CN108451969B - Uca1作为靶位点在制备治疗色素增加性皮肤病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明的实验结果发现UCA1对黑素细胞的黑素生成能力具有负性调控作用，在黑素细胞中过表达UCA1后黑素生成相关基因表达水平降低，敲除UCA1后黑素生成相关基因表达水平明显提高，且UCA1主要通过cAMP/PKA/CREB通路负性调控黑素生成。本研究结果提示UCA1是调控黑素细胞黑素生成的潜在治疗靶点，开发调控UCA1表达水平的药物或治疗方式有望为色素性皮肤病的治疗带来新曙光。

Description

UCA1作为靶位点在制备治疗色素增加性皮肤病药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及UCA1作为靶位点在制备治疗色素增加性皮肤病药物中的应用。

背景技术

色素增加性皮肤病是由于各种物理、化学、生理等因素引起的皮肤黑素细胞产生黑素增多所致，是皮肤科一大类常见病。虽然大多数皮肤色素增加性皮肤病不会对身体健康造成很大影响，但是皮肤色素沉着尤其是面部皮肤色沉严重影响患者的美观，并对患者的心理健康产生很大影响，给患者带来很大的精神压力，甚至影响患者的工作学习以及生活等方面。且近年来人们对自身的外表要求越来越高，皮肤科门诊色素增加性皮肤病患者的就诊率呈上升趋势。目前临床上常见的色素增加性皮肤病包括黄褐斑、老年斑、雀斑等，传统的治疗方法如外用药物，系统性用药以及激光等治疗手段尚不能取得满意的效果，部分色素沉着增加性皮肤病患者的治疗仍然存在困难。因此寻找提高皮肤色素增加性皮肤病疗效的新药物或新治疗靶点十分的迫切。

黑素的合成是多级酶促反应过程，调节黑素合成途径的关键酶是酪氨酸酶(TYR)，其活性及表达量可直接反应黑色素的合成水平。酪氨酸酶相关蛋白1 (TYRP1)可以起到稳定酪氨酸酶活性的作用，酪氨酸酶相关蛋白2(TYRP2)也是能影响黑素产量及活性的重要关键酶。当黑素沉积于黑素小体后，黑素小体从核周向树突转运。Rab27a，FSCN1，MYO5A等多种转运相关蛋白共同参与了黑素小体转运过程。同时，黑素前体蛋白17(PMEL 17)和MART1被认为是重要的结构蛋白。黑素的合成及转运由一系列的转录因子如酪氨酸激酶受体KIT受体、性别决定区Y框(SOX9)及小眼畸形转录因子(MiTF)及及信号通路调控。其中转录因子MiTF的表达激活可诱导TYR、TYRP1、TYRP2等黑素合成关键酶的表达增多或活性增强，同时有文献报道MiTF也是黑素转运相关基因Rab27a的重要转录因子，因此MiTF在黑素的生成及转运过程中均起到了重要的调节作用。目前研究显示cAMP/PKA/CREB等信号通路是黑素合成及转运的主要调控通路。黑素细胞在受到各种刺激下cAMP/PKA/CREB信号通路激活，进而增强转录因子MITF的表达，MITF表达上调后促进了黑素生成相关基因的表达。

UCA1是一种非常重要的长链非编码RNA，首先被发现于膀胱癌中。近年来的研究发现UCA1参与多种肿瘤的发生发展，UCA1能参与细胞存活、自噬、表观遗传、代谢、耐药性等多种生物学行为的调控。目前尚无研究报道阐述UCA1对黑素细胞黑素生成功能的影响及机制。

发明内容

针对现有技术的不足，本研究旨在提供治疗色素增加性皮肤病新的靶点，进一步探索UCA1对黑素细胞黑素生成功能的影响及具体调控机制。

本发明的技术方案是：

UCA1作为靶位点在制备治疗色素增加性皮肤病药物中的应用。

进一步所述色素增加性皮肤病包括黄褐斑、老年斑、雀斑等。

进一步所述UCA1通过抑制cAMP/CREB信号通路负性调控黑素生成。

进一步UCA1也可以在制备靶向负性调控黑素生成制剂中的应用。

本发明的研究结果表明：1.UCA1表达水平与黑素含量呈负相关；2.UCA1 主要通过cAMP/PKA/CREB通路负性调控黑素细胞的黑素生成。

本发明的实验结果发现UCA1对黑素细胞的黑素生成能力具有负性调控作用，在黑素细胞中过表达UCA1后黑素生成相关基因表达水平降低，敲除UCA1 后黑素生成相关基因表达水平明显提高，且UCA1主要通过cAMP/PKA/CREB通路负性调控色素生成。本研究结果提示UCA1是调控黑素生成的潜在治疗靶点，开发调控UCA1表达水平的药物或治疗方式有望为色素性皮肤病的治疗带来新曙光。

附图说明

图1是UCA1与人原代皮肤黑素细胞(MC)、人永生化黑素细胞(PIG1)及人黑色素瘤细胞系(SK-MEL-28、A375)中黑素含量的关系的实验数据。(A)收集MC、PIG1、SK-MEL-28和A375细胞，离心后肉眼观察细胞颜色的差异。(B) NaOH法检测MC、PIG1、SK-MEL-28和A375四种细胞中黑素含量。(C)qRT-PCR 法检测MC、PIG1、SK-MEL-28和A375四种细胞中UCA1的表达情况。

图2是在PIG1细胞中使用慢病毒载体构建UCA1过表达稳定株后，qRT-PCR 及Western blot方法检测UCA1过表达水平(A)及TYR、TYRP1、TYRP1、Rab27A、 FSCM1、MYO5A等黑素生成相关基因mRNA及蛋白水平(B-C)。

图3是在PIG1细胞中使用慢病毒载体构建UCA1敲除稳定株后，qRT-PCR 及Westernblot方法检测UCA1敲除效率(A)及TYR、TYRP1、TYRP1、Rab27A、 FSCM1、MYO5A等黑素生成相关基因mRNA及蛋白水平(B-C)。

图4是qRT-PCR及Western blot方法检测过表达及敲除UCA1后PIG1细胞中调控黑素生成的一个重要转录因子MiTF的变化水平。

图5是检测调控黑素生成的cAMP/PKA/CREB通路变化情况。(A-B)通过WB 检测过表达及敲除UCA1后CREB、PKA及二者的磷酸化水平变化情况。(C)用生物发光法检测过表达及敲除UCA1后细胞中cAMP的浓度变化情况。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明。

实验方法：

1、主要材料

由上海吉凯基因构建慢病毒过表达载体一条。由苏州吉玛基因构建慢病毒敲降载体三条。

2、细胞培养：

在37℃、5％CO₂条件下，永生化人黑色素细胞株(PIG1细胞)及人原代皮肤黑色素细胞(MC)培养于5％胎牛血清(Biological Industries,Israel)、 1％双抗(Gibco)及1％HMGS(#S0025,Gibco)的254(#M-254-500,Gibco)培养基中。黑色素瘤细胞SK-MEL-28及A375细胞培养于10％胎牛血清及1％双抗 (Gibco)的DMEM(Hyclone)培养基中。

3、黑素含量测定

将MC、PIG1、SK-MEL-28、A375细胞(2.5×10⁵个细胞每35mm培养皿)种板，胰酶消化、离心、收集细胞，100ul 1mol/L NaOH 70℃水浴加热2小时使细胞溶解,使用酶标仪(PerkinElmer EnVision xcite,UK)在490nm处测量吸光度。

4、慢病毒载体构建及转染：

1)过表达UCA1:根据NCBI数据库提供的基因ID 652995，Genbank NR_015379, 片段大小2313，由上海吉凯基因构建慢病毒过表达载体，携带嘌呤霉素抗性，基因过表达慢病毒及阴性对照慢病毒滴度为5E+7TU。

2)敲降UCA1:由苏州吉玛基因构建慢病毒敲降载体三条。载体携带嘌呤霉素抗性，基因敲除慢病毒及阴性对照慢病毒滴度为10*8。

3)转染：将四种细胞计数后种板，根据慢病毒转染说明书，按照公式MOI＝(所转染的病毒滴度*病毒体积)/接种细胞数目计算每个孔需加入的病毒体积。病毒转染后24小时后观察细胞形态，并更换正常完全培基，72小时后，当在荧光显微镜可以观察到明亮的荧光时，则加入5ug/ul嘌呤霉素进行筛选。当换液后次日再无明显细胞悬浮时开始后续功能及机制实验。

6、qRT-PCR实验

在PIG1细胞中构建UCA1过表达及敲除稳定株后，提取总RNA，qRT-PCR法检测黑素生成相关基因TYR、TYRP1、TYRP1、Rab27A、FSCM1、MYO5A的表达及转录因子MITF的表达水平。使用E.Z.N.

Total RNA提取试剂盒(OMEGA BIO-TEK,USA)按生产厂家操作说明提取细胞总RNA。使用TOYOBO RT试剂盒 (TOYOBO Co.,Ltd,Osaka,Japan)按生产厂家操作说明将总RNA逆转录为cDNA。使用KOD

qPCR(TOYOBO Co.,Ltd,Osaka,Japan)试剂盒在实时荧光定量PCR仪(LightCycler480Ⅱ,Mannheim,Germany)上进行qRT-PCR反应，各基因引物合成于上海生工公司。

6、蛋白质免疫印迹法(Western-Blot)

在PIG1细胞中构建UCA1过表达及敲除稳定株后，用裂解缓冲液提取蛋白，并在4℃以12,000rpm离心10分钟。通过BCA蛋白测定法测定蛋白质浓度，实验前煮沸5分钟。每孔上样20μg蛋白质样品，用10％SDS PAGE(Well Biological Co.，Ltd，Changsha，China)分离，转移到PVDF膜(Millipore，USA)。5％ BSA封闭2小时后，将膜在4℃下与一抗(TYR、TYRP1、TYRP1、Rab27A、FSCM1、 MYO5A、MiTF、CREB、p-CREB、PKA、p-PKA)孵育过夜。用PBST洗涤PVDF膜，然后在室温下与有HRP标记的山羊抗兔IgG或抗小鼠IgG二抗(CST，USA)孵育 60分钟，通过ECL化学发光法检测结合的抗体。

7、检测cAMP含量

将过表达及敲除的PIG1细胞接种于不透光的96孔板中，使用cAPM-Glo^TM检测试剂盒，按照说明书步骤进行细胞内cAMP含量的检测，使用酶标仪检测cAPM 的浓度。

8、统计学分析

以SPSS 22.0统计学软件对实验数据进行统计学分析。实验重复三次，数据用Mean±SD表示，组间差异比较采用方差分析或T检验分析，当p<0.05时，认为差异具有统计学意义(****p<0.0001,***p<0.001,**p<0.01,*p<0.05)。

实验结果：

1.UCA1表达水平与黑素含量呈负相关

人皮肤原代黑素细胞、人永生化黑素细胞及黑色素瘤细胞系中黑素的含量可以从肉眼观察细胞的颜色以及黑素含量检测得知，本实验通过体外培养MC、PIG1 细胞及黑色素瘤细胞系SK-MEL-28、A375两种细胞，将细胞离心后放于EP管中观察，发现四种细胞颜色深浅不同如图1A，氢氧化钠法检测四组细胞中的黑素含量如图1B，细胞中UCA1表达量如图1C。可以得出四种细胞中黑素含量与UCA1 的表达量呈负相关。

2.PIG1细胞中过表达UCA1后黑素生成相关基因表达下调

使用慢病毒构建UCA1过表达稳定株，PCR结果显示UCA1过表达效率达100倍 (p<0.05，图2A),成功构建过表达稳定细胞株后，PCR及WB结果可以看出，与对照组比较，PIG1细胞中过表达UCA1后，TYR、TYRP1、TYRP2、Rab27A、FSCN1、 MYO5A六个黑素生成相关基因mRNA及蛋白表达均明显下调(p<0.05，图2B-C)。

3.PIG1细胞中敲除UCA1后黑素生成相关基因表达上调

使用慢病毒构建UCA1敲除稳定株，为防止脱靶效应，我们构建了三条敲除序列，经PCR验证敲除效率后，其中的sh-UCA1-1及sh-UCA1-2的敲除效率具有统计学意义(p<0.05，图3A),用于后续实验。成功构建UCA1敲除稳定细胞株后，PCR及WB结果可以看出，与对照组相比，PIG1细胞中TYR、TYRP1、TYRP2、 Rab27A、FSCN1、MYO5A六个黑素生成相关基因mRNA及蛋白表达均明显上调 (p<0.05，图3B-C)，所得结果与过表达稳定株的结果相反。

4.UCA1调控转录因子MiTF的表达

为进一步探索UCA1调控黑素生成的机制，我们通过文献查询，发现MiTF 是调控黑素生成及转运的关键转录因子，所以我们进行了PCR及WB水平的验证。与对照组相比，在PIG1细胞中过表达UCA1后MiTF表达下调，敲除UCA1后MiTF 表达显著上调(p<0.05,图4A-D)。

5.UCA1可通过cAMP/PKA/CREB通路负性调控黑素生成

cAMP/PKA/CREB信号通路可以通过调控转录因子MiTF在黑素生成中起作用，因此我们探索了UCA1对PIG1细胞cAMP/PKA/CREB信号通路关键分子CREB、 p-CREB、PKA、p-PKA、cAMP的影响。我们的研究发现UCA1能调控cAMP/PKA/CREB 信号通路关键分子，提示可能通过调控cAMP/PKA/CREB信号通路影响黑素的生成。图5是能激活cAMP/PKA/CREB信号通路的试验数据图谱。Western-Blot法检测过表达UCA1后CREB、p-CREB、PKA及p-PKA均表达下调(图5A)，利用生物发光法检测细胞内cAMP水平显著下调(p<0.05，图5C)；PIG1细胞中敲除UCA1后CREB、p-CREB、PKA及p-PKA均表达上调(图5B)，利用生物发光法检测细胞内cAMP水平显著上调(p<0.05，图5C)；

结论：1.UCA1表达水平与黑素含量呈负相关；

2.UCA1主要通过cAMP/PKA/CREB通路负性调控黑素细胞的黑素生成。

Claims (2)

1.UCA1的增强剂在制备治疗色素增加性皮肤病药物中的应用，所述色素增加性皮肤病为黄褐斑、老年斑、雀斑，所述UCA1的增强剂通过抑制cAMP/CREB信号通路负性调控黑素生成。

2.UCA1的增强剂在制备靶向负性调控黑素生成制剂中的应用。

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