JP6608284B2 - 癌の治療に使用されるｒｎａトランススプライシング分子（ｒｔｍ） - Google Patents

癌の治療に使用されるｒｎａトランススプライシング分子（ｒｔｍ） Download PDF

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Description

本発明は、腫瘍関連遺伝子のプレmRNAに相補的な結合領域と、自殺遺伝子をコードするコーディングドメインとを含む新規のプレmRNAトランススプライシング分子（RTM）に関する。本発明の具体的な実施の形態は、扁平上皮細胞癌関連遺伝子の溶質輸送体有機アニオントランスポーターファミリーメンバー1B3（SLCO1B3）による単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（HSV-tk）等の自殺遺伝子のトランススプライシングを媒介するRTMに関する。本発明は、SLCO1B3を発現する細胞を選択的に死滅させ、したがって癌、具体的には表皮水疱症を伴う扁平上皮細胞癌の治療に有用なRTMを提供する。本発明によるRTMに関連する方法、キット及び医薬組成物も提供する。
大半の腫瘍除去戦略は、腫瘍細胞における毒素媒介細胞死誘導に焦点を合わせたものである。毒素をコードする導入遺伝子を腫瘍細胞に送達し、続く細胞の細胞死をもたらす。薬物送達及び腫瘍細胞の標的特異性における問題による治療遺伝子の非効率的な発現が、依然としてこの最新技術の現在の障害となっている。最も確立されている自殺遺伝子の1つは単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（HSV-tk）である。この酵素は、ヌクレオシド類似体ガンシクロビル（GCV）に対して高い基質親和性を示す。プロドラッグガンシクロビルは代謝産物GCV三リン酸（GCVTP）へと変換され、細胞内毒性効果が生じる。リン酸化の際にGCVは複製DNAへと組み込まれ、DNA重合の阻害、最終的にはアポトーシスによる細胞死が引き起こされる。
RNAトランススプライシングは、細胞の内因性スプライセオソームを利用することによって遺伝情報を標的mRNAへと送達する技術である。トランススプライシング反応は、遺伝子標的化のための結合ドメイン（BD）と、効率的なトランススプライシングのためのスプライシングドメインと、導入する配列を含むコーディングドメインとからなるRNAトランススプライシング分子（RTM）によって容易になる。標的プレmRNAに結合したRTMは、両分子間の特異的トランススプライシングを誘導し、内因性mRNAとRTMによって与えられるコード配列とからなる新たな遺伝子産物をもたらす。
この系は表皮水疱症（EB）、嚢胞性線維症、血友病A又は脊髄性筋萎縮症等の幾つかの遺伝的疾患において突然変異遺伝子を修正するためにin vitro及びin vivoで既に適用されている。加えて、SMaRTはキメラ分子を生成することによって高レベルの治療タンパク質及び抗体をinvivoで作製するために利用することができる。
RTMが規定の標的遺伝子に結合することによって細胞特異的な発現をもたらすことから、RNAトランススプライシングは癌遺伝子療法ともみなされていた。Puttaraju et al（非特許文献1）は、ヒト絨毛性ゴナドトロピン遺伝子6とRTMとの間の正確なトランススプライシングをin vivo及びin vitroで初めて実証した。しかしながら、EB癌における自殺RTMの臨床的適用の成功のためには、効率及び特異性を改善して、僅かな副作用で細胞死滅能を増大させる必要がある。したがって、本発明者らは臨床的に承認されたHSV-TK/GCV系を含有するRTMを評価した。二重トランスフェクション系において、本発明者らは、結腸直腸腺癌、乳癌及び肺癌、並びに最も重要なRDEB-SCCを含む様々なヒト癌と関連するマーカー遺伝子である溶質輸送体有機アニオントランスポーターファミリーメンバー1B3（SLCO1B3）を標的とするRTMを分析した。本発明者らは、半定量的リアルタイムPCR及びマイクロアレイ分析を用いてSLCO1B3の過剰発現も確認した（データは示さない）。
Spliceosome-mediated RNA trans-splicing as a tool for gene therapy. Puttaraju M, Jamison SF, Mansfield SG, Garcia-BlancoMA, Mitchell LG. Nat Biotechnol. 1999 Mar;17(3):246-52.
背景技術における上記の欠点に鑑みると、本発明の目的は、悪性細胞の選択的な死滅を可能にすると同時に健常組織を除外する自殺遺伝子の導入によって増殖性疾患、特に表皮水疱症を伴う扁平上皮細胞癌を標的とする新たな治療戦略を提供することである。
本発明の第1の様態では、上記目的は、RNAトランススプライシング分子（RTM）であって、少なくとも1つの結合ドメインと、少なくとも1つのスプライシングドメインと、少なくとも1つのコーディングドメインとを含み、前記コーディングドメインが自殺遺伝子配列を含むことを特徴とする、RNAトランススプライシング分子を提供することによって解決される。
腫瘍細胞の除去は複数の問題点による大きな課題に直面している。かかる問題の1つは正常細胞と悪性細胞との識別である。これらの細胞集団の遺伝子発現パターンの変動は、より細胞特異的な療法アプローチに新たな道を開くものである。本研究では、mRNAベースの方法であるスプライセオソーム媒介RNAトランススプライシング（SMaRT）を用いて腫瘍細胞中の過剰発現遺伝子を標的とする可能性を記載している。RNAトランススプライシングは、主に腫瘍細胞において毒素媒介細胞死を誘導する細胞及び遺伝子に特異的な技法として用いることができる。腫瘍特異的マーカー遺伝子の標的化により、より高い細胞特異性、従来の毒素ベースの適用によく見られる副作用の低減がもたらされる。標的細胞への毒素を保有するRTMの導入は、腫瘍マーカー遺伝子とRTMとの間で細胞特異的トランススプライシング反応を引き起こし、遺伝子−毒素融合mRNAを生じるはずである。その後の融合タンパク質の発現により、細胞を死滅させる毒素の影響が現れる。
本発明の第1の好ましい実施の形態では、RTMは、自殺遺伝子の配列を含有するコーディングドメインの上流に最小数の開始コドン（ATG）又は潜在的スプライス部位のみを含むように設計される。これは、トランススプライシングにより標的エクソン配列に融合することなく自殺遺伝子の望ましくない発現を低減するために必要である。かかる事象は不要な開始コドンからのRTMの直接インフレーム翻訳によって、又はRTM内の潜在的スプライス部位により、他の細胞mRNAによるスプライシング若しくは同様に自殺遺伝子の無制御な発現をもたらすシススプライシング事象が生じるために起こり得る。具体的には、本発明のRTMがRTMの結合ドメインの上流に若しくはその中に任意の開始コドン若しくは潜在的スプライス部位を含まないのが好ましく、又はRTMが自殺遺伝子のコード配列の上流に任意の開始コドン若しくは潜在的スプライス部位を含まないのが最も好ましい。「潜在的スプライス部位」という用語は、コーディングドメインに直接隣接せず、したがって結合ドメインとその標的（相補的）配列との選択的結合に依存せず、自殺遺伝子を発現し得るトランススプライシング産物又はシススプライシング産物をもたらし得る任意のスプライス部位を表す。かかる非選択的RTMは標的細胞に対する任意の選択性なしに細胞死をもたらし得るため、好ましい実施の形態では本発明に含まれない。
一実施の形態では、本発明によるプレmRNAトランススプライシング分子（RTM）は、a）核酸分子と細胞内で発現されるプレmRNAとの結合を標的とする少なくとも1つの結合ドメインと、b）トランススプライシング反応が生じるのに必要とされるモチーフを含有する少なくとも1つのスプライシングドメインと、c）少なくとも1つのコーディングドメインとを含む。スプライセオソーム媒介トランススプライシング反応を細胞において首尾よく誘導するためのRTMの一般的設計、構築及び遺伝子操作並びにその能力の実証は、米国特許第6,083,702号、同第6,013,487号、同第7,399,753号及び同第6,280,978号、並びに米国特許出願公開第09/756,095号、同第09/756,096号、同第09/756,097号及び同第09/941,492号（その開示全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に詳細に記載されている。
簡潔に述べると、RTM分子は標的シススプライシングを抑制する一方で、RTMと標的との間のトランススプライシングを増強するために、標的プレmRNAのイントロン配列に相補的な結合ドメイン（BD）をそのアンチセンス方向に保有するように設計される（Mansfield et al. 2000）。RTMは更に、強く保存された分岐点（BP）配列、ポリピリミジントラクト（PPT）及び3'アクセプタスプライス部位（ss）を含むスプライシングドメインからなる。スペーサー配列によりスプライシングドメインと標的結合ドメインとが分離される。最後に、RTMは標的プレmRNAにトランススプライスされる野生型コード配列の一部とともにコーディングドメインを含む。コーディングドメインは単一のエクソン、複数のエクソン又は全コード配列であり得る。本発明においては、コーディングドメインは好ましくは自殺遺伝子の完全なコード配列であるが、翻訳開始コドン（開始コドン：ATG）を含まない。BDは、内因性標的プレmRNAに特異的に結合することによってトランススプライシングに対する特異性をもたらすが、スプライシングドメイン及びコーディングドメインはスプライセオソームによって認識される必須のコンセンサスモチーフを与え、トランススプライシング反応を実際に生じさせる。BP及びPPTの使用はシススプライシング、更には推定上トランススプライシングに関与する2つのリン酸転移反応が生じるのに必要なコンセンサス配列に従う（Kramer 1996）。スプライセオソームによって触媒されるこれらの反応では、機能性mRNAを産生するためにイントロンを正確に切除する必要がある。RNAシススプライシングプロセスと同様の方法で、RTM RNAの結合ドメイン及びスプライシングドメイン配列はトランススプライシング後に切除され、再プログラム化された最終mRNA産物中に保持されない。
本発明の方法は、RTMの一部が標的プレmRNAの一部にトランススプライスされ、細胞内で更にプロセシング及び発現される新規のRNA分子が形成される条件下で本発明のRTMと標的プレmRNAとを接触させることを包含する。
RTMの標的結合ドメインは、RTMに標的プレmRNAに対する結合親和性を与える。本明細書で使用される場合、標的結合ドメインは、核のスプライセオソームプロセシング機構が合成RTMの一部をプレmRNAの一部にトランススプライスするように、結合特異性をもたらし、プレmRNAを合成RTMに密に固定する任意の分子、すなわちヌクレオチド、タンパク質、化学化合物等として定義される。
RTMの標的結合ドメインは、選択された標的プレmRNAの標的領域に相補的な複数の結合ドメインをそのアンチセンス方向に含有し得る。標的結合ドメインは最大で数千個のヌクレオチドを含み得る。本発明の好ましい実施の形態では、結合ドメインは少なくとも10個〜30個、最大で数百個又はそれ以上のヌクレオチドを含み得る。RTMの特異性は、標的結合ドメインの長さを増すことによって顕著に増大させることができる。例えば、標的結合ドメインは数百個又はそれ以上のヌクレオチドを含み得る。完全な相補性が好ましいが、必要というわけではない。本明細書で言及されるRNAの一部に「相補的な」配列は、標的プレmRNAとハイブリダイズし、安定した二重鎖を形成することが可能となるのに十分な相補性を有する配列を意味する。ハイブリダイズする能力は、相補性の程度及び核酸の長さの両方に依存する（例えば、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2dEd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.を参照されたい）。概して、ハイブリダイズする核酸が長いほど、安定した二重鎖を形成したうえでそれが含有し得るRNAとの塩基ミスマッチが増える。当業者は、標準手順を用いてハイブリダイズした複合体の安定性を決定することによって、許容されるミスマッチの程度又は二重鎖の長さを確認することができる。
結合は他の機構、例えばRTMを特異的RNA結合タンパク質、すなわち特異的な標的プレmRNAに結合するタンパク質を認識するように操作するような三重ヘリックス形成、アプタマー相互作用、抗体相互作用又はタンパク質／核酸相互作用によっても達成することができる。
3' RTM分子は、分岐点配列及び3'スプライスアクセプタAG部位及び／又は5'スプライスドナー部位を含む3'スプライス領域も含有する。3'スプライス領域はポリピリミジントラクトを更に含み得る。5' RTMは、GUスプライスドナー部位を含む5'スプライス部位領域を含有する。RNAスプライシングに使用される5'スプライスドナー部位及び3'スプライス領域のコンセンサス配列は、当該技術分野で既知である（Moore, et al., 1993, The RNA World, Cold Spring HarborLaboratory Press, p. 303-358を参照されたい）。加えて、5'ドナースプライス部位及び3'スプライス領域として機能する能力を維持する修飾コンセンサス配列を本発明の実施において使用することができる。簡潔に述べると、5'スプライス部位コンセンサス配列はAG/GURAGUである（A＝アデノシン、U＝ウラシル、G＝グアニン、C＝シトシン、R＝プリン及び/＝スプライス部位）。3'スプライス部位は、3つの別個の配列要素：分岐点又は分岐部位、ポリピリミジントラクト及び3'コンセンサス配列（YAG）からなる。哺乳動物の分岐点コンセンサス配列はYNYURACである（Y＝ピリミジン、N＝任意のヌクレオチド）。下線のAは分岐形成部位である。ポリピリミジントラクトは分岐点とスプライス部位アクセプタとの間に位置し、種々の分岐点利用及び3'スプライス部位認識に重要である。近年、U12依存性イントロンと称されるプレmRNAイントロン（その多くがジヌクレオチドAUで始まり、ジヌクレオチドACで終わる）が記載されている。U12依存性イントロン配列、及びスプライスアクセプタ／ドナー配列として機能する任意の配列を用いて本発明のRTMを生成することもできる。
RNAスプライス部位と標的結合ドメインとを分離するスペーサー領域もRTMに含まれ得る。スペーサー領域は、（i）任意の非スプライスRTMの翻訳を阻止するように機能し得る終止コドン、及び／又は（ii）標的プレmRNAへのトランススプライシングを増強する配列等の特徴部を含むように設計することができる。
本発明によると、好ましいRTMでは、上記自殺遺伝子配列が細胞内で発現された場合に細胞死を誘導するか、又は細胞成長若しくは細胞分裂を阻害するタンパク質をコードする。本発明に使用される自殺遺伝子は、例えば抗癌剤の非毒性プロドラッグを毒性のある抗癌剤へと変換するプロドラッグ活性化酵素であるのが好ましい。例示的な自殺遺伝子としては、単純ヘルペス1型チミジンキナーゼ（HSV-TK）及びシトシンデアミナーゼ（CD）をコードする遺伝子が挙げられる。HSV-TKは非毒性ガンシクロビル（ganciclovir）（GCV）を毒性リン酸化代謝産物へと変換し、CDは非毒性5-フルオロシトシン（5-FC）を毒性5-フルオロウラシル（5-FU）へと変換する。自殺遺伝子の付加的な例は、水痘帯状疱疹ウイルスのチミジンキナーゼ（VZV-tk）である（Lacey S F et al,Analysis of mutations in the thymidine kinase genes of drug-resistantvaricella-zoster virus populations using the polymerase chain reaction, J. Gen.Virol. 72 (PT 3), 623-630, 1991に開示されている）。更なる例はストレプトリジンO（Yang WS, Park SO, Yoon AR, Yoo JY, Kim MK, Yun CO, etal. Suicide cancer gene therapy using pore-forming toxin, streptolysin O. MolCancer Ther 2006;5:1610-9.）、又はPuttaraju et al.（上記を参照されたい）に使用されているようなジフテリア毒素である。
このため、本発明のRTMによって選択的に標的化される腫瘍細胞はプロドラッグ活性化の結果として毒性代謝産物に曝露されるため、プロドラッグ治療により影響を受けやすく、感受性が高い。この点で、活性化された毒性代謝産物を受動的に隣接腫瘍細胞へと拡散し、腫瘍の死滅を更に増強することができることが発見された。これは「バイスタンダー効果」と呼ばれる。バイスタンダー効果は、本発明のRTMによって標的化されることが可能ではなかった周辺腫瘍細胞の根絶において重要な役割を果たす。これは、RTM処理腫瘍細胞（形質導入方法の場合、全腫瘍塊のごく一部であり得る）から非処理腫瘍細胞への活性化プロドラッグの伝播に起因するものである。HSVtk/GCV系では、活性化GCVはその高電荷リン酸基のために膜透過性ではない。しかしながら、これはギャップ結合又は周辺の非形質導入腫瘍細胞を死滅させるアポトーシスベシクルの交換により非感染細胞へと移動させることができる。
本発明の方法に有用なプロドラッグは毒性生成物へと変換する、すなわち腫瘍細胞に対して毒性とすることができる任意のプロドラッグである。好ましいプロドラッグは、HSV-tkによりin vivoで毒性化合物へと変換されるガンシクロビルである（Chen et al., Cancer Res. 1996, 56: 3758-3762）。プロドラッグの他の代表例としては、アシクロビル、FIAU［1-(2-デオキシ-2-フルオロ-β-D-アラビノフラノシル)-5-ヨードウラシル］（FIALURIDINE（商標）、MoravekBiochemicals and Radiochemicals）、6-メトキシプリンアラビノシド（VZV-tkによって変換される）及び5-フルオロシトシン（シトシンデアミナーゼによって変換される）（5-フルオロシトシン、Roche）が挙げられる。
当該技術分野における通常の技術を有する医師は、患者にプロドラッグを容易に投与することができる。当該技術分野で既知の方法を用いることによって、かかる医師はプロドラッグの最も適切な用量及び投与経路を決定することも可能である。例えば、ガンシクロビルは好ましくは約1 mg／日／kg（体重）〜20 mg／日／kg（体重）の用量で全身的に（例えば経口的又は非経口的に）投与され、アシクロビルは約1mg／日／kg（体重）〜100 mg／日／kg（体重）の用量で投与され、FIAUは約1 mg／日／kg（体重）〜50 mg／日／kg（体重）の用量で投与される。
本発明の好ましい実施の形態では、RTMは腫瘍関連プレmRNAに相補的な少なくとも1つの結合ドメインを含む。腫瘍関連プレmRNAは腫瘍マーカー遺伝子、すなわち健常細胞とは対照的に腫瘍において選択的に発現される遺伝子から転写される前駆体mRNAである。当該技術分野で既知の4つの腫瘍関連遺伝子のカテゴリーが知られている。（I）突然変異抗原が腫瘍発生時に腫瘍細胞において点突然変異又は転座によって現れる。これらの抗原は厳密に腫瘍特異的である。（II）癌／生殖系列抗原は通常は成体生物の生殖系列のみで発現され、健常体細胞組織では発現されない。しかしながら、癌細胞ではエピジェネティック調節の喪失のために、生殖系列特異的遺伝子が活性化し得る。（III）分化抗原が腫瘍及びその健常前駆細胞において発現され、（IV）過剰発現腫瘍関連遺伝子は健常細胞では僅かな発現しか示さないが、腫瘍ではこれらのタンパク質は強く活性化される。
本発明による更に好ましい実施の形態では、配列番号1〜6のいずれか1つによる核酸配列を含むRTMが提供される。本発明のRTMが配列番号4〜6のいずれか1つによる配列を含むのが最も好ましい。これらは本発明のRTMに好ましい結合ドメインである。本発明においては、配列番号4〜6に示される配列のいずれか1つと少なくとも85 %、好ましくは90 %、最も好ましくは95 %、96 %、97 %、98 %又は99 %の配列同一性を有する核酸配列を含む結合ドメインを有するRTMも含まれる。
本発明による好ましい実施の形態では、前記腫瘍関連プレmRNAが固形腫瘍、とりわけ黒色腫、カポジ肉腫、扁平上皮細胞癌、頭頸部癌、悪性胸膜中皮腫、リンパ腫又は多発性骨髄腫、膠芽腫等の胃腸管、膵臓、乳房、胃、子宮頸部、膀胱、腎臓、前立腺、卵巣、子宮内膜、肺、脳、皮膚の癌、及び液性腫瘍、とりわけCML又はALL等の白血病から選択される腫瘍と関連するプレmRNAである。本発明においては、表皮水疱症を伴う扁平上皮細胞癌と関連するプレmRNAが最も好ましい。
具体的な一実施の形態では、上記腫瘍関連プレmRNAは溶質輸送体有機アニオントランスポーターファミリーメンバー1B3（SLCO1B3）である。SLCO1B3は、17-β-グルクロノシルエストラジオール、タウロコール酸、トリヨードチロニン（T3）、ロイコトリエンC4、硫酸デヒドロエピアンドロステロン（DHEAS）、メトトレキサート及びスルホブロモフタレイン（BSP）等の有機アニオンのNa（+）非依存性取込みを媒介する。コードされるタンパク質は、内因性化合物及び生体異物化合物のナトリウム非依存性取込みを媒介し、胆汁酸及びビリルビン輸送において重要な役割を果たす膜貫通受容体である。SLCO1B3については6つのスプライス変異体が知られている。遺伝子は12番染色体のフォワード鎖に位置する：20963636-21243040。
RTMの結合ドメインが遺伝子SLCO1B3のイントロンに対して相補的な配列を含むことが本発明によると好ましい。しかしながら、本発明の更なる実施の形態では、結合ドメインはエクソン又は混合イントロン／エクソンであってもよい。かかるRTMの混合結合ドメインの例は、例えば欧州特許第2151248号に見ることができる。
イントロンがSLCO1B3の少なくとも最初のタンパク質コーディングエクソンに続くイントロン、したがって例えばイントロン3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13又は14、最も好ましくは（preferentially）イントロン3であることが好ましい。このため、本発明によるRTMは好ましくは細胞におけるトランススプライシングの際に、SLCO1B3の最初のエクソン（エクソン3）と自殺遺伝子の開始コドンを含まない自殺遺伝子（例えばHSV-TK）のコード配列とから構成されるトランススプライスmRNAを生じる。しかしながら、このことは、本発明のRTMがその結合ドメイン内に標的遺伝子のエクソン配列、したがって好ましくはSLCO1B3遺伝子のエクソン配列に相補的な配列を更に含有することを排除するものではない。
SLCO1B3の遺伝子配列のイントロン3のヌクレオチド1075と1100との間、好ましくはSLCO1B3の遺伝子配列のイントロン3のヌクレオチド1050と1100との間、最も好ましくはSLCO1B3の遺伝子配列のイントロン3のヌクレオチド1012と1118との間のヌクレオチド配列と少なくとも80 %、85 %、90 %、95 %、96 %、97 %、98 %、99 %又は100 %同一の配列に対して（選択的に）結合する結合ドメインを有する本発明によるRTMが更により好ましい。上にも記載されているように、付加的な好ましい一実施の形態では本発明のRTMによる結合配列は修飾配列を有する。元の結合ドメインと比較した修飾は、開始コドン（少なくとも自殺遺伝子のコード配列とインフレームのもの）が除去される及び／又は任意の潜在的スプライス部位が除去されるものである。
本発明の付加的な一実施の形態は、上記スプライシングドメイン中の少なくとも1つの安全配列及び／又は隣接エクソン配列に相補的な少なくとも1つの配列を更に含む、本明細書に記載のRTMに関する。上記「安全配列」は非特異的トランススプライシングを防ぐためにスペーサー、結合ドメイン又はRTMの他の部分に組み込まれる。これは、非特異的トランススプライシングを防ぐ比較的弱い相補性によってRTMの3'及び／又は5'スプライス部位の要素をカバーするRTMの領域である。RTMは、RTMの結合／標的化部分（複数の場合もあり）のハイブリダイゼーションの際に、3'及び／又は5'スプライス部位がカバーされず、完全に活性となるように設計される。かかる「安全配列」は、RTM分岐点、ピリミジントラクト、3'スプライス部位及び／又は5'スプライス部位（スプライシング要素）の片側又は両側に結合するシス配列の1つ若しくは複数の相補的なストレッチを含む（又は第2の別個の核酸鎖であり得る）か、又はスプライシング要素自体の一部に結合し得る。この「安全」結合は、スプライシング要素が活性となることを防ぐ（すなわち、U2 snRNP又は他のスプライシング因子がRTMスプライス部位認識要素に付着するのを阻止する）。「安全配列」の結合はRTMの標的結合領域が標的プレmRNAに結合し、それによりRTMスプライシング要素が曝露及び活性化する（標的プレmRNAへのトランススプライスに利用可能となる）ことによって破壊され得る。
核酸分子と標的プレmRNAとの結合が相補性（すなわち核酸の塩基対合特徴に基づく）、三重ヘリックス形成（例えば、Suzuki T. Targeted gene modification byoligonucleotides and small DNA fragments in eukaryotes. Front Biosci. 2008 Jan1;13:737-44. Review. Dang N, Klingberg S, Marr P, Murrell DF. Review ofcollagen VII sequence variants found in Australasian patients with dystrophicepidermolysis bullosa reveals nine novel COL7A1 variants. J Dermatol Sci. 2007 Jun;46(3):169-78.Reviewに記載される）、又はタンパク質−核酸相互作用（それぞれの文献に記載される）によって媒介される、本発明によるRTMが更に好ましい。
本発明の別の態様は、トランススプライスされるエクソンがRNAi様効果をもたらすために天然の又は人工的に導入された終止コドン及び／又はステム形成構造である、本発明によるRTMに関する。
本発明においては、RTMがトランススプライシング効率、発現又はRNA安定性を改善する更なる3'UTRを含むのが更に好ましい。RNA発現／安定性を修飾するポリアデニル化シグナル、又はスプライシングを増強する5'スプライス配列、分子の安定性を変化させ、分解を防ぐ、付加的な結合領域、「安全」自己相補的領域、付加的なスプライス部位又は保護基等の付加的な特徴部をRTM分子に付加させることができる。加えて、非スプライスRTMの翻訳を防ぐために終止コドンがRTM構造に含まれ得る。核局在化及びスプライセオソーム組込み及び細胞内安定性を促進する又は容易にするために3'ヘアピン構造、環状RNA、ヌクレオチド塩基修飾又は合成類似体等の更なる要素をRTMに組み込むことができる。
本発明によるRTMはDNA、RNA、DNA/RNAハイブリッド又は核酸類似分子等の核酸分子である。
次に、本発明の別の態様は上記の本発明によるRTMを含む組み換え発現ベクターに関する。本発明の意味の範囲内のベクターは、導入されることが可能な又は細胞に含まれる核酸を導入することが可能な核酸である。導入核酸によりコードされるRTMがベクターの導入の際に細胞内で発現されるのが好ましい。上記ベクターは真核生物発現ベクター、好ましくはウイルス由来配列から構成されるベクターであるのが好ましい。導入遺伝子発現を誘発するために皮膚細胞、好ましくはケラチノサイトに特異的な調節要素を更に含む本発明のベクターが更に好ましい。
in vitro又はin vivo発現に好適な発現ベクターは文献中に見ることができる。本発明の方法に適用するために当業者はこれらのベクターを容易に修飾することもできる。発現ベクターは、通常は特異的RTM分子の生成に必要な全ての遺伝要素を含有する。本発明の幾つかの実施の形態では、本発明による発現ベクターは例えば発現、特にin vivoで誘導性の及び／又は制御可能な発現のために設計される好適なベクター中の「導入遺伝子」、すなわち発現要素の形態を有し得る。したがって、導入遺伝子は本明細書で論考される発現のための或る特定の遺伝子制御要素とともに本発明の核酸を含む。
好ましい実施の形態では、本発明のベクターはプラスミド、ファージミド、ファージ、コスミド、人工哺乳動物染色体、ノックアウト又はノックイン構築物、ウイルス、特にアデノウイルス、ワクシニアウイルス、レンチウイルス（Chang, L.J. and Gay, E.E. (20001) Curr. Gene Therap. 1: 237-251）、単純ヘルペスウイルス（HSV-1、Carlezon, W.A. et al. (2000) Crit.Rev. Neurobiol.; 14(1): 47-67）、バキュロウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV、Carter, P.J. and Samulski, R. J. (2000)J. Mol. Med. 6: 17-27）、ライノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、フィロウイルス及びそれらを操作したもの（例えば、Cobinger G. P. et al (2001) Nat. Biotechnol. 19: 225-30を参照されたい）、ビロソーム、「ネイキッド」DNAリポソーム及び核酸被覆粒子、特に金粒子（spheres）を含む。アデノウイルスベクター又はレトロウイルスベクターのようなウイルスベクターが特に好ましい（Lindemann et al. (1997) Mol. Med. 3: 466-76 and Springer et al.(1998) Mol. Cell. 2: 549-58）。リポソームは、通常は例えばリポソーム懸濁液の超音波処理によって中性、カチオン性及び／又はアニオン性脂質から作製される小さな単層又は多層ベシクルである。DNAを例えばリポソームの表面にイオン結合するか、又はリポソームの内部に封入することができる。好適な脂質混合物は当該技術分野で既知であり、例えばコレステロール、例えばホスファチジルコリン（phosphatidylcholin）（PC）、ホスファチジルセリン（phosphatidylserin）（PS）等のようなリン脂質（phospholipid）、様々な細胞株で使用されているDOTMA（1,2-ジオレイルオキシプロピル-3-トリメチルアンモニウムブロミド（1,2-Dioleyloxpropyl-3-trimethylammoniumbromid））及びDPOE（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（Dioleoylphosphatidylethanolamin））を含む。核酸被覆粒子は、細胞への粒子の機械的導入を可能にするいわゆる「遺伝子銃」を用いて核酸を細胞に導入する別の手段である。好ましくは、粒子自体は不活性であり、したがって好ましい実施の形態では金粒子から作製される。
本発明の好ましい実施の形態では、本明細書に記載のベクターは、導入遺伝子の発現を調節する皮膚細胞、好ましくはケラチノサイト、線維芽細胞又は内皮細胞に特異的な調節要素を更に含む。
本発明は、本発明のポリヌクレオチドベクター構築物を用いて形質転換される宿主細胞にも関する。宿主細胞は原核生物又は真核生物の細胞であり得る。細菌細胞は状況によっては好ましい原核生物宿主細胞であり、典型的には大腸菌（E. coli）株、例えばBethesda Research LaboratoriesInc.（Bethesda，MD，USA）から入手可能な大腸菌DH5株、及びアメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）（Rockville，MD，USA）から入手可能なRR1（NoATCC 31343）である。好ましい真核生物宿主細胞としては、酵母、昆虫及び哺乳動物細胞、好ましくはマウス、ラット、サル又はヒト線維芽細胞及び結腸細胞株に由来する脊椎動物細胞が挙げられる。酵母宿主細胞としては、一般にStratagene Cloning Systems（La Jolla，CA 92037，USA）から入手可能なYPH499、YPH500及びYPH501が挙げられる。好ましい哺乳動物宿主細胞としては、ATCCからCCL61として入手可能なチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、ATCCからCRL1658として入手可能なNIH Swissマウス胚細胞NIH/3T3、ATCCからCRL 1650として入手可能なサル腎臓由来COS-1細胞、及びヒト胎児腎臓細胞である293細胞が挙げられる。好ましい昆虫細胞は、バキュロウイルス発現ベクターをトランスフェクトすることができるSf9細胞である。発現に好適な宿主細胞の選択に関する概要は、例えばPaulinaBalbas and ArgeliaLorenceの教科書である「分子生物学組み換え遺伝子発現の方法、概説及びプロトコル（Methods inMolecular Biology Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols）」第1部、第2版（ISBN978-1-58829-262-9）、及び当業者に既知の他の文献に見ることができる。好ましい宿主（host）細胞は、本発明によるRTM分子又は組み換え発現ベクターを含む組み換え細胞、好ましくはケラチノサイト等の組み換え皮膚細胞、線維芽細胞又は内皮細胞である。
本発明のDNA構築物による適切な細胞宿主の形質転換は、典型的には使用するベクターのタイプに応じて異なる既知の方法によって達成される。原核生物宿主細胞の形質転換に関しては、例えばCohen et al (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110及びSambrook et al (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NYを参照されたい。酵母細胞の形質転換はSherman et al (1986) Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor, NYに記載されている。Beggsの方法（(1978) Nature 275, 104-109）も有用である。脊椎動物細胞に関しては、かかる細胞のトランスフェクトに有用な試薬、例えばリン酸カルシウム及びDEAE-デキストラン又はリポソーム配合物がStratagene Cloning Systems又はLifeTechnologies Inc.（Gaithersburg，MD20877，USA）から入手可能である。エレクトロポレーションも細胞を形質転換及び／又はトランスフェクトするのに有用であり、酵母細胞、細菌細胞、昆虫細胞及び脊椎動物細胞の形質転換に関して当該技術分野で既知である。
次に、本発明の別の様態は、生理学的に許容可能な担体と、本発明によるRTM分子、本発明による組み換え発現ベクター又は本発明による組み換え皮膚細胞とを含む医薬調製物に関する。次に、本発明の更に別の様態は、薬剤として使用される、本発明によるRTM分子、本発明による組み換え発現ベクター、本発明による組み換え皮膚細胞又は本発明による医薬調製物に関する。
具体的な実施の形態では、「薬学的に許容可能な」という用語は連邦政府若しくは州政府の規制機関によって認可されているか、又は米国薬局方若しくは動物、より具体的にはヒトへの使用に関する他の一般的に承認された薬局方に記載されていることを意味する。「担体」という用語は合成物とともに投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤又はビヒクルを指す。好適な医薬担体の例は、E. W. Martinによる「レミントンの薬剤学（Remington'sPharmaceutical sciences）」に記載されている。
具体的な実施の形態では、（1）例えばタンパク質が欠如した、遺伝的に欠損した、生物学的に不活性な若しくは低活性の、若しくは低発現の宿主における内因性タンパク質若しくは機能の非存在若しくは（正常又は所望レベルに対して）低下したレベルに関する疾患若しくは障害、又は（2）in vitro若しくはinvivoでアッセイにより特定のタンパク質の機能を阻害する合成RTMの有用性が示される疾患若しくは障害において医薬組成物を投与する。合成RTM媒介トランススプライシング反応によって生じるキメラmRNAによりコードされるタンパク質の活性は、例えば宿主組織サンプルを（例えば生検組織から）得て、それをin vitroで発現されたキメラmRNAのmRNA又はタンパク質レベル、構造及び／又は活性についてアッセイすることによって容易に検出することができる。したがって、キメラmRNAによってコードされるタンパク質を検出及び／又は可視化する免疫測定法（例えばウエスタンブロット法、免疫沈降に続くドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動、免疫細胞化学等）、及び／又はキメラmRNAの存在を検出及び／又は可視化することによってキメラmRNA発現の形成を検出するハイブリダイゼーションアッセイ（例えばノーザンアッセイ、ドットブロット法、in situハイブリダイゼーション及び逆転写PCR等）等を含むが、これらに限定されない当該技術分野で標準的な多くの方法を用いることができる。代替的には、合成RTMによってコードされる又はRTMと関連するレポーター遺伝子の直接可視化を行うことができる。
本発明は、有効量の合成RTM又は合成RTMをコードする核酸と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物も提供する。具体的な実施の形態では、本発明の医薬組成物を、治療を必要とする部位に局所的に投与することが望ましい場合もある。これは例えば、限定されるものではないが、外科手術時の局所注入、局所適用、例えば外科手術後の創傷包帯と併せた局所適用、注射により、カテーテルを用いて、坐剤を用いて、又はサイラスティック（silastic）膜等の膜若しくは繊維を含む多孔質、非多孔質若しくはゼラチン状材料の移植片、又はナノ粒子、放出制御ポリマー等のマトリックス、ヒドロゲル等の他の放出制御薬物送達系を用いて達成することができる。RTM又は合成RTMは、標的細胞において所望の効果をもたらすのに効果的な量で投与される。合成RTMの効果的な投与量は、生物学的半減期、バイオアベイラビリティ及び毒性等のパラメーターを扱う当業者に既知の手順によって決定することができる。本発明の組成物の効果的な量は治療される疾患又は障害の性質に応じて異なり、標準的な臨床技法によって決定することができる。加えて、最適な投与量範囲の特定を助けるためにin vitroアッセイを任意に用いることができる。
本発明は、本発明の医薬組成物の1つ又は複数の成分で満たされた1つ又は複数の容器を含む医薬パック又はキットであって、任意にかかる容器にヒト投与のための製造、使用又は販売の機関による認可を反映する医薬品又は生物学的製品の製造、使用又は販売を規制する行政機関によって規定される形態の注意書きが付随し得る、医薬パック又はキットも提供する。
本発明の任意の分子、核酸、発現ベクター又は細胞は、本明細書に記載の障害の治療に有用である。したがって、本発明の任意の分子は薬剤として又は薬剤の製造において使用することができる。分子は単独で、又は本発明の他の分子（複数の場合もあり）若しくは既知の分子（複数の場合もあり）と組み合わせて使用することができる。
好ましくは、本発明の薬剤は患者、罹患器官に直接、若しくは全身的に皮内、筋肉内、皮下、腹腔内及び静脈内に投与するか、又は患者に由来する細胞若しくはヒト細胞株にex vivoで適用し、これを続いて患者に投与するか、又はin vitroで組み換え細胞の作製に使用し、これを次いで患者に再投与することができる。本発明の好ましい実施の形態では、本発明によるRTMの投与に続いて、プロドラッグを投与して標的細胞の死滅を開始させる。
本発明のアミノ酸は実質的に純粋であっても、又は好適なベクター若しくは送達系に含有されていてもよい。核酸はDNA、cDNA、PNA、CNA、RNA又はそれらの組合せであり得る。かかる核酸を設計及び導入する方法は当該技術分野で既知である。概要は例えばPascolo S. 2006、Stan R. 2006又はA Mahdavi 2006によって提示される（Mahdavi A, Monk BJ.Recent advances in human papillomavirus vaccines. Curr Oncol Rep. 2006 Nov;8(6): 465-72. Stan R, Wolchok JD, Cohen AD. DNA vaccines against cancer. HematolOncol Clin North Am. 2006 Jun; 20(3): 613-36. Pascolo S. Vaccination withmessenger RNA. Methods Mol Med. 2006; 127:23-40を参照されたい）。ポリヌクレオチドワクチンは調製が容易であるが、免疫応答の誘導におけるこれらのベクターの作用機序は完全には理解されていない。好適なベクター及び送達系としては、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス、又は2つ以上のウイルスの要素を含有するハイブリッドをベースとする系等のウイルスDNA及び／又はRNAが挙げられる。非ウイルス送達系としてはカチオン性脂質及びカチオン性ポリマーが挙げられ、DNA送達の技術分野で既知である。例えば「遺伝子銃」による物理的送達を使用してもよい。
したがって、本発明は皮膚又は他の上皮の障害、例えば表皮水疱症、嚢胞性線維症、先天性爪肥厚症、自己免疫疾患、例えば乾癬又は神経皮膚炎、及び皮膚癌の治療に有用な薬剤を提供する。
次に、本発明の別の態様は、皮膚又は他の上皮の障害、例えば表皮水疱症、嚢胞性線維症、先天性爪肥厚症、自己免疫疾患、例えば乾癬又は神経皮膚炎、及び皮膚癌から選択される疾患の治療への本発明によるRTM、本発明による組み換え発現ベクター、本発明による組み換え皮膚細胞又は本発明による医薬調製物の使用に関する。上記薬剤を皮膚に適用する、本発明による使用が好ましい。上記のそれぞれの疾患の治療方法も本発明の範囲に包含される。
本発明の配合物はそれぞれの活性化合物、特に本発明のRTMの局所、経口（経腸）、経鼻、経眼、皮下、皮内、筋肉内、静脈内又は経皮等の任意の許容可能な経路による投与に好適なものである。投与は好ましくは皮下、最も好ましくは局所である。投与は注入ポンプによるものであってもよい。
本発明により治療される好ましい疾患は増殖性疾患、好ましくは皮膚癌、最も好ましくは扁平上皮細胞癌等の癌性疾患、又は皮膚及び上皮の遺伝障害、例えば表皮水疱症、嚢胞性線維症、先天性爪肥厚症、免疫疾患、例えば乾癬若しくは神経皮膚炎から選択される疾患である。
したがって、本発明の付加的な一態様は本明細書で上に記載の疾患を治療又は予防する方法に関する。治療方法はかかる治療を必要とする患者にRTM分子を投与すること、続いてプロドラッグを投与することを含む。プロドラッグはトランススプライシング反応が起こる細胞において又は自殺遺伝子により細胞死を開始させる。
ここで、本発明を以下の実施例において添付の図面及び配列を参照して更に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。本発明の目的上、本明細書に引用される全ての参照文献は、その全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
効率的なトランススプライシングについての特異的結合ドメイン（BD）の評価を示す図である。（A）BDの評価に用いられるスクリーニング手順の概要図。（B）SLCO1B3の標的イントロン3内のRTM_1の結合位置（nt1012-nt1118）。（C）標的分子、RTM_1、又は標的分子＋RTM_1の両方をトランスフェクトしたHEK293細胞におけるフローサイトメトリーによるAcGFP発現の分析。標的分子及びRTM_1を共トランスフェクトした細胞のみが、RNAトランススプライシングによる両方のAcGFP分離部分の融合のために緑色の蛍光シグナルを示した。 （A）実験手順に使用される構築物。（B）RTM評価に用いられる二重トランスフェクション系の概要図。SLCO1B3-MGへのRTMの正確なトランススプライシングにより、SLCO1B3のエクソン3及びTKからなる融合mRNAが生じる。 SLCO1B3-TK融合構築物の発現及び自殺遺伝子活性を示す図である。（A）HSV-TK（37 kDa）又はSLCO1B3-TK融合物（40 kDa）とのトランスフェクションの48時間後のHEK293AD細胞のウエスタンブロット分析。非処理細胞を陰性対照とし、α−アクチニン（100kDa）をローディング対照として使用した。（B）MTTアッセイを行い、SLCO1B3-MGとTK-RTMとの特異的RNAトランススプライシングによって生じる産物である発現SLCO1B3-TK融合タンパク質の機能性を分析した。細胞生存性は非トランスフェクトHEK293AD細胞に対するパーセンテージとして表す。 トランススプライシングの検出を示す図である。（A）SLCO1B3-MG及びRTMorg（1）、RTMm1（2）、RTMm2（3）を用いて二重トランスフェクトしたHEK293AD細胞のSqRT-PCR分析。SCO1B3及びHSV-TKの融合mRNAのPCR産物（205 bp）を示す。GAPDHをハウスキーピング遺伝子として使用した。PCR産物を直接シークエンシングによって検証し、SLCO1B3-MGとRTMとの間の正確なトランススプライシングが実証された。（B）単一トランスフェクト及び共トランスフェクトHEK293AD細胞のウエスタンブロット分析。α−アクチニン染色（100 kDa）をローディング対照とした。 （A）MTTアッセイを行い、細胞生存性の低減を測定した。100 ngの各RTM及び異なる濃度のSLCO1B3-MG（100 ng、500 ng、1000 ng）をHEK293AD細胞にトランスフェクトし、100 μMで処理した。SLCO1B3-MG単独、SLCO1B3-TK融合物又はHSV-TKを用いてトランスフェクトしたHEK293AD細胞を、それぞれ陰性対照及び陽性対照とした。2回の独立実験の平均±SDを示す。全実験において各々のサンプルで6回の反復試験を測定した。細胞生存性のパーセンテージは方程式：（OD GCV−処理／OD GCV−非処理）×100／陰性対照（OD GCV−処理／OD GCV−非処理）によって算出した。（B）RTMm2及びRTMm2+MGで処理したHEK293AD細胞におけるTUNELアッセイによるin situ細胞死検出を、フローサイトメトリー分析によって評価した。本実験ではSLCO1B3-TK融合物を陽性対照とした。TMR red陽性細胞のオーバレイを示す。黒線はGCV非処理細胞集団を表し、赤線はGCV処理細胞集団を表す。（C）アポトーシス細胞のTMR red染色を蛍光顕微鏡法分析によって示す。細胞数の減少を光学顕微鏡法分析によって可視化した。 種々のRTM；RTMorg、RTMm1及びRTMm2の配列アラインメントを示す図である。
配列番号1は、図6のアラインメントに使用されるRTMorgの配列の一部を示す。
配列番号2は、図6のアラインメントに使用されるRTMm1の配列の一部を示す。
配列番号3は、図6のアラインメントに使用されるRTMm2の配列の一部を示す。
配列番号4はRTMorgの結合ドメイン配列を示す。
配列番号5はRTMm1の結合ドメイン配列を示す。
配列番号6はRTMm2の結合ドメイン配列を示す。
配列番号7〜16はプライマー配列を示す。
実施例1：効率的なRTM結合ドメインのスクリーニング
結合ドメイン（BD）スクリーニングは、内因性目的で高度に効率的なRTMの構築の加速を助けるものである。蛍光ベースのRTMスクリーニング手順を用いて、標的イントロンにおいて様々な結合局在化を有する無作為に作製されたBDのプールからSLCO1B3のイントロン3に特異的な有望なBDを選択することが可能であった。全体として、28個の個々の3' RTMを、HEK293AD細胞への設計された標的分子との共トランスフェクション後にフローサイトメトリー分析によってそのトランススプライシング効率について試験した（データは示さない）。標的分子のイントロン3に特異的なRTMの結合は、共トランスフェクト細胞における完全長レポーターの発現で認められる3' RNAトランススプライシングによる両方のAcGFP分離配列部分の融合を誘導する。蛍光シグナルの強度及びAcGFP発現細胞の量は、トランスフェクトRTMのトランススプライシング効率と相関する（図1A）。分析から、RTM_1（イントロン3における結合位置：nt1012-nt1118）が最も効率的なRTMの1つであることが明らかとなり、したがってチミジンキナーゼベースの誘導性細胞死系における初期試験に選択した（図1B＋図1C）。
実施例2：SLCO1B3-MGとTK-RTMとのトランススプライシング
自殺遺伝子療法アプローチにおけるRTMの特異性を更に評価するために、RTM_1由来のBDを単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼ（TK）配列を含有する自殺RTMプラスミドにクローニングした。潜在的スプライス部位及び開始コドンを低減するためにスプライシングドメインの上流の配列を突然変異させ、RTMorg、RTMm1及びRTMm2と称される3つの異なるRTMを得た。RTMの配列修飾に関する詳細な情報は図6に提示する。
実験HEK293細胞において内因性RDEB-SCC状況を模倣するために、腫瘍マーカー遺伝子SLCO1B3のエクソン3及びイントロン3の最初の1200塩基を保有するミニ遺伝子（MG）ベクターを設計した。HSV-TK及びSLCO1B3-TK発現ベクターを本実験手順の陽性対照とした（図2A）。図2Bには、二重トランスフェクション系の概要図を示す。MGプレmRNAによるRTMの正確なトランススプライシングの際には、元のHSV-TKよりもおよそ3 kDa大きい融合タンパク質をコードするSCLO1B3エクソン3及びHSV-TKの融合mRNAが生成する。
実施例3：SLCO1B3-TKの融合タンパク質は自殺遺伝子活性を示す
TK-RTM調査の前に、SLCO1B3-MGとTK-RTMとのトランススプライシング反応によって生じる融合タンパク質が正確に発現され、依然として自殺遺伝子としての機能性を有するか否かを決定した。この目的で、SLCO1B3エクソン3及びHSV-TKのキメラcDNAを作製し、HEK293AD細胞の全細胞溶解物でのその発現をウエスタンブロット分析によって確認した（図3A）。SLCO1B3-TK融合タンパク質を、元のHSV-TK（37 kDa）よりも3kDa大きい40 kDaの予測分子量で検出した。さらに、SLCO1B3-TK融合タンパク質の生物活性をMTT細胞生存性アッセイにおいて評価した（図3B）。HEK293AD細胞にプラスミドHSV-TK又は融合構築物をトランスフェクトし、100 μMのGCVで処理した。ここで、SLCO1B3-TK融合タンパク質が、細胞死を誘導する毒性代謝産物へとプロドラッグGCVを変換することが可能であり、元のHSV-TKと同様の細胞生存性の低減をもたらすことが実証された。したがって、これらのデータから、同様に本実験設定のトランススプライシング手順に起因する融合構築物の機能性が確認された。
実施例4：mRNAレベル及びタンパク質レベルでのSLCO1B3-TK融合の検出
SLCO1B3-MGと各々個々のRTMとの正確なトランススプライシングを調査するために、初めにsqRT-PCRを行った。アガロースゲル上に示される205 bp PCR産物によって表される3つ全ての共トランスフェクト細胞集団において正確な融合mRNAが検出された（図4A）。興味深いことに、発現量における有意差は観察されなかった（データは示さない）。加えて、ウエスタンブロット分析を行い、トランススプライシング産物をタンパク質レベルでも確認した。図4Bに示されるように、改善されたRTMであるRTMm1及びRTMm2とは対照的に、RTMorgをトランスフェクトした細胞においてHSV-TKの高バックグラウンド発現が維持された。さらに、標的及び各々個々のRTMの二重トランスフェクションから、RTMorgがトランススプライス融合構築物（40 kDa）及びバックグラウンドHSV-TKタンパク質（37 kDa）を示すことが明らかとなった。しかしながら、RTMm1及びRTMm2トランスフェクト細胞ではHSV-TKのバックグラウンド発現は殆ど観察されず、トランススプライス融合タンパク質が依然として発現された。このデータから、配列最適化によるRTMの改善がHSV-TKの不要な発現を低減するのに重要であることが示される。
実施例5：RNAトランススプライシングによる自殺遺伝子誘導
RNAベースの方法であるSMaRTは遺伝子及び細胞への特異性をもたらし、それにより他の毒素媒介細胞死アプローチに付随する不要な副作用を低減する。細胞死は主に上方調節された腫瘍マーカー遺伝子SLCO1B3を発現する細胞において誘導される。図4Bに示されるタンパク質レベルでの融合構築物の発現は、MTTアッセイにおいて測定される細胞生存性の低減とも相関した（図5A）。RTMorgの単一トランスフェクションから、BDの上流及びBD内の代替開始コドン（ATG）及びスプライス部位によって説明可能なHEK293AD細胞におけるアポトーシスの誘導が既に実証されている。このことから、代替インフレームTKタンパク質がRTMベクターから発現し、処理細胞においてRTM単独の毒性効果を引き起こす可能性がある。さらに、RTMorg及びSLCO1B3-MGの共トランスフェクションは細胞生存性の僅かな低減を示し、トランススプライシング効果の低下が示された。しかしながら、部位特異的突然変異誘発によるRTMのBD配列内及びその上流のATG及び生じ得る潜在的スプライス部位の欠失はRTM媒介副作用を顕著に低減した。RTMm1及びRTMm2は、100 ngプラスミド／トランスフェクションを用いてアポトーシスを誘導する最小限の能力しか示さなかった。さらに、異なる量のSLCO1B3-MG（100 ng、500ng、1000 ng）の添加はトランススプライシングによるMGのSLCO1B3エクソン3とRTMのTKとの融合をもたらし、トランスフェクト細胞における機能性SLCO1B3-TK融合タンパク質の発現を誘導した。RTMm1及びRTMm2はどちらもMG添加後に細胞生存性の明らかな減少を用量依存的に誘導した。さらに、HSV-TK及びSLCO1B3-TK融合タンパク質を発現するプラスミドのトランスフェクションから、MGのみをトランスフェクトしたHEK293AD細胞と比較した細胞生存性の明らかな低減が示された（図5A）。
トランスフェクトHEK293AD細胞に対して行ったTUNELアッセイから、トランススプライシング構築物による誘導性細胞死系の信頼性及び機能性が強調された（図5B）。HEK293AD細胞へのSLCO1B3-MG（1 μg）及びRTMm2（100 ng）の共トランスフェクションにより、最大で63.8 %の細胞においてアポトーシスが誘導されることがフローサイトメトリーにより明らかとなった。この結果は、SLCO1B3-TK融合対照ベクターで達成された細胞の致死率と同程度である。SLCO1B3-MG及びRTMm2共トランスフェクト細胞に対する蛍光顕微鏡法から、RTMm2単一トランスフェクト細胞と比較して健常細胞の減少（光学顕微鏡法）と相関するTMR red染色の増大が明らかとなった。
材料及び方法
RTMスクリーニング構築物
SLCO1B3標的分子：
標的分子はAcGFPの5'コード領域（nt1-nt336）、機能性5'スプライス部位（ag/gtaag）及びSLCO1B3のイントロン3のヌクレオチド4-1200（生じ得る競合的5'ssの生成を回避するためにイントロン3の最初の3ヌクレオチドを除去した）を有する。イントロン3部分を、Gotaq DNAポリメラーゼ（Promega）、健常ドナーのゲノムDNA及びクローニングのための制限酵素認識部位を挿入するイントロン特異的プライマー対（fw：5'-gatcgatatcgaatgggttttatattttcaaactaaaataagttaatggaaaattttt-3' 配列番号7；rv：5'-gagagcggccgcgatttgaatatacatttctcaaaagaagacatacaaatagc-3' 配列番号8）を使用するPCRによって増幅した。PCR産物を、EcoRV及びNotI制限酵素認識部位を用いて発現ベクターpcDNA 3.1D/V5-His-TOPOの5' AcGFP配列の下流にライゲートした。増幅PCR産物のゲル抽出を、GFXTM PCR DNA及びゲルバンド精製キット（GE Healthcare）を用いて行った。プラスミド調製を、Sigma-Aldrich（St. Louis，MO，USA）のPlasmid Mini Prep Kitを用いて製造業者のプロトコルに従って行った。全てのプラスミド及びPCR産物の配列分析を、3130 ABI Prism自動シークエンサー及びABI PRISM色素ターミネーターサイクルシークエンシングキット（AppliedBiosystems）を用いて行った。
RNAトランススプライシング分子：
RTM骨格は、効率的なスプライシングのための短スペーサー領域及び3'スプライシング要素（分岐点、ポリピリミジントラクト、3'アクセプタスプライス部位）を保有するスプライシングドメインと、AcGFPの欠損3'コード配列（nt337-nt720）に組み込まれたコーディングドメインと、内部リボソーム侵入部位（IRES）の翻訳制御下で発現する完全長DsRED遺伝子とからなる［14，19］。SLCO1B3のイントロン3に特異的な多様なRTMライブラリーの作成を、Bauer et al.（Bauer et al. 2012 in press, wirdnoch eingefuegt）に従って行った。結合ドメイン（BD）ライブラリーのクローニング手順はSLCO1B3のイントロン3部分のPCR増幅、超音波処理（氷上で約10分間）によるPCR産物の断片化、及び最後にHpaI制限酵素認識部位を用いた得られる末端修復（DNATerminator（商標） End Repair Kit、LucigenCorporation）フラグメントのRTMベクターのスプライシングドメインの上流へのクローニングを含む。
HSV-TKベースの誘導性細胞死系の構築物
SLCO1B3ミニ遺伝子：
内因性トランススプライシングシナリオを可能な限り厳密にシミュレートするために、SLCO1B3の最初のコーディングエクソン（エクソン3：84ヌクレオチド）及び完全なイントロン（39205ヌクレオチド）の巨大なサイズのためにイントロン3の最初の1200塩基からなるSLCO1B3ミニ遺伝子（SLCO1B3-MG）を構築した。SLCO1B3のエクソン／イントロン3領域を、健常ドナーのゲノムDNAからGotaqDNAポリメラーゼ（Promega）及び特異的プライマー対（fw：5'-gatcaagcttatggaccaacatcaacatttgaataaaacagc-3' 配列番号9、rv：5'-gagagcggccgcgatttgaatatacatttctcaaaagaagacatacaaatagc-3' 配列番号10）を用いてPCR増幅した。得られるPCR産物を、pcDNA 3.1D/V5-His-TOPOベクター（Invitrogen）にHindIII及びNotI制限酵素認識部位を用いてクローニングした。
TK-RTM：
初めに、蛍光ベースのスクリーニング系で評価した最も効率的な結合ドメイン（BD）を、EcoRI及びPstI制限酵素認識部位を用いて3'スプライシング要素とともにpIRES2-AcGFP1ベクター（Clontech）にクローニングした。開始コドンを含まない単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（HSV-TK）のコード配列（CDS）を、Dr.Peckl-Schmidから厚意提供されたHAX1標的化ベクターから増幅した［20］。PCR増幅の前に、HSV-TKのCDS内のPstI制限酵素認識部位を、QuikChangeLightning部位特異的突然変異誘発キット（Stratagene）を用いて製造業者のプロトコルに従って突然変異させた。PstI制限酵素認識部位を含むフォワードプライマー（5'-ctagctgcagcccacgctactgcgggttta-3' 配列番号11）、BamHI制限酵素認識部位を含むリバースプライマー（5'-gagagaggatcctcagttagcctcccccatctc-3' 配列番号12）、及びPfu turboポリメラーゼ（Stratagene）をPCR増幅に使用した。得られるPCR産物をRTMベクターに更にサブクローニングした。
RTM最適化のために、開始コドン及びスプライシングドメインの上流の生じ得る潜在的スプライス部位をQuikChange Lightning部位特異的突然変異誘発キット（Stratagene）で修飾し、3つの異なるRTM：RTMorg、RTMm1、RTMm2を得た。各々の構築物の配列を補足データ1に示す。
陽性対照：
TK-RTMとSLCO1B3-MGとの正確なトランススプライシング産物であるSLCO1B3及びHSV-TKの融合タンパク質（SLCO1B3-TK融合）を発現するプラスミドを陽性対照とした。ここで、SLCO1B3のエクソン3を、SCLO1B3-MGからPfuturboポリメラーゼ及び以下のプライマー（fw：5'-gagagaattcatggaccaacatcaacattt-3'、配列番号13；rv：5'-ctagctgcagcttgaatccattgcagcgtc-3'、配列番号14）を用いて増幅した。PCR産物をEcoRI及びPstI制限酵素認識部位を用いてTK-RTM-ベクターに更にクローニングし、それによりTK-RTMの結合及びスプライシングドメインを除去した。最後に、残存PstI制限酵素認識部位をCDSからQuikChange Lightning部位特異的突然変異誘発キット（Stratagene）を用いて除去した。
細胞培養及びトランスフェクション
全てのスクリーニング実験について、ヒト胎児腎臓細胞株HEK293AD（Stratagene）を使用した。HEK293AD細胞を10 %のFCS及び100 U/mlのペニシリン／ストレプトマイシン（Biochrom）を添加したDMEM中、37℃及び5 % CO2で加湿インキュベーターにおいて成長させた。細胞を4日毎にトリプシン-EDTA（Biochrom）処理によって継代した後、250 gで5分間遠心分離した。その後、プラスミドトランスフェクションの翌日に細胞を新たな組織培養プレートに60 %コンフルエンシーを達成する所望の密度で播種した。細胞をjetPEI試薬（Polyplus-transfection SA，Illkirch，France）を用いて製造業者のプロトコルに従ってトランスフェクトした。
RNA単離及びcDNA合成
処理HEK293AD細胞を、RNA単離についてトランスフェクションの2日後にRNeasy Mini Kit（Qiagen）を用いて製造業者のプロトコルに従って考察した。1 μgの精製RNAを室温で30分間DNase I消化した後、iScriptTMcDNASynthesis Kit（Biorad）を用いたcDNA合成を行った。cDNA合成のために、オリゴ（dT）及びランダムヘキサマープライマーの混合物を準備した。
SqRT-PCR
SqRT-PCRを行い、SLCO1B3-MG及びTK-RTM共トランスフェクトHEK293AD細胞中のSLCO1B3-TK融合転写産物を検出した。PCR分析のために、SLCO1B3特異的フォワードプライマー（5'-ggaccaacatcaacatttgaataaaacagcagag-3' 配列番号15）、HSV-TK特異的リバースプライマー（5'-gtaagtcatcggctcgggta-3' 配列番号16）、処理HEK293AD細胞及びGoTaq（商標） qPCRMaster Mix（Promega）のcDNAが含まれていた。PCRを以下の条件下でBiorad CFX96（商標）システムを用いて行った：95℃で2分間、95℃で20秒間、64℃で20秒間及び72℃で20秒間を40サイクル。実験は二連で行い、2回繰り返した。正確なPCR産物を直接シークエンシングによって検証した。
ウエスタンブロット分析
SLCO1B3-TK融合タンパク質の免疫染色のために、HEK293AD細胞をRIPA溶解バッファー（Santa Cruz）に再懸濁し、抽出タンパク質をNuPAGE 4-12％ BisTrisゲル（1.0 mm×12ウェル、Invitrogen）上で変性条件下、120ボルトで2時間分離した。標準ブロッティングバッファー中、室温で最大30分間のSDSゲルの平衡化の後、タンパク質をニトロセルロース膜（Amersham Hybon-ECL，GE Healthcare）に0.25アンペアで75分間エレクトロブロットした。続いて、膜をブロッキングバッファー（TBS-T中5 %粉乳）に室温で1時間浸漬し、一次抗体：ヤギ抗HSV-TK1 IgG（TBS-T中で1000倍に希釈）（Santa Cruz Biotechnology）及びウサギ抗α−アクチニンIgG（TBS-T中で000倍〜5000倍に希釈）（Santa Cruz Biotechnology）とともに4℃で一晩インキュベートした。TBS-Tで3回の洗浄工程の後、膜を二次抗体ポリクローナルウサギ抗ヤギHRP（TBS-T中で1000倍に希釈、Dako）及びHRP標識Envision+抗ウサギ抗体（TBS-T中で500倍に希釈、Dako）のそれぞれとともにインキュベートした。ブロットを3回洗浄し、特異的タンパク質バンドの可視化をImmun-Star WesternC Kit（Biorad）及びChemiDoc XRS Imager（Biorad）を用いて行った。
細胞生存性アッセイ
RTM処理後の細胞生存性を、MTT（3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド）アッセイ（Sigma）によって評価した。RTMトランスフェクションの48時間後にHEK296AD細胞を96ウェルプレートに播種し（10000細胞／ウェル）、翌日100 μMのGCV（Cymevene（商標）、Roche）で72時間処理した。20 μlのMTT（PBS中で5 g/L）を各ウェルに添加し（200 μl）、37℃でおよそ2時間インキュベートした。次いで、全ての培地を除去し、細胞を100 μlのDMSO/Glycin（6容量のDMSO＋1容量の0.1 M Glycin/NaOH（pH10.2））で溶解させた。プレートシェーカー（500 rpm）上で10分間のインキュベーションの後、得られるホルマザン生成物の吸光度を、プレート光度計（Tecan）を用いて492 nm／620nmで測定した。細胞生存率を方程式：（OD GCV−処理／ODGCV−非処理）×100／陰性対照（OD GCV−処理／OD GCV−非処理）によって算出した。SLCO1B3-MGのみをトランスフェクトしたHEK293AD細胞を本アッセイにおける陰性対照とした。
末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼdUTPニック末端標識化（TUNEL）アッセイ
アポトーシスの検出を、In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red（Roche）を用いて製造業者のプロトコルに従って行った。簡潔に述べると、細胞を1×PBSで洗浄し、2 %パラホルムアルデヒドを用いて室温で60分間固定し、PBS中の0.1 % BSA／0.2 %Triton X-100を用いて氷上で5分間〜10分間透過処理した。3回の洗浄工程の後、細胞をTUNEL反応溶液とともに暗所、37℃で1時間インキュベートし、最後に蛍光顕微鏡法（Axiophot，Carl Zeiss）及びフローサイトメトリー（FC500，Beckman Coulter）によって分析した。
各図における英語表記は以下の意味である。
図１
Targetmolecule 標的分子
Fusion mRNA 融合mRNA
Intron イントロン
Binding_Site 結合部位
Consensus コンセンサス
Target 標的
図２
Fusion Ctrl 融合対照
TK Ctrl TK対照
Intron イントロン
Fusion mRNA 融合mRNA
図３
TK Ctrl TK対照
Fusion Ctrl 融合対照
Rel. CellViability 相対細胞生存性
図４
Fusion 融合
図５
Rel. CellViability 相対細胞生存性
Fusion Ctrl 融合対照
TK Ctrl TK対照
apoptoticcells アポトーシス細胞
図６
Consensus コンセンサス
Promotor プロモーター
bindingdomain 結合ドメイン

Claims (18)

  1. RNAトランススプライシング分子（RTM）であって、少なくとも1つの結合ドメインと、少なくとも1つのスプライシングドメインと、少なくとも1つのコーディングドメインとを含み、前記コーディングドメインが自殺遺伝子配列を含み、前記少なくとも1つの結合ドメインが、溶質輸送体有機アニオントランスポーターファミリーメンバー1B3（SLCO1B3）のプレmRNAに相補的な配列を含み、該コーデイングドメインは、単純ヘルペス1型チミジンキナーゼ（HSV-TK）、シトシンデアミナーゼ（CD）、水痘帯状疱疹ウイルスのチミジンキナーゼ（VZV-tk）、ストレプトリジンO、ジフテリア毒素から選ばれた自殺遺伝子の配列を含む、RNAトランススプライシング分子。
  2. 前記自殺遺伝子配列が、細胞内で発現された場合に細胞死を誘導するか、又は細胞成長若しくは細胞分裂を阻害するタンパク質をコードし、該タンパク質が、細胞死を誘導するか、又は細胞成長若しくは細胞分裂を阻害する活性薬物への不活性なプロドラッグの変換を媒介する、請求項1に記載のRTM。
  3. 前記少なくとも1つの結合ドメインが前記SLCO1B3のプレmRNAのイントロン、エクソン又は混合イントロン（intron）−エクソン配列に相補的な配列を含む、請求項1又は2に記載のRTM。
  4. 前記コーディングドメインが、自殺遺伝子の開始コドンを含まない自殺遺伝子の配列を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載のRTM。
  5. トランススプライシング反応後に細胞内で発現された場合に、前記HSV-TKがガンシクロビル三リン酸へのプロドラッグガンシクロビルの変換を開始することが可能である、請求項4に記載のRTM。
  6. 前記プレmRNAが固形腫瘍、黒色腫、カポジ肉腫、扁平上皮細胞癌、頭頸部癌、悪性胸膜中皮腫（mesothelioma）、リンパ腫又は多発性骨髄腫、膠芽腫、胃腸管若しくは膵臓若しくは乳房若しくは胃若しくは子宮頸部若しくは膀胱若しくは腎臓若しくは前立腺若しくは卵巣若しくは子宮内膜若しくは肺若しくは脳若しくは皮膚の癌、液性腫瘍、及び白血病から選択される腫瘍と関連するプレmRNAである、請求項1〜5のいずれか一項に記載のRTM。
  7. 前記結合ドメインが遺伝子SLCO1B3のイントロンに、またはSLCO1B3のイントロン3に相補的な配列を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載のRTM。
  8. 前記RTMと前記プレmRNAとの結合が相補性、三重ヘリックス形成又はタンパク質−核酸相互作用によって媒介される、請求項1〜7のいずれか一項に記載のRTM。
  9. トランススプライシング効率、発現又はRNA安定性を改善する3'UTRを更に含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載のRTM。
  10. RNA分子である、請求項1〜9のいずれか一項に記載のRTM。
  11. 請求項1〜10のいずれか一項に記載のRTMをコードする配列を含む組み換え発現ベクター。
  12. 真核生物発現ベクター、又はウイルス由来配列を含むベクターである、請求項11に記載のベクター。
  13. 導入遺伝子発現を調節する皮膚細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞又は内皮細胞に特異的な調節要素を更に含む、請求項11又は12に記載のベクター。
  14. 請求項1〜10のいずれか一項に記載のRTM分子又は請求項11〜13のいずれか一項に記載の組み換え発現ベクターを含む組み換え細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞又は内皮細胞の組み換え皮膚細胞。
  15. 生理学的に許容可能な担体と、請求項1〜10のいずれか一項に記載のRTM、請求項11〜13のいずれか一項に記載の組み換え発現ベクター又は請求項14に記載の組み換え細胞とを含む医薬調製物。
  16. 薬剤として使用される、請求項1〜10のいずれか一項に記載のRTM、請求項11〜13のいずれか一項に記載の組み換え発現ベクター、請求項14に記載の組み換え細胞又は請求項15に記載の医薬調製物。
  17. 疾患の治療に使用される、請求項1〜10のいずれか一項に記載のRTM、請求項11〜13のいずれか一項に記載の組み換え発現ベクター、請求項14に記載の組み換え細胞又は請求項15に記載の医薬調製物。
  18. 対象疾患が増殖性疾患、癌疾患、扁平上皮細胞癌、表皮水疱症、嚢胞性線維症、先天性爪肥厚症、皮膚及び上皮の遺伝障害、乾癬若しくは神経皮膚炎、及び免疫疾患から選択される疾患である、請求項15〜17のいずれか一に記載のRTM、組み換え発現ベクター、組み換え細胞又は医薬調製物。
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