　ザ・プロトコールシリーズ　遺伝子導入＆発現解析実験法　斎藤泉他編集、羊土社（１９９７年９月１日発行）、あるいは、Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ他編、加藤郁之進　監訳ＤＮＡクローニング４−哺乳類のシステム−（第２版）ＴａＫａＲａ、ＥＭＢＯ　Ｊｏｕｒｎａｌ（１９８７年　６巻　ｐ．３３７９−３３８４等の記載に従えばよい。
　本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
次に、本発明を実施例により具体的に説明する。
参考例１　弱毒化ワクシニアウイルスの抗癌効果（腫瘍溶解性）と安全性
　ルシフェラーゼを恒常的に発現するヒト膵癌ＢｘＰＣ−３Ｌｕｃ細胞（５×１０６個）をＳＣＩＤマウスの腹腔内に投与し、腹膜播種マウスモデルを作成した。ＢｘＰＣ−３Ｌｕｃ細胞投与４日目に、ルシフェリン溶液（１５ｍｇ／ｍＬ　ｉｎ　ＰＢＳ）を１０μＬ／ｇで腹膜播種マウスモデルの腹腔内に投与し、癌細胞で発現するルシフェラーゼによる発光をＩＶＩＳＴＭ　ｉｍａｇｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍ（Ｘｅｎｏｇｅｎ社）によって非侵襲的にモニターした（図１；治療前）。次に、ＢｘＰＣ−３Ｌｕｃ細胞投与７日目に、１０７プラーク形成単位（ｐｌａｑｕｅ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｕｎｉｔ；ｐｆｕ）のＬＣ１６ｍＯ株（Ｌｉｓｔｅｒ株からＬＣ１６ｍ８株を分離する過程の中間株であり、特徴的性質としては中枢神経病原性が減弱している）、またはＬＣ１６ｍ８Δ（ＬＣ１６ｍ８株の遺伝的安定性を向上させた組換えウイルスであり、ワクチンとして副作用無くヒトに使用された実績を持つＣ１６ｍ８株と同様の特性を示す）を腹膜播種マウスモデルの腹腔内に投与した。ウイルスによる抗癌効果を判定するため、ＢｘＰＣ−３Ｌｕｃ細胞投与１８日目、及び２９日目に、マウス体内の癌細胞を上述のようにモニターした（図１；治療後）。その結果、ウイルスを投与していない模擬対照群（Ｍｏｃｋ）では、時間経過に伴って移植した癌細胞の増殖が確認された。それに対し、ＬＣ１６ｍＯ投与群では、強力な抗腫瘍効果を示した。ＬＣ１６ｍ８Δ投与群では、一時的に抗腫瘍効果を示したが、２９日目では移植した癌細胞の再増殖が確認された。同時に、治療に伴うウイルスによる副作用を投与後の体重変化により評価した結果、ＬＣ１６ｍＯ投与マウスは全身でのウイルス増殖による発痘を伴う急激な体重減少によって、全てのマウスが２１日から２８日目の間に死亡した。その一方、ＬＣ１６ｍ８Δ投与群では模擬対照群と同様に全く副作用は見られなかった（図２）。以上より、ＬＣ１６ｍ８Δは非常に安全性の高い腫瘍溶解性ウイルスになり得るが、それ自体の抗癌効果は完全に癌細胞を死滅させるには不十分であると示唆された。
参考例２　ヒト腫瘍細胞における弱毒化ワクシニアウイルスのＢ５Ｒ発現とウイルス増殖性
　ＬＣ１６ｍＯ株のゲノムＤＮＡを鋳型として、２つのプライマー５’−ＴＣＧＧＡＡＧＣＡＧＴＣＧＣＡＡＡＣＡＡＣ−３’（配列番号６５）と５’−ＡＴＡＣＣＡＴＣＧＴＣＧＴＴＡＡＡＡＧＣＧＣ−３’（配列番号６６）によって、Ｂ４ＲからＢ５Ｒ、そしてＢ６Ｒまでの遺伝子領域を増幅し、ＴＡベクターｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、ｐＢ５Ｒを構築した。
　組換えウイルスＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒ（図３）の回収のため、６ｗｅｌｌディッシュに８０％コンフルエントに培養されたＲＫ１３細胞にワクシニアウイルス（ＬＣ１６ｍ８Δ）をＭＯＩ＝０．０２~０．１で感染させ、室温で１時間吸着後、ＦｕＧＥＮＥ　ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ）と混合したトランスファーベクタープラスミドＤＮＡ（ｐＢ５Ｒ）をマニュアルに従って細胞に添加して取り込ませ、３７℃にて２~５日間培養した。細胞を凍結融解後、ソニケーション処理し、ほぼコンフルエントになったＲＫ１３細胞に適当に希釈して接種し、０．８％メチルセルロースを含むＥａｇｌｅ　ＭＥＭ，５％ＦＢＳ培地を加え、３７℃で２~５日間培養した。培地を除き、ラージプラークをチップの先で掻き取り、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に浮遊させた。ＲＫ１３細胞にてさらに３回以上この操作を繰り返し、プラーク純化した。プラーク純化後に採取したプラークの浮遊液をソニケーション後、その２００μＬを１５，０００ｒｐｍ、３０分間遠心し、沈査に５０μＬの滅菌蒸留水または１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ＰＨ７．５）を添加した。３０秒間ソニケーション後、９５℃で１０分間加熱してゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲによるスクリーニングに供した。２つのプライマー５’−ｃｇｔａｔａａｔａｃｇｔｔｇｇｔｃｔａｔ−３’（配列番号６７）と５’−ｇａｔｃｇｔｇｃｃａａｔａｇｔａｇｔｔａ−３’（配列番号６８）によってＰＣＲを行い、所定の大きさのＰＣＲプロダクトが検出されたクローンについて、ＰＣＲプロダクトの塩基配列をダイレクトシーケンスにより確認した。塩基配列に問題が無いウイルスクローンを選択し、ＲＫ１３細胞にて大量培養した後、ＲＫ１３細胞にてウイルス力価を測定し、実験に供した。
　図３に示すウイルスゲノムを持つ各ウイルスの腫瘍溶解性を検討するため、９６ｗｅｌｌで培養したヒト癌細胞株（肺癌Ａ５４９細胞、膵癌ＢｘＰＣ−３・ＰａｎｃＩ細胞、結腸癌Ｃａｃｏ−２細胞、子宮頚癌ＨｅＬａ細胞、咽頭癌ＨＥｐ−２細胞、乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、神経芽腫ＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞）にＭＯＩ＝０．５で感染させ、３７℃で５日間培養後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（Ｒ）ＡＱｕｅｏｕｓ　Ｏｎｅ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって、そのマニュアルに従い生細胞数を測定した（図４）。その結果、Ｂ５Ｒを発現するＬＣ１６ｍＯ株と組換えＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒは、全ての癌細胞に対して同等の腫瘍溶解性を示し、模擬対照群の生細胞数を１００％とした時、約６０~９５％の細胞を死滅させた。一方、Ｂ５Ｒを発現しないＬＣ１６ｍ８Δは、一部の細胞株で腫瘍溶解性を示したが、０~５０％の細胞を死滅させるにとどまった。これらの結果より、ワクシニアウイルスが腫瘍細胞に感染後、増殖しながら死滅させるという腫瘍溶解性は、Ｂ５Ｒの発現によって劇的に増強されることが示された。
　癌細胞のみを特異的に破壊するマイクロＲＮＡ制御増殖型ワクシニアウイルス（図５）の構築
　Ｂ５Ｒ遺伝子の３’ＵＴＲにＮｈｅＩとＡｇｅＩの制限酵素配列を挿入するため、ｐＢ５Ｒプラスミドを鋳型に各２つのプライマー５’−ＣＡＡＡＣＴＣＴＣＧＡＡＡＧＡＣＧＴ−３’（配列番号６９）と５’−ｇｃａｃｃｇｇｔｇｃｔａｇｃＴＴＡＣＧＧＴＡＧＣＡＡＴＴＴＡＴＧＧＡＡ−３’（配列番号７０）、又は５’−ｃｃｇｃｔａｇｃａｃｃｇｇｔＡＴＡＴＡＡＡＴＣＣＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＴＴＡＡＴ−３’（配列番号７１）と５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ−３’（Ｍ１３　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ（配列番号７２））によって、２種類のＤＮＡ断片を増幅した。前者のＰＣＲ産物を制限酵素ＨｐａＩとＮｈｅＩで、後者のＰＣＲ産物を制限酵素ＮｈｅＩとＨｉｎｄＩＩで切断した。この２種類のＤＮＡ断片を、制限酵素ＨｐａＩとＨｉｎｄＩＩで切断したｐＢ５Ｒにクローニングし、ｐＴＮ−Ｂ５Ｒを構築した。ｐＴＮ−Ｂ５Ｒプラスミドを鋳型として、２つのプライマー５’−ｃａａａａｔａｔｔｔｔｃｇｔｔｇｃｇａａｇａ−３’（配列番号７３）と５’−ＣＡＣＣＡＴＧＧＧＴＡＧＣＡＡＴＴＴＡＴＧＧＡＡＣＴ−３’（配列番号７４）によって、終止コドンを除去したＢ５Ｒを増幅した。又、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）プラスミドを鋳型として、２つのプライマー５’−ＧＣＧＧＣＣＧＧＡＣＣＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡ−３’（配列番号７５）と５’−ｇｃｇｃｔａｇｃＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡ−３’（配列番号７６）によって、ＮｈｅＩ制限酵素配列を付加したＥＧＦＰ（緑色蛍光蛋白）遺伝子を増幅した。前者のＰＣＲ産物を制限酵素ＨｐａＩとＮｃｏＩで、後者のＰＣＲ産物を制限酵素ＮｃｏＩとＮｈｅＩで切断した。この２種類のＤＮＡ断片を、制限酵素ＨｐａＩとＮｈｅＩで切断したｐＴＮ−Ｂ５Ｒにクローニングし、ｐＴＮ−Ｂ５Ｒｇｆｐを構築した。２２塩基のｌｅｔ７ａマイクロＲＮＡの標的配列を２回繰り返して挿入するため、２つの合成ＤＮＡ（５’−ｃｔａｇｃＡＡＣＴＡＴＡＣＡＡＣＣＴＡＣＴＡＣＣＴＣＡｃｇａｔＡＡＣＴＡＴＡＣＡＡＣＣＴＡＣＴＡＣＣＴＣＡｃｇｃｇｔａ−３’（配列番号７７）と５’−ｃｃｇｇｔａｃｇｃｇＴＧＡＧＧＴＡＧＴＡＧＧＴＴＧＴＡＴＡＧＴＴａｔｃｇＴＧＡＧＧＴＡＧＴＡＧＧＴＴＧＴＡＴＡＧＴＴｇ−３’（配列番号７８））をアニールした。それを制限酵素ＮｈｅＩとＡｇｅＩで切断したｐＴＮ−Ｂ５Ｒ又はｐＴＮ−Ｂ５Ｒｇｆｐにクローニングし、ｐＴＮ−Ｂ５Ｒ−ｌｅｔ７ａｘ２、又はｐＴＮ−Ｂ５Ｒｇｆｐ−ｌｅｔ７ａｘ２を構築した。同様な方法で、変異を加えた２２塩基のｌｅｔ７ａマイクロＲＮＡの標的配列を２回繰り返して挿入する場合は、５’−ｃｔａｇｃＡＡＴＴＡＣＡＣＧＡＣＴＴＡＴＴＡＴＴＴＧＡｃｇａｔＡＡＴＴＡＣＡＣＧＡＣＴＴＡＴＴＡＴＴＴＧＡｃｇｃｇｔａ−３’（配列番号７９）と５’−ｃｃｇｇｔａｃｇｃｇＴＣＡＡＡＴＡＡＴＡＡＧＴＣＧＴＧＴＡＡＴＴａｔｃｇＴＣＡＡＡＴＡＡＴＡＡＧＴＣＧＴＧＴＡＡＴＴｇ−３’（配列番号８０）の２つの合成ＤＮＡを使用し、ｐＴＮ−Ｂ５Ｒ−ｌｅｔ７ａ　ｍｕｔｘ２、又はｐＴＮ−Ｂ５Ｒｇｆｐ−ｌｅｔ７ａ　ｍｕｔｘ２を構築した。さらに、２つの合成ＤＮＡ（５’−ｃｇｃｇｔＡＡＣＴＡＴＡＣＡＡＣＣＴＡＣＴＡＣＣＴＣＡｔｃａｃＡＡＣＴＡＴＡＣＡＡＣＣＴＡＣＴＡＣＣＴＣＡ−３’（配列番号８１）と５’−ｃｃｇｇＴＧＡＧＧＴＡＧＴＡＧＧＴＴＧＴＡＴＡＧＴＴｇｔｇａＴＧＡＧＧＴＡＧＴＡＧＧＴＴＧＴＡＴＡＧＴＴａ−３’（配列番号８２））をアニールしたＤＮＡ断片を、制限酵素ＭｌｕＩとＡｇｅＩで切断したｐＴＮ−Ｂ５Ｒ−ｌｅｔ７ａｘ２又はｐＴＮ−Ｂ５Ｒｇｆｐ−ｌｅｔ７ａｘ２にクローニングし、４回繰り返してｌｅｔ７ａマイクロＲＮＡの標的配列をもつｐＴＮ−Ｂ５Ｒ−ｌｅｔ７ａ、又はｐＴＮ−Ｂ５Ｒｇｆｐ−ｌｅｔ７ａを構築した。同様な方法で、変異を加えた標的配列を挿入する場合は、５’−ｃｇｃｇｔＡＡＴＴＡＣＡＣＧＡＣＴＴＡＴＴＡＴＴＴＧＡｔｃａｃＡＡＴＴＡＣＡＣＧＡＣＴＴＡＴＴＡＴＴＴＧＡ−３’（配列番号８３）と５’−ｃｃｇｇＴＣＡＡＡＴＡＡＴＡＡＧＴＣＧＴＧＴＡＡＴＴｇｔｇａＴＣＡＡＡＴＡＡＴＡＡＧＴＣＧＴＧＴＡＡＴＴａ−３’（配列番号８４）の２つの合成ＤＮＡを使用し、ｐＴＮ−Ｂ５−ｌｅｔ７ａ　ｍｕｔ、又はｐＴＮ−Ｂ５Ｒｇｆｐ−ｌｅｔ７ａ　ｍｕｔを構築した。
　各組換えウイルス（図７）は、参考例２で記述した方法と同様に、ｐＴＮ−Ｂ５Ｒ、ｐＴＮ−Ｂ５Ｒ−ｌｅｔ７ａ、またはｐＴＮ−Ｂ５Ｒ−ｌｅｔ７ａ　ｍｕｔ、ｐＴＮ−Ｂ５Ｒｇｆｐ、ｐＴＮ−Ｂ５Ｒｇｆｐ−ｌｅｔ７ａ、又はｐＴＮ−Ｂ５Ｒｇｆｐ−ｌｅｔ７ａ　ｍｕｔのトランスファーベクターを用いて作出し、ラージプラーク、又はＥＧＦＰの発現を目安にプラーク純化した後、ＰＣＲとダイレクトシーケンスにより確認した。塩基配列に問題が無いウイルスクローンを選択し、ＲＫ１３細胞にて大量培養した後、ＲＫ１３細胞にてウイルス力価を測定し、実験に供した。
　マイクロＲＮＡ制御増殖型ワクシニアウイルスの迅速簡便な評価システムの確立
　ヒト腫瘍細胞より、ｍｉｒＶａｎａ　ｍｉＲＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって、そのマニュアルに従いｓｍａｌｌ　ＲＮＡを含むトータルＲＮＡを回収した。１０ｎｇの各回収ＲＮＡを用いて、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡ　Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって、そのマニュアルに従い各腫瘍細胞のｌｅｔ７ａマイクロＲＮＡ（Ｐｒｏｄｕｃｔ　ＩＤ；０００３７７）をＴａｑＭａｎ法で定量した。内在性コントロールには、ＲＮＵ６Ｂ（Ｐｒｏｄｕｃｔ　ＩＤ；００１０９３）を使用した。ｌｅｔ７ａマイクロＲＮＡの相対発現量は、ＨｅＬａ細胞を基準に比較Ｃｔ法を用いて算出した。その結果、ＨｅＬａ細胞に対して、Ａ５４９細胞では約６０％、ＢｘＰＣ−３細胞では約５０％、ＰａｎｃＩ細胞では約４５％の発現低下が観察された。一方、ＮＨＬＦ（正常ヒト肺線維芽細胞）では、Ｈｅｌａ細胞に対して、１．５倍の発現が観察された（図６）。
　図７に示すウイルスゲノムを持つ各マイクロＲＮＡ制御増殖型ワクシニアウイルスを２４ｗｅｌｌで培養した各癌細胞にＭＯＩ＝０．１で感染させ、３７℃で３日間培養後、蛍光顕微鏡（オリンパス）で生細胞のまま明視野観察と蛍光観察した。その結果、ｌｅｔ７ａマイクロＲＮＡの発現が低下しているＡ５４９、ＢｘＰＣ−３、ＰａｎｃＩ細胞では、ＥＧＦＰ融合Ｂ５Ｒ、ＥＧＦＰ融合Ｂ５Ｒの３’ＵＴＲにｌｅｔ７ａ標的配列、又はＥＧＦＰ融合Ｂ５Ｒの３’ＵＴＲに変異ｌｅｔ７ａ標的配列を挿入したいずれのウイルスでも、同程度の細胞変性が観察され、その変性細胞ではＥＧＦＰの発現が確認された。一方、ｌｅｔ７ａマイクロＲＮＡの発現が高いＨｅＬａ及びＮＨＬＦ細胞では、ＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｇｆｐｌｅｔ７ａによる細胞変性、及びＥＧＦＰの発現が観察されなかった（図８）。さらに、それぞれの感染細胞を回収し、凍結融解後、ソニケーションし、遠心（２，０００ｒｐｍ、５分間）後の上清をウイルス液として回収した。各ウイルス液（１ｍｌ）のウイルス力価をＲＫ１３細胞にて測定した。その結果、Ａ５４９、ＰａｎｃＩ細胞では、ＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｇｆｐ、ＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｇｆｐｌｅｔ７ａ、ＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｇｆｐｌｅｔ７ａ　ｍｕｔは同等に増殖しており、それはＬＣ１６ｍ８Δよりも高く、ＬＣ１６ｍＯの増殖にほぼ匹敵していた。一方、ＨｅＬａ及びＮＨＬＦ細胞において、ＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｇｆｐｌｅｔ７ａの増殖はＬＣ１６ｍ８Δと同等で、他のウイルスに比べて劇的に低下していた（図９）。これらの結果より、マイクロＲＮＡ制御型ウイルスでは、細胞内のマイクロＲＮＡ制御機構による遺伝子発現調節と同調して、そのマイクロＲＮＡが発現する細胞においてはＢ５Ｒの発現が抑制されるが、そのマイクロＲＮＡの発現が低下している細胞においてはＢ５Ｒが発現し、細胞変性と効率の良いウイルス増殖を示した。又、Ｂ５Ｒ遺伝子にＥＧＦＰ遺伝子を融合させて発現させることによって、蛍光顕微鏡下で生細胞のまま、容易にＢ５Ｒの発現を観察することが可能となり、ｌｅｔ７ａ以外の他のマイクロＲＮＡ制御型ウイルスの簡便迅速な評価系として有益となる。
　外来遺伝子を発現するマイクロＲＮＡ制御増殖型ワクシニアウイルスの構築
　赤血球凝集素（ＨＡ）遺伝子に挿入された２種類の外来遺伝子（ホタルルシフェラーゼ遺伝子とＥＧＦＰ遺伝子）を発現する組換えウイルスを構築するため、ｐＧＬ４．２０プラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）を鋳型に２つのプライマー５’−ＧＣＧＧＣＣＧＧＡＣＣＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＧＡＴＧＣＣＡＡＡＡＡ−３’（配列番号８５）と５’−ＡＴＧＧＣＣＧＧＣＣＴＴＡＣＡＣＧＧＣＧＡＴＣＴＴＧＣＣＧＣ−３’（配列番号８６）によって、両末端にＳｆｉＩとＦｓｅＩ制限酵素配列を付加したルシフェラーゼ遺伝子を増幅した。このＰＣＲ産物を制限酵素ＳｆｉＩとＦｓｅＩで切断し、ｐＶＮＣ１１０（Ｓｕｚｕｋｉ　Ｈ　ｅｔ　ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ．２００９　１１；２７（７）：９６６−９７１）の同じ制限酵素部位にクローニングし、ｐＶＮＣ１１０−Ｌｕｃを構築した。ｐＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミドから制限酵素ＳｍａＩとＮｏｔＩの切断によって獲得したＥＧＦＰ遺伝子断片を、ｐＩＲＥＳ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の同じ制限酵素部位にクローニングし、ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰを構築した。そして、ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰから制限酵素ＭｌｕＩとＮｏｔＩの切断によって獲得したＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ遺伝子断片を、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼでその両末端を平滑化した。この平滑化遺伝子断片を、ｐＶＮＣ１１０−Ｌｕｃの制限酵素ＦｓｅＩ処理後に平滑化した部位にクローニングし、ｐＶＮＣ１１０−Ｌｕｃ／ＩＲＥＳ／ＥＧＦＰを構築した。
　各組換えウイルス（図１０）は、参考例２で記述した方法と同様に、ＲＫ１３細胞にワクシニアウイルス（ＬＣ１６ｍＯ株、ＬＣ１６ｍ８Δ、参考例２で作出したＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒ、実施例１で作出したＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ、又はＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ　ｍｕｔ）を感染させ、トランスファーベクタープラスミドＤＮＡのｐＶＮＣ１１０−Ｌｕｃ／ＩＲＥＳ／ＥＧＦＰを細胞に取り込ませることによって作出し、プラークの大きさ、又はＥＧＦＰの発現を目安にプラーク純化した後、ＰＣＲとダイレクトシーケンスにより確認した。塩基配列に問題が無いウイルスクローンを選択し、ＲＫ１３細胞にて大量培養した後、ＲＫ１３細胞にてウイルス力価を測定し、実験に供した。
　外来遺伝子を発現するマイクロＲＮＡ制御増殖型ワクシニアウイルスの特性
　図１０に示すウイルスゲノムを持つ各マイクロＲＮＡ制御増殖型ワクシニアウイルスを９６ｗｅｌｌで培養した各癌細胞にＭＯＩ＝０．５で感染させ、３７℃で５日間培養後、参考例２で記述した方法によって生細胞数を測定した（図１１）。その結果、ｌｅｔ７ａ標的配列を挿入したＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ／ＬＧのｌｅｔ７ａ高発現Ｈｅｌａ細胞おける殺細胞効果は、Ｂ５Ｒ遺伝子欠失ＬＣ１６ｍ８Δと同等で、Ｂ５Ｒを挿入したＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒ／ＬＧや変異ｌｅｔ７ａ標的配列を挿入したＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ　ｍｕｔ／ＬＧと比較して顕著に低下した。それに対し、ｌｅｔ７ａの発現が低下しているＡ５４９、及びＢｘＰＣ−３細胞では、ＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒ／ＬＧやＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ　ｍｕｔ／ＬＧと同等で強力な殺細胞効果が見られた。以上より、外来遺伝子を発現するマイクロＲＮＡ制御増殖型ワクシニアウイルスにおいても、そのマイクロＲＮＡが発現する細胞においてはＢ５Ｒの発現が抑制されるが、そのマイクロＲＮＡの発現が低下している細胞においてはＢ５Ｒが発現し、効率の良いウイルス増殖による殺細胞効果を示した。
　さらに、このマイクロＲＮＡ制御ウイルスが、マウス体内においても機能するかどうかを検討した。Ｌｅｔ７ａは、全てのマウス正常組織において高発現しているので、ＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ／ＬＧはマウス体内で増殖できないと予想される。１０７ｐｆｕの各ルシフェラーゼ発現ウイルスをＳＣＩＤマウスに腹腔内投与した（各群３匹）。参考例１で記述したように、３日、９日、１６日後にルシフェリンを投与し、ウイルスが感染、増殖した細胞におけるルシフェラーゼ発現を非侵襲的にモニターし（図１２Ａ）、数値化した（図１２Ｂ）。その結果、ウイルス投与３日後では、全てのウイルス投与群において腹腔内での発現が確認され、それを数値化し２要因の分散分析（ｔｗｏ−ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ）によって統計解析したところ、全てのウイルス間で有意な差はなかった。それに対し投与９日、１６日後では、ＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ／ＬＧの増殖は、Ｂ５Ｒ遺伝子欠失ＬＣ１６ｍ８△／ＬＧと同様に著しく低下していたが、ＬＣ１６ｍＯ／ＬＧとＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ　ｍｕｔ／ＬＧの増殖は、時間経過に伴って投与部位の腹腔内だけではなく全身に広がり、主に尾、手足、口腔で見られる発痘と一致していた（図１２Ａ）。同様の統計解析の結果、投与後１６日のＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ／ＬＧのウイルス増殖は、ＬＣ１６ｍＯ／ＬＧとＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ　ｍｕｔ／ＬＧに対して有意な差が確認されたが、ＬＣ１６ｍ８Δに対しては有意な差がなかった（図１２Ｂ）。これより、外来遺伝子発現マイクロＲＮＡ制御増殖型ウイルスは、ｌｅｔ７ａの制御によって、免疫欠損ＳＣＩＤマウスの正常組織においても、その増殖性が著しく低下することを確認した。
　次に、１０８ｐｆｕの各ルシフェラーゼ発現ウイルスをＣ５７ＢＬ／６マウスに腹腔内投与した（各群３匹）。参考例１で記述したように、１日、４日、１０日後にルシフェリンを投与し、ウイルスが感染、増殖した細胞におけるルシフェラーゼ発現を非侵襲的にモニターした（図１６）。その結果、ＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ／ＬＧの増殖は、ウイルス投与１日後でさえ、腹腔内での発現はわずかであり、４日後には確認できなくなった。それに対し、ＬＣ１６ｍＯ／ＬＧとＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ　ｍｕｔ／ＬＧの増殖は、ウイルス投与１日後は腹腔内での強い発現が確認され、４日後には投与部位の腹腔内だけではなく全身に広がり、主に尾、手足、口腔で見られた。但し、１０日後では、ＬＣ１６ｍＯ／ＬＧとＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ　ｍｕｔ／ＬＧウイルス投与群においても、それらの発現はわずかになった。これより、外来遺伝子発現マイクロＲＮＡ制御増殖型ウイルスは、ｌｅｔ７ａの制御によって、免疫が機能するＣ５７ＢＬ／６マウスの正常組織においては、感染後２４時間以内に、その増殖性が極めて著しく低下し、体内から排除されることを確認した。
　外来遺伝子を発現するマイクロＲＮＡ制御増殖型ワクシニアウイルスの抗癌効果と安全性
　５ｘ１０６個のＢｘＰＣ３、又はＡ５４９を免疫不全ヌードマウスの右腹側の皮下に移植し、その腫瘍塊が約１００ｍｍ３（皮膚を介して腫瘍塊の長径Ｌと短径Ｗをノギスで測定し、腫瘍体積Ｖを計算式Ｖ＝ＬＷ２／２により算出した大きさ）に到達した時を０日とした。１０７ｐｆｕの各ウイルスを腫瘍内に０日、３日、及び６日目と合計３回投与した（各群５匹）。その結果、ＬＣ１６ｍＯ／ＬＧ、ＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ／ＬＧ、又はＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ　ｍｕｔ／ＬＧは、ＢｘＰＣ３担癌マウスにおいて強力な抗癌作用を示し、ウイルス投与無の模擬対照群と比べて、２１~３５日後の腫瘍体積において非常に有意な差があることがｔｗｏ−ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ統計解析によって確認された（図１３Ａ）。ＬＣ１６ｍ８Δ群では、模擬対照群と比べて、３２~３５日後の腫瘍体積において非常に有意な差があることが確認されたが、治療５６日後までに全てのマウスで腫瘍体積が２５００ｍｍ３に到達したため安楽死された。一方ＬＣ１６ｍＯ／ＬＧ、又はＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ　ｍｕｔ／ＬＧ投与マウスでは、治療５９日後までに全身での発痘を伴う急激な体重減少によって全てのマウスが死亡、又は安楽死された。それらに対しＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ／ＬＧは、他群と比べて生存率における非常に有意な差がＬｏｇ−ｒａｎｋ検定によって確認され、治療５９日後で１００％のマウスが生存しており、その５匹中４匹のマウスにおいて完全な腫瘍の消失が観察された（図１３Ｂ）。同様にＡ５４９担癌マウスにおいても、ＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ／ＬＧ投与群では、完全に腫瘍が消失したマウスはいなかったものの、副作用無く強力な抗癌作用を示した（図１４ＡとＢ）。模擬対照群と比べて、全てのウイルス投与群で生存率における有意な差がＬｏｇ−ｒａｎｋ検定によって確認された。しかしながら、ＬＣ１６ｍ８Δ群では、治療５６日後までに全てのマウスで腫瘍体積が２５００ｍｍ３に到達したため安楽死された。ＬＣ１６ｍＯ／ＬＧ、及びＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ　ｍｕｔ／ＬＧ群では、治療４９日後までに全身での発痘を伴う急激な体重減少によって全てのマウスが死亡、又は安楽死された。
　次に、ＢｘＰＣ３担癌マウスにおいて治療２７日、５２日後にルシフェリンを投与することによって、実施例４で記述したように、マウス体内でのウイルス増殖を非侵襲的にモニターした。その結果、ＬＣ１６ｍＯ／ＬＧとＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ　ｍｕｔ／ＬＧの投与マウスでは、治療２７日後に全身の正常組織でウイルス増殖が見られ、５２日後と時間経過に従ってウイルス増殖は増加し、それに伴う急激な体重減少が確認された。それに対しＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ／ＬＧの投与マウスでは、治療２７日後のウイルス増殖は移植した腫瘍塊のみに限局し、完全に腫瘍が消失したマウスを含め、正常組織におけるウイルス増殖は見られず、５２日後の腫瘍が消失したマウスではそのウイルス増殖も消失していた（図１５）。
　一方、ＢｘＰＣ−３細胞（５ｘ１０６個）をＳＣＩＤマウスの腹腔内に投与し、その７日後に１０７ｐｆｕの各ウイルスを腹腔内に投与した（各群１０匹）。その結果、ＬＣ１６ｍＯ／ＬＧ、又はＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ　ｍｕｔ／ＬＧ投与マウスでは、ウイルス投与無の模擬対照群マウスが腫瘍によって死亡、又は安楽死されるよりも早く、治療２４~４３日後までに全身での発痘を伴う急激な体重減少によって全てのマウスが死亡、又は安楽死された。それに対しＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ／ＬＧは、ＬＣ１６ｍＯ／ＬＧ、又はＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ　ｍｕｔ／ＬＧ投与マウスと比べて生存率における非常に有意な差がＬｏｇ−ｒａｎｋ検定によって確認されたが、最終的にはＬＣ１６ｍＯ／ＬＧ、又はＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ　ｍｕｔ／ＬＧ投与マウスで見られた同様のウイルス毒性によって全てのマウスが死亡、又は安楽死された。（図１７）。
　ＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ／ＬＧは、赤血球凝集素（ＨＡ）遺伝子に２種類の外来遺伝子（ホタルルシフェラーゼ遺伝子とＥＧＦＰ遺伝子）が挿入されている。そこで、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子に２種類の外来遺伝子を挿入することによって、組換えＴＫ欠失ｌｅｔ７ａ制御ウイルスＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ／ＬＧ　ＴＫ−を作製した。最初に、ＬＣ１６ｍＯ株のゲノムＤＮＡを鋳型として、２つのプライマー５’−ｃｇＣＡＧＣＴＧＡＧＣＴＴＴＴＧＣＧＡＴＣＡＡＴＡＡＡＴＧ−３’（配列番号８８）と５’−ＴＴＣＡＧＣＴＧＡＡＴＡＴＧＡＡＧＧＡＧＣＡＡ−３’（配列番号８９）によって、ＴＫ遺伝子領域を増幅した。そのＰＣＲ産物を制限酵素ＰｖｕＩＩで切断し、それをｐＵＣ１９ベクターの同じ制限酵素部位にクローニングし、ｐＴＫを構築した。さらに、２つの合成ＤＮＡ（５’−ａａｔｔｇｃａｔｇｃｇｔｃｇａｃａｔｔａａｔＧＧＣＣＧＧＡＣＣＧＧＣＣｔｔｃｇａａｇ−３’（配列番号９０）と５’−ａａｔｔｃｔｔｃｇａａＧＧＣＣＧＧＴＣＣＧＧＣＣａｔｔａａｔｇｔｃｇａｃｇｃａｔｇｃ−３’（配列番号９１））をアニールし、それを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断したｐＴＫにクローニングし、ｐＴＫ−ＭＳＣを構築した。合成ワクシニアウイルスプロモーター（Ｈａｍｍｏｎｄ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９７　６６：１３５−１３８）を挿入するため、２つの合成ＤＮＡ（５’−ＴＣＧＡａａｔｔｇｇａｔｃａｇｃｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｇｇｃａｔａｔａａａｔａａｇｇｔｃｇａＧＧＴＡＣＣａａａａａｔｔｇａａａａａｃｔａｔｔｃｔａａｔｔｔａｔｔｇｃａｃＧＧＣＣＧＧＡＣ−３’（配列番号９２）と５’−ＣＧＧＣＣｇｔｇｃａａｔａａａｔｔａｇａａｔａｇｔｔｔｔｔｃａａｔｔｔｔｔＧＧＴＡＣＣｔｃｇａｃｃｔｔａｔｔｔａｔａｔｇｃｃａａａａａａａａａａａａａａａａａａｇｃｔｇａｔｃｃａａｔｔ−３’（配列番号９３））をアニールし、それを制限酵素ＳｆｉＩとＳａｌＩで切断したｐＴＫ−ＭＳＣにクローニングし、ｐＴＫ−ＳＰ−ＭＳＣを構築した。ｐＶＮＣ１１０−Ｌｕｃ／ＩＲＥＳ／ＥＧＦＰプラスミドから制限酵素ＳｆｉＩとＥｃｏＲＩの切断によって獲得したＬｕｃ／ＩＲＥＳ／ＥＧＦＰ遺伝子断片を、ｐＴＫ−ＳＰ−ＭＳＣの同じ制限酵素部位にクローニングし、ｐＴＫ−ＳＰ−ＬＧを構築した。各組換えウイルス（図１８）は、参考例２で記述した方法を若干変更して、１４３細胞にワクシニアウイルス（実施例１で作出したＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ、又はＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ　ｍｕｔ）を感染させ、２５μｇ／ｍｌ　ＢＵｄＲ（ブロモデオキシウリディン）の存在下でトランスファーベクタープラスミドＤＮＡのｐＴＫ−ＳＰ−ＬＧを細胞に取り込ませることによって作出し、ＥＧＦＰの発現を目安にプラーク純化した後、ＰＣＲとダイレクトシーケンスにより確認した。塩基配列に問題が無いウイルスクローンを選択し、ＲＫ１３細胞にて大量培養した後、ＲＫ１３細胞にてウイルス力価を測定し、実験に供した。
　上述のように、ＢｘＰＣ−３細胞（５ｘ１０６個）をＳＣＩＤマウスの腹腔内に投与し、その７日後に１０７ｐｆｕの各ウイルスを腹腔内に投与した（各群５匹）。その結果、ＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ／ＬＧ　ＴＫ−は、ウイルス投与無の模擬対照群マウス、及びＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ／ＬＧ投与マウスと比べて生存率における非常に有意な差がＬｏｇ−ｒａｎｋ検定によって確認され、ウイルス毒性による副作用も見られなかった（図１９）。次に、２９日後にルシフェリンを投与することによって、実施例４で記述したように、マウス体内でのウイルス増殖を非侵襲的にモニターした。その結果、ＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ／ＬＧとＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ　ｍｕｔ／ＬＧ　ＴＫ−の投与マウスでは、正常組織におけるウイルス増殖が見られたが、ＬＣ１６ｍ８Δ−Ｂ５Ｒｌｅｔ７ａ／ＬＧ　ＴＫ−では、腹腔内の腫瘍のみに限局し、正常組織におけるウイルス増殖は見られなかった（図２０）。これより、ＨＡ遺伝子に比べてＴＫ遺伝子への外来遺伝子挿入は、マイクロＲＮＡ制御増殖型ワクシニアウイルスの治療指数を高めた。
　以上の結果より、担癌マウスモデルにおいて、マイクロＲＮＡ制御増殖型ワクシニアウイルスは強力な腫瘍溶解性による抗腫瘍効果と高い安全性を兼ね備えたウイルスであることが確認された。
　本発明のｍｉＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスは癌治療に用いることができる。
配列番号６５−７６、８５、８６、８８、８９　プライマー
配列番号７７−８４、９０−９３　合成
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (17)

  1. 　正常細胞に比べて癌細胞で発現が低下しているマイクロＲＮＡの標的配列を、ウイルス増殖に関るＢ５Ｒ遺伝子の３’非翻訳領域に挿入したワクシニアウイルスであって、前記癌細胞内で特異的に増殖し、癌細胞を特異的に破壊する腫瘍溶解性を有するマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルス。
  2. 　正常細胞で発現するマイクロＲＮＡによって、Ｂ５Ｒ遺伝子の発現が抑制され、正常細胞での増殖性が低下している、請求項１記載のマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルス。
  3. 　Ｂ５Ｒ遺伝子を部分的に又は完全に欠失した弱毒化ワクシニアウイルスに、３’非翻訳領域にマイクロＲＮＡの標的配列を挿入したＢ５Ｒ遺伝子を導入した、請求項１又は２に記載のマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルス。
  4. 　ワクシニアウイルスが、ＬＣ１６株又はＬＣ１６ｍＯ株である、請求項１又は２に記載のマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルス。
  5. 　ワクシニアウイルスが、Ｂ５Ｒ遺伝子を部分的に欠失したＬＣ１６ｍ８株又はＢ５Ｒ遺伝子を完全に欠失したｍ８Δ株である、請求項３記載のマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルス。
  6. 　正常細胞に比べて癌細胞で発現が低下しているマイクロＲＮＡが、ｌｅｔ−７ａ（配列番号１）、ｌｅｔ−７ｂ（配列番号２）、ｌｅｔ−７ｃ（配列番号３）、ｌｅｔ−７ｄ（配列番号４）、ｌｅｔ−７ｅ（配列番号５）、ｌｅｔ−７ｆ（配列番号６）、ｍｉＲ−９（配列番号７）、ｍｉＲ−１５ａ（配列番号８）、ｍｉＲ−１６−１（配列番号９）、ｍｉＲ−２１（配列番号１０）、ｍｉＲ−２０ａ（配列番号１１）、ｍｉＲ−２６ａ（配列番号１２）、ｍｉＲ−２７ｂ（配列番号１３）、ｍｉＲ−２９ａ（配列番号１４）、ｍｉＲ−２９ｂ（配列番号１５）、ｍｉＲ−２９ｃ（配列番号１６）、ｍｉＲ−３０ａ（配列番号１７）、ｍｉＲ−３０ｄ（配列番号１８）、ｍｉＲ−３２（配列番号１９）、ｍｉＲ−３３ａ（配列番号２０）、ｍｉＲ−３４ａ（配列番号２１）、ｍｉＲ−９２ａ（配列番号２２）、ｍｉＲ−９５（配列番号２３）、ｍｉＲ−１０１（配列番号２４）、ｍｉＲ−１２２（配列番号２５）、ｍｉＲ−１２４（配列番号２６）、ｍｉＲ−１２５ａ（配列番号２７）、ｍｉＲ−１２５ｂ（配列番号２８）、ｍｉＲ−１２６（配列番号２９）、ｍｉＲ−１２７（配列番号３０）、ｍｉＲ−１２８（配列番号３１）、ｍｉＲ−１３３ｂ（配列番号３２）、ｍｉＲ−１３９−５ｐ（配列番号３３）、ｍｉＲ−１４０（配列番号３４）、ｍｉＲ−１４１（配列番号３５）、ｍｉＲ−１４２（配列番号３６）、ｍｉＲ−１４３（配列番号３７）、ｍｉＲ−１４４（配列番号３８）、ｍｉＲ−１４５（配列番号３９）、ｍｉＲ−１５５（配列番号４０）、ｍｉＲ−１８１ａ（配列番号４１）、ｍｉＲ−１８１ｂ（配列番号４２）、ｍｉＲ−１８１ｃ（配列番号４３）、ｍｉＲ−１９２（配列番号４４）、ｍｉＲ−１９５（配列番号４５）、ｍｉＲ−１９８（配列番号４６）、ｍｉＲ−１９９ａ（配列番号４７）、ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ（配列番号４８）、ｍｉＲ−２００ａ（配列番号４９）、ｍｉＲ−２０３（配列番号５０）、ｍｉＲ−２０４（配列番号５１）、ｍｉＲ−２０５（配列番号５２）、ｍｉＲ−２１７（配列番号５３）、ｍｉＲ−２１８（配列番号５４）、ｍｉＲ−２１９−５ｐ（配列番号５５）、ｍｉＲ−２２０ａ（配列番号５６）、ｍｉＲ−２２０ｂ（配列番号５７）、ｍｉＲ−２２０ｃ（配列番号５８）、ｍｉＲ−２２２（配列番号５９）、ｍｉＲ−２２３（配列番号６０）、ｍｉＲ−２２４（配列番号６１）、ｍｉＲ−３４５（配列番号６２）、及びｍｉＲ−３７５（配列番号６３）からなる群から選択される、請求項１~５のいずれか１項に記載のマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルス。
  7. 　癌細胞において欠損した場合にはその機能欠損が補償され得るが、正常細胞では機能欠損が補償されない遺伝子の１つ又は複数を欠損させた、請求項１~６のいずれか１項に記載のマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルス。
  8. 　少なくともチミジンキナーゼ遺伝子を欠損させた、請求項７記載のマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルス。
  9. 　さらに、赤血球凝集素（ＨＡ）遺伝子を欠損させた、請求項８記載のマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルス。
  10. 　さらに、Ｆフラグメントを欠損させた、請求項９記載のマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルス。
  11. 　さらに、ＶＧＦ遺伝子を欠損させた、請求項８記載のマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルス。
  12. 　請求項１~１１のいずれか１項に記載のマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスを含む癌治療のための医薬組成物。
  13. 　請求項１~１２のいずれか１項に記載のマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスに外来ＤＮＡを導入した、マイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスベクター。
  14. 　外来ＤＮＡがマーカーＤＮＡ、細胞毒性効果若しくは免疫賦活効果を有する治療用遺伝子、又は癌、ウイルス、細菌若しくは原虫の抗原をコードするＤＮＡである、請求項１３記載のマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスベクター。
  15. 　請求項１３又は１４に記載のマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスベクターを含む癌治療のための、又は癌、ウイルス、細菌若しくは原虫に対するワクチンとして使用するための医薬組成物。
  16. 　請求項１~１１のいずれか１項に記載のマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスの癌患者における癌治療効果を評価する方法であって、
    （ｉ）　前記癌患者より採取した癌細胞及び正常細胞に前記マイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスを接触させる工程、及び
    （ｉｉ）　癌細胞及び正常細胞におけるマイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスの増殖を測定する工程
    を含み、前記マイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスが癌細胞で増殖し、正常細胞で増殖しない場合に、癌治療効果があると判断する方法。
  17. 　マイクロＲＮＡ制御型ワクシニアウイルスがＢ５Ｒ遺伝子とマーカー遺伝子の融合遺伝子を有し、マーカーの発現により、癌治療効果を評価する、請求項１６記載の方法。
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