JPWO2017014296A1 - ワクシニアウイルスの増殖・伝搬を増強する宿主制御因子 - Google Patents
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Abstract
Description
[1] 癌患者の癌細胞におけるUCA1遺伝子の発現を測定し、UCA1遺伝子が発現している場合に、該患者においてワクシニアウイルスによる癌治療効果があると予測する、ワクシニアウイルスによる癌治療効果を予測評価する方法。
[2] ワクシニアウイルスが、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスである、[1]の方法。
[3] ワクシニアウイルスが、LC16株、LC16mO株又はB5R遺伝子が発現するように改変されたLC16m8株である、[1]又は[2]の方法。
[4] UCA1遺伝の発現をRT-PCRにより測定する、[1]〜[3]のいずれかの方法。
[5] UCA1遺伝子を発現可能に導入した、ワクシニアウイルス。
[6] 癌細胞中でUCA1遺伝子を発現させ、UCA1の制御により癌細胞中で増殖する、[5]のワクシニアウイルス。
[7] 腫瘍溶解性ワクシニアウイルスである、[5]又は[6]のワクシニアウイルス。
[8] ワクシニアウイルスが、LC16株、LC16mO株又はB5R遺伝子が発現するように改変されたLC16m8株である、[5]〜[7]のいずれかのワクシニアウイルス。
[9] [5]〜[8]のいずれかのワクシニアウイルスを含む癌治療のための医薬組成物。
[10] UCA1遺伝子を発現可能に導入した発現ベクター及びワクシニアウイルスを組合せて含む、癌治療のための医薬組成物キット。
[11] ワクシニアウイルスが、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスである、[10]の癌治療のための医薬組成物キット。
[12] ワクシニアウイルスが、LC16株、LC16mO株又はB5R遺伝子が発現するように改変されたLC16m8株である、[10]又は[11]の癌治療のための医薬組成物キット。 本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2015-145153号の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。
KFtx (PTx-resistant KF)は抗がん剤PTx(パクリタキセル)が含まれていないRPMI,10%FBS培地で培養を続けるとPTx耐性能が低下する。このPTx耐性能が低下した株をLowとする。Lowを次に62.5nM PTx in RPMI培地で培養を行うとPTx耐性能が回復する。このPTx耐性能が回復した株をLowTxとする(図1)。また、LowTxをPTxなしで培養すると耐性能が低下することから、この耐性能は可逆的であるといえる。
KFtx、Low、LowTxの3者間でマイクロアレイ(タカラバイオ)による遺伝子発現の網羅的な解析を行った。ウイルス増殖、抗がん剤耐性が高い細胞株で発現が亢進され、ウイルス増殖、抗がん剤耐性が低い細胞株で発現が抑制されている遺伝子を候補遺伝子として抽出した。図3にマイクロアレイによる遺伝子発現の網羅的な解析の結果を示す。図3は、KFtx、LowTx及びLow間の発現が亢進され、又は発現が抑制されている遺伝子の遺伝子解析の結果を示す。候補遺伝子として抽出されたUCA1はLong-non coding RNAであり、卵巣癌、膀胱癌、胃癌など、他の様々な癌種においてもoncogeneとして同定されている。このUCA1の安定発現株を作成するためにKFtxからNucleoSpinRNA(タカラバイオ)を用いて、そのマニュアルに従いRNAを抽出した。このRNAをHigh-Capacity cDNA Reverse Transcription Kitを用い、マニュアルに従いRT-PCR(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)によりcDNAを作成した。cDNAを鋳型に2つのプライマー5’-ctggatcctgacattcttctggacaatgag-3’(配列番号4)と5’-ctgcggccgcatattagctttaatgtaggtggc-3’(配列番号5)によって、両末端にBamH1とNot1の制限酵素サイトを付加したUCA1遺伝子を増幅した。両末端にBamH1とNot1の制限酵素サイトを付加したUCA1遺伝子の配列を配列番号3に示す。配列番号3の配列における7番目のtから1414番目のcまでがUCA1遺伝子の配列であり、配列番号1の1番目から1408番目の塩基に相当する。ただし、配列番号1の797番目のaがtに変異している。このPCR産物をBamH1とNot1で切断し、pcDNA3.1(+)の同じ制限酵素部位にクローニングしてpcDNA3.1(+)- UCA1を取得した。次に24wellに播種したLow、LowTxにpcDNA3.1(+)-UCA1とネガティブコントロールであるpcDNA3.1(+)をFugeneHD(Promega社)とProFection Mammalian Transfection System(Promega社)(リン酸カルシウムを使用)を用いてトランスフェクションを行った。pcDNA3.1(+)-UCA1によりUCA1遺伝子をトランスフェクションしたLowTxをUCA1 LowTxと呼び、pcDNA3.1(+)-UCA1によりUCA1遺伝子をトランスフェクションしたLowをUCA1 Lowと呼ぶ。また、UCA1を含まないpcDNA3.1(+)をトランスフェクションしたLowTxをEmpty LowTxと呼び、UCA1を含まないpcDNA3.1(+)をトランスフェクションしたLowをEmpty Lowと呼ぶ。UCA1 LowTx及びEmpty LowTxに対しては、FugeneHDを用い、UCA1 Low及びLowに対しては、リン酸カルシウムを用いた。その後、Geneticinによりセレクションを行い、UCA1安定発現株を取得した。図4にUCA1遺伝子のトランスフェクションの方法を示す。このUCA1安定発現株に対してUCA1の発現増強を確認するために、qRT-PCRを行った。各細胞からRNAをNucleoSpinRNAにより抽出し、抽出したRNAからRT-PCR(Reverse Transcription PCR)によりcDNAを作成し、TaqMan probe(Life Technologies, Assay ID: Hs01909129_s1)を用いて、qRT-PCRを実施した(n=3)。リファレンス遺伝子にはGAPDH(Life Technologies, Assay ID: Hs03929097_g1)を選択した。UCA1の相対発現量は、GAPDHを基準に比較Ct法を用いて算出した。UCA1の安定発現株ではKFtxと同等のUCA1の発現を確認することができた。一方、ネガティブコントロールであるpcDNA3.1(+)の安定発現株ではUCA1の発現が増強されていないことが確認された(図5)。
UCA1の安定発現株を含むKFtxシリーズにおいてパクリタキセル(Paclitaxel)耐性能を比較した。KFtxシリーズを6×103/wellで96wellに播種し、細胞がプレートに生着したと考えられる37℃、12hr培養後に、PTxを含有したRPMIでメディウムチェンジを行った。PTxの濃度は、0、2、5、20、50、100、200、500nMであった。さらに、37℃、48hr培養後にcell titer glo (Promega社)により生細胞数を定量化し、比較した。その結果、UCA1の発現が低いLowとEmpty Lowのみ有意に生細胞数が減少していることが分かった(図6)。このことから、UCA1の高発現はパクリタキセル耐性能において重要であることが考えられた。
UCA1によるワクシニアウイルスの増殖能の増強を詳細に解析した。ERKの活性化はワクシニアウイルスの増殖能を増強するという報告があることから、ERKの活性化とUCA1の高発現の関係を比較した。KFtxシリーズを6×103/wellで96wellに播種し、37℃、36hr培養後にPierce Colorimetric In-Cell ELISA Kitsにより総ERKとその中で活性化しているERK(リン酸化 ERK)を計測した(図8)。その結果、Low、Empty Lowではリン酸化ERKの割合が低くUCA1の発現が上昇するにしたがってリン酸化ERKの割合も上昇した。すなわち、UCA1の発現と比例するようにリン酸化 ERKの割合が変動していた。さらに、ERKはウイルスの増殖・伝搬能に関わるため、UCA1はERKの活性化を制御することでウイルスの増殖を調節すること、すなわちUCA1の高発現がワクシニアウイルスの増殖能だけではなく、ERKの活性化にも関与することが示唆された。
UCA1の高発現がワクシニアウイルスの増殖能を増強する現象をKFtxシリーズ以外の細胞株で検証した。6wellにSHIN3、OVCAR3、RMG-1、SKOV3、ES2の5種を播種した。37℃、36hr後に各細胞からRNAをNucleoSpinRNAで抽出回収し、RT-PCRによりcDNAを作成した。そのcDNAを鋳型としてTaqManプローブ(Life Technologies, Assay ID: Hs01909129_s1)を用いたqRT-PCRによりUCA1の発現を定量化した(n=3)。なお、リファレンス遺伝子はGAPDH(Life Technologies, Assay ID: Hs03929097_g1)を用いた。UCA1の相対発現量は、GAPDHを基準に比較Ct法を用いて算出した。その結果、細胞株間でUCA1の発現の差が示された。(図10)。
(1) KFtxシリーズにおけるウイルスの感染像及びウイルスGFP蛍光の定量化 UCA1の高発現とKFtxシリーズにおけるワクシニアウイルスの増殖能を比較した。KFtxシリーズ(Low、UCA1 Low、Empty Low、KFtx、LowTx、UCA1 LowTx及びEmpty LowTx)を6×103/wellの細胞密度で96wellに播種し、37℃、36hr培養後にVGF+/O1L+をMOI=0.01で感染させた(n=3)。37℃で培養を行い、感染から72hr後にキーエンスの蛍光顕微鏡BZ-X710で生細胞のまま蛍光観察を行うと共に、蛍光強度を数値化した。感染像を図12−1に示し、蛍光の定量化の結果を図12−2に示す。図12−1に示すように、UCA1 Low及びUCA1 LowTxで蛍光強度が強く、UCA1の発現量とウイルスの増殖及び伝播能は正の相関を示していた。また、図12−2に示すように、GFPの蛍光強度は蛍光顕微鏡による観察像と一致していた。
UCA1の高発現とKFtxシリーズにおけるワクシニアウイルスの増殖能を経時的に比較した。KFtxシリーズ(Low、UCA1 Low、Empty Low、KFtx、LowTx、UCA1 LowTx及びEmpty LowTx)を6×103/wellの細胞密度で96wellに播種し、37℃、36hr培養後にVGF+/O1L+をMOI=0.01で感染させた(n=3)。37℃で培養を行い、感染から12hr〜72hr後まで12hr毎にキーエンスの蛍光顕微鏡BZ-X710で生細胞のまま明視野観察と蛍光観察を行った。感染像を図13に示す。図13に示すように、UCA1の発現とワクシニアウイルスの増殖能は正の相関を示すことが経時的に確認された。
UCA1の発現量とウイルスの増殖能を経時的に比較した。KFtxシリーズ(Low、UCA1 Low、Empty Low)を3×104/wellの細胞密度で24wellに播種し、37℃、36hr培養後にVGF+/O1L+をMOI=0.01で感染させた。さらに感染の直前と感染から12hr、24hr、36hr、48hr後にRNAを回収し、RT-PCRによりcDNAを作製した。RNAの抽出回収はNucleoSpinRNAにより行い、cDNAの作製は、RT-PCR(Reverse Transcription PCR)で行った。得られたcDNAを鋳型としてTaqManプローブを用いたqRT-PCRによりUCA1の発現を定量化した(n=3)。なお、リファレンス遺伝子はGAPDHを用いた。UCA1の相対発現量は、GAPDHを基準に比較Ct法を用いて算出した。図14に結果を示す。図14に示すように、UCA1の高発現株において、UCA1の発現量はウイルス増殖に伴って増強されることが分かった。
ワクシニウイルスはIMV(細胞内成熟ウイルス)とEEV(細胞外被覆ウイルス)の2種類の感染形態を保持している。EEVはIMVと比べて高い遠隔感染能を保持している。この2種類の産生量の比較をKFtxシリーズにおいて行った。KFtxシリーズ(Low、UCA1 Low、Empty Low、KFtx、LowTx、UCA1 LowTx及びEmpty LowTx)を1.5×105/wellの細胞密度で6wellに播種し、37℃、36hr培養後にVGF+/O1L+をMOI=0.01で感染させた。37℃、72hr培養後 、それぞれの上清(感染細胞から放出されたEEV)と感染細胞(感染細胞内に存在するIMV)を回収した。IMVは上清を除いた後、感染細胞をTryple Expressで剥がし凍結融解することにより得た。凍結融解後、ソニケーションし、遠心(2,000 rpm、5分間)後の上清をウイルス液として回収した(EEVは凍結融解により外膜構造が破損するため、凍結融解、ソニケーション、遠心の工程は行っていない)。各ウイルス液(1ml)のウイルス力価をRK13細胞にて測定した。結果を図15に示した。図15に示すように、EEVとIMVのウイルス力価は両方とも蛍光顕微鏡による観察像(図12−1)と一致していた。
ERKを活性化させることによるワクシニアウイルスの増殖能の変化を測定する。ERKの上流にはEGFRがあり、EGFによって活性化される。KFtxシリーズ(Low、UCA1 Low、Empty Low、KFtx)を6×103/wellの細胞密度で96wellに播種し、37℃、12hr培養後、10%FBSと0.5%FBSのRPMIにメディウムチェンジをする。さらに、37℃、24hr培養後、MOI=0.01でVGF+/O1L+を感染させた。感染の30min前に0.2ng/μlでEGF刺激を行った。感染から72hr後にキーエンスの蛍光顕微鏡BZ-X710で生細胞のまま蛍光観察を行うと共に、蛍光強度を数値化した。感染像を図16−1に示し、蛍光の定量化の結果を図16−2に示す(図16−2Aは10%FBSの結果であり、図16−2Bは0.5%FBSの結果である)。図16−1及び図16−2に示すように、GFPの蛍光強度はEGF刺激によってワクシニウイルスの増殖能が増強されることはなかった。このことから、KFtxシリーズにおいてERKの活性化によってワクシニアウイルスの増殖能の増強は確認されなかった。
KFtxシリーズ(Low、UCA1 Low、Empty Low、KFtx)を6×103/wellの細胞密度で96wellに10%FBS RPMIで播種し、37℃、12hr培養後に10%FBS、0.5%FBS RPMIでメディウムチェンジを行った。さらに37℃、24hr培養後にEGFを0.2ng/μlになるようにメディウムチェンジした。30分のEGF刺激後にPierce Colorimetric In-Cell ELISA KitsによりtERK(total-ERK)とpERK(phosphorylated-ERK)を計測した(n=3)。結果を図17に示す。図17に示すように、0.5%、10%FBSで差は見られなかった。また全ての細胞においてEGF刺激によりpERKが活性化されpERKの割合が増大することが確認された。
(1) 様々な卵巣癌におけるVGF+/O1L+感染像及びウイルスGFP蛍光の定量化
SHIN3、OVCAR3、RMG-1、SKOV3、ES2の卵巣癌5種を1×104/wellの細胞密度で96wellに播種し、37℃、36hr培養後にMOI=0.01、0.001でVGF+/O1L+を感染させた。37℃、48hr培養後、キーエンスの蛍光顕微鏡BZ-X710で生細胞のまま蛍光観察を行うと共に、蛍光強度を数値化した。感染像を図18−1に示し、蛍光の定量化の結果を図18−2に示す(図18−2AはMOI=0.01の結果であり、図18−2BはMOI=0.001の結果である)。図18−1に示すように、UCA1を高発現しているRMG-1とSKOV3では蛍光強度が強く、ウイルス増殖・伝搬能が高かった。一方、UCA1の発現が低いSHIN3、OVCAR3、ES2では蛍光強度が弱く、ウイルス増殖・伝搬能は低かった。また、図18−2に示すように、GFPの蛍光強度は蛍光顕微鏡による観察像と一致していた。
KFtxシリーズ(Low、UCA1 Low、Empty Low、KFtx)を6×103/wellの細胞密度で96wellに播種し、37℃、36hr培養後にVGF-/O1L-をMOI=0.5で感染させた。感染から72hrと96hrにCellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega社)で生細胞数を測定した。結果を図20に示す。図20に示すように、UCA1の高発現はウイルスの腫瘍溶解性を増強することが示された。
配列番号4及び5 プライマー
Claims (12)
- 癌患者の癌細胞におけるUCA1遺伝子の発現を測定し、UCA1遺伝子が発現している場合に、該患者においてワクシニアウイルスによる癌治療効果があると予測する、ワクシニアウイルスによる癌治療効果を予測評価する方法。
- ワクシニアウイルスが、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスである、請求項1記載の方法。
- ワクシニアウイルスが、LC16株、LC16mO株又はB5R遺伝子が発現するように改変されたLC16m8株である、請求項1又は2に記載の方法。
- UCA1遺伝の発現をRT-PCRにより測定する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- UCA1遺伝子を発現可能に導入した、ワクシニアウイルス。
- 癌細胞中でUCA1遺伝子を発現させ、UCA1の制御により癌細胞中で増殖する、請求項5記載のワクシニアウイルス。
- 腫瘍溶解性ワクシニアウイルスである、請求項5又は6に記載のワクシニアウイルス。
- ワクシニアウイルスが、LC16株、LC16mO株又はB5R遺伝子が発現するように改変されたLC16m8株である、請求項5〜7のいずれか1項に記載のワクシニアウイルス。
- 請求項5〜8のいずれか1項に記載のワクシニアウイルスを含む癌治療のための医薬組成物。
- UCA1遺伝子を発現可能に導入した発現ベクター及びワクシニアウイルスを組合せて含む、癌治療のための医薬組成物キット。
- ワクシニアウイルスが、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスである、請求項10に記載の癌治療のための医薬組成物キット。
- ワクシニアウイルスが、LC16株、LC16mO株又はB5R遺伝子が発現するように改変されたLC16m8株である、請求項10又は11に記載の癌治療のための医薬組成物キット。
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