JPWO2017209053A1 - 新規な遺伝子組換えワクシニアウイルス - Google Patents
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Abstract
[課題] 本発明は、がんの予防又は治療に有効的な遺伝子組換えワクシニアウイルスを提供する。
[解決手段]具体的には、本発明では、IL−7をコードするポリヌクレオチド及びIL−12をコードするポリヌクレオチドの2つのポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルス、IL−7をコードするポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルスとIL−12をコードするポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルスとの2つのワクシニアウイルスを含む組合せキット、並びに、前記2つのワクシニアウイルスの併用が提供される。
Description
1)IL−7をコードするポリヌクレオチド及びIL−12をコードするポリヌクレオチドの2つのポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルスは、担癌ヒト化マウスモデルにおいて腫瘍退縮作用を示し(実施例6)、同系担癌マウスモデルにおいて完全寛解を示し(実施例7)、さらに、獲得免疫を誘導して抗腫瘍効果を持続させ得た(実施例8)。また、2)IL−7をコードするポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルスとIL−12をコードするポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルスとの2つのワクシニアウイルスの混合物は、同系担癌マウスモデルにおいて完全寛解を示し(実施例7)、さらに、獲得免疫を誘導して抗腫瘍効果を持続させ得た(実施例8)。
[1]以下の(1)及び(2)を含む、ワクシニアウイルス:
(1)インターロイキン−7(IL−7)をコードするポリヌクレオチド;及び
(2)インターロイキン−12(IL−12)をコードするポリヌクレオチド。
[2]以下の(1)又は(2)から選択される医薬組成物:
(1)IL−7をコードするポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルスを含む医薬組成物と併用するための、IL−12をコードするポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルスを含む医薬組成物;又は
(2)IL−12をコードするポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルスを含む医薬組成物と併用するための、IL−7をコードするポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルスを含む医薬組成物。
[3]以下の(1)及び(2)のワクシニアウイルスを含む、組合せキット:
(1)IL−7をコードするポリヌクレオチドを含む、ワクシニアウイルス;及び
(2)IL−12をコードするポリヌクレオチドを含む、ワクシニアウイルス。
[4]ワクシニアウイルス増殖因子(VGF)の機能を欠損している、[1]に記載のワクシニアウイルス。
[5]O1Lの機能を欠損している、[1]に記載のワクシニアウイルス。
[6]VGF及びO1Lの機能を欠損している、[1]に記載のワクシニアウイルス。
[7]B5R細胞外領域のSCR(short consensus repeat)ドメインを欠失している、[1]に記載のワクシニアウイルス。
[8]VGF及びO1Lの機能を欠損し、かつ、B5R細胞外領域のSCRドメインを欠失している、[1]に記載のワクシニアウイルス。
[9]LC16mO株である、[1]及び[4]〜[8]のいずれかに記載のワクシニアウイルス。
[10][1]及び[4]〜[9]のいずれかに記載のワクシニアウイルス及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
[11]ワクシニアウイルスがVGFの機能を欠損している、[2]に記載の医薬組成物又は[3]に記載のキット。
[12]ワクシニアウイルスがO1Lの機能を欠損している、[2]に記載の医薬組成物又は[3]に記載のキット。
[13]ワクシニアウイルスがVGF及びO1Lの機能を欠損している、[2]に記載の医薬組成物又は[3]に記載のキット。
[14]ワクシニアウイルスがB5R細胞外領域のSCRドメインを欠失している、[2]に記載の医薬組成物又は[3]に記載のキット。
[15]ワクシニアウイルスがVGF及びO1Lの機能を欠損し、かつ、B5R細胞外領域のSCRドメインを欠失している、[2]に記載の医薬組成物又は[3]に記載のキット。
[16]ワクシニアウイルスがLC16mO株である、[2]及び[11]〜[15]のいずれかに記載の医薬組成物又は[3]及び[11]〜[15]のいずれかに記載のキット。
[17]薬学的に許容される賦形剤を含む、[2]及び[11]〜[16]のいずれかに記載の医薬組成物又は[3]及び[11]〜[16]のいずれかに記載のキット。
[18]がんの予防又は治療用である、[10]〜[17]のいずれかに記載の医薬組成物又はキット。
[19]がんが、悪性黒色腫、肺腺癌、肺癌、小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、腎癌、膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、食道癌、グリア芽細胞腫、神経芽細胞腫、骨髄腫、卵巣癌、大腸癌、膵癌、前立腺癌、肝細胞癌、中皮腫、子宮頸癌、又は、胃癌である、[18]に記載の医薬組成物又はキット。
[20]がんの予防又は治療を必要とする対象に[1]及び[4]〜[9]のいずれかに記載のワクシニアウイルスを投与する工程を包含する、がんを予防又は治療する方法。
[21]がんが、悪性黒色腫、肺腺癌、肺癌、小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、腎癌、膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、食道癌、グリア芽細胞腫、神経芽細胞腫、骨髄腫、卵巣癌、大腸癌、膵癌、前立腺癌、肝細胞癌、中皮腫、子宮頸癌、又は、胃癌である、[20]記載の方法。
[22]がんの予防又は治療に使用するための、[1]及び[4]〜[9]のいずれかに記載のワクシニアウイルス。
[23]がんが、悪性黒色腫、肺腺癌、肺癌、小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、腎癌、膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、食道癌、グリア芽細胞腫、神経芽細胞腫、骨髄腫、卵巣癌、大腸癌、膵癌、前立腺癌、肝細胞癌、中皮腫、子宮頸癌、又は、胃癌である、[22]記載のワクシニアウイルス。
[24]がんの予防又は治療用医薬組成物を製造するための、[1]及び[4]〜[9]のいずれかに記載のワクシニアウイルスの使用。
[25]がんが、悪性黒色腫、肺腺癌、肺癌、小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、腎癌、膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、食道癌、グリア芽細胞腫、神経芽細胞腫、骨髄腫、卵巣癌、大腸癌、膵癌、前立腺癌、肝細胞癌、中皮腫、子宮頸癌、又は、胃癌である、[24]記載の使用。
[26]がんの予防又は治療を必要とする対象に
(1)IL−7をコードするポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルス;及び
(2)IL−12をコードするポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルス
を投与する工程を包含する、がんを予防又は治療する方法。
[27]がんが、悪性黒色腫、肺腺癌、肺癌、小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、腎癌、膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、食道癌、グリア芽細胞腫、神経芽細胞腫、骨髄腫、卵巣癌、大腸癌、膵癌、前立腺癌、肝細胞癌、中皮腫、子宮頸癌、又は、胃癌である、[26]記載の方法。
[28]以下の(1)又は(2)から選択される、ワクシニアウイルス:
(1)IL−12をコードするポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルスを含む医薬組成物と併用してがんの予防又は治療に使用するための、IL−7をコードするポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルス;又は
(2)IL−7をコードするポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルスを含む医薬組成物と併用してがんの予防又は治療に使用するための、IL−12をコードするポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルス。
[29]がんが、悪性黒色腫、肺腺癌、肺癌、小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、腎癌、膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、食道癌、グリア芽細胞腫、神経芽細胞腫、骨髄腫、卵巣癌、大腸癌、膵癌、前立腺癌、肝細胞癌、中皮腫、子宮頸癌、又は、胃癌である、[28]記載のワクシニアウイルス。
[30]以下の(1)又は(2)から選択される、ワクシニアウイルスの使用:
(1)IL−12をコードするポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルスを含む医薬組成物と併用するがんの予防又は治療用医薬組成物を製造するための、IL−7をコードするポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルスの使用;又は
(2)IL−7をコードするポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルスを含む医薬組成物と併用するがんの予防又は治療用医薬組成物を製造するための、IL−12をコードするポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルスの使用。
[31]がんが、悪性黒色腫、肺腺癌、肺癌、小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、腎癌、膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、食道癌、グリア芽細胞腫、神経芽細胞腫、骨髄腫、卵巣癌、大腸癌、膵癌、前立腺癌、肝細胞癌、中皮腫、子宮頸癌、又は、胃癌である、[30]記載の使用。
[32]がんの予防又は治療用の組合せキットを製造するための、(1)IL−7をコードするポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルス及び(2)IL−12をコードするポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルスの使用。
[33]がんが、悪性黒色腫、肺腺癌、肺癌、小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、腎癌、膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、食道癌、グリア芽細胞腫、神経芽細胞腫、骨髄腫、卵巣癌、大腸癌、膵癌、前立腺癌、肝細胞癌、中皮腫、子宮頸癌、又は、胃癌である、[32]記載の使用。
本発明は、以下の(1)及び(2)を含む、ワクシニアウイルスを提供する:
(1)IL−7をコードするポリヌクレオチド;及び
(2)IL−12をコードするポリヌクレオチド。
(本明細書中、当該ワクシニアウイルスを「本発明のワクシニアウイルス」ともいう。)
(1)IL−7をコードするポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルスを含む医薬組成物と併用するための、IL−12をコードするポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルスを含む医薬組成物;又は
(2)IL−12をコードするポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルスを含む医薬組成物と併用するための、IL−7をコードするポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルスを含む医薬組成物。
(本明細書中、当該医薬組成物を「本発明の併用用医薬組成物」ともいい、上記(1)又は(2)に記載の本発明の併用用医薬組成物にそれぞれ含まれるIL−7をコードするポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルス又はIL−12をコードするポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルスを、「併用用ワクシニアウイルス」ともいう。)
(1)IL−7をコードするポリヌクレオチドを含む、ワクシニアウイルス;及び
(2)IL−12をコードするポリヌクレオチドを含む、ワクシニアウイルス。
(本明細書中、当該組合せキットを「本発明の組合せキット」ともいい、本発明の組合せキットに含まれる各ワクシニアウイルスを、「組合せキット用ワクシニアウイルス」ともいう。)
(1)Accession No.NP_000871.1に示されるアミノ酸配列を含み、かつ、ヒトIL−7の機能を有するポリペプチド、
(2)Accession No.NP_000871.1に示されるアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒトIL−7の機能を有するポリペプチド、並びに
(3)Accession No.NP_000871.1に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を含み、かつ、ヒトIL−7の機能を有するポリペプチド。
ここで、ヒトIL−7の機能とは、各種ヒト免疫細胞に対しての生存、増殖及び分化作用をいう。
(1)(1−a)Accession No.NP_002178.2に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、(1−b)Accession No.NP_002178.2に示されるアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は、(1−c)Accession No.NP_002178.2に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、並びに、
(2−a)Accession No.NP_000873.2に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、(2−b)Accession No.NP_000873.2に示されるアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は、(2−c)Accession No.NP_000873.2に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含み、かつ、
ヒトIL−12の機能を有するポリペプチド、
(2)(1−a)Accession No.NP_002178.2に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、並びに、
(2−a)Accession No.NP_000873.2に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、(2−b)Accession No.NP_000873.2に示されるアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は(2−c)Accession No.NP_000873.2に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含み、かつ、
ヒトIL−12の機能を有するポリペプチド、並びに、
(3)(1−a)Accession No.NP_002178.2に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、(1−b)Accession No.NP_002178.2に示されるアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は、(1−c)Accession No.NP_002178.2に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、並びに、
(2−a)Accession No.NP_000873.2に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、かつ、
ヒトIL−12の機能を有するポリペプチド。
ここで、ヒトIL−12の機能とは、T細胞やNK細胞の活性化作用、及び/又は分化誘導作用をいう。IL−12サブユニットp40及びIL−12サブユニットαは直接結合することでIL−12を形成することができる。また、IL−12サブユニットp40及びIL−12サブユニットαをリンカーを介して結合させることができる。
Gap penalty = 10
Extend penalty = 0.5
Matrix = EBLOSUM62
本発明の医薬組成物には、本発明のワクシニアウイルス及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物が含まれる。本発明の医薬組成物には、本発明の併用用医薬組成物も含まれる。1つの実施形態において、本発明の併用用医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤を含む。
本発明の医薬組成物は、がん、例えば、悪性黒色腫、肺腺癌、肺癌、小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、腎癌、膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、食道癌、グリア芽細胞腫、神経芽細胞腫、骨髄腫、卵巣癌、大腸癌、膵癌、前立腺癌、肝細胞癌、中皮腫、子宮頸癌、及び、胃癌等からなる群から選択されるがんの予防又は治療剤として用いることができる。
(1)IL−7をコードするポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルス;及び
(2)IL−12をコードするポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルス。
当該2つのワクシニアウイルスは、同時に、別々に、連続して、あるいは間隔をあけて、対象に投与してよい。
(1)IL−12をコードするポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルスを含む医薬組成物と併用してがんの予防又は治療に使用するための、IL−7をコードするポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルス;又は
(2)IL−7をコードするポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルスを含む医薬組成物と併用してがんの予防又は治療に使用するための、IL−12をコードするポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルス。
(1)IL−12をコードするポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルスを含む医薬組成物と併用するがんの予防又は治療用医薬組成物を製造するための、IL−7をコードするポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルスの使用;又は
(2)IL−7をコードするポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルスを含む医薬組成物と併用するがんの予防又は治療用医薬組成物を製造するための、IL−12をコードするポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルスの使用。
相同組換え法により組換えワクシニアウイルスを作製するために使用するトランスファーベクタープラスミドDNAを以下の通りに作製した。
国際公開第2015/076422号に基づいてpUC19−VGFベクターを作製した。より具体的には、pUC19−VGFベクター作製のために、LC16mO株のゲノムDNA(Accession No.AY678277.1)を鋳型に使用し、Invitrogen社のpUC19ベクター(製品コード:54357)を使用した。作製したpUC19−VGFベクターを制限酵素AccIで切断した後、末端を平滑化した。この切断部位に、p7.5kプロモーターとDsRed断片とを含むDNA断片(配列番号22)を挿入することで、トランスファーベクタープラスミドDNAを構築した。構築したプラスミドDNAをpTN−VGF−P−DsRedと称する。
(2)pTN−VGF−SP−IL12及びpTN−VGF−SP−IL7トランスファーベクタープラスミドDNAの構築
pTagBFP−N vector(FP172、Evrogen社)のDNAを鋳型として、2つのプライマー(配列番号1及び配列番号2)によってBFP遺伝子領域を増幅した。そのPCR産物を制限酵素SfiI及びEcoRIで切断し、pTK−SP−LGベクター(国際公開第2015/076422号。但し、LC16mO株のゲノムDNA(Accession No.AY678277.1)を鋳型に使用し、Invitrogen社のpUC19ベクター(製品コード:54357)を使用した。また、pVNC110−Luc/IRES/EGFPプラスミドは国際公開第2011/125469号に記載のpVNC110−Luc/IRES/EGFPを使用した。)の同じ制限酵素部位にクローニングし、合成ワクシニアウイルスプロモーター(Journal of Virological Methods、1997、Vol.66、p.135−138)下にBFPを連結したpTK−SP−BFPを構築した。次に、pTK−SP−BFPを制限酵素SphI及びEcoRIで切断し、末端を平滑化した。こうして得られたDNA断片を、pUC19−VGFベクターを制限酵素AccIで切断し末端を平滑化した部位へクローニングすることで、pTN−VGF−SP−BFPを構築した(図1)。次に、ヒトIL−12をコードするポリヌクレオチド(ヒトIL−12サブユニットp40、内部リボソーム導入部位及びヒトIL−12サブユニットαを含むポリヌクレオチド。配列番号7)、及びヒトIL−7をコードするポリヌクレオチド(配列番号8)(各ポリヌクレオチドは、5’側に制限酵素サイトaccggtcgccacc(配列番号16)及び3’側に制限酵素サイトgctagcgaattc(配列番号17)をそれぞれ含む)を制限酵素AgeIとNheIで切断した。各ポリヌクレオチド断片をpTN−VGF−SP−BFPの同じ制限酵素部位にクローニングすることで、トランスファーベクタープラスミドDNAを構築した。構築したプラスミドDNAをそれぞれpTN−VGF−SP−IL12及びpTN−VGF−SP−IL7と称する。
(3)pTN−O1L−SP−BFP、pTN−O1L−SP−LacZ、pTN−O1L−SP−IL12、及びpTN−O1L−SP−IL7トランスファーベクタープラスミドDNAの構築
上記(2)と同様の方法で、pTK−SP−BFPを制限酵素SphI及びEcoRIで切断し、末端を平滑化して得られたDNA断片を、pUC19−O1Lベクター(国際公開第2015/076422号。但し、pUC19−VGFベクター作製と同様に、LC16mO株のゲノムDNA(Accession No.AY678277.1)を鋳型に使用し、Invitrogen社のpUC19ベクター(製品コード:54357)を使用した。O1L遺伝子領域はpUC19ベクターのXbaIサイトに挿入した。)を制限酵素XbaIで切断し末端を平滑化した部位へクローニングすることで、トランスファーベクタープラスミドDNAを作製した(図1)。作製したプラスミドDNAをpTN−O1L−SP−BFPと称する。次に、ヒトに対してコドンを最適化した大腸菌LacZ遺伝子を含むポリヌクレオチド(配列番号9)、ヒトIL−12をコードするポリヌクレオチド(配列番号7)、及びヒトIL−7をコードするポリヌクレオチド(配列番号8)を制限酵素AgeIとNheIで切断した。LacZ、IL−12、又はIL−7をコードする各ポリヌクレオチド断片をpTN−O1L−SP−BFPベクターの同じ制限酵素部位(AgeI部位及びNheI部位)にクローニングすることで、トランスファーベクタープラスミドDNAを構築した。構築したプラスミドDNAをそれぞれpTN−O1L−SP−LacZ、pTN−O1L−SP−IL12、及びpTN−O1L−SP−IL7と称する。
pB5R(国際公開第2011/125469号。但し、LC16mO株のゲノムDNA(Accession No.AY678277.1)を鋳型に使用した)のDNAを鋳型として、2つのプライマー(配列番号3及び配列番号4)によってB4R遺伝子領域を増幅した。また、pDsRed−Express−N1(Clontech社)のDNAを鋳型として、2つのプライマー(配列番号5及び配列番号6)によってDsRed遺伝子領域を増幅した。前者のPCR産物を制限酵素NotI及びFspIで、後者のPCR産物を制限酵素FspI及びMfeIで切断した。この2種類のDNA断片を、制限酵素NotI及びMfeIで切断したpB5Rにクローニングすることで、トランスファーベクタープラスミドDNAを作製した。作製したプラスミドDNAをpTN−DsRed(B5R−)と称する。一方、pB5Rを制限酵素NotI及びNspIで、又は制限酵素NspI及びSacIで切断した。この2種類のDNA断片を、制限酵素NotIとSacIで切断したpB5Rにクローニングすることで、トランスファーベクタープラスミドDNAを構築した。作製したプラスミドDNAをpTN−B5RΔ1−4と称する。pTN−B5RΔ1−4には4つのSCRドメインが欠失したB5R蛋白質がコードされる。当該アミノ酸配列は配列番号18に示した配列となる。
(4−1)具体的には、実施例2(2)で作製したLC16mO ΔSCR VGF−p7.5−DsRed/O1L−SP−BFP及び実施例1(2)で構築したトランスファーベクタープラスミドDNA pTN−VGF−SP−IL12を用いて、BFP発現の代わりにDsRed発現消失を指標に、実施例2(1)と同様の方法にて各組換えウイルスを回収した。回収したウイルスをLC16mO ΔSCR VGF−SP−IL12/O1L−SP−BFPと称する。
実施例2で作製されたhIL12及びhIL7搭載ワクシニアウイルスについて、各種ヒトがん細胞における溶解能力(細胞死滅能力)を評価した。また、実施例2で作製されたhIL12搭載ワクシニアウイルスとhIL7搭載ワクシニアウイルスとの2種類の組合せ混合物についても、同様に各種ヒトがん細胞における溶解能力を評価した。
hIL12及びhIL7搭載ワクシニアウイルスをがん細胞に感染させた際に、がん細胞から産生されるヒトIL−7蛋白質及びヒトIL−12蛋白質の濃度を測定した。さらに、hIL12搭載ワクシニアウイルスとhIL7搭載ワクシニアウイルスとの混合物についても同様に、がん細胞に感染させた際にがん細胞から産生されるヒトIL−7蛋白質及びヒトIL−12蛋白質の濃度を測定した。
(1)実施例1(2)に記載の方法に従い、トランスファーベクタープラスミドDNA pTN−VGF−SP−mIL12を構築した。実施例1(2)に記載の方法において、ヒトIL−12をコードするポリヌクレオチド(配列番号7)に代えて、マウスIL−12をコードするポリヌクレオチド(マウスIL−12サブユニットp40、内部リボソーム導入部位及びマウスIL−12サブユニットαを含むポリヌクレオチド。配列番号23)を用い、このポリヌクレオチド断片をpTN−VGF−SP−BFPにクローニングした。
(2)実施例1(3)に記載の方法に従い、トランスファーベクタープラスミドDNA pTN−O1L−SP−Luc2を構築した。実施例1(3)に記載の方法において、大腸菌LacZ遺伝子を含むポリヌクレオチド(配列番号9)に代えて、ルシフェラーゼLuc2遺伝子をコードするポリヌクレオチド(Accession No.DQ188840の100番目から1752番目)を用い、このポリヌクレオチド断片をpTN−O1L−SP−BFPにクローニングした。
さらに、実施例2(4−2)の方法に従い、組換えウイルスを回収した。実施例2(4−2)の方法において、LC16mO ΔSCR VGF−SP−IL12/O1L−SP−BFPに代えて上記で作製したLC16mO ΔSCR VGF−SP−mIL12/O1L−SP−BFPと、pTN−O1L−SP−IL7とを用いた。回収したウイルスをLC16mO ΔSCR VGF−SP−mIL12/O1L−SP−IL7と称する(以下、「mIL12及びhIL7搭載ワクシニアウイルス」とも称する。)。
hIL12及びhIL7搭載ワクシニアウイルスについて、ヒト癌細胞を移植したヒト化マウス(重度免疫不全マウスにヒト造血幹細胞を移入することで免疫系をヒト免疫細胞に置き換えたマウス)を用いて、生体内における抗腫瘍効果を評価した。
ウイルス投与後14日の腫瘍体積変化率(%)=100(%)×ウイルス投与後14日の腫瘍体積(mm3)/ウイルス投与日の腫瘍体積(mm3)。
ウイルス投与後14日の腫瘍体積変化率(%)の各群の平均値が100を下回り、かつ、各群のウイルス投与後14日の腫瘍体積とウイルス投与日の腫瘍体積をPaired t−testにて検定し有意差(p値<0.05を有意差ありとする)が認められる場合に、腫瘍退縮効果ありと判定した。
なお本実施例では、hIL12及びhIL7搭載ワクシニアウイルス(2×106PFU/個体)に対する比較ウイルスとして、同じ注射量(20μL)及び希釈溶液(PBS)で、対照ワクシニアウイルス(2×106PFU/個体)、hIL12搭載ワクシニアウイルス(2×106PFU/個体)、又はhIL7搭載ワクシニアウイルス(2×106PFU/個体)を用いた(表中、それぞれ、「対照VV投与群」、「hIL12搭載VV投与群」、「hIL7搭載VV投与群」とする。)。
mIL12及びhIL7搭載ワクシニアウイルスについて、同系のマウス癌細胞株を皮下移植したマウス(同系担癌マウス)を用いて生体における完全寛解導入効果を評価した。なお、ヒトIL−12はマウスの免疫細胞に対して反応しないことが知られているため、ヒトIL−12をコードするポリヌクレオチドに代えてマウスIL−12をコードするポリヌクレオチドを搭載した遺伝子組換えワクシニアウイルス(実施例5で作製)を用いた。
ノギスで腫瘍径を週に2回測定して腫瘍体積を算出した。最終的にウイルス初回投与の27日後の観察で、触診によって腫瘍が認められない場合を完全寛解と定義し、完全寛解を示した個体の数を計測した。試験期間中に群の平均腫瘍体積が1700mm3を超えた群に関しては、動物倫理上の観点から安楽死させた。なお本実施例では、mIL12及びhIL7搭載ワクシニアウイルス(2×107PFU/回、3回投与)に対する比較ウイルスとして、同じ注射量(30μL/1回投与)及び希釈溶液(PBS)で、対照ワクシニアウイルス、mIL12搭載ワクシニアウイルス、又はhIL7搭載ワクシニアウイルス(それぞれ、2×107PFU/回、3回投与)を用いた(表中、それぞれ、「対照VV投与群」、「mIL12搭載VV投与群」、「hIL7搭載VV投与群」とする。)。
mIL12搭載ワクシニアウイルスとhIL7搭載ワクシニアウイルスとの1対1混合物(以下、「mIL12搭載ワクシニアウイルスとhIL7搭載ワクシニアウイルスとの混合物」)について、同系担癌マウスを用いて生体における完全寛解導入効果を評価した。
(1)mIL12及びhIL7搭載ワクシニアウイルスについて:
mIL12及びhIL7搭載ワクシニアウイルスを処置した結果完全寛解したマウスに対して同癌細胞の再移植実験を行い、ウイルスによる獲得免疫効果を評価した。
mIL12搭載ワクシニアウイルスとhIL7搭載ワクシニアウイルスとの混合物を処置した結果完全寛解したマウスに対して同癌細胞の再移植実験を行い、獲得免疫効果を評価した。
したがって本実施例により、mIL12搭載ワクシニアウイルスとhIL7搭載ワクシニアウイルスとの混合物の投与による獲得免疫効果が確認された。
配列番号1〜6及び10〜15で示されるヌクレオチド配列はプライマーである。
配列番号7、8及び9で示される塩基配列は、それぞれ、ヒトIL−12遺伝子を含むポリヌクレオチド、ヒトIL−7遺伝子を含むポリヌクレオチド及び大腸菌LacZ遺伝子を含むポリヌクレオチドである。配列番号7において、14番目〜1000番目の塩基配列がIL−12のp40サブユニットをコードする領域に対応し、1606番目〜2367番目の塩基配列がIL−12のサブユニットαをコードする領域に対応する。
配列番号16及び17で示されるヌクレオチド配列は配列番号7〜9の各遺伝子コード領域に連結された制限酵素サイトである。
配列番号18で示されるアミノ酸配列は、4つのSCRドメインが欠失したB5R蛋白質である。
配列番号19、20で示される塩基配列は、LC16mO VGF−SP−LucGFP/O1L−p7.5−DsRedの両末端ループ配列の配列である。
配列番号21で示される塩基配列はLC16mO VGF−SP−LucGFP/O1L−p7.5−DsRedの両末端ループ配列を除く配列である。
配列番号22で示される塩基配列はp7.5kプロモーターとDsRed断片とを含むDNA断片である。
配列番号23で示される塩基配列はマウスIL−12遺伝子を含むポリヌクレオチドである。
Claims (33)
- 以下の(1)及び(2)を含む、ワクシニアウイルス:
(1)インターロイキン−7(IL−7)をコードするポリヌクレオチド;及び
(2)インターロイキン−12(IL−12)をコードするポリヌクレオチド。 - 以下の(1)又は(2)から選択される医薬組成物:
(1)IL−7をコードするポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルスを含む医薬組成物と併用するための、IL−12をコードするポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルスを含む医薬組成物;又は
(2)IL−12をコードするポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルスを含む医薬組成物と併用するための、IL−7をコードするポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルスを含む医薬組成物。 - 以下の(1)及び(2)のワクシニアウイルスを含む、組合せキット:
(1)IL−7をコードするポリヌクレオチドを含む、ワクシニアウイルス;及び
(2)IL−12をコードするポリヌクレオチドを含む、ワクシニアウイルス。 - ワクシニアウイルス増殖因子(VGF)の機能を欠損している、請求項1に記載のワクシニアウイルス。
- O1Lの機能を欠損している、請求項1に記載のワクシニアウイルス。
- VGF及びO1Lの機能を欠損している、請求項1に記載のワクシニアウイルス。
- B5R細胞外領域のSCR(short consensus repeat)ドメインを欠失している、請求項1に記載のワクシニアウイルス。
- VGF及びO1Lの機能を欠損し、かつ、B5R細胞外領域のSCRドメインを欠失している、請求項1に記載のワクシニアウイルス。
- LC16mO株である、請求項1及び4〜8のいずれかに記載のワクシニアウイルス。
- 請求項1及び4〜9のいずれかに記載のワクシニアウイルス及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
- ワクシニアウイルスがVGFの機能を欠損している、請求項2に記載の医薬組成物又は請求項3に記載のキット。
- ワクシニアウイルスがO1Lの機能を欠損している、請求項2に記載の医薬組成物又は請求項3に記載のキット。
- ワクシニアウイルスがVGF及びO1Lの機能を欠損している、請求項2に記載の医薬組成物又は請求項3に記載のキット。
- ワクシニアウイルスがB5R細胞外領域のSCRドメインを欠失している、請求項2に記載の医薬組成物又は請求項3に記載のキット。
- ワクシニアウイルスがVGF及びO1Lの機能を欠損し、かつ、B5R細胞外領域のSCRドメインを欠失している、請求項2に記載の医薬組成物又は請求項3に記載のキット。
- ワクシニアウイルスがLC16mO株である、請求項2及び11〜15のいずれかに記載の医薬組成物又は請求項3及び11〜15のいずれかに記載のキット。
- 薬学的に許容される賦形剤を含む、請求項2及び11〜16のいずれかに記載の医薬組成物又は請求項3及び11〜16のいずれかに記載のキット。
- がんの予防又は治療用である、請求項10〜17のいずれかに記載の医薬組成物又はキット。
- がんが、悪性黒色腫、肺腺癌、肺癌、小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、腎癌、膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、食道癌、グリア芽細胞腫、神経芽細胞腫、骨髄腫、卵巣癌、大腸癌、膵癌、前立腺癌、肝細胞癌、中皮腫、子宮頸癌、又は、胃癌である、請求項18に記載の医薬組成物又はキット。
- がんの予防又は治療を必要とする対象に請求項1及び4〜9のいずれかに記載のワクシニアウイルスを投与する工程を包含する、がんを予防又は治療する方法。
- がんが、悪性黒色腫、肺腺癌、肺癌、小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、腎癌、膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、食道癌、グリア芽細胞腫、神経芽細胞腫、骨髄腫、卵巣癌、大腸癌、膵癌、前立腺癌、肝細胞癌、中皮腫、子宮頸癌、又は、胃癌である、請求項20記載の方法。
- がんの予防又は治療に使用するための、請求項1及び4〜9のいずれかに記載のワクシニアウイルス。
- がんが、悪性黒色腫、肺腺癌、肺癌、小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、腎癌、膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、食道癌、グリア芽細胞腫、神経芽細胞腫、骨髄腫、卵巣癌、大腸癌、膵癌、前立腺癌、肝細胞癌、中皮腫、子宮頸癌、又は、胃癌である、請求項22記載のワクシニアウイルス。
- がんの予防又は治療用医薬組成物を製造するための、請求項1及び4〜9のいずれかに記載のワクシニアウイルスの使用。
- がんが、悪性黒色腫、肺腺癌、肺癌、小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、腎癌、膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、食道癌、グリア芽細胞腫、神経芽細胞腫、骨髄腫、卵巣癌、大腸癌、膵癌、前立腺癌、肝細胞癌、中皮腫、子宮頸癌、又は、胃癌である、請求項24記載の使用。
- がんの予防又は治療を必要とする対象に
(1)IL−7をコードするポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルス;及び
(2)IL−12をコードするポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルスを投与する工程を包含する、がんを予防又は治療する方法。 - がんが、悪性黒色腫、肺腺癌、肺癌、小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、腎癌、膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、食道癌、グリア芽細胞腫、神経芽細胞腫、骨髄腫、卵巣癌、大腸癌、膵癌、前立腺癌、肝細胞癌、中皮腫、子宮頸癌、又は、胃癌である、請求項26記載の方法。
- 以下の(1)又は(2)から選択される、ワクシニアウイルス:
(1)IL−12をコードするポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルスを含む医薬組成物と併用してがんの予防又は治療に使用するための、IL−7をコードするポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルス;又は
(2)IL−7をコードするポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルスを含む医薬組成物と併用してがんの予防又は治療に使用するための、IL−12をコードするポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルス。 - がんが、悪性黒色腫、肺腺癌、肺癌、小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、腎癌、膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、食道癌、グリア芽細胞腫、神経芽細胞腫、骨髄腫、卵巣癌、大腸癌、膵癌、前立腺癌、肝細胞癌、中皮腫、子宮頸癌、又は、胃癌である、請求項28記載のワクシニアウイルス。
- 以下の(1)又は(2)から選択される、ワクシニアウイルスの使用:
(1)IL−12をコードするポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルスを含む医薬組成物と併用するがんの予防又は治療用医薬組成物を製造するための、IL−7をコードするポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルスの使用;又は
(2)IL−7をコードするポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルスを含む医薬組成物と併用するがんの予防又は治療用医薬組成物を製造するための、IL−12をコードするポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルスの使用。 - がんが、悪性黒色腫、肺腺癌、肺癌、小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、腎癌、膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、食道癌、グリア芽細胞腫、神経芽細胞腫、骨髄腫、卵巣癌、大腸癌、膵癌、前立腺癌、肝細胞癌、中皮腫、子宮頸癌、又は、胃癌である、請求項30記載の使用。
- がんの予防又は治療用の組合せキットを製造するための、(1)IL−7をコードするポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルス及び(2)IL−12をコードするポリヌクレオチドを含むワクシニアウイルスの使用。
- がんが、悪性黒色腫、肺腺癌、肺癌、小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、腎癌、膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、食道癌、グリア芽細胞腫、神経芽細胞腫、骨髄腫、卵巣癌、大腸癌、膵癌、前立腺癌、肝細胞癌、中皮腫、子宮頸癌、又は、胃癌である、請求項32記載の使用。
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