JP2012520085A

JP2012520085A - 生物活性ｒｎａの送達のための組成物及び方法

Info

Publication number: JP2012520085A
Application number: JP2011554275A
Authority: JP
Inventors: ポラック、ケヴィン; フューウェル、ジェイソン; アンワー、クワーシード
Original assignee: エーゲン、インコーポレイテッド
Priority date: 2009-03-13
Filing date: 2010-03-15
Publication date: 2012-09-06
Also published as: CN102625842A; AU2010223888A1; EP2406379A4; US8569065B2; US20140005254A1; US20100233141A1; EP2406379A1; CA2755245A1; KR20110128345A; WO2010105277A1

Abstract

本発明は、生物活性ＲＮＡ分子の細胞への送達のための新規な化合物、組成物及び方法を提供する。具体的には、本発明は、生物活性ＲＮＡの細胞への送達に有用な新規な核酸分子、ポリペプチド及びＲＮＡ−タンパク質複合体、並びにそれらをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、そのポリヌクレオチドを発現するためのベクターをも提供する。更に、本発明は、トランスフェクション試薬として使用され得る新規な化合物及びベクターを含む細胞及び組成物を提供する。本発明は、それらの化合物、ベクター、細胞及び組成物の作製方法を更に提供する。更に、生物活性ＲＮＡ分子を細胞及び／又は組織に送達するためのベクター及び方法が提供される。新規な化合物、ベクター、細胞及び組成物は、例えば、対象又は生物における疾患、障害又は状態の診断、予防、寛解及び／又は治療における標的遺伝子発現を調節するために生物活性ＲＮＡ分子を細胞に送達する場合に有用である。

Description

本出願は、図面を含めて、両出願が参照により本明細書に完全に組み込まれている２００９年３月１３日に出願の米国出願シリアル番号第６１／１６０２８７号及び２００９年３月１３日に出願の米国出願シリアル番号第６１／１６０２８８号に基づく優先権を主張するものである。

本発明は、生物活性ＲＮＡ分子の細胞への送達のための新規な化合物、組成物及び方法を提供する。具体的には、本発明は、生物活性ＲＮＡの細胞への送達に有用な新規な核酸分子、ポリペプチド及びＲＮＡ−タンパク質複合体、並びにそれらをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、そのポリヌクレオチドを発現するためのベクターをも提供する。更に、本発明は、とりわけ、トランスフェクション試薬として使用され得る新規な化合物及びベクターを含む細胞及び組成物を提供する。本発明は、それらの化合物、ベクター、細胞及び組成物の作製方法を更に提供する。更に、生物活性ＲＮＡ分子、例えば、リボザイム、アンチセンス核酸、アロザイム、アプタマー、短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）及び短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子を細胞及び／又は組織に送達するためのベクター及び方法が提供される。新規な化合物、ベクター、細胞及び組成物は、例えば、対象又は生物における疾患、障害又は状態の診断、予防、寛解及び／又は治療における標的遺伝子発現を調節するために生物活性ＲＮＡ分子を細胞に送達する場合に有用である。

ＲＮＡ分子は、インビトロ及びインビボにおける遺伝子発現の強力な調節因子としての役割を果たす能力を有する。これらの分子は、細胞タンパク質との特異的相互作用又は他のＲＮＡ分子との塩基対合相互作用のいずれかを利用する多くの機序を通して機能し得る。この調節は、ＲＮＡ−タンパク質及びタンパク質−タンパク質相互作用を破壊するＲＮＡアプタマーと同様に細胞機構に対抗して、又は内因性ＲＮＡｉ機構を選択標的に向け直すことによって作用するｓｉＲＮＡｓと同様に細胞プロセスと協力して作用することができる。ＲＮＡエフェクター分子を介した遺伝子発現の調節は、形成される調節複合体（それらがＲＮＡ−タンパク質複合体又はＲＮＡ−ＲＮＡ複合体である場合）がしばしば非常に特異的であるので大きな治療能力を有する（Ａａｇａａｒｄら、２００７、ＡｄｖＤｒｕｇＤｅｌｉｖＲｅｖ．、５９：７５〜８６；ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓら、２００７、ＮａｔＲｅｖＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖ．、６：４４３〜５３；Ｇｒｉｍｍら、２００７、ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ．、１１７：３６３３−４１１−４；Ｒａｙｂｕｒｎら、２００８、ＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖＴｏｄａｙ．、１３：５１３〜２１）。この特異性が塩基対合の十分に確立された法則によって決定される場合、この調節機構の特定の遺伝子産物へのターゲッティングは、実験計画を方向づけるために利用できるようになる。

遺伝子発現を調節するＲＮＡ分子は、多くの異なる形態を取ることができる。おそらく、全てについての有力な例は、アンチセンスＲＮＡ分子である。この阻害性ＲＮＡは、典型的には、それがターゲッティングするｍＲＮＡ転写産物の直接の相補物であり、翻訳機構に対する障害を示すことによって、更に細胞ヌクレアーゼによる分解の転写産物をターゲッティングすることによって機能する。別の関連且つ重複するクラスは、転写後遺伝子サイレンシング又はＲＮＡｉ経路を通して作用する低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。これらのＲＮＡは、典型的には長さが約２１〜２３ヌクレオチドであり、特異的な細胞タンパク質と会合してＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を形成する。また、これらの低分子ＲＮＡは、それらのｍＲＮＡ標的の中の配列に対して相補的でもあり、これらの複合体の結合は、転写産物の翻訳サイレンシング又は分解をもたらす（Ｆａｒａｚｉら、２００８、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．、１３５：１２０１−１４５−７；Ｓｏｎｔｈｅｉｍｅｒら、２００５、ＮａｔＲｅｖＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ．、６：１２７〜３８；Ｚａｍｏｒｅら、２００５、Ｓｃｉｅｎｃｅ．、３０９：１５１９〜２４）。

遺伝子発現及び活性を調節し得るＲＮＡ分子の２つの更なるクラスは、触媒性ＲＮＡリボザイム及び競合的ＲＮＡアプタマーである。リボザイムは、ＲＮＡ基質における化学反応、多くの場合ホスホジエステル骨格の加水分解を触媒するＲＮＡ系酵素である。触媒性活性部位の形成はリボザイムとＲＮＡ基質との間の塩基対合を必要とするため、適切なガイド配列を提供することによって所望の基質にリボザイム活性をターゲッティングすることもできる（Ｗｏｏｄら、２００７、ＰＬｏＳＧｅｎｅｔ．、３：ｅ１０９；Ｓｃｈｅｒｅｒら、２００７、ＧｅｎｅＴｈｅｒ．、１４：１０５７〜６４；Ｔｒａｎｇら、２００４、ＣｅｌｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６：４９９〜５０８）。ｍＲＮＡ転写産物をターゲッティングする場合、リボザイムは、それらの転写産物を切断する能力を有し、会合タンパク質の下方制御をもたらす（Ｌｉｕら、２００７、ＣａｎｃｅｒＢｉｏｌＴｈｅｒ．、６：６９７〜７０４；Ｓｏｎｇら、２００８、ＣａｎｃｅｒＧｅｎｅＴｈｅｒ．、；Ｗｅｎｇら、２００５、ＭｏｌＣａｎｃｅｒＴｈｅｒ．、４：９４８〜５５；Ｌｉら、２００５、ＭｏｌＴｈｅｒ．１２：９００〜９）。ＲＮＡアプタマーは、典型的には、標的分子（しばしばタンパク質分子）と相互作用するその能力によってランダムＲＮＡ配列のプールから選択される。結合が塩基対合相互作用によって定義されないので、ＲＮＡアプタマーを操作することはあまり簡単でないが、一旦有効な配列が明らかにされると、その結合の特異性及び親和性は、しばしば抗体−抗原相互作用のものに対抗する（Ｍｉら、２００８、ＭｏｌＴｈｅｒ．、１６：６６〜７３；Ｌｅｅら、２００７、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．、６７：９３１５〜２１；Ｉｒｅｓｏｎら、２００６、ＭｏｌＣａｎｃｅｒＴｈｅｒ．、１２：２９５７〜６２；Ｃｅｒｃｈｉａら、２００５、ＰＬｏＳＢｉｏｌ．、３：ｅ１２３０）。ＲＮＡアプタマーはまた、標的分子のより大きな範囲を有し、多くの異なる機序を介して遺伝子活性を改変する能力を有する。

阻害性ＲＮＡ分子を細胞に送達するための２つの方法が標準的技法になっている。第１の方法は、精製されたポリメラーゼ及びＤＮＡ鋳型を用いることによる又は直接的化学合成を通した試験管内におけるＲＮＡ分子の作製を含む。次いで、これらのＲＮＡ分子を精製して、合成担体、典型的にはポリマー、リポソーム又はペプチドと混合し、標的細胞に送達することができる（Ａｉｇｎｅｒら、２００７、ＡｐｐｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、７６：９〜２１；Ｊｕｌｉａｎｏら、２００８、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．、３６：４１５８〜７１；Ａｋｈｔａｒら、２００７、ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ．、１１７：３６２３〜３２）。これらの分子を、それらのｍＲＮＡ又はタンパク質標的に直接又は調節複合体の形成を通してそれらが結合する細胞質に送達する。第２の方法は、標的細胞に生物活性ＲＮＡをコードするプラスミド分子をトランスフェクトすることを含む。再度、精製プラスミド分子を試験管内の合成担体と結合させ、標的細胞に送達する（Ｆｅｗｅｌｌら、２００５、ＪＣｏｎｔｒｏｌＲｅｌｅａｓｅ．、１０９：２８８〜９８；Ｗｏｌｆｆら、２００８、ＭｏｌＴｈｅｒ．、１６：８〜１５；Ｇａｒｙら、２００７、ＪＣｏｎｔｒｏｌＲｅｌｅａｓｅ．、１２１：６４〜７３）。

この場合、プラスミド鋳型を、ＤＮＡが生物活性ＲＮＡ分子に転写される細胞核に送達しなければならない。次いで、このＲＮＡを、それが調節複合体及び特異的ｍＲＮＡ転写産物標的に到達するまでの途中にある細胞質に搬出する。これらのアプローチの各々において、細胞集団の中における遺伝子調節の程度は、送達系のトランスフェクション効率によって限定される。生物活性ＲＮＡをコードする生物活性ＲＮＡ分子又はプラスミドでトランスフェクトされない細胞は、調節シグナルを受信するための機序を有さない。培養において成長する細胞にとって高トランスフェクション効率が可能であるにもかかわらず、トランスフェクションの同様の程度を達成することは、インビボにおいて困難である。この送達問題は、特定の遺伝子が細胞集団において調節され得る程度をそれが限定するので、現在、インビボにおけるＲＮＡに基づいた治療薬の適用に対する主要な禁止要因である。したがって、生物活性ＲＮＡを細胞及び組織に効率的に送達するための有効な送達系の必要性が残っている。

本発明は、生物活性ＲＮＡ分子の哺乳動物の細胞及び組織への送達における低トランスフェクション効率を伴う現在の問題を回避するための新規なアプローチを提供する。１つのアプローチは、１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ分子、例えば、リボザイム、アンチセンス核酸、アロザイム、アプタマー、短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）及び短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子、並びに１つ又は複数の生物活性ペプチドをコードするＲＮＡ転写物を産生し、続いて分泌する１つ又は複数の「バイオリアクター」細胞を使用し、それによって前記分子（単数又は複数）を細胞外マトリックス並びに周囲の細胞及び組織に送達することを含む。バイオリアクター細胞は、対象となる１つ又は複数の遺伝子をターゲッティングする少なくとも１種の生物活性ＲＮＡ分子と生物活性ＲＮＡ分子（単数又は複数）を細胞外マトリックス並びに／又は隣接する細胞及び組織に送達し得る融合タンパク質とを含むＲＮＡ−タンパク質複合体を産生するように設計された１つ又は複数の発現ベクターを細胞に投与することによって作製される。

ＲＮＡ−タンパク質複合体のＲＮＡ部分は、少なくとも認識ＲＮＡ配列と１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列とを含む。ＲＮＡ−タンパク質複合体のタンパク質部分は、少なくともＲＮＡ結合ドメインと輸送ペプチドとを含む融合タンパク質である。適切な輸送ペプチドの例としては、限定されるものではないが、細胞貫通ペプチド、非古典的分泌ドメイン、エンドソーム放出ドメイン、受容体結合ドメイン及び融合ペプチドから選択される１つ又は複数のペプチドが挙げられる。ＲＮＡ−タンパク質複合体のＲＮＡ部分及びタンパク質部分は、トランスフェクトされたバイオリアクター細胞の核内において１つ又は複数のベクターから発現され、細胞質に輸送され、そこで融合タンパク質が翻訳され、生物活性ＲＮＡを含むＲＮＡ配列に結合し、それによってＲＮＡ−タンパク質複合体が産生される。ＲＮＡ−タンパク質複合体は、バイオリアクター細胞から分泌され、細胞外マトリックスにおいて無傷のままである。ＲＮＡ−タンパク質複合体は、細胞外マトリックス内に残ることができ、そこでそれは細胞外マトリックスの中で又は隣接する標的細胞の細胞表面においてその修飾作用を発揮する。別の場合、ＲＮＡ−タンパク質複合体は、標的細胞の表面において融合タンパク質が標的細胞の細胞質への生物活性ＲＮＡの移入を促進するように設計され得る。

したがって、本質的には、トランスフェクト細胞は、ＲＮＡ−タンパク質複合体として分泌される生物活性ＲＮＡ分子を産生し、細胞外マトリックス及び／又は他の隣接する細胞に送達する「バイオリアクター」に転化される。このアプローチは、プラスミド鋳型から生物活性ＲＮＡ分子を合成するように細胞機構を方向づけることによって提供される調節シグナルの増幅を利用する。したがって、調節シグナルは、単一の送達事象の初期トランスフェクション効率によってもはや結合されないが、持続した期間に亘って多くの細胞に到達する能力を有する。

かかるバイオリアクター細胞は、本明細書に記載されている発現ベクターの内の１つ又は複数による適切な細胞のトランスフェクションによって細胞培養において作製することもできる。本質的には、トランスフェクト細胞は、培養において、生物活性ＲＮＡ分子を産生し、他の細胞に送達するバイオリアクターに転化される。したがって、バイオリアクター細胞は、治療用送達系としてのインビボ及びエクスビボでの適用、並びに新規なトランスフェクション剤としてのインビトロ及びインビボでの適用を有する。

バイオリアクター細胞の目的は、細胞外マトリックスの中で若しくは隣接する標的細胞の細胞表面において次いで機能し得る又は隣接する標的細胞に送達され得る形態で細胞外マトリックスに生物活性ＲＮＡ分子を分泌することである。ウイルスパッケージング細胞は、同じ目的（生物活性ＲＮＡ分子の分泌及び送達）に役立つことができる。しかし、各種源から得られる個々のドメインから構築された融合タンパク質を産生するバイオリアクターとは対照的に、ウイルス粒子は、一方の細胞からもう一方に核酸を転移する目的のために進化してきた（したがって、可動遺伝因子）。両ＲＮＡ及びＤＮＡウイルスは、核酸調節因子のための可能な担体として利用され得る。ＲＮＡウイルスの場合、生物活性ＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドは、ウイルスの非構造遺伝子をコードするウイルス転写産物に付加される。この転写産物は、ウイルスプロセスを担うウイルスタンパク質のための鋳型として及びウイルス粒子中にパッケージされるゲノムとしての両方の役割を果たす。生物活性ＲＮＡがウイルス粒子に組み込まれるように、生物活性ＲＮＡは、非構造遺伝子をコードするＲＮＡと結合する。ＤＮＡウイルスの場合、ウイルス転写産物の合成が同様に生物活性ＲＮＡを産生するように、生物活性ＲＮＡをコードするＤＮＡ断片は、ウイルスＤＮＡに付加される。ウイルス粒子は、ヘルパープラスミドから産生された転写産物によってコードされる構造タンパク質から構築される。同様に、生物活性ＲＮＡ及び融合タンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドは、非構造ウイルス遺伝子をコードするウイルス転写産物に付加され得る（ＲＮＡウイルスの場合）か、又はウイルスＤＮＡに付加され得る（ＤＮＡウイルスの場合）。したがって、ウイルス非構造遺伝子をコードするための配列と生物活性ＲＮＡ又は本発明の生物活性ＲＮＡ−タンパク質複合体のいずれかをコードするための配列とを含む発現ベクターをトランスフェクトした細胞は、本明細書において記載されるように、バイオリアクター細胞と同じ方法で使用され得る。

これらのアプローチは、プラスミドに基づいたＲＮＡ仲介治療薬の適用における重要な問題、即ちプラスミド送達に伴う低トランスフェクション効率に直接対処する。ＲＮＡ仲介効果が、生物活性ＲＮＡのインビボ産生、並びに周囲の細胞及び組織への送達を通して増幅されるので、記載されたバイオリアクター細胞の使用は、高効率トランスフェクションの必要性を回避する。

したがって、本発明は、生物活性ＲＮＡ分子の哺乳動物細胞及び組織への送達に有用な、新規な核酸分子、ポリペプチド、ＲＮＡ−タンパク質複合体、ポリヌクレオチド及びベクターを提供する。更に、本発明は、前記核酸分子、ポリペプチド、ＲＮＡ−タンパク質複合体、ポリヌクレオチド及びベクターを含む組成物を提供する。本発明はまた、本発明の核酸分子、ポリペプチド、ＲＮＡ−タンパク質複合体、ポリヌクレオチド及びベクターを含む細胞をも提供する。更に、本発明は、本発明の核酸分子、ポリペプチド、ＲＮＡ−タンパク質複合体、ポリヌクレオチド、ベクター、組成物及び細胞の作製方法、並びにインビトロ、エクスビボ及びインビボで本発明の分子を使用するための治療方法を提供する。

本発明は、本発明の核酸分子、ポリペプチド及びＲＮＡ−タンパク質複合体の作製に有用な、新規な発現ベクターを提供する。一実施形態において、本発明は、本発明のＲＮＡ−タンパク質複合体を発現する発現ベクターを提供する。したがって、一実施形態において、本発明は、１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列を含む核酸をコードするポリヌクレオチドを含み、ＲＮＡ結合ドメイン及び１つ又は複数の輸送ペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。発現ベクターから発現されるＲＮＡ−タンパク質複合体のＲＮＡ部分及びタンパク質部分は、トランスフェクトされたバイオリアクター細胞の核内において発現され、別々に細胞質へ輸送され、そこで融合タンパク質が翻訳され、生物活性ＲＮＡを含むＲＮＡ配列に結合し、それによってＲＮＡ−タンパク質複合体が産生される。ＲＮＡ−タンパク質複合体は、本明細書において考察されるようにバイオリアクター細胞から分泌される。１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列は、同じ遺伝子標的に向けられた１つ又は複数の異なる型の生物活性ＲＮＡ配列であり得るか、又は異なる遺伝子標的に向けられた生物活性ＲＮＡ配列であり得る。

更なる一実施形態において、発現ベクターは、第１プロモーター配列、終止配列及び場合によって１つ又は複数のプライマー配列、第２プロモーター配列、ポリＡ付加配列及び場合によって１つ又は複数のプライマー配列を更に含み、第１生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列をコードするポリヌクレオチドは、第１プロモーター配列及び終止配列に作動可能に連結し、ＲＮＡ結合ドメイン配列及び輸送ペプチド配列をコードするポリヌクレオチドは、第２プロモーター配列及びポリＡ付加配列に作動可能に連結する。

別の一実施形態において、発現ベクターは、ウイルス複製のために必要な１つ又は複数のウイルスポリメラーゼと１つ又は複数のウイルスアクセサリータンパク質とをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を更に含む。更なる一実施形態において、ベクターは、１つ又は複数のプロモーター配列、１つ又は複数のポリＡ付加配列及び場合によって１つ又は複数のプライマー配列を更に含み、ウイルスポリメラーゼ（単数又は複数）とウイルスアクセサリータンパク質（単数又は複数）とをコードするポリヌクレオチド配列（単数又は複数）は、１つ又は複数のプロモーター配列及び１つ又は複数のポリＡ付加配列に作動可能に連結する。ウイルスポリメラーゼ及びアクセサリータンパク質配列を含むベクターは、１つ又は複数のウイルスコートタンパク質と１つ又は複数のウイルス融合タンパク質とをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターと共に使用され得る。更なる一実施形態において、１つ又は複数のウイルスコートタンパク質と１つ又は複数のウイルス融合タンパク質とをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターは、１つ又は複数のプロモーター配列及び１つ又は複数のポリＡ付加配列を更に含むことができ、ウイルスコートタンパク質（単数又は複数）とウイルス融合タンパク質（単数又は複数）とをコードするポリヌクレオチド配列（単数又は複数）は、１つ又は複数のプロモーター配列及び１つ又は複数のポリＡ付加配列に作動可能に連結する。

記載された発現ベクターのある種の実施形態において、生物活性ＲＮＡ配列は、リボザイム、アンチセンス核酸、アロザイム、アプタマー、短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及び１つ又は複数の生物活性ペプチドをコードする転写産物から選択される。特定の一実施形態において、生物活性ＲＮＡ配列は、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。別の特定の一実施形態において、生物活性ＲＮＡ配列は、アプタマーである。ある種の実施形態において、認識ＲＮＡ配列は、Ｕ１ループ、グループＩＩイントロン、ＮＲＥステムループ、Ｓ１Ａステムループ、バクテリオファージＢｏｘＢＲ、ＨＩＶＲｅｖ応答エレメント、ＡＭＶＣＰ認識配列及びＡＲＥ配列から選択される。一実施形態において、末端ミニヘリックス配列は、アデノウイルスＶＡ１ＲＮＡ分子に由来する。ある種の実施形態において、ＲＮＡ結合ドメインは、Ｕ１Ａ、ＣＲＳ１、ＣＲＭ１、ヌクレオリンＲＢＤ１２、ｈＲＢＭＹ、バクテリオファージタンパク質Ｎ、ＨＩＶＲｅｖ、アルファルファ−モザイクウイルスコートタンパク質（ＡＭＶＣＰ）及びトリステトラプロリンアミノ酸配列から選択される。ある種の実施形態において、１つ又は複数の輸送ペプチドは、細胞貫通ペプチド、非古典的分泌ドメイン、受容体結合ドメイン、融合ペプチド及びエンドソーム放出ドメイン、並びにそれらのあらゆる組合せから選択される。特定の一実施形態において、輸送ペプチドは細胞貫通ペプチドである。ある種の特定の実施形態において、細胞貫通ペプチドは、ペネトラチン、トランスポルタン、ＭＡＰ、ＨＩＶＴＡＴ、Ａｎｔｐ、Ｒｅｖ、ＦＨＶコートタンパク質、ＴＰ１０及びｐＶＥＣ配列から選択される。別の特定の一実施形態において、輸送ペプチドは非古典的分泌ドメインである。ある種の特定の実施形態において、非古典的分泌ドメインは、Ｇａｌｃｅｔｉｎ−１ペプチド、ガレクチン−３ペプチド、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＨＡＳＰＢ、ＨＭＧＢ１、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＩＬ−２シグナル、分泌トランスグルタミナーゼ、アネキシン−１、ＨＩＶＴＡＴ、ヘルペスＶＰ２２、チオレドキシン、ロダネーゼ及びプラスミノーゲンアクチベーターシグナル配列から選択される。特定の一実施形態において、輸送ペプチドは、細胞貫通ペプチド、並びに非古典的分泌ドメイン、受容体結合ドメイン、融合ペプチド及びエンドソーム放出ドメインから選択される１つ又は複数の輸送ペプチドである。特定の実施形態において、輸送ペプチドは、細胞貫通ペプチド及び非古典的分泌ドメインである。ある種の実施形態において、ウイルス非構造及び構造遺伝子（ウイルスポリメラーゼ、アクセサリータンパク質、コートタンパク質及び融合タンパク質）は、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、単純ヘルペスウイルスレンチウイルス、レトロウイルス、シンドビスウイルス及びフォーミーウイルスが含まれるがこれらに限定されないＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルスから選択される。

上記の実施形態の内のいずれかにおいて、発現ベクターは、１つ又は複数の更なる遺伝子標的（単数又は複数）をターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列を含む核酸をコードする更なるポリヌクレオチド配列を更に含むことができる。一実施形態において、更なるポリヌクレオチド配列は、更なる遺伝子標的をターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列及びＲＮＡ認識配列を含む核酸をコードする。別の一実施形態において、ベクター中における生物活性ＲＮＡ配列の内の１つが、短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）又は短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である場合、発現ベクターは、ダイサー及び／又はドローシャをターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列を含む核酸をコードするポリヌクレオチドを更に含む。ダイサー及び／又はドローシャをターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列を含む核酸をコードするポリヌクレオチド配列のいずれも認識ＲＮＡ配列を含まない。

別の一実施形態において、発現ベクターは、第１発現カセット及び第２発現カセットを含み、第１発現カセットは、プロモーター配列、１つ又は複数の標的遺伝子に向けられた１つ又は生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列、場合によって末端ミニヘリックス配列、終止配列及び場合によって１つ又は複数のプライマー配列を含み、生物活性ＲＮＡ配列（単数又は複数）、認識ＲＮＡ配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列は、プロモーター配列及び終止配列に作動可能に連結し、第２発現カセットは、プロモーター配列、ＲＮＡ結合ドメイン配列、輸送ペプチド配列、ポリＡ付加配列及び場合によって１つ又は複数のプライマー配列を含み、ＲＮＡ結合ドメイン配列及び輸送ペプチド配列は、プロモーター配列及びポリＡ付加配列に作動可能に連結する。更なる一実施形態において、発現ベクターは、第３発現カセットを更に含み、第３発現カセットは、１つ又は複数のプロモーター配列、ウイルス複製のために必要な１つ又は複数のウイルスポリメラーゼと１つ又は複数のウイルスアクセサリータンパク質とをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列、１つ又は複数のポリＡ付加配列及び場合によって１つ又は複数のプライマー配列を含み、ウイルスポリメラーゼ（単数又は複数）とウイルスアクセサリータンパク質（単数又は複数）とをコードするポリヌクレオチド配列（単数又は複数）は、１つ又は複数のプロモーター配列及び１つ又は複数のポリＡ付加配列に作動可能に連結する。ウイルスポリメラーゼとアクセサリータンパク質配列とを含む第３発現カセットを含むベクターは、１つ又は複数のウイルスコートタンパク質と１つ又は複数のウイルス融合タンパク質とをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターと共に使用され得る。更なる一実施形態において、１つ又は複数のウイルスコートタンパク質と１つ又は複数のウイルス融合タンパク質とをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターは、１つ又は複数のプロモーター配列及び１つ又は複数のポリＡ付加配列を更に含むことができ、ウイルスコートタンパク質（単数又は複数）とウイルス融合タンパク質（単数又は複数）とをコードするポリヌクレオチド配列（単数又は複数）は、１つ又は複数のプロモーター配列及び１つ又は複数のポリＡ付加配列に作動可能に連結する。

上記の発現ベクターの一実施形態において、ＲＮＡ−タンパク質複合体のＲＮＡ部分を含む（即ち、ＲＮＡ認識配列、１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ及び場合によって末端ミニヘリックス配列を含む）発現カセットは、融合タンパク質（即ち、ＲＮＡ結合ドメイン及び１つ又は複数の輸送ペプチド）のための発現カセットの中の人工イントロン中にライゲーションされる。この発現ベクターにおいて、Ｓｅｃ−ＲＮＡは、融合タンパク質をコードするｍＲＮＡ配列の中に配置した人工イントロンの中でコードされる。Ｓｅｃ−ＲＮＡ分子又は融合タンパク質をコードするＤＮＡ断片は、ＰＣＲによって調製される。Ｓｅｃ−ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ断片は、融合タンパク質配列の中の固有の制限部位中にサブクローニングするためのスプライスドナー及び受容体部位並びに制限部位を含むプライマーにより調製される。融合タンパク質をコードするＤＮＡ断片は、上記のプラスミド中にサブクローニングするための制限部位を含むプライマーにより調製される。転写後、Ｓｅｃ−ＲＮＡは、バイオリアクター細胞に対して内在性のスプライシング機構によって融合タンパク質をコードするｍＲＮＡから放出される。

これらの実施形態のいずれかにおいて、生物活性ＲＮＡ配列は、リボザイム、アンチセンス核酸、アロザイム、アプタマー、短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及び１つ又は複数の生物活性ペプチドをコードする転写産物から選択される。認識ＲＮＡ配列は、Ｕ１ループ、グループＩＩイントロン、ＮＲＥステムループ、Ｓ１Ａステムループ、バクテリオファージＢｏｘＢＲ、ＨＩＶＲｅｖ応答エレメント、ＡＭＶＣＰ認識配列及びＡＲＥ配列から選択される。末端ミニヘリックス配列は、アデノウイルスＶＡ１ＲＮＡ分子から選択される。ＲＮＡ結合ドメインは、Ｕ１Ａ、ＣＲＳ１、ＣＲＭ１、ヌクレオリンＲＢＤ１２、ｈＲＢＭＹ、バクテリオファージタンパク質Ｎ、ＨＩＶＲｅｖ、アルファルファ−モザイクウイルスコートタンパク質（ＡＭＶＣＰ）及びトリステトラプロリンアミノ酸配列から選択される。１つ又は複数の輸送ペプチドは、細胞貫通ペプチド、非古典的分泌ドメイン、受容体結合ドメイン、融合ペプチド及びエンドソーム放出ドメイン、並びにそれらのあらゆる組合せから選択される。

上記の実施形態のいずれかにおいて、発現ベクターは、更なる発現カセットを更に含むことができ、更なる発現カセットは、１つ又は複数のプロモーター配列、更なる遺伝子転写物をターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列を含む核酸をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列及び１つ又は複数のポリＡ付加配列を含み、更なる遺伝子転写物をターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列を含む核酸をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列は、１つ又は複数のプロモーター配列及び１つ又は複数のポリＡ付加配列に作動可能に連結する。一実施形態において、更なるポリヌクレオチド配列は、更なる遺伝子転写物をターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列及びＲＮＡ認識配列を含む核酸をコードする。別の一実施形態において、ベクター中における生物活性ＲＮＡ配列の内の１つが、短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）又は短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である場合、更なるポリヌクレオチド配列は、ダイサー及び／又はドローシャをターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列を含む核酸をコードする。ダイサー及び／又はドローシャをターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列を含む核酸をコードするポリヌクレオチド配列のいずれも認識ＲＮＡ配列を含まない。

一実施形態において、本発明は、１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列を含む核酸分子をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。一実施形態において、発現ベクターは、１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列及びウイルス複製のために必要な１つ又は複数のウイルスポリメラーゼと１つ又は複数のウイルスアクセサリータンパク質とをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を含む核酸分子をコードするポリヌクレオチドを含む。ある種の実施形態において、発現ベクターは、核酸分子をコードするポリヌクレオチドを含み、生物活性ＲＮＡ配列は、リボザイム、アンチセンス核酸、アロザイム、アプタマー、短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及び１つ又は複数の生物活性ペプチドをコードする転写産物から選択される。特定の一実施形態において、発現ベクターは、核酸分子をコードするポリヌクレオチドを含み、生物活性ＲＮＡ配列は短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。別の特定の一実施形態において、発現ベクターは、核酸分子をコードするポリヌクレオチドを含み、生物活性ＲＮＡ配列はアプタマーである。ある種の実施形態において、発現ベクターは、核酸分子をコードするポリヌクレオチドを含み、認識ＲＮＡ配列は、Ｕ１ループ、グループＩＩイントロン、ＮＲＥステムループ、Ｓ１Ａステムループ、バクテリオファージＢｏｘＢＲ、ＨＩＶＲｅｖ応答エレメント、ＡＭＶＣＰ認識配列及びＡＲＥ配列から選択される。一実施形態において、末端ミニヘリックス配列は、アデノウイルスＶＡ１ＲＮＡ分子に由来する。

本発明はまた、ＲＮＡ結合ドメイン及び１つ又は複数の輸送ペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターをも提供する。ある種の実施形態において、ＲＮＡ結合ドメインは、Ｕ１Ａ、ＣＲＳ１、ＣＲＭ１、ヌクレオリンＲＢＤ１２、ｈＲＢＭＹ、バクテリオファージタンパク質Ｎ、ＨＩＶＲｅｖ、アルファルファ−モザイクウイルスコートタンパク質（ＡＭＶＣＰ）及びトリステトラプロリンアミノ酸配列から選択される。ある種の実施形態において、１つ又は複数の輸送ペプチドは、細胞貫通ペプチド、非古典的分泌ドメイン、受容体結合ドメイン、融合ペプチド及びエンドソーム放出ドメイン、並びにそれらのあらゆる組合せから選択される。一実施形態において、本発明は、ＲＮＡ結合ドメイン及び細胞貫通ペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。ある種の特定の実施形態において、細胞貫通ペプチドは、ペネトラチン、トランスポルタン、ＭＡＰ、ＨＩＶＴＡＴ、Ａｎｔｐ、Ｒｅｖ、ＦＨＶコートタンパク質、ＴＰ１０及びｐＶＥＣ配列から選択される。別の一実施形態において、本発明は、ＲＮＡ結合ドメイン及び非古典的分泌ドメインを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。ある種の特定の実施形態において、非古典的分泌ドメインは、Ｇａｌｃｅｔｉｎ−１ペプチド、ガレクチン−３ペプチド、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＨＡＳＰＢ、ＨＭＧＢ１、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＩＬ−２シグナル、分泌トランスグルタミナーゼ、アネキシン−１、ＨＩＶＴＡＴ、ヘルペスＶＰ２２、チオレドキシン、ロダネーゼ及びプラスミノーゲンアクチベーターシグナル配列から選択される。一実施形態において、本発明は、ＲＮＡ結合ドメイン、細胞貫通ペプチド、並びに非古典的分泌ドメイン、受容体結合ドメイン、融合ペプチド及びエンドソーム放出ドメインから選択される１つ又は複数の輸送ペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。一実施形態において、本発明は、ＲＮＡ結合ドメイン、細胞貫通ペプチド及び非古典的分泌ドメインを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。

したがって、本発明は、１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列を含む核酸分子をコードするポリヌクレオチドを含む第１発現ベクターと、ＲＮＡ結合ドメイン及び１つ又は複数の輸送ペプチド、例えば、細胞貫通ペプチド、非古典的分泌ドメイン、受容体結合ドメイン、融合ペプチド及びエンドソーム放出ドメインから選択されるペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む第２発現ベクターとを提供する。第１発現ベクターから発現したＲＮＡ−タンパク質複合体のＲＮＡ部分と第２発現ベクターから発現したＲＮＡ−タンパク質複合体のタンパク質部分とは、トランスフェクトされたバイオリアクター細胞の核内において発現し、別々に細胞質へ輸送され、そこで融合タンパク質が翻訳され、生物活性ＲＮＡを含むＲＮＡ配列に結合し、それによってＲＮＡ−タンパク質複合体が産生される。ＲＮＡ−タンパク質複合体は、本明細書において考察されるようにバイオリアクター細胞から分泌される。

本発明の発現ベクターのいずれかにおいて、認識ＲＮＡ配列、個々の生物活性ＲＮＡ配列、場合によって末端ミニヘリックス配列、ＲＮＡ結合ドメイン及び輸送ペプチド（単数又は複数）、並びにウイルス配列、プロモーター、プライマー、終止配列及びポリＡ配列が含まれるあらゆる他の配列を含む配列の内の１つ又は複数は、１つ又は複数の介在又は付加配列の付加なしで直接結合する。別の場合、認識ＲＮＡ配列、個々の生物活性ＲＮＡ配列、場合によって末端ミニヘリックス配列、ＲＮＡ結合ドメイン及び輸送ペプチド（単数又は複数）、並びにウイルス配列、プロモーター、プライマー、終止配列及びポリＡ配列が含まれるあらゆる他の配列を含む配列の内の１つ又は複数は、１つ又は複数の介在又は付加配列の付加と共に結合する。上記の実施形態のいずれかにおいて、個々の生物活性ＲＮＡ配列自体は、いずれの介在若しくは付加配列もなしで直接結合するか又は１つ若しくは複数の介在若しくは付加配列の付加と共に結合する。上記の実施形態のいずれかにおいて、認識ＲＮＡ配列と生物活性ＲＮＡのいずれかとは、１つ若しくは複数のリンカー、スペーサー若しくは他の配列の付加なしで直接結合するか又は１つ若しくは複数のリンカー、スペーサー及び／若しくは他の配列の付加と共に結合する。上記の実施形態のいずれかにおいて、ＲＮＡ結合ドメインと個々の輸送ペプチドのいずれかとは、１つ若しくは複数のリンカー、スペーサー若しくは他の配列の付加なしで直接結合するか又は１つ若しくは複数のリンカー、スペーサー及び／若しくは他の配列の付加と共に結合する。

本発明の発現ベクターのいずれかにおいて、ベクターは、適切なバックボーンベクターから選択される。適切なベクターの例としては、ｐＣＩ、ｐＥＴ、ｐＳＩ、ｐｃＤＮＡ、ｐＣＭＶ等に由来するものが挙げられる。ある種の実施形態において、ベクターは、ｐＥＧＥＮ１．１、ｐＥＧＥＮ２．１、ｐＥＧＥＮ３．１及びｐＥＧＥＮ４．１から選択される。ｐＥＧＥＮベクターは、ｐＳＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ、製品＃Ｅ１７２１）、ｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ、製品＃Ｅ１７３１）、ｐＶＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、製品＃１２７２７−０１０）及び会社の構築物における他のものに由来する。一実施形態において、ベクターはｐＵＣ複製開始点を含む。一実施形態において、発現ベクターは薬剤耐性遺伝子を含む。適切な薬剤耐性遺伝子の非限定的な例としては、ピューロマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン及びクロラムフェニコール耐性遺伝子、並びに本技術分野において公知で記載されている他のあらゆる薬剤耐性遺伝子から選択されるものが挙げられる。

本発明はまた、本発明の１つ又は複数の発現ベクターと医薬的に許容し得る担体とを含む組成物をも提供する。組成物の発現ベクターは、本明細書に記載される発現ベクターのいずれかであってよい。一実施形態において、組成物は、１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列、場合によって末端ミニヘリックス配列を含む核酸をコードするポリヌクレオチド、並びにＲＮＡ結合ドメインを含むポリペプチド及び１つ又は複数の輸送ペプチド配列（例えば、細胞貫通ペプチド、非古典的分泌ドメイン、エンドソーム放出ドメイン、受容体結合ドメイン、融合ペプチド）をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターと医薬的に許容し得る担体とを含む。一実施形態において、組成物は、１つ又は複数の更なる遺伝子標的（単数又は複数）をターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列を含む核酸をコードするポリヌクレオチド配列を含む第２発現ベクターを更に含む。一実施形態において、更なるポリヌクレオチド配列は、１つ又は複数の更なる遺伝子標的をターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列及びＲＮＡ認識配列を含む核酸をコードする。別の一実施形態において、ベクター中における生物活性ＲＮＡ配列の内の１つが、短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）又は短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である場合、発現ベクターは、ダイサー及び／又はドローシャをターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列を含む核酸をコードするポリヌクレオチドを更に含む。

一実施形態において、組成物は、１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列、場合によって末端ミニヘリックス配列を含む核酸をコードするポリヌクレオチド配列、並びにＲＮＡ結合ドメインを含むポリペプチド及び１つ又は複数の輸送ペプチド配列（例えば、細胞貫通ペプチド、非古典的分泌ドメイン、エンドソーム放出ドメイン、受容体結合ドメイン、融合ペプチド）をコードするポリヌクレオチド配列、並びにダイサー及び／又はドローシャをターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列を含む核酸をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターと医薬的に許容し得る担体とを含む。

一実施形態において、組成物は、１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列、場合によって末端ミニヘリックス配列を含む核酸をコードするポリヌクレオチド、並びにＲＮＡ結合ドメインを含むポリペプチド及び１つ又は複数の輸送ペプチド配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びに第１プロモーター配列、終止配列及び場合によって１つ又は複数のプライマー配列、第２プロモーター配列、ポリＡ付加配列及び場合によって１つ又は複数のプライマー配列を含む発現ベクターと医薬的に許容し得る担体とを含む。本実施形態において、第１生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列をコードするポリヌクレオチドは、第１プロモーター配列及び終止配列に作動可能に連結し、ＲＮＡ結合ドメイン配列及び輸送ペプチド配列をコードするポリヌクレオチドは、第２プロモーター配列及びポリＡ付加配列に作動可能に連結する。

一実施形態において、組成物は、１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列、場合によって末端ミニヘリックス配列を含む核酸をコードするポリヌクレオチド、ＲＮＡ結合ドメインを含むポリペプチド及び１つ又は複数の輸送ペプチド配列をコードするポリヌクレオチド、並びにダイサー及び／又はドローシャをターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列を含む核酸をコードするポリヌクレオチド、並びに第１プロモーター配列、第１終止配列及び場合によって１つ又は複数のプライマー配列、第２プロモーター配列、ポリＡ付加配列及び場合によって１つ又は複数のプライマー配列、並びに１つ又は複数の更なるプロモーター配列、１つ又は複数の更なる終止配列及び１つ又は複数のプライマー配列を含む発現ベクターと医薬的に許容し得る担体とを含む。本実施形態において、第１生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列をコードするポリヌクレオチドは、第１プロモーター配列及び第１終止配列に作動可能に連結し、ＲＮＡ結合ドメイン配列及び輸送ペプチド配列をコードするポリヌクレオチドは、第２プロモーター配列及びポリＡ付加配列に作動可能に連結し、ダイサー及び／又はドローシャをターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列をコードするポリヌクレオチドは、１つ又は複数の更なるプロモーター配列及び１つ又は複数の更なる終止配列に作動可能に連結する。

一実施形態において、組成物は、医薬的に許容し得る担体中において、１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列、場合によって末端ミニヘリックス配列を含む核酸をコードするポリヌクレオチド、並びにＲＮＡ結合ドメインを含むポリペプチド及び１つ又は複数の輸送ペプチド配列をコードするポリヌクレオチド、並びにウイルス複製のために必要な１つ又は複数のウイルスポリメラーゼ及び１つ又は複数のウイルスアクセサリータンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を含む第１発現ベクターと、１つ又は複数のウイルスコートタンパク質及び１つ又は複数のウイルス融合タンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を含む第２発現ベクターとを含む。ある種の実施形態において、これらの組成物の発現ベクターは、第１プロモーター配列、終止配列及び場合によって１つ又は複数のプライマー配列、第２プロモーター配列、ポリＡ付加配列及び場合によって１つ又は複数のプライマー配列、並びに１つ又は複数の更なるプロモーター配列、１つ又は複数の更なるポリＡ付加配列及び場合によって１つ又は複数の更なるプライマー配列を更に含み、第１生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列をコードするポリヌクレオチドは、第１プロモーター配列及び終止配列に作動可能に連結し、ＲＮＡ結合ドメイン配列及び輸送ペプチド配列をコードするポリヌクレオチドは、第２プロモーター配列及びポリＡ付加配列に作動可能に連結し、１つ又は複数のウイルスポリメラーゼ及び１つ又は複数のウイルスアクセサリータンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドは、１つ又は複数のプロモーター配列及び１つ又は複数のポリＡ付加配列に作動可能に連結し、ウイルスコートタンパク質（単数又は複数）及びウイルス融合タンパク質（単数又は複数）をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列は、１つ又は複数のプロモーター配列及び１つ又は複数のポリＡ付加配列に作動可能に連結する。

一実施形態において、組成物は、１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列を含む核酸分子をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターと医薬的に許容し得る担体とを含む。

一実施形態において、組成物は、ＲＮＡ結合ドメインを含むポリペプチド及び１つ又は複数の輸送ペプチド配列（例えば、細胞貫通ペプチド、非古典的分泌ドメイン、エンドソーム放出ドメイン、受容体結合ドメイン、融合ペプチド）をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターと医薬的に許容し得る担体とを含む。

一実施形態において、組成物は、１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列を含む核酸分子をコードするポリヌクレオチドを含む第１発現ベクターと、ＲＮＡ結合ドメインを含むポリペプチド及び１つ又は複数の輸送ペプチド配列（例えば、細胞貫通ペプチド、非古典的分泌ドメイン、エンドソーム放出ドメイン、受容体結合ドメイン、融合ペプチド）をコードするポリヌクレオチドを含む第２発現ベクターと、医薬的に許容し得る担体とを含む。一実施形態において、組成物は、１つ又は複数の更なる遺伝子標的（単数又は複数）をターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列を含む核酸をコードするポリヌクレオチド配列を含む第３発現ベクターを更に含む。一実施形態において、更なるポリヌクレオチド配列は、更なる遺伝子標的をターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列及びＲＮＡ認識配列を含む核酸をコードする。別の一実施形態において、ベクター中における生物活性ＲＮＡ配列の内の１つが、短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）又は短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である場合、発現ベクターは、ダイサー及び／又はドローシャをターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列を含む核酸をコードするポリヌクレオチドを更に含む。

一実施形態において、組成物は、医薬的に許容し得る担体中において、１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列を含む核酸をコードするポリヌクレオチド、並びにウイルス複製のために必要な１つ又は複数のウイルスポリメラーゼ及び１つ又は複数のウイルスアクセサリータンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を含む第１発現ベクターと、１つ又は複数のウイルスコートタンパク質及び１つ又は複数のウイルス融合タンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を含む第２発現ベクターとを含む。

一実施形態において、組成物は、第１発現カセットが、第１プロモーター配列、１つ又は複数の標的遺伝子に向けられた１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列、場合によって末端ミニヘリックス配列、終止配列及び場合によって１つ又は複数のプライマー配列を含み、第２発現カセットが、第２プロモーター配列、ＲＮＡ結合ドメイン配列、輸送ペプチド配列、ポリＡ付加配列及び場合によって１以上のプライマー配列を含む、第１発現カセット及び第２発現カセットを含む発現ベクターと医薬的に許容し得る担体とを含む。これらの実施形態において、生物活性ＲＮＡ配列（単数又は複数）、認識ＲＮＡ配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列は、第１プロモーター配列及び終止配列に作動可能に連結し、ＲＮＡ結合ドメイン配列及び輸送ペプチド配列は、第２プロモーター配列及びポリＡ付加配列に作動可能に連結する。

別の一実施形態において、組成物は、第１発現カセットが、第１プロモーター配列、１つ又は複数の標的遺伝子に向けられた１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列、場合によって末端ミニヘリックス配列、終止配列及び場合によって１つ又は複数のプライマー配列を含み、第２発現カセットが、第２プロモーター配列、ＲＮＡ結合ドメイン配列、輸送ペプチド配列、ポリＡ付加配列及び場合によって１つ又は複数のプライマー配列を含み、第３発現カセットが、１つ又は複数のプロモーター配列、ウイルス複製のために必要な１つ又は複数のウイルスポリメラーゼ及び１つ又は複数のウイルスアクセサリータンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列、１つ又は複数のポリＡ付加配列及び場合によって１つ又は複数のプライマー配列を含む、第１発現カセット、第２発現カセット及び第３発現カセットを含む第１発現ベクターと、１つ又は複数のプロモーター配列、１つ又は複数のウイルスコートタンパク質及び１つ又は複数のウイルス融合タンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列、１つ又は複数のポリＡ付加配列及び場合によって１つ又は複数のプライマー配列を含む第４発現カセットを含む第２発現ベクターと、医薬的に許容し得る担体とを含む。これらの実施形態において、生物活性ＲＮＡ配列（単数又は複数）、認識ＲＮＡ配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列は、第１プロモーター配列及び終止配列に作動可能に連結し、ＲＮＡ結合ドメイン配列及び輸送ペプチド配列は、第２プロモーター配列及びポリＡ付加配列に作動可能に連結し、ウイルスポリメラーゼ（単数又は複数）及びウイルスアクセサリータンパク質（単数又は複数）をコードするポリヌクレオチド配列（単数又は複数）は、１つ又は複数のプロモーター配列及び１つ又は複数のポリＡ付加配列に作動可能に連結し、ウイルスコートタンパク質及びウイルス融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列（単数又は複数）は、１つ又は複数のプロモーター配列及び１つ又は複数のポリＡ付加配列に作動可能に連結する。

本発明の発現ベクター及び組成物は、本発明のＲＮＡ−タンパク質複合体を産生する「バイオリアクター」細胞を作製するために使用され得る。ＲＮＡ−タンパク質複合体のＲＮＡ部分は、１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列を含む。ＲＮＡ−複合体のタンパク質部分は、ＲＮＡ結合ドメイン及び１つ又は複数の輸送ペプチド配列を含む。転写産物は、細胞核から細胞質へ搬出され、そこでＲＮＡ結合ドメイン及び輸送ペプチド配列（単数又は複数）を含む転写産物が翻訳される。翻訳されたペプチドのＲＮＡ結合ドメインは、ＲＮＡ部分の認識ＲＮＡ配列と相互作用し、ＲＮＡ−タンパク質複合体を形成する。タンパク質−ＲＮＡ複合体が、続いて細胞から分泌され、細胞外マトリックス及び／又は隣接する細胞に移入され、そこで生物活性ＲＮＡが作用して遺伝子発現を調節する。

一実施形態において、本発明は、本明細書において提供される発現ベクター及びそれらの組成物のいずれかを含む細胞を提供する。一実施形態において、本発明は、生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列を含む核酸をコードするポリヌクレオチド配列、並びにＲＮＡ結合ドメイン配列及び輸送ペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む細胞を提供する。

一実施形態において、本発明は、生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列を含む核酸をコードするポリヌクレオチド配列、ＲＮＡ結合ドメイン配列及び輸送ペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、並びにウイルス複製のために必要な１つ又は複数のウイルスポリメラーゼ及び１つ又は複数のウイルスアクセサリータンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターと１つ又は複数のウイルスコートタンパク質及び１つ又は複数のウイルス融合タンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターとを含む細胞を提供する。

一実施形態において、本発明は、生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列を含む核酸をコードするポリヌクレオチド配列、ＲＮＡ結合ドメイン配列及び輸送ペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、並びに１つ又は複数の更なる遺伝子標的（単数又は複数）をターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列を含む核酸をコードする更なるポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む細胞を提供する。一実施形態において、更なるポリヌクレオチド配列は、更なる遺伝子標的をターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列及びＲＮＡ認識配列を含む核酸をコードする。別の一実施形態において、ベクター中における生物活性ＲＮＡ配列の内の１つが、短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）又は短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である場合、更なるポリヌクレオチド配列は、ダイサー及び／又はドローシャをターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列を含む核酸をコードする。

一実施形態において、本発明は、生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列を含む核酸をコードするポリヌクレオチド配列、ＲＮＡ結合ドメイン配列及び輸送ペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、ウイルス複製のために必要な１つ又は複数のウイルスポリメラーゼ及び１つ又は複数のウイルスアクセサリータンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列、並びに１つ又は複数の更なる遺伝子標的（単数又は複数）（例えば、ダイサー及び／又はドローシャ遺伝子標的）をターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列を含む核酸をコードする更なるポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターと１つ又は複数のウイルスコートタンパク質及び１つ又は複数のウイルス融合タンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターとを含む細胞を提供する。

一実施形態において、本発明は、生物活性ＲＮＡ配列を含む核酸をコードするポリヌクレオチド配列並びにウイルス複製のために必要な１つ又は複数のウイルスポリメラーゼ及び１つ又は複数のウイルスアクセサリータンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターと１つ又は複数のウイルスコートタンパク質及び１つ又は複数のウイルス融合タンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターとを含む細胞を提供する。

一実施形態において、本発明は、生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列を含む核酸をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターとＲＮＡ結合ドメイン配列及び１つ又は複数の輸送ペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターとを含む細胞を提供する。一実施形態において、細胞は、第１発現ベクター中における生物活性ＲＮＡの遺伝子標的（単数又は複数）とは異なる１つ又は複数の遺伝子標的（単数又は複数）をターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列を含む核酸をコードするポリヌクレオチド配列を含む第３発現ベクターを更に含む。一実施形態において、第３発現ベクターは、１つ又は複数の遺伝子標的をターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列及びＲＮＡ認識配列を含む核酸をコードするポリヌクレオチド配列を含む。別の一実施形態において、第１発現ベクター中における生物活性ＲＮＡ配列の内の１つが、短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）又は短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である場合、第３発現ベクターは、ダイサー及び／又はドローシャをターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列を含む核酸をコードするポリヌクレオチド配列を含む。

本発明はまた、本発明のバイオリアクター細胞と医薬的に許容し得る担体とを含む組成物をも提供する。組成物は、本明細書に記載されるバイオリアクター細胞のいずれかと医薬的に許容し得る担体とを含むことができる。一実施形態において、組成物は、本発明の発現ベクターを含む１つ又は複数の細胞と医薬的に許容し得る担体とを含む。細胞は、本明細書に記載される発現ベクターのいずれかの内の１つ又は複数を含むことができる。一実施形態において、本発明は、本発明のＲＮＡ−複合体を発現する１つ又は複数のバイオリアクター細胞と医薬的に許容し得る担体とを含む組成物を提供する。一実施形態において、組成物は、１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列、場合によって末端ミニヘリックス配列、ＲＮＡ結合ドメイン及び１つ又は複数の輸送ペプチド配列を含むＲＮＡ−タンパク質複合体を発現する１つ又は複数の細胞を含む。一実施形態において、組成物は、１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列、場合によって末端ミニヘリックス配列、ＲＮＡ結合ドメイン及び細胞貫通ペプチド配列を含むＲＮＡ−タンパク質複合体を発現する１つ又は複数の細胞と医薬的に許容し得る担体とを含む。一実施形態において、組成物は、１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列、場合によって末端ミニヘリックス配列、ＲＮＡ結合ドメイン及び非古典的分泌ドメインを含むＲＮＡ−タンパク質複合体を発現する１つ又は複数の細胞と医薬的に許容し得る担体とを含む。一実施形態において、組成物は、１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列、場合によって末端ミニヘリックス配列、ＲＮＡ結合ドメイン、細胞貫通ペプチド配列及び非古典的分泌ドメインを含むＲＮＡ−タンパク質複合体を発現する１つ又は複数の細胞と医薬的に許容し得る担体とを含む。

本発明の１つ又は複数の発現ベクターを含むバイオリアクター細胞は、本発明のＲＮＡ−タンパク質複合体を産生し、分泌することが可能である。更に、バイオリアクター細胞は、１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ（単数又は複数）の他の標的細胞及び組織への送達のための新規なトランスフェクション試薬としてインビトロ、エクスビボ及びインビボで有用である。したがって、本発明は、（ａ）１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ、認識ＲＮＡ配列、場合によって末端ミニヘリックス配列、ＲＮＡ結合ドメイン配列及び（例えば、細胞貫通ペプチド、非古典的分泌ドメイン、エンドソーム放出ドメイン、受容体結合ドメイン及び融合ペプチド配列から選択される）１つ又は複数の輸送ペプチド配列を含むＲＮＡ−タンパク質複合体をコードする発現ベクターを調製するステップ、（ｂ）培養細胞にステップ（ａ）の発現ベクターを投与して、ＲＮＡ−タンパク質複合体を発現する１つ又は複数のバイオリアクター細胞を作製するステップ、及び（ｃ）トランスフェクション試薬としてのステップ（ｂ）の培養細胞を回収するステップを含む、１つ又は複数のバイオリアクター細胞を含むトランスフェクション試薬を作製する方法を提供する。一実施形態において、方法は、（ｄ）ＲＮＡ−タンパク質複合体を発現するバイオリアクター細胞を決定するために（ｃ）の細胞を試験すること、及び（ｅ）トランスフェクション試薬としての使用のための他の培養細胞からバイオリアクター細胞を単離することを更に含む。発現ベクターは、本明細書に記載される発現ベクターのいずれかであってよい。ＲＮＡ−タンパク質複合体は、本明細書に記載されるＲＮＡ−タンパク質複合体のいずれかであってよい。一実施形態において、ＲＮＡ−タンパク質複合体の生物活性ＲＮＡは、ｓｈＲＮＡである。別の一実施形態において、ＲＮＡ−タンパク質複合体の生物活性ＲＮＡは、アプタマーである。一実施形態において、ステップ（ｂ）の細胞に発現ベクターを安定してトランスフェクトする。

別の一実施形態において、本発明は、（ａ）１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ、認識ＲＮＡ配列、場合によって末端ミニヘリックス配列を含む核酸をコードするポリヌクレオチド配列、ＲＮＡ結合ドメイン及び１つ又は複数の輸送ペプチド配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、並びに１つ又は複数の更なる遺伝子標的（単数又は複数）をターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列を含む核酸をコードする更なるポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを調製するステップ、（ｂ）培養細胞にステップ（ａ）の発現ベクターを投与して、ＲＮＡ−タンパク質複合体を発現する１つ又は複数のバイオリアクター細胞を作製するステップ、及び（ｃ）トランスフェクション試薬としてのステップ（ｂ）の培養細胞を回収するステップを含む、１つ又は複数のバイオリアクター細胞を含むトランスフェクション試薬を作製するための方法を提供する。一実施形態において、方法は、（ｄ）ＲＮＡ−タンパク質複合体を発現するバイオリアクター細胞を決定するために（ｄ）の細胞を試験すること、及び（ｅ）トランスフェクション試薬としての使用のための他の培養細胞からバイオリアクター細胞を単離することを更に含む。一実施形態において、更なるポリヌクレオチド配列は、更なる遺伝子標的をターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列及びＲＮＡ認識配列を含む核酸をコードする。別の一実施形態において、ベクター中における生物活性ＲＮＡ配列の内の１つが、短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）又は短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である場合、更なるポリヌクレオチド配列は、ダイサー及び／又はドローシャをターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列を含む核酸をコードする。

別の一実施形態において、本発明は、（ａ）１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ、認識ＲＮＡ配列、場合によって末端ミニヘリックス配列を含む核酸をコードするポリヌクレオチド配列、ＲＮＡ結合ドメイン及び１つ又は複数の輸送ペプチド配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、並びにウイルス複製のために必要な１つ又は複数のウイルスポリメラーゼ及び１つ又は複数のウイルスアクセサリータンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを調製するステップ、（ｂ）１つ又は複数のウイルスコートタンパク質及び１つ又は複数のウイルス融合タンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを調製するステップ、（ｃ）培養細胞にステップ（ａ）の発現ベクター及びステップ（ｂ）の発現ベクターを投与して、ＲＮＡ−タンパク質複合体を発現する１つ又は複数のバイオリアクター細胞（この場合、ウイルス産生細胞）を作製するステップ、及び（ｄ）トランスフェクション試薬としてのステップ（ｃ）の培養細胞を回収するステップを含む、１つ又は複数のバイオリアクター細胞を含むトランスフェクション試薬を作製するための方法を提供する。一実施形態において、方法は、（ｅ）ＲＮＡ−タンパク質複合体を発現するバイオリアクター細胞を決定するために（ｄ）の細胞を試験すること、及び（ｆ）トランスフェクション試薬としての使用のための他の培養細胞からバイオリアクター細胞を単離することを更に含む。

別の一実施形態において、本発明は、（ａ）１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ、認識ＲＮＡ配列、場合によって末端ミニヘリックス配列を含む核酸をコードするポリヌクレオチド配列、ＲＮＡ結合ドメイン及び１つ又は複数の輸送ペプチド配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、１つ又は複数の更なる遺伝子標的（単数又は複数）をターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列を含む核酸をコードする更なるポリヌクレオチド配列、並びにウイルス複製のために必要な１つ又は複数のウイルスポリメラーゼ及び１つ又は複数のウイルスアクセサリータンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを調製するステップ、（ｂ）１つ又は複数のウイルスコートタンパク質及び１つ又は複数のウイルス融合タンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを調製するステップ、（ｃ）培養細胞にステップ（ａ）の発現ベクター及びステップ（ｂ）の発現ベクターを投与して、ＲＮＡ−タンパク質複合体を発現する１つ又は複数のバイオリアクター細胞（この場合、ウイルス産生細胞）を作製するステップ、及び（ｄ）トランスフェクション試薬としてのステップ（ｃ）の培養細胞を回収するステップを含む、１つ又は複数のバイオリアクター細胞を含むトランスフェクション試薬を作製するための方法を提供する。一実施形態において、方法は、（ｅ）ＲＮＡ−タンパク質複合体を発現するバイオリアクター細胞を決定するために（ｄ）の細胞を試験すること、及び（ｆ）トランスフェクション試薬としての使用のための他の培養細胞からバイオリアクター細胞を単離することを更に含む。一実施形態において、更なるポリヌクレオチド配列は、更なる遺伝子標的をターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列及びＲＮＡ認識配列を含む核酸をコードする。別の一実施形態において、ベクター中における生物活性ＲＮＡ配列の内の１つが、短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）又は短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である場合、更なるポリヌクレオチド配列は、ダイサー及び／又はドローシャをターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列を含む核酸をコードする。

別の一実施形態において、本発明は、（ａ）１つ又は複数の生物活性ＲＮＡを含む核酸をコードするポリヌクレオチド配列、並びにウイルス複製のために必要な１つ又は複数のウイルスポリメラーゼ及び１つ又は複数のウイルスアクセサリータンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを調製するステップ、（ｂ）１つ又は複数のウイルスコートタンパク質及び１つ又は複数のウイルス融合タンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを調製するステップ、（ｃ）培養細胞にステップ（ａ）の発現ベクター及びステップ（ｂ）の発現ベクターを投与して、生物活性ＲＮＡを発現する１つ又は複数のバイオリアクター細胞（この場合、ウイルス産生細胞）を作製するステップ、及び（ｄ）トランスフェクション試薬としてのステップ（ｃ）の培養細胞を回収するステップを含む、１つ又は複数のバイオリアクター細胞を含むトランスフェクション試薬を作製するための方法を提供する。一実施形態において、方法は、（ｅ）ＲＮＡ−タンパク質複合体を発現するバイオリアクター細胞を決定するために（ｄ）の細胞を試験すること、及び（ｆ）トランスフェクション試薬としての使用のための他の培養細胞からバイオリアクター細胞を単離することを更に含む。

別の一実施形態において、本発明は、（ａ）１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ、認識ＲＮＡ配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列を含む核酸をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを調製するステップ、（ｂ）ＲＮＡ結合ドメイン及び１つ又は複数の輸送ペプチド配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを調製するステップ、（ｃ）培養細胞にステップ（ａ）の発現ベクター及びステップ（ｂ）の発現ベクターを投与して、ＲＮＡ−タンパク質複合体を発現する１つ又は複数のバイオリアクター細胞を作製するステップ、及び（ｄ）トランスフェクション試薬としてのステップ（ｃ）の培養細胞を回収するステップを含む、１つ又は複数のバイオリアクター細胞を含むトランスフェクション試薬を作製するための方法を提供する。一実施形態において、方法は、（ｅ）ＲＮＡ−タンパク質複合体を発現するバイオリアクター細胞を決定するために（ｄ）の細胞を試験すること、及び（ｆ）トランスフェクション試薬としての使用のための他の培養細胞からバイオリアクター細胞を単離することを更に含む。

本発明はまた、インビトロ、エクスビボ及びインビボの標的細胞が含まれる標的細胞への生物活性ＲＮＡの送達のためのバイオリアクター細胞を使用する方法をも提供する。一実施形態において、生物活性ＲＮＡを標的細胞に送達する方法は、（ａ）生物活性ＲＮＡ、認識ＲＮＡ配列、場合によって末端ミニヘリックス配列、ＲＮＡ結合ドメイン、並びに細胞貫通ドメイン、非古典的分泌ドメイン、エンドソーム放出ドメイン、融合ペプチド及び受容体結合ドメインから選択される１つ又は複数の輸送ペプチド配列を含むＲＮＡ−タンパク質複合体をコードする発現ベクターを調製するステップ、（ｂ）培養細胞にステップ（ａ）の発現ベクターを投与して、ＲＮＡ−タンパク質複合体を発現するバイオリアクター細胞を作製するステップ、（ｃ）ステップ（ｂ）の培養細胞を回収するステップ、及び（ｄ）１つ又は複数の標的細胞とステップ（ｃ）において回収された培養細胞（単数又は複数）とを混合して、生物活性ＲＮＡを標的細胞に送達するステップを含む。一実施形態において、標的細胞は培養細胞である。別の一実施形態において、標的細胞は、対象、例えばヒト対象が含まれる哺乳動物対象から得られた培養細胞である。一実施形態において、ステップ（ａ）の発現ベクターは、１つ又は複数の更なる遺伝子標的（単数又は複数）をターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列を含む核酸をコードする更なるポリヌクレオチド配列を更に含む。一実施形態において、更なるポリヌクレオチド配列は、更なる遺伝子標的をターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列及びＲＮＡ認識配列を含む核酸をコードする。別の一実施形態において、ベクター中における生物活性ＲＮＡ配列の内の１つが、短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）又は短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である場合、更なるポリヌクレオチド配列は、ダイサー及び／又はドローシャをターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列を含む核酸をコードする。

別の一実施形態において、生物活性ＲＮＡを標的細胞に送達する方法は、（ａ）１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ、認識ＲＮＡ配列、場合によって末端ミニヘリックス配列を含む核酸をコードするポリヌクレオチド配列、ＲＮＡ結合ドメイン及び１つ又は複数の輸送ペプチド配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、並びにウイルス複製のために必要な１つ又は複数のウイルスポリメラーゼ及び１つ又は複数のウイルスアクセサリータンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを調製するステップ、（ｂ）１つ又は複数のウイルスコートタンパク質及び１つ又は複数のウイルス融合タンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを調製するステップ、（ｃ）培養細胞にステップ（ａ）の発現ベクター及びステップ（ｂ）の発現ベクターを投与して、ＲＮＡ−タンパク質複合体を発現する１つ又は複数のバイオリアクター細胞（この場合、ウイルス産生細胞）を作製するステップ、（ｄ）ステップ（ｃ）の培養細胞を回収するステップ、及び（ｅ）１つ又は複数の標的細胞とステップ（ｄ）において回収された培養細胞（単数又は複数）とを混合して、生物活性ＲＮＡを標的細胞に送達するステップを含む。一実施形態において、標的細胞は培養細胞である。別の一実施形態において、標的細胞は、対象、例えばヒト対象が含まれる哺乳動物対象から得られた培養細胞である。一実施形態において、ステップ（ａ）の発現ベクターは、１つ又は複数の更なる遺伝子標的（単数又は複数）をターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列を含む核酸をコードする更なるポリヌクレオチド配列を更に含む。一実施形態において、更なるポリヌクレオチド配列は、更なる遺伝子標的をターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列及びＲＮＡ認識配列を含む核酸をコードする。別の一実施形態において、ベクター中における生物活性ＲＮＡ配列の内の１つが、短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）又は短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である場合、更なるポリヌクレオチド配列は、ダイサー及び／又はドローシャをターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列を含む核酸をコードする。

別の一実施形態において、生物活性ＲＮＡを標的細胞に送達するための方法は、（ａ）１つ又は複数の生物活性ＲＮＡを含む核酸をコードするポリヌクレオチド配列、並びにウイルス複製のために必要な１つ又は複数のウイルスポリメラーゼ及び１つ又は複数のウイルスアクセサリータンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを調製するステップ、（ｂ）１つ又は複数のウイルスコートタンパク質及び１つ又は複数のウイルス融合タンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを調製するステップ、（ｃ）培養細胞にステップ（ａ）の発現ベクター及びステップ（ｂ）の発現ベクターを投与して、生物活性ＲＮＡを発現する１つ又は複数のバイオリアクター細胞（この場合、ウイルス産生細胞）を作製するステップ、（ｄ）ステップ（ｃ）の培養細胞を回収するステップ、及び（ｅ）１つ又は複数の標的細胞とステップ（ｄ）において回収された培養細胞（単数又は複数）とを混合して、生物活性ＲＮＡを標的細胞に送達するステップを含む。一実施形態において、標的細胞は培養細胞である。別の一実施形態において、標的細胞は、対象、例えばヒト対象が含まれる哺乳動物対象から得られた培養細胞である。

別の一実施形態において、生物活性ＲＮＡを標的細胞に送達するための方法は、（ａ）１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ、認識ＲＮＡ配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列を含む核酸をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを調製するステップ、（ｂ）ＲＮＡ結合ドメイン及び１つ又は複数の輸送ペプチド配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを調製するステップ、（ｃ）培養細胞にステップ（ａ）の発現ベクター及びステップ（ｂ）の発現ベクターを投与して、ＲＮＡ−タンパク質複合体を発現する１つ又は複数のバイオリアクター細胞を作製するステップ、（ｄ）ステップ（ｃ）の培養細胞を回収するステップ、（ｅ）１つ又は複数の標的細胞とステップ（ｄ）において回収された培養細胞（単数又は複数）とを混合して、生物活性ＲＮＡを標的細胞に送達するステップを含む。一実施形態において、標的細胞は培養細胞である。別の一実施形態において、標的細胞は、対象、例えばヒト対象が含まれる哺乳動物対象から得られた培養細胞である。

一実施形態において、標的細胞は、対象、例えばヒト対象が含まれる哺乳動物対象から摘出された細胞である。したがって、一実施形態において、生物活性ＲＮＡを標的細胞に送達する方法は、（ａ）生物活性ＲＮＡ、認識ＲＮＡ配列、場合によって末端ミニヘリックス配列、ＲＮＡ結合ドメイン、並びに細胞貫通ドメイン、非古典的分泌ドメイン、エンドソーム放出ドメイン、融合ペプチド及び受容体結合ドメインから選択される１つ又は複数の輸送ペプチド配列を含むＲＮＡ−タンパク質複合体をコードする発現ベクターを調製するステップ、（ｂ）培養細胞にステップ（ａ）の発現ベクターを投与して、ＲＮＡ−タンパク質複合体を発現するバイオリアクター細胞を作製するステップ、（ｃ）ステップ（ｂ）の培養細胞を回収するステップ、及び（ｄ）対象から摘出された１つ又は複数の標的細胞とステップ（ｃ）において回収された培養細胞（単数又は複数）とを混合して、生物活性ＲＮＡを標的細胞に送達するステップを含む。一実施形態において、方法は、対象、例えばヒト対象が含まれる哺乳動物対象にステップ（ｄ）の細胞を投与するステップを更に含む。別の一実施形態において、方法は、標的細胞を対象に投与する前にステップ（ｄ）の標的細胞からバイオリアクター細胞を分離するステップを更に含む。一実施形態において、ステップ（ａ）の発現ベクターは、１つ又は複数の更なる遺伝子標的（単数又は複数）をターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列を含む核酸をコードする更なるポリヌクレオチド配列を更に含む。一実施形態において、更なるポリヌクレオチド配列は、更なる遺伝子標的をターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列及びＲＮＡ認識配列を含む核酸をコードする。別の一実施形態において、ベクター中における生物活性ＲＮＡ配列の内の１つが、短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）又は短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である場合、更なるポリヌクレオチド配列は、ダイサー及び／又はドローシャをターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列を含む核酸をコードする。

一実施形態において、生物活性ＲＮＡを標的細胞に送達する方法は、（ａ）１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ、認識ＲＮＡ配列、場合によって末端ミニヘリックス配列、ＲＮＡ結合ドメイン及び１つ又は複数の輸送ペプチド配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、並びにウイルス複製のために必要な１つ又は複数のウイルスポリメラーゼ及び１つ又は複数のウイルスアクセサリータンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を含む核酸をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを調製するステップ、（ｂ）１つ又は複数のウイルスコートタンパク質及び１つ又は複数のウイルス融合タンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを調製するステップ、（ｃ）培養細胞にステップ（ａ）の発現ベクター及びステップ（ｂ）の発現ベクターを投与して、ＲＮＡ−タンパク質複合体を発現する１つ又は複数のバイオリアクター細胞（この場合、ウイルス産生細胞）を作製するステップ、（ｄ）ステップ（ｃ）の培養細胞を回収するステップ、及び（ｅ）対象から摘出された１つ又は複数の標的細胞とステップ（ｃ）において回収された培養細胞（単数又は複数）とを混合して、生物活性ＲＮＡを標的細胞に送達するステップを含む。一実施形態において、方法は、対象、例えばヒト対象が含まれる哺乳動物対象にステップ（ｅ）の細胞を投与するステップを更に含む。別の一実施形態において、方法は、標的細胞を対象に投与する前にステップ（ｅ）の標的細胞からバイオリアクター細胞を分離するステップを更に含む。一実施形態において、ステップ（ａ）の発現ベクターは、１つ又は複数の更なる遺伝子標的（単数又は複数）をターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列を含む核酸をコードする更なるポリヌクレオチド配列を更に含む。一実施形態において、更なるポリヌクレオチド配列は、更なる遺伝子標的をターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列及びＲＮＡ認識配列を含む核酸をコードする。別の一実施形態において、ベクター中における生物活性ＲＮＡ配列の内の１つが、短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）又は短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である場合、更なるポリヌクレオチド配列は、ダイサー及び／又はドローシャをターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列を含む核酸をコードする。

別の一実施形態において、生物活性ＲＮＡを標的細胞に送達するための方法は、（ａ）１つ又は複数の生物活性ＲＮＡを含む核酸をコードするポリヌクレオチド配列、並びにウイルス複製のために必要な１つ又は複数のウイルスポリメラーゼ及び１つ又は複数のウイルスアクセサリータンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを調製するステップ、（ｂ）１つ又は複数のウイルスコートタンパク質及び１つ又は複数のウイルス融合タンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを調製するステップ、（ｃ）培養細胞にステップ（ａ）の発現ベクター及びステップ（ｂ）の発現ベクターを投与して、生物活性ＲＮＡを発現する１つ又は複数のバイオリアクター細胞（この場合、ウイルス産生細胞）を作製するステップ、（ｄ）ステップ（ｃ）の培養細胞を回収するステップ、及び（ｅ）対象から摘出された１つ又は複数の標的細胞とステップ（ｃ）において回収された培養細胞（単数又は複数）とを混合して、生物活性ＲＮＡを標的細胞に送達するステップを含む。一実施形態において、方法は、対象、例えばヒト対象が含まれる哺乳動物対象にステップ（ｅ）の細胞を投与するステップを更に含む。別の一実施形態において、方法は、標的細胞を対象に投与する前にステップ（ｅ）の標的細胞からバイオリアクター細胞を分離するステップを更に含む。

別の一実施形態において、生物活性ＲＮＡを標的細胞に送達するための方法は、（ａ）１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ、認識ＲＮＡ配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列を含む核酸をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを調製するステップ、（ｂ）ＲＮＡ結合ドメイン及び１つ又は複数の輸送ペプチド配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを調製するステップ、（ｃ）培養細胞にステップ（ａ）の発現ベクター及びステップ（ｂ）の発現ベクターを投与して、ＲＮＡ−タンパク質複合体を発現する１つ又は複数のバイオリアクター細胞を作製するステップ、（ｄ）ステップ（ｃ）の培養細胞を回収するステップ、及び（ｅ）対象から摘出された１つ又は複数の標的細胞とステップ（ｃ）において回収された培養細胞（単数又は複数）とを混合して、生物活性ＲＮＡを標的細胞に送達するステップを含む。一実施形態において、方法は、対象、例えばヒト対象が含まれる哺乳動物対象にステップ（ｅ）の細胞を投与するステップを更に含む。別の一実施形態において、方法は、標的細胞を対象に投与する前にステップ（ｅ）の標的細胞からバイオリアクター細胞を分離するステップを更に含む。

本発明は、バイオリアクター細胞から１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ分子を分泌するための方法と、インビボ、エクスビボ及びインビトロで標的遺伝子発現を調節するための方法とを提供する。本発明は、対象となる１つ又は複数の遺伝子をターゲッティングする少なくとも１つの生物活性ＲＮＡ分子と、細胞外マトリックス並びに／又は隣接する細胞及び組織に生物活性ＲＮＡ分子（単数又は複数）を送達し得る融合タンパク質とを含むＲＮＡ−タンパク質複合体を産生するように設計された発現ベクターを提供する。インビボ、エクスビボ及びインビトロでの細胞への発現ベクターの投与は、ＲＮＡ−タンパク質複合体として分泌される生物活性ＲＮＡ分子を産生し、細胞外マトリックス及び／又は他の隣接する細胞に送達する「バイオリアクター」に細胞を転化させる。したがって、ＲＮＡ仲介効果は、生物活性ＲＮＡの産生並びに周囲の細胞及び組織への送達を通して増幅される。

一実施形態において、本発明は、本発明の１つ又は複数の発現ベクターを対象に投与することを含む、対象における１つ又は複数の標的遺伝子（単数又は複数）の発現を調節するための方法を提供する。別の一実施形態において、本発明は、本発明の１つ又は複数の発現ベクターと医薬的に許容し得る担体とを含む組成物を対象に投与することを含む、対象における１つ又は複数の標的遺伝子（単数又は複数）の発現を調節するための方法を提供する。別の一実施形態において、本発明は、本発明の１つ又は複数の発現ベクターを含む細胞と医薬的に許容し得る担体とを対象に投与することを含む、対象における１つ又は複数の標的遺伝子（単数又は複数）の発現を調節するための方法を提供する。発現ベクターは、本明細書に記載される本発明の発現ベクターのいずれかであってよい。

一実施形態において、本発明は、本発明の１つ又は複数のバイオリアクター細胞を対象に投与することを含む、対象における１つ又は複数の標的遺伝子（単数又は複数）の発現を調節するための方法を提供する。別の一実施形態において、本発明は、本発明の１つ又は複数のバイオリアクター細胞と、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、生理食塩水又は５％デキストロースが含まれるが限定されない医薬的に許容し得る担体とを含む組成物を対象に投与することを含む、対象における１つ又は複数の標的遺伝子（単数又は複数）の発現を調節するための方法を提供する。バイオリアクター細胞（単数又は複数）は、本明細書に記載される本発明のバイオリアクター細胞（単数又は複数）のいずれかであってよい。一実施形態において、バイオリアクター細胞（単数又は複数）は、標的遺伝子（単数又は複数）に向けられた１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列、場合によって末端ミニヘリックス配列、ＲＮＡ結合ドメイン配列、並びに例えば細胞貫通ペプチド配列、非古典的分泌ドメイン、エンドソーム放出ドメイン、受容体結合ドメイン及び融合ペプチドから選択される１つ又は複数の輸送ペプチド配列を含むＲＮＡ−タンパク質複合体を産生し、分泌する。

本明細書に記載される対象における遺伝子発現を調節する方法のいずれかにおいて、対象は、例えばヒト、齧歯動物、ネズミ、ウシ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウマ及びサル対象が含まれる哺乳動物対象であってよい。

本発明は、本発明の１つ又は複数の発現ベクターを対象に投与することを含む、対象における欠損遺伝子発現及び／又は活性に伴う疾患又は状態を予防し、寛解させ及び／又は治療する方法を更に提供する。一実施形態において、本発明は、本発明の１つ又は複数の発現ベクターと医薬的に許容し得る担体とを含む組成物を対象に投与することを含む、対象における欠損遺伝子発現及び／又は活性に伴う疾患又は状態を予防し、寛解させ及び／又は治療する方法を提供する。一実施形態において、本発明は、本発明の１つ又は複数の発現ベクターを含む細胞と医薬的に許容し得る担体とを対象に投与することを含む、対象における欠損遺伝子発現及び／又は活性に伴う疾患又は状態を予防し、寛解させ及び／又は治療する方法を提供する。発現ベクターは、本明細書に記載される本発明の発現ベクターのいずれかであってよい。

特定の一実施形態において、本発明は、本発明の発現ベクターを標的細胞に投与することを含む、標的細胞中における標的遺伝子の発現を調節するための方法であって、標的細胞が本発明のＲＮＡ−タンパク質複合体を産生且つ分泌し、続いてＲＮＡ−タンパク質複合体が細胞外マトリックス又は他の標的細胞に送達される、上記方法を提供する。別の一実施形態において、本発明は、本発明の発現ベクターを含む組成物を標的細胞に投与することを含む、標的細胞中における標的遺伝子の発現を調節するための方法であって、標的細胞が本発明のＲＮＡ−タンパク質複合体を産生且つ分泌し、続いてＲＮＡ−タンパク質複合体が細胞外マトリックス又は他の標的細胞に送達される、上記方法を提供する。別の一実施形態において、本発明は、本発明の発現ベクターを含む細胞を標的細胞に投与することを含む、標的細胞中における標的遺伝子の発現を調節するための方法であって、標的細胞が本発明のＲＮＡ−タンパク質複合体を産生且つ分泌し、続いてＲＮＡ−タンパク質複合体が細胞外マトリックス又は他の標的細胞に送達される、上記方法を提供する。発現ベクターは、本明細書に記載される本発明のいずれかの発現ベクターであってよい。

本発明はまた、エクスビボでの標的細胞中における標的遺伝子の発現を調節するための方法を提供する。一実施形態において、本発明は、本発明の１つ又は複数の発現ベクターをエクスビボで標的細胞に投与することを含む、エクスビボでの標的細胞中における標的遺伝子の発現を調節するための方法を提供する。別の一実施形態において、本発明は、本発明の１つ又は複数の発現ベクターと医薬的に許容し得る担体とを含む組成物をエクスビボで標的細胞に投与することを含む、エクスビボでの標的細胞中における標的遺伝子の発現を調節するための方法を提供する。別の一実施形態において、本発明は、本発明の１つ又は複数の発現ベクターを含むバイオリアクター細胞と医薬的に許容し得る担体とをエクスビボで標的細胞に投与することを含む、エクスビボでの標的細胞中における標的遺伝子の発現を調節するための方法を提供する。発現ベクターは、本明細書に記載される本発明の発現ベクターのいずれかであってよい。

本発明はまた、培養細胞中における遺伝子発現を調節するための方法をも提供する。一実施形態において、本発明は、培養細胞中における１つ又は複数の標的遺伝子（単数又は複数）の発現を調節するための方法であって、本発明の１つ又は複数の発現ベクターを前記細胞に投与することを含む上記方法を提供する。別の一実施形態において、本発明は、培養細胞中における１つ又は複数の標的遺伝子（単数又は複数）の発現を調節するための方法であって、本発明の１つ又は複数の発現ベクターと医薬的に許容し得る担体とを含む組成物を前記細胞に投与することを含む上記方法を提供する。別の一実施形態において、本発明は、培養細胞中における１つ又は複数の標的遺伝子（単数又は複数）の発現を調節するための方法であって、本発明の１つ又は複数の発現ベクターを含むバイオリアクター細胞と医薬的に許容し得る担体とを前記細胞に投与することを含む上記方法を提供する。発現ベクターは、本明細書に記載される本発明の発現ベクターのいずれかであってよい。

一実施形態において、本発明は、培養細胞中における１つ又は複数の標的遺伝子（単数又は複数）の発現を調節するための方法であって、標的遺伝子に向けられた１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列を含む核酸をコードする第１発現ベクターと、ＲＮＡ結合ドメイン、並びに例えば細胞貫通ペプチド配列、非古典的分泌ドメイン、エンドソーム放出ドメイン及び受容体結合ドメインから選択される１つ又は複数の輸送ペプチド配列を含むポリペプチドをコードする第２発現ベクターとを前記細胞に投与することを含む上記方法を提供する。

更に、本発明は、形質転換パッケージング細胞から１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ分子を担持し、分布させる複製欠損又は複製不能ウイルス粒子から構築される発現ベクターを提供する。一実施形態において、本発明は、本明細書に記載される核酸分子のいずれかをコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを提供する。一実施形態において、本発明は、１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列及び認識ＲＮＡ配列を含む核酸分子をコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを提供する。別の一実施形態において、本発明は、１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列及び末端ミニヘリックス配列を含む核酸分子をコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを提供する。生物活性ＲＮＡ配列は、本明細書に記載され、それ以外の場合、本技術分野において公知の生物活性ＲＮＡ配列のいずれかであってよい。一実施形態において、ウイルスベクターは、生物活性ＲＮＡ配列が、リボザイム、アンチセンス核酸、アロザイム、アプタマー、短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及び１つ又は複数の生物活性ペプチドをコードする転写産物から選択される、核酸分子をコードするポリヌクレオチドを含む。特定の一実施形態において、ウイルスベクターは、生物活性ＲＮＡ配列が短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、核酸分子をコードするポリヌクレオチドを含む。特定の一実施形態において、ウイルスベクターは、生物活性ＲＮＡ配列がアプタマーである、核酸分子をコードするポリヌクレオチドを含む。認識ＲＮＡ配列は、本明細書に記載され、それ以外の場合、本技術分野において公知の認識ＲＮＡ配列のいずれかであってよい。一実施形態において、ウイルスベクターベクターは、認識ＲＮＡ配列が、Ｕ１ループ、グループＩＩイントロン、ＮＲＥステムループ、Ｓ１Ａステムループ、バクテリオファージＢｏｘＢＲ、ＨＩＶＲｅｖ応答エレメント、ＡＭＶＣＰ認識配列及びＡＲＥ配列から選択される、核酸分子をコードするポリヌクレオチドを含む。末端ミニヘリックス配列は、本明細書に記載され、それ以外の場合、本技術分野において公知の末端ミニヘリックス配列のいずれかであってよい。一実施形態において、末端ミニヘリックス配列は、アデノウイルスＶＡ１ＲＮＡ分子から選択される。

別の一実施形態において、ウイルスベクターは、ダイサー及び／又はドローシャをターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列を含む核酸分子をコードするポリヌクレオチドを更に含む。これらのポリヌクレオチドのいずれも、ＲＮＡ結合ドメインをコードしない。一実施形態において、ポリヌクレオチドは、単一の生物活性ＲＮＡ配列を含む核酸分子をコードする。別の一実施形態において、ポリヌクレオチドは、２つ以上の生物活性ＲＮＡ配列を含む核酸分子をコードする。ある種の実施形態において、生物活性ＲＮＡ配列は、リボザイム、アンチセンス核酸、アロザイム、アプタマー、短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及び１つ又は複数の生物活性ペプチドをコードする転写産物から選択される。

本発明の核酸分子をコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターの上記実施形態のいずれかにおいて、ポリヌクレオチドは、認識ＲＮＡ配列、個々の生物活性ＲＮＡ配列、場合によって末端ミニヘリックス配列及び他のあらゆる含まれる配列が１つ若しくは複数の介在若しくは付加配列の付加と共に結合するか又は介在配列の付加なしで直接結合する配列を含むことができる。

別の一実施形態において、ウイルスベクターは、ＲＮＡ結合ドメイン、並びに細胞貫通ペプチド、非古典的分泌ドメイン、受容体結合ドメイン、エンドソーム放出ドメイン及び融合ペプチドから選択される１つ又は複数の輸送ペプチド配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。一実施形態において、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、プロモーター配列、終止配列及び場合によって１つ又は複数のプライマー配列を更に含む。別の一実施形態において、ウイルスベクターは、１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列を含む核酸分子をコードするポリヌクレオチドを更に含む。その上更なる一実施形態において、核酸分子をコードするポリヌクレオチドは、プロモーター配列、終止配列及び場合によって１つ又は複数のプライマー配列を更に含む。その上別の一実施形態において、ウイルスベクターは、ダイサー及び／又はドローシャをターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、並びに場合によってプロモーター配列、終止配列及び１つ又は複数のプライマー配列を含む核酸分子をコードするポリヌクレオチドを更に含む。したがって、一実施形態において、ウイルスベクターは、ＲＮＡ結合ドメイン、並びに細胞貫通ペプチド、非古典的分泌ドメイン、受容体結合ドメイン、エンドソーム放出ドメイン及び融合ペプチドから選択される１つ又は複数の輸送ペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列、場合によって末端ミニヘリックス配列を含む核酸分子をコードするポリヌクレオチドを更に含む。一実施形態において、このウイルスベクターは、ダイサー及び／又はドローシャをターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列を含む核酸分子をコードするポリヌクレオチドを更に含むことができる。これらの実施形態のいずれかにおいて、ウイルスベクターは、１つ又は複数のプロモーター配列、１つ又は複数の終止配列及び１つ又は複数のプライマー配列を場合によって含むことができる。

ウイルスベクターの上記実施形態のいずれかにおいて、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ結合ドメイン、細胞貫通ペプチド、非古典的分泌ドメイン、受容体結合ドメイン、エンドソーム放出ドメイン、融合ペプチド及び他のあらゆる含まれる配列（即ち、プロモーター、終止、プライマー、生物活性ＲＮＡ、認識ＲＮＡ、末端ミニヘリックス配列等）のいずれかが１つ若しくは複数の介在若しくは付加配列の付加と共に結合するか又は介在配列の付加なしで直接結合する配列を含むことができる。上記実施形態のいずれかにおいて、ベクターは、個々のドメイン及びペプチドの配列（単数又は複数）が１つ又は複数のリンカー、スペーサー又は他の配列の付加なしで又は付加と共に結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。

本発明はまた、形質転換パッケージング細胞から標的細胞へ生物活性ＲＮＡを送達するための操作された複製欠損ウイルスをも提供する。一実施形態において、本発明は、２つの非依存性ウイルスＲＮＡをコードするプラスミドによるレシピエント細胞のトランスフェクションによって作製されるパッケージング細胞を提供するものであって、一方はウイルス構造遺伝子をコードし、他方は非構造遺伝子及び生物活性ＲＮＡ配列をコードする。一実施形態において、ウイルス非構造及び構造遺伝子は、ＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルスから選択され、適切なウイルスの非限定的な例としては、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、単純ヘルペスウイルスレンチウイルス、レトロウイルス、シンドビスウイルス、フォーミーウイルスがある。生物活性ＲＮＡ配列は、本明細書に記載され、それ以外の場合、本技術分野において公知の生物活性ＲＮＡ配列のいずれかであってよい。一実施形態において、生物活性ＲＮＡ配列は、リボザイム、アンチセンス核酸、アロザイム、アプタマー、短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及び１つ又は複数の生物活性ペプチドをコードする転写産物から選択される。特定の一実施形態において、生物活性ＲＮＡ配列は短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。別の特定の一実施形態において、生物活性ＲＮＡ配列はミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。

両プラスミドの成功した同時トランスフェクションは、複製欠損ウイルス粒子を産生し得るパッケージング細胞を生じる。一実施形態において、本発明は、インビトロ、エクスビボ又はインビボでの細胞のトランスフェクションによって作製されたパッケージング細胞を提供する。更なる一実施形態において、パッケージング細胞を回収し、インビトロで標的細胞と混合する。別の一実施形態において、パッケージング細胞を回収し、インビボで標的細胞中において投与する。更なる一実施形態において、パッケージング細胞を回収し、エクスビボで標的細胞に移す。

生物活性ＲＮＡ分子のベクターに基づいた送達のためのインビボでの作用機序を例示する非限定的な概略図であって、その例示的な生物活性ＲＮＡ分子はｓｈＲＮＡである。示されるように、発現ベクター（ｐＢｉｏＲ）は、認識ＲＮＡ配列及びｓｈＲＮＡを含む核酸分子、並びにＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）及び細胞貫通ペプチド（ＣＰＰ）を含む融合タンパク質を発現する。融合タンパク質は、細胞質中において翻訳され、そこで翻訳された融合タンパク質のＲＮＡ結合ドメインが核酸の認識ＲＮＡ配列に結合し、ＲＮＡ−タンパク質複合体を形成する。ＲＮＡ−タンパク質複合体は、細胞外マトリックス中に分泌され、隣接する細胞によって取り込まれ、そこでｓｈＲＮＡが作用して対象となる標的遺伝子（ＧＯＩ）を調節する。

生物活性ＲＮＡ分子のベクターに基づいた送達のためのインビボでの作用機序を例示する非限定的な概略図であって、その例示的な生物活性ＲＮＡ分子はｓｈＲＮＡである。示されるように、発現ベクター（ｐＢｉｏＲ）は、認識ＲＮＡ配列及びｓｈＲＮＡを含む核酸分子、並びにＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）、非古典的分泌ドメイン（ＮＣＳ）及び細胞貫通ペプチド（ＣＰＰ）を含む融合タンパク質を発現する。融合タンパク質は、細胞質中において翻訳され、そこで翻訳された融合タンパク質のＲＮＡ結合ドメインが核酸の認識ＲＮＡ配列に結合し、ＲＮＡ−タンパク質複合体を形成する。ＲＮＡ−タンパク質複合体は、細胞外マトリックス中に分泌され、隣接する細胞によって取り込まれ、そこでｓｈＲＮＡが作用して対象となる標的遺伝子（ＧＯＩ）を調節する。

生物活性ＲＮＡ分子のベクターに基づいた送達のためのインビボでの作用機序を例示する非限定的な概略図であって、その例示的な生物活性ＲＮＡ分子は、特異的細胞表面受容体をターゲッティングするアプタマーである。示されるように、発現ベクター（ｐＢｉｏＲ）は、認識ＲＮＡ配列及び特異的細胞表面受容体をターゲッティングするアプタマーを含む核酸分子、並びにＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）及び非古典的分泌ドメイン（ＮＣＳ）を含む融合タンパク質を発現する。融合タンパク質は、細胞質中において翻訳され、そこで翻訳された融合タンパク質のＲＮＡ結合ドメインが核酸の認識ＲＮＡ配列に結合し、ＲＮＡ−タンパク質複合体を形成する。ＲＮＡ−タンパク質複合体は、細胞外マトリックス中に分泌される。アプタマーは、標的細胞表面受容体と結合し、受容体リガンドが受容体と結合することを阻止する。

生物活性ＲＮＡ分子のベクターに基づいた送達のためのインビボでの作用機序を例示する非限定的な概略図であって、その例示的な生物活性ＲＮＡ分子は、特異的細胞外マトリックスタンパク質をターゲッティングするアプタマーである。示されるように、発現ベクター（ｐＢｉｏＲ）は、認識ＲＮＡ配列及び特異的細胞外マトリックスタンパク質をターゲッティングするアプタマーを含む核酸分子、並びにＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）及び非古典的分泌ドメイン（ＮＣＳ）を含む融合タンパク質を発現する。融合タンパク質は、細胞質中において翻訳され、そこで翻訳された融合タンパク質のＲＮＡ結合ドメインが核酸の認識ＲＮＡ配列に結合し、ＲＮＡ−タンパク質複合体を形成する。ＲＮＡ−タンパク質複合体は、細胞外マトリックス中に分泌される。アプタマーは、細胞外マトリックスタンパク質と結合し、細胞外マトリックスタンパク質が標的細胞に侵入することを阻止する。細胞外マトリックスタンパク質は、とりわけ細胞表面受容体リガンドであってよく、それによってアプタマーはリガンドに結合し、それがその受容体（図示せず）に結合することを阻止する。

バックボーンプラスミドｐＥＧＥＮ１．１の概略図を示す。ｐＥＧＥＮ１．１は、ＳＶ４０プロモーター配列（１）、イントロン配列（２）、多重クローニング配列（ＭＣＳ）、ヒト成長ホルモンポリＡテイル配列（４）、カナマイシン耐性遺伝子（７）及びｐＵＣ複製開始点（８）を含む。

バックボーンプラスミドｐＥＧＥＮ２．１の概略図を示す。ｐＥＧＥＮ２．１は、ニワトリ−アクチンプロモーター配列（１）、イントロン配列（２）、多重クローニング配列（ＭＣＳ）、ヒト成長ホルモンポリＡテイル配列（４）、カナマイシン耐性遺伝子（７）及びｐＵＣ複製開始点（８）を含む。

バックボーンプラスミドｐＥＧＥＮ３．１の概略図を示す。ｐＥＧＥＮ３．１は、ＣＭＶプロモーター配列（１）、イントロン配列（２）、多重クローニング配列（ＭＣＳ）、ヒト成長ホルモンポリＡテイル配列（４）、カナマイシン耐性遺伝子（７）及びｐＵＣ複製開始点（８）を含む。

バックボーンプラスミドｐＥＧＥＮ４．１の概略図を示す。ｐＥＧＥＮ４．１は、ヒトＵ６プロモーター配列（１）、多重クローニング配列（ＭＣＳ）、ポリＴターミネーター配列（４）、カナマイシン耐性遺伝子（７）及びｐＵＣ複製開始点（８）を含む。

本発明の例示的なＲＮＡ−タンパク質複合体をコードする発現ベクターｐＢｉｏＲＰｏｌＩＩの概略図を示す。ベクターは、Ｓｅｃ−ＲＮＡ配列（３）の上流のＳＶ４０プロモーター（１）及びイントロン配列（２）、並びに下流のｈＧＨポリＡ配列（４）を含む。ベクターはまた、融合タンパク質配列（６）の上流のβ−アクチンプロモーター（５）、及び下流のｈＧＨポリＡ配列（４）をも含む。ベクターはまた、カナマイシン耐性遺伝子（７）及びｐＵＣ複製開始点（８）をも含む。

本発明の例示的なＲＮＡ−タンパク質複合体をコードする発現ベクターｐＢｉｏＲＰｏｌＩＩＩの概略図を示す。ベクターは、Ｓｅｃ−ＲＮＡ配列（３）の上流の上流のｈＵ６プロモーター（１）及びイントロン配列（２）、並びに下流のＰｏｌ−ＩＩＩポリＴターミネーター配列（４）を含む。ベクターはまた、融合タンパク質配列（６）の上流のβ−アクチンプロモーター（５）、及び下流のｈＧＨポリＡ配列（４）をも含む。ベクターはまた、カナマイシン耐性遺伝子（７）及びｐＵＣ複製開始点（８）をも含む。

本発明の例示的なＲＮＡ−タンパク質複合体をコードする発現ベクターｐＢｉｏＲＰｏｌＩＩｃｏｍｂｏの概略図を示す。ベクターは、β−アクチンプロモーター（１）、イントロン配列（２）、融合タンパク質カセット（６）、融合タンパク質に対して内部のフランキングイントロン（２）を有するＳｅｃ−ＲＮＡカセット（３）、ヒト成長ホルモンポリＡテイル配列（４）、カナマイシン耐性遺伝子（７）及びｐＵＣ複製開始点（８）を含む。

本発明の例示的なＲＮＡ−タンパク質複合体をコードする発現ベクターｐＢｉｏＲＰｏｌＩＩｓｔａｂｌｅの概略図を示す。ベクターは、ＣＴＳ調節因子（９）、ＰＧＫプロモーター（１）、ピューロマイシン耐性遺伝子（１０）、ニワトリ−アクチンプロモーター（５）、融合タンパク質カセット（６）、融合タンパク質に対して内部のフランキングイントロン（２）を有するＳｅｃ−ＲＮＡカセット（３）、ヒト成長ホルモンポリＡテイル配列（４）、カナマイシン耐性遺伝子（７）及びｐＵＣ複製開始点（８）を含む。

本発明の例示的なＲＮＡ−タンパク質複合体をコードする発現ベクターｐＢｉｏＲＰｏｌＩＩダイサーの概略図を示す。ベクターは、ＳＶ４０プロモーター（１）、イントロン配列（２）、ｓｈＲＮＡ配列（３）、ｈＧＨポリＡテイル配列（４）、ニワトリβ−アクチンプロモーター（５）、融合タンパク質カセット（６）、融合タンパク質に対して内部のフランキングイントロン（２）を有するＳｅｃ−ＲＮＡカセット（１１）、ヒト成長ホルモンポリＡテイル配列（４）、カナマイシン耐性遺伝子（７）及びｐＵＣ複製開始点（８）を含む。

図１４Ａは、バイオリアクター細胞を作製し、ＣＰＰ−ルシフェラーゼ／ＣＰＰ−アルカリホスファターゼレポーター系を使用してそれらの分泌活性を試験するための例示的なトランスフェクションアッセイを示す非限定的な概略図である。図１４Ｂは、ＣＴ２６細胞からのルシフェラーゼレポータータンパク質のＴＡＴ仲介分泌についての結果を示す。ＣＴ２６細胞に、ルシフェラーゼ又はＣＰＰ−ルシフェラーゼ融合タンパク質を発現するプラスミドをトランスフェクトした。アッセイされるＣＰＰドメインは、ＴＡＴ、ＲＥＶ、ＦＨＶ及びペネトラチン（Ｐｅｎ）を含む。４８時間後、細胞培地をＰＢＳと交換し、細胞を３７℃で更に１時間、３時間又は６時間インキュベートした。ＰＢＳ上清を回収し、細胞をＴＥＮＴ緩衝液中に溶解させた。標準法を使用して、可溶化細胞タンパク質及びＰＢＳ上清の当量についてルシフェラーゼ活性を測定した。細胞分画及び上清分画中に存在する相対ルシフェラーゼ活性は、両画分において認められた総ルシフェラーゼ活性の百分率として示される。

分泌ＲＮＡ及びバイオリアクター融合タンパク質の発現のためのプラスミドの構築についての概略図を示す。図１５Ａに示されるように、ｐＥ３．１Ｓｅｃ−レポーターは、ＣＭＶプロモーター配列（１）、イントロン配列（２）、分泌ＲＮＡレポーターコード配列（ＢｏｘＢ配列及びグルカゴン様ペプチド１）（３）、ヒト成長ホルモンポリＡテイル配列（４）、カナマイシン耐性遺伝子（７）及びｐＵＣ複製開始点（８）を含む。図１５Ｂに示すように、ｐＥ１ＴＡＴ−ＲＢＤは、ＳＶ４０プロモーター配列（１）、イントロン配列（２）、融合タンパク質コード配列（即ち、ＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）及び細胞貫通ペプチド（ＴＡＴ））（６）、ヒト成長ホルモンポリＡテイル配列（４）、カナマイシン耐性遺伝子（７）及びｐＵＣ複製開始点（８）を含む。図１５Ｃ〜Ｅは、ｐＥ３．１Ｓｅｃ−レポーター及びｐＥ１ＴＡＴ−ＲＢＤプラスミドの制限酵素分析を示す。図１５Ｃは、新規なＥｃｏＮＩ制限部位がＲＮＡ発現インサートと共に導入されたｐＥ３．１Ｓｅｃ−レポーターの制限酵素分析を示す。図１５Ｄ及び１５Ｅは、２つのｐＥ１ＴＡＴ−ＲＢＤプラスミド（一方は、タンパク質ＮＲＮＡ結合ドメイン（ＴＡＴ＋）に融合したＴＡＴ細胞貫通ペプチドを有する融合タンパク質を発現するもの、他方は、ＲｅｖＲＮＡ結合ドメイン（ＴＡＴ−）に融合したＴＡＴ細胞貫通ペプチドを有する融合タンパク質を発現するもの）の制限酵素及びＰＣＲ分析をそれぞれ示す。これらの図において、（Ｍ）は、サイズマーカーレーンを示す。図１５Ｃにおいて、Ｓｅｃ−レポーター（−）は、ｐＥ３．１Ｓｅｃ−レポータープラスミドだけを指し、Ｓｅｃ−レポーター（＋）は、ＲＮＡ発現インサートを有するｐＥ３．１Ｓｅｃ−レポータープラスミドを指す。図１５Ｄ及び１５Ｅにおいて、ｐ１．１は、ｐＥ１．１プラスミドだけを指し、ＴＡＴ（−）は、ＲｅｖＲＮＡ結合ドメインに融合したＴＡＴ細胞貫通ペプチドを含む融合タンパク質インサートを有するｐＥ１．１プラスミドを指し、ＴＡＴ（＋）は、タンパク質ＮＲＮＡ結合ドメインに融合したＴＡＴ細胞貫通ペプチドを含む融合タンパク質インサートを有するｐＥ１．１プラスミドを指す。

図１６Ａ及び１６Ｂは、分泌ＲＮＡ及びバイオリアクター融合タンパク質に対する発現産物を示す。図１６Ａに示された分泌ＲＮＡレポーター転写産物分析のために、ＣＴ２６細胞にｐＥ３．１Ｓｅｃ−レポーター（図１５Ａ）をトランスフェクトした。４８時間後、未処置の対照細胞及びトランスフェクト細胞からトータル細胞ＲＮＡを回収し、精製ＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲを用いて増幅し、３％低融解アガロースゲル（１×ＴＡＥ）上で分離させた。非トランスフェクト対照細胞（「Ｕ」）は１８ＳｒＲＮＡ内部対照（１８Ｓ）だけを示すのに対して、トランスフェクト細胞は、１８ＳｒＲＮＡ産物と、プラスミドのみに対応する親レポーターＲＮＡ産物（「Ｒ」）又はプラスミド及びＳｅｃ−ＲＮＡ配列インサートに対応する分泌レポーターＲＮＡ産物（「ＳＲ」）との両方を示す。図１６Ｂは、バイオリアクター融合タンパク質を発現するプラスミドをＣＴ２６細胞にトランスフェクトした融合タンパク質発現分析を示す。４８時間後、未処置の細胞、並びにｐＥ３．１Ｓｅｃ−レポーター及びｐＥ１．１ＴＡＴ＋（タンパク質ＮＲＮＡ結合ドメイン及び６×ヒスチジンエピトープ標識に融合したＴＡＴ）又はｐＥ２．１ＴＡＴ＋（タンパク質ＮＲＮＡ結合ドメイン及び６×ヒスチジンエピトープ標識に融合したＴＡＴ）のいずれかをトランスフェクトした細胞からの細胞溶解物をブロッティング抗体に対する陽性対照タンパク質と共にＰＶＤＦ膜にスポットした。ブロットを色素形成基質によって発生させ、イメージドキュメンテーションセンターによって記録した。「Ｈｉｓ＋」は陽性対照の結果を示し、「Ｕｎｔ」は非トランスフェクトＣＴ２６細胞の結果を示す。ブロットを色素形成基質によって発生させ、イメージドキュメンテーションセンターによって記録した。「Ｈｉｓ＋」は、精製Ｈｉｓ標識タンパク質（陽性対照）によって得られた色素形成シグナルを示し、「Ｕｎｔ」は、非トランスフェクトＣＨＯ細胞から回収されたタンパク質溶解物によって得られたバックグラウンドシグナルを示し、ｐＥ１．１ＴＡＴ＋は、ｐＥ１．１ＴＡＴ−タンパク質Ｎ−６×ＨｉｓをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞から回収されたタンパク質溶解物によって得られたシグナルを示し、ｐＥ２．１ＴＡＴ＋は、ｐＥ２．１ＴＡＴ−タンパク質Ｎ−６×ＨｉｓをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞から回収されたタンパク質溶解物によって得られたシグナルを示す。

図１７Ａ及び１７Ｂは、図１５Ａ及び１５Ｂに記載される２つの成分プラスミドを用いたバイオリアクター活性を示す。未処置の対照ＣＴ２６細胞、並びに分泌ＲＮＡ及びバイオリアクター融合タンパク質を発現するｐＥ３．１Ｓｅｃ−レポーター及びｐＥ１ＴＡＴ−ＲＢＤプラスミドをトランスフェクトしたＣＴ２６細胞からのＲＮＡを回収し、ＲＴ−ＰＣＲ増幅反応のための鋳型として用いた。ＲＮＡを細胞培養培地からも回収し、精製し、増幅した。増幅産物をＤＮＡサイズ標準物質と共に３％低融解アガロースゲル（１×ＴＡＥ）上で分離した。図１７Ａ及び１７Ｂは、ｐＥ３．１Ｓｅｃ−レポーター及びｐＥ１．１ＴＡＴ（＋）（適切なＲＢＤに融合したＴＡＴ）又はｐＥ１．１ＴＡＴ（−）（陰性対照ＲＢＤに融合したＴＡＴ）のいずれかによるトランスフェクションアッセイの結果を示す。図１７Ａの左側のパネルは、親レポータープラスミド（「Ｒ」）、ｓｅｃ−ＲＮＡ配列インサート（「ＳＲ」）を含有するレポータープラスミド、ｐＥ１．１ＴＡＴ（＋）（「ＴＡＴ（＋）」（タンパク質ＮＲＮＡ結合ドメインに融合したＴＡＴ）又はｐＥ１．１ＴＡＴ（−）（「ＴＡＴ（−）」（陰性対照ＲＢＤとしての役割を果たすＲｅｖＲＮＡ結合ドメインに融合したＴＡＴ）を同時トランスフェクトしたｓｅｃ−ＲＮＡレポータープラスミドをトランスフェクトした細胞から回収された細胞溶解物に対するＲＴ−ＰＣＲ産物を示す。図１７Ａの右側のパネルは、ｓｅｃ−ＲＮＡレポータープラスミド及びｐＥ１．１ＴＡＴ（＋）（「ＴＡＴ（＋）」（タンパク質ＮＲＮＡ結合ドメインに融合したＴＡＴ）又はｐＥ１．１ＴＡＴ（−）（「ＴＡＴ（−）」（ＲｅｖＲＮＡ結合ドメインに融合した））を同時トランスフェクトした細胞からの細胞溶解物（「Ｃ」）及び細胞外培地試料（「Ｍ」）の両方を示す。図１７Ｂは、第１実験において認められた培地の１８ＳｒＲＮＡコンタミネーションをなくすためにステップを行った第２アッセイの結果（第１と同じ）を示す。

ＧＦＰレポーター系を用いてバイオリアクター細胞の移入活性を生成し、試験する例示的なトランスフェクションアッセイを示す非限定的な概略図である。

図１９Ａは、本発明のバイオリアクター細胞によって産生されたオンコスタチンＭをターゲッティングするアプタマーの分泌及び活性を示す概略図である。図１９Ｂは、レポーター系とオンコスタチンＭタンパク質（ｇｐ１３０受容体仲介シグナル伝達経路の活性化因子）をターゲッティングする分泌ＲＮＡアプタマーとを用いてバイオリアクター細胞の分泌活性を決定するための例示的なトランスフェクションアッセイを示す非限定的な概略図である。

図２０Ａは、本発明のバイオリアクター細胞によって産生されたＨＥＲ３にターゲッティングするアプタマーの分泌及び活性を示す概略図である。図２０Ｂは、レポーター系とＨＥＲ３をターゲッティングする分泌ＲＮＡアプタマーとを用いてバイオリアクター細胞の分泌活性を決定するための例示的なトランスフェクションアッセイを示す非限定的な概略図である。

バイオリアクター細胞の分泌活性と標的細胞の細胞質への阻害性ｓｈＲＮＡの後続の送達とを決定するための例示的なトランスフェクションアッセイを示す非限定的な概略図である。

生物活性阻害性ＲＮＡ分子を含有するウイルスパッケージング細胞を作製するために必要な２つの構築物を示す非限定的な概略図である。

ウイルス粒子及び生物活性ＲＮＡ分子を含有するウイルスパッケージング細胞の作製を示す非限定的な概略図である。概略図は、標的細胞中への生物活性ＲＮＡ分子の転移を更に示す。

ウイルス粒子、バイオリアクター融合タンパク質及び生物活性ＲＮＡ分子を含有するウイルスパッケージング細胞の作製を示す非限定的な概略図である。概略図は、第１の標的細胞（第２のバイオリアクター細胞）へのウイルス粒子を介したバイオリアクター発現カセットの転移と第２の標的細胞中への生物活性ＲＮＡ分子の後続の転移とを更に示す。

定義

本明細書において用いられる場合、「生物活性ＲＮＡ」という用語は、標的とされた遺伝子産物の遺伝子発現又は遺伝子活性を調節する任意のＲＮＡ配列を指すものとする。

本明細書において用いられる場合、「認識ＲＮＡ配列」という用語は、ＲＮＡ結合ドメインを含むペプチドが特異的に結合する任意のＲＮＡ配列を指すものとする。

本明細書において用いられる場合、「ＲＮＡ結合ドメイン」という用語は、対応する認識ＲＮＡ配列に特異的に結合する任意のタンパク質又はペプチド配列を指すものとする。

本明細書において用いられる場合、「輸送ペプチド」という用語は、細胞の細胞膜を越えるカーゴの移動、細胞からのカーゴの分泌及びエンドソームからのカーゴの放出、並びに細胞移動の他の手段を促進することを含む、細胞（単数又は複数）の中の任意の付着カーゴの移動を促進する任意のペプチド配列を指すものとする。具体的な、しかし非限定的な例において、輸送ペプチドは、細胞貫通ペプチド、非古典的分泌配列、エンドソーム放出ドメイン、受容体結合ドメイン及び融合ペプチドから誘導された配列であり得る。

本明細書において用いられる場合、「細胞貫通ペプチド」という用語は、細胞の膜等の脂質二重層を越える任意の付着カーゴの移動を促進する任意のペプチド配列を指すものとする。

本明細書において用いられる場合、「非古典的分泌配列」という用語は、ＥＲ−ゴルジ体非依存性経路を介した細胞からの任意の付着カーゴの分泌をもたらす任意のタンパク質又はペプチド配列を指すものとする。

本明細書において用いられる場合、「エンドソーム放出ドメイン」という用語は、細胞のエンドソームからの任意の付着カーゴの放出を促進する任意のペプチド配列を指すものとする。

本明細書において用いられる場合、「受容体結合ドメイン」という用語は、表面結合細胞受容体と相互作用し得る任意のＲＮＡ又はタンパク質ドメインを指すものとする。

本明細書において用いられる場合、「融合ペプチド」という用語は、細胞のエンドソームからのカーゴの流出を促進する任意のペプチド配列を指すものとする。

本明細書において用いられる場合、「ｓｅｃ−ＲＮＡ」という用語は、本発明のＲＮＡ−タンパク質複合体のＲＮＡ部分を指す。典型的には、「ｓｅｃ−ＲＮＡ」は、１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ、認識ＲＮＡ配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列を含む。本発明の融合タンパク質と複合体を形成する場合、ｓｅｃ−ＲＮＡは細胞から分泌される。

本明細書において用いられる場合、「ｓｅｃ−ｓｈＲＮＡ」という用語は、本発明のＲＮＡ−タンパク質複合体のｓｈＲＮＡ部分を指す。典型的には、「ｓｅｃ−ｓｈＲＮＡ」は、１つ又は複数の短鎖ヘアピンＲＮＡ、認識ＲＮＡ配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列を含む。本発明の融合タンパク質と複合体を形成する場合、ｓｅｃ−ｓｈＲＮＡは細胞から分泌される。

本明細書において用いられる場合、「融合タンパク質」という用語は、作動可能に連結した、典型的には異なる源に由来する少なくとも２つのポリペプチドを指すものとする。ポリペプチドに関して、作動可能に連結したという用語は、２つのポリペプチドが、各ポリペプチドがその意図した機能を果たすことができるような様式で連結されることを意味することが意図される。典型的には、２つのポリペプチドは、ペプチド結合を介して共有結合する。融合タンパク質は、標準的な組み換えＤＮＡ技術によって産生され得る。例えば、第１ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子は、第２ポリペプチドをコードする別のＤＮＡ分子にライゲーションされ、結果として生じるハイブリッドＤＮＡ分子が宿主細胞中において発現されて融合タンパク質を産生する。ＤＮＡ分子は、ライゲーション後にコードされたポリペプチドの翻訳フレームが改変されないように５’から３’方向に互いにライゲーションされる（即ち、ＤＮＡ分子が各々の他のインフレームにライゲーションされる）。具体例において、融合タンパク質は、ＲＮＡ結合ドメイン配列及び１つ又は複数の輸送ペプチド配列を含むペプチドを指す。

本明細書において用いられる場合、「バイオリアクター細胞」又は「バイオリアクター」という用語は、Ｓｅｃ−ＲＮＡ分子を産生し、分泌する任意の細胞を指すものとする。

本明細書において用いられる場合、「ｐＢｉｏＲプラスミド」という用語は、少なくともＲＮＡ結合ドメイン配列、輸送ペプチド配列をコードするポリヌクレオチドと生物活性ＲＮＡ及び認識ＲＮＡ配列をコードするポリヌクレオチドとを含む任意のプラスミドを指すものとする。

本明細書において用いられる場合、「発現カセット」という用語は、終止シグナルに作動可能に連結され得る対象となるヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーターを含むことができる特定のヌクレオチド配列の発現を方向づけ得る核酸配列を指すものとする。また、それは、ヌクレオチド配列の適切な翻訳のために必要な配列をも含み得る。コード領域は、対象となるペプチドをコードすることができるが、対象となる生物活性ＲＮＡをコードすることもできる。対象となるヌクレオチド配列を含む発現カセットはキメラであってよい。発現カセットは、天然に存在するものであってもよいが、異種発現に有用な組み換え型において得られたものであってもよい。具体例において、発現カセットは、プロモーター配列、ペプチド配列をコードするポリヌクレオチド又はＲＮＡ配列及びターミネーター配列をコードするポリヌクレオチドを含む核酸配列を含む。

「作動的に連結した」という用語は、こうして記載されるフランキング配列がその通常の機能を実施するように構成されるか又は構築されるフランキング配列の配置を指すために本明細書において用いられる。コード配列に作動可能に連結したフランキング配列は、コード配列の複製、転写及び／又は翻訳を行うことが可能であってよい。例えば、コード配列は、プロモーターがそのコード配列の転写を方向づけ得る場合にプロモーターに作動可能に連結する。フランキング配列は、それが正確に機能する限り、コード配列に隣接する必要はない。したがって、例えば、介在、非翻訳で、その上転写された配列は、プロモーター配列とコード配列との間に存在することができ、プロモーター配列は、なお、コード配列に「作動可能に連結する」と考えることができる。

ベクターに基づいた送達系についての作用機序

本発明は、プラスミドが、生物活性ＲＮＡ分子を産生し、分泌し得るＲＮＡバイオリアクターにトランスフェクト細胞を転化させる、ベクターに基づいたＲＮＡ送達系を提供する。プラスミドは、生物活性ＲＮＡ分子と、バイオリアクターからのその分泌、並びに細胞外マトリックス及び／又は周囲の標的細胞への送達を促進し得る融合タンパク質との両方をコードすることによってこれを達成する。一旦標的細胞に送達されると、生物活性ＲＮＡ分子は、任意の細胞中における場合と同様に機能する。このアプローチは、プラスミドに基づいたＲＮＡｉ仲介治療薬の適用における重要な問題、即ちプラスミド送達に伴う低トランスフェクション効率に直接対処する。バイオリアクター細胞の初期のトランスフェクションは、標準的な遺伝子送達方法に伴う技術的困難に限定され得るが、本発明のプラスミドに基づいた送達系の後続の発現は、従来の限定を、それがバイオリアクター細胞からの活性ＲＮＡ及び関連タンパク質の持続的且つ連続的な送達を可能にするように軽減する。ＲＮＡ仲介ノックダウンは、バイオリアクター細胞の細胞産生及び生物活性ＲＮＡの周囲の細胞及び組織への送達を通して増幅される。

プラスミドに基づいた送達系の中心的成分は、分泌及び／又は送達を促進する融合タンパク質である。ＥＲ−ゴルジ体を介したタンパク質分子の古典的搬出は共翻訳であり、このことは、タンパク質が、それが作製される際にＥＲ膜を越えて転位することを意味する。これは、ＲＮＡ結合ドメインが、Ｓｅｃ−ＲＮＡ分子を有する細胞質中にごくわずかの時間だけ存在し、膜を越える輸送がＲＮＡ−タンパク質の相互作用を破壊する可能性があるので、バイオリアクター細胞中における古典的輸送機序の使用を阻止する。その代わり、細胞質中における十分に翻訳され且つ折り畳まれたタンパク質は、続いて、生物活性ＲＮＡカーゴを有する非古典的機序を介して共に分泌され得る。ますます多くのタンパク質がＥＲ−ゴルジ装置とは独立した非古典経路を介して分泌されることが現在知られている。これらの系のための搬出の正確な機序は十分に特性評価されていないが、それらのタンパク質は、細胞質中において翻訳されることが知られており、したがって、それらを分泌させ得る配列モチーフを含有し、バイオリアクター中における使用に適切である。

バイオリアクター細胞機能における早期ステップは、ＲＮＡ−タンパク質複合体のＲＮＡ及びタンパク質成分の合成、並びにそれらの成分の細胞質への局在化である。ＲＮＡ分子のプロモーター駆動転写は、十分に確立されている機序を介して生じ、バイオリアクターとして使用される細胞型のために最適化され得る。融合タンパク質をコードする転写産物の搬出は、核孔複合体を介して典型的なＰｏｌ−ＩＩｍＲＮＡ経路を辿る。別の場合、Ｓｅｃ−ＲＮＡ分子は、ミクロＲＮＡ及びｓｈＲＮＡによって利用されるエクスポルチン−５経路を介してそれが搬出されるというような方法で構築され得る。更に別の場合、ＲＮＡ分子は、核からのＳｅｃ−ＲＮＡの搬出を促進するためのアデノウイルスＶＡ１ミニヘリックスドメインを含有することができる。Ｐｏｌ−ＩＩプロモーターからＳｅｃ−ＲＮＡ構築物を発現し、ｈＧＨポリアデニル化シグナルによって終止することも可能であり、その結果、Ｓｅｃ−ＲＮＡをキャップし、核孔複合体を介して核から搬出することができる。

一旦細胞質中において共局在すると、生物活性ＲＮＡ及び融合タンパク質は、一緒になってＲＮＡ−タンパク質複合体を形成するはずである。この結合事象は、融合タンパク質中における高親和性ＲＮＡ結合ドメインと、生物活性ＲＮＡ分子を含む核酸中における対応する配列特異的認識部位とを含むことによって達成される安定な複合体の均質集団を提供する特異的な高親和性相互作用を含む。ＲＮＡ結合ドメイン及びＲＮＡ認識配列は、バイオリアクター細胞の細胞質中において相互作用し、標的細胞への分泌及び送達のために必要なタンパク質機構に生物活性ＲＮＡ配列を結合させる。その相互作用の特異性は、バイオリアクター細胞に対して内在性の他のＲＮＡの分泌を最小限に抑え、高親和性は、細胞外空間中において複合体を維持することを助ける。

ＲＮＡ−タンパク質複合体

考察されるように、本発明は、プラスミドが、生物活性ＲＮＡ分子を産生且つ分泌し得るＲＮＡバイオリアクター中にトランスフェクト細胞を転化させるベクターに基づいたＲＮＡ送達系を提供する。バイオリアクタープラスミドは、送達融合タンパク質に対する認識配列に連結した任意の生物活性ＲＮＡ分子をコードし、分布させる能力を有する。したがって、本発明の発現ベクターは、１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、ＲＮＡ認識配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列を含む核酸をコードするポリヌクレオチド配列、並びに／又はＲＮＡ結合ドメイン及び１つ又は複数の輸送ペプチド配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。生物活性ＲＮＡ分子は、それらが相互作用する細胞成分に応じた多くの異なる機序を通して生物学的効果を発揮することができる。ほとんどの生物活性ＲＮＡは、ｍＲＮＡ分子の翻訳サイレンシング又は分解を引き起こす特異的ｍＲＮＡ転写産物との塩基対合相互作用を通して機能する。阻害性ＲＮＡの２つの関連クラスは、アンチセンスＲＮＡ分子及び低分子阻害性ＲＮＡ分子である。アンチセンスＲＮＡは、典型的には、それがターゲッティングするｍＲＮＡ転写産物の直接の相補物であり、翻訳機構に対して障害を提示し、更に細胞ヌクレアーゼによる分解に対する転写産物をターゲッティングすることによって機能する。低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子は、転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）経路を通して又はＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路を通して作用する。これらのＲＮＡは、長さが約２２ヌクレオチドであり、特異的な細胞タンパク質と会合してＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を形成する。これらの低分子ＲＮＡは、それらのｍＲＮＡ標的中の配列に対して相補的でもあり、これらの複合体の結合は、転写産物の翻訳サイレンシング又は分解を引き起こす。

遺伝子発現を調節し得るＲＮＡ分子の２つの更なるクラスは、触媒性ＲＮＡリボザイム及びＲＮＡアプタマーである。リボザイムは、ＲＮＡ基質に対する化学反応、多くの場合ホスホジエステル骨格の加水分解を触媒するＲＮＡに基づく酵素である。触媒性活性部位の形成は、リボザイムとＲＮＡ基質との間の塩基対合を必要とするので、リボザイム活性は、適切なガイド配列を提供することによって所望の基質をターゲッティングすることもできる。ｍＲＮＡ転写産物をターゲッティングする場合、リボザイムは、それらの転写産物を分解させ、関連のタンパク質の下方制御を引き起こす能力を有する。ＲＮＡアプタマーは、典型的には、標的分子（しばしばタンパク質分子）と相互作用するそれらの能力によってランダムＲＮＡ配列のプールから選択される。結合は塩基対合相互作用によって定義されないので、ＲＮＡアプタマーを操作することはあまり簡単ではないが、一旦有効な配列が分かると、結合の特異性及び親和性は、しばしば抗体−抗原相互作用と拮抗する。ＲＮＡアプタマーはまた、より大きな範囲の標的分子、及び多くの異なる機序を介して遺伝子活性を改変する能力をも有する。これは、タンパク質又はそれを産生するｍＲＮＡ転写産物の分解の必要がない標的分子の生物学的活性の直接的阻害を含む。

本発明のある種の実施形態において、ＲＮＡ−タンパク質複合体の１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列は、リボザイム、アンチセンス核酸、アロザイム、アプタマー、短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及び１つ又は複数の生物活性ペプチドをコードする転写産物、並びにそれらのあらゆる組合せから選択される。一実施形態において、生物活性ＲＮＡ配列の内の１つ又は複数は、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。別の一実施形態において、生物活性ＲＮＡ配列の内の１つ又は複数は、アプタマーである。１つ又は複数の生物活性ペプチドをコードする転写産物である生物活性ＲＮＡに関して、例示的なペプチドとしては、癌抑制遺伝子によってコードされるペプチド、アポトーシス促進因子、及び癌系に対する細胞内抗体、又は機能若しくは欠失変異の喪失から生じる疾患系における遺伝子機能を回復させるタンパク質から選択されるものが挙げられる。核酸分子の生物活性ＲＮＡ配列は、対象となるあらゆる標的遺伝子に対して向けられ得る。例えば、生物活性ＲＮＡは、例えばＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）において見出されるデータベースのいずれかが含まれる一般公開されているあらゆる遺伝子配列データベースにおいて見出されるあらゆる遺伝子に対して向けられ得る。特定の一実施形態において、生物活性ＲＮＡ配列は、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。別の特定の一実施形態において、生物活性ＲＮＡは、アプタマーである。適切なｓｈＲＮＡ配列の非限定的な例としては、Ｍｍｐ２、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、カベオリン−１（Ｃａｖ−１）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ハーベイ−レトロウイルス関連ＤＮＡ配列（Ｈ−Ｒａｓ）、Ｂ細胞ＣＣＬ／リンパ腫２（Ｂｃｌ−２）、スルビビン、焦点接着キナーゼ（ＦＡＫ）、シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ−３）、ヒト上皮成長因子受容体３（ＨＥＲ−３）、ベータ−カテニン、及びとりわけ本明細書に記載され、本技術分野において公知のＳｒｃｓｈＲＮＡ配列が挙げられる。表Ｉは、非限定的で例示的な生物活性ＲＮＡ配列のヌクレオチド配列を提供する。ある種の実施形態において、生物活性ＲＮＡ配列は、配列番号１〜１５のいずれかから選択される１つ又は複数の配列を含む。

生物活性ＲＮＡ配列を含む核酸は、認識ＲＮＡ配列を更に含み、その配列は、本発明の融合タンパク質中に位置するＲＮＡ結合ドメインによって認識され、それに特異的に結合する。（ＲＮＡ配列中における）認識ＲＮＡ配列と（タンパク質配列中における）ＲＮＡ結合ドメインと間の特異的な高親和性相互作用の多くの例は、本技術分野において公知であり、記載されている。本発明の認識ＲＮＡ配列は、ポリペプチドのＲＮＡ結合ドメインに結合することが公知の本技術分野において記載されているいずれのＲＮＡ配列でもあってよい。一実施形態において、認識ＲＮＡ配列は、長さが少なくとも約１０ヌクレオチドである。一実施形態において、認識ＲＮＡ配列は、約１０ヌクレオチドから約２５０ヌクレオチドである。ある種の特定の実施形態において、認識ＲＮＡ配列は、例えば、約１０〜１５ヌクレオチド、約１６〜２０ヌクレオチド、約２１〜２５ヌクレオチド、約２６〜３０ヌクレオチド、約３１〜３５ヌクレオチド、約３６〜４０ヌクレオチド、約４１〜４５ヌクレオチド、約４６〜５０ヌクレオチド、約５１〜７５ヌクレオチド、約７６〜１００ヌクレオチド、約１０１〜１２５ヌクレオチド、約１２６〜１５０ヌクレオチド、約１５１〜１７５ヌクレオチド、約１７６〜２００ヌクレオチド又は約２０１〜２５０ヌクレオチドである。一実施形態において、認識ＲＮＡ配列は、少なくとも約１００ｎＭの解離定数（Ｋ_ｄ）を有する。特定の一実施形態において、解離定数は、約１００ｎＭから約１ｐＭである。（ＲＮＡ配列中における）認識ＲＮＡ配列と（タンパク質配列中における）ＲＮＡ結合ドメインと間の特異的な高親和性相互作用の非限定的な例としては、とりわけ、Ｕ１Ａ配列を有するＵ１ループ配列、ＣＲＳ１配列を有するグループＩＩイントロン配列のドメインＩ又はドメインＩＶ、ヌクレオリン配列を有するＮＲＥステムループ配列、ｈＲＢＭＹ配列を有するＳ１Ａステムループ配列、バクテリオファージタンパク質Ｎを有するバクテリオファージＢｏｘＢＲ配列、ＨＩＶＲｅｖタンパク質を有するＨＩＶＲｅｖ応答エレメント、ＡＭＶＣＰタンパク質を有するアルファルファ−モザイクウイルスコートタンパク質認識配列（ＡＭＶＣＰ）及びトリステトラプロリン配列を有するＡＲＥステムループ配列が挙げられる。ある種の特定の実施形態において、核酸の認識ＲＮＡ配列は、Ｕ１ループ、グループＩＩイントロン、ＮＲＥステムループ、Ｓ１Ａステムループ、バクテリオファージＢｏｘＢＲ、ＨＩＶＲｅｖ応答エレメント、アルファルファ−モザイクウイルスコートタンパク質認識配列（ＡＭＶＣＰ）及びＡＲＥ配列から選択される配列を含む。表ＩＩは、非限定的な例示的認識ＲＮＡ配列のヌクレオチド配列を提供する。ある種の特定の実施形態において、認識ＲＮＡ配列は、配列番号１６〜２３のいずれかの配列を含む。

ある種の実施形態において、核酸分子は、１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列及び末端ミニヘリックス配列を含む。末端ミニヘリックス配列は、ＲＮＡ分子の５’及び３’末端をアニールする約１７ヌクレオチドの短配列である。この配列は、Ｐｏｌ−ＩＩＩプロモーターから誘導されるＲＮＡ分子の核外搬出を促進することを示し、バイオリアクター細胞中におけるＲＮＡ−融合タンパク質複合体の形成を駆動することを助けることができる。適切な末端ミニヘリックス配列の例は、本明細書に記載され、それ以外の場合、本技術分野において公知である。一実施形態において、末端ミニヘリックス配列は、長さが少なくとも約１７ヌクレオチドである。特定の一実施形態において、末端ミニヘリックス配列は、長さが約１０ヌクレオチドから約１００ヌクレオチドである。一実施形態において、末端ミニヘリックス配列は、アデノウイルスＶＡ１ＲＮＡ分子に由来する。

更に、本発明の発現ベクターは、ダイサー及び／又はドローシャをターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列を含むポリペプチドをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を含むことができる。これらの実施形態の配列のいずれも、ＲＮＡ認識配列を含まない。生物活性ＲＮＡ配列の内の１つ又は複数が短鎖干渉性ＲＮＡ、（ｓｉＲＮＡ）、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）及び短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である場合、かかるポリペプチドは有用である。

上記の核酸分子のいずれかにおいて、核酸分子は、認識ＲＮＡ配列、個々の生物活性ＲＮＡ配列及び場合による末端ミニヘリックス配列が介在又は付加配列の付加なしで直接結合する配列を含むことができる。別の場合、上記の核酸分子のいずれかにおいて、核酸分子は、認識ＲＮＡ配列、個々の生物活性ＲＮＡ配列及び場合による末端ミニヘリックス配列を含む配列の内の１つ又は複数が１つ又は複数の介在又は付加配列の付加と共に結合する配列を含むことができる。同様に、上記の核酸分子のいずれかにおいて、核酸分子は、個々の生物活性ＲＮＡ配列自体が１つ若しくは複数の介在若しくは付加配列の付加なしで直接結合するか又は１つ若しくは複数の介在若しくは付加配列の付加と共に結合する配列を含むことができる。

生物活性ＲＮＡ分子を分泌し、隣接する細胞に送達するバイオリアクター細胞の能力は、ｐＢｉｏＲプラスミド（単数又は複数）から産生されたＲＮＡ−タンパク質複合体の特性に由来する。第１に、（ＲＮＡ結合ドメイン及び場合によって他の配列を含む）融合タンパク質は、（ＲＮＡ認識配列を介して）生物活性ＲＮＡに結合し、バイオリアクター細胞から分泌される。細胞外マトリックスにおいて、ＲＮＡ−タンパク質複合体は、標的細胞に達するのに十分長く、無傷のままである。一旦標的細胞の表面にあると、融合タンパク質は、標的細胞の細胞質への生物活性ＲＮＡの移入を促進する。

ＲＮＡ−タンパク質複合体の分泌は、融合タンパク質のＲＮＡ結合ドメインによるＳｅｃ−ＲＮＡの効率的結合によって最適化される。融合タンパク質−Ｓｅｃ−ＲＮＡ複合体の形成を駆動するため、融合タンパク質は、ウイルス又は細菌由来の高親和性ＲＮＡ結合ドメインを含有する。非ネイティブ高親和性相互作用の利用は、バイオリアクター細胞に対して内在性のＲＮＡ分子の非特異的結合から最小限の拮抗で安定な複合体の均質集団を得る見込みを向上させる。

したがって、一実施形態において、融合タンパク質は、ＲＮＡ結合ドメイン及び１つ又は複数の輸送ペプチドを含む。新規な融合タンパク質のＲＮＡ結合ドメインは、対応するＲＮＡ認識モチーフを認識し得るいずれのアミノ酸配列であってもよい。一実施形態において、ＲＮＡ結合ドメインは、約２５アミノ酸から約３００アミノ酸である。ある種の特定の実施形態において、ＲＮＡ結合ドメインは、例えば、約２５〜４９アミノ酸、約５０〜７５アミノ酸、約７６〜１００アミノ酸、約１０１〜１２５アミノ酸、約１２６〜１５０アミノ酸、約１５１〜１７５アミノ酸、約１７６〜２００アミノ酸、約２０１〜２２５アミノ酸、約２２６〜２５０アミノ酸、約２５１〜２７５アミノ酸又は約２７６〜３００アミノ酸である。融合ポリペプチドのＲＮＡ結合ドメインは、本技術分野において公知で記載されているいずれのＲＮＡ結合ドメインであってもよい。ある種の特定の実施形態において、融合ポリペプチドのＲＮＡ結合ドメインは、Ｕ１Ａ、ＣＲＳ１、ＣＲＭ１、ヌクレオリンＲＢＤ１２、ｈＲＢＭＹ、バクテリオファージタンパク質Ｎ、ＨＩＶＲｅｖ、アルファルファ−モザイクウイルスコートタンパク質（ＡＭＶＣＰ）及びトリステトラプロリンアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む。ＲＮＡ結合ドメイン配列の非限定的な例のアミノ酸配列は、表ＩＩＩに示される。ある種の特定の実施形態において、ＲＮＡ結合ドメインは、配列番号２４〜３１のいずれかから選択される配列を含む。

融合タンパク質の別の成分は、ＲＮＡ−タンパク質複合体の分泌を促進するドメインである。非古典的分泌経路を辿るタンパク質は、古典的搬出機序を方向づける典型的な分泌シグナルを欠き、ＥＲ−ゴルジ体ネットワークから排除され、ＥＲ−ゴルジ体輸送を阻害する薬物の存在下で分泌され得る。膜の小胞形成、小胞及び非小胞非古典的輸送、能動的及び受動的膜輸送体、並びに膜フリップフロップを含む幾つかの機序が、非古典的分泌経路について提案されている。ＥＲ−ゴルジ体ネットワークのものに依存しない分泌経路に接近するタンパク質からのペプチド配列は、本発明の生物活性ＲＮＡ分子の分泌に有用である。ＲＮＡ−タンパク質複合体の分泌を促進するために有用な別の群の配列は、細胞貫通ペプチドである。これらのペプチドの侵入の正確な機序は十分に知られていないが、一部のデータが非エンドソーム機序を示唆するもののエンドソーム経路を含むことができる。

融合ポリペプチドの輸送ペプチドは、細胞外マトリックス並びに／又は隣接する細胞及び組織への核酸、ペプチド、融合タンパク質、ＲＮＡ−タンパク質複合体及び／又は他の生物学的分子の送達を促進するいずれのアミノ酸配列であってもよい。輸送ペプチドの一例は、標的細胞中へのＳｅｃ−ＲＮＡの移入を促進する細胞貫通ペプチドである。本技術分野において公知の多くの細胞貫通ペプチドがあるが、それらのペプチド配列は、原形質膜を越えることが可能である。かかるペプチドは、しばしば、転写因子、例えばホメオドメインタンパク質及びウイルスタンパク質、例えばＨＩＶ−１のＴＡＴ中に存在する。細胞貫通ペプチドを介した細胞の細胞質へのＲＮＡ−タンパク質複合体の送達は、実験的に確立されている。例えば、Ｕ１ＡＲＮＡ結合ドメイン及びＴＡＴ細胞貫通ペプチドから成る精製融合タンパク質によるＣＨＯ細胞へのｓｉＲＮＡの送達が報告されている。ビオチン−ストレプトアビジン連結を利用する更なる報告は、ＴＡＴペプチドを介した各種カーゴ分子の成功した送達を示す。標的細胞の細胞質へのカーゴ分子のＴＡＴ仲介送達は、エンドソーム放出を促進するために更なる融合ペプチドを必要とすると思われないが、ＴＡＴへのかかるペプチドの付加は、送達の効率を改善させ得る。送達系の一部としての融合ペプチドの必要性は、融合タンパク質において使用される細胞貫通ペプチドの同一性に依存し得る。

したがって、一実施形態において、輸送タンパク質は、細胞貫通ペプチドである。典型的には、かかる配列は、正に帯電する側基を有するアミノ酸、即ち、塩基性アミノ酸、例えば、ヒスチジン、リシン及びアルギニンが豊富なポリカチオン性又は両親媒性配列である。細胞貫通ペプチドの多くの例は、本技術分野において公知であり、記載されている。適切な細胞貫通ペプチドの非限定的な例としては、転写因子、例えばホメオドメインタンパク質及びウイルスタンパク質、例えばＨＩＶ−１のＴＡＴ中に存在するタンパク質膜トランスダクションドメインから誘導されるものが挙げられる。一実施形態において、細胞貫通ペプチドは、例えば、約１０〜１５アミノ酸、約１６〜２０アミノ酸、約２１〜２５アミノ酸、約２６〜３０アミノ酸、約３１〜３５アミノ酸、約３６〜４０アミノ酸、約４１〜４５アミノ酸及び約４６〜５０アミノ酸を含む約１０アミノ酸から約５０アミノ酸である。ある種の特定の実施形態において、ポリペプチドの細胞貫通ペプチドは、ペネトラチン、トランスポルタン、ＭＡＰ、ＨＩＶＴＡＴ、Ａｎｔｐ、Ｒｅｖ、ＦＨＶコートタンパク質、ＴＰ１０及びｐＶＥＣアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む。細胞貫通ペプチド配列の非限定的な例のアミノ酸配列は、表ＩＶに示される。ある種の特定の実施形態において、細胞貫通ペプチドは、配列番号３２〜４０のいずれかから選択される配列を含む。

輸送ペプチドの別の一例は、非古典的分泌ドメインである。非古典的分泌ドメインは、ペプチド及び／又は他の生物学的分子をタンパク質分泌の古典経路（単数又は複数）以外の経路を介して細胞から分泌するように向けるいずれのアミノ酸配列であってもよい。生物学的分子は、細胞外マトリックス中に分泌され得、且つ／又は周囲の細胞及び組織に送達され得る。非古典的分泌ドメインの多くの例は、本技術分野において公知であり、記載されている。一実施形態において、非古典的分泌ドメインは、約５０アミノ酸から約２５０アミノ酸である。ある種の特定の実施形態において、非古典的分泌ドメインは、例えば、約５０〜７５アミノ酸、約７６〜１００アミノ酸、約１０１〜１２５アミノ酸、約１２６〜１５０アミノ酸、約１５１〜１７５アミノ酸、約１７６〜２００アミノ酸、約２０１〜２２５アミノ酸又は約２２６〜２５０アミノ酸である。ある種の特定の実施形態において、非古典的分泌ドメインは、Ｇａｌｃｅｔｉｎ−１ペプチド、ガレクチン−３ペプチド、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＨＡＳＰＢ、ＨＭＧＢ１、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＩＬ−２シグナル、分泌トランスグルタミナーゼ、アネキシン−１、ＨＩＶＴＡＴ、ヘルペスＶＰ２２、チオレドキシン、ロダネーゼ及びプラスミノーゲンアクチベーターシグナルアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む。非古典的分泌ドメイン配列の非限定的な例は、表Ｖに示される。ある種の特定の実施形態において、非古典的分泌ドメインは、配列番号４１〜４８のいずれかから選択される配列を含む。

適切な輸送ペプチドの他の例としては、限定されるものではないが、受容体結合ドメイン、融合ペプチド及びエンドソーム放出ドメインから誘導される配列が挙げられる。一実施形態において、輸送ペプチドは、受容体結合ドメインから誘導される配列を含む。受容体結合ドメインは、標的細胞膜の細胞外側面上の表面受容体複合体に特異的に結合するいずれのアミノ酸配列であってもよい。ある種の特定の実施形態において、受容体結合ドメインは、ＥＧＦタンパク質、ＶＥＧＦタンパク質、血管ホーミングペプチド、ｇｐ３０タンパク質（若しくは他のＥｒｂＢ−２結合タンパク質）又はガレクチン−１タンパク質（若しくは他のＣＡ１２５結合タンパク質）から選択されるアミノ酸配列を含む。

別の一実施形態において、輸送ペプチドは、エンドソーム放出ドメインから誘導される配列を含む。エンドソーム放出ドメインは、標的細胞のエンドソーム区画からのＲＮＡ−タンパク質複合体の放出を促進するいずれのアミノ酸配列であってもよい。ある種の特定の実施形態において、エンドソーム放出ドメインは、インフルエンザ由来の血球凝集素タンパク質、セムリキ森林ウイルス由来のＥ１タンパク質、又はポリヒスチジンモチーフから選択されるアミノ酸配列を含む。

別の一実施形態において、輸送ペプチドは、融合ペプチドから誘導される配列を含む。表ＶＩは、適切な融合ペプチドの非限定的な例を提供する。したがって、ある種の特定の実施形態において、融合ペプチドは、配列番号５０〜５４のいずれかから選択される配列を含む。

融合タンパク質ポリペプチドの上記実施形態のいずれかにおいて、ポリペプチドは、個々のドメイン及びペプチドが１つ又は複数のリンカー、スペーサー又は他の配列の付加なしで直接結合する配列（単数又は複数）を含むことができる。別の一実施形態において、ポリペプチドは、個々のドメイン及びペプチドが１つ又は複数のリンカー、スペーサー及び／又は他の配列の付加と共に結合する配列（単数又は複数）を含むことができる。

したがって、本発明の発現ベクターのある種の特定の実施形態において、生物活性ＲＮＡ配列（単数又は複数）は、リボザイム、アンチセンス核酸、アロザイム、アプタマー、短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及び１つ又は複数の生物活性ペプチドをコードする転写産物から選択される。認識ＲＮＡ配列は、Ｕ１ループ、グループＩＩイントロン、ＮＲＥステムループ、Ｓ１Ａステムループ、バクテリオファージＢｏｘＢＲ、ＨＩＶＲｅｖ応答エレメント、ＡＭＶＣＰ認識配列及びＡＲＥ配列から選択される。ＲＮＡ結合ドメインは、Ｕ１Ａ、ＣＲＳ１、ＣＲＭ１、ヌクレオリンＲＢＤ１２、ｈＲＢＭＹ、バクテリオファージタンパク質Ｎ、ＨＩＶＲｅｖ、ＡＭＶＣＰ及びトリステトラプロリンアミノ酸配列から誘導されるアミノ酸配列を含む。輸送ペプチドは、細胞貫通ペプチド、非古典的分泌ドメイン、受容体結合ドメイン、融合ペプチド及びエンドソーム放出ドメインから選択される。適切な細胞貫通ペプチド配列としては、限定されるものではないが、ペネトラチン、トランスポルタン、ＭＡＰ、ＨＩＶＴＡＴ、Ａｎｔｐ、Ｒｅｖ、ＦＨＶコートタンパク質、ＴＰ１０及びｐＶＥＣアミノ酸配列から誘導されるアミノ酸配列を有するそれらのペプチドが挙げられる。適切な非古典的分泌ドメイン配列としては、限定されるものではないが、Ｇａｌｃｅｔｉｎ−１ペプチド、ガレクチン−３ペプチド、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＨＡＳＰＢ、ＨＭＧＢ１、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＩＬ−２シグナル、分泌トランスグルタミナーゼ、アネキシン−１、ＨＩＶＴＡＴ、ヘルペスＶＰ２２、チオレドキシン、ロダネーゼ及びプラスミノーゲンアクチベーターシグナルアミノ酸配列から誘導されるアミノ酸配列を有するペプチドが挙げられる。適切な融合ペプチド配列としては、限定されるものではないが、インフルエンザ由来のＨＡ、ＨＩＶ由来のＧｐ４１、メリチン、ＧＡＬＡ及びＫＡＬＡから誘導されるアミノ酸配列を有するペプチドが挙げられる。

ＲＮＡ−タンパク質複合体の本明細書に記載される実施形態のいずれかにおいて、核酸分子は、認識ＲＮＡ配列、個々の生物活性ＲＮＡ配列及び場合による末端ミニヘリックス配列が１つ又は複数の介在又は付加配列の付加なしで直接結合する配列を含むことができる。別の場合、ＲＮＡ−タンパク質複合体の上記実施形態のいずれかにおいて、核酸分子は、認識ＲＮＡ配列、個々の生物活性ＲＮＡ配列及び場合による末端ミニヘリックス配列が１つ又は複数の介在又は付加配列の付加と共に結合する配列を含むことができる。ＲＮＡ−タンパク質複合体の上記実施形態のいずれかにおいて、核酸分子は、個々の生物活性ＲＮＡ配列自体が１つ又は複数の介在又は付加配列の付加と共に又は付加なしで結合する配列を含むことができる。ＲＮＡ−タンパク質複合体の上記実施形態のいずれかにおいて、ＲＮＡ−タンパク質複合体のポリペプチド部分は、個々のドメイン及びペプチドのいずれかがリンカー、スペーサー及び／又は他の配列の付加と共に又は付加なしで結合する配列（単数又は複数）を含むことができる。

発現ベクター

一実施形態において、発現ベクターは、１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、ＲＮＡ結合ドメイン（Ｓｅｃ−ＲＮＡ）に対する認識ＲＮＡ部位、及び場合によってミニ末端ヘリックス配列を含むＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチド配列を含む第１発現カセットを含む。発現ベクターは、ＲＮＡ結合ドメインとＲＮＡ−タンパク質複合体の分泌及び細胞外マトリックス又は標的細胞への生物活性ＲＮＡの送達を促進する１つ又は複数の輸送ペプチドとを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む第２発現カセットを更に含む。更なる一実施形態において、発現ベクターは、第３発現カセットが、ウイルス複製のために必要な１つ又は複数のウイルスポリメラーゼ及び１つ又は複数のウイルスアクセサリータンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を含む、第３発現カセットを更に含む。場合によって、発現ベクターは、第４発現カセットを更に含むことができるか、又は別の発現ベクターは、１つ若しくは複数の生物活性ＲＮＡ、場合によって認識ＲＮＡ配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットを含むことができる。一実施形態において、第４発現カセットの１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列は、第１発現カセットの生物活性ＲＮＡ配列（単数又は複数）がターゲッティングする同じ標的遺伝子であり得る又はあり得ない標的遺伝子に向けられる。別の一実施形態において、第４発現カセットの１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列は、バイオリアクター細胞の中のダイサータンパク質及び／又はドローシャタンパク質に向けられる。このカセットは、ＲＮＡ結合ドメインに対する認識ＲＮＡ配列を含まないので、バイオリアクター細胞から分泌されない。

一実施形態において、第１及び第２発現カセットは、融合タンパク質をコードするＲＮＡの中の人工イントロン中にＳｅｃ−ＲＮＡ配列を配置することによって組み合わせられる。このベクターは、全体的なプラスミドのサイズを減少させる利点を提供し、単一プロモーターの制御下における全てのバイオリアクター成分の転写を配置する。細胞への発現ベクターの投与の際、ＲＮＡ−タンパク質複合体は、単一のＲＮＡ転写物として又は１つ若しくは複数のＲＮＡ転写物としてベクターから発現され得る。例えば、ＲＮＡ−タンパク質複合体は、（１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列を含む）ＲＮＡ−タンパク質複合体のＲＮＡ部分と（ＲＮＡ結合ドメイン、並びに例えば細胞貫通ペプチド、非古典的分泌ドメイン、エンドソーム放出ドメイン、融合ペプチド及び受容体結合ドメインから選択される１つ又は複数の輸送ペプチド配列を含む）ＲＮＡ−複合体のタンパク質部分とを含む単一の転写産物としてベクターから発現され得る。Ｓｅｃ−ＲＮＡは、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）中又は融合タンパク質に対するコード配列の中のいずれかにおいて配置される人工イントロンの中でコードされる。Ｓｅｃ−ＲＮＡ配列は、適切な制限部位を用いて人工イントロンのスプライスドナー及びスプライス受容体部位の間でサブクローニングされる。転写後、Ｓｅｃ−ＲＮＡは、バイオリアクター細胞に対して内在性のスプライシング機構によって融合タンパク質をコードするｍＲＮＡから放出される。別々の転写産物が細胞核から細胞質に搬出され、そこでＲＮＡ結合ドメイン配列及び任意の他の配列（単数又は複数）を含む転写産物が翻訳される。翻訳されたペプチドのＲＮＡ結合ドメインがＲＮＡの認識ＲＮＡ配列と相互作用し、ＲＮＡ−タンパク質複合体を形成する。

他の実施形態において、第１及び第２発現カセット、並びに任意の第３及び第４発現カセットは、プロモーター配列、１つ又は複数の制限酵素部位を含む配列、プライマー配列、ＧＣ塩基対配列、開始コドン、翻訳開始部位及び終止配列から選択される１つ又は複数の配列を更に含む。適切なプロモーターとしては、限定されないがシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、β−アクチン、ヒトアルブミン、ヒトＨＩＦ−α、ヒトゲルソリン、ヒトＣＡ−１２５、ユビキチン及びＰＳＡプロモーターが含まれるＰｏｌＩＩプロモーターが挙げられる。別の一実施形態において、プロモーターは、ＰｏｌＩＩＩプロモーターである。適切なＰｏｌＩＩＩプロモーターの非限定的な例としては、限定されるものではないが、ヒトＨ１及びヒトＵ６プロモーターが挙げられる。別の一実施形態において、カセットは、１つ又は複数の終止配列を更に含む。適切な終止配列の非限定的な例としては、限定されるものではないが、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化配列、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化配列、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）大型Ｔポリアデニル化配列及び単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）ポリアデニル化配列が挙げられる。一実施形態において、発現カセットは、制限酵素部位、１つ又は複数のプロモーター配列及び１つ又は複数の終止配列を含有し得る１つ又は複数のプライマー配列を更に含む。

発現ベクターの上記実施形態のいずれかにおいて、ポリヌクレオチドは、生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列、ＲＮＡ結合ドメイン配列、輸送ペプチド配列、ウイルスポリペプチド及びあらゆる他の含まれる配列（即ち、プロモーター、終止配列、プライマー等）のいずれかが１つ若しくは複数の介在若しくは付加配列の付加と共に結合するか又は介在配列の付加なしで直接結合する配列を含むことができる。上記実施形態のいずれかにおいて、発現ベクターは、個々のドメイン及びペプチドの配列（単数又は複数）が１つ又は複数のリンカー、スペーサー又は他の配列の付加なしで又は付加と共に結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。

更なる一実施形態において、発現ベクターは、１つ又は複数の多重クローニング部位配列を更に含む。また、発現ベクターは、１つ又は複数の薬剤耐性遺伝子配列を更に含むことができる。適切な薬剤耐性遺伝子の例としては、限定されるものではないが、カナマイシン、アンピシリン、ピューロマイシン、テトラサイクリン及びクロラムフェニコール耐性遺伝子、並びに本技術分野において公知で、記載されているあらゆる他の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。発現ベクターは、ｐＵＣ複製開始点を更に含むことができる。

バイオリアクタープラスミドのタンパク質又はＲＮＡ成分に対する発現カセットは、適切なフォワード及びリバースプライマーを用いてそれぞれｃＤＮＡクローン又はＲＮＡ発現プラスミドからの関連配列のＰＣＲ増幅によって調製される。プライマーには、対象となるドメイン又は生物活性ＲＮＡ配列、サブクローニングの際に使用される制限酵素に対する部位、及び制限酵素による消化を促進するための各プライマーの５’末端における約６個のＧＣ塩基対に対して相補的な配列が含まれる。Ｓｅｃ−ＲＮＡ発現構築物を作製するため、生物活性ＲＮＡ配列の５’末端に対応するプライマーに認識ＲＮＡ配列を付加する。この発現構築物は、ヒトＵ６プロモーター配列の下流及びＰｏｌＩＩＩポリＴ終止配列の上流にＳｅｃ−ＲＮＡ発現カセットを配置するｐＥＧＥＮ４．１構築物中にサブクローニングするための適切な制限酵素によって消化される。別の場合、ＣＭＶＰｏｌ−ＩＩプロモーターの制御下でＲＮＡ発現を配置し、ヒトＧＨポリアデニル化シグナルによって終止するｐＥＧＥＮ３．１中にＳｅｃ−ＲＮＡ発現カセットをサブクローニングすることができる。

図５〜１３に、幾つかの例示的な発現ベクターを示す。１つの例示的な発現ベクターは、図５に示されるｐＥＧＥＮ１．１である。示されるように、ｐＥＧＥＮ１．１は、ＳＶ４０プロモーター配列（１）、イントロン配列（２）、多重クローニング配列（ＭＣＳ）、ヒト成長ホルモンポリＡテイル配列（４）、カナマイシン耐性遺伝子（７）及びｐＵＣ複製開始点（８）を含む。Ｓｅｃ−ＲＮＡ分子又は融合タンパク質をコードするＤＮＡ断片を、多重クローニング配列中へのサブクローニングのための制限部位を含むプライマーによるＰＣＲによって調製する。ＰＣＲ産物及びｐＥＧＥＮ１．１プラスミドを、適切な制限酵素によって消化し、ライゲーション前に精製する。Ｓｅｃ−ＲＮＡ分子、又は融合タンパク質をコードするｍＲＮＡは、人工イントロン及びポリＡテイル配列を有するＳＶ４０プロモーター配列から転写される。

別の例示的な発現ベクターは、図６に示されるｐＥＧＥＮ２．１である。示されるように、ｐＥＧＥＮ２．１は、ニワトリβ−アクチンプロモーター配列（１）、イントロン配列（２）、多重クローニング配列（ＭＣＳ）、ヒト成長ホルモンポリＡテイル配列（４）、カナマイシン耐性遺伝子（７）及びｐＵＣ複製開始点（８）を含む。Ｓｅｃ−ＲＮＡ分子又は融合タンパク質をコードするＤＮＡ断片を、多重クローニング配列中へのサブクローニングのための制限部位を含むプライマーによるＰＣＲによって調製する。ＰＣＲ産物及びｐＥＧＥＮ２．１プラスミドを、適切な制限酵素によって消化し、ライゲーション前に精製する。Ｓｅｃ−ＲＮＡ分子、又は融合タンパク質をコードするｍＲＮＡは、人工イントロン及びポリＡテイル配列を有するニワトリ−アクチンプロモーター配列から転写される。

別の例示的な発現ベクターは、図７に示されるｐＥＧＥＮ３．１である。示されるように、ｐＥＧＥＮ３．１は、ＣＭＶプロモーター配列（１）、イントロン配列（２）、多重クローニング配列（ＭＣＳ）、ヒト成長ホルモンポリＡテイル配列（４）、カナマイシン耐性遺伝子（７）及びｐＵＣ複製開始点（８）を含む。Ｓｅｃ−ＲＮＡ分子又は融合タンパク質をコードするＤＮＡ断片を、多重クローニング配列中へのサブクローニングのための制限部位を含むプライマーによるＰＣＲによって調製する。ＰＣＲ産物及びｐＥＧＥＮ３．１プラスミドを、適切な制限酵素によって消化し、ライゲーション前に精製する。Ｓｅｃ−ＲＮＡ分子、又は融合タンパク質をコードするｍＲＮＡは、人工イントロン及びポリＡテイル配列を有するＣＭＶプロモーター配列から転写される。

別の例示的な発現ベクターは、図８に示されるｐＥＧＥＮ４．１である。示されるように、ｐＥＧＥＮ４．１は、ヒトＵ６プロモーター配列（１）、多重クローニング配列（ＭＣＳ）、ポリＴターミネーター配列（４）、カナマイシン耐性遺伝子（７）及びｐＵＣ複製開始点（８）を含む。Ｓｅｃ−ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ断片を、多重クローニング配列中へのサブクローニングのための制限部位を含むプライマーによるＰＣＲによって調製する。ＰＣＲ産物及びｐＥＧＥＮ４．１プラスミドを、適切な制限酵素によって消化し、ライゲーション前に精製する。Ｓｅｃ−ＲＮＡ分子は、Ｕ６プロモーター配列から転写され、ポリＴターミネーター配列により終止する。

別の例示的な発現ベクターは、本発明の例示的なＲＮＡ−タンパク質複合体をコードするｐＢｉｏＲＰｏｌＩＩ（図９に示される）である。ベクターは、Ｓｅｃ−ＲＮＡ配列（３）の上流のＳＶ４０プロモーター（１）と下流のｈＧＨポリＡ配列（４）とを含む。ベクターはまた、融合タンパク質配列（６）の上流のβ−アクチンプロモーター（５）と下流のｈＧＨポリＡ配列（４）とを含む。ベクターはまた、カナマイシン耐性遺伝子（７）及びｐＵＣ複製開始点（８）をも含む。

別の例示的な発現ベクターは、本発明の例示的なＲＮＡ−タンパク質複合体をコードする図１０に示されるｐＢｉｏＲＰｏｌＩＩＩである。ベクターは、Ｓｅｃ−ＲＮＡ配列（３）の上流（１）のｈＵ６プロモーターと下流のＰｏｌ−ＩＩＩポリＴターミネーター配列（４）とを含む。ベクターはまた、融合タンパク質配列（６）の上流のβ−アクチンプロモーター（５）と下流のｈＧＨポリＡ配列（４）とを含む。ベクターはまた、カナマイシン耐性遺伝子（７）及びｐＵＣ複製開始点（８）をも含む。

別の例示的な発現ベクターは、本発明の例示的なＲＮＡ−タンパク質複合体をコードする図１１に示されるｐＢｉｏＲＰｏｌＩＩｃｏｍｂｏである。ベクターは、β−アクチンプロモーター（１）、イントロン配列（２）、融合タンパク質（６）、融合タンパク質に対して内部のフランキングイントロン（２）を有するＳｅｃ−ＲＮＡ（３）、ヒト成長ホルモンポリＡテイル配列（４）、カナマイシン耐性遺伝子（７）及びｐＵＣ複製開始点（８）を含む。この発現ベクターにおいて、Ｓｅｃ−ＲＮＡは、融合タンパク質をコードするｍＲＮＡ配列中において配置される人工イントロン中においてコードされる。Ｓｅｃ−ＲＮＡ分子又は融合タンパク質をコードするＤＮＡ断片をＰＣＲによって調製する。Ｓｅｃ−ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ断片は、融合タンパク質配列の中の固有の制限部位中にサブクローニングするためのスプライスドナー及び受容体部位並びに制限部位を含むプライマーにより調製される。融合タンパク質をコードするＤＮＡ断片は、上記のプラスミド中にサブクローニングするための制限部位を含むプライマーにより調製される。転写後、Ｓｅｃ−ＲＮＡは、バイオリアクター細胞に対して内在性のスプライシング機構によって融合タンパク質をコードするｍＲＮＡから放出される。

別の例示的な発現ベクターは、本発明の例示的なＲＮＡ−タンパク質複合体をコードする図１２に示されるｐＢｉｏＲＰｏｌＩＩｓｔａｂｌｅである。ベクターは、ＣＴＳ調節因子（９）、ＰＧＫプロモーター（１）、ピューロマイシン耐性遺伝子（１０）、ニワトリβ−アクチンプロモーター（５）、融合タンパク質（６）、融合タンパク質に対して内部のフランキングイントロン（２）を有するＳｅｃ−ＲＮＡ（３）、ヒト成長ホルモンポリＡテイル配列（４）、カナマイシン耐性遺伝子（７）及びｐＵＣ複製開始点（８）を含む。Ｓｅｃ−ＲＮＡ配列は、表Ｉ及びＩＩから選択され得、融合タンパク質配列は、表ＩＩＩ、ＩＶ及びＶから選択され得る。

別の例示的な発現ベクターは、本発明の例示的なＲＮＡ−タンパク質複合体をコードする図１３に示されるｐＢｉｏＲＰｏｌＩＩダイサーである。ベクターは、ＳＶ４０プロモーター（１）、イントロン配列（２）、生物活性ＲＮＡ配列及び認識ＲＮＡ配列（３）、ｈＧＨポリＡテイル配列（４）、ニワトリ−アクチンプロモーター（５）、融合タンパク質（６）、融合タンパク質に対して内部のフランキングイントロン（２）を有するＳｅｃ−ＲＮＡ（３）、ヒト成長ホルモンポリＡテイル配列（４）、カナマイシン耐性遺伝子（７）及びｐＵＣ複製開始点（８）を含む。Ｓｅｃ−ＲＮＡ配列は、表Ｉ及びＩＩから選択され得、融合タンパク質配列は、表ＩＩＩ、ＩＶ及びＶから選択され得る。

他の実施形態において、発現ベクターは、１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列を含む核酸分子をコードする第１ポリヌクレオチド配列と、ＲＮＡ結合ドメイン及び１つ又は複数の輸送ペプチド配列を含むポリペプチドをコードする第２ポリヌクレオチド配列とを含む。別の一実施形態において、発現ベクターは、１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、場合によって認識ＲＮＡ配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列を含む核酸分子をコードする第３ポリヌクレオチドを更に含む。一実施形態において、第１ポリヌクレオチド及び第３ポリヌクレオチドの生物活性ＲＮＡは、対象となる１つ又は複数の標的遺伝子をターゲッティングする。別の一実施形態において、第１ポリヌクレオチドの生物活性ＲＮＡは、対象となる１つ又は複数の標的遺伝子をターゲッティングする短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）及び短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）から選択され、第３ポリヌクレオチドの生物活性ＲＮＡは、ダイサー及び／又はドローシャをターゲッティングする。

更なる一実施形態において、発現ベクターは、第１プロモーター配列、終止配列及び場合によって１つ又は複数のプライマー配列、第２プロモーター配列、ポリＡ付加配列及び場合によって１つ又は複数のプライマー配列を更に含み、１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列及び場合による末端ミニヘリックス配列をコードする第１ポリヌクレオチドは、第１プロモーター配列及び終止配列に作動可能に連結し、ＲＮＡ結合ドメイン配列及び輸送ペプチド配列をコードする第２ポリヌクレオチドは、第２プロモーター配列及びポリＡ付加配列に作動可能に連結する。更に、ベクターは、１つ又は複数のプロモーター配列、１つ又は複数の終止配列及び場合によって１つ又は複数のプライマー配列を更に含むことができ、１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、場合によって認識ＲＮＡ配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列を含む核酸をコードする第３ポリヌクレオチド配列（単数又は複数）は、１つ又は複数のプロモーター配列及び１つ又は複数の終止配列に作動可能に連結する。

別の一実施形態において、発現ベクターは、ウイルス複製のために必要な１つ又は複数のウイルスポリメラーゼ及び１つ又は複数のウイルスアクセサリータンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を更に含む。更なる一実施形態において、ベクターは、１つ又は複数のプロモーター配列、１つ又は複数のポリＡ付加配列及び場合によって１つ又は複数のプライマー配列を更に含み、ウイルスポリメラーゼ（単数又は複数）及びウイルスアクセサリータンパク質（単数又は複数）をコードするポリヌクレオチド配列（単数又は複数）は、１つ又は複数のプロモーター配列及び１つ又は複数のポリＡ付加配列に作動可能に連結する。

一実施形態において、本発明は、１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列及び場合による末端ミニヘリックス配列を含む核酸分子をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。一実施形態において、発現ベクターは、１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列を含む核酸分子をコードするポリヌクレオチドと、ウイルス複製のために必要な１つ又は複数のウイルスポリメラーゼ及び１つ又は複数のウイルスアクセサリータンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列とを含む。

本発明はまた、ＲＮＡ結合ドメイン及び１つ又は複数の輸送ペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターをも提供する。

したがって、本発明は、１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列を含む核酸分子をコードするポリヌクレオチドを含む第１発現ベクターと、ＲＮＡ結合ドメイン及び１つ又は複数の輸送ペプチド、例えば細胞貫通ペプチド、非古典的分泌ドメイン、受容体結合ドメイン、融合ペプチド及びエンドソーム放出ドメインから選択されるペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む第２発現ベクターとを提供する。

本発明の発現ベクターのいずれかにおいて、認識ＲＮＡ配列、個々の生物活性ＲＮＡ配列、場合による末端ミニヘリックス配列、ＲＮＡ結合ドメイン及び輸送ペプチド（単数又は複数）を含む配列、並びにウイルス配列、プロモーター、プライマー、終止配列及びポリＡ配列が含まれるあらゆる他の配列の内の１つ又は複数は、１つ又は複数の介在又は付加配列の付加なしで直接結合する。別の場合、認識ＲＮＡ配列、個々の生物活性ＲＮＡ配列、場合による末端ミニヘリックス配列、ＲＮＡ結合ドメイン及び輸送ペプチド（単数又は複数）を含む配列、並びにウイルス配列、プロモーター、プライマー、終止配列及びポリＡ配列が含まれるあらゆる他の配列の内の１つ又は複数は、１つ又は複数の介在又は付加配列の付加と共に結合する。上記実施形態のいずれかにおいて、個々の生物活性ＲＮＡ配列自体は、いずれの介在若しくは付加配列なしで直接結合するか又は１つ若しくは複数の介在若しくは付加配列の付加と共に結合する。上記実施形態のいずれかにおいて、認識ＲＮＡ配列及び生物活性ＲＮＡのいずれかは、１つ若しくは複数のリンカー、スペーサー若しくは他の配列の付加なしで直接結合するか又は１つ若しくは複数のリンカー、スペーサー及び／若しくは他の配列の付加と共に結合する。上記実施形態のいずれかにおいて、ＲＮＡ結合ドメイン及び個々の輸送ペプチドのいずれかは、１つ若しくは複数のリンカー、スペーサー若しくは他の配列の付加なしで直接結合するか又は１つ若しくは複数のリンカー、スペーサー及び／若しくは他の配列の付加と共に結合する。

記載される発現ベクターのある種の実施形態において、生物活性ＲＮＡ配列は、リボザイム、アンチセンス核酸、アロザイム、アプタマー、短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及び１つ又は複数の生物活性ペプチドをコードする転写産物から選択される。特定の一実施形態において、生物活性ＲＮＡ配列は、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。別の特定の一実施形態において、生物活性ＲＮＡ配列は、アプタマーである。ある種の実施形態において、認識ＲＮＡ配列は、Ｕ１ループ、グループＩＩイントロン、ＮＲＥステムループ、Ｓ１Ａステムループ、バクテリオファージＢｏｘＢＲ、ＨＩＶＲｅｖ応答エレメント、ＡＭＶＣＰ認識配列及びＡＲＥ配列から選択される。一実施形態において、末端ミニヘリックス配列は、アデノウイルスＶＡ１ＲＮＡ分子に由来する。ある種の実施形態において、ＲＮＡ結合ドメインは、Ｕ１Ａ、ＣＲＳ１、ＣＲＭ１、ヌクレオリンＲＢＤ１２、ｈＲＢＭＹ、バクテリオファージタンパク質Ｎ、ＨＩＶＲｅｖ、アルファルファ−モザイクウイルスコートタンパク質（ＡＭＶＣＰ）及びトリステトラプロリンアミノ酸配列から選択される。ある種の実施形態において、１つ又は複数の輸送ペプチドは、細胞貫通ペプチド、非古典的分泌ドメイン、受容体結合ドメイン、融合ペプチド及びエンドソーム放出ドメイン、並びにそれらのあらゆる組合せから選択される。特定の一実施形態において、輸送ペプチドは細胞貫通ペプチドである。ある種の特定の実施形態において、細胞貫通ペプチドは、ペネトラチン、トランスポルタン、ＭＡＰ、ＨＩＶＴＡＴ、Ａｎｔｐ、Ｒｅｖ、ＦＨＶコートタンパク質、ＴＰ１０及びｐＶＥＣ配列から選択される。別の特定の一実施形態において、輸送ペプチドは非古典的分泌ドメインである。ある種の特定の実施形態において、非古典的分泌ドメインは、Ｇａｌｃｅｔｉｎ−１ペプチド、ガレクチン−３ペプチド、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＨＡＳＰＢ、ＨＭＧＢ１、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＩＬ−２シグナル、分泌トランスグルタミナーゼ、アネキシン−１、ＨＩＶＴＡＴ、ヘルペスＶＰ２２、チオレドキシン、ロダネーゼ及びプラスミノーゲンアクチベーターシグナル配列から選択される。特定の一実施形態において、輸送ペプチドは、細胞貫通ペプチド、並びに非古典的分泌ドメイン、受容体結合ドメイン、融合ペプチド及びエンドソーム放出ドメインから選択される１つ又は複数の輸送ペプチドである。特定の一実施形態において、輸送ペプチドは、細胞貫通ペプチド及び非古典的分泌ドメインである。ある種の実施形態において、ウイルス非構造及び構造遺伝子（ウイルスポリメラーゼ、アクセサリータンパク質、コートタンパク質及び融合タンパク質）は、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、単純ヘルペスウイルスレンチウイルス、レトロウイルス、シンドビスウイルス及びフォーミーウイルスが含まれるがこれらに限定されないＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルスから選択される。

更に、本発明は、形質転換されたパッケージング細胞から１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ分子を担持し、分布させる複製可能又は複製不能ウイルス粒子から構築された発現ベクターを提供する。一実施形態において、本発明は、部分的ウイルスゲノムを含むウイルスベクター、及び部分的ウイルスゲノムと本明細書に記載される核酸分子のいずれかをコードするポリヌクレオチドとを含む第２ウイルスベクターを提供する。一実施形態において、本発明は、１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列を含む核酸分子をコードするポリヌクレオチド、並びに１つ又は複数の融合タンパク質、即ちＲＮＡ結合ドメイン及び１つ又は複数の輸送ペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを提供する。生物活性ＲＮＡ配列は、本明細書に記載され、それ以外の場合、本技術分野において公知の生物活性ＲＮＡ配列のいずれかであってよい。一実施形態において、ウイルスベクターは、生物活性ＲＮＡ配列が、リボザイム、アンチセンス核酸、アロザイム、アプタマー、短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及び１つ又は複数の生物活性ペプチドをコードする転写産物から選択される、核酸分子をコードするポリヌクレオチドを含む。特定の一実施形態において、ウイルスベクターは、生物活性ＲＮＡ配列が短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、核酸分子をコードするポリヌクレオチドを含む。特定の一実施形態において、ウイルスベクターは、生物活性ＲＮＡ配列がアプタマーである、核酸分子をコードするポリヌクレオチドを含む。認識ＲＮＡ配列は、本明細書に記載され、それ以外の場合、本技術分野において公知の認識ＲＮＡ配列のいずれかであってよい。一実施形態において、ウイルスベクターベクターは、認識ＲＮＡ配列が、Ｕ１ループ、グループＩＩイントロン、ＮＲＥステムループ、Ｓ１Ａステムループ、バクテリオファージＢｏｘＢＲ、ＨＩＶＲｅｖ応答エレメント、ＡＭＶＣＰ認識配列及びＡＲＥ配列から選択される、核酸分子をコードするポリヌクレオチドを含む。末端ミニヘリックス配列は、本明細書に記載され、それ以外の場合、本技術分野において公知の末端ミニヘリックス配列のいずれかであってよい。本発明はまた、ＲＮＡ結合ドメイン及び１つ又は複数の輸送ペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターをも提供する。ある種の実施形態において、ＲＮＡ結合ドメインは、Ｕ１Ａ、ＣＲＳ１、ＣＲＭ１、ヌクレオリンＲＢＤ１２、ｈＲＢＭＹ、バクテリオファージタンパク質Ｎ、ＨＩＶＲｅｖ、アルファルファ−モザイクウイルスコートタンパク質（ＡＭＶＣＰ）及びトリステトラプロリンアミノ酸配列から選択される。ある種の実施形態において、１つ又は複数の輸送ペプチドは、細胞貫通ペプチド、非古典的分泌ドメイン、受容体結合ドメイン、融合ペプチド及びエンドソーム放出ドメイン、並びにそれらのあらゆる組合せから選択される。一実施形態において、本発明は、ＲＮＡ結合ドメイン及び細胞貫通ペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。ある種の特定の実施形態において、細胞貫通ペプチドは、ペネトラチン、トランスポルタン、ＭＡＰ、ＨＩＶＴＡＴ、Ａｎｔｐ、Ｒｅｖ、ＦＨＶコートタンパク質、ＴＰ１０及びｐＶＥＣ配列から選択される。別の一実施形態において、本発明は、ＲＮＡ結合ドメイン及び非古典的分泌ドメインを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。ある種の特定の実施形態において、非古典的分泌ドメインは、Ｇａｌｃｅｔｉｎ−１ペプチド、ガレクチン−３ペプチド、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＨＡＳＰＢ、ＨＭＧＢ１、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＩＬ−２シグナル、分泌トランスグルタミナーゼ、アネキシン−１、ＨＩＶＴＡＴ、ヘルペスＶＰ２２、チオレドキシン、ロダネーゼ及びプラスミノーゲンアクチベーターシグナル配列から選択される。一実施形態において、本発明は、ＲＮＡ結合ドメイン、細胞貫通ペプチド、並びに非古典的分泌ドメイン、受容体結合ドメイン、融合ペプチド及びエンドソーム放出ドメインから選択される１つ又は複数の輸送ペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。一実施形態において、本発明は、ＲＮＡ結合ドメイン、細胞貫通ペプチド及び非古典的分泌ドメインを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。

別の一実施形態において、ウイルスベクターは、部分的ウイルスゲノム、並びにダイサー及び／又はドローシャをターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列を含む核酸分子をコードするポリヌクレオチドを更に含む。これらのポリヌクレオチドのいずれも、ＲＮＡ結合ドメインをコードしない。一実施形態において、ポリヌクレオチドは、単一の生物活性ＲＮＡ配列を含む核酸分子をコードする。別の一実施形態において、ポリヌクレオチドは、２つ以上の生物活性ＲＮＡ配列を含む核酸分子をコードする。ある種の実施形態において、生物活性ＲＮＡ配列は、リボザイム、アンチセンス核酸、アロザイム、アプタマー、短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及び１つ又は複数の生物活性ペプチドをコードする転写産物から選択される。

バイオリアクター細胞

バイオリアクター細胞は、本発明の発現ベクター、例えばｐＢｉｏＲプラスミド（単数又は複数）をインビトロでレシピエント細胞系にトランスフェクトすることによって作製される。いかなる細胞型も、ｐＢｉｏＲプラスミドのいずれかが含まれる発現ベクター（単数又は複数）のためのレシピエント細胞としての役割を果たすことができる。可能なバイオリアクター細胞の源は、融合タンパク質中において使用されるドメインの同一性と遺伝子ノックダウンに対してターゲッティングされる細胞の同一性とに応じて変化し得る。バイオリアクターは、融合タンパク質の産生、Ｓｅｃ−ＲＮＡの産生、融合タンパク質によるＳｅｃ−ＲＮＡの結合、及びＲＮＡ−タンパク質複合体の分泌が可能である。融合タンパク質の産生は、タンパク質をコードするプラスミド由来ｍＲＮＡ転写産物を検出するＲＴ−ＰＣＲに基づいたアッセイ、及びタンパク質自体を検出する抗体に基づいたアッセイを通して確認され得る。Ｓｅｃ−ＲＮＡの成功した産生は、ＲＮＡ（生物活性ＲＮＡ及び認識ＲＮＡ配列）の転写と核からのその転写産物の搬出との両方を含む。プラスミド由来Ｓｅｃ−ＲＮＡ分子の産生を示すためにＲＴ−ＰＣＲアッセイを用いることができ、細胞質中におけるＲＮＡの蓄積を実証するために細胞分画を用いることができる。融合タンパク質によるＳｅｃ−ＲＮＡ分子の結合は、融合タンパク質のドメインの内の１つに対する抗体を用いた、又は、別の場合、融合タンパク質配列へのエピトープ標識（ＦＬＡＧ、ＨＡ等）の付加を介したＲＮＡ−タンパク質複合体の免疫沈降によって実証され得る。ＲＮＡ−タンパク質複合体の分泌は、細胞外マトリックス中における、又は培養細胞の場合は培地中におけるＳｅｃ−ＲＮＡの検出によって確認され得る。無傷のＲＮＡ−タンパク質複合体を、上記の通りの免疫沈降を介して培地から単離することができるか、又はトータルＲＮＡを、Ｔｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、製品＃Ｔ９４２４）を用いて調製することができる。Ｓｅｃ−ＲＮＡは、ノーザンブロットによって、又は上記の通りのＲＴ−ＰＣＲによって検出される。

バイオリアクター細胞は、本発明の発現ベクターによる適切な細胞の一過性トランスフェクションによって又は安定にトランスフェクトした細胞の発生によって作製することができ、そこでプラスミドがバイオリアクター細胞のゲノム中に組み込まれる。本明細書に記載され、それ以外の場合、本技術分野において公知の方法を用いてリポソーム若しくはポリマー送達剤を介して又はエレクトロポレーションを介して本発明の発現ベクターを細胞に一過性にトランスフェクトすることができる。この種のトランスフェクションの効率によって、後続の送達ステップにおいて不活性出発材料として機能する非トランスフェクト細胞からのバイオリアクター細胞（即ち、トランスフェクト細胞）の精製の必要性がなくなる。対照的に、本発明の発現ベクターを安定してトランスフェクトし、レシピエント細胞のゲノム由来の融合タンパク質及びＳｅｃ−ＲＮＡを発現する細胞系の発生は、トランスフェクト細胞の個々のコロニーの単離を必要とし、各々は、単一の組み込み事象を表し、バイオリアクター細胞の均質集団を生じる。これらの細胞は、連続的に分泌複合体を産生し、インビトロ及びインビボの用途において有用である。

バイオリアクター細胞をトランスフェクション剤として用いて、細胞へのＳｅｃ−ＲＮＡ分子の送達を促進することができる。バイオリアクター細胞を、Ｓｅｃ−ＲＮＡ分子がターゲッティングする遺伝子産物をノックダウンする目的のためにインビトロ、エクスビボ又はインビボで標的細胞に適用することもできる。トランスフェクションにおいて用いられる特定の発現ベクター及びレシピエント細胞は、対象となる遺伝子標的及び標的細胞同一性によって決定される。同様に、標的細胞に対するバイオリアクター細胞の最適比は、細胞及び遺伝子標的の各系について実験的に決定される。ＲＮＡ及び／又はタンパク質試料は、ｍＲＮＡ転写産物又はタンパク質のノックダウンをアッセイするためにバイオリアクター細胞の付加の約２４〜７２時間後に標的細胞からそれぞれ回収される。標的遺伝子のｍＲＮＡレベルは、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット及び本技術分野において公知の他の方法を介して測定され得る。標的遺伝子のタンパク質レベルは、公知の方法、例えばウエスタンブロット及び免疫沈降を用いて測定され得る。

バイオリアクター細胞は、本発明の発現ベクターの内の１つ又は複数を投与することによって作製され得る。一実施形態において、本発明は、本明細書において提供される発現ベクター及びそれらの組成物のいずれかを含むバイオリアクター細胞を提供する。一実施形態において、本発明は、生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列を含む核酸をコードするポリヌクレオチド配列と、ＲＮＡ結合ドメイン配列及び輸送ペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列とを含む発現ベクターを含む細胞を提供する。

一実施形態において、本発明は、生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列を含む核酸をコードするポリヌクレオチド配列、ＲＮＡ結合ドメイン配列及び輸送ペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、並びにウイルス複製のために必要な１つ又は複数のウイルスポリメラーゼ及び１つ又は複数のウイルスアクセサリータンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターと、１つ又は複数のウイルスコートタンパク質及び１つ又は複数のウイルス融合タンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターとを含む細胞を提供する。

一実施形態において、本発明は、生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列を含む核酸をコードするポリヌクレオチド配列、ＲＮＡ結合ドメイン配列及び輸送ペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、並びに１つ又は複数の更なる遺伝子標的（単数又は複数）をターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列を含む核酸をコードする更なるポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む細胞を提供する。一実施形態において、更なるポリヌクレオチド配列は、更なる遺伝子標的をターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列とＲＮＡ認識配列とを含む核酸をコードする。別の一実施形態において、ベクター中における生物活性ＲＮＡ配列の内の１つが短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）又は短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である場合、更なるポリヌクレオチド配列は、ダイサー及び／又はドローシャをターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列を含む核酸をコードする。

一実施形態において、本発明は、生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列を含む核酸をコードするポリヌクレオチド配列、ＲＮＡ結合ドメイン配列及び輸送ペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、ウイルス複製のために必要な１つ又は複数のウイルスポリメラーゼ及び１つ又は複数のウイルスアクセサリータンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列、並びに１つ又は複数の更なる遺伝子標的（単数又は複数）（例えば、ダイサー及び／又はドローシャ遺伝子標的）をターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列を含む核酸をコードする更なるポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターと、１つ又は複数のウイルスコートタンパク質及び１つ又は複数のウイルス融合タンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターとを含む細胞を提供する。

一実施形態において、本発明は、生物活性ＲＮＡ配列を含む核酸をコードするポリヌクレオチド配列、並びにウイルス複製のために必要な１つ又は複数のウイルスポリメラーゼ及び１つ又は複数のウイルスアクセサリータンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターと、１つ又は複数のウイルスコートタンパク質及び１つ又は複数のウイルス融合タンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターとを含む細胞を提供する。

一実施形態において、本発明は、生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列を含む核酸をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターと、ＲＮＡ結合ドメイン配列及び１つ又は複数の輸送ペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターとを含む細胞を提供する。一実施形態において、細胞は、第１発現ベクター中における生物活性ＲＮＡの遺伝子標的（単数又は複数）と異なる１つ又は複数の遺伝子標的（単数又は複数）をターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列を含む核酸をコードするポリヌクレオチド配列を含む第３発現ベクターを更に含む。一実施形態において、第３発現ベクターは、１つ又は複数の遺伝子標的をターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列とＲＮＡ認識配列とを含む核酸をコードするポリヌクレオチド配列を含む。別の一実施形態において、第１発現ベクター中における生物活性ＲＮＡ配列の内の１つが、短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）又は短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である場合、第３発現ベクターは、ダイサー及び／又はドローシャをターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列を含む核酸をコードするポリヌクレオチド配列を含む。

本明細書に記載されるバイオリアクター細胞は、とりわけ、標的細胞に生物活性ＲＮＡを送達するために使用され得る。一実施形態において、標的細胞に生物活性ＲＮＡを送達する方法は、（ａ）１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ、認識ＲＮＡ配列、場合によって末端ミニヘリックス配列、ＲＮＡ結合ドメイン、並びに細胞貫通ドメイン、非古典的分泌ドメイン、エンドソーム解放ドメイン、融合ペプチド及び受容体結合ドメインから選択される１つ又は複数の輸送ペプチド配列を含むＲＮＡ−タンパク質複合体をコードする発現ベクターを調製するステップ、（ｂ）培養細胞にステップ（ａ）の発現ベクターを投与して、ＲＮＡ−タンパク質複合体を発現するバイオリアクター細胞を作製するステップ、（ｃ）ステップ（ｂ）の培養細胞を回収するステップ、（ｄ）ＲＮＡ−タンパク質複合体を発現するバイオリアクター細胞を決定するために（ｃ）の細胞を試験するステップ、並びに（ｅ）他の培養細胞からバイオリアクター細胞を単離するステップ、並びに（ｆ）１つ又は複数の標的細胞とステップ（ｅ）における単離したバイオリアクター細胞とを混合して、標的細胞に生物活性ＲＮＡを送達するステップを含む。一実施形態において、（ｆ）の標的細胞は、細胞培養における標的細胞である。一実施形態において、（ｆ）の標的細胞は、哺乳動物が含まれる生物から抽出された標的細胞である。一実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。発現ベクターは、本明細書に記載されるいずれの発現ベクターであってもよい。ＲＮＡ−タンパク質複合体は、本明細書に記載されるいずれのＲＮＡ−タンパク質複合体であってもよい。一実施形態において、ＲＮＡ−タンパク質複合体の生物活性ＲＮＡは、ｓｈＲＮＡである。別の一実施形態において、ＲＮＡ−タンパク質複合体の生物活性ＲＮＡは、アプタマーである。一実施形態において、ステップ（ｂ）の細胞に、発現ベクターを安定にトランスフェクトする。方法のある種の実施形態において、ステップ（ａ）の発現ベクターは、１つ又は複数の更なる遺伝子標的（単数又は複数）をターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列を含む核酸をコードするポリヌクレオチド配列を更に含む。一実施形態において、更なるポリヌクレオチド配列は、更なる遺伝子標的をターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列とＲＮＡ認識配列とを含む核酸をコードする。別の一実施形態において、ベクター中における生物活性ＲＮＡ配列の内の１つが、短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）又は短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である場合、更なるポリヌクレオチド配列は、ダイサー及び／又はドローシャをターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列を含む核酸をコードする。

別の一実施形態において、標的細胞に生物活性ＲＮＡを送達する方法は、（ａ）１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ、認識ＲＮＡ配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列を含む核酸をコードするポリヌクレオチド配列、ＲＮＡ結合ドメイン及び１つ又は複数の輸送ペプチド配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、並びにウイルス複製のために必要な１つ又は複数のウイルスポリメラーゼ及び１つ又は複数のウイルスアクセサリータンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを調製するステップ、（ｂ）１つ又は複数のウイルスコートタンパク質及び１つ又は複数のウイルス融合タンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを調製するステップ、（ｃ）培養細胞にステップ（ａ）の発現ベクター及び（ｂ）の発現ベクターを投与して、ＲＮＡ−タンパク質複合体を発現するバイオリアクター細胞を作製するステップ、（ｄ）ステップ（ｃ）の培養細胞を回収するステップ、（ｅ）ＲＮＡ−タンパク質複合体を発現するバイオリアクター細胞を決定するために（ｄ）の細胞を試験するステップ、及び（ｆ）他の培養細胞からバイオリアクター細胞を単離するステップ、及び（ｇ）１つ又は複数の標的細胞とステップ（ｆ）における単離したバイオリアクター細胞とを混合して、標的細胞に生物活性ＲＮＡを送達するステップを含む。一実施形態において、（ｇ）の標的細胞は、細胞培養における標的細胞である。一実施形態において、（ｇ）の標的細胞は、哺乳動物が含まれる生物から抽出された標的細胞である。一実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。一実施形態において、ステップ（ｃ）の細胞に、発現ベクターを安定にトランスフェクトする。

方法のある種の実施形態において、ステップ（ａ）の発現ベクターは、１つ又は複数の更なる遺伝子標的（単数又は複数）をターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列を含む核酸をコードするポリヌクレオチド配列を更に含む。一実施形態において、更なるポリヌクレオチド配列は、更なる遺伝子標的をターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列とＲＮＡ認識配列とを含む核酸をコードする。別の一実施形態において、ベクター中における生物活性ＲＮＡ配列の内の１つが、短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）又は短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である場合、更なるポリヌクレオチド配列は、ダイサー及び／又はドローシャをターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列を含む核酸をコードする。

別の一実施形態において、標的細胞に生物活性ＲＮＡを送達する方法は、（ａ）１つ又は複数の生物活性ＲＮＡを含む核酸をコードするポリヌクレオチド配列、並びにウイルス複製のために必要な１つ又は複数のウイルスポリメラーゼ及び１つ又は複数のウイルスアクセサリータンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを調製するステップ、（ｂ）１つ又は複数のウイルスコートタンパク質及び１つ又は複数のウイルス融合タンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを調製するステップ、（ｃ）培養細胞にステップ（ａ）の発現ベクター及び（ｂ）の発現ベクターを投与して、ＲＮＡ−タンパク質複合体を発現するバイオリアクター細胞を作製するステップ、（ｄ）ステップ（ｃ）の培養細胞を回収するステップ、（ｅ）ＲＮＡ−タンパク質複合体を発現するバイオリアクター細胞を決定するために（ｄ）の細胞を試験するステップ、及び（ｆ）他の培養細胞からバイオリアクター細胞を単離するステップ、及び（ｇ）１つ又は複数の標的細胞とステップ（ｆ）における単離したバイオリアクター細胞とを混合して、標的細胞に生物活性ＲＮＡを送達するステップを含む。一実施形態において、（ｇ）の標的細胞は、細胞培養における標的細胞である。一実施形態において、（ｇ）の標的細胞は、哺乳動物が含まれる生物から抽出された標的細胞である。一実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。一実施形態において、ステップ（ｃ）の細胞に、発現ベクターを安定にトランスフェクトする。

別の一実施形態において、標的細胞に生物活性ＲＮＡを送達する方法は、（ａ）１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ、認識ＲＮＡ配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列を含む核酸をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを調製するステップ、（ｂ）ＲＮＡ結合ドメイン及び１つ又は複数の輸送ペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを調製するステップ、（ｃ）培養細胞にステップ（ａ）の発現ベクター及び（ｂ）の発現ベクターを投与して、ＲＮＡ−タンパク質複合体を発現するバイオリアクター細胞を作製するステップ、（ｄ）ステップ（ｃ）の培養細胞を回収するステップ、（ｅ）ＲＮＡ−タンパク質複合体を発現するバイオリアクター細胞を決定するために（ｄ）の細胞を試験するステップ、及び（ｆ）他の培養細胞からバイオリアクター細胞を単離するステップ、及び（ｇ）１つ又は複数の標的細胞とステップ（ｆ）における単離したバイオリアクター細胞とを混合して、標的細胞に生物活性ＲＮＡを送達するステップを含む。一実施形態において、（ｇ）の標的細胞は、細胞培養における標的細胞である。一実施形態において、（ｇ）の標的細胞は、哺乳動物が含まれる生物から抽出された標的細胞である。一実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。一実施形態において、ステップ（ｃ）の細胞に、発現ベクターを安定にトランスフェクトする。

別の一実施形態において、方法は、１つ又は複数の更なる遺伝子標的（単数又は複数）をターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列を含む核酸をコードするポリヌクレオチド配列を含む第３発現ベクターを調製し、投与することを含む。一実施形態において、更なるポリヌクレオチド配列は、更なる遺伝子標的をターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列とＲＮＡ認識配列とを含む核酸をコードする。別の一実施形態において、第１ベクター中における生物活性ＲＮＡ配列の内の１つが、短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）又は短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である場合、更なるポリヌクレオチド配列は、ダイサー及び／又はドローシャをターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列を含む核酸をコードする。

本発明はまた、標的細胞への生物活性ＲＮＡの送達のためのエクスビボでのバイオリアクター細胞の使用方法をも提供する。一実施形態において、エクスビボで標的細胞に生物活性ＲＮＡを送達する方法は、（ａ）１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ、認識ＲＮＡ配列、場合によって末端ミニヘリックス配列、ＲＮＡ結合ドメイン及び１つ又は複数の標的ペプチド配列を含むＲＮＡ−タンパク質複合体をコードする発現ベクターを調製するステップ、（ｂ）培養細胞にステップ（ａ）の発現ベクターを投与して、ＲＮＡ−タンパク質複合体を発現するバイオリアクター細胞を作製するステップ、（ｃ）ステップ（ｂ）の培養細胞を回収するステップ、（ｄ）対象から標的細胞を得るステップ、（ｅ）ステップ（ｄ）において得られた１つ又は複数の標的細胞とステップ（ｃ）において回収された培養細胞（単数又は複数）とを混合して、標的細胞に生物活性ＲＮＡを送達するステップを含む。一実施形態において、方法は、（ｆ）対象にステップ（ｅ）における細胞を投与するステップを更に含む。一実施形態において、方法は、バイオリアクター細胞を標的細胞から分離した後、標的細胞を対象に投与するステップを更に含む。一実施形態において、ステップ（ｆ）の対象は、標的細胞を得たステップ（ｄ）における対象と同じ対象である。別の一実施形態において、ステップ（ｆ）の対象は、標的細胞を得たステップ（ｄ）における対象とは異なる対象である。方法のある種の実施形態において、ステップ（ａ）の発現ベクターは、１つ又は複数の更なる遺伝子標的（単数又は複数）をターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列を含む核酸をコードするポリヌクレオチド配列を更に含む。一実施形態において、更なるポリヌクレオチド配列は、更なる遺伝子標的をターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列とＲＮＡ認識配列とを含む核酸をコードする。別の一実施形態において、ベクター中における生物活性ＲＮＡ配列の内の１つが、短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）又は短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である場合、更なるポリヌクレオチド配列は、ダイサー及び／又はドローシャをターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列を含む核酸をコードする。

別の一実施形態において、標的細胞に生物活性ＲＮＡを送達する方法は、（ａ）１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ、認識ＲＮＡ配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列を含む核酸をコードするポリヌクレオチド配列、ＲＮＡ結合ドメイン及び１つ又は複数の輸送ペプチド配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、並びにウイルスの複製のために必要な１つ又は複数のウイルスポリメラーゼ及び１つ又は複数のウイルスアクセサリータンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを調製するステップ、（ｂ）１つ又は複数のウイルスコートタンパク質及び１つ又は複数のウイルス融合タンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを調製するステップ、（ｃ）培養細胞にステップ（ａ）の発現ベクター及び（ｂ）の発現ベクターを投与して、ＲＮＡ−タンパク質複合体を発現するバイオリアクター細胞を作製するステップ、（ｄ）ステップ（ｃ）の培養細胞を回収するステップ、（ｅ）対象から標的細胞を得るステップ、（ｆ）ステップ（ｅ）において得られた１つ又は複数の標的細胞とステップ（ｄ）において回収された培養細胞（単数又は複数）とを混合して、標的細胞に生物活性ＲＮＡを送達するステップを含む。一実施形態において、方法は、（ｇ）対象にステップ（ｄ）における細胞を投与するステップを更に含む。一実施形態において、方法は、バイオリアクター細胞を標的細胞から分離した後、標的細胞を対象に投与するステップを更に含む。一実施形態において、ステップ（ｇ）の対象は、標的細胞を得たステップ（ｅ）における対象と同じ対象である。別の一実施形態において、ステップ（ｇ）の対象は、標的細胞を得たステップ（ｅ）における対象とは異なる対象である。

別の一実施形態において、標的細胞に生物活性ＲＮＡを送達する方法は、（ａ）１つ又は複数の生物活性ＲＮＡを含む核酸をコードするポリヌクレオチド配列、並びにウイルス複製のために必要な１つ又は複数のウイルスポリメラーゼ及び１つ又は複数のウイルスアクセサリータンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを調製するステップ、（ｂ）１つ又は複数のウイルスコートタンパク質及び１つ又は複数のウイルス融合タンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを調製するステップ、（ｃ）培養細胞にステップ（ａ）の発現ベクター及び（ｂ）の発現ベクターを投与して、ＲＮＡ−タンパク質複合体を発現するバイオリアクター細胞を作製するステップ、（ｄ）ステップ（ｃ）の培養細胞を回収するステップ、（ｅ）対象から標的細胞を得るステップ、（ｆ）ステップ（ｅ）において得られた１つ又は複数の標的細胞とステップ（ｄ）において回収された培養細胞（単数又は複数）とを混合して、標的細胞に生物活性ＲＮＡを送達するステップを含む。一実施形態において、方法は、（ｇ）対象にステップ（ｄ）における細胞を投与するステップを更に含む。一実施形態において、方法は、バイオリアクター細胞を標的細胞から分離した後、標的細胞を対象に投与するステップを更に含む。一実施形態において、ステップ（ｇ）の対象は、標的細胞を得たステップ（ｅ）における対象と同じ対象である。別の一実施形態において、ステップ（ｇ）の対象は、標的細胞を得たステップ（ｅ）における対象とは異なる対象である。

別の一実施形態において、標的細胞に生物活性ＲＮＡを送達する方法は、（ａ）１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ、認識ＲＮＡ配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列を含む核酸をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを調製するステップ、（ｂ）ＲＮＡ結合ドメイン及び１つ又は複数の輸送ペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを調製するステップ、（ｃ）培養細胞にステップ（ａ）の発現ベクター及び（ｂ）の発現ベクターを投与して、ＲＮＡ−タンパク質複合体を発現するバイオリアクター細胞を作製するステップ、（ｄ）ステップ（ｃ）の培養細胞を回収するステップ、（ｅ）対象から標的細胞を得るステップ、（ｆ）ステップ（ｅ）において得られた１つ又は複数の標的細胞とステップ（ｄ）において回収された培養細胞（単数又は複数）とを混合して、標的細胞に生物活性ＲＮＡを送達するステップを含む。一実施形態において、方法は、（ｇ）対象にステップ（ｄ）における細胞を投与するステップを更に含む。一実施形態において、方法は、バイオリアクター細胞を標的細胞から分離した後、標的細胞を対象に投与するステップを更に含む。一実施形態において、ステップ（ｇ）の対象は、標的細胞を得たステップ（ｅ）における対象と同じ対象である。別の一実施形態において、ステップ（ｇ）の対象は、標的細胞を得たステップ（ｅ）における対象とは異なる対象である。

上記の方法のいずれかにおいて、方法は、ＲＮＡ−タンパク質複合体を発現するバイオリアクター細胞を決定するために（ｃ）又は（ｄ）の細胞を試験するステップ、及び他の培養細胞からバイオリアクター細胞を単離した後、対象から標的細胞を得るステップを更に含むことができる。

これらの方法のいずれかにおいて、ステップの対象は、ヒトが含まれる哺乳動物である。本明細書に記載されるエクスビボでの方法のいずれかにおいて、標的細胞が得られる対象及び細胞が投与される対象は、例えばヒト対象が含まれる哺乳動物対象である。発現ベクターは、本明細書に記載される発現ベクターのいずれかであってよい。ＲＮＡ−タンパク質複合体は、本明細書に記載されるＲＮＡ−タンパク質複合体のいずれかであってよい。一実施形態において、ＲＮＡ−タンパク質複合体の生物活性ＲＮＡは、ｓｈＲＮＡである。別の一実施形態におい、ＲＮＡ−タンパク質複合体の生物活性ＲＮＡは、アプタマーである。一実施形態において、発現ベクターによってコードされるＲＮＡ−タンパク質複合体は、非古典的分泌ドメイン配列を含む。別の一実施形態において、発現ベクターによってコードされるＲＮＡ−タンパク質複合体は、細胞貫通ペプチドを含む。別の一実施形態において、発現ベクターによってコードされるＲＮＡ−タンパク質複合体は、細胞貫通ペプチド及び非古典的分泌ドメインを含む。一実施形態において、ステップ（ｂ）又はステップ（ｃ）の細胞に、発現ベクターを安定にトランスフェクトする。

本発明はまた、標的細胞及び／又は組織への生物活性ＲＮＡの送達のためのインビボでのバイオリアクター細胞の使用方法をも提供する。一実施形態において、インビボで標的細胞に生物活性ＲＮＡを送達する方法は、（ａ）１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ、認識ＲＮＡ配列、場合によって末端ミニヘリックス配列、ＲＮＡ結合ドメイン及び１つ又は複数の輸送ペプチド配列（即ち、細胞貫通ドメイン、非古典的分泌ドメイン、エンドソーム放出ドメイン、融合ペプチド及び受容体結合ドメインから選択される）を含むＲＮＡ−タンパク質複合体をコードする発現ベクターを調製するステップ、（ｂ）培養細胞にステップ（ａ）の発現ベクターを投与して、ＲＮＡ−タンパク質複合体を発現するバイオリアクター細胞を作製するステップ、（ｃ）ステップ（ｂ）の培養細胞を回収するステップ、（ｄ）対象にステップ（ｃ）における細胞を投与するステップを含む。一実施形態において、ステップ（ｄ）の対象は、哺乳動物である。一実施形態において、哺乳動物は、ヒト対象である。

本発明はまた、標的細胞及び／又は組織への生物活性ＲＮＡの送達のためのインビボでのバイオリアクター細胞の使用方法をも提供する。一実施形態において、インビボで標的細胞に生物活性ＲＮＡを送達する方法は、（ａ）１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ、認識ＲＮＡ配列、場合によって末端ミニヘリックス配列、ＲＮＡ結合ドメイン及び１つ又は複数の輸送ペプチド配列、並びにウイルス複製のために必要な１つ又は複数のウイルスポリメラーゼ及び１つ又は複数のウイルスアクセサリータンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を含むＲＮＡ−タンパク質複合体をコードする発現ベクターを調製するステップ、（ｂ）１つ又は複数のウイルスコートタンパク質及び１つ又は複数のウイルス融合タンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを調製するステップ、（ｃ）培養細胞にステップ（ａ）の発現ベクター及びステップ（ｂ）の発現ベクターを投与して、ＲＮＡ−タンパク質複合体を発現するバイオリアクター細胞を作製するステップ、（ｄ）ステップ（ｃ）の培養細胞を回収するステップ、（ｅ）対象にステップ（ｄ）における細胞を投与するステップを含む。一実施形態において、ステップ（ｅ）の対象は、哺乳動物である。一実施形態において、哺乳動物は、ヒト対象である。

本発明はまた、標的細胞及び／又は組織への生物活性ＲＮＡの送達のためのインビボでのバイオリアクター細胞の使用方法をも提供する。一実施形態において、インビボで標的細胞に生物活性ＲＮＡを送達する方法は、（ａ）１つ又は複数の生物活性ＲＮＡを含む核酸をコードするポリヌクレオチド配列、並びにウイルス複製のために必要な１つ又は複数のウイルスポリメラーゼ及び１つ又は複数のウイルスアクセサリータンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを調製するステップ、（ｂ）１つ又は複数のウイルスコートタンパク質及び１つ又は複数のウイルス融合タンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを調製するステップ、（ｃ）培養細胞にステップ（ａ）の発現ベクター及び（ｂ）の発現ベクターを投与して、ＲＮＡ−タンパク質複合体を発現するバイオリアクター細胞を作製するステップ、（ｄ）ステップ（ｃ）の培養細胞を回収するステップ、（ｅ）対象にステップ（ｄ）における細胞を投与するステップを含む。一実施形態において、ステップ（ｅ）の対象は、哺乳動物である。一実施形態において、哺乳動物は、ヒト対象である。

本発明はまた、標的細胞及び／又は組織への生物活性ＲＮＡの送達のためのインビボでのバイオリアクター細胞の使用方法をも提供する。一実施形態において、インビボで標的細胞に生物活性ＲＮＡを送達する方法は、（ａ）１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ、認識ＲＮＡ配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列を含む核酸をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを調製するステップ、（ｂ）ＲＮＡ結合ドメイン及び１つ又は複数の輸送ペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを調製するステップ、（ｃ）培養細胞にステップ（ａ）の発現ベクター及び（ｂ）の発現ベクターを投与して、ＲＮＡ−タンパク質複合体を発現するバイオリアクター細胞を作製するステップ、（ｄ）ステップ（ｃ）の培養細胞を回収するステップ、（ｅ）対象にステップ（ｄ）における細胞を投与するステップを含む。一実施形態において、ステップ（ｅ）の対象は、哺乳動物である。一実施形態において、哺乳動物は、ヒト対象である。

上記の方法のいずれかにおいて、方法は、ＲＮＡ−タンパク質複合体を発現するバイオリアクター細胞を決定するために（ｃ）又は（ｄ）の細胞を試験するステップ、及び他の培養細胞からバイオリアクター細胞を単離した後、対象に細胞を投与するステップを更に含むことができる。一実施形態において、対象は、哺乳動物である。一実施形態において、哺乳動物は、ヒト対象である。

治療方法

一実施形態において、本発明は、本発明の発現ベクターを対象に投与することを含む、対象における欠損遺伝子発現及び／又は活性に伴う疾患又は状態を予防し、寛解させ及び／又は治療する方法を提供する。本明細書に記載される発現ベクターのいずれかを、対象における欠損遺伝子発現及び／又は活性に伴う疾患又は状態を予防し、寛解させ及び／又は治療するための方法において使用することができる。

一実施形態において、本発明は、標的遺伝子に向けられた１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列を含む核酸をコードするポリヌクレオチド、並びにＲＮＡ結合ドメイン及び１つ又は複数の輸送ペプチド配列（即ち、細胞貫通ペプチド配列、非古典的分泌ドメイン、エンドソーム放出ドメイン及び受容体結合ドメインから選択される）を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを対象に投与することを含む、対象における欠損遺伝子発現及び／又は活性に伴う疾患又は状態を予防し、寛解させ及び／又は治療する方法を提供する。一実施形態において、発現ベクターは、標的遺伝子（単数又は複数）に向けられた１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、場合によって認識ＲＮＡ結合ドメイン及び場合によって末端ミニヘリックス配列を含む更なる核酸をコードするポリヌクレオチドを更に含む。一実施形態において、更なる核酸の標的遺伝子（単数又は複数）は、ダイサー及び／又はドローシャから選択される。

一実施形態において、本発明は、標的遺伝子に向けられた１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列を含む核酸をコードするポリヌクレオチド、並びにＲＮＡ結合ドメイン及び１つ又は複数の輸送ペプチド配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びにウイルス複製のために必要な１つ又は複数のウイルスポリメラーゼ及び１つ又は複数のウイルスアクセサリータンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターと、１つ又は複数のウイルスコートタンパク質及び１つ又は複数のウイルス融合タンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターとを対象に投与することを含む、対象における欠損遺伝子発現及び／又は活性に伴う疾患又は状態を予防し、寛解させ及び／又は治療する方法を提供する。一実施形態において、発現ベクターは、標的遺伝子（単数又は複数）に向けられた１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、場合によって認識ＲＮＡ結合ドメイン及び場合によって末端ミニヘリックス配列を含む更なる核酸をコードするポリヌクレオチドを更に含む。一実施形態において、更なる核酸の標的遺伝子（単数又は複数）は、ダイサー及び／又はドローシャから選択される。

一実施形態において、本発明は、標的遺伝子に向けられた１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列を含む核酸をコードするポリヌクレオチド、並びにウイルス複製のために必要な１つ又は複数のウイルスポリメラーゼ及び１つ又は複数のウイルスアクセサリータンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターと、１つ又は複数のウイルスコートタンパク質及び１つ又は複数のウイルス融合タンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターとを対象に投与することを含む、対象における欠損遺伝子発現及び／又は活性に伴う疾患又は状態を予防し、寛解させ及び／又は治療する方法を提供する。

一実施形態において、本発明は、標的遺伝子に向けられた１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列を含む核酸をコードする第１発現ベクターと、ＲＮＡ結合ドメイン及び１つ又は複数の輸送ペプチド配列（即ち、細胞貫通ペプチド配列、非古典的分泌ドメイン、エンドソーム放出ドメイン及び受容体結合ドメインから選択される）を含むポリペプチドをコードする第２発現ベクターとを対象に投与することを含む、対象における欠損遺伝子発現及び／又は活性に伴う疾患又は状態を予防し、寛解させ及び／又は治療する方法を提供する。一実施形態において、方法は、標的遺伝子（単数又は複数）に向けられた１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、場合によって認識ＲＮＡ結合ドメイン及び場合によって末端ミニヘリックス配列を含む核酸をコードする第３発現ベクターを対象に投与することを更に含む。一実施形態において、第２核酸の標的遺伝子（単数又は複数）は、ダイサー及び／又はドローシャから選択される。

上記の方法のいずれかにおいて、発現ベクターは、発現ベクターと医薬的に許容し得る担体とを含む組成物として投与され得る。

本発明は、本発明の１つ又は複数のバイオリアクター細胞を対象に投与することを含む、対象における欠損遺伝子発現及び／又は活性に伴う疾患又は状態を予防し、寛解させ及び／又は治療する方法を更に提供する。一実施形態において、本発明は、本発明の１つ又は複数のバイオリアクター細胞と、限定されるものではないが、リン酸緩衝食塩水、生理食塩水又は５％デキストロースが含まれる医薬的に許容し得る担体とを含む組成物を対象に投与することを含む、対象における欠損遺伝子発現及び／又は活性に伴う疾患又は状態を予防し、寛解させ及び／又は治療する方法を提供する。バイオリアクター細胞（単数又は複数）は、本明細書に記載される本発明のバイオリアクター細胞（単数又は複数）のいずれかであってよい。一実施形態において、バイオリアクター細胞は、標的遺伝子に向けられた１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列、場合によって末端ミニヘリックス配列、ＲＮＡ結合ドメイン配列、並びに細胞貫通ペプチド配列、非古典的分泌ドメイン、エンドソーム放出ドメイン、受容体結合ドメイン及び融合ペプチドから選択される１つ又は複数の輸送ペプチド配列を含むＲＮＡ−タンパク質複合体をコードする。

別の一実施形態において、本発明は、１つ又は複数のバイオリアクター細胞と、限定されるものではないが、リン酸緩衝食塩水、生理食塩水又は５％デキストロースが含まれる医薬的に許容し得る担体とを含む組成物を対象に投与することを含む、対象における欠損遺伝子発現及び／又は活性に伴う疾患又は状態を予防し、寛解させ及び／又は治療する方法であって、バイオリアクター細胞（単数又は複数）が、標的遺伝子（単数又は複数）に向けられた１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列、ＲＮＡ結合ドメイン配列、細胞貫通ペプチド配列、非古典的分泌ドメイン、エンドソーム放出ドメイン、受容体結合ドメインから選択される１つ又は複数の輸送ペプチド配列を含むＲＮＡ−タンパク質複合体を産生し、分泌し、ダイサー及び／又はドローシャに向けられた１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列を含むＲＮＡを更に産生する、上記方法を提供する。

欠損遺伝子発現及び／又は活性に伴う疾患又は状態を予防し、寛解させ及び／又は治療する上記方法のいずれかにおいて、適切な遺伝子ターゲッティングしては、Ｍｍｐ２、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、Ｃａｖ−１、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、Ｈ−Ｒａｓ、Ｂｃｌ−２、スルビビン、ＦＡＫ、ＳＴＡＴ−３、ＨＥＲ−３、ベータ−カテニン及びＳｒｃが挙げられる。

したがって、一実施形態において、本発明は、１つ又は複数の発現ベクターと医薬的に許容し得る担体とを含む組成物を対象に投与することを含む、対象における欠損標的遺伝子発現及び／又は活性に伴う疾患又は状態を予防し、寛解させ及び／又は治療する方法であって、発現ベクター（単数又は複数）が、標的遺伝子に向けられた１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列、場合によって末端ミニヘリックス配列、ＲＮＡ結合ドメイン配列、並びに細胞貫通ペプチド配列、非古典的分泌ドメイン、エンドソーム放出ドメイン、受容体結合ドメイン及び融合ペプチドから選択される１つ又は複数の配列を含むＲＮＡ−タンパク質複合体をコードする、上記方法を提供する。例示的な標的遺伝子としては、Ｍｍｐ２、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、Ｃａｖ−１、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、Ｈ−Ｒａｓ、Ｂｃｌ−２、スルビビン、ＦＡＫ、ＳＴＡＴ−３、ＨＥＲ−３、ベータ−カテニン及びＳｒｃが挙げられる。

別の一実施形態において、本発明は、１つ又は複数のバイオリアクター細胞と医薬的に許容し得る担体とを含む組成物を対象に投与することを含む、対象における欠損遺伝子発現及び／又は活性に伴う疾患又は状態を予防し、寛解させ及び／又は治療する方法であって、欠損遺伝子発現及び／又は活性が、欠損Ｍｍｐ２、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、Ｃａｖ−１、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、Ｈ−Ｒａｓ、Ｂｃｌ−２、スルビビン、ＦＡＫ、ＳＴＡＴ−３、ＨＥＲ−３、ベータ−カテニン及びＳｒｃ発現及び／又は活性から選択され、バイオリアクター細胞（単数又は複数）が、１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列、場合によって末端ミニヘリックス配列、ＲＮＡ結合ドメイン配列、及び細胞貫通ペプチド配列、非古典的分泌ドメイン、エンドソーム放出ドメイン、受容体結合ドメインから選択される１つ又は複数の配列を含むＲＮＡ−タンパク質複合体を産生し、分泌し、生物活性ＲＮＡ（単数又は複数）が、Ｍｍｐ２、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、Ｃａｖ−１、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、Ｈ−Ｒａｓ、Ｂｃｌ−２、スルビビン、ＦＡＫ、ＳＴＡＴ−３、ＨＥＲ−３、ベータ−カテニン及びＳｒｃから選択される遺伝子（単数又は複数）に向けられ、生物活性ＲＮＡ（単数又は複数）が、欠損発現及び／又は活性を有する遺伝子（単数又は複数）をターゲッティングする、上記方法を提供する。

本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチド

本発明は、細胞への生物活性ＲＮＡの送達のための核酸分子、ポリペプチド、ＲＮＡ−タンパク質複合体及びそれらを含む発現ベクターの産生に有用な新規なポリヌクレオチドを提供する。一実施形態において、本発明は、１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列を含む核酸分子をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。特定の一実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、１つ又は複数の短鎖ヘアピンＲＮＡ、認識ＲＮＡ配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列を含む核酸分子をコードする。別の一実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、１つ又は複数のアプタマー、認識ＲＮＡ配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列を含む核酸分子をコードする。別の一実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、１つ又は複数のリボザイム、認識ＲＮＡ配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列を含む核酸分子をコードする。別の一実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、１つ又は複数のアンチセンス核酸、認識ＲＮＡ配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列を含む核酸分子をコードする。更に、本発明は、ダイサーをターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列を含む核酸分子をコードする単離されたポリヌクレオチド、例えば配列番号４９を含むポリヌクレオチドを提供する。

更に、本発明は、上記の核酸配列の認識ＲＮＡ配列と結合するアミノ酸配列（ＲＮＡ結合ドメイン）と、細胞からの上記の生物活性ＲＮＡの輸送及び分泌を促進するアミノ酸配列（輸送ペプチド）とを含む新規な融合タンパク質を提供する。したがって、一実施形態において、融合タンパク質は、ＲＮＡ結合ドメイン及び１つ又は複数の輸送ペプチドを含む。融合ポリペプチドの輸送ペプチドは、細胞外マトリックス並びに／又は隣接する細胞及び組織への核酸、ペプチド、融合タンパク質、ＲＮＡ−タンパク質複合体及び／又は他の生体分子の送達を促進するいずれのアミノ酸配列であってもよい。

本発明はまた、本明細書に記載されるポリペプチド分子のいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。一実施形態において、本発明は、ＲＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列を含むポリペプチドと、例えば非古典的分泌ドメイン、細胞貫通ペプチド、受容体結合ドメイン、エンドソーム放出ドメイン及び融合ペプチドから選択される１つ又は複数の輸送ペプチド配列のアミノ酸配列を含むポリペプチドとをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。

本発明の核酸又はポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドの上記実施形態のいずれかにおいて、単離されたポリヌクレオチドは、個々の配列、ドメイン及びペプチドが、１つ若しくは複数のリンカー、スペーサー若しくは他の配列の付加なしで直接結合するか又は１つ若しくは複数のリンカー、スペーサー及び／若しくは他の配列の付加と共に結合する配列を含むことができる。

本発明はまた、本セクション及び本出願における他の場所に記載されるポリヌクレオチドのいずれかの相補配列をも提供する。本明細書において用いられる場合、「相補的」という用語は、ヌクレオチドの間、例えば、二本鎖ポリヌクレオチドの２本の鎖の間又はオリゴヌクレオチドプライマーと増幅若しくは配列決定すべき一本鎖ポリヌクレオチド上のプライマー結合部位との間のハイブリダイゼーション又は塩基対合を指す。２つの一本鎖ヌクレオチド分子は、適切なヌクレオチド挿入、欠失又は置換により最適にアラインメントされた一方の鎖のヌクレオチドが、他方の鎖のヌクレオチドの少なくとも約８０％と対合する場合、相補的であると言われる。

本発明の「ポリヌクレオチド」としては、本明細書に記載されるポリヌクレオチド又はそれらの相補物のいずれかとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得るそれらのポリヌクレオチドが挙げられる。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、一般に、定義されたイオン強度及びｐＨにおける特異的配列に対する熱融解点（Ｔ_Ｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％デキストラン硫酸及び２０μｇ／ｍｌの変性され、剪断されたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中における４２℃での終夜のインキュベーションの後、約６５℃の０．１×ＳＳＣ中においてフィルターを洗浄することである。

本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドのいずれかとそれらの全長に亘って少なくとも８０％の同一性、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９８％の同一性及び少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドにも関する。したがって、ある種の特定の実施形態において、本発明は、配列番号１〜１５から選択される１つ又は複数の配列と配列番号１６〜２３から選択される配列とを含む核酸分子をコードするポリヌクレオチドとその全長に亘って少なくとも８０％の同一性（即ち、少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。

一実施形態において、本発明は、配列番号２４〜３１から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとその全長に亘って少なくとも８０％（即ち、少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％の同一性）の同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。別の一実施形態において、本発明は、配列番号２４〜３１から選択されるアミノ酸配列と配列番号３２〜４０から選択される配列とを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとその全長に亘って少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。別の一実施形態において、本発明は、配列番号５０〜５４から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとその全長に亘って少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。別の一実施形態において、本発明は、配列番号２４〜３１から選択されるアミノ酸配列と配列番号４１〜４８から選択される配列とを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとその全長に亘って少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。別の一実施形態において、本発明は、配列番号２４〜３１から選択されるアミノ酸配列と配列番号３２〜４０から選択される配列と配列番号４１〜４８から選択される配列とを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとその全長に亘って少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。

本発明はまた、ポリヌクレオチド及びポリペプチド変異体にも関する。「ポリヌクレオチド変異体」は、本発明のポリヌクレオチドと異なるが、その不可欠な特性を保持するポリヌクレオチドを指す。同様に、「ポリペプチド変異体」は、本発明のポリペプチドと異なるが、その不可欠な特性を保持するポリペプチドを指す。ある種の実施形態において、本発明は、配列番号１〜２３から選択される配列のポリヌクレオチド変異体を提供する。ある種の実施形態において、本発明は、配列番号２４〜５４から選択される配列のポリペプチド変異体をコードするポリヌクレオチドを提供する。

変異体としては、限定されるものではないが、スプライス変異体及び対立遺伝子変異体、並びに付加、欠失、トランケーション及び置換変異体が挙げられる。「対立遺伝子変異体」は、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子の幾つかの代替形態の内の１つを指す天然に存在する変異体である。（ＧｅｎｅｓＩＩ、Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．編、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８５）。）これらの対立遺伝子の変異体は、ポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドレベルのいずれかで変化し得る。別の場合、天然に存在しない変異体は、突然変異誘発技術によって又は直接合成によって作製され得る。

変異体としては、「保存的アミノ酸置換」を有する配列を挙げることができ、その用語は、その位置におけるアミノ酸残基の極性又は電荷に対する効果がほとんどないような非ネイティブ残基を有するネイティブアミノ酸残基の置換を指す。例えば、保存的置換は、他のいずれかの無極性残基によるポリペプチド中における無極性残基の置換から生じる。保存的置換の別の例は、別の酸性残基による酸性残基の置換である。また、変異体としては、「オルソログ」を挙げることもでき、その用語は、異なる種から同定されるポリペプチドに対応するポリペプチドを指す。

特定の一実施形態において、輸送ポリペプチドは、ネイティブ輸送ポリペプチドの生物活性が実質的に減少しないように１つ又は複数の置換、欠失、トランケーション、付加及び／又は挿入を含む。換言すれば、輸送ポリペプチド変異体の生物活性は、ネイティブタンパク質に対して５０％未満、好ましくは２０％未満減少してよい。

好ましくは、輸送ポリペプチド変異体は、保存的置換を含む。「保存的置換」は、ペプチド化学の当業者によってポリペプチドの２次構造及び疎水性親水性が実質的に不変であると期待されるように同様の特性を有する別のアミノ酸をアミノ酸と置換したものである。アミノ酸置換は、一般に、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び／又は両親媒性における類似性に基づいて行われ得る。例えば、負に荷電したアミノ酸としては、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられ、正に荷電したアミノ酸としては、リシン及びアルギニンが挙げられ、同様の親水性値を有する非荷電性極性頭部基を有するアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシン及びバリン、グリシン及びアラニン、アスパラギン及びグルタミン、並びにセリン、スレオニン、フェニルアラニン及びチロシンが挙げられる。変異体は、又は別の場合、非保存的変化をも含む。特定の一実施形態において、変異体ポリペプチドは、アミノ酸の置換、欠失又は付加によってネイティブ配列と異なる。変異体は（又は別の場合）、例えば、ポリペプチドの生物活性、２次構造及び疎水性親水性に対してほとんど影響を及ぼさないアミノ酸の欠失又は付加によって修飾することもできる。

本発明は、生物学的試料から輸送ポリペプチド活性を有するポリペプチドをコードする核酸を単離するか又は回収するための方法であって、（ａ）対象となるポリペプチドをコードする核酸を増幅するための増幅プライマー配列対を提供するステップであって、前記プライマー対が本発明の核酸を増幅し得る、ステップ、（ｂ）前記試料中における核酸が前記増幅プライマー対とのハイブリダイゼーションのために利用可能であるように生物学的試料から核酸を単離するか又は生物学的試料を処置するステップ、及び（ｃ）ステップ（ｂ）の核酸とステップ（ａ）の前記増幅プライマー対とを組み合わせて、生物学的試料から核酸を増幅することによって、生物学的試料から輸送ポリペプチド活性を有するポリペプチドをコードする核酸を単離するか又は回収するステップを含む上記方法を提供する。増幅プライマー配列対の１つ又は各メンバーは、本発明の配列の少なくとも約１０〜５０の連続した塩基を含むオリゴヌクレオチドを含むことができる。一態様において、生物学的試料は、細菌細胞、原生動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、植物細胞、真菌細胞又は哺乳動物細胞に由来し得る。

本発明は、輸送ポリペプチド活性を有する輸送ポリペプチドをコードする核酸の変異体を作製する方法であって、（ａ）本発明の核酸を含む鋳型核酸を提供するステップ、及び（ｂ）鋳型配列中における１つ若しくは複数のヌクレオチド又はそれらの組合せを修飾するか、欠失させるか又は付加して、鋳型核酸の変異体を作製するステップを含む上記方法を提供する。一態様において、方法は、変異体輸送ポリペプチドポリペプチドを作製するために変異体核酸を発現することを更に含むことができる。修飾、付加又は欠失は、エラープローンＰＣＲ、シャフリング、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、アセンブリＰＣＲ、性的ＰＣＲ突然変異誘発、インビボ突然変異誘発、カセット突然変異誘発、再帰的アンサンブル突然変異誘発、指数的アンサンブル突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、遺伝子再構築、遺伝子部位飽和突然変異誘発（ＧＳＳＭ）、合成ライゲーション再構築（ＳＬＲ）又はそれらの組合せを含む方法によって導入され得る。別の一態様において、修飾、付加又は欠失は、組み換え、再帰的配列組み換え、ホスホチオエート修飾ＤＮＡ突然変異誘発、ウラシル含有鋳型突然変異誘発、ギャップドデュプレックス突然変異誘発、点ミスマッチ修復突然変異誘発、修復欠損宿主株突然変異誘発、化学的突然変異誘発、放射線突然変異誘発、欠失突然変異誘発、制限−選択突然変異誘発、制限−精製突然変異誘発、人工遺伝子合成、アンサンブル突然変異誘発、キメラ核酸マルチマークリエーション及びそれらの組合せを含む方法によって導入される。

一態様において、方法は、鋳型核酸によってコードされるポリペプチドのものから改変されたか若しくは異なる活性又は改変されたか若しくは異なる安定性を有する輸送ポリペプチドが産生されるまで反復的に繰り返すことができる。一態様において、方法は、鋳型核酸のものから改変されたコドン利用を有する輸送タンパク質コード配列が産生されるまで反復的に繰り返すことができる。別の一態様において、方法は、鋳型核酸のものからより高い又はより低いレベルのメッセージ発現又は安定性を有する輸送タンパク質が産生されるまで反復的に繰り返すことができる。

本発明は、宿主細胞中におけるその発現を増大させる輸送タンパク質活性を有するポリペプチドをコードする核酸中におけるコドンを修飾するための方法であって、以下の、（ａ）輸送タンパク質活性を有するポリペプチドをコードする本発明の核酸を提供するステップ、及び（ｂ）ステップ（ａ）の核酸中における好ましくないか又はあまり好ましくないコドンを同定し、置換されたコドンと同じアミノ酸をコードする好ましいか又は中立的に使用されるコドンとそれを置換するステップであって、好ましいコドンが、宿主細胞中における遺伝子中におけるコード配列中において過剰に現れるコドンであり、好ましくないか又はあまり好ましくないコドンが、宿主細胞中における遺伝子中におけるコード配列中において過少に現れるコドンであり、それによって核酸を修飾して宿主細胞中におけるその発現を増大させるステップを含む上記方法を提供する。

本発明は、輸送タンパク質活性を有するポリペプチドをコードする核酸中におけるコドンを修飾するための方法であって、以下の、（ａ）本発明の核酸を提供するステップ、及び（ｂ）ステップ（ａ）の核酸のコドンを同定し、置換されたコドンと同じアミノ酸をコードする異なるコドンとそれを置換し、それによって輸送タンパク質をコードする核酸中におけるコドンを修飾するステップを含む上記方法を提供する。

本発明は、宿主細胞中におけるその発現を増大させる輸送タンパク質活性を有するポリペプチドをコードする核酸中におけるコドンを修飾するための方法であって、以下の、（ａ）輸送タンパク質ポリペプチドをコードする本発明の核酸を提供するステップ、及び（ｂ）ステップ（ａ）の核酸中における好ましくないか又はあまり好ましくないコドンを同定し、置換されたコドンと同じアミノ酸をコードする好ましいか又は中立的に使用されるコドンとそれを置換するステップであって、好ましいコドンが、宿主細胞中における遺伝子中におけるコード配列中において過剰に現れるコドンであり、好ましくないか又はあまり好ましくないコドンが、宿主細胞中における遺伝子中におけるコード配列中において過少に現れるコドンであり、それによって核酸を修飾して宿主細胞中におけるその発現を増大させるステップを含む上記方法を提供する。

本発明は、宿主細胞中におけるその発現を低下させる輸送タンパク質活性を有するポリペプチドをコードする核酸中におけるコドンを修飾するための方法であって、以下の、（ａ）本発明の核酸を提供するステップ、及び（ｂ）ステップ（ａ）の核酸中における少なくとも１つの好ましいコドンを同定し、置換されたコドンと同じアミノ酸をコードする好ましくないか又はあまり好ましくないコドンとそれを置換するステップであって、好ましいコドンが、宿主細胞中における遺伝子中におけるコード配列中において過剰に現れるコドンであり、好ましくないか又はあまり好ましくないコドンが、宿主細胞中における遺伝子中におけるコード配列中において過少に現れるコドンであり、それによって核酸を修飾して宿主細胞中におけるその発現を低下させるステップを含む上記方法を提供する。一態様において、宿主細胞は、細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞、植物細胞又は哺乳動物細胞であり得る。

本発明は、複数の修飾輸送タンパク質活性部位又は基質結合部位をコードする核酸のライブラリーを作製するための方法であって、前記修飾活性部位又は基質結合部位が、第１活性部位又は第１基質結合部位をコードする配列を含む第１核酸から誘導され、以下の、（ａ）第１核酸配列が、本発明の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含み、核酸が、輸送タンパク質活性部位又は輸送タンパク質基質結合部位をコードする、第１活性部位又は第１基質結合部位をコードする第１核酸を提供するステップ、（ｂ）第１核酸中における複数の標的コドンにおける天然に存在するアミノ酸変異体をコードする突然変異誘発性オリゴヌクレオチドのセットを提供するステップ、及び（ｃ）突然変異誘発性オリゴヌクレオチドのセットを用いて、突然変異を起こした各アミノ酸コドンにおけるアミノ酸変異の範囲をコードする活性部位コード又は基質結合部位コード変異体核酸のセットを作製することによって、複数の修飾輸送タンパク質活性部位又は基質結合部位をコードする核酸のライブラリーを作製するステップを含む上記方法を提供する。一態様において、方法は、最適化特異的発生系、遺伝子部位飽和突然変異誘発（ＧＳＳＭ）、合成ライゲーション再構築（ＳＬＲ）、エラープローンＰＣＲ、シャフリング、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、アセンブリＰＣＲ、性的なＰＣＲ突然変異誘発、インビボ突然変異誘発、カセット突然変異誘発、再帰的アンサンブル突然変異誘発、指数的アンサンブル突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、遺伝子再構築、遺伝子部位飽和突然変異誘発（ＧＳＳＭ）、合成ライゲーション再構築（ＳＬＲ）及びそれらの組合せを含む方法によってステップ（ａ）の第１核酸に突然変異を起こさせることを含む。別の一態様において、方法は、組み換え、再帰的配列組み換え、ホスホチオエート修飾ＤＮＡ突然変異誘発、ウラシル含有鋳型突然変異誘発、ギャップドデュプレックス突然変異誘発、点ミスマッチ修復突然変異誘発、修復欠損宿主株突然変異誘発、化学的突然変異誘発、放射線突然変異誘発、欠失突然変異誘発、制限−選択突然変異誘発、制限−精製突然変異誘発、人工遺伝子合成、アンサンブル突然変異誘発、キメラ核酸マルチマークリエーション及びそれらの組合せを含む方法によってステップ（ａ）の第１核酸又は変異体に突然変異を起こさせることを含む。

したがって、本発明は、記載された置換、欠失、トランケーション及び挿入変異体、並びに対立遺伝子変異体、スプライス変異体、断片、誘導体及びオルソログを含む本発明の核酸又はポリペプチドをコードするそれらのポリヌクレオチドを含む。したがって、本発明のポリヌクレオチド配列は、両方の天然に存在する配列並びに変異体型を含む。同様に、本発明のポリペプチドは、両方の天然に存在するタンパク質、並びに変異及びそれらの修飾型を包含する。かかる変異体は、所望の活性を有し続ける。本明細書に包含されるポリペプチド配列の欠失、挿入及び置換が、ポリペプチドの特性の根本的な変化を生じさせるとは考えられない。しかし、それを行う前の置換、欠失又は挿入の正確な効果を予測することが困難である場合、当業者は、通常のスクリーニングアッセイによって効果が評価されることを理解する。

発現ベクターの投与

本発明の発現ベクターは、例えば欠損標的遺伝子発現及び／又は活性に伴う障害の治療、予防及び／又は寛解において標的遺伝子発現を調節するように細胞及び／又は哺乳動物対象に投与される。

本発明の発現ベクター及びそれらの製剤は、局所又は全身投与によって送達され得、経口、局所、直腸を含む様々な経路によって、又は非経口、鼻腔内、皮内、動脈内、静脈内及び筋肉内の経路を介して、並びに患部組織への直接注入によって投与され得る。非経口という用語は、経皮、皮下、血管内、筋肉内並びに脊髄内注射又は注入技術等を含むものとする。発現ベクターは、脳に直接注射され得る。別の場合、前記ベクターは、脳及び脊髄の状態のために髄腔内で導入され得る。他の一例において、ベクターは、筋肉内で導入され得る。本発明のベクターの直接注入は、皮下、筋肉内又は皮内であるにせよ、標準的針及び注射器の方法を用いて、又は公知の無針技術によって行うことができる。ＣＮＳ送達に対する伝統的なアプローチは、公知であり、例えば、髄腔内及び脳室内投与、カテーテル及びポンプの埋込み、傷害若しくは病変の部位における直接注入若しくは灌流、脳動脈系への注入、又は血液脳関門の化学的若しくは浸透性開放によるものが含まれる。本発明のベクター及びそれらの製剤は、肺内送達を介して、例えば、関連の肺組織中へのベクターの迅速な局所的取込みを提供する吸入装置又はネブライザによって投与されるエアゾル剤又は噴霧乾燥製剤の吸入によって投与され得る。本発明の組成物は、本技術分野において公知の通りの局所、皮膚又は経皮投与のための乳剤、ゲル剤、噴霧剤、油剤及び他の適切な組成物として製剤化し、使用することもできる。

投与頻度は、使用される製剤中における発現ベクターの薬物動態パラメータに依存する。典型的には、臨床医は、所望の効果を達成する用量に達するまでその組成物を投与する。したがって、その組成物は、時間に亘って（同一量の所望のベクターを含有してもしなくてもよい）単回投与として若しくは２回以上の投与として、又は埋込み装置若しくはカテーテルを介した連続注入として投与され得る。適切な用量の更なる改善は、当業者によって通常行われ、当業者によって通常実施される課題の範囲内である。したがって、本発明による発現ベクターの投与は、１回の投与で行われるか、又は、例えば、レシピエントの生理学的状態、投与の目的が治療的であるのか予防的であるのか、及び当業者に公知の他の要素に応じて、治療経過に亘って連続的若しくは間欠的に投与され得る。本発明の発現ベクターの投与は、予め選択された期間に亘って本質的に連続的であり得るか、又は一連の間隔を置いた投与においてあり得る。

加えるべきベクターの有効量は、実験的に決定され得る。投与の最も有効な手段及び用量を決定する方法は、当業者に周知であり、ベクター、標的細胞及び治療される対象によって変化する。例えば、投与すべき量は、限定されるものではないが、哺乳動物のＲＮＡ−タンパク質複合体、障害、体重、身体状態及び年齢、並びに達成すべきなのは予防なのか治療なのかが含まれる幾つかの因子に依存する。かかる因子は、動物モデル又は本技術分野において周知の他の試験系を用いて臨床医によって容易に決定され得る。例えば、適切な用量は、適切な用量反応データを用いることにより確認され得る。したがって、単回及び多回投与は、治療医によって選択される投与レベル及びパターンによって実施され得る。医薬的に有効な用量は、疾患状態の出現を予防し、阻害する又は疾患状態を治療する（症状を軽減する）ために必要なその用量である。一般に、上述のように、医薬的に有効な用量は、疾患の型、使用される組成物、投与経路、治療される哺乳動物の型、検討中の特定の哺乳動物の身体特性、併用薬、及び医学の当業者が認識する他の要素に依存する。一般に、０．１ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の間の量の活性成分が投与される。

エクスビボで本発明によるベクターの医薬組成物を使用することも望ましくあり得る。かかる例において、対象から摘出された細胞、組織又は器官をベクター医薬組成物に曝露し、その後、続いて、細胞、組織及び／又は器官を対象中に移植して戻す。

医薬組成物

本発明は、安定剤、緩衝剤、可溶化剤、乳化剤、保存剤及び／又は補助剤等、許容し得る担体中における本発明の１つ又は複数の発現ベクターを含む医薬組成物を提供する。好ましくは、許容し得る製剤材料は、用いられる用量及び濃度においてレシピエントに対して無毒性である。本発明のベクターは、医薬組成物を形成するための安定剤、緩衝剤等を有する又は有さない任意の標準的手段によって対象に投与され得る。薬理学的組成物又は製剤は、投与のために適切な形態、例えば全身又は局所投与で、例えばヒトが含まれる細胞又は対象中への本発明のベクターの有効な分布を可能にする組成物又は製剤を指す。適切な形態は、部分的に、例えば経口、経皮又は注射による投入の使用又は経路に依存する。かかる形態は、所望の活性のために最も適切な身体位置において投与されるべきであり、組成物又は製剤が標的細胞に到達することを妨げるべきでない。一実施形態において、医薬組成物は、治療上有効量、即ち、当該の疾患状態の症状を減少若しくは寛解させるために十分な量、又は所望の有益性を付与するために十分な量のＲＮＡ−タンパク質複合体を産生するために十分なベクターを含む。医薬組成物は、医薬的に許容し得る賦形剤、例えば、ソルビトール、Ｔｗｅｅｎ８０及び液体、例えば、水、生理食塩水、グリセロール及びエタノールを含有することもできる。その中に、医薬的に許容し得る塩、例えば、鉱酸塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩等、及び有機酸の塩、例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩等が含まれ得る。更に、かかるビヒクル中に、補助的物質、例えば、湿潤又は乳化剤、ｐＨ緩衝物質等が存在してよい。

ある種の実施形態において、医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ、容量オスモル濃度、粘度、清澄度、色、等浸透圧、匂い、無菌性、安定性、溶解若しくは放出の速度、吸着又は浸透を修飾、維持又は保存するための製剤材料を含んでよい。かかる実施形態において、適切な製剤材料としては、限定されるものではないが、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン）、抗菌剤、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム又は亜硫酸水素ナトリウム）、緩衝剤（例えば、ボレート、バイカルボネート、トリス−ｈｃｌ、シトレート、ホスフェート又は他の有機酸）、増量剤（例えば、マンニトール又はグリシン）、キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ｅｄｔａ））、錯化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリン又はヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン）、充填剤、単糖、二糖及び他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノース又はデキストリン）、タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン）、着色、着香及び希釈剤、乳化剤、親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）、保存剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸又は過酸化水素）、溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコール又はポリエチレングリコール）、糖アルコール（例えば、マンニトール又はソルビトール）、懸濁化剤、界面活性剤又は湿潤剤（例えば、プルロニック、ｐｅｇ、ソルビタンエステル、ポリソルベート、例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ｔｒｉｔｏｎ、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサポール）、安定性増強剤（例えば、スクロース又はソルビトール）、張性増強剤（例えば、ハロゲン化アルカリ金属、好ましくは、塩化ナトリウム又は塩化カリウム、マンニトールソルビトール）、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤及び／又は医薬補助剤が挙げられる。ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’ＳＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳＣＩＥＮＣＥＳ、第１８版、（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編）、１９９０、ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙを参照すること。

本発明の発現ベクター及びそれらの製剤は、従来の無毒性の医薬的に許容し得る担体、補助剤及び／又はビヒクルを含有する用量単位製剤中において、経口、局所、非経口、吸入若しくは噴霧により又は直腸投与され得る。経口的使用が意図される組成物は、医薬組成物の製造のための本技術分野に公知の任意の方法に従って調製することができ、かかる組成物は、美味な調製物を提供するために１種又は複数種のかかる甘味剤、着香剤、着色剤又は保存剤を含有することができる。

水性懸濁剤は、水性懸濁剤の製造のために適切な賦形剤との混合物中において活性材料を含有する。かかる賦形剤としては、例えば、懸濁化剤、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロプロピル−メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム及びアラビアゴムが挙げられ、分散又は湿潤剤は、天然に存在するリン脂質、例えば、レシチン、又はアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンステアレート、又はエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、又はエチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトールから誘導される部分エステルとの縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート、又はエチレンオキシドと脂肪酸及び無水ヘキシトールから誘導される部分エステルとの縮合生成物、例えば、ポリエチレンソルビタンモノオレエートであり得る。水性懸濁剤はまた、１種又は複数種の保存剤、例えば、エチル又はｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエート、１種又は複数種の着色剤、１種又は複数種の着香剤及び１種又は複数種の甘味剤、例えば、スクロース又はサッカリンを含有することもできる。

シロップ剤及びエリキシル剤を、甘味剤、例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、グルコース又はスクロースと共に製剤化することができる。かかる製剤はまた、粘滑剤、保存剤、並びに着香及び着色剤を含有することもできる。医薬組成物は、無菌注射用水性又は油性懸濁剤の形態であってよい。この懸濁剤は、上述したそれらの適切な分散又は湿潤剤及び懸濁化剤を用いる公知の技術に従って製剤化され得る。無菌注射用製剤は、無毒性の非経口的に許容し得る希釈剤又は溶媒中における無菌注射用溶液又は懸濁液であってもよく、例えば、１，３−ブタンジオール中における溶液としてあってもよい。用いることができる許容し得るビヒクル及び溶媒の中では、水、リンガー溶液及び等張食塩液がある。更に、溶媒又は懸濁媒として無菌固定油が従来用いられる。この目的のために、合成モノ−又はジグリセリドが含まれる任意の滅菌固定油を用いることができる。更に、オレイン酸等の脂肪酸が、注射剤の調製において使用される。

遺伝子発現の調節方法

本発明の発現ベクター及び本発明のバイオリアクターをインビトロ、エクスビボ及びインビボで使用して、対象となる標的遺伝子の発現を調節することができる。本発明は、細胞外マトリックス並びに／又は隣接する細胞及び組織に生物活性ＲＮＡ分子（単数又は複数）を送達し得る、対象となる１つ又は複数の遺伝子をターゲッティングする少なくとも１つの生物活性ＲＮＡ分子及び融合タンパク質を含むＲＮＡ−タンパク質複合体を産生するように設計された発現ベクターを提供する。インビボ、エクスビボ及びインビトロでの細胞への発現ベクターの投与は、ＲＮＡ−タンパク質複合体として分泌される生物活性ＲＮＡ分子を産生し、細胞外マトリックス及び／又は他の隣接する細胞に送達する「バイオリアクター」に細胞を転化させる。

本発明は、本発明の１つ又は複数の発現ベクター又はその組成物（単数又は複数）を対象に投与することを含む、対象における１つ又は複数の標的遺伝子（単数又は複数）の発現を調節するための方法を提供する。一実施形態において、対象における１つ又は複数の標的遺伝子（単数又は複数）の発現を調節するための方法は、生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列、場合によって末端ミニヘリックス配列を含む核酸をコードするポリヌクレオチド、並びにＲＮＡ結合ドメイン及び１つ又は複数の輸送ペプチド（即ち、細胞貫通ペプチド配列、非古典的分泌ドメイン、エンドソーム放出ドメイン、受容体結合ドメイン及び融合ペプチドから選択される配列）を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを対象に投与することを含む。一実施形態において、発現ベクターは、更なる核酸の標的遺伝子（単数又は複数）が第１核酸の標的遺伝子と異なる、標的遺伝子（単数又は複数）に向けられた１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、場合によって認識ＲＮＡ結合ドメイン及び場合によって末端ミニヘリックス配列を含む更なる核酸を含む。一実施形態において、標的遺伝子は、ダイサー及び／又はドローシャから選択される。

一実施形態において、対象における１つ又は複数の標的遺伝子（単数又は複数）の発現を調節するための方法は、１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列を含む核酸をコードするポリヌクレオチド配列、ＲＮＡ結合ドメイン及び１つ又は複数の輸送ペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びにウイルス複製のために必要な１つ又は複数のウイルスポリメラーゼ及び１つ又は複数のウイルスアクセサリータンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターと、１つ又は複数のウイルスコートタンパク質及び１つ又は複数のウイルス融合タンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターとを対象に投与することを含む。一実施形態において、発現ベクターは、更なる核酸の標的遺伝子（単数又は複数）が第１核酸の標的遺伝子と異なる、標的遺伝子（単数又は複数）に向けられた１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、場合によって認識ＲＮＡ結合ドメイン及び場合によって末端ミニヘリックス配列を含む更なる核酸を含む。一実施形態において、標的遺伝子は、ダイサー及び／又はドローシャから選択される。

一実施形態において、対象における１つ又は複数の標的遺伝子（単数又は複数）の発現を調節するための方法は、１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列を含む核酸をコードするポリヌクレオチド配列、並びにウイルス複製のために必要な１つ又は複数のウイルスポリメラーゼ及び１つ又は複数のウイルスアクセサリータンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターと、１つ又は複数のウイルスコートタンパク質及び１つ又は複数のウイルス融合タンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターとを対象に投与することを含む。

別の一実施形態において、対象における１つ又は複数の標的遺伝子（単数又は複数）の発現を調節するための方法は、標的遺伝子に向けられた１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列を含む核酸をコードする第１発現ベクターと、ＲＮＡ結合ドメイン及び１つ又は複数の輸送ペプチド配列（即ち、細胞貫通ペプチド配列、非古典的分泌ドメイン、エンドソーム放出ドメイン、受容体結合ドメイン及び融合ペプチドから選択される）を含むポリペプチドをコードする第２発現ベクターとを、又は両発現ベクターを含む組成物（単数又は複数）を対象に投与することを含む。方法は、標的遺伝子（単数又は複数）がダイサー及び／又はドローシャから選択される、標的遺伝子（単数又は複数）に向けられた１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、場合によって認識ＲＮＡ結合ドメイン及び場合によって末端ミニヘリックス配列を含む核酸をコードする更なる発現ベクターを対象に投与することを更に含むことができる。

本発明はまた、バイオリアクター細胞（単数又は複数）が、標的遺伝子に向けられた１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列、ＲＮＡ結合ドメイン配列、１つ又は複数の輸送ペプチド（即ち、細胞貫通ペプチド配列、非古典的分泌ドメイン、エンドソーム放出ドメイン、受容体結合ドメイン及び融合ペプチドから選択される配列）を含むＲＮＡ−タンパク質複合体を産生し、分泌する、本発明の１つ又は複数のバイオリアクター細胞又はその組成物を対象に投与することを含む、対象における１つ又は複数の標的遺伝子（単数又は複数）の発現を調節するための方法をも提供する。

対象は、例えば、ヒト、齧歯動物、ネズミ、ウシ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウマ及びサル対象が含まれる哺乳動物対象であってよい。生物活性ＲＮＡ配列は、リボザイム、アンチセンス核酸、アロザイム、アプタマー、短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及び１つ又は複数の生物活性ペプチドをコードする転写産物であってよく、認識ＲＮＡ配列は、Ｕ１ループ、グループＩＩイントロン、ＮＲＥステムループ、Ｓ１Ａステムループ、バクテリオファージＢｏｘＢＲ、ＨＩＶＲｅｖ応答エレメント、ＡＭＶＣＰ認識配列及びＡＲＥ配列であってよく、ＲＮＡ結合ドメインは、Ｕ１Ａ、ＣＲＳ１、ＣＲＭ１、ヌクレオリンＲＢＤ１２、ｈＲＢＭＹ、バクテリオファージタンパク質Ｎ、ＨＩＶＲｅｖ、ＡＭＶＣＰ及びトリステトラプロリン配列であってよく、細胞貫通ペプチドは、ペネトラチン、トランスポルタン、ＭＡＰ、ＨＩＶＴＡＴ、Ａｎｔｐ、Ｒｅｖ、ＦＨＶコートタンパク質、ＴＰ１０及びｐＶＥＣ配列であってよく、非古典的分泌ドメインは、Ｇａｌｃｅｔｉｎ−１ペプチド、ガレクチン−３ペプチド、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＨＡＳＰＢ、ＨＭＧＢ１、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＩＬ−２シグナル、分泌トランスグルタミナーゼ、アネキシン−１、ＨＩＶＴＡＴ、ヘルペスＶＰ２２、チオレドキシン、ロダネーゼ及びプラスミノーゲンアクチベーターシグナルヌクレオチド配列であってよい。バイオリアクター細胞は、本明細書に記載されるバイオリアクター細胞のいずれかであってよい。

方法を用いて、対象における欠損遺伝子発現及び／又は活性に伴う疾患又は状態を予防し、寛解させ及び／又は治療することができる。適切な遺伝子ターゲッティングしては、例えば、Ｍｍｐ２、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、Ｃａｖ−１、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、Ｈ−Ｒａｓ、Ｂｃｌ−２、スルビビン、ＦＡＫ、ＳＴＡＴ−３、ＨＥＲ−３、ベータ−カテニン及びＳｒｃが挙げられる。これらの遺伝子の欠損発現に伴う障害は、表Ｖにおいて列挙される。

本発明はまた、エクスビボで標的細胞中における標的遺伝子の発現を調節するための方法をも提供する。一実施形態において、本発明は、本発明の１つ又は複数の発現ベクター又はその組成物（単数又は複数）をエクスビボで標的細胞に投与することを含む、エクスビボで標的細胞中における標的遺伝子の発現を調節するための方法を提供する。特定の一実施形態において、方法は、（ａ）対象から標的細胞を得るステップ、（ｂ）発現ベクター（単数又は複数）が本発明のＲＮＡ−タンパク質複合体をコードする、ステップ（ａ）の標的細胞に本発明の１つ又は複数の発現ベクター（単数又は複数）と医薬的に許容し得る担体とを含む組成物を投与するステップ、及び（ｃ）前記対象にステップ（ｂ）における細胞を投与するステップを含む。別の一実施形態において、本発明は、本発明の１つ又は複数のバイオリアクター細胞又はその組成物をエクスビボで標的細胞に投与することを含む、エクスビボで標的細胞中における標的遺伝子の発現を調節するための方法であって、上記方法が、（ａ）対象から標的細胞を得るステップ、（ｂ）バイオリアクター細胞（単数又は複数）が本発明のＲＮＡ−タンパク質複合体を産生し、分泌する、ステップ（ａ）の標的細胞に本発明の１つ又は複数のバイオリアクター細胞（単数又は複数）を投与するステップ、及び（ｃ）前記対象にステップ（ｂ）における細胞を投与するステップを含む、上記方法を提供する。

本発明はまた、培養細胞中における遺伝子発現を調節するための方法であって、本発明の１つ又は複数の発現ベクター又はその組成物（単数又は複数）を前記細胞に投与することを含む上記方法をも提供する。更に、本発明は、培養細胞中における１つ又は複数の標的遺伝子（単数又は複数）の発現を調節するための方法であって、前記細胞に本発明の１つ又は複数のバイオリアクター細胞又はその組成物を投与することを含む上記方法を提供する。

ウイルスに基づいた送達系のための作用機序

ウイルスに基づいたＲＮＡ送達系は、操作、複製可能又は複製欠損ウイルスを利用して、形質転換されたパッケージング細胞から標的細胞に生物活性ＲＮＡを送達する。この系は、インビトロで（ＬｕｎｄＰＥら、ＰｈａｒｍＲｅｓ．２００９年１２月９日；ＫｏｅｒｂｅｒＪＴら、ＭｏｌＴｈｅｒ．２００８年１０月；１６（１０）：１７０３〜９；ＣａｓｃａｎｔｅＡ、ＧｅｎｅＴｈｅｒ．２００７年１０月；１４（２０）：１４７１〜８０；ＲｉｎｇＣＪ．ＪＧｅｎＶｉｒｏｌ．２００２年３月；８３（Ｐｔ３）：４９１〜５０２；ＰａｒａｄａＣら、ＣａｎｃｅｒＧｅｎｅＴｈｅｒ．２００３年２月；１０（２）：１５２〜６０；ＴｉｅｄｅＡら、ＧｅｎｅＴｈｅｒ．２００３年１０月；１０（２２）：１９１７〜２５；ＬｅｅＹＪ、ＣａｎｃｅｒＧｅｎｅＴｈｅｒ．２００１年６月；８（６）：３９７〜４０４；ＮｅｓｔｌｅｒＵら、ＧｅｎｅＴｈｅｒ．１９９７年１１月；４（１１）：１２７０〜７）及びインビボで（ＴｓｅｎｇＪＣら、ＧｅｎｅＴｈｅｒ．２００９年２月；１６（２）：２９１〜６；ＫｉｋｕｃｈｉＥら、ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ．２００７年８月１日；１３（１５Ｐｔ１）：４５１１〜８；ＢｏｕｒｂｅａｕＤら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．２００７年４月１日；６７（７）：３３８７〜９５；ＨｉｒａｏｋａＫら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．２００７年６月１日；６７（１１）：５３４５〜５３；ＨｉｒａｏｋａＫら、ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ．２００６年１２月１日；１２（２３）：７１０８〜１６；ＶａｒｇｈｅｓｅＳら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．２００７年１０月１日；６７（１９）：９３７１〜９；ＶａｒｇｈｅｓｅＳら、ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ．２００６年５月１日；１２（９）：２９１９〜２７；ＱｉａｏＪら、ＧｅｎｅＴｈｅｒ．２００６年１０月；１３（２０）：１４５７〜７０；ＨｅｉｎｋｅｌｅｉｎＭら、ＣａｎｃｅｒＧｅｎｅＴｈｅｒ．２００５年１２月；１２（１２）：９４７〜５３）ウイルス粒子が標的細胞の内部に核酸を効果的に送達するために有する能力を利用する。多くの研究は、ｓｉＲＮＡのウイルスの送達系がインビトロ及びインビボで有効なＲＮＡｉ応答をもたらすことを実証している（ＡｎｅｓｔｉＡＭら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２００８年８月；３６（１４）：ｅ８６；ＧｏｒｂａｔｙｕｋＭら、ＶｉｓｉｏｎＲｅｓ．２００７年４月；４７（９）：１２０２〜８；ＳｃｈｅｒｒＭら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２００７；３５（２２）：ｅ１４９；ＣｈｅｎＷら、ＪＶｉｒｏｌ．２００６年４月；８０（７）：３５５９〜６６；ＲａｏｕｌＣら、ＮａｔＭｅｄ．２００５年４月；１１（４）：４２３〜８；Ｂｒｏｍｂｅｒｇ−ＷｈｉｔｅＪＬら、ＪＶｉｒｏｌ．２００４年５月；７８（９）：４９１４〜６；ＳｃｈｅｒｒＭら、ＣｅｌｌＣｙｃｌｅ．２００３年５月〜６月；２（３）：２５１〜７）。本発明は、哺乳動物細胞中へのトランスフェクションの際にウイルス粒子（又は偽ウイルス粒子）を産生する構築プラスミドベクター（ｐＶｉｒ）を提供する。これらのウイルスは、ウイルス又は宿主発現機構によってそれらの阻害性配列の発現を可能にする部分的ウイルスゲノムの一部として対象となる生物活性ＲＮＡ標的遺伝子を担持する。ウイルスパッケージング細胞を標的細胞又は組織に付加する場合、次いで、送達されたＲＮＡは、各感染標的細胞の中の遺伝子発現を調節することができる。複製可能ウイルスについては、ウイルス複製がプロドラッグの付加によって阻害され得るように自殺遺伝子をウイルス配列に付加する。これによって、プロドラッグの使用が無制御なウイルス複製を阻止することが可能になる。複製欠損ウイルスについては、周辺組織への分布のためのパッケージング細胞中だけにウイルス粒子を産生し、パッケージされたウイルスゲノムは、生物活性ＲＮＡを含むが、ウイルス粒子形成のために必要な構造遺伝子を欠く。この配置は、ウイルスの無制御な複製を阻止する。この系は、高効率ウイルス感染効率及び複製機構を利用して、阻害性シグナルを送達し、増幅する。したがって、このアプローチは、我々のプラスミドに基づいたバイオリアクター送達系に対する直接の賛辞である。

ウイルスパッケージング細胞が送達系として機能するためには、ウイルス粒子は、生物学的シグナル（例えば、阻害性シグナル）をパッケージ且つ分布させなければならない。この生物学的シグナルは、生物学的ＲＮＡ自体又は生物学的ＲＮＡをコードするＤＮＡ分子の形態をとることができる。したがって、ウイルスに基づいた送達系の構築のためのバックボーンベクターは、ＤＮＡ及びＲＮＡウイルスの両方を含み、前者は、発現のための適切なプロモーター及びターミネーターを含み、後者は、効率的なダイサー基質を提供する。ＲＮＡウイルスは、標的細胞の細胞質に（生物学的ＲＮＡを含む）部分的ウイルスゲノムを送達することだけが必要であるが、ＤＮＡウイルスは、ＤＮＡ鋳型からの生物学的ＲＮＡの転写のための核へのＤＮＡゲノムの送達を必要とする。細胞質の送達は、ＲＮＡウイルスによってより効率的であり得るのに対して、核送達は、複数の生物活性ＲＮＡが単一の鋳型分子から産生され得るので、更なる増幅のための機会を提供する。

ウイルスパッケージング細胞は、２つの非依存性ウイルスＲＮＡをコードするプラスミド（一方がウイルス構造遺伝子をコードし、他方が非構造遺伝子及び生物活性ＲＮＡ分子をコードする）によるレシピエント細胞のトランスフェクションによって作製される。両プラスミドの成功した同時トランスフェクションは、複製欠損ウイルス粒子を産生し得るパッケージング細胞を生じる。ＤＮＡ又はＲＮＡウイルスゲノムのパッケージングは、パッケージング細胞からの分泌及び標的細胞への移入等の天然のウイルスプロセスによって駆動される。一旦標的細胞の内部にあると、細胞機序は、特定の生物学的分子の同一性に応じて特異的な生物学的プロセスを引き継ぐ。この送達系は、標的細胞の遺伝子発現を調節するために作用する本明細書に記載の生物活性ＲＮＡのいずれかを収容することができる。

ウイルスに基づいた送達は、ｐＶｉｒプラスミドによる初期トランスフェクションが生物活性ＲＮＡのための発現カセットと融合タンパク質のための発現カセットとの両方を担持するウイルスの産生をもたらすようにＤＮＡウイルスにおけるタンパク質に基づいた送達と組み合わせることができる。この態様において、ウイルスパッケージング細胞から放出されたウイルスは、一次標的細胞に感染し、それらをタンパク質系バイオリアクター細胞に形質転換する。次いで、これらのバイオリアクター細胞は、二次標的細胞への分泌及び分布のための融合タンパク質及び生物活性ＲＮＡの両方を産生する。生物活性ＲＮＡ及び融合タンパク質のための発現カセットは、本明細書に記載される発現カセットのいずれかであってよい。

ウイルスバックボーン

ＤＮＡ及びＲＮＡウイルスの両方は、阻害性シグナルのための可能な担体として利用される。多くの一般的に用いられるウイルスベクターは、この種の適用のために適切であり、上記の通りのインビトロ及びインビボの適用において特徴づけられている。特定のウイルス系の適用は、所望の標的細胞に依存し、過剰発現したラミニン受容体との特異的相互作用によるシンドビスウイルス粒子の腫瘍特異的送達（ＴｓｅｎｇＪＣら、ＧｅｎｅＴｈｅｒ．２００９年２月；１６（２）：２９１〜６；ＴｓｅｎｇＪＣら、ＪＮａｔｌＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．２００２；９４：１７９０〜１８０２）から、フォーミーウイルス粒子と同様の組織の広域スペクトルへの非特異的送達（ＨｅｉｎｋｅｌｅｉｎＭら、ＣａｎｃｅｒＧｅｎｅＴｈｅｒ．２００５年１２月；１２（１２）：９４７〜５３；ＦａｌｃｏｎｅＶら、ＣｕｒｒＴｏｐＭｉｃｒｏｂｉｏｌＩｍｍｕｎｏｌ．２００３；２７７：１６１〜１８０）に変化し得る。生物学的ＲＮＡは、複製欠損ウイルス粒子中に最終的にパッケージするための非構造的ウイルス遺伝子のための発現カセット中に組み込まれる。

遺伝子ノックダウンが必要であるが、標的細胞の溶解が望ましくない場合、複製欠損ウイルスの使用は適切である。これらのウイルスは、生物学的ＲＮＡ鋳型又は分子が含まれる細胞の内部にそれらの核酸カーゴを効率的に送達する。しかし、送達された核酸が、新規なウイルス粒子を産生し得る完全なゲノムを含有しないのであれば、ウイルス複製や後続の細胞溶解はない。癌細胞等の標的細胞の溶解が所望である場合、複製可能腫瘍崩壊性ウイルスの使用が最も適切であり得る。これらのウイルスは、それらの最終的溶解が生じる癌標的細胞中において選択的に複製される（ＲｉｎｇＣＪ、ＪＧｅｎＶｉｒｏｌ．２００２年３月；８３（Ｐｔ３）：４９１〜５０２、ＶａｒｇｈｅｓｅＳら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．２００７年１０月１日；６７（１９）：９３７１〜９；ＶａｒｇｈｅｓｅＳら、ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ．２００６年５月１日；１２（９）：２９１９〜２７；ＲｅｉｎｂｌａｔｔＭ．ら、Ｓｕｒｇｅｒｙ２００４；１３６：５７９〜５８４）。ヒト細胞に感染することが可能であるが、通常はそうしないウイルス、例えば他の霊長類由来のウイルスの使用（ＬｕｎｄＰＥら、ＰｈａｒｍＲｅｓ．２００９年１２月９日；ＬｕｎｄＰＥら、ＰｈａｒｍＲｅｓ．２００９年１２月９日；ＨｅｉｎｋｅｌｅｉｎＭら、ＣａｎｃｅｒＧｅｎｅＴｈｅｒ．２００５年１２月；１２（１２）：９４７〜５３；ＦａｌｃｏｎｅＶら、ＣｕｒｒＴｏｐＭｉｃｒｏｂｉｏｌＩｍｍｕｎｏｌ．２００３；２７７：１６１〜１８０）は、ヒトが自然宿主であるウイルスに対して存在することができる中和抗体を回避する際に有用であり得る。

インビトロでのウイルスパッケージング細胞の適用

インビトロで成長するウイルスパッケージング細胞中において産生されたウイルス粒子は、最終的にパッケージング細胞から培養培地中に放出される。これらの粒子は、成長培地から通常回収され、濃縮され、生物活性ＲＮＡのためのトランスフェクション試薬として使用される（ＨｅｉｎｋｅｌｅｉｎＭら、ＣａｎｃｅｒＧｅｎｅＴｈｅｒ．２００５年１２月；１２（１２）：９４７〜５３；ＡｎｅｓｔｉＡＭら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２００８年８月；３６（１４）：ｅ８６；ＧｏｒｂａｔｙｕｋＭら、ＶｉｓｉｏｎＲｅｓ．２００７年４月；４７（９）：１２０２〜８；ＳｃｈｅｒｒＭら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２００７；３５（２２）：ｅ１４９；ＣｈｅｎＷら、ＪＶｉｒｏｌ．２００６年４月；８０（７）：３５５９〜６６；ＲａｏｕｌＣら、ＮａｔＭｅｄ．２００５年４月；１１（４）：４２３〜８；Ｂｒｏｍｂｅｒｇ−ＷｈｉｔｅＪＬら、ＪＶｉｒｏｌ．２００４年５月；７８（９）：４９１４〜６；ＳｃｈｅｒｒＭら、ＣｅｌｌＣｙｃｌｅ．２００３年５月〜６月；２（３）：２５１〜７）。更に２つの培養物が共通の培地を共有することを可能にするウイルス産生及び標的細胞を物理的に分離することによって、ウイルスパッケージング細胞から培地のいかなる処理を行うことなく培養において成長する標的細胞を感染させることが可能であり得る。これは、細胞培養プレート中において適合するように設計されたインサートを用いて、又は産生から標的細胞への培地の手動の転移によって達成される。この場合、パッケージング細胞の同一性は、ウイルス産生に対してのみ最適化される。ウイルスのバックボーンは、細胞培養培地中における粒子安定性と濃縮なしで最高の可能な力価を最適化するように選択される。

標的細胞へのパッケージング細胞の直接の付加によってインビトロで成長する細胞にトランスフェクトするために、ウイルスパッケージング細胞をも用いる。一態様において、（中間濃縮ステップなしの）ウイルス送達生物学的ＲＮＡは、ウイルス産生細胞とレポータープラスミドをトランスフェクトした標的細胞との記載された型の共培養を用いて直接転移される。特異的レポーターの存在は、ウイルス産生及び標的細胞の区別を必要とせず、代わりに、生物活性ＲＮＡのウイルスに基づいた送達の直接のリードアウトを提供する。標的内在性遺伝子に対するウイルス系を用いる場合、生物活性ＲＮＡによる遺伝子発現の調節のためのリードアウトは、標的細胞に対して固有でなければならず、タンパク質系バイオリアクター細胞による実験と同様のウイルス産生細胞によって共有されてはならない。ウイルス送達系に対するレシピエント細胞は、標的細胞の同一性によって影響され、その結果、種特異的リードアウトは、ｍＲＮＡ及びタンパク質ノックダウンの分析を単純化する。標的細胞に対するウイルスパッケージング細胞の最適比は、標的細胞及び標的遺伝子の組合せごとに実験的に決定される。

インビボでの遺伝子発現の調節

インビボ系に対するウイルスパッケージング細胞の適用が、マウスモデル系におけるタンパク質分子の過剰発現のために開発されたトランス核埋込みの方法に続く。タンパク質系バイオリアクター細胞と同様に、マウス腫瘍細胞系（ＳＣＣＶＩＩ又はＲｅｎｋａ）とマウス由来のウイルスパッケージング細胞との同時埋込みを利用するインビボ試験系（例２９及び３０参照）を使用する。これらの細胞型の混合物を、動物の脾腹への皮下注射によってマウスに埋め込む。ウイルス粒子は、ＶＥＧＦ又はＭｍｐ２をターゲッティングするｓｈＲＮＡを送達する。活性を、埋め込みの領域中における標的遺伝子の成功したノックダウンによって、又は腫瘍成長及び転移に対する生理学的影響によってアッセイする。

マウス由来のウイルスのパッケージング細胞（ＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞又はｍＥＳＣ）をマウスにも埋め込み、周囲のマウス組織へのウイルス分泌及び送達をアッセイする。この場合、生物活性ＲＮＡ分子を含有するウイルス粒子は、ヒト疾患のためのマウスモデルの内在性組織をターゲッティングする（例３１〜３２参照）。関連の疾患組織を各動物から回収し、標的遺伝子発現を、ＲＴ−ＰＣＲを用いて転写産物レベルで、又はＥＬＩＳＡアッセイを用いてタンパク質レベルで評価する。ウイルスに基づいた送達系の機能と疾患の治療に対する遺伝子標的の有効性との両方を評価するために、治療及び無治療対照マウスの中で、疾患進行の生理学的アッセイをも測定し、比較する。

キット

本発明は、本明細書に記載される方法において用いることができるキットを更に提供する。例えば、本発明は、発現ベクターが本発明のＲＮＡ−タンパク質複合体を発現する、発現ベクターを構築するためのキットを提供する。一実施形態において、キットは、認識ＲＮＡ配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列（以下、「ＲＮＡ配列」と呼ぶ）を含む核酸分子をコードする第１ポリヌクレオチドと、ＲＮＡ結合ドメイン及び（非古典的分泌ドメイン、細胞貫通ペプチド、受容体結合ドメイン及びエンドソーム放出ドメインから選択される場合によって１つ又は複数の輸送ペプチド配列（以下、「タンパク質配列」と呼ぶ）を含むポリペプチドをコードする第２ポリヌクレオチドとを含む。別の一実施形態において、キットは、ダイサー及び／又はドローシャをターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列（以下、「ダイサー／ドローシャ配列」と呼ぶ）を含む核酸分子をコードする第３ポリヌクレオチドを更に含む。

したがって、一実施形態において、キットは、（ＲＮＡ結合配列（単数又は複数）が含まれる）ＲＮＡ配列をコードするポリヌクレオチドを増幅するための１つ又は複数のプライマー配列を更に含む。一実施形態において、プライマー配列（単数又は複数）は、（ＲＮＡ結合配列（単数又は複数）が含まれる）ＲＮＡ配列をコードするポリヌクレオチドに対して相補的な１つ又は複数の配列、１つ又は複数の制限酵素部位配列、及び場合によって少なくとも４つのＧＣ塩基対を含む１つ又は複数の配列を含む。別の一実施形態において、キットは、（ＲＮＡ結合配列（単数又は複数）が含まれる）ＲＮＡ配列をコードするポリヌクレオチドを発現するために適切なプロモーター配列を更に含む。別の一実施形態において、キットは、（ＲＮＡ結合配列（単数又は複数）が含まれる）ＲＮＡ配列をコードするポリヌクレオチドを発現するために適切な終止配列を更に含む。別の一実施形態において、キットは、タンパク質配列をコードするポリヌクレオチドを増幅するための１つ又は複数のプライマー配列を更に含む。一実施形態において、プライマー配列（単数又は複数）は、タンパク質配列をコードするポリヌクレオチドに対して相補的な１つ又は複数の配列、１つ又は複数の制限酵素部位配列、及び場合によって少なくとも４つのＧＣ塩基対を含む１つ又は複数の配列を含む。別の一実施形態において、プライマー配列（単数又は複数）は、１つ又は複数の開始コドン配列及び１つ又は複数の翻訳開始部位配列を更に含む。別の一実施形態において、キットは、タンパク質配列をコードするポリヌクレオチドを発現するために適切なプロモーター配列を更に含む。別の一実施形態において、キットは、タンパク質配列をコードするポリヌクレオチドを発現するために適切な終止配列を更に含む。

代替の実施形態において、キットは、認識ＲＮＡ配列、場合によって末端ミニヘリックス配列、場合によって１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、１つ又は複数のプライマー配列、１つ又は複数のプロモーター配列及び１つ又は複数の終止配列を含むポリヌクレオチドを含む。一実施形態において、ポリヌクレオチドは、生物活性ＲＮＡ配列が、リボザイム、アンチセンス核酸、アロザイム、アプタマー、短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及び１つ又は複数の生物活性ペプチドをコードする転写産物から選択される、１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列を含む。生物活性ＲＮＡは、例えば、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＭＭＰ２、Ｃａｖ−１、ＥＧＦＲ、Ｈ−ＲＡｓ、Ｂｃｌ−２、スルビビン、ＦＡＫ、ＳＴＡＴ３、Ｈｅｒ−３、ベータ−カテニン、ｈＲＥＴ受容体型チロシンキナーゼが含まれる、対象となる任意の遺伝子標的をターゲッティングすることができる。別の一実施形態において、ポリヌクレオチドは、生物活性ＲＮＡ配列を含まず、その配列は、キットの個々の使用者によって供給される。一実施形態において、プライマー配列（単数又は複数）は、（生物活性ＲＮＡが含まれる）ＲＮＡ配列をコードするポリヌクレオチドに対して相補的な１つ又は複数の配列、１つ又は複数の制限酵素部位配列、及び場合によって少なくとも４つのＧＣ塩基対を含む１つ又は複数の配列を含む。代替の実施形態の別のものにおいて、キットは、ＲＮＡ結合ドメイン、非古典的分泌ドメイン、細胞貫通ペプチド、受容体結合ドメイン、エンドソーム放出ドメインから選択される１つ又は複数の配列、１つ又は複数のプライマー配列、１つ又は複数のプロモーター配列及び１つ又は複数の終止配列を含むポリヌクレオチドを更に含む。一実施形態において、プライマー配列（単数又は複数）は、タンパク質配列をコードするポリヌクレオチドに対して相補的な１つ又は複数の配列、１つ又は複数の制限酵素部位配列、場合によって少なくとも４つのＧＣ塩基対を含む１つ又は複数の配列、１つ又は複数の開始コドン配列及び１つ又は複数の翻訳開始部位配列を含む。別の代替の一実施形態において、キットはまた、ダイサー及び／又はドローシャをターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、１つ又は複数のプライマー配列、１つ又は複数のプロモーター配列及び１つ又は複数の終止配列を含むポリヌクレオチドをも含む。

記載されたキットの実施形態のいずれかにおいて、（生物活性ＲＮＡが含まれる）ＲＮＡ配列をコードするポリヌクレオチドは、認識ＲＮＡ配列、個々の生物活性ＲＮＡ配列、場合による末端ミニヘリックス配列及びあらゆる他の含まれる配列が、直接結合するか、又は１つ若しくは複数の介在若しくは付加配列の付加と共に結合する、配列を含むことができる。記載されたキットの実施形態のいずれかにおいて、タンパク質配列をコードするポリヌクレオチドは、ＲＮＡ結合ドメイン及び非古典的分泌ドメイン、細胞貫通ペプチド、受容体結合ドメイン及びエンドソーム放出ドメイン配列、並びにあらゆる他の含まれる配列が、直接結合するか、又は１つ若しくは複数の介在若しくは付加配列の付加と共に結合する、配列を含むことができる。したがって、ある種の実施形態において、キットは、ＲＮＡ配列をコードするポリヌクレオチド及びタンパク質配列をコードするポリヌクレオチドの各種の配列及びドメインを結合するためのリンカー配列を更に含む。

記載されたキットの実施形態のいずれかにおいて、認識ＲＮＡ配列は、Ｕ１ループ、グループＩＩイントロン、ＮＲＥステムループ、Ｓ１Ａステムループ、バクテリオファージＢｏｘＢＲ、ＨＩＶＲｅｖ応答エレメント、ＡＭＶＣＰ認識配列及びＡＲＥ配列から選択され得る。記載されたキットの実施形態のいずれかにおいて、ＲＮＡ結合ドメインは、Ｕ１Ａ、ＣＲＳ１、ＣＲＭ１、ヌクレオリンＲＢＤ１２、ｈＲＢＭＹ、バクテリオファージタンパク質Ｎ、ＨＩＶＲｅｖ、ＡＭＶＣＰ及びトリステトラプロリン配列から選択され得る。記載されたキットの実施形態のいずれかにおいて、細胞貫通ペプチドは、ペネトラチン、トランスポルタン、ＭＡＰ、ＨＩＶＴＡＴ、Ａｎｔｐ、Ｒｅｖ、ＦＨＶコートタンパク質、ＴＰ１０及びｐＶＥＣ配列から選択され得る。記載されたキットの実施形態のいずれかにおいて、非古典的分泌ドメインは、Ｇａｌｃｅｔｉｎ−１ペプチド、ガレクチン−３ペプチド、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＨＡＳＰＢ、ＨＭＧＢ１、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＩＬ−２シグナル、分泌トランスグルタミナーゼ、アネキシン−１、ＨＩＶＴＡＴ、ヘルペスＶＰ２２、チオレドキシン、ロダネーゼ及びプラスミノーゲンアクチベーターシグナル配列から選択され得る。キットの実施形態のいずれかにおいて、プロモーターは、ＰｏｌＩＩプロモーターである。適切なＰｏｌＩＩプロモーターの非限定的な例としては、限定されるものではないが、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、β−アクチン、ヒトアルブミン、ヒトＨＩＦ−α、ヒトゲルソリン、ヒトＣＡ−１２５、ユビキチン及びＰＳＡプロモーターが挙げられる。別の一実施形態において、プロモーターは、ＰｏｌＩＩＩプロモーターである。適切なＰｏｌＩＩＩプロモーターの例としては、限定されるものではないが、ヒトＨ１及びヒトＵ６プロモーターが挙げられる。適切な終止配列の非限定的な例としては、限定されるものではないが、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化配列、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化配列、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）大型Ｔポリアデニル化配列及び単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）ポリアデニル化配列が挙げられる。

更に別の一実施形態において、キットは、（生物活性ＲＮＡが含まれる）ＲＮＡ配列をコードするポリヌクレオチド及び／又はタンパク質配列をコードするポリヌクレオチド及び／又はダイサー／ドローシャ配列をコードするポリヌクレオチドが挿入され得る１つ又は複数のバックボーンベクターを更に含む。一実施形態において、ＲＮＡ配列をコードするポリヌクレオチドは、第１バックボーンベクターに挿入され、タンパク質配列をコードするポリヌクレオチドは、第２バックボーンベクターに挿入される。別の一実施形態において、ＲＮＡ配列をコードするポリヌクレオチド及びタンパク質配列をコードするポリヌクレオチドは、単一のバックボーンベクターに挿入される。一実施形態において、ダイサー／ドローシャ配列をコードするポリヌクレオチドは、第３バックボーンベクターに挿入され得る。別の一実施形態において、ダイサー／ドローシャ配列をコードするポリヌクレオチドは、ＲＮＡ配列をコードするポリヌクレオチドと同じベクターに挿入され得る。適切なバックボーンベクターの非限定的な例としては、ｐＣＩ、ｐＥＴ、ｐＳＩ、ｐｃＤＮＡ、ｐＣＭＶ等が挙げられる。上記実施形態のいずれかにおいて、バックボーンベクターは、ｐＵＣ複製開始点を更に含む。一実施形態において、バックボーンベクターは、カナマイシン、アンピシリン、ピューロマイシン、テトラサイクリン及びクロラムフェニコール耐性遺伝子、並びに本技術分野において公知で、記載されているあらゆる他の薬剤耐性遺伝子から選択される１つ又は複数の薬剤耐性遺伝子を更に含む。

他の実施形態において、キットは、例えば１つ又は複数の制限酵素、フォスファターゼ、キナーゼ、リガーゼ及びポリメラーゼが含まれる、（生物活性ＲＮＡが含まれる）ＲＮＡ配列をコードするポリヌクレオチド、タンパク質配列をコードするポリヌクレオチド及びダイサー／ドローシャ配列をコードするポリヌクレオチドを増幅、クローニング及び／又は発現するために有用な緩衝剤、酵素及び溶液を更に含む。

別の一実施形態において、キットは、例えば、ポリヌクレオチド配列マップ及びプラスミドマップが含まれる、発現ベクターを構築するための指示書を更に含む。

別の一実施形態において、キットは、市販用のキットをパッケージするための材料を更に含む。

更に、本発明は、標的遺伝子の発現を調節するために有用な発現ベクターを含むキットを提供する。キットは、インビボ、エクスビボ及びインビトロで遺伝子発現を調節するために使用され得る本発明のＲＮＡ−タンパク質複合体を産生する１つ又は複数の発現ベクターを提供する。一実施形態において、キットは、ＲＮＡ−タンパク質複合体のＲＮＡ部分及びＲＮＡ−タンパク質複合体の融合タンパク質部分を発現するための別々の発現ベクターを含む。ＲＮＡ−タンパク質複合体のＲＮＡ部分及びタンパク質部分のための別々の発現ベクターを含むキットの利点の内の１つは、標的細胞に生物活性ＲＮＡを含むベクターをトランスフェクトすることによって生物活性ＲＮＡの活性を確認することができるということである。融合タンパク質を発現するベクターの非存在下で、生物活性ＲＮＡを発現するベクターの遺伝子調節を、標的細胞中において直接確認することができる。別の一実施形態において、キットは、ＲＮＡ−タンパク質複合体を発現するための単一の発現ベクターを含む。

一実施形態において、キットは、生物活性ＲＮＡ配列（単数又は複数）、認識ＲＮＡ配列及び場合による末端ミニヘリックス配列がプロモーター配列の下流にある、標的遺伝子に向けられた１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列、場合によって末端ミニヘリックス配列、１つ又は複数のプロモーター配列、１つ又は複数の終止配列、制限酵素部位、プライマー配列及び場合によってＧＣ塩基対配列を含む発現ベクターを提供する。生物活性ＲＮＡは、本明細書に記載されるか、又はそれ以外の場合、本技術分野において公知のいずれかの生物活性ＲＮＡであってもよい。生物活性ＲＮＡ配列は、リボザイム、アンチセンス核酸、アロザイム、アプタマー、短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及び１つ又は複数の生物活性ペプチドをコードする転写産物から選択され得る。生物活性ＲＮＡは、例えば、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＭＭＰ２、Ｃａｖ−１、ＥＧＦＲ、Ｈ−ＲＡｓ、Ｂｃｌ−２、スルビビン、ＦＡＫ、ＳＴＡＴ３、Ｈｅｒ−３、ベータ−カテニン、ｈＲＥＴ受容体型チロシンキナーゼが含まれる、対象となる任意の遺伝子標的をターゲッティングすることができる。別の一実施形態において、発現ベクターは、生物活性ＲＮＡ配列を含まず、その配列は、キットの個々の使用者によって供給される。したがって、一実施形態において、キットは、認識ＲＮＡ配列及び場合による末端ミニヘリックス配列がプロモーター配列の下流にある、認識ＲＮＡ配列、場合によって末端ミニヘリックス配列、１つ又は複数のプロモーター配列、１つ又は複数の終止配列、制限酵素部位、プライマー配列及び場合によってＧＣ塩基対配列を含む発現ベクターを提供する。制限酵素部位は、使用者の生物活性ＲＮＡ配列の挿入のための好都合クローニング部位を提供するように位置する。別の代替の一実施形態において、キットはまた、ダイサー及び／又はドローシャをターゲッティングする１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、１つ又は複数のプライマー配列、１つ又は複数のプロモーター配列及び１つ又は複数の終止配列を含むポリヌクレオチドをも含む。

上記実施形態のいずれかにおいて、認識ＲＮＡ配列は、Ｕ１ループ、グループＩＩイントロン、ＮＲＥステムループ、Ｓ１Ａステムループ、バクテリオファージＢｏｘＢ、ＨＩＶＲｅｖ応答エレメント、ＡＭＶＣＰ認識配列及びＡＲＥ配列から選択され得る。一実施形態において、プロモーター配列は、ＰｏｌＩＩＩプロモーターである。適切なＰｏｌＩＩＩプロモーターの非限定的な例としては、ヒトＵ６ｐｏｌＩＩＩプロモーター及びヒトＨ１ｐｏｌＩＩＩプロモーターが挙げられる。一実施形態において、プロモーター配列は、ｐｏｌＩＩプロモーターである。適切なｐｏｌＩＩプロモーターの非限定的な例としては、ＳＶ４０、β−アクチン、ヒトアルブミン、ヒトＨＩＦ−α、ヒトゲルソリン、ヒトＣＡ−１２５、ヒトユビキチン、ＰＳＡ及びサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターが挙げられる。一実施形態において、生物活性ＲＮＡ配列及び認識ＲＮＡ配列は、プロモーター配列に作動可能に連結する。一実施形態において、終止配列は、Ｐｏｌ−ＩＩＩポリＴ終止配列である。

上記実施形態のいずれかにおいて、発現ベクターは、ｐＵＣ複製開始点を更に含む。上記実施形態のいずれかにおいて、発現ベクターは、１つ又は複数の薬剤耐性遺伝子を更に含む。適切な薬剤耐性遺伝子の例としては、限定されるものではないが、カナマイシン、アンピシリン、ピューロマイシン、テトラサイクリン及びクロラムフェニコール耐性遺伝子、並びに本技術分野において公知で、記載されているあらゆる他の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。

一実施形態において、キットは、ＲＮＡ結合ドメイン、並びに細胞貫通ペプチド、非古典的分泌ドメイン、受容体結合ドメイン、エンドソーム放出ドメイン及び融合ペプチドから選択される１つ又は複数の配列を含む発現ベクターを更に含み、更に、１つ又は複数のプロモーター配列、１つ又は複数の終止配列、制限酵素部位、プライマー配列、場合によってＧＣ塩基対配列、開始コドン及び翻訳開始部位を含み、ＲＮＡ結合ドメイン及び細胞貫通ペプチド、非古典的分泌ドメイン、受容体結合ドメイン、エンドソーム放出ドメイン及び融合ペプチドは、プロモーター配列の下流にある。一実施形態において、プロモーター配列は、ＰｏｌＩＩプロモーターである。適切なｐｏｌＩＩプロモーターの非限定的な例としては、ＳＶ４０、β−アクチン、ヒトアルブミン、ヒトＨＩＦ−α、ヒトゲルソリン、ヒトＣＡ−１２５、ヒトユビキチン、ＰＳＡ及びサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターが挙げられる。終止配列は、ポリアデニル化配列、例えば、ｈＧＨから誘導されるポリアデニル化配列であってよい。ある種の実施形態において、ＲＮＡ結合ドメインは、Ｕ１Ａ、ＣＲＳ１、ＣＲＭ１、ヌクレオリンＲＢＤ１２、ｈＲＢＭＹ、バクテリオファージタンパク質Ｎ、ＨＩＶＲｅｖ、ＡＭＶＣＰ及びトリステトラプロリンアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む。ある種の実施形態において、細胞貫通ペプチドは、ペネトラチン、トランスポルタン、ＭＡＰ、ＨＩＶＴＡＴ、Ａｎｔｐ、Ｒｅｖ、ＦＨＶコートタンパク質、ＴＰ１０及びｐＶＥＣアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む。ある種の実施形態において、非古典的分泌ドメインは、Ｇａｌｃｅｔｉｎ−１ペプチド、ガレクチン−３ペプチド、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＨＡＳＰＢ、ＨＭＧＢ１、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＩＬ−２シグナル、分泌トランスグルタミナーゼ、アネキシン−１、ＨＩＶＴＡＴ、ヘルペスＶＰ２２、チオレドキシン、ロダネーゼ及びプラスミノーゲンアクチベーターシグナルアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む。

上記実施形態のいずれかにおいて、発現ベクターは、ｐＵＣ複製開始点を更に含む。一実施形態において、発現ベクターは、カナマイシン、アンピシリン、ピューロマイシン、テトラサイクリン及びクロラムフェニコール耐性遺伝子、並びに本技術分野において公知で、記載されているあらゆる他の薬剤耐性遺伝子から選択される１つ又は複数の薬剤耐性遺伝子を更に含む。

一実施形態において、キットは、生物活性ＲＮＡ配列（単数又は複数）及び場合による末端ミニヘリックス配列がプロモーター配列の下流にあり、生物活性ＲＮＡ配列（単数又は複数）がダイサー及び／又はドローシャをターゲッティングする、１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、場合によって末端ミニヘリックス配列、１つ又は複数のプロモーター配列、１つ又は複数の終止配列、制限酵素部位、プライマー配列及び場合によってＧＣ塩基対配列を含む発現ベクターを場合によって更に含むことができる。ある種の実施形態において、生物活性ＲＮＡ配列は、リボザイム、アンチセンス核酸、アロザイム、アプタマー、短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及び１つ又は複数の生物活性ペプチドをコードする転写産物から選択される。一実施形態において、プロモーター配列（単数又は複数）は、例えばヒトＵ６ｐｏｌＩＩＩプロモーター及びヒトＨ１ｐｏｌＩＩＩプロモーターが含まれるＰｏｌＩＩＩプロモーターである。一実施形態において、プロモーター配列は、例えばＳＶ４０、β−アクチン、ヒトアルブミン、ヒトＨＩＦ−α、ヒトゲルソリン、ヒトＣＡ−１２５、ヒトユビキチン、ＰＳＡ及びサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターが含まれるｐｏｌＩＩプロモーターである。一実施形態において、終止配列（単数又は複数）は、Ｐｏｌ−ＩＩＩポリＴ終止配列である。上記実施形態のいずれかにおいて、発現ベクターは、ｐＵＣ複製開始点を更に含む。一実施形態において、発現ベクターは、カナマイシン、アンピシリン、ピューロマイシン、テトラサイクリン及びクロラムフェニコール耐性遺伝子、並びに本技術分野において公知で、記載されているあらゆる他の薬剤耐性遺伝子から選択される１つ又は複数の薬剤耐性遺伝子を更に含む。

別の一実施形態において、キットは、指示書と、市販用のキットをパッケージするための材料とを更に含む。

別の場合、キットは、本発明のＲＮＡ−タンパク質複合体をコードする単一の発現ベクターを含む。一実施形態において、キットは、第１発現カセット、第２発現カセット及び場合によって第３発現カセットを含む発現ベクターを含む。第１発現カセットは、生物活性ＲＮＡ配列（単数又は複数）、認識ＲＮＡ配列及び場合による末端ミニヘリックス配列がプロモーター配列の下流にある、標的遺伝子（単数又は複数）に向けられた１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列、場合によって末端ミニヘリックス配列、１つ又は複数のプロモーター配列、１つ又は複数の終止配列、制限酵素部位、プライマー配列及び場合によってＧＣ塩基対配列を含む。ある種の実施形態において、生物活性ＲＮＡ配列は、リボザイム、アンチセンス核酸、アロザイム、アプタマー、短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及び１つ又は複数の生物活性ペプチドをコードする転写産物から選択される。標的遺伝子は、例えばＭｍｐ２、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、Ｃａｖ−１、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、Ｈ−Ｒａｓ、Ｂｃｌ−２、スルビビン、ＦＡＫ、ＳＴＡＴ−３、ＨＥＲ−３、ベータ−カテニン及びＳｒｃ遺伝子標的が含まれるいずれの標的遺伝子であってもよい。ある種の実施形態において、認識ＲＮＡ配列は、Ｕ１ループ、グループＩＩイントロン、ＮＲＥステムループ、Ｓ１Ａステムループ、バクテリオファージＢｏｘＢＲ、ＨＩＶＲｅｖ応答エレメント、ＡＭＶＣＰ認識配列及びＡＲＥ配列から選択される。一実施形態において、プロモーター配列は、例えばヒトＵ６ｐｏｌＩＩＩプロモーター及びヒトＨ１ｐｏｌＩＩＩプロモーターから選択されるプロモーターが含まれるＰｏｌＩＩＩプロモーターである。一実施形態において、プロモーター配列は、例えばＳＶ４０、β−アクチン、ヒトアルブミン、ヒトＨＩＦ−α、ヒトゲルソリン、ヒトＣＡ−１２５、ヒトユビキチン、ＰＳＡ及びサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターから選択されるプロモーターが含まれるｐｏｌＩＩプロモーターである。一実施形態において、終止配列は、Ｐｏｌ−ＩＩＩポリＴ終止配列である。

キットの発現ベクターは、第２発現カセットが、ＲＮＡ結合ドメイン配列、細胞貫通ペプチド、非古典的分泌ドメイン、受容体結合ドメイン、エンドソーム放出ドメイン及び融合ペプチドから選択される１つ又は複数の配列、１つ又は複数のプロモーター配列、１つ又は複数の終止配列、制限酵素部位、プライマー配列、ＧＣ塩基対配列、開始コドン及び翻訳開始部位を含み、ＲＮＡ結合ドメイン及び細胞貫通ペプチド、非古典的分泌ドメイン、受容体結合ドメイン、エンドソーム放出ドメイン及び融合ペプチドがプロモーター配列の下流にある、第２発現カセットを更に含む。ある種の実施形態において、ＲＮＡ結合ドメインは、Ｕ１Ａ、ＣＲＳ１、ＣＲＭ１、ヌクレオリンＲＢＤ１２、ｈＲＢＭＹ、バクテリオファージタンパク質Ｎ、ＨＩＶＲｅｖ、ＡＭＶＣＰ及びトリステトラプロリン配列から選択される。ある種の実施形態において、細胞貫通ペプチドは、ペネトラチン、トランスポルタン、ＭＡＰ、ＨＩＶＴＡＴ、Ａｎｔｐ、Ｒｅｖ、ＦＨＶコートタンパク質、ＴＰ１０及びｐＶＥＣアミノ酸配列から選択される。ある種の実施形態において、非古典的分泌ドメインは、ガレクチン−１ペプチド、ガレクチン−３ペプチド、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＨＡＳＰＢ、ＨＭＧＢ１、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＩＬ−２シグナル、分泌トランスグルタミナーゼ、アネキシン−１、ＨＩＶＴＡＴ、ヘルペスＶＰ２２、チオレドキシン、ロダネーゼ及びプラスミノーゲンアクチベーターシグナル配列から選択される。一実施形態において、プロモーター配列は、例えばＳＶ４０、β−アクチン、ヒトアルブミン、ヒトＨＩＦ−α、ヒトゲルソリン、ヒトＣＡ−１２５、ヒトユビキチン、ＰＳＡ及びサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターから選択されるプロモーターが含まれるｐｏｌＩＩプロモーターである。一実施形態において、終止配列は、ポリアデニル化配列である。一実施形態において、ポリアデニル化配列は、ｈＧＨから誘導される。

キットの発現ベクターは、第３発現カセットが、１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列、１つ又は複数のプロモーター配列、１つ又は複数の終止配列、制限酵素部位、プライマー配列及び場合によってＧＣ塩基対配列を含み、生物活性ＲＮＡ配列（単数又は複数）及び場合による末端ミニヘリックス配列がプロモーター配列の下流にある、第３発現カセットを更に含む。上記の発現ベクターのある種の実施形態において、生物活性ＲＮＡ配列は、リボザイム、アンチセンス核酸、アロザイム、アプタマー、短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及び１つ又は複数の生物活性ペプチドをコードする転写産物から選択される。一実施形態において、生物活性ＲＮＡ配列の内の１つ又は複数は、ダイサー及び／又はドローシャに向けられる。一実施形態において、プロモーターは、ＰｏｌＩＩＩプロモーターである。適切なＰｏｌＩＩＩプロモーターの非限定的な例としては、ヒトＵ６ｐｏｌＩＩＩプロモーター及びヒトＨ１ｐｏｌＩＩＩプロモーターが挙げられる。一実施形態において、プロモーター配列は、ｐｏｌＩＩプロモーターである。適切なｐｏｌＩＩプロモーターの非限定的な例としては、ＳＶ４０、β−アクチン、ヒトアルブミン、ヒトＨＩＦ−α、ヒトゲルソリン、ヒトＣＡ−１２５、ヒトユビキチン、ＰＳＡ及びサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターが挙げられる。一実施形態において、生物活性ＲＮＡ配列は、プロモーター配列に作動可能に連結する。一実施形態において、終止配列は、Ｐｏｌ−ＩＩＩポリＴ終止配列である。

発現ベクターは、ｐＵＣ複製開始点を更に含む。一実施形態において、発現ベクターは、カナマイシン、アンピシリン、ピューロマイシン、テトラサイクリン及びクロラムフェニコール耐性遺伝子、並びに本技術分野において公知で、記載されているあらゆる他の薬剤耐性遺伝子から選択される１つ又は複数の薬剤耐性遺伝子を更に含む。

代替の一実施形態において、キットは、第１発現カセットが、認識ＲＮＡ配列、場合によって末端ミニヘリックス配列、１つ又は複数のプロモーター配列、１つ又は複数の終止配列、制限酵素部位、プライマー配列及び場合によってＧＣ塩基対配列を含み、認識ＲＮＡ配列及び場合による末端ミニヘリックス配列がプロモーター配列の下流にある、第１発現カセット、第２発現カセット及び場合によって第３発現カセットを含む発現ベクターを含む。キットは、生物活性ＲＮＡ配列を含まず、その配列は、キットの個々の使用者によって供給される。キットは、発現ベクターへの好都合なクローニングのための生物活性ＲＮＡ配列にライゲーションされ得る制限酵素部位を含む１つ又は複数のプライマー配列を場合によって含む。第２発現カセット及び任意の第３発現カセットは、上記の第２及び第３発現カセットのいずれかであってよい。

代替の一実施形態において、キットは、第２発現カセット及び場合によって第３発現カセットを含む発現ベクターを含む。キットは、第１の発現カセットが、認識ＲＮＡ配列、場合によって末端ミニヘリックス配列、１つ又は複数のプロモーター配列、１つ又は複数の終止配列、制限酵素部位、プライマー配列及び場合によってＧＣ塩基対配列を含み、認識ＲＮＡ配列及び場合による末端ミニヘリックス配列がプロモーター配列の下流にある、発現ベクターにライゲーションされ得る第１発現カセットを含む単離されたポリヌクレオチドを更に含む。キットは、生物活性ＲＮＡ配列を含まず、その配列は、キットの個々の使用者によって供給される。キットは、第１発現カセットへの好都合な挿入のための生物活性ＲＮＡ配列にライゲーションされ得る１つ又は複数のプライマー配列を場合によって含む。次いで、第１発現カセットを、第２発現カセット及び第３発現カセットを含む発現ベクターにクローニングすることができる。キットは、発現ベクターへの好都合クローニングのための第１発現カセットにライゲーションされ得る発現ベクターと適合性の制限部位を含む１つ又は複数のプライマー配列を場合によって含む。第２発現カセット及び第３発現カセットは、上記の第２及び第３発現カセットのいずれかであってよい。発現ベクターが第２発現カセットだけを含む実施形態において、キットは、発現ベクターにライゲーションされ得る第３発現カセットを含む単離されたポリヌクレオチドを更に含むことができる。第３発現カセットは、上記の第３発現カセットのいずれかであってよい。キットは、発現ベクターへの好都合なクローニングのための第３発現カセットにライゲーションされ得る発現ベクターと適合性の制限部位を含む１つ又は複数のプライマー配列を場合によって含む。

これらの実施形態のいずれかにおいて、発現ベクターは、ｐＵＣ複製開始点を更に含む。一実施形態において、発現ベクターは、カナマイシン、アンピシリン、ピューロマイシン、テトラサイクリン及びクロラムフェニコール耐性遺伝子、並びに本技術分野において公知で、記載されているあらゆる他の薬剤耐性遺伝子から選択される１つ又は複数の薬剤耐性遺伝子を更に含む。

本発明はまた、インビボ、エクスビボ及びインビトロで遺伝子発現を調節するために使用され得る本発明のＲＮＡ−タンパク質複合体を産生する１つ又は複数のバイオリアクター細胞を含むキットをも提供する。本発明は、１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列、場合によって末端ミニヘリックス配列、ＲＮＡ結合ドメイン配列、並びに細胞貫通ペプチド、非古典的分泌ドメイン、エンドソーム放出ドメイン、受容体結合ドメイン及び融合ペプチド配列から選択される１つ又は複数の配列を含むＲＮＡ−タンパク質複合体を産生し、分泌するバイオリアクター細胞の溶液を提供する。一実施形態において、バイオリアクター細胞は、１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列、場合による末端ミニヘリックス配列、ＲＮＡ結合ドメイン配列及び細胞貫通ペプチド配列を含むＲＮＡ−タンパク質複合体を産生する。別の一実施形態において、バイオリアクター細胞は、１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列、場合による末端ミニヘリックス配列、ＲＮＡ結合ドメイン配列及び非古典的分泌ドメイン配列を含むＲＮＡ−タンパク質複合体を産生する。更に別の一実施形態において、バイオリアクター細胞は、１つ又は複数の生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列、場合による末端ミニヘリックス配列、ＲＮＡ結合ドメイン配列、細胞貫通ペプチド配列及び非古典的分泌ドメイン配列を含むＲＮＡ−タンパク質複合体を産生する。

バイオリアクター細胞を含む上記のキットのある種の実施形態において、生物活性ＲＮＡ配列（単数又は複数）は、リボザイム、アンチセンス核酸、アロザイム、アプタマー、短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及び１つ又は複数の生物活性ペプチドをコードする転写産物から選択される。生物活性ＲＮＡ配列（単数又は複数）は、限定されるものではないが、Ｍｍｐ２、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、Ｃａｖ−１、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、Ｈ−Ｒａｓ、Ｂｃｌ−２、スルビビン、ＦＡＫ、ＳＴＡＴ−３、ＨＥＲ−３、ベータ−カテニン及びＳｒｃ遺伝子標的が含まれるいずれの遺伝子をターゲッティングしてもよい。上記の細胞のある種の実施形態において、認識ＲＮＡ配列は、Ｕ１ループ、グループＩＩイントロン、ＮＲＥステムループ、Ｓ１Ａステムループ、バクテリオファージＢｏｘＢＲ、ＨＩＶＲｅｖ応答エレメント、ＡＭＶＣＰ認識配列及びＡＲＥ配列から選択される。上記の細胞のある種の実施形態において、ＲＮＡ結合ドメインは、Ｕ１Ａ、ＣＲＳ１、ＣＲＭ１、ヌクレオリンＲＢＤ１２、ｈＲＢＭＹ、バクテリオファージタンパク質Ｎ、ＨＩＶＲｅｖ、ＡＭＶＣＰ及びトリステトラプロリン配列から選択される。上記の細胞のある種の実施形態において、細胞貫通ペプチドは、ペネトラチン、トランスポルタン、ＭＡＰ、ＨＩＶＴＡＴ、Ａｎｔｐ、Ｒｅｖ、ＦＨＶコートタンパク質、ＴＰ１０及びｐＶＥＣアミノ酸配列から選択される配列を含む。上記の細胞のある種の実施形態において、非古典的分泌ドメインは、Ｇａｌｃｅｔｉｎ−１ペプチド、ガレクチン−３ペプチド、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＨＡＳＰＢ、ＨＭＧＢ１、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＩＬ−２シグナル、分泌トランスグルタミナーゼ、アネキシン−１、ＨＩＶＴＡＴ、ヘルペスＶＰ２２、チオレドキシン、ロダネーゼ及びプラスミノーゲンアクチベーターシグナル配列から選択される配列を含む。

適切な細胞の非限定的な例としては、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｃｏｓ−１、Ｃｏｓ−７、ＳＣＣＶＩＩ、ＨＥＫ２９３、ＰＣ−１２、Ｒｅｎｋａ、Ａ５４９、ＣＴ２６、ＣＨＯ、ＨｅｐＧ２、Ｊｕｒｋａｔ及びＨｅＬａ細胞、並びに本技術分野において公知で、記載されているあらゆる他の細胞が挙げられる。

前述の記載及び以下の実施例において特に記載されるもの以外に本発明を実施することができることは明らかである。本発明の多くの修正及び変更は、本明細書における教示に鑑みて可能であり、したがって添付の特許請求の範囲の範囲内である。

実施例

（例１）−本発明のバイオリアクタープラスミドの一般的構築

単離したプラスミドバックボーンと、ＲＮＡ（ｓｅｃ−ＲＮＡ）及びタンパク質（融合タンパク質）成分の両方に対するＰＣＲ増幅発現カセットとから発現ベクターを構築する。適切なバックボーンベクターの例としては、ｐＣＩ、ｐＥＴ、ｐＳＩ、ｐｃＤＮＡ、ｐＣＭＶ等から誘導されるものが挙げられる。発現ベクターは、少なくとも以下の成分、細菌における調製のための複製開始点、抗生物質選択可能マーカー、ＲＮＡ発現のためのプロモーター（Ｐｏｌ−ＩＩ又はＰｏｌ−ＩＩＩ）、プロモーター配列に適切なターミネーター配列、融合タンパク質発現のためのプロモーター及びポリＡテイル配列を含むべきである。適切なバックボーンベクターの一例は、ｐＳＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ、製品＃Ｅ１７２１）、ｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ、製品＃Ｅ１７３１）、ｐＶＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、製品＃１２７２７−０１０）及び会社構築物における他のものから誘導される本明細書に記載される各種ｐＥＧＥＮバックボーンベクターから選択される。ｐＥＧＥＮベクター、例えば、ｐＥＧＥＮ１．１、ｐＥＧＥＮ２．１、ｐＥＧＥＮ３．１及びｐＥＧＥＮ４．１は、ｐＵＣ複製開始点と、ベクターを細菌中において複製し、カナマイシンの存在下で培養することを可能にするカナマイシン耐性遺伝子とを含む。他の適切なバックボーンベクター、例えば、ｐＣＩ、ｐＳＩ、ｐｃＤＮＡ、ｐＣＭＶ等は、周知であり、商業的に入手可能である。標準熱ショック法を介してｐＥＧＥＮベクターをＸＬ１−Ｂｌｕｅコンピテント細胞に形質転換する。形質転換細胞をＬＢ−カナマイシンプレート上の成長によって選択し、個々のコロニーを用いて５ｍＬのＬＢ−カナマイシン液体培養物を播種し、３７℃で終夜成長させる。結果として生じた培養物を用いて、標準法を用いて精製プラスミドストックを調製する。

バイオリアクタープラスミドのタンパク質成分のための発現カセットを、適切なフォワード及びリバースプライマーを用いてｃＤＮＡクローンからの関連配列のＰＣＲ増幅によって調製する。プライマーは、典型的には、対象となるドメイン（単数又は複数）（例えば、ＲＮＡ結合ドメイン、細胞貫通ペプチド、非古典的分泌ドメイン、エンドソーム放出ドメイン、受容体結合ドメイン、融合ペプチド等）に対して相補的な配列、サブクローニングにおいて用いられる制限酵素に対する部位、及び各プライマーの５’末端における少なくとも４つのＧＣ塩基対を含み、制限酵素による消化を促進する。他の有用なプライマーは、対象となるドメイン（単数又は複数）（例えば、ＲＮＡ結合ドメイン、細胞貫通ペプチド、非古典的分泌ドメイン、エンドソーム放出ドメイン、受容体結合ドメイン、融合ペプチド等）に対して相補的な配列、サブクローニングにおいて用いられる制限酵素に対する部位、及び組み換えクローニング（Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎＡｄｖａｎｔａｇｅＰＣＲクローニングキット、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ＃６３９６２０）において用いるための制限部位にフランクするベクター配列の１５塩基を含むことができる。他の適切なプライマーは、タンパク質ドメイン（単数又は複数）に対して相補的な配列、サブクローニングにおいて用いられる制限酵素に対する部位、及び各プライマーの５’末端における６つのＧＣ塩基対を含む。開始コドン及び最適化Ｋｏｚａｋ翻訳開始部位を、転写産物の５’末端に対応する各プライマーに付加し、各融合タンパク質のＮ末端ドメインの翻訳を促進する。制限部位を転写産物の３’末端に対応するプライマーに付加し、ＲＮＡ結合ドメインによる送達ドメインの構築を促進する。典型的なＰＣＲ反応は、５０μＬの反応につき、１０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ９．０、５０ｍＭＫＣｌ、１．５ｍＭＭｇＣｌ_２、０．１％トリトンＸ−１００、２００μＭ各ｄＮＴＰ、１．０μＭセンスプライマー、１．０μＭアンチセンスプライマー、１００ｎｇＤＮＡ鋳型及び１．０ＵのＴａｑポリメラーゼを含む。反応を、３つの温度ステップ（９５℃で３０秒間の変性ステップ、５０℃〜６０℃で３０秒間のアニーリングステップ及び７２℃で１分間の伸長ステップ）を通して繰り返す。典型的には、繰り返しの総数は、特異的増幅反応に応じて、２０回から３５回の繰り返しの範囲に及ぶ。

ドメインは、互いに直接連結し得るか、又はアルファヘリックスリンカー若しくは他のリンカードメインをコードする配列を介して連結し得る。これらのリンカーは、起こり得る立体化学の問題を回避するために２つの機能ドメインの間の分離を提供する。各場合において、各ドメインをコードするＤＮＡの制限消化は、方向性ライゲーションのための適合性の末端を生じる。典型的な制限消化は、１０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、１００ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＭｇＣｌ_２、１ｍＭＤＴＴ、０．１〜１単位の各制限酵素及び１μｇのＤＮＡを含み、３７℃で１時間消化する。産物を１×ＴＡＥ中において２％アガロースゲルのランニング上で精製し、切り出したバンドを、ＱｉａｇｅｎのＱｉａｅｘＩＩゲル精製システムを使用して回収する。これらの発現カセットを、対象となるインサートにマッチする制限酵素を用いてｐＥＧＥＮベクターの多重クローニング部位にクローニングする。典型的なライゲーション反応は、３０ｍＭトリス（ｐＨ７．８）、１０ｍＭＭｇＣｌ_２、１０ｍＭＤＴＴ、１ｍＭＡＴＰ、１００ｎｇＤＮＡベクター、１００〜５００ｎｇＤＮＡインサート、１単位Ｔ４ＤＮＡリガーゼを含み、１６℃で終夜ライゲーションする。別の典型的な再結合反応は、１×Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ反応緩衝液、１００ｎｇの線状化プラスミド、５０〜２００ｎｇのインサート、１単位のＩｎ−ｆｕｓｉｏｎ酵素を含み、それをまず３７℃で１５分間インキュベートし、次いで５０℃で１５分間インキュベートする。このプロセスは、強力なＰｏｌＩＩプロモーター配列の下流及びｈＧＨポリＡシグナル配列の上流に発現カセットを配置する。図５〜７に示すように、ｐＥＧＥＮ１．１に対するＰｏｌＩＩプロモーターはＳＶ４０プロモーターを含み、ｐＥＧＥＮ２．１に対するＰｏｌＩＩプロモーターは、ニワトリβ−アクチンプロモーターを含み、ｐＥＧＥＮ３．１に対するＰｏｌＩＩプロモーターは、ＣＭＶプロモーターを含む。プラスミドベクターへのＰＣＲ産物の成功したクローニングは、挿入位置にフランクする部位を有する酵素を用いる制限マッピングによって、及び挿入配列に特異的なプライマーを用いるＰＣＲによって確認することができる（例えば、図１５参照）。

融合タンパク質カセットを含むベクターを用いて、以下に記載する本発明のＳｅｃ−ＲＮＡを含むベクターと組み合わせて細胞にトランスフェクトすることができる。

バイオリアクタープラスミドのＲＮＡ成分（例えばリボザイム、アンチセンス核酸、アロザイム、アプタマー、短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及び生物活性ペプチドをコードするＲＮＡ転写物が含まれる認識ＲＮＡ配列及び生物活性ＲＮＡ配列等）に対する発現カセットを、適切なフォワード及びリバースプライマーを用いたＲＮＡ発現プラスミドからの関連配列のＰＣＲ増幅によって調製する。プライマーは、生物活性ＲＮＡ配列（単数又は複数）に対して相補的な配列、サブクローニングにおいて用いられる制限酵素に対する部位、及び各プライマーの５’末端における少なくとも４つのＧＣ塩基対を含み、制限酵素による消化を促進する。他の適切なプライマーは、対象となるドメイン（単数又は複数）（例えば、ＲＮＡ結合ドメイン、細胞貫通ペプチド、非古典的分泌ドメイン、エンドソーム放出ドメイン、受容体結合ドメイン、融合ペプチド等）に対して相補的な配列、サブクローニングにおいて用いられる制限酵素に対する部位、及び組み換えクローニング（Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎＡｄｖａｎｔａｇｅＰＣＲクローニングキット、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ＃６３９６２０）において用いるための制限部位にフランクするベクター配列の１５塩基を含むことができる。具体例において、プライマーは、生物活性ＲＮＡ配列（単数又は複数）に対して相補的な配列、サブクローニングにおいて用いられる制限酵素に対する部位、及び各プライマーの５’末端における６つのＧＣ塩基対を含む。Ｓｅｃ−ＲＮＡ発現構築物を作製するために、認識ＲＮＡ配列を生物活性ＲＮＡ配列の５’末端に対応するプライマーに付加する。この発現構築物を、強力なＰｏｌ−ＩＩＩプロモーター配列（ｐＥＧＥＮ４．１に対するヒトＵ６プロモーター及びｐＥＧＥＮ５．１に対するヒトＨ１プロモーター）から下流及びＰｏｌＩＩＩポリＴ終止配列の上流にＳｅｃ−ＲＮＡ発現カセットを配置するｐＥＧＥＮ４．１構築物にサブクローニングするための適切な制限酵素によって消化する。図８を参照すること。別の場合、発現構築物を、ヒトＨ１プロモーター配列（Ｐｏｌ−ＩＩＩプロモーター）の下流及びＰｏｌＩＩＩポリＴ終止配列の上流にＳｅｃ−ＲＮＡ発現カセットを配置するｐＥＧＥＮ５．１構築物にサブクローニングする。別の場合、Ｓｅｃ−ＲＮＡ発現カセットは、それぞれＳＶ４０、β−アクチン及びＣＭＶＰｏｌ−ＩＩプロモーターの制御下でＲＮＡ発現を配置し、ヒトＧＨポリアデニル化シグナルによって終止するｐＥＧＥＮ１．１、２．１又は３．１にサブクローニングすることができる。別の場合、Ｓｅｃ−ＲＮＡ発現カセットを、ｐＥＧＥＮ６．１〜１１．１のいずれかにサブクローニングすることができる。

Ｓｅｃ−ＲＮＡ発現カセットを含むベクターを用いて、上記の本発明の融合タンパク質を含むベクターと組み合わせて細胞にトランスフェクトすることができる。

プラスミドベクターへのＰＣＲ産物の成功したクローニングは、挿入位置にフランクする部位を有する酵素を用いる制限マッピングによって、及び挿入配列に特異的なプライマーを用いるＰＣＲによって確認することができる。例えば、図１５は、制限酵素分析（１５Ｃ及びＤ）、並びにｓｅｃ−ＲＮＡプラスミド（１５Ｃ）及び融合タンパク質プラスミド（１５Ｄ及びＥ）のＰＣＲ増幅分析（１５Ｅ）を示す。図１５Ｃは、新規なＥｃｏＮＩ制限部位がＲＮＡ発現インサートと共に導入されるｐＥ３．１Ｓｅｃ−レポーターの制限酵素分析を示す。図１５Ｄ及び１５Ｅは、それぞれ、２つのｐＥ１ＴＡＴ−ＲＢＤプラスミドの制限酵素及びＰＣＲ分析を示す。図１５Ｃにおいて、Ｓｅｃ−レポーター（−）は、ｐＥ３．１Ｓｅｃ−レポータープラスミドだけを指し、Ｓｅｃ−レポーター（＋）は、ｓｅｃ−ＲＮＡ発現インサートを有するｐＥ３．１Ｓｅｃ−レポータープラスミドを指す。図１５Ｄ及び１５Ｅにおいて、ｐ１．１は、ｐＥ１．１プラスミドだけを指し、ＴＡＴ（−）は、ＲｅｖＲＮＡ結合ドメインに融合したＴＡＴ細胞貫通ペプチドを含む融合タンパク質インサートを有するｐＥ１，１プラスミドを指し、ＴＡＴ（＋）は、タンパク質ＮＲＮＡ結合ドメインに融合したＴＡＴ細胞貫通ペプチドを含む融合タンパク質インサートを有するｐＥ１．１プラスミドを指す。（挿入の部位にフランクする）ＸｃｍＩ及びＡｌｅＩ酵素による各プラスミドの制限消化は、空の親プラスミド（９９ｂｐ産物）とインサート（２４５ｂｐ産物）の成功したサブクローニングとの間を区別するアガロースゲル分析を可能にする。融合タンパク質インサートのコーディング鎖にアニールする一方のプライマーとポリＡ配列の非コード鎖にアニールする第２のプライマーとを用いる挿入部位のＰＣＲ増幅は、適切に配向されたインサートに対する４１６ｂｐの産物を産生する。プラスミドインサートの同一性を、ＤＮＡ塩基配列決定により確認した。

Ｓｅｃ−ＲＮＡ発現カセット及び融合タンパク質カセットが単一ベクター中にある本発明のそれらの実施形態において、最終サブクローニングステップは、単一プラスミドベクター（ｐＢｉｏＲプラスミド）中に融合タンパク質発現カセットをＳｅｃ−ＲＮＡ発現カセットと結合する。一実施形態において、Ｓｅｃ−ＲＮＡ発現カセット（例えば、プライマー、プロモーター、認識ＲＮＡ配列、生物活性ＲＮＡ及び終止配列）を、融合タンパク質を含むｐＥＧＥＮプラスミドにライゲーションして、完全なｐＢｉｏＲプラスミドを作製する。例えばｐＥＧＥＮ４．１（図８）又はｐＥＧＥＮ５．１（図示せず）におけるＳｅｃ−ＲＮＡにおいて示されるように、発現カセットにフランクする制限部位をプラスミドからインサートを放出し、次いで、それを１×ＴＡＥ中において２％アガロースゲルのランニング上で精製し、切り出したバンドを、例えばＱｉａｇｅｎのＱｉａｅｘＩＩゲル精製システムを使用して回収する。融合タンパク質に対する発現カセットを含むプラスミドを、Ｓｅｃ−ｓｈＲＮＡ発現カセットにフランクする同じ制限酵素によって消化する。次いで、Ｓｅｃ−ＲＮＡ発現カセットを、融合タンパク質を含むプラスミドにライゲーションして、完全なｐＢｉｏＲプラスミドを作製する。

（例２）−ＣＰＰ−ＲＢＤ融合タンパク質によって送達されるＳｅｃ−ｓｈＲＮＡによるバイオリアクタープラスミドｐＢｉｏＲ（１）の構築

ここで、バイオリアクター融合タンパク質及び分泌ｓｈＲＮＡ（Ｓｅｃ−ｓｈＲＮＡ）を発現し得る発現ベクターについて記載する。表Ｉ及び表ＶＩＩに列挙される遺伝子標的のいずれかをターゲッティングするＳｅｃ−ｓｈＲＮＡ、並びにあらゆる他の標的ｍＲＮＡの産生及び送達を、２つの親プラスミドから構築されるプラスミドｐＢｉｏＲ（１）によって達成する。第１親プラスミド（ｐＥＧＥＮＦＰ）は、融合タンパク質を発現し、例１に記載されるプラスミド及び方法を用いて、表ＩＩＩからのＲＮＡ結合ドメイン配列と表ＩＶからの細胞貫通ペプチド配列とを含む融合タンパク質カセットを表ＶＩＩＩからのｐＥＧＥＮベクターの多重クローニング部位にクローニングすることによって構築される。一実施形態において、このプロセスは、強力なＰｏｌＩＩプロモーター配列（ニワトリβ−アクチンプロモーター）の下流及びｈＧＨポリＡシグナル配列の上流に融合タンパク質カセットを配置する。アルファヘリックスリンカードメインにより又はなしで、ＲＮＡ結合ドメイン及び細胞貫通ペプチド融合タンパク質を構築することができる。このベクターを、ｐＥＧＥＮＳＲベクターと組み合わせてトランスフェクトすることができる。

第２親プラスミド（ｐＥＧＥＮＳＲ）は、分泌ＲＮＡを発現し、例１に記載されるプラスミド及び方法を用いて、表ＩＩからのＲＮＡ認識エレメントと表Ｉからの生物活性ＲＮＡとを含む分泌ＲＮＡカセットをｐＥＧＥＮ４．１又はｐＥＧＥＮ５．１ベクター（表ＶＩＩＩ参照）の多重クローニング部位にクローニングすることによって構築される。このプロセスは、ＰｏｌＩＩＩプロモーター（ｐＥＧＥＮ４．１に対するヒトＵ６プロモーター、ｐＥＧＥＮ５．１に対するヒトＨ１プロモーター）からの下流及びＰｏｌＩＩＩポリＴ終止配列の上流にＳｅｃ−ＲＮＡカセットを配置する。このベクターをｐＥＧＥＮＦＰベクターと組み合わせて細胞にトランスフェクトすることができる。別の場合、このＳｅｃ−ｓｈＲＮＡ（例えば、プライマー、プロモーター、表ＩＩからの認識ＲＮＡヘアピン、ｓｈＲＮＡ及びＰｏｌＩＩＩポリＴ終止配列）に対する発現カセットを、適切な制限酵素によりｐＥＧＥＮＳＲプラスミドから放出し、融合タンパク質を含むｐＥＧＥＮＦＰベクターにライゲーションして、最終プラスミドｐＢｉｏＲ（１）を作製する。

各種ＣＰＰ−ＲＢＤ融合タンパク質によって送達される各種Ｓｅｃ−ｓｈＲＮＡの具体例は、表Ｉに示され、更に、ＵＳＳＮ６１／１６０２８７及び６１／１６０２８８（例１〜２０）に記載されており、それらの両方は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

また、異なる生物活性ＲＮＡ配列、例えば、アンチセンス、リボザイム、アプタマー、アロザイム、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又は本明細書に記載される他の生物学的活性分子のいずれかを用いて、記載されるｐＥＧＥＮＳＲベクター中においてｓｈＲＮＡ配列を置換することもできる。

（例３）−ＣＰＰ−ＮＣＳ−ＲＢＤ融合タンパク質によって送達されるＳｅｃ−ｓｈＲＮＡによるバイオリアクタープラスミドｐＢｉｏＲ（２）の構築。

表Ｉ及び表ＶＩＩからの遺伝子標的並びにあらゆる他の遺伝子標的のいずれかをターゲッティングするＳｅｃ−ｓｈＲＮＡの送達をも、例１及び２に記載される同じ方法を用いて構築されるプラスミドｐＢｉｏＲ（２）によって達成する。ｐＢｉｏＲ２は、表ＩＩＩからのＲＮＡ結合ドメインと表ＩＶからの細胞貫通ペプチドとに融合した表Ｖからの非古典的分泌ドメインを含む融合タンパク質をコードする。この融合タンパク質を、アルファヘリックスリンカー又は他のリンカードメインにより又はなしで構築する。融合タンパク質及びＳｅｃ−ｓｈＲＮＡに対する発現カセットを、例１及び２に記載される方法を用いて表ＶＩＩＩからのｐＥＧＥＮプラスミドにライゲーションする。各種ＣＰＰ−ＮＣＳ−ＲＢＤ融合タンパク質によって送達される各種Ｓｅｃ−ｓｈＲＮＡの具体例は、表Ｉに示され、更に、ＵＳＳＮ６１／１６０２８７及び６１／１６０２８８（例２１〜２６）に記載されており、それらの両方は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

（例４）−ＣＰＰ−ＮＣＳ−ＲＢＤ融合タンパク質によって送達されるＳｅｃ−ｓｈＲＮＡによるバイオリアクタープラスミドｐＢｉｏＲ（３）の構築。

表Ｉ及び表ＶＩＩからの遺伝子標的並びにあらゆる他の遺伝子標的のいずれかをターゲッティングするＳｅｃ−ｓｈＲＮＡの送達をも、プラスミドｐＢｉｏＲ（３）によって達成する。プラスミドｐＢｉｏＲ（３）は、ｐＢｉｏＲ（１）の構築について例１に記載される同じ方法を用いて構築され、バイオリアクター細胞のダイサータンパク質をターゲッティングするｓｈＲＮＡ分子をコードする更なる発現カセットをそれが含むことを以外はｐＢｉｏＲ（２）と同様である。ダイサーをターゲッティングするｓｈＲＮＡは、以下の配列、ＴＴＧＧＣＴＴＣＣＴＣＣＴＧＧＴＴＡＴＧＴＴＣＡＡＧＡＧＡＣＡＴＡＡＣＣＡＧＧＡＧＧＡＡＧＣＣＡＡを有する。融合タンパク質及びＳｅｃ−ｓｈＲＮＡに対する発現カセットを、例１及び２に記載される方法を用いて表ＶＩＩＩからのｐＥＧＥＮプラスミドにライゲーションする。ダイサーをターゲッティングするｓｈＲＮＡは、ヒトＨ１プロモーターから発現し、Ｐｏｌ−ＩＩＩポリＴターミネーターにより終止する。ダイサータンパク質をターゲッティングするｓｈＲＮＡ分子をコードする更なるカセットを有するプラスミドの一例を図１３に示す。

（例５）−ＮＣＳ−ＲＢＤ−ＣＰＰ融合タンパク質によって送達されるＳｅｃ−ｓｈＲＮＡによるバイオリアクタープラスミドｐＢｉｏＲ（１４）の構築。

表Ｉ及び表ＶＩＩからの遺伝子標的並びにあらゆる他の遺伝子標的のいずれかをターゲッティングするＳｅｃ−ｓｈＲＮＡの送達を、プラスミドｐＢｉｏＲ（１４）によって達成する。プラスミドｐＢｉｏＲ（１４）は、ｐＢｉｏＲ（１）の構築について例１及び２に記載される同じ方法を用いて構築され、Ｓｅｃ−ｓｈＲＮＡに対する発現カセットの位置以外はｐＢｉｏＲ（２）と同様である。Ｓｅｃ−ｓｈＲＮＡは、表ＩＩＩからのＲＮＡ結合ドメインと表ＩＶからの細胞貫通ペプチドとに融合した表Ｖからの非古典的分泌ドメインを含む融合タンパク質を伴う。このプラスミドにおいて、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）又は融合タンパク質に対するコード配列の中のいずれかに配置した人工イントロンの中で、Ｓｅｃ−ｓｈＲＮＡをコードする。適切な制限部位を用いて、人工イントロンのスプライスドナー及びスプライスアクセプター部位の間で、Ｓｅｃ−ｓｈＲＮＡ配列をサブクローニングする。この多機能性転写産物は、ニワトリβ−アクチンプロモーターから発現し、ヒト成長ホルモンポリアデニル化シグナルによって終止する。この種の構築を有するプラスミドの例を図１１及び１２に示す。

（例６）−ＮＣＳ−ＲＢＤ−ＣＰＰ融合タンパク質によって送達されるＳｅｃ−リボザイムによるバイオリアクタープラスミドｐＢｉｏＲ（１５）の構築。

表Ｉ及び表ＶＩＩにおいて列挙される遺伝子標的並びにあらゆる他の遺伝子標的のいずれかをターゲッティングするＳｅｃ−リボザイムの送達を、表ＩＩＩからのＲＮＡ結合ドメインと表ＩＶからの細胞貫通ペプチドとに融合した表Ｖからの非古典的分泌ドメインを含む融合タンパク質をコードするｐＢｉｏＲ（１）の構築について例１及び２に記載される同じ方法を用いて構築したプラスミドｐＢｉｏＲ（１５）によって達成する。この特定の融合タンパク質を伴うＳｅｃ−リボザイムは、表ＩＩからのＲＮＡ認識エレメントと、表Ｉ及び表ＶＩＩにおいて列挙される遺伝子標的のｍＲＮＡ転写産物のいずれかをターゲッティングするＲＮＡリボザイムとを含む。融合タンパク質及びＳｅｃ−リボザイムに対する発現カセットをｐＥＧＥＮ２．１プラスミドにライゲーションする。融合タンパク質は、ニワトリβ−アクチンプロモーターから発現し、ヒト成長ホルモンポリアデニル化シグナルにより終止し、Ｓｅｃ−リボザイムは、ヒトＵ６プロモーターから発現し、Ｐｏｌ−ＩＩＩポリＴターミネーターにより終止する。Ｓｅｃ−リボザイムＲＮＡ及びＣＰＰ−ＮＣＳ−ＲＢＤ融合タンパク質に対する発現ベクターの具体例は、ＵＳＳＮ６１／１６０２８７及び６１／１６０２８８（例３９及び４０）に記載されており、それらの両方は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

（例７）−ＮＣＳ−ＲＢＤ−ＣＰＰ融合タンパク質によって送達されるＳｅｃ−アンチセンスＲＮＡ（Ｓｅｃ−ａｓＲＮＡ）によるバイオリアクタープラスミドｐＢｉｏＲ（１６）の構築。

表Ｉ及び表ＶＩにおいて列挙される遺伝子標的並びにあらゆる他の遺伝子標的のいずれかをターゲッティングするＳｅｃ−ａｓＲＮＡの送達を、表ＩＩＩからのＲＮＡ結合ドメインと表ＩＶからの細胞貫通ペプチドとに融合した表Ｖからの非古典的分泌ドメインを含む融合タンパク質をコードするｐＢｉｏＲ（１）の構築について例１及び２に記載される同じ方法を用いて構築したプラスミドｐＢｉｏＲ（１６）によって達成する。この特定の融合タンパク質を伴うＳｅｃ−ａｓＲＮＡは、表ＩＩからのＲＮＡ認識エレメントと、表Ｉ及び表ＶＩＩにおいて列挙される遺伝子標的のｍＲＮＡ転写産物のいずれかに対して相補的なアンチセンスＲＮＡとを含む。融合タンパク質に対する発現カセットは、ｐＥＧＥＮ２．１プラスミドにライゲーションされ、ニワトリβ−アクチンプロモーターから発現し、ヒト成長ホルモンポリアデニル化シグナルにより終止する。Ｓｅｃ−ａｓＲＮＡに対する発現カセットは、ｐＥＧＥＮ１．１プラスミドにライゲーションされ、ＳＶ４０プロモーターから発現し、ヒト成長ホルモンポリアデニル化シグナルによって終止する。このＳｅｃ−ａｓＲＮＡ（プライマー、Ｕ６プロモーター、表ＩＩからの認識ＲＮＡヘアピン、ａｓＲＮＡ及びＰｏｌＩＩＩポリＴ終止配列）に対する発現カセットを、例２に記載したように、適切な制限酵素によりｐＥＧＥＮ１．１プラスミドから放出し、融合タンパク質を含むｐＥＧＥＮ２．１／ＦＰベクターにライゲーションして、最終プラスミドｐＢｉｏＲ（１６）を作製する。Ｓｅｃ−ａｓＲＮＡ及びＣＰＰ−ＮＣＳ−ＲＢＤ融合タンパク質に対する発現ベクターの具体例は、ＵＳＳＮ６１／１６０２８７及び６１／１６０２８８（例４１及び４２）に記載されており、それらの両方は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

（例８）−ＮＣＳ−ＲＢＤ−ＣＰＰ融合タンパク質によって送達されるＳｅｃ−アンチセンスＲＮＡ（Ｓｅｃ−ａｓＲＮＡ）によるバイオリアクタープラスミドｐＢｉｏＲ（１７）の構築。

表Ｉ及び表ＶＩＩからの遺伝子標的並びにあらゆる他の遺伝子標的のいずれかをターゲッティングするＳｅｃ−ａｓＲＮＡの送達を、表ＩＩＩからのＲＮＡ結合ドメインと表ＩＶからの細胞貫通ペプチドとに融合した表Ｖからの非古典的分泌ドメインを含む融合タンパク質をコードするｐＢｉｏＲ（１）の構築について例１及び２に記載される同じ方法を用いて構築したプラスミドｐＢｉｏＲ（１７）によって達成する。この特定の融合タンパク質を伴うＳｅｃ−ａｓＲＮＡは、表ＩＩからのＲＮＡ認識エレメントと、表Ｉ及び表ＶＩＩにおいて列挙される遺伝子標的のｍＲＮＡ転写産物のいずれかに対して相補的なアンチセンスＲＮＡとを含む。融合タンパク質及びＳｅｃ−ａｓＲＮＡに対する発現カセットは、ｐＥＧＥＮ２．１プラスミドにライゲーションされ、ニワトリβ−アクチンプロモーターから発現し、ヒト成長ホルモンポリアデニル化シグナルにより終止する。このプラスミドにおいて、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）又は融合タンパク質に対するコード配列の中のいずれかに配置した人工イントロンの中で、Ｓｅｃ−ａｓＲＮＡをコードする。この多機能性転写産物は、ニワトリβ−アクチンプロモーターから発現し、ヒト成長ホルモンポリアデニル化シグナルによって終止する。

（例９）−ＮＣＳ−ＲＢＤ融合タンパク質によって分泌されるＳｅｃ−アプタマーによるバイオリアクタープラスミドｐＢｉｏＲ（１８）の構築。

表Ｉ及び表ＶＩＩにおいて列挙される細胞外受容体タンパク質並びにあらゆる他の細胞外受容体タンパク質のいずれかをターゲッティングするＳｅｃ−アプタマーの送達を、表ＩＩＩからのＲＮＡ結合ドメインに融合した表Ｖからの非古典的分泌ドメインを含む融合タンパク質をコードするｐＢｉｏＲ（１）の構築について例１及び２に記載される同じ方法を用いて構築したプラスミドｐＢｉｏＲ（１８）によって達成する。この特定の融合タンパク質を伴うＳｅｃ−アプタマーは、表ＩＩからのＲＮＡ認識エレメントと、表Ｉ及び表ＶＩＩにおいて列挙される細胞外受容体タンパク質のいずれかをターゲッティングするアプタマー配列とを含む。融合タンパク質及びＳｅｃ−アプタマーに対する発現カセットをｐＥＧＥＮ２．１プラスミドにライゲーションする。融合タンパク質は、ニワトリβ−アクチンプロモーターから発現し、ヒト成長ホルモンポリアデニル化シグナルにより終止し、Ｓｅｃ−アプタマーは、ヒトＵ６プロモーターから発現し、Ｐｏｌ−ＩＩＩポリＴターミネーターにより終止する。

Ｓｅｃ−アプタマー及びＮＣＳ−ＲＢＤ融合タンパク質に対する発現ベクターの具体例は、ＵＳＳＮ６１／１６０２８７及び６１／１６０２８８（例４３及び４４）に記載されており、それらの両方は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

（例１０）−ＮＣＳ−ＲＢＤ−ＣＰＰ融合タンパク質によって分泌されるＳｅｃ−アプタマーによるバイオリアクタープラスミドｐＢｉｏＲ（１９）の構築

表Ｉ及び表ＶＩＩにおいて列挙される細胞タンパク質並びにあらゆる他の細胞タンパク質のいずれかをターゲッティングするＳｅｃ−アプタマーの送達を、表ＩＩＩからのＲＮＡ結合ドメインと表ＩＶからの細胞貫通ペプチドとに融合した表Ｖからの非古典的分泌ドメインを含む融合タンパク質をコードするｐＢｉｏＲ（１）の構築について例１及び２に記載される同じ方法を用いて構築したプラスミドｐＢｉｏＲ（１９）によって達成する。この特定の融合タンパク質を伴うＳｅｃ−アプタマーは、表ＩＩからのＲＮＡ認識エレメントと、表Ｉ及び表ＶＩＩにおいて列挙される細胞内タンパク質のいずれかをターゲッティングするアプタマー配列とを含む。融合タンパク質及びＳｅｃ−アプタマーを同じ方法で構築し、ｐＢｉｏＲ（１）について例１及び２において記載したものと同じプロモーターから発現させる。

Ｓｅｃ−アプタマー及びＣＰＰ−ＮＣＳ−ＲＢＤ融合タンパク質に対する発現ベクターの具体例は、ＵＳＳＮ６１／１６０２８７及び６１／１６０２８８（例４５及び４６）に記載されており、それらの両方は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

（例１１）−ポリマー仲介トランスフェクションを用いたＨｅＬａ培養細胞へのバイオリアクタープラスミドの投与。

インビトロで、レシピエント細胞系、例えばＨｅＬａ細胞にｐＥＧＥＮＦＰ及びｐＥＧＥＮＳＲを同時トランスフェクトする（例２参照）ことによってバイオリアクター細胞を作製する。ＨｅＬａ細胞を、ポリマー送達剤によるトランスフェクションのための調製において８０％コンフルエントの密度にＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清（２ｍＬの総体積）中において６ウェルプレート中において培養する。成長培地を細胞から除去し、３７℃に予熱した１ｍＬのＤＭＥＭのみ（無血清）で置き換える。室温で２０分間のＤＭＥＭ中におけるインキュベーションによって送達試薬とｐＢｉｏＲプラスミドとの間でトランスフェクション複合体を形成する（各適用について最適化したＤＮＡ及び試薬濃度）。トランスフェクション複合体を、各培養物への滴下によってＨｅＬａ細胞に加え、３７℃のインキュベーターに戻す。５時間のインキュベーション後、ＤＭＥＭ＋２０％血清をトランスフェクション培地に加え、１０％の終濃度の血清を最終的な体積２ｍＬで生成する。一過性にトランスフェクトした細胞を、標的細胞に加えることによってバイオリアクターとしての使用のために準備する。

（例１２）−ポリマー仲介トランスフェクションを用いた培養細胞へのバイオリアクタープラスミドの投与。

インビトロでレシピエント細胞系にｐＢｉｏＲプラスミド（本出願のどこか他の場所において、及び前の実施例において記載したいずれかのプラスミド）をトランスフェクトすることによってバイオリアクター細胞を作製する。一過性にトランスフェクトしたバイオリアクター細胞の作製のためのトランスフェクションプロトコールは、ＨｅＬａ細胞に基づいたバイオリアクターの作製について例１１に記載されたものと同様である。適切なレシピエント培養細胞の非限定的な例としては、Ａ５４９細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、Ｒｅｎｋａ細胞、ＣＴ２６細胞、ＰＣ−１２細胞、Ｃｏｓ−１細胞、Ｃｏｓ−７細胞及びＣＨＯ細胞が挙げられる。例１１に記載される方法を、これらの培養細胞と、他の公知の樹立細胞系とに適用することができる。

（例１３）−エレクトロポレーション仲介トランスフェクションを用いたＨｅＬａ培養細胞へのバイオリアクタープラスミドの投与。

バイオリアクター細胞を、エレクトロポレーションによるｐＢｉｏＲプラスミドによるトランスフェクションによってＨｅＬａレシピエント細胞から産生する。ＨｅＬａ細胞を、エレクトロポレーションのための調製において８０％コンフルエントの密度にＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎仔血清（１５ｍＬの総体積）中において１００ｍｍ培養皿中において培養する。細胞を、トリプシンによりウェルから放出し、遠心分離（４℃で５分間、５００×ｇ）によって回収する。細胞ペレットを成長培地中において再懸濁し、血球計数器を用いて細胞密度を測定し、最終的な体積を成長培地によって調整し、５×１０^６細胞／ｍＬを生じる。細胞を、２０ｕｇのｐＢｉｏＲプラスミドと共にエレクトロポレーションキュベットに移し、電極間に配置する。エレクロトポレーターを２６０Ｖ（静電容量＝１０００μＦ、無限内部抵抗）で放電し、キュベットを２分間静止させる。次いで、エレクトロポレートした細胞を、成長培地によるキュベットの２回の洗浄処理と共に、培養皿に移す。細胞を、５％のＣＯ_２下で３７℃で４８時間成長させる。

バイオリアクター細胞を、ＨｅＬａ細胞に基づいたバイオリアクターの作製について上記した通りのｐＢｉｏＲプラスミドによるトランスフェクションによって他のレシピエント細胞から産生する。適切なレシピエント培養細胞の非限定的な例としては、Ａ５４９細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、Ｒｅｎｋａ細胞、ＣＴ２６細胞、ＰＣ−１２細胞、Ｃｏｓ−１細胞、Ｃｏｓ−７細胞及びＣＨＯ細胞が挙げられる。バイオリアクター細胞の機能を実証するアッセイは、例１６において記載される通りである。

（例１４）−ウイルス仲介トランスフェクションを用いたＨｅＬａ培養細胞へのバイオリアクタープラスミドの投与。

単離したプラスミドバックボーン、ウイルスの構造的及び非構造的成分に対する発現カセット、及び生物活性ＲＮＡに対する発現カセットからウイルスベクターを構築する。発現カセットのＰＣＲ増幅、プラスミドバックボーンへの発現カセットのサブクローニング、結果として生じるウイルス産生ベクターの増幅及び単離、並びにプラスミド配列の後続の確認を、全て例１に記載したように実施する。幾つかのＤＮＡウイルス発現カセット、例えば、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルス（２〜３、７、１１、１９、２１）並びに単純ヘルペスウイルス（５、１４〜１５、１８）又はＲＮＡウイルス発現カセット、例えば、レンチウイルス（６、２０、２２、２４）、シンドビスウイルス（９）、マウス白血病ウイルス（１０、１２〜１３、１６）又はフォーミーウイルス（８、１７）、及び本出願のどこか他の場所において、及び前の実施例において記載した生物活性ＲＮＡ分子のいずれかの内の１つからウイルスベクターを構築する。ウイルスごと、ウイルスコートタンパク質及び融合タンパク質をコードする構造遺伝子を、ｐＶｉｒ１を作製するＰｏｌ−ＩＩプロモーター配列からの発現のためのｐＥＧＥＮバックボーンプラスミドのいずれかにサブクローニングする。それとは別に、ポリメラーゼ及びアクセサリータンパク質をコードする非構造遺伝子を、生物活性ＲＮＡ配列及び融合タンパク質配列と結合させ、ｐＶｉｒ２を作製するＰｏｌ−ＩＩプロモーター配列からの発現のための第２ｐＥＧＥＮプラスミドにサブクローニングする。プラスミドｐＶｉｒ１及びｐＶｉｒ２をレシピエント細胞に同時トランスフェクトして、ウイルス産生細胞を作製する。次いで、バイオリアクター細胞へのバイオリアクター発現カセットの投与における使用のためにウイルス粒子を精製し、濃縮する。

（例１５）−ポリマー仲介トランスフェクション及び安定な細胞系の作製を用いたＨｅＬａ培養細胞へのバイオリアクタープラスミドの投与。

バイオリアクター細胞を、例１１〜１４に記載したようにｐＢｉｏＲプラスミドによるトランスフェクションによってＨｅＬａレシピエント細胞から産生する。レシピエント細胞ゲノムへのｐＢｉｏＲプラスミドの安定な組み込みを、選択培地中における拡大成長によって達成する。安定な組み込みのためのｐＢｉｏＲプラスミドは、ｐＵＣ開始点及びカナマイシン耐性遺伝子の他に、ピューロマイシン耐性遺伝子又はＧ４１８／ネオマイシン耐性遺伝子を含む。新しくトランスフェクトした細胞を、完全な非選択培地中において４８時間回収することができる。これらの細胞を、次いで選択培地に移し、３日ごとに培地交換を行いながら５％のＣＯ２下で３７℃で成長させる。安定に組み込まれたプラスミドを有する細胞の個々の単離物を個々のウェルに移し、増殖させる。次いで、これらの増殖した細胞系を最適バイオリアクター活性についてアッセイする。バイオリアクター細胞の機能を実証するアッセイは、例１６に記載される通りである。

（例１６）−細胞培養におけるＲＮＡ−タンパク質複合体の産生及び分泌を確認するためのアッセイ

例１１〜１４に記載した方法を用いてｐＢｉｏＲ発現ベクター又はヌルベクターを細胞にトランスフェクトする。バイオリアクター細胞の成功した作製を、以下の、（１）融合タンパク質の産生、（２）Ｓｅｃ−ＲＮＡの産生、（３）融合タンパク質によるＳｅｃ−ＲＮＡの結合、及び（４）ＲＮＡ−タンパク質複合体の成功した分泌、の１つ又は複数を確認するアッセイによって確認する。融合タンパク質の産生を、融合タンパク質をコードするプラスミド由来ｍＲＮＡ転写産物を検出するＲＴ−ＰＣＲに基づいたアッセイと、融合タンパク質自体を検出する抗体に基づいたアッセイとを通して確認することができる。融合タンパク質を検出する目的のために、商業的に入手可能な抗体によって認識される短い「タンパク質標識」を融合タンパク質の配列中に含めることができる。これらのタンパク質標識を、バイオリアクター細胞の機能を確認するために使用するが、必ずしも機能的バイオリアクター融合タンパク質中に含めるというわけではない。

プラスミド由来ｍＲＮＡ転写産物を検出するため、製造業者のプロトコールに従ってＴｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、製品＃Ｔ９４２４）を用いて、ｐＢｉｏＲトランスフェクト、ヌルベクタートランスフェクト及び非トランスフェクト細胞、即ち、ＨｅＬａ細胞、又は本明細書に記載され、それ以外の場合、本技術分野において公知の他の細胞のいずれかからトータルＲＮＡを調製する。ｃＤＮＡライブラリーを、ポリＴプライマーを用いてトータルＲＮＡから調製し、ＰＣＲ増幅のための鋳型として用いる。各々が異なるサイズの産物を産生する２つの別々の増幅反応のためのプライマー（（１）β−アクチン又はＧＡＰＤＨ等の内部対照遺伝子に由来する配列を増幅するプライマー、及び（２）融合タンパク質をコードするｍＲＮＡに特異的な配列を増幅するプライマー）を、ＰＣＲ反応中に含める。産物を、１×ＴＡＥ中における２％アガロースゲルのランニング上、又は１×ＴＢＥ中における１０％アクリルアミドゲルのランニング上で分解する。臭化エチジウムで染色し、３０２ｎｍのＵＶ光の照射を行うことによって、産物を非トランスフェクト細胞（陰性対照）、ヌルベクター（融合タンパク質のないバックボーンベクター）をトランスフェクトした細胞、及び潜在的なバイオリアクター（即ち、ｐＢｉｏＲをトランスフェクトした細胞）について比較する。非トランスフェクト対照細胞は、内部対照遺伝子に対する単一のＰＣＲ産物を有するが、成功したバイオリアクターは、内部対照遺伝子と融合タンパク質をコードする転写産物との両方に対する産物を有する。

融合タンパク質の直接検出を、ｐＢｉｏＲトランスフェクト、ヌルベクタートランスフェクト及び非トランスフェクト細胞、並びにそれらの細胞が成長する培地からの総タンパク質の回収によって達成する。総タンパク質をアセトン沈殿によって各試料から濃縮し、濃縮タンパク質をＥＬＩＳＡ分析用ネイティブ緩衝液又はウエスタンブロット分析用変性緩衝液のいずれかの中で再懸濁する。各アッセイは、標準法と、融合タンパク質中に存在する内部対照遺伝子（β−アクチン又はＧＡＰＤＨ）及びタンパク質標識に特異的な抗体とを利用する。考察されるように、タンパク質標識を、バイオリアクター細胞の機能を確認するための好都合な手段として融合タンパク質中に含める。非トランスフェクト及びヌルベクタートランスフェクト対照細胞は、内部対照遺伝子に対して検出される単一タンパク質を有するが、成功したバイオリアクターは、内部対照タンパク質及び融合タンパク質の両方を有する。

Ｓｅｃ−ＲＮＡの成功した産生は、ＲＮＡの転写と核からのその転写産物の搬出との両方を含む。プラスミド由来Ｓｅｃ−ＲＮＡ分子の産生を示すためにＲＴ−ＰＣＲアッセイを用い、細胞質中におけるＲＮＡの蓄積を実証するために細胞分画を用いる。製造業者のプロトコールに従って、ＰＡＲＩＳＲＮＡ単離キット（Ａｍｂｉｏｎ、製品＃１９２１）によって細胞分画を達成する。ｃＤＮＡライブラリーを、ランダムヘキサマー非特異的プライマーを用いて分画ＲＮＡから調製し、ＰＣＲ増幅のための鋳型として用いる。各々が異なるサイズの産物を産生する２つの別々の増幅反応のためのプライマー（（１）β−アクチン又はＧＡＰＤＨ等の内部対照遺伝子に由来する配列を増幅するプライマー、及び（２）Ｓｅｃ−ＲＮＡに特異的な配列を増幅するプライマー）を、ＰＣＲ反応中に含める。産物を、１×ＴＡＥ中における２％アガロースゲルのランニング上、又は１×ＴＢＥ中における１０％アクリルアミドゲルのランニング上で分解する。臭化エチジウムで染色し、３０２ｎｍのＵＶ光の照射を行うことによって、産物をヌルベクタートランスフェクト及び非トランスフェクト細胞（陰性対照）並びに潜在的なバイオリアクターについて比較する。ヌルベクタートランスフェクト及び非トランスフェクト対照細胞は、内部対照遺伝子に対する単一のＰＣＲ産物を有するが、成功したバイオリアクターは、内部対照遺伝子とＳｅｃ−ＲＮＡとの両方に対する産物を有する。

図１６は、Ｓｅｃ−ＲＮＡ及び融合タンパク質の発現を確認するための実験の結果を示す。図１６Ａに示される分泌ＲＮＡレポーター転写産物分析のために、ＣＴ２６細胞にｐＥ３．１Ｓｅｃ−レポーター（図１５Ａ）をトランスフェクトした。４８時間後、製造業者の推奨プロトコールに従ってＱｕｉｇｅｎのＲＮＥａｓｙキットを用いてトータル細胞ＲＮＡを非トランスフェクト対照細胞及びトランスフェクトバイオリアクター細胞から回収し、精製ＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲを用いて増幅し、３％低融解アガロースゲル（１×ＴＡＥ）上において分離した。ｓｅｃ−ＲＮＡに対するＲＴ−ＰＣＲ反応は、１８ＳｒＲＮＡ（内部対照、１９６ｂｐ産物）と分泌ＲＮＡレポーター（１００ｂｐ産物）との両方を増幅するためのプローブ及びプライマーを含んだ。非トランスフェクト対照細胞（「Ｕ」）は、１８ＳｒＲＮＡ内部対照（１８Ｓ）だけを示すが、トランスフェクト細胞は、１８ＳｒＲＮＡ産物と、プラスミドだけに対応する親レポーターＲＮＡ産物（「Ｒ」）又はプラスミド及びＳｅｃ−ＲＮＡ配列インサートに対応する分泌レポーターＲＮＡ産物（「ＳＲ」）との両方を示す。図１６Ｂは、ＣＴ２６細胞にバイオリアクター融合タンパク質を発現するプラスミドをトランスフェクトした融合タンパク質発現分析を示す。４８時間後、細胞を、ＴＥＮＴ緩衝液中において採取し、５分間沸騰させ、１６，０００×Ｇで１５分間スピンして細胞デブリを除去し、細胞溶解物（総タンパク質）の回収を可能にした。非トランスフェクト細胞、並びにｐＥ３．１Ｓｅｃ−レポーター及びｐＥ１．１ＴＡＴ＋（タンパク質ＮＲＮＡ結合ドメイン及び６×ヒスチジンエピトープ標識に融合したＴＡＴ）又はｐＥ２．１ＴＡＴ＋（タンパク質ＮＲＮＡ結合ドメイン及び６×ヒスチジンエピトープ標識に融合したＴＡＴ）のいずれかをトランスフェクトした細胞からの細胞溶解物のアリコートを、ブロッティング抗体に対する陽性対照タンパク質と共にＰＶＤＦ膜にスポットした。ブロットを、色素形成基質によって発生させ、イメージドキュメンテーションセンターによって記録した。

融合タンパク質によるＳｅｃ−ＲＮＡ分子の結合を、上記記載のペプチド標識を介したＲＮＡ−タンパク質複合体の免疫沈降によって実証する。内部対照遺伝子（β−アクチン又はＧＡＰＤＨ）又は融合タンパク質中に存在するタンパク質標識に特異的な抗体をプロテインＡセファロース（ＰＡＳ）ビーズ又はプロテインＧセファロース（ＰＧＳ）ビーズに結合する。ビーズを細胞溶解緩衝液中において再水和し、抗体を、４℃で終夜、ビーズによるインキュベーションによって結合する。非特異的抗体（しばしば、免疫前血清）を免疫沈降アッセイのための陰性対照として用いる。抗体結合ビーズを溶液からスピンし（１５００×ｇで５分間）、上清を除去し、抗体結合ビーズを細胞溶解緩衝液によって洗浄する。タンパク質を、ｐＢｉｏＲトランスフェクト、ヌルベクタートランスフェクト及び非トランスフェクト細胞、並びにそれらの細胞が成長する培地から調製する。その厳密な組成物を特異的な精製に調整するＲＮＡ−タンパク質複合体を保存するために、タンパク質をネイティブ細胞溶解緩衝液中において回収する。典型的な細胞溶解緩衝液組成は、２０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ及び０．０５％ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０である。タンパク質抽出物を抗体結合ビーズに加え、反応ごとに最適化した条件下で免疫沈降を行う。典型的な沈殿物を室温で２〜４時間インキュベートする。単離したＲＮＡ−タンパク質複合体を溶液からスピンし、上清を沈殿投入物として回収する。ビーズを繰り返し洗浄して、非特異的に結合したタンパク質を除去するが、洗浄の総回数は、沈殿ごとに実験的に決定する。単離した複合体を、抗体上に存在する結合部位に対して競合する融合タンパク質標識のものにマッチするペプチドを有するビーズから溶出する。次いで、単離したＲＮＡを、ノーザンブロットによって、又は上記の通りのＲＴ−ＰＣＲによって検出する。

ＲＮＡ−タンパク質複合体の成功した分泌を、細胞外マトリックス、又は培養細胞の場合は培地中におけるＳｅｃ−ＲＮＡの検出によって確認する。無傷のＲＮＡ−タンパク質複合体を、上記のように免疫沈降を介して培地から単離することができるか、又はトータルＲＮＡを、製造業者のプロトコールに従ってＴｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、製品＃Ｔ９４２４）を用いて調製することができる。Ｓｅｃ−ＲＮＡを、ノーザンブロットによって、又は上記の通りのＲＴ−ＰＣＲによって検出する。

図１７は、バイオリアクター細胞からのＲＮＡ−タンパク質複合体の分泌を確認するための実験の結果を示す。非トランスフェクト対照ＣＴ２６細胞、並びにｐＥ３．１Ｓｅｃ−レポーターと分泌ＲＮＡ及びバイオリアクター融合タンパク質を発現するｐＥ１ＴＡＴ−ＲＢＤプラスミドとをトランスフェクトしたＣＴ２６細胞に由来するトータル細胞ＲＮＡを、製造業者の推奨プロトコールに従ってＱｉａｇｅｎのＲＮＥａｓｙキットを用いて４８時間のトランスフェクションの後で回収した。また、細胞培養培地からＲＮＡをも回収し、ＲＮＡｅａｓｙキットを用いて精製した。精製ＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ増幅反応のための鋳型として用い、増幅産物を、ＤＮＡサイズ標準品と共に３％低融解アガロースゲル（１×ＴＡＥ）上で分離した。ＲＴ−ＰＣＲを、１８ＳｒＲＮＡ（内部対照）及び分泌ＲＮＡレポーターに対するプローブ及びプライマーによって実施した。図１７Ａ及び１７Ｂは、ｐＥ３．１Ｓｅｃ−レポーター及びｐＥ１．１ＴＡＴ（＋）（適切なＲＢＤに融合したＴＡＴ）又はｐＥ１．１ＴＡＴ（−）（陰性対照ＲＢＤに融合したＴＡＴ）のいずれかによるトランスフェクションアッセイの結果を示す。図１７Ａの左側パネルは、親レポータープラスミド（「Ｒ」）、ｓｅｃ−ＲＮＡ配列インサート（「ＳＲ」）を含むレポータープラスミド、ｐＥ１．１ＴＡＴ（＋）又はｐＥ１．１ＴＡＴ（−）を同時トランスフェクトしたｓｅｃ−ＲＮＡレポータープラスミドをトランスフェクトした細胞から回収した細胞溶解物に対するＲＴ−ＰＣＲ産物を示す。図１７Ａの右側パネルは、ｓｅｃ−ＲＮＡレポータープラスミド及びｐＥ１．１ＴＡＴ（＋）又はｐＥ１．１ＴＡＴ（−）を同時トランスフェクトした細胞に由来する細胞溶解物（「Ｃ」）及び細胞外培地試料（「Ｍ」）の両方を示す。示されるように、ｐＥ３．１Ｓｅｃ−レポーター及びｐＥ１ＴＡＴ（＋）プラスミドをトランスフェクトした細胞において、ＲＮＡ−タンパク質複合体は培地中に分泌されるが、一方で、ｐＥ３．１Ｓｅｃ−レポーター及びｐＥ１ＴＡＴ（−）プラスミド（陰性対照ＲＢＤに融合したＴＡＴ）をトランスフェクトした細胞において、融合タンパク質（ｓｅｃ−ＲＮＡ）は培地中に存在しなかった。

（例１７）−ルシフェラーゼ／アルカリホスファターゼレポーター遺伝子のＣＰＰ仲介分泌活性をアッセイすること。

図１４Ａは、ＣＰＰ−ルシフェラーゼ／ＣＰＰ−アルカリホスファターゼレポーターシステムを用いてバイオリアクター細胞の分泌活性を生成し、試験するための例示的なトランスフェクションアッセイを示す非限定的な概略図である。細胞貫通ペプチドをルシフェラーゼレポーター遺伝子に融合する融合タンパク質カセットを、ＰＣＲを介して作製する。これらのＰＣＲ産物は、ＳＶ４０プロモーターとｈＧＨポリＡテイル配列との間に融合タンパク質カセットを配置するｐＥＧＥＮ１．１プラスミドへのサブクローニングを促進するためにＤＮＡの各末端において制限部位を含む。例１１〜１４に記載したように、結果として生じるプラスミドをインビトロで多くの異なる細胞型にトランスフェクトして、バイオリアクターレポーター細胞を作製する。総タンパク質を成長培地及び細胞から回収し、両方においてルシフェラーゼ活性を測定して、細胞の内側及び外側における標識されたルシフェラーゼ分子の分布を確立する。分泌のための必要条件を、ルシフェラーゼ／アルカリホスファターゼ単独及びスクランブルＣＰＰドメインに融合したルシフェラーゼ／アルカリホスファターゼを含む対照タンパク質との比較を通して確立する。

図１４Ｂは、レポータープラスミドをトランスフェクトし、インビトロで培養した細胞からのルシフェラーゼレポータータンパク質のＣＰＰ仲介分泌を示す。ＣＴ２６細胞に、ルシフェラーゼ又はＴＡＴ−ルシフェラーゼ融合タンパク質を発現するプラスミドをトランスフェクトした。４８時間後、細胞培地をＰＢＳと置き換え、細胞を更に３時間、３７℃でインキュベートした。ＰＢＳ上清を回収し、細胞をＴＥＮＴ緩衝液中に溶解した。標準法を用いて、可溶化細胞タンパク質及びＰＢＳ上清の当量についてルシフェラーゼ活性を測定した。細胞及び上清画分中に存在する相対ルシフェラーゼ活性は、両画分において観察される総ルシフェラーゼ活性の百分率として示す。ルシフェラーゼレポータータンパク質にＴＡＴ細胞貫通ペプチドを加えることによって、トランスフェクト細胞からの及び上清中へのルシフェラーゼ活性の分布がシフトする。

（例１８）−スプリットＧＦＰレポーター遺伝子のＣＰＰ仲介送達をアッセイすること

図１８は、ＧＦＰレポーターシステムを用いてバイオリアクター細胞の移入活性を生成し、試験するための例示的なトランスフェクションアッセイを示す非限定的な概略図である。スプリットＧＦＰレポーターシステムからの単離したドメインに細胞貫通ペプチドを融合する融合タンパク質カセットをＰＣＲによって作製する。別々のＰＣＲ反応は、ＧＦＰ相補的断片をコードするタンパク質カセットを作製する。これらのＰＣＲ産物は、ＳＶ４０プロモーターとｈＧＨポリＡテイル配列との間に融合タンパク質カセット及びＧＦＰ相補的断片カセットを配置するｐＥＧＥＮ１．１プラスミドへのサブクローニングを促進するためにＤＮＡの各末端において各々制限部位を含む。結果として生じるプラスミドをインビトロで細胞に独立してトランスフェクトして、ＣＰＰ−ＧＦＰ融合タンパク質を発現するバイオリアクターレポーター細胞とＧＦＰ相補的断片を発現する標的細胞とを作製する。バイオリアクター細胞と標的細胞とを混合することによって実験を開始する。バイオリアクター細胞からのＣＰＰ融合タンパク質の分泌と標的細胞への後続の移入とを、結果として生じるＧＦＰシグナルによるＧＦＰ相補的断片への活性化領域のドッキングの際に検出する。

（例１９）−培養におけるｍＲＮＡ転写産物ノックダウンの目的のためのＨｅＬａ細胞へのバイオリアクター細胞トランスフェクション試薬の適用

例１１〜１４から産生したものや例１６に記載した方法を用いて確認したもの等のバイオリアクター細胞を、Ｓｅｃ−ＲＮＡ分子がターゲッティングする遺伝子産物をノックダウンする目的のために標的細胞に直接適用する。トランスフェクションにおいて用いられる特定のｐＢｉｏＲプラスミド及びレシピエント細胞を、対象となる遺伝子標的及び標的細胞同一性によって決定する。本例において、ＶＥＧＦ転写産物をターゲッティングするｓｈＲＮＡを有するＳｅｃ−ｓｈＲＮＡ−融合タンパク質複合体を分泌するＮＩＨ３Ｔ３バイオリアクター細胞をＨｅＬａ標的細胞にトランスフェクトする。マウス由来バイオリアクター細胞を用いてヒト由来標的細胞にトランスフェクトする場合、種特異的プライマーセットを用いることにより、ヒト標的細胞においてＶＥＧＦ転写産物のノックダウンを観察することが可能である。ヒト細胞におけるＶＥＧＦタンパク質の欠乏と、分泌されたタンパク質の量の後続の減少とを、ヒトタンパク質に特異的なＶＥＧＦ抗体によるアッセイを用いて培地中において検出することもできる。

例１１〜１４に記載したように、ｐＢｉｏＲプラスミドによるＮＩＨ３Ｔ３細胞のトランスフェクションによってＮＩＨ３Ｔ３レシピエント細胞からバイオリアクター細胞を産生する。例１６に記載したアッセイによってバイオリアクター機能をも確認する。ＮＩＨ３Ｔ３細胞の一過性トランスフェクションの後にバイオリアクター細胞を分離又は精製することは必要でない。ＨｅＬａ細胞を、５０％コンフルエントの密度にＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清（２ｍＬの総体積）中において６ウェルプレート中において培養する。トリプシン処理及び遠心分離（５００×ｇで５分間）によってバイオリアクター細胞を回収する。ＨｅＬａ標的細胞のために用いた同じ成長培地中において細胞ペレットを再懸濁し、血球計数器を用いて細胞密度を測定する。ＨｅＬａ標的細胞にバイオリアクター細胞を加え、組み合わせた培養物を５％ＣＯ_２下で３７℃でインキュベートする。標的細胞に対するバイオリアクター細胞の最適比を、細胞及び遺伝子標的の各系について実験的に決定する。例１６に記載したように、それぞれｍＲＮＡ転写産物又はタンパク質のノックダウンをアッセイするために、バイオリアクター細胞を加えた４８〜９６時間後に各細胞培養物からＲＮＡ又はタンパク質試料を回収する。

（例２０）−細胞外マトリックスへのＲＮＡアプタマーのバイオリアクター仲介送達

本例は、アプタマー、例えば、ｇｐ１３０受容体仲介シグナル伝達経路の活性化因子であるオンコスタチンＭタンパク質をターゲッティングするアプタマーを分泌するバイオリアクター細胞の分泌活性を決定するための例示的なトランスフェクションアッセイを記載する（図１９参照）。アッセイは、レポーターシステムと、オンコスタチンＭタンパク質をターゲッティングする分泌ＲＮＡアプタマーとの使用を用いる。例１１〜１４に記載したように、融合タンパク質に対する発現プラスミド（ｐＥＧＥＮＦＰ、例２）と、オンコスタチンＭをターゲッティングするＲＮＡアプタマーに対する発現プラスミド（ｐＥＧＥＮＳＲ、例２）とを、インビトロで多くの異なる細胞型にトランスフェクトして、ＲＮＡアプタマーを分泌するバイオリアクター細胞を作製する。ｇｐ１３０仲介ＳＴＡＴ３シグナル伝達経路（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣｉｇｎａｌＲｅｐｏｒｔｅｒＡｓｓａｙｓ、カタログ＃ＣＣＳ−９０２８）に応答するプロモーターエレメントの制御下でルシフェラーゼタンパク質を発現するレポータープラスミドをインビトロでＨｅｐＧ２細胞（ｇｐ１３０発現細胞）にトランスフェクトして、標的（レポーター）細胞を作製する。４８時間後、細胞培地を、オンコスタチンＭに対するアプタマーを分泌するバイオリアクター細胞から回収し、室温で３時間、組み換えオンコスタチンＭタンパク質（０．２〜２０ｎｇ／ｍＬ）と共にインキュベートし、標的タンパク質への分泌アプタマーの結合を可能にする。次いで、培地を標的（レポーター）細胞に移し、培養物を３７℃で２４時間インキュベートする。対照には、レポーター細胞への直接の組み換えオンコスタチンＭタンパク質、非トランスフェクト細胞からの培地と共にインキュベートしたオンコスタチンＭ、プラスミド（ｐＥＧＥＮＳＲ）を発現するＲＮＡアプタマーだけをトランスフェクトしたバイオリアクター細胞からの培地と共にインキュベートしたオンコスタチンＭ、ミスマッチＲＮＡ結合ドメインを発現する細胞からの培地と共にインキュベートしたオンコスタチンＭ、及びｐＥＧＥＮＳＲトランスフェクト細胞から精製したＲＮＡアプタマーにより処置したオンコスタチンＭの添加が含まれる。例１７に記載したようにルシフェラーゼアッセイを実施する。オンコスタチンＭをターゲッティングするアプタマーを含む培地と共にインキュベートしたレポーター細胞は、オンコスタチンＭ単独と共にインキュベートした又はオンコスタチンＭ及び対照培地と共にインキュベートしたレポーター細胞より低いルシフェラーゼ活性を有する。バイオリアクター細胞からの他のアプタマーの分泌を、適切なルシフェラーゼ又は他のレポーターベクターシステムによる同様の方法を用いてアッセイすることができる。

（例２１）−細胞外マトリックスへのＲＮＡアプタマーのバイオリアクター仲介送達。

本例は、アプタマー、例えば、ＨＥＲ３をターゲッティングするアプタマーを分泌するバイオリアクター細胞の分泌活性を決定するための例示的なトランスフェクションアッセイを記載する（図２０参照）。アッセイは、レポーターシステムと、ＨＥＲ３タンパク質をターゲッティングする分泌ＲＮＡアプタマーとの使用を用いる。例１１〜１４に記載したように、融合タンパク質に対する発現プラスミド（ｐＥＧＥＮＦＰ、例２）と、ＨＥＲ３をターゲッティングするＲＮＡアプタマーに対する発現プラスミド（ｐＥＧＥＮＳＲ、例２）とを、インビトロで多くの異なる細胞型にトランスフェクトして、ＲＮＡアプタマーを分泌するバイオリアクター細胞を作製する。ＨＥＲ３受容体タンパク質（例えば、ＭＣＦ７）を発現するレポーター細胞を別々に培養する。４８時間後、細胞培地を、ＨＥＲ３に対するアプタマーを分泌するバイオリアクター細胞から回収し、ＨＥＲ３発現レポーター細胞に移し、培養物を３７℃で２４〜７２時間インキュベートする。対照には、非トランスフェクト細胞からの培地、ＲＮＡアプタマー発現プラスミド（ｐＥＧＥＮＳＲ）だけをトランスフェクトしたバイオリアクター細胞からの培地、ミスマッチＲＮＡ結合ドメインを発現する細胞からの培地、及びｐＥＧＥＮＳＲトランスフェクト細胞から精製したＲＮＡアプタマーの添加が含まれる。細胞成長を、製造業者のプロトコールに従ってＰｒｏｍｅｇａのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６ＡｑｕｅｏｕｓＮｏｎ−ＲａｄｉｏａｃｔｉｖｅＣｅｌｌＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎＡｓｓａｙ（カタログ＃Ｇ５４２１）を用いてモニタする。ＨＥＲ３をターゲッティングするアプタマーを含む培地と共にインキュベートしたレポーター細胞は、対照培地と共にインキュベートしたレポーター細胞より低い細胞成長を示す。バイオリアクター細胞からの他のアプタマーの分泌を、適切なレポーターベクターシステムによる同様の方法を用いてアッセイすることができる。

（例２２）−標的細胞の細胞質へのｓｈＲＮＡのバイオリアクター仲介送達。

本例は、バイオリアクター細胞の分泌活性を決定するための例示的なトランスフェクションアッセイと、標的細胞の細胞質への阻害性ｓｈＲＮＡの後続の送達とを記載する（図２１参照）。例１１〜１４に記載したように、融合タンパク質に対する発現プラスミド（ｐＥＧＥＮＦＰ、例２）と、ｓｈＲＮＡに対する発現プラスミド（ｐＥＧＥＮＳＲ、例２）とを、インビトロで多くの異なる細胞型にトランスフェクトして、バイオリアクター細胞を作製する。ｓｈＲＮＡがターゲッティングするｍＲＮＡ転写産物を発現する標的細胞を別々に培養する。４８時間後、細胞培地を、バイオリアクター細胞から回収し、標的細胞に移し、培養物を３７℃で２４〜７２時間インキュベートする。対照には、非トランスフェクト細胞からの培地、ｓｈＲＮＡ発現プラスミド（ｐＥＧＥＮＳＲ）だけをトランスフェクトしたバイオリアクター細胞からの培地、ミスマッチＲＮＡ結合ドメインを発現する細胞からの培地、及びｐＥＧＥＮＳＲトランスフェクト細胞から精製したｓｈＲＮＡの添加が含まれる。トータルＲＮＡを標的細胞から調製し、ＲＴ−ＰＣＲ分析を例１１に記載したように実施する。標的遺伝子のノックダウンを、非ターゲッティング内部対照遺伝子との比較によって評価する。別の場合、バイオリアクター細胞及び標的細胞を、ＲＴ−ＰＣＲアッセイにおいて用いるプライマー及びプローブがバイオリアクター細胞中における対応する転写産物を認識しない場合、実験の間に一緒に培養することができる。これは、バイオリアクター細胞に対するある種に由来する細胞系と、標的細胞に対する異なる種に由来する細胞系とを用いることによって最も容易に達成される。この場合、バイオリアクター細胞を、トランスフェクションの２４時間後に回収し、ＲＴ−ＰＣＲ分析によってアッセイされる通りのバイオリアクター活性の直接アッセイのために標的細胞と混合することができる。ｓｈＲＮＡがターゲッティングするｍＲＮＡ転写産物を発現する標的細胞を別々に培養する。バイオリアクター細胞からの他のｓｈＲＮＡの分泌を、適切な標的細胞による同様の方法を用いてアッセイすることができる。

（例２３）−細胞へのｐＢｉｏＲ発現ベクターのエクスビボでの投与

バイオリアクター細胞を、例１１〜１４に記載したようにｐＢｉｏＲプラスミドによるトランスフェクションによってＮＩＨ３Ｔ３レシピエント細胞から産生する。バイオリアクター機能を、例１６に記載したアッセイによって確認する。本例において、ＮＩＨ３Ｔ３バイオリアクター細胞は、ＶＥＧＦ転写産物をターゲッティングするｓｈＲＮＡを有するＳｅｃ−ｓｈＲＮＡ−融合タンパク質複合体を分泌する。バイオリアクター細胞をＳＣＣＶＩＩ標的細胞（マウス扁平上皮癌系）と混合し、混合物を、各動物の脾腹への皮下注射によってヌードマウス（免疫低下）中に移植する。バイオリアクター活性を、対照と比較したＶＥＧＦ転写産物と、移植部位を囲む組織中におけるタンパク質レベルとの評価によってモニタする。バイオリアクター／ＳＣＣＶＩＩ移植片中における腫瘍成長をＳＣＣＶＩＩ細胞単独又は非機能的バイオリアクター細胞（非特異的ｓｈＲＮＡ又は送達低下融合タンパク質）と共にＳＣＣＶＩＩ細胞が投与された対照マウスと比較することによってインビボでバイオリアクター機能をも評価する。

（例２４）−マウス筋組織へのバイオリアクター細胞のインビボでの投与。

バイオリアクター細胞を、例１１〜１４に記載したようにｐＢｉｏＲプラスミドによるトランスフェクションによって初代マウス筋芽細胞レシピエント細胞から産生する。バイオリアクター機能を、例１６に記載したアッセイを用いて確認する。本例において、バイオリアクター細胞は、ミオスタチン（骨格筋成長の負の調節因子）に対するｍＲＮＡ転写産物をターゲッティングするｓｈＲＮＡを有するＳｅｃ−ｓｈＲＮＡ−融合タンパク質複合体を分泌する。バイオリアクター細胞を、ｍｄｘマウス（デュシェンヌ型筋ジストロフィーのためのモデル系）の脛骨筋に移植する（ＬｉＳ、ＫｉｍｕｒａＥ、ＮｇＲ、ＦａｌｌＢＭ、ＭｅｕｓｅＬ、ＲｅｙｅｓＭ、ＦａｕｌｋｎｅｒＪＡ、ＣｈａｍｂｅｒｌａｉｎＪＳ．、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの細胞及び遺伝子治療研究のための高機能ミニジストロフィン／ＧＦＰ融合遺伝子（Ａｈｉｇｈｌｙｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｍｉｎｉ−ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ／ＧＦＰｆｕｓｉｏｎｇｅｎｅｆｏｒｃｅｌｌａｎｄｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙｓｔｕｄｉｅｓｏｆＤｕｃｈｅｎｎｅｍｕｓｃｕｌａｒｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．）、ＨｕｍＭｏｌＧｅｎｅｔ．２００６年５月１５日；１５（１０）：１６１０〜２２）。バイオリアクター活性を、ミオスタチン転写産物と、移植部位を囲む組織中におけるタンパク質レベルとの評価によってモニタする。Ｔｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、製品＃Ｔ９４２４）を用いて、未処置マウス、非特異的Ｓｅｃ−ｓｈＲＮＡを分泌するバイオリアクター細胞を移植したマウス、及びミオスタチン転写産物をターゲッティングするｓｈＲＮＡを分泌するバイオリアクター細胞を移植したマウスから回収した脛骨筋からＲＮＡ及びタンパク質試料を調製する。次いで、ミオスタチン転写産物及びタンパク質の相対レベルを、例１６に記載したように、それぞれＲＴ−ＰＣＲ又はＥＬＩＳＡによって評価することができる。バイオリアクター細胞又は非機能バイオリアクター細胞が投与されていない対照マウスに対してバイオリアクター移植片中における体重、筋肉質量、筋肉サイズ及び筋力を比較することによって、インビボでバイオリアクター機能をも評価する（ＢｏｇｄａｎｏｖｉｃｈＳ、ＫｒａｇＴＯ、ＢａｒｔｏｎＥＲ、ＭｏｒｒｉｓＬＤ、ＷｈｉｔｔｅｍｏｒｅＬＡ、ＡｈｉｍａＲＳ、ＫｈｕｒａｎａＴＳ．、ミオスタチン遮断によるジストロフィー筋の機能的改善（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｏｆｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃｍｕｓｃｌｅｂｙｍｙｏｓｔａｔｉｎｂｌｏｃｋａｄｅ．）、Ｎａｔｕｒｅ．２００２年１１月２８日；４２０（６９１４）：４１８〜２１）。

（例２５）−マウス神経組織へのバイオリアクター細胞のインビボでの投与

例１１〜１４に記載したように、ｐＢｉｏＲプラスミドによるトランスフェクションによってマウス神経幹細胞（ｍＮＳＣ）からバイオリアクター細胞を産生する。例１６に記載したアッセイによってバイオリアクター機能を確認する。本例において、ｍＮＳＣバイオリアクター細胞は、変異ハンチンチン（ｈｔｔ）タンパク質のＣＡＧリピート伸長に対するｍＲＮＡ転写産物をターゲッティングするｓｈＲＮＡを有するＳｅｃ−ｓｈＲＮＡ−融合タンパク質複合体を分泌する。バイオリアクター細胞をハンチントン病についてのマウスモデルの脳に移植して、ｈｔｔタンパク質の変異形に対するｍＲＮＡ転写産物のバイオリアクター仲介ノックダウンの有効性を評価する。Ｔｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、製品＃Ｔ９４２４）を用いて、未処置マウス、非特異的Ｓｅｃ−ｓｈＲＮＡを分泌するバイオリアクター細胞を移植したマウス、及び変異ハンチンチン転写産物をターゲッティングするｓｈＲＮＡを分泌するバイオリアクター細胞を移植したマウスから回収したマウス脳組織からＲＮＡ試料を調製する。次いで、ハンチンチン転写産物の相対レベルを、例１６に記載したように、ＲＴ−ＰＣＲによって評価することができる。ハンチントン病についてのマウスモデルはまた、線条体組織中における異常タンパク質形成及び異常歩行をも示し、それらの両方は、バイオリアクター活性の生理学的リードアウトを提供することができる。ＹａｎｇＣＲ、ＹｕＲＫ．、トレハロース摂取と組み合わせた神経幹細胞の脳内移植は、ハンチントン病のマウスモデルにおける病状を軽減する（ＩｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎｏｆｎｅｕｒａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈｔｒｅｈａｌｏｓｅｉｎｇｅｓｔｉｏｎａｌｌｅｖｉａｔｅｓｐａｔｈｏｌｏｇｙｉｎａｍｏｕｓｅｍｏｄｅｌｏｆＨｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓｄｉｓｅａｓｅ．）、ＪＮｅｕｒｏｓｃｉＲｅｓ．２００８年８月５日；８７（１）：２６〜３３．；ＤｉＦｉｇｌｉａＭ、Ｓｅｎａ−ＥｓｔｅｖｅｓＭ、ＣｈａｓｅＫ、ＳａｐｐＥ、ＰｆｉｓｔｅｒＥ、ＳａｓｓＭ、ＹｏｄｅｒＪ、ＲｅｅｖｅｓＰ、ＰａｎｄｅｙＲＫ、ＲａｊｅｅｖＫＧ、ＭａｎｏｈａｒａｎＭ、ＳａｈＤＷ、ＺａｍｏｒｅＰＤ、ＡｒｏｎｉｎＮ．、ｓｉＲＮＡによる変異ハンチンチンの治療的サイレンシングは、線条体及び皮質の神経病理学及び行動性欠損を減少させる（ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓｉｌｅｎｃｉｎｇｏｆｍｕｔａｎｔｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎｗｉｔｈｓｉＲＮＡａｔｔｅｎｕａｔｅｓｓｔｒｉａｔａｌａｎｄｃｏｒｔｉｃａｌｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙａｎｄｂｅｈａｖｉｏｒａｌｄｅｆｉｃｉｔｓ．）、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．２００７年１０月２３日；１０４（４３）：１７２０４〜９を参照すること。

（例２６）−ヒト滑液へのバイオリアクター細胞の投与

例１１〜１４に記載したように、ｐＢｉｏＲプラスミドによるトランスフェクションによってヒト滑膜線維芽細胞からバイオリアクター細胞を産生する。例１６に記載したアッセイによってバイオリアクター機能を確認する。本例において、繊維芽細胞バイオリアクター細胞は、ＩＬ−１β、ＩＬ−６又はＩＬ−１８炎症誘発性サイトカインに対するｍＲＮＡ転写産物をターゲッティングするｓｈＲＮＡを有するＳｅｃ−ｓｈＲＮＡ−融合タンパク質複合体を分泌する。抗生物質による選択成長を介して一過性トランスフェクト細胞の注射又は安定細胞の作製のためにトランスフェクト細胞を増殖させる。バイオリアクター細胞を、１×ＰＢＳ（Ｃａ^２＋もＭｇ^２＋も有さない）中に再懸濁し、関節炎患者の関節に注射する（ＥｖａｎｓＣＨ、ＲｏｂｂｉｎｓＰＤ、ＧｈｉｖｉｚｚａｎｉＳＣ、ＷａｓｋｏＭＣ、ＴｏｍａｉｎｏＭＭ、ＫａｎｇＲ、ＭｕｚｚｏｎｉｇｒｏＴＡ、ＶｏｇｔＭ、ＥｌｄｅｒＥＭ、ＷｈｉｔｅｓｉｄｅＴＬ、ＷａｔｋｉｎｓＳＣ、ＨｅｒｎｄｏｎＪＨ．、ヒト関節への遺伝子導入：関節炎の遺伝子治療への進歩（Ｇｅｎｅｔｒａｎｓｆｅｒｔｏｈｕｍａｎｊｏｉｎｔｓ：ｐｒｏｇｒｅｓｓｔｏｗａｒｄａｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙｏｆａｒｔｈｒｉｔｉｓ．）、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．２００５年６月１４日；１０２（２４）：８６９８〜７０３）。繊維芽細胞バイオリアクター細胞によって産生されたＳｅｃ−ｓｈＲＮＡ−融合タンパク質複合体をインターロイキン産生単球に送達し、滑液中に存在するサイトカインの量を減少させる。滑液中に存在するＩＬ−１α、ＩＬ−６、ＩＬ−１８及びＴＮＦαタンパク質の量、並びに疾患の生理学的適応をモニタリングすることによってバイオリアクター機能を評価する。（ＫｈｏｕｒｙＭ、ＥｓｃｒｉｏｕＶ、ＣｏｕｒｔｉｅｓＧ、ＧａＩｙＡ、ＹａｏＲ、ＬａｒｇｅａｕＣ、ＳｃｈｅｒｍａｎＤ、ＪｏｒｇｅｎｓｅｎＣ、ＡｐｐａｒａｉｌｌｙＦ．、組み合わせた抗サイトカイン低分子干渉ＲＮＡリポプレックスによるマウス関節炎の効率的抑制（ＥｆｆｉｃｉｅｎｔｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｕｒｉｎｅａｒｔｈｒｉｔｉｓｂｙｃｏｍｂｉｎｅｄａｎｔｉｃｙｔｏｋｉｎｅｓｍａｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡｌｉｐｏｐｌｅｘｅｓ．）、ＡｒｔｈｒｉｔｉｓＲｈｅｕｍ．２００８年８月；５８（８）：２３５６〜６７）。

（例２７）−ウイルスベクターの構築

単離したプラスミドバックボーン、ウイルス構造的及び非構造的成分に対する発現カセット、及び生物活性ＲＮＡに対する発現カセットからウイルスベクターを構築する。発現カセットのＰＣＲ増幅、プラスミドバックボーンへの発現カセットのサブクローニング、結果として生じるウイルス産生ベクターの増幅及び単離、並びにプラスミド配列の後続の確認を、全て例１に記載したように実施する。幾つかのＤＮＡウイルス発現カセット、例えば、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルス（２〜３、７、１１、１９、２１）並びに単純ヘルペスウイルス（５、１４〜１５、１８）又はＲＮＡウイルス発現カセット、例えば、レンチウイルス（６、２０、２２、２４）、シンドビスウイルス（９）、マウス白血病ウイルス（１０、１２〜１３、１６）又はフォーミーウイルス（８、１７）、及び本出願のどこか他の場所において、及び前の実施例において記載した生物活性ＲＮＡ分子のいずれかの内の１つからウイルスベクターを構築する。ウイルスごとに、ウイルスコートタンパク質及び融合タンパク質をコードする構造遺伝子を、ｐＶｉｒ１を作製するＰｏｌ−ＩＩプロモーター配列からの発現のためのｐＥＧＥＮバックボーンプラスミドのいずれかにサブクローニングする。それとは別に、ポリメラーゼ及びアクセサリータンパク質をコードする非構造遺伝子を、生物活性ＲＮＡ配列と結合させ、ｐＶｉｒ２を作製するＰｏｌ−ＩＩプロモーター配列からの発現のための第２ｐＥＧＥＮプラスミドにサブクローニングする。ｐＶｉｒ２の中のプロモーター配列の配置は、異なるウイルスのバックボーンのために変化することができる。生物活性ＲＮＡ分子に対するウイルス非構造遺伝子及び鋳型は、ネイティブウイルスに内在性の又は表ＶＩＩＩ内からの共通又は非依存性プロモーター配列のいずれかから発現することができる。プラスミドｐＶｉｒ１及びｐＶｉｒ２をレシピエント細胞に同時トランスフェクトして、ウイルス産生細胞を作製する。

ウイルス産生細胞の成功した作製を、多くの異なる実験的アッセイを介して確認することができる。ウイルス転写産物に特異的なプライマーによるＲＴ−ＰＣＲと、ウイルスタンパク質に特異的な抗体によるＥＬＩＳＡとを用いて、ウイルス構造遺伝子の発現を評価することができる。ウイルス転写産物に特異的なプライマーと、更に非構造的遺伝子及び生物活性ＲＮＡを架橋するプライマーとによるＲＴ−ＰＣＲによって、ウイルス非構造遺伝子の発現を評価することもできる。ウイルス産生細胞が成長している培地を回収し、その培地からタンパク質、ＤＮＡ又はＲＮＡを単離し、次いで、ＥＬＩＳＡ、ＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲを用いてウイルスタンパク質又は核酸についてアッセイすることによって、ウイルス粒子の分泌を評価することができる。ヘルパーウイルスを担持する細胞系を利用するプラークアッセイを介して機能的ウイルス粒子を検出することができる。

（例２８）−標的培養細胞へのウイルスパッケージング細胞の投与

例１１〜１４に記載したように、ｐＶｉｒプラスミドによるトランスフェクションによってＭＤＣＫレシピエント細胞からウイルスパッケージング細胞を産生する。例２９に記載されるアッセイによってウイルスパッケージ機能を確認する。本例において、ウイルスパッケージング細胞は、ＶＥＧＦタンパク質をターゲッティングするｓｈＲＮＡを担持する複製欠損ウイルスを産生する。これらのウイルス産生細胞を用いて、ＨｅＬａ細胞中においてＶＥＧＦタンパク質をノックダウンして、ウイルス産生マウス細胞をヒト標的細胞から区別するための機序を提供する。ＲＴ−ＰＣＲにおいて種特異的プライマーセットを、ＥＬＩＳＡにおいて種特異的抗体をそれぞれ用いて、ヒト細胞中におけるＶＥＧＦｍＲＮＡ転写産物の欠乏と、分泌タンパク質の量の後続の減少とを検出することができる。ＨｅＬａ細胞を、５０％コンフルエントの密度にＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清（２ｍＬの総体積）中において６ウェルプレート中において培養する。トリプシン処理及び遠心分離（５００×ｇで５分間）によってウイルスパッケージング細胞を回収する。ＨｅＬａ標的細胞のために用いた同じ成長培地中において細胞ペレットを再懸濁し、血球計数器を用いて細胞密度を測定する。ＨｅＬａ標的細胞にウイルスパッケージング細胞を加え、組み合わせた培養物を５％ＣＯ_２下で３７℃でインキュベートする。標的細胞に対するウイルスパッケージング細胞の最適比を、細胞及び遺伝子標的の各系について実験的に決定する。それぞれｍＲＮＡ転写産物又はタンパク質のノックダウンをアッセイするために、ウイルスパッケージング細胞を加えた４８〜９６時間後に各細胞培養物からＲＮＡ又はタンパク質試料を回収する。

（例２９）−細胞培養における組み換えウイルスの産生及び分泌を確認するためのアッセイ

例１１〜１４に記載した方法を用いてｐＶｉｒ発現ベクター又はヌルベクターを細胞にトランスフェクトする。ウイルス産生細胞の成功した作製を、以下の、（１）ウイルスタンパク質成分の産生、（２）生物活性ＲＮＡ鋳型又は分子を含む部分的ウイルスゲノムの産生、（３）ウイルス粒子中へのＳｅｃ−ＲＮＡのカプセル化、及び（４）ウイルス産生細胞からのウイルス粒子の成功した放出、の１つ又は複数を確認するアッセイによって確認する。ウイルスタンパク質成分の産生を、それらのタンパク質をコードするプラスミド由来ｍＲＮＡ転写産物を検出するＲＴ−ＰＣＲに基づいたアッセイと、それらのタンパク質自体を検出する抗体に基づいたアッセイとを通して確認することができる。ウイルスタンパク質を検出する目的のために、商業的に入手可能な抗体によって認識される短い「タンパク質標識」をウイルスタンパク質の配列中に含めることができる。これらのタンパク質標識を、ウイルス産生細胞の機能を確認するために使用するが、必ずしも機能的ウイルス粒子中に含めるというわけではない。

プラスミド由来ｍＲＮＡ転写産物を検出するため、製造業者のプロトコールに従ってＴｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、製品＃Ｔ９４２４）を用いて、ｐＶｉｒトランスフェクト、ヌルベクタートランスフェクト及び非トランスフェクト細胞、即ち、ＨｅＬａ細胞、又は本明細書に記載され、それ以外の場合、本技術分野において公知の他の細胞のいずれかからトータルＲＮＡを調製する。ｃＤＮＡライブラリーを、ポリＴプライマーを用いてトータルＲＮＡから調製し、ＰＣＲ増幅のための鋳型として用いる。各々が異なるサイズの産物を産生する２つの別々の増幅反応のためのプライマー（（１）β−アクチン又はＧＡＰＤＨ等の内部対照遺伝子に由来する配列を増幅するプライマー、及び（２）融合タンパク質をコードするｍＲＮＡに特異的な配列を増幅するプライマー）を、ＰＣＲ反応中に含める。産物を、１×ＴＡＥ中における２％アガロースゲルのランニング上、又は１×ＴＢＥ中における１０％アクリルアミドゲルのランニング上で分解する。臭化エチジウムで染色し、３０２ｎｍのＵＶ光の照射を行うことによって、産物を非トランスフェクト細胞（陰性対照）、ヌルベクター（融合タンパク質のないバックボーンベクター）をトランスフェクトした細胞、及び潜在的なウイルス産生細胞（即ち、ｐＶｉｒをトランスフェクトした細胞）について比較する。非トランスフェクト対照細胞は、内部対照遺伝子に対する単一のＰＣＲ産物を有するが、成功したバイオリアクターは、内部対照遺伝子と融合タンパク質をコードする転写産物との両方に対する産物を有する。

ウイルスタンパク質の直接検出を、ｐＶｉｒトランスフェクト、ヌルベクタートランスフェクト及び非トランスフェクト細胞、並びにそれらの細胞が成長する培地からの総タンパク質の回収によって達成する。総タンパク質をアセトン沈殿によって各試料から濃縮し、濃縮タンパク質をＥＬＩＳＡ分析用ネイティブ緩衝液又はウエスタンブロット分析用変性緩衝液のいずれかの中で再懸濁する。各アッセイは、標準法と、ウイルスタンパク質中に存在する内部対照遺伝子（β−アクチン又はＧＡＰＤＨ）及びタンパク質標識に特異的な抗体とを利用する。考察されるように、タンパク質標識を、ウイルス産生細胞の機能を確認するための好都合な手段としてウイルスタンパク質中に含める。非トランスフェクト及びヌルベクタートランスフェクト対照細胞は、内部対照遺伝子に対して検出される単一タンパク質を有するが、成功したウイルス産生細胞は、内部対照タンパク質及びウイルスタンパク質の両方を有する。

阻害性ＲＮＡ鋳型又は分子を有する部分的ウイルスゲノムの成功した産生を、ＤＮＡ又はＲＮＡ産物の増幅を通して確認することができる。プラスミド由来部分的ウイルスゲノムの産生を示すためにＲＴ−ＰＣＲアッセイを用い、細胞質中におけるこの核酸の蓄積を実証するために細胞分画を用いる。製造業者のプロトコールに従って、ＰＡＲＩＳＲＮＡ単離キット（Ａｍｂｉｏｎ、製品＃１９２１）によって細胞分画を達成する。ｃＤＮＡライブラリーを、ランダムヘキサマー非特異的プライマーを用いて分画ＲＮＡから調製し、ＰＣＲ増幅のための鋳型として用いる。各々が異なるサイズの産物を産生する２つの別々の増幅反応のためのプライマー（（１）β−アクチン又はＧＡＰＤＨ等の内部対照遺伝子に由来する配列を増幅するプライマー、及び（２）部分的ウイルスゲノムに特異的な配列を増幅するプライマー）を、ＰＣＲ反応中に含める。産物を、１×ＴＡＥ中における２％アガロースゲルのランニング上、又は１×ＴＢＥ中における１０％アクリルアミドゲルのランニング上で分解する。臭化エチジウムで染色し、３０２ｎｍのＵＶ光の照射を行うことによって、産物をヌルベクタートランスフェクト及び非トランスフェクト細胞（陰性対照）並びに潜在的なウイルス産生細胞について比較する。ヌルベクタートランスフェクト及び非トランスフェクト対照細胞は、内部対照遺伝子に対する単一のＰＣＲ産物を有するが、成功したウイルス産生細胞は、内部対照遺伝子と部分的ウイルスゲノムとの両方に対する産物を有する。

部分的ウイルスゲノム及び阻害性ＲＮＡ鋳型又は分子のカプセル化を、ＣｓＣｌ勾配による超遠心分離によってウイルス粒子の単離を通して実証する。ウイルス粒子を、ｐＶｉｒトランスフェクト、ヌルベクタートランスフェクト及び非トランスフェクト細胞から採取し、ＣｓＣｌ勾配精製に供する。核酸を、単離したウイルス粒子から調製し、上記の通りのＰＣＲ分析（ＤＮＡウイルスバックボーン）又はＲＴ−ＰＣＲ（ＲＮＡウイルスバックボーン）のいずれかのための鋳型として用いる。ウイルス粒子の成功した放出を、細胞外マトリックス、又は培養細胞の場合は培地中におけるウイルスタンパク質又は部分的ウイルスゲノムの検出によって確認する。無傷のウイルス粒子を、培地から、及び上記の通りのＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲ分析のための鋳型として精製及び使用した核酸から精製し、濃縮することができる。

（例３０）−細胞培養において完全なバイオリアクターカセットを担持する組み換えウイルスを産生するウイルスベクターの構築

単離したプラスミドバックボーン、ウイルス構造的及び非構造的成分に対する発現カセット、並びに生物活性ＲＮＡ及び融合タンパク質に対する発現カセットからウイルスベクターを構築する。発現カセットのＰＣＲ増幅、プラスミドバックボーンへの発現カセットのサブクローニング、結果として生じるウイルス産生ベクターの増幅及び単離、並びにプラスミド配列の後続の確認を、全て例１に記載したように実施する。これらのウイルスのベクターは、ウイルス粒子がバイオリアクター発現カセットを担持するようにＤＮＡウイルス（例２８において列挙したいずれかのもの）を利用する。ウイルスごとに、ウイルスコートタンパク質及び融合タンパク質をコードする構造遺伝子を、ｐＶｉｒ１を作製するＰｏｌ−ＩＩプロモーター配列からの発現のためのｐＥＧＥＮバックボーンプラスミドのいずれかにサブクローニングする。それとは別に、ポリメラーゼ及びアクセサリータンパク質をコードする非構造遺伝子を、生物活性ＲＮＡ（単数又は複数）及び融合タンパク質に対する発現カセットと結合させ、ｐＶｉｒ３を作製するＰｏｌ−ＩＩプロモーター配列からの発現のための第２ｐＥＧＥＮプラスミドにサブクローニングする。プラスミドｐＶｉｒ１及びｐＶｉｒ３をレシピエント細胞に同時トランスフェクトして、ウイルス産生細胞を作製する。例１１〜１４に記載した方法を用いて、細胞にｐＶｉｒ発現ベクター又はヌルベクターをトランスフェクトする。

（例３１）−細胞培養において完全なバイオリアクターカセットを担持する組み換えウイルスの産生及び分泌を確認するためのアッセイ。

ｐＶｉｒプラスミドをトランスフェクトした細胞は、ウイルス産生細胞になり、標的細胞の感染の際にその標的細胞をバイオリアクター細胞に転化するウイルス粒子を産生する。ウイルス産生細胞の成功した作製を、以下の、（１）ウイルスタンパク質成分の産生、（２）生物活性ＲＮＡ鋳型又は分子、並びに融合タンパク質のための鋳型を含む部分的ウイルスゲノムの産生、（３）ウイルス粒子中への生物活性ＲＮＡ鋳型及び融合タンパク質鋳型のカプセル化、（４）ウイルス産生細胞からのウイルス粒子の成功した放出、及び（５）感染標的細胞の中のバイオリアクター活性の成功した生成の１つ又は複数を確認するアッセイによって確認する。ウイルスタンパク質成分の産生を、例２７に記載したアッセイを用いて確認する。ウイルスゲノム及びバイオリアクター発現成分の産生を、例１６に記載したアッセイを用いて確認する。必要とする核酸のカプセル化を、例２９に記載したアッセイを用いて確認する。ウイルス粒子の成功した放出と、感染標的細胞中におけるバイオリアクター活性の生成とを、例１６に記載したアッセイを用いて確認する。

（例３２）−細胞培養におけるｍＲＮＡ転写産物のノックダウンの目的のためのＨｅＬａ細胞へのウイルス産生細胞の投与

ウイルス産生細胞、例えば、例３０〜３１から産生したもの及び例３１に記載した方法を用いて確認されたものを、生物活性ＲＮＡ分子がターゲッティングする遺伝子産物をノックダウンする目的のために標的細胞に直接適用する。トランスフェクションにおいて用いられる特定のｐＶｉｒプラスミド及びレシピエント細胞を、対象となる遺伝子標的及び標的細胞同一性によって決定する。本例において、ＨｅＬａ標的細胞を、バイオリアクター融合タンパク質とＶＥＧＦ（又は表ＶＩＩに列挙される転写産物のいずれか）をターゲッティングする分泌ｓｈＲＮＡとに対する発現カセットを担持するウイルス粒子を作製するＭＤＣＫウイルス産生細胞と共培養する。次いで、感染ＨｅＬａ細胞は、融合タンパク質−Ｓｅｃ−ｓｈＲＮＡ複合体を産生し、その複合体を増殖培地中に分泌することが可能なバイオリアクター細胞になる。次いで、この培地を、トランスフェクション及び後続のＶＥＧＦノックダウンのための２次標的細胞（ＨｅＬａ又は他の細胞系）に移すことができる。別の場合、標的細胞への適用の前に、６×ヒスチジンエピトープ標識による沈殿を通して融合タンパク質−Ｓｅｃ−ｓｈＲＮＡ複合体を精製することができる。種特異的プライマーセット及びＲＴ−ＰＣＲを用いることにより、ヒト標的細胞中におけるＶＥＧＦ転写産物のノックダウンを観察することが可能である。ヒト細胞におけるＶＥＧＦタンパク質の欠乏と、分泌されたタンパク質の量の後続の減少とを、ヒトタンパク質に特異的なＶＥＧＦ抗体によるアッセイを用いて培地中において検出することもできる。

（例３３）−インビボでのウイルスパッケージング細胞の投与

ウイルスパッケージング細胞を、例１１〜１４に記載したようにｐＶｉｒプラスミドによるトランスフェクションによってＮＩＨ３Ｔ３レシピエント細胞から産生する。ウイルスパッケージ機能を、例２９に記載したアッセイによって確認する。本例において、ＮＩＨ３Ｔ３ウイルスパッケージング細胞は、ＶＥＧＦタンパク質をターゲッティングするｓｈＲＮＡを担持する複製欠損ウイルスを産生する。ウイルスパッケージング細胞をＳＣＣＶＩＩ標的細胞（マウス扁平上皮癌系）と混合し、混合物を、各動物の脾腹への皮下注射によってヌードマウス（免疫低下）中に移植する。活性を、ＶＥＧＦ転写産物と、移植部位を囲む組織中におけるタンパク質レベルとの評価によってモニタする。Ｔｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、製品＃Ｔ９４２４）を用いて、未処置マウス、非特異的Ｓｅｃ−ｓｈＲＮＡを分泌するバイオリアクター細胞を移植したマウス、及びＶＥＧＦ転写産物をターゲッティングするｓｈＲＮＡを分泌するバイオリアクター細胞を移植したマウスの脾腹から回収した組織からＲＮＡ試料を調製する。次いで、ＶＥＧＦ転写産物の相対レベルを、例１１に記載したように、ＲＴ−ＰＣＲによって評価することができる。ウイルス産生／ＳＣＣＶＩＩ移植片中における腫瘍成長をＳＣＣＶＩＩ細胞単独又は非機能的ウイルス産生細胞（非特異的ｓｈＲＮＡ又は送達低下ウイルス）と共にＳＣＣＶＩＩ細胞が投与された対照マウスと比較することによってインビボでウイルスパッケージ機能をも評価する。

（例３４）−マウス筋組織へのウイルスパッケージング細胞のインビボでの投与

ウイルスパッケージング細胞を、例１１〜１４に記載したようにｐＶｉｒプラスミドによるトランスフェクションによって初代マウス筋芽細胞レシピエント細胞から産生する。ウイルス機能を、例２９に記載したアッセイを用いて確認する。本例において、ウイルスパッケージング細胞は、ミオスタチン（骨格筋成長の負の調節因子）に対するｍＲＮＡ転写産物をターゲッティングするｓｈＲＮＡを有する複製不能ウイルス粒子を産生する。ウイルスパッケージング細胞を、ｍｄｘマウス（デュシェンヌ型筋ジストロフィーのためのモデル系）の脛骨筋に移植する（ＬｉＳ、ＫｉｍｕｒａＥ、ＮｇＲ、ＦａｌｌＢＭ、ＭｅｕｓｅＬ、ＲｅｙｅｓＭ、ＦａｕｌｋｎｅｒＪＡ、ＣｈａｍｂｅｒｌａｉｎＪＳ．、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの細胞及び遺伝子治療研究のための高機能ミニジストロフィン／ＧＦＰ融合遺伝子（Ａｈｉｇｈｌｙｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｍｉｎｉ−ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ／ＧＦＰｆｕｓｉｏｎｇｅｎｅｆｏｒｃｅｌｌａｎｄｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙｓｔｕｄｉｅｓｏｆＤｕｃｈｅｎｎｅｍｕｓｃｕｌａｒｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．）、ＨｕｍＭｏｌＧｅｎｅｔ．２００６年５月１５日；１５（１０）：１６１０〜２２）。ウイルス活性を、ミオスタチン転写産物と、移植部位を囲む組織中におけるタンパク質レベルとの評価によってモニタする。Ｔｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、製品＃Ｔ９４２４）を用いて、未処置マウス、非特異的ｓｈＲＮＡを有するウイルス粒子を産生するウイルス産生細胞を移植したマウス、及びミオスタチン転写産物をターゲッティングするｓｈＲＮＡを有するウイルスパッケージング細胞を移植したマウスから回収した脛骨筋からＲＮＡ及びタンパク質試料を調製する。次いで、ミオスタチン転写産物及びタンパク質の相対レベルを、例１６に記載したように、それぞれＲＴ−ＰＣＲ又はＥＬＩＳＡによって評価することができる。ウイルスパッケージング細胞又は非機能ウイルスパッケージング細胞が投与されていない対照マウスに対してウイルスパッケージング細胞移植片中における体重、筋肉質量、筋肉サイズ及び筋力を比較することによって、インビボでウイルス機能をも評価する（ＢｏｇｄａｎｏｖｉｃｈＳ、ＫｒａｇＴＯ、ＢａｒｔｏｎＥＲ、ＭｏｒｒｉｓＬＤ、ＷｈｉｔｔｅｍｏｒｅＬＡ、ＡｈｉｍａＲＳ、ＫｈｕｒａｎａＴＳ．、ミオスタチン遮断によるジストロフィー筋の機能的改善（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｏｆｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃｍｕｓｃｌｅｂｙｍｙｏｓｔａｔｉｎｂｌｏｃｋａｄｅ．）、Ｎａｔｕｒｅ．２００２年１１月２８日；４２０（６９１４）：４１８〜２１．）。

（例３５）−マウス神経組織へのウイルスパッケージング細胞の投与

例１１〜１４に記載したように、ｐＶｉｒプラスミドによるトランスフェクションによってマウス神経幹細胞（ｍＮＳＣ）からウイルスパッケージング細胞を産生する。例２９に記載したアッセイによってウイルス機能を確認する。本例において、ｍＮＳＣウイルスパッケージング細胞は、変異ハンチンチン（ｈｔｔ）タンパク質のＣＡＧリピート伸長を有するｍＲＮＡ転写産物をターゲッティングするｓｈＲＮＡを担持する複製欠損ウイルスを産生する。ウイルス産生細胞をハンチントン病についてのマウスモデルの脳に移植して、ｈｔｔタンパク質の変異形に対するｍＲＮＡ転写産物のウイルス仲介ノックダウンの有効性を評価する。Ｔｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、製品＃Ｔ９４２４）を用いて、未処置マウス、非特異的ｓｈＲＮＡを含むウイルス粒子を産生するウイルス産生細胞を移植したマウス、及び変異ハンチンチン転写産物をターゲッティングするｓｈＲＮＡを有するウイルス産生細胞を移植したマウスから回収したマウス脳組織からＲＮＡ試料を調製する。次いで、ハンチンチン転写産物の相対レベルを、例１１に記載したように、ＲＴ−ＰＣＲによって評価することができる。

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引用される各文献の全ての開示（特許、特許出願、雑誌論文、要約、実験室マニュアル、本又は他の開示が含まれる）は、これによってその全体が参照により本明細書に組み込まれる。更に、これと共に提出される配列表は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本発明が、その好ましい実施形態を参照して特に示され、記載されたが、形態及び詳細の各種変更が添付の特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲から逸脱することなくその中で為され得ることは、当業者によって理解される。

前述の記載及び実施例において特に記載されるもの以外に本発明を実施することができることは明らかである。本発明の多くの修正及び変更は、上記教示に鑑みて可能であり、したがって添付の特許請求の範囲の範囲内である。

Claims

第１ポリヌクレオチドが、標的遺伝子転写物に向けられた第１生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列を含む核酸をコードし、
第２ポリヌクレオチドが、ＲＮＡ結合ドメイン配列及び細胞貫通ペプチド配列を含むポリペプチドをコードする、
第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
第１ポリヌクレオチドが、標的遺伝子転写物に向けられた生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列及び場合によって末端ミニヘリックス配列を含む核酸をコードし、
第２ポリヌクレオチドが、ＲＮＡ結合ドメイン配列及び非古典的分泌ドメイン配列を含むポリペプチドをコードする、
第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
第２ポリヌクレオチドが、非古典的分泌ドメイン配列を更に含むポリペプチドをコードする、請求項１に記載の発現ベクター。
前記ベクターが、第１プロモーター配列及び終止配列、並びに第２プロモーター配列及びポリＡ付加配列を更に含み、第１生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列及び場合による末端ミニヘリックス配列をコードするポリヌクレオチドが、第１プロモーター配列及び終止配列に作動可能に連結し、ＲＮＡ結合ドメイン配列及び細胞貫通ペプチド配列をコードするポリヌクレオチドが、第２プロモーター配列及びポリＡ付加配列に作動可能に連結する、請求項１に記載の発現ベクター。
前記ベクターが、第１プロモーター配列及び終止配列、並びに第２プロモーター配列及びポリＡ付加配列を更に含み、第１生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列及び場合による末端ミニヘリックス配列をコードするポリヌクレオチドが、第１プロモーター配列及び終止配列に作動可能に連結し、ＲＮＡ結合ドメイン配列及び非古典的分泌ドメイン配列をコードするポリヌクレオチドが、第２プロモーター配列及びポリＡ付加配列に作動可能に連結する、請求項２に記載の発現ベクター。
前記ベクターが、第１プロモーター配列及び終止配列、並びに第２プロモーター配列及びポリＡ付加配列を更に含み、第１生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列及び場合による末端ミニヘリックス配列をコードするポリヌクレオチドが、第１プロモーター配列及び終止配列に作動可能に連結し、ＲＮＡ結合ドメイン配列、細胞貫通ペプチド及び非古典的分泌ドメイン配列をコードするポリヌクレオチドが、第２プロモーター配列及びポリＡ付加配列に作動可能に連結する、請求項３に記載の発現ベクター。
第１発現カセットが、プロモーター配列、標的遺伝子に向けられた第１生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列、場合によって末端ミニヘリックス配列及び終止配列を含み、第１生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列及び場合による末端ミニヘリックス配列が、プロモーター配列及び終止配列に作動可能に連結し、
第２発現カセットが、プロモーター配列、ＲＮＡ結合ドメイン配列、細胞貫通ペプチド配列及びポリＡ付加配列を含み、ＲＮＡ結合ドメイン配列及び細胞貫通ペプチド配列が、プロモーター配列及びポリＡ付加配列に作動可能に連結する
第１発現カセット及び第２発現カセットを含む発現ベクター。
第１発現カセットが、プロモーター配列、標的遺伝子に向けられた第１生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列、場合によって末端ミニヘリックス配列及び終止配列を含み、第１生物活性ＲＮＡ配列、認識ＲＮＡ配列及び場合による末端ミニヘリックス配列が、プロモーター配列及び終止配列に作動可能に連結し、
第２発現カセットが、プロモーター配列、ＲＮＡ結合ドメイン配列、非古典的分泌ドメイン配列及びポリＡ付加配列を含み、ＲＮＡ結合ドメイン配列及び非古典的分泌ドメイン配列が、プロモーター配列及びポリＡ付加配列に作動可能に連結する
第１発現カセット及び第２発現カセットを含む発現ベクター。
第２発現カセットが、非古典的分泌ドメイン配列を更に含み、ＲＮＡ結合ドメイン配列、細胞貫通ペプチド配列及び非古典的分泌ドメイン配列が、プロモーター配列及びポリＡ付加配列に作動可能に連結する、請求項７に記載の発現ベクター。
発現ベクターが、ウイルス複製のために必要な１つ又は複数のウイルスポリメラーゼ及び１つ又は複数のウイルスアクセサリータンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を更に含む、請求項１に記載の発現ベクター。
前記ベクターが、１つ又は複数のプロモーター配列及び１つ又は複数のポリＡ付加配列を更に含み、ウイルスポリメラーゼ（単数又は複数）及びウイルスアクセサリータンパク質（単数又は複数）をコードするポリヌクレオチド配列（単数又は複数）が、１つ又は複数のプロモーター配列及び１つ又は複数のポリＡ付加配列に作動可能に連結する、請求項１０に記載の発現ベクター。
第３発現カセットが、１つ又は複数のプロモーター配列、ウイルス複製のために必要な１つ又は複数のウイルスポリメラーゼ及び１つ又は複数のウイルスアクセサリータンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列、並びに１つ又はポリＡ付加配列を含み、ウイルスポリメラーゼ（単数又は複数）及びウイルスアクセサリータンパク質（単数又は複数）をコードするポリヌクレオチド配列（単数又は複数）が、１つ又は複数のプロモーター配列及び１つ又は複数のポリＡ付加配列に作動可能に連結する、第３発現カセットを更に含む、請求項７に記載の発現ベクター。
発現ベクターが、ウイルス複製のために必要な１つ又は複数のウイルスポリメラーゼ及び１つ又は複数のウイルスアクセサリータンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を更に含む、請求項２に記載の発現ベクター。
前記ベクターが、１つ又は複数のプロモーター配列及び１つ又は複数のポリＡ付加配列を更に含み、ウイルスポリメラーゼ（単数又は複数）及びウイルスアクセサリータンパク質（単数又は複数）をコードするポリヌクレオチド配列（単数又は複数）が、１つ又は複数のプロモーター配列及び１つ又は複数のポリＡ付加配列に作動可能に連結する、請求項１３に記載の発現ベクター。
第３発現カセットが、１つ又は複数のプロモーター配列、ウイルス複製のために必要な１つ又は複数のウイルスポリメラーゼ及び１つ又は複数のウイルスアクセサリータンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列、並びに１つ又はポリＡ付加配列を含み、ウイルスポリメラーゼ（単数又は複数）及びウイルスアクセサリータンパク質（単数又は複数）をコードするポリヌクレオチド配列（単数又は複数）が、１つ又は複数のプロモーター配列及び１つ又は複数のポリＡ付加配列に作動可能に連結する、第３発現カセットを更に含む、請求項８に記載の発現ベクター。
請求項４に記載の発現ベクターを含む細胞。
請求項５に記載の発現ベクターを含む細胞。
請求項６に記載の発現ベクターを含む細胞。
請求項１１に記載の発現ベクターと、１つ又は複数のウイルスコートタンパク質及び１つ又は複数のウイルス融合タンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列、１つ又は複数のプロモーター配列及び１つ又は複数のポリＡ付加配列を含む発現ベクターと、医薬的に許容し得る担体とを含む組成物であって、該ウイルスコートタンパク質（単数又は複数）及び該ウイルス融合タンパク質（単数又は複数）をコードする該ポリヌクレオチド配列（単数又は複数）が、１つ又は複数のプロモーター配列及び１つ又は複数のポリＡ付加配列に作動可能に連結する、上記組成物。
請求項１４に記載の発現ベクターと、１つ又は複数のウイルスコートタンパク質及び１つ又は複数のウイルス融合タンパク質をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列、１つ又は複数のプロモーター配列及び１つ又は複数のポリＡ付加配列を含む発現ベクターと、医薬的に許容し得る担体とを含む組成物であって、該ウイルスコートタンパク質（単数又は複数）及び該ウイルス融合タンパク質（単数又は複数）をコードする該ポリヌクレオチド配列（単数又は複数）が、１つ又は複数のプロモーター配列及び１つ又は複数のポリＡ付加配列に作動可能に連結する、上記組成物。
請求項１９に記載の組成物を含む細胞。
請求項２０に記載の組成物を含む細胞。
請求項４に記載の発現ベクターを細胞に投与して、バイオリアクター細胞を作製することを含む、標的細胞中における１つ又は複数の標的遺伝子の発現を調節するための方法であって、バイオリアクター細胞が、標的細胞への送達のための生物活性ＲＮＡを産生し、分泌する、上記方法。
請求項１６に記載の細胞を対象に投与することを含む、対象における標的細胞中における１つ又は複数の標的遺伝子の発現を調節するための方法。
請求項２１に記載の細胞を対象に投与することを含む、対象における標的細胞中における１つ又は複数の標的遺伝子の発現を調節するための方法。
請求項４に記載の発現ベクターを対象に投与することを含む、対象における標的細胞中における１つ又は複数の標的遺伝子の発現を調節するための方法。
請求項１９に記載の組成物を対象に投与することを含む、対象における標的細胞中における１つ又は複数の標的遺伝子の発現を調節するための方法。
請求項２１に記載の組成物を対象に投与することを含む、対象における標的細胞中における１つ又は複数の標的遺伝子の発現を調節するための方法。
請求項２２に記載の組成物を対象に投与することを含む、対象における標的細胞中における１つ又は複数の標的遺伝子の発現を調節するための方法。
請求項４に記載の発現ベクターを細胞に投与することを含む、細胞から生物活性ＲＮＡ分子を分泌するための方法。
請求項５に記載の発現ベクターを細胞に投与することを含む、細胞から生物活性ＲＮＡ分子を分泌するための方法。
請求項６に記載の発現ベクターを細胞に投与することを含む、細胞から生物活性ＲＮＡ分子を分泌するための方法。
請求項１９に記載の組成物を細胞に投与することを含む、細胞から生物活性ＲＮＡ分子を分泌するための方法。
請求項２０に記載の組成物を細胞に投与することを含む、細胞から生物活性ＲＮＡ分子を分泌するための方法。
請求項２１に記載の細胞を第２細胞に投与することを含む、第２細胞から生物活性ＲＮＡ分子を分泌するための方法。
請求項２２に記載の細胞を第２細胞に投与することを含む、第２細胞から生物活性ＲＮＡ分子を分泌するための方法。