WO2021251589A1 - 다중 표적화 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스 및 그 용도 - Google Patents

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박은란
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    • C12N2710/16645—Special targeting system for viral vectors

Definitions

  • the present invention relates to a multi-targeting recombinant herpes simplex virus and uses thereof.
  • Surgical therapy, chemotherapy, radiation therapy, etc. have been widely used for cancer treatment, but most of them have side effects, incomplete therapeutic effects, and problems such as cancer recurrence and metastasis. Therefore, there has been a continuous demand for the development of new and effective cancer treatment methods, and in recent years, there has been rapid development in anticancer immunotherapy such as anticancer viruses and CAR-T cell therapy (chimeric antigen receptor T cell therapy).
  • anticancer immunotherapy such as anticancer viruses and CAR-T cell therapy (chimeric antigen receptor T cell therapy).
  • anticancer virus is a virus with the property of lysing cancer cells by selectively proliferating in cancer cells by manipulating the genes of living viruses, and proliferation in normal cells is limited. Viruses released by dissolving cancer cells continuously infect surrounding cancer cells, thereby producing a lasting and synergistic therapeutic effect.
  • anticancer viruses can increase the anticancer effect by stimulating the body's immune response by releasing tumor antigens with immunogenicity in the process of dissolving cancer cells. may be enhanced.
  • Anticancer viruses currently being developed can be divided into more than 10 types including adenovirus, herpes simplex virus (HSV), and vaccinia virus.
  • HSV herpes simplex virus
  • vaccinia virus As an enveloped icosahedral virion, it is divided into HSV-1 type and HSV-2 type.
  • HSV has many non-essential genes and has a large genome, so it is easy to manipulate or transport foreign genes, has a short replication cycle, and has high infection efficiency. It has the advantage of being able to improve the targeting to cancer cells by easy manipulation of the protein.
  • T-VEC (Talimogene Laherparepvec, product name: Imrisic), which was approved by the US FDA in October 2015, is an anticancer virus treatment for malignant melanoma using HSV-1.
  • ICP34.5 and ICP47 genes are deleted to attenuate pathogenicity, and attenuated (attenuated) HSV-1 type expressing GM-CSF (granulocyte-macrophage colony stimulating factor) to promote human immune response. it's a virus
  • GM-CSF granulocyte-macrophage colony stimulating factor
  • HSV is a virus with an envelope (envelope)
  • the entry of HSV into the cell is through the complex interaction of the glycoproteins gD, gB, gH/gL and gC present in the envelope.
  • gB and gC are attached to 3-O- S HS (3- O- sulfated heparan sulfate) on the cell surface
  • gD is a cell receptor, herpesvirus entry mediator (HVEM), and nectin-1 (HveC).
  • HVEM herpesvirus entry mediator
  • HveC nectin-1
  • HSV enters the cell by inducing fusion between the virus and the cell membrane by binding to at least one receptor of nectin-2 (HveB) (Hiroaki Uchida et al., Generation of Herpesvirus Entry Mediator (HVEM)- restricted Herpes Simplex Virus Type 1 Mutant Viruses: Resistance of HVEM-expressing Cells and Identification of Mutations That Rescue nectin-1 Recognition. J Virol. 2009 Apr;83(7):2951-61).
  • HVEM Herpesvirus Entry Mediator
  • T-VEC (Talimogene Laherparepvec, product name: Imrisic), which was approved by the US FDA in October 2015, is an anticancer virus treatment for malignant melanoma using HSV-1.
  • ICP34.5 and ICP47 genes are deleted to attenuate pathogenicity, and attenuated (attenuated) HSV-1 type expressing GM-CSF (granulocyte-macrophage colony stimulating factor) to promote human immune response. it's a virus
  • GM-CSF granulocyte-macrophage colony stimulating factor
  • retargeting was attempted to specifically target cancer cells by engineering the envelope glycoproteins gD, gB, gH, and gC involved in HSV cell entry without weakening the virus.
  • This retargeting is the introduction of an exogenous sequence encoding a targeting domain for a cancer cell target molecule into the glycoprotein gD, gB, gH, gC sequence, in which the targeting domain of the exogenous sequence (also called a ligand) is added to the glycoprotein instead of the wild-type glycoprotein.
  • This is a method using a recombinant virus having an inserted chimeric glycoprotein.
  • Such a recombinant virus can enter cancer cells having a target molecule that the targeting region specifically recognizes and binds to.
  • a targeting region scFv (single-chain variable fragment) is generally used, and target molecules currently retargeted are EpCAM (Epithelial cell adhesion molecule), HER2 (Human epidermal growth factor receptor 2), etc., and gB as a glycoprotein , gH, gC, etc. were modified.
  • HVEM belongs to the tumor necrosis factor receptor protein family (TNFR family), mainly T, B lymphocytes, macrophages, DC cells, sensory neurons, mucosal epithelium. Although expressed in mucosal epithelial cells (Shui JW, Kronenberg M. 2013. Gut Microbes 4(2):146-151), B, T lymphoma, melanoma, colorectal cancer, hepatocellular carcinoma , breast cancer, ovarian serous adenocarcinoma, clear renal cell carcinoma, and glioblastoma are known to be highly expressed in various tumor tissues (Pasero C et al. , Curr Opin Pharmacol. 2012.
  • TNFR family tumor necrosis factor receptor protein family
  • HVEM Malissen N et al., ONCOIMMUNOLOGY 2019, VOL. 8(12):e1665976
  • HVEM is characterized by the four cystein-rich domains (CRDs) of the TNFR family. It is reported that two CRDs bind to gD of HSV and induce cell entry of HSV-1 and HSV-2 (Sarah A Connolly et al., Structure-based Analysis of the Herpes Simplex Virus Glycoprotein D Binding Site Present on Herpesvirus Entry Mediator HveA (HVEM). J Virol. 2002 Nov;76(21):10894-904.).
  • CEAscFv-HveA a fusion protein of a single-chain variable fragment (scFv) for CEA (carcinoembryonal antigen) and an extracellular domain of HVEM, one of the HSV cell surface receptors, and the fusion protein was used for HSV It has been previously reported that, when treated with a cell line expressing CEA with and US Patent No. 8318662).
  • the present inventors insert a gene encoding a fusion protein (HER2scFv-HveA, EpCAM2scFv-HveA), which is an adapter capable of targeting HER2 (Human epidermal growth factor receptor 2) or EpCAM, into the genome of HSV so that the fusion protein is expressed.
  • HER2scFv-HveA EpCAM2scFv-HveA
  • EpCAM2scFv-HveA EpCAM2scFv-HveA
  • the fusion protein When expressed in HSV-infected cells, it was confirmed that the fusion protein induces HSV to infect by targeting cell lines expressing HER2 or EpCAM, and furthermore, targeting to HER2 to enable multiple targeting by adapters
  • the expression cassette capable of expressing the fusion protein (HER2scFv-HveA) that is an adapter having a function and the expression cassette capable of expressing the fusion protein (EpCAM-HveA) that is an adapter having a targeting function for EpCAM were inserted into the genome of HSV. When inserted in dual such that the fusion proteins are expressed in HSV-infected cells, the fusion proteins are induced to infect the HSV virions by multiple targeting to cell lines expressing HER2 and/or EpCAM.
  • an object of the present invention to provide a recombinant HSV capable of multiple targeting by multiple expression of an adapter, which is a fusion protein of a cancer cell targeting region and an extracellular domain of HVEM.
  • Another object of the present invention is to provide a recombinant HSV capable of multiple targeting by having a glycoprotein modified to enable retargeting in addition to expressing an adapter, which is a fusion protein of a cancer cell targeting region and an extracellular domain of HVEM. .
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for anticancer treatment comprising the recombinant HSV as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating cancer in which the pharmaceutical composition is administered in an effective amount to a subject such as a patient.
  • the present invention relates to a recombinant HSV capable of multiple targeting.
  • the recombinant HSV capable of multiple targeting of the present invention does not inhibit the proliferation of a herpes simplex virus and is located in its genome in a cancer cell targeting region (ie, on the surface of a cancer cell).
  • a cancer cell targeting region ie, on the surface of a cancer cell.
  • the multi-targeting recombinant HSV of the present invention two or more, i.e., multiple, fusion proteins are expressed, so that the multiple-expressed fusion protein targets the same target molecule multiple times or multiple target molecules different from each other.
  • the target molecule refers to any antigen or any receptor present on the surface of a cancer cell to which the targeting region of the fusion protein specifically recognizes and binds.
  • the recombinant HSV of the present invention can target HER2 as a single target molecule.
  • One or more expression cassettes capable of multiple expression of a fusion protein with More than one dog may have been inserted into the genome.
  • the recombinant HSV of the present invention infects a target cell, which is a cancer cell, and enters the target cell, the HSV is proliferated and two or more multiple fusion proteins, the adapter, are expressed in the cell, together with the HSV virion proliferated by cell lysis.
  • the adapter When released to the outside of the cell or when the adapter has a leader sequence, it is also released before release of virions by cell lysis. Then, multiple adapters released outside the cell recognize HSV virions, and the cancer cell targeting region of the adapter recognizes the HSV virions.
  • the infection By inducing multiple infections to surrounding cancer cells expressing the target molecule, the infection compared to single-targeted recombinant HSV (i.e., recombinant HSV comprising only one expression cassette capable of expressing a fusion protein of the cancer cell targeting region and the extracellular domain of HVEM) It increases the efficiency and acts to further increase the efficiency of continuous diffusion into surrounding cancer cells. This in turn leads to more effective killing of cancer cells.
  • single-targeted recombinant HSV i.e., recombinant HSV comprising only one expression cassette capable of expressing a fusion protein of the cancer cell targeting region and the extracellular domain of HVEM
  • the multi-targeting recombinant HSV of the present invention is capable of (i) expressing an adapter, which is a fusion protein of a cancer cell targeting region and an extracellular domain of HVEM, in its genome without inhibiting the proliferation of herpes simplex virus. It can be identified as recombinant HSV capable of multiple targeting by inserting one or more expression cassettes capable of being capable of multiple targeting, and (ii) inserting and fusion of a cancer cell targeting region to the glycoprotein.
  • the multi-targeting recombinant HSV of the present invention has a modified glycoprotein capable of retargeting by insertion and fusion of a cancer cell targeting region, thereby enabling additional targeting by a glycoprotein in addition to targeting by an adapter.
  • This multi-targeting recombinant HSV is also more effective in terms of the efficiency of virion infection of cancer cells, continuous diffusion of virions into surrounding cancer cells, and cancer cell killing efficiency like the aforementioned recombinant HSV having multiple adapter expression cassettes.
  • recombinant HSV is compared to wild-type HSV virus by introducing artificial mutations (ie, deletion, substitution, or insertion of some nucleic acid sequences) resulting in loss or alteration of certain functions, or HSV genetically engineered to express the intended protein of interest.
  • artificial mutations ie, deletion, substitution, or insertion of some nucleic acid sequences
  • recombinant HSV is in the HSV genome, without inhibiting the proliferation of HSV, the adapter expression cassette (adapter expressionl cassette) (that is, the adapter gene, a promoter sequence and polyadenylation signal that enables its expression
  • the recombinant HSV is capable of expressing the adapter in the infected cancer cell, and also refers to HSV having a modified glycoprotein for retargeting.
  • Recombinant virus production techniques such as genetic manipulation of viruses and production of virions, are very well known in the art, and specifically, described in Sandri-Goldin RM et al, Alpha Herpesviruses: Molecular and Cellular Biology, Caister Academic Press, 2006 ], Robin H Lachmann, Herpes simplex virus-based vectors, Int J Exp Pathol. 2004 Aug; 85(4): 177-190]. All documents cited in this specification, including the above documents, are considered a part of this specification.
  • the recombinant HSV of the present invention in particular, in addition to being engineered to express such an adapter, does not enter the cell through nectin-1 as an entry receptor, but enters the cell only through the HVEM receptor.
  • HSV glycoprotein (envelope glycoprotein) gD sequence was manipulated in the Examples below to allow HSV to enter the cell only through the HVEM receptor. Specifically, arginine (R) at position 222 and phenylalanine (F) at position 223 of gD are replaced with asparagine (N) and isoleucine (I) to change the function of gD.
  • HVEM Herpesvirus Entry Mediator
  • HVEM (HveA) receptor rarely exists in normal cells and exists only in lymphoma, etc., whereas nectin-1 exists in most normal cells, so it can enter cells only through HVEM receptors and enter cells through nectin-1 receptors.
  • Recombinant HSV with altered gD function which is impossible, cannot infect normal cells, and thus has advantageous properties in terms of safety.
  • the recombinant HSV of the present invention is engineered to enable additional targeting through insertion and fusion of a cancer cell targeting region to a glycoprotein in addition to targeting through an adapter.
  • a glycoprotein that can be used for additional targeting gB, gC, gH, etc. may be used.
  • HSV in which a cancer cell targeting region to a glycoprotein is inserted/fused can be prepared by inserting a gene for a cancer cell targeting region into an open reading frame without partially or not deleting the glycoprotein gene. can When the gene of the cancer cell targeting region is inserted into the glycoprotein gene, the cancer cell targeting region is integrated into the envelope of the virion when recombinant HSV is produced intracellularly in a form fused to the glycoprotein.
  • Insertion and fusion of the cancer cell targeting region into glycoproteins are performed in glycoproteins such as gB, gC, gD, gH, etc., at any position in the amino acid sequence without deletion of the amino acid sequence of the glycoprotein, or by some length (especially An amino acid sequence of 1 amino acid to 40 consecutive amino acids) may be deleted and made at the deleted position, or an amino acid sequence of some length may be deleted or substituted but may be made at any position in the deleted or unsubstituted amino acid sequence.
  • deletion or substitution of amino acids of some length may be made in order to inactivate a binding site of a glycoprotein to a specific cellular receptor such as HVEM, nectin-1, and the like.
  • a cancer cell targeting region When a cancer cell targeting region is inserted and fused to gB glycoprotein, it may be at any position including the N-terminus, but in HSV-1, a preferred position is the amino acid sequence of gB (SEQ ID NO: 1, GenBank Accession No. ASM47779), any position within the region of amino acids 9 to 896. Also, a preferred position may be any position within the region of amino acids 31 to 78, any position within the region of amino acids 80 to 363, or any position within the region of amino acids 408 to 896.
  • preferred positions are the position after amino acid 43, the position after amino acid 52, the position after amino acid 70, the position after amino acid 76, the position after amino acid 80, the position after amino acid 81, the position after amino acid 95, 100 Amino acid next position, after amino acid 137, after amino acid 185, after amino acid 187, after amino acid 241, after amino acid 261, after amino acid 265, after amino acid 304, after amino acid 334 position after amino acid 361, after amino acid 408, after amino acid 419, after amino acid 430, after amino acid 458, after amino acid 470, after amino acid 481, after amino acid 495, After amino acid 497, after amino acid 546, after amino acid 608, after amino acid 630, after amino acid 663, after amino acid 664, after amino acid 665, after amino acid 671, after amino acid 673 Amino acid next position, after amino acid 690, after amino acid 725, after amino acid 730, after amino acid 732, after amino acid 742, after amino acid 772, after amino acid 868, after amino
  • any position including the N-terminus may be used, but in HSV-1, the preferred position is the amino acid sequence of gC (SEQ ID NO: 2). , GenBank Accession No. ASM47796), any position within the region of amino acids 1 to 442, or a preferred position, may be any position within the region of amino acids 33 to 154. Also, preferred positions may be the position after amino acid 33, the position after amino acid 82, the position after amino acid 148, the position after amino acid 149, and the position after amino acid 153 of gC. The position is based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 of gC, but in the case of a mutant strain having some difference in the sequence of gC, it is based on a homologous sequence corresponding thereto.
  • the cancer cell targeting region When the cancer cell targeting region is inserted and fused to the gH glycoprotein, it may be any position including the N-terminus and the N-terminus of the H1A domain, but in HSV-1, the preferred position is the amino acid of gH In the sequence (SEQ ID NO: 3, GenBank Accession No. ASM47773), it may be a position within the region of amino acids 12 to 88, a position within the region of amino acids 116 to 137, or a position within the region of amino acids 209 to 839. Also, a preferred position may be a position within the region of amino acids 12 to 49 or a position within the region of amino acids 116 to 137.
  • preferred positions are amino acid 12, amino acid 22, amino acid 23, amino acid 29, amino acid 83, amino acid 116, amino acid 116, amino acid 209, amino acid 215 position after amino acid 225, after amino acid 277, after amino acid 386, after amino acid 437, after amino acid 447, after amino acid 472, next position after amino acid 636, after amino acid 637, The position after amino acid 666, the position after amino acid 731, the position after amino acid 763, the position after amino acid 764, the position after amino acid 775, the position after amino acid 806, the position after amino acid 824, the position after amino acid 838 .
  • the position is based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 of gH, but in the case of a mutant strain having some difference in the sequence of gH, it is based on a homologous sequence corresponding thereto.
  • HSV Herpes Simplex Virus
  • linker peptides may exist at the N-terminus and C-terminus of the cancer cell targeting region.
  • This linker peptide is intended to provide a distance between the cancer cell targeting region and the glycoprotein so that the cancer cell targeting region to be fused to the glycoprotein is not interfered with forming its intrinsic three-dimensional structure by fusion with the glycoprotein. It may be a linker peptide of any length and any sequence as long as it has specific binding ability with the target molecule.
  • the linker is preferably composed of one or more amino acids among amino acids such as Ser, Gly, Ala, and Thr, and has a length of 1 to 30 amino acids , preferably 3 to 25 amino acids, more preferably 8 to 20 amino acids.
  • the recombinant HSV of the present invention is mutated so that non-essential genes that are not necessary for the proliferation (ie, survival and replication) of HSV are deleted or do not function (ie, transcription or translation is disturbed).
  • non-essential genes include UL3 gene (see, eg, Genbank Accession No. AFE62830.1), UL4 gene (see, eg, Genbank Accession No. AFE62831.1), UL14 gene (eg, see Genbank Accession No. AFE62841.1).
  • UL16 gene see, eg, Genbank Accession No. AFE62843.1
  • UL21 gene see, eg, Genbank Accession No.
  • AFE62848.1 UL24 gene (see, eg, Genbank Accession No. AFE62851.1), UL31 gene (eg, see Genbank Accession No. AFE62851.1) , Genbank Accession No. AFE62859.1), UL32 gene (see, eg, Genbank Accession No. AFE62860.1), US3 gene (see, eg, Genbank Accession No. AFE62891.1), UL51 gene (eg, see Genbank Accession No. AFE62891.1).
  • AFE62880.1 UL55 gene (see eg Genbank Accession No. AFE62884.1), UL56 gene (see eg Genbank Accession No. AFE62885.1), US2 gene (eg Genbank Accession No.
  • AFE62890.1 US12 gene (eg Genbank Accession No. AFE62901.1; ie see ICP47 gene), LAT gene (see eg Genbank Accession No. JQ673480.1), gB gene (eg Genbank Accession No. GU734771.1 with 52996 of 55710), gL gene (see eg Genbank Accession No. AFE62828.1), gH gene (see eg Genbank Accession No. AFE62849.1), gD gene (eg Genbank Accession N o. Refer to AFE62894.1) 1) and the like.
  • the recombinant HSV of the present invention is a recombinant HSV-1 virus, a recombinant HSV-2 virus, or an HSV-1/HSV-2 chimeric virus (ie, both DNA whose genome is derived from HSV-1 and DNA derived from HSV-2). ), preferably a recombinant HSV-1 virus, more preferably a recombinant HSV-1 derived from an HSV-1 KOS strain.
  • the HSV-1 KOS strain can be purchased from ATCC (Cat No VR-1493TM), and the genome sequence of the strain has been completely sequenced, and GenBank Accession No. JQ673480.1 (Stuart J Macdonald et al. Genome Sequence of Herpes Simplex Virus 1 Strain KOS. J Virol. 2012 Jun;86(11):6371-2).
  • the genome of HSV-1 virus is composed of 152 kb double-stranded linear DNA encoding a total of 84 genes, which is composed of two linked fragments, a long fragment (L region) and a short fragment (S region).
  • the long fragment (L region) occupies about 82% of the genome, and the short fragment (S region) occupies about 18% of the genome.
  • the L region (UL) 56 UL1-UL56 genes and 10 genes (UL8.5, 9.5, 10.5, 12.5, 15.5, 20.5) are present at the end of each fragment.
  • the adapter expression cassette is constructed by operably linking an adapter gene with a promoter sequence for enabling its expression and a polyadenylation signal sequence, which is a transcription termination signal sequence.
  • operably linked means that the transcription and/or translation of an expressed adapter gene is operably linked.
  • a promoter is operably linked to the adapter gene if it affects the transcription of an adapter gene linked thereto.
  • a promoter is located upstream (5' side) with respect to the transcription start point of a gene, and includes a binding site for DNA-dependent RNA polymerase, a transcription initiation point, a transcription factor binding site, etc. of one or more genes. It refers to a nucleic acid sequence having a function of controlling transcription.
  • These promoters when derived from eukaryotes, have a TATA box (usually located at positions -20 to -30 of the transcription initiation point (+1)), a CAAT box (usually located at approximately -75 positions relative to the transcription initiation site), which is above the transcription initiation site. present), enhancers, transcription factor binding sites, and the like.
  • a promoter is a promoter capable of expressing a target gene linked to it, a constitutive promoter (a promoter that constantly induces gene expression), an inducible promoter (a promoter that induces expression of a target gene in response to a specific external stimulus), tissue specific promoter (promoter that induces expression of a gene in a characteristic tissue or cell), tissue non-specific promoter (promoter that induces expression of a gene in any tissue or cell), endogenous promoter (promoter derived from the cell in which the virus is infected); Any exogenous promoter (a promoter derived from a cell other than the virus-infected cell) can be used.
  • CMV cytomegalovirus
  • RSV rous sarcoma virus
  • TK thymidine kinase
  • adenovirus late promoter vaccinia virus 75K promoter
  • SV40 promoter metallo Cancer cell-specific promoters (tumors) such as thionine (metallothionein) promoter, CD45 promoter (hematopoietic stem cell-specific promoter), CD14 promoter (monocyte-specific promoter), Survivin, Midkine, TERT, CXCR4 specific promoter)
  • a cancer cell-specific promoter by inducing expression of the adapter only in cancer cells, expression of the adapter in normal cells is suppressed, thereby enhancing the safety of the recombinant HSV of the
  • the adapter expression cassette is configured to include a transcription termination signal sequence in addition to the promoter.
  • the transcription termination signal sequence is a sequence that acts as a poly(A) addition signal (polyadenylation signal) to increase transcriptional integrity and efficiency.
  • Many transcription termination signal sequences are known in the art, and an appropriate one, such as SV40 transcription termination signal sequence, and a transcription termination signal sequence of Herpes simplex virus thymidine kinase (HSV TK), may be selected and used.
  • the adapter expression cassette is inserted so as to be expressible into the HSV genome without inhibiting the proliferation of HSV, such insertion is inserted without deletion of the HSV genome, or a portion or all of a non-essential gene is deleted in the HSV genome and the deleted position can be inserted into
  • the adapter expression cassette can be inserted between each gene.
  • Preferred positions for insertion are, for example, between UL3 and UL4 genes, between UL26 and UL27 genes, between UL37 and UL38 genes, UL48 and UL49. between genes, between UL53 and UL54 genes, between US1 and US2 genes, and the like.
  • the deleted non-essential gene may be any non-essential gene as exemplified above.
  • an adapter expression cassette having a polycistron configuration is inserted into one or more HSV genomes, or an adapter expression cassette having a monocistron configuration is inserted into two or more HSV genomes.
  • An adapter expression cassette having a polycistronic configuration includes two or more adapter genes between them in addition to a promoter and a transcription termination signal sequence, and IRES (Internal Ribosome Entry Site, internal ribosome entry) so that proteins can be expressed between these genes, respectively. region) or a nucleic acid sequence encoding the 2A peptide. wherein the 2A peptide is a Picornavirus, an insect virus.
  • preferred 2A peptides are 2A (T2A) of Thoseaasigna virus, 2A (P2A) of Pocine Teschovirus-1, ERAV 2A (E2A) of (Equine Rhinitis A Virus), 2A (F2A) of FMDV (Foot-and-mouth disease virus), etc.
  • T2A 2A
  • P2A Pocine Teschovirus-1
  • E2A Equine Rhinitis A Virus
  • F2A Freot-and-mouth disease virus
  • IRES or 2A peptides see Edith Renaud-Gabardos et al., Internal ribosome entry site-based vectors for combined gene therapy, World J Exp Med.
  • two or more adapter expression cassettes are inserted into the HSV genome if the adapter expression cassette has a monocistronic configuration, in which case the two or more adapter expression cassettes are contiguous at the same position in the HSV genome. to be inserted or may be inserted at different positions.
  • an adapter expression cassette targeting HER2 and an adapter expression cassette targeting EpCAM are both inserted between the UL3 and UL4 genes at the same position, or adapters targeting HER2 at different positions are UL3 and UL4 genes
  • An adapter inserted between the UL26 and UL27 genes using EpCAM as a target molecule may be inserted between the UL26 and UL27 genes.
  • a non-coding region may be placed between the expression cassettes.
  • This non-coding region is for preventing two or more expression cassettes from interfering with each other's expression (transcription and/or translation), and this non-coding region may consist of 3 to 60 nucleotides.
  • an adapter expression cassette having a polycistron configuration capable of expressing two types of adapters and a monocistron capable of expressing the remaining adapters can be inserted together at the same or different locations in the genome of HSV.
  • the cancer cell targeting region of the adapter specifically recognizes and binds to a target molecule of a cancer cell that is a target cell, and the target molecule recognized by the cancer cell targeting region is any antigen present on the surface of the cancer cell. or any receptor.
  • Such antigen or receptor preferably refers to an antigen or receptor that is expressed only in cancer cells or is overexpressed in cancer cells compared to normal cells.
  • epidermal growth factor receptor variant III EGFRvIII
  • EGFRvIII epidermal growth factor receptor variant III
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • anaplastic thyroid cancer breast cancer, lung cancer, glioma, etc., papillary thyroid cancer
  • metastin receptor ErbB receptor tyrosine kinases overexpressed in breast cancer, breast cancer, bladder cancer, gallbladder cancers, cholangiocarcinomas, esophagogastric HER2 (Human epidermal growth factor receptor 2) overexpressed in junction cancers, etc.
  • tyrosine kinase-18-receptor c-Kit
  • HGF receptor c-Met overexpressed in esophageal adenocarcinoma
  • PPAR- ⁇ peroxisome proliferator activated receptor ⁇
  • PDGFR- ⁇ platelet-derived growth factor receptor ⁇
  • CEA carcinoembryonic antigen
  • EpCAM overexpressed in liver cancer, stomach cancer, colorectal cancer, pancreatic cancer, breast cancer, etc
  • MSLN epidermal cell adhesion molecule
  • MSLN Mesothelin
  • GD2 disialoganglioside
  • hepatic GPC3 Glypican 3
  • PSMA Prostate Specific Membrane Antigen
  • TAG-72 tumor-associated glycoprotein 72
  • GD3 dialoganglioside
  • HLA-DR human leukocyte antigen-DR
  • MUC1 Moc 1
  • LMP1 Latent membrane protein 1
  • NY-ESO-1 New York esophageal squamous cell carcinoma 1
  • nasopharyngeal neoplasms lung cancer, non-Hodgkin's lymphoma, ovarian cancer, colon cancer, colorectal cancer, pancreatic cancer, etc.
  • Target molecules may include overexpressed tumor-necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor (TRAILR2), vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2), overexpressed hepatocyte growth factor receptor (HGFR), etc.
  • TRAILR2 tumor-necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor
  • VEGFR2 vascular endothelial growth factor receptor 2
  • HGFR hepatocyte growth factor receptor
  • Many target molecules are known in the art that are overexpressed in cancer cells compared to normal cells, and for more specific target molecules other than those exemplified above, see Anne T Collins et al. Prospective Identification of Tumorigenic Prostate Cancer Stem Cells. Cancer Res. 2005 Dec 1;65(23):10946-51], Chenwei Li et al.
  • the target molecule is preferably HER2 or EpCAM.
  • the target cell that the recombinant HSV of the present invention targets by the adapter is any cancer cell having a target molecule that the cancer cell targeting region of the adapter in the present invention can target.
  • Cancer cells include esophageal cancer, stomach cancer, colorectal cancer, rectal cancer, oral cancer, pharyngeal cancer, laryngeal cancer, lung cancer, colon cancer, breast cancer, cervical cancer, endometrial cancer, ovarian cancer, prostate cancer, testicular cancer, melanoma, bladder cancer, kidney cancer, liver cancer, pancreatic cancer , bone cancer, connective tissue cancer, skin cancer, brain cancer, thyroid cancer, leukemia, Hodgkin's disease, lymphoma, multiple myeloma, hematologic cancer, etc.
  • the cell-targeting region of the adapter may be an antibody derivative or an antibody analog in addition to a complete antibody having specific binding ability with a target molecule.
  • An antibody derivative refers to a fragment or modified antibody of a complete antibody comprising at least one antibody variable region having specific binding ability with a target molecule. Examples of such antibody derivatives include antibody fragments such as Fab, scFv, Fv, VhH, VH, VL, and polyvalent or multispecific modified antibodies such as Fab2, Fab3, minibody, diabody, tribody, tetrabody, bis-scFv, etc.
  • Antibody analog refers to an artificial peptide or polypeptide that has specific binding ability with a target molecule like an antibody, but is different from an antibody in structure and generally has a lower molecular weight than an antibody.
  • ABD adhron, affibody, affilin, affimer, alphabody, anticalin, armadillo repeat protein, centimeter Lin (centyrin), dalpin (DARPin), phynomer (fynomer), Kunitz region, pronectin (pronectin), repeat body (repebody) and the like are mentioned.
  • the cell targeting region of the adapter is preferably a single-chain variable fragment (scFv).
  • scFv refers to a single-chain antibody linked via a short linker peptide between the variable region of the heavy chain (VH) and the variable region of the light chain (VL) of immunoglobulin.
  • VH variable region of the heavy chain
  • VL variable region of the light chain
  • the C-terminus of VH is linked to the N-terminus of the VL, or the C-terminus of the VL is linked to the N-terminus of VH.
  • the linker peptide is a linker of any length and any sequence as long as the heavy and light chains are spatially adjacent to each other and have specific binding ability with the target molecule without interfering with the intrinsic three-dimensional structure of the heavy and light chains. It may be a peptide.
  • the linker is preferably composed of one or more amino acids among amino acids such as Ser, Gly, Ala, and Thr, and the length is 1 ⁇ 30 amino acids, preferably 3-25 amino acids, more preferably 8-20 amino acids.
  • scFv in the present invention has a target molecule HER2 or EpCAM as a target molecule
  • scFv for HER2 is one in which VH of SEQ ID NO: 4 and VL of SEQ ID NO: 5 are linked in the order of VH and VL of linker peptide via a linker peptide.
  • the scFv for EpCAM is VL of SEQ ID NO: 6 and VH of SEQ ID NO: 7 VL via a linker peptide
  • Linker peptides those joined in the VH order (ie, the C-terminus of VL is connected with the N-terminus of VH via a linker peptide) is preferred.
  • HVEM extracellular domain of HVEM is used in the examples below, in addition to HveA82 of SEQ ID NO: 8 (the HveA82 sequence including the leader sequence is disclosed in SEQ ID NO: 9), Korean Patent Registration No. 10-0937774 and US HveA87 of SEQ ID NO: 10 (the HveA87 sequence including the leader sequence is disclosed in SEQ ID NO: 11) disclosed in Korean Patent No. 8318662 (this document is incorporated herein by reference), HveA102 of SEQ ID NO: 12 (leader) The HveA102 sequence up to and including the sequence is shown in SEQ ID NO: 13) or HveA107 of SEQ ID NO: 14 (the HveA107 sequence up to and including the leader sequence is shown in SEQ ID NO: 15).
  • the leader sequence included in the sequences of SEQ ID NOs: 9, 11, 13 and 15 is a signal peptide sequence of HveA.
  • HveA87, HveA102, and HveA107 each contain 5, 20, and 25 amino acids more than HveA82, and it has been confirmed that all of the above Korean and US patents can be used as HSV receptors for adapters.
  • a linker sequence may be placed between the cancer cell targeting region and the extracellular domain of the HVEM, and the linker sequence may be a linker of any length and any sequence as long as it does not inhibit the function of each domain of these adapters.
  • the linker may consist of one or more amino acids among four amino acids, Ser, Gly, Ala, and Thr, and have a length of 1 to 30 amino acids, preferably 3 to 25 amino acids, more preferably 8 to 20 amino acids. It may be a dog amino acid.
  • the adapter of the present invention may have a configuration in the order of NH 2 -cancer cell targeting domain-HVEM extracellular domain-COOH or the reverse order.
  • NH 2 -cancer cell targeting region-linker peptide-HVEM extracellular domain-COOH may be in the order or in the reverse order.
  • the adapter of the present invention is at its N-terminus, specifically, the N-terminus of the cancer cell targeting domain (VH or VH when scFv is used when the adapter configuration is NH 2 -cancer cell targeting region-linker peptide-HVEM extracellular domain-COOH)
  • VH or VH when scFv is used when the adapter configuration is NH 2 -cancer cell targeting region-linker peptide-HVEM extracellular domain-COOH At the N-terminus of the VL), when the adapter configuration is NH 2 -HVEM extracellular domain-linker peptide-cancer cell targeting domain-COOH, a leader sequence (ie, secretion inducing signal sequence) is located at the N-terminus of the HVEM extracellular domain more may be included.
  • the leader sequence is a sequence having a function of inducing a protein expressed in the cytoplasm to penetrate a cell membrane and secreted to the outside of the cell, and typically includes about 15 to 30 consecutive hydrophobic amino acid residues.
  • the leader sequence that can be used is not particularly limited, but the leader sequence of HveA, the leader sequence of the antibody variable region VL (kaapa), the leader sequence of t-PA (tissue plasminogen activator), the leader sequence of serum albumin, the leader sequence of lactoferrin, ⁇ - It may be any sequence present at the N-terminus of a protein secreted outside the cell membrane, such as a casein leader sequence, a leader sequence of various hormones including human growth hormone, and a polypeptide secreted sequence from yeast or bacteria.
  • This leader sequence is a sequence that induces expression of the adapter in the target cell and the outflow of the adapter out of the cell.
  • the adapter induces the HSV virus to infect adjacent target cells only after the target cell is lysed and the HSV virus is released. It may be omitted because
  • an scFv for a target molecule when using an scFv for a target molecule as the cell targeting region, between VH and VL, between VH and VL when a linker peptide is mediated, between VH or VL and linker peptide, between scFv and HVEM, between scFv and When a linker peptide is mediated between HVEMs, an amino acid corresponding to an arbitrary restriction enzyme action site may be inserted between scFv and linker and between linker and HVEM to facilitate cloning.
  • EF base sequence: GAATTC
  • GS (base sequence: GGATCC) on which BamHI acts
  • LEEL base sequence: CTCGAGGAGCTC
  • the gene for the recombinant HSV may be inserted into the HSV genome so that the factors for inducing or enhancing an immune response against cancer cells are expressed alone or in any combination.
  • factors include cytokines, chemokines, antagonists of immune checkpoints (eg antibodies, antibody derivatives or antibody analogs, particularly scFv), costimulatory factors capable of inducing activation of immune cells (T cells or NK cells) (co-stimulatory factor), an antagonist capable of inhibiting the function of TGF ⁇ to suppress the immune response to cancer cells (such as antibodies, antibody derivatives or antibody analogs, especially scFv), heparan sulfate proteoglycans that constitute the solid tumor microenvironment ( Heparanase capable of degrading heparan sulfate proteoglycan, and antagonists capable of inhibiting the function of VEGF receptor-2 (VEGFR-2), an angiogenesis factor receptor (eg, antibody, antibody derivative or antibody analog, particularly scF
  • Cytokines include, for example, interleukins such as IL-2, IL-4, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, and IL-24, interferons such as IFN ⁇ , IFN ⁇ , IFN ⁇ , TNF ⁇ , etc.
  • Colony stimulating factors such as tumor necrosis factor of GM-CSF, G-CSF, FLT3L, etc. may be used alone or in any combination of two or more to be expressed in recombinant HSV.
  • Chemokines for example, CCL2 (CC Motif Chemokine Ligand 2), CCL5 (RANTES), CCL7, CCL9, CCL10, CCL12, CCL15, CCL19, CCL21, CCL20, XCL-1 ((XC Motif Chemokine Ligand 1)) alone or In combination, it can be used to be expressed in recombinant HSV.
  • CCL2 CC Motif Chemokine Ligand 2
  • CCL5 RANTES
  • CCL7, CCL9 CCL10
  • CCL12 CCL15
  • CCL19 CCL19
  • CCL21 CCL21
  • CCL20 XCL-1
  • Antibodies against immune checkpoints are PD-1 (programmed cell death-1), PD-L1 (programmed cell deathligand 1), PD-L2 (programmed cell death-ligand 2), CD27 (cluster of differentiation 27), CD28 (cluster of differentiation 28), CD70 (cluster of differentiation 70), CD80 (cluster of differentiation 80), CD86 (cluster of differentiation 86), CD137 (cluster of differentiation 137), CD276 (cluster of differentiation 276), KIRs (killer-cell) immunoglobulin-like receptors), lymphocyte-activation gene 3 (LAG3), glucocorticoid-induced TNFR-related protein (GITR), glucocorticoid-induced TNFR-related protein ligand (GITRL), cytolytic T lymphocyte associated antigen-4 (CTLA-4) antagonists can be used alone or in combination to be expressed in recombinant HSV.
  • PD-1 programmed cell death-1
  • PD-L1 programmed cell deathligand 1
  • Co-stimulatory factors are CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, LFA-1 (lymphocyte function-associated antigen-1), ICOS (inducible T-cell co-stimulatory factor), CD3 ⁇ , CD3 ⁇ , CD3 ⁇ , etc., alone or in combination, can be used to be expressed in recombinant HSV.
  • recombinant HSV can be engineered to express prodrug-activating enzymes that convert a prodrug into a drug that is toxic to cancer cells.
  • a prodrug activating enzyme cytosine deaminase, which converts the prodrug 5-FC (5-fluorocytosine) into a drug that is 5-FU (5-fluorouracil)
  • the prodrug CPA cyclophosphamide
  • Carboxylesterase rat cytochrome P450, CYP2B1, which converts the phosphoramide mustard (PM) drug, and the prodrug irinotecan (SN-38150) to the SN-38 drug carboxylesterase
  • bacterial nitroreductase that converts prodrug BC1954 to DNA crosslinking agent 4-hydroxylamine151, prodrug 6-methylpurine-2'-deoxyriboside and PNP (purine nucleoside phosphorylase) isolated from E. coli, which converts (6-met), 5-
  • recombinant HSV may be engineered to express TRAIL (TNF-Related Apoptosis Inducing Ligand).
  • TRAIL TNF-Related Apoptosis Inducing Ligand
  • TRAIL is known to induce apoptosis by binding to its receptor overexpressed in cancer cells (Kaoru Tamura et al. Multimechanistic Tumor Targeted Oncolytic Virus Overcomes Resistance in Brain Tumors. Mol Ther. 2013 Jan;21(1):68- 77).
  • factors or prodrug activating enzymes for inducing or enhancing an immune response are the expression cassettes of the gene (that is, the promoter sequence and the polyade a construct operably linked to a nylation signal sequence) is inserted into the HSV genome without inhibiting the proliferation of HSV, such insertion without deletion of the HSV genome, or in which some or all of the non-essential genes in the HSV genome are deleted and the deletion can be inserted into position.
  • insertion positions are, for example, between the UL3 and UL4 genes, between the UL26 and UL27 genes, between the UL37 and UL38 genes, between the UL48 and UL49 genes, and between the UL53 and UL54 genes. between, between US1 and US2, and the like.
  • a non-essential gene is deleted and inserted at the deleted position or inserted into the gene without deletion of the non-essential gene, such non-essential gene may be selected from any of the non-essential genes described above.
  • the present invention relates to an anticancer pharmaceutical composition
  • an anticancer pharmaceutical composition comprising the above-mentioned recombinant HSV as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention has anticancer use against a carcinoma expressing a target molecule targeted by a targeting region of an adapter expressed by recombinant HSV.
  • carcinoma is the same as described above with respect to the target molecule.
  • the composition of the present invention has anticancer use against carcinoma having tumor cells expressing HER2 or EpCAM.
  • tumor cells expressing HER2 include breast cancer cells, ovarian cancer cells, gastric cancer cells, lung cancer cells, head and neck cancer cells, osteosarcoma cells, glioblastoma multiforme cells, salivary gland tumor cells, and the like.
  • tumor cells expressing EpCAM include liver cancer cells, prostate cancer cells, breast cancer cells, colorectal cancer cells, lung cancer cells, gallbladder cancer cells, pancreatic cancer cells, gastric cancer cells, and the like.
  • anticancer includes apoptosis of cancer cells, reduction in viability of cancer cells, inhibition or delay of pathological symptoms of cancer due to inhibition of proliferation of cancer cells, inhibition or delay of onset of such pathological symptoms, inhibition of cancer metastasis, inhibition of cancer recurrence it means to
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a recombinant adapter molecule in addition to the above-mentioned recombinant HSV as an active ingredient.
  • the recombinant adapter molecule refers to a fusion protein having the same cancer cell targeting region as the above-mentioned adapter expressed by recombinant HSV, that is, a fusion protein between a cancer cell targeting region and an extracellular domain of HVEM, prepared by a recombinant method.
  • the fact that the recombinant HSV has the same cancer cell targeting region as the adapter expressed by HSV means that if the cancer cell targeting region of the HSV-expressed adapter targets HER2, the cancer cell targeting region of the adapter molecule also targets HER2. do.
  • the method for producing the intended protein by the recombinant method is generally by preparing an expression vector capable of expressing the target protein, E. coli, yeast, animal cells (CHO cells, NSO cells, BHK cells, Sp2 cells, HEK-293 cells). ), etc., is transformed into a host cell and cultured, followed by a step of isolating the target protein, and the method for producing the target protein by this recombinant method is very well known in the art (Sambrook et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001)), in particular, Korean Patent No. 10-0937774 and US Patent No.
  • 8318662 can be referred to with respect to the preparation of the recombinant adapter molecule used in the present invention.
  • a recombinant adapter molecule is additionally included in the pharmaceutical composition of the present invention, when the recombinant HSV, which is the active ingredient of the present invention, and the recombinant adapter molecule are administered together to a patient, the efficiency of initial infection of the recombinant HSV into cancer cells is increased.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be used in combination or mixed with an approved anticancer agent.
  • anticancer agents include, any anticancer agents that are cytotoxic to cancer cells, such as metabolic antagonists, alkylating agents, topoisomerase antagonists, microtubule antagonists, and plant-derived alkaloids, any cytokine drug, any antibody drug, any immune checkpoint inhibitor drug , any cell therapy (car-T cell therapy, car-NK cell therapy) medicines, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be prepared as an oral dosage form or a parenteral dosage form by a conventional method known in the art according to the route of administration, including a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.
  • Such pharmaceutically acceptable carriers or excipients do not inhibit the activity or properties of drugs without being particularly toxic to the human body, and include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia gum, calcium phosphate, algae nate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water (eg, saline and sterile water), syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc , magnesium stearate, mineral oil, Ringer's solution, buffer, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, dextran, albumin, or any combination thereof.
  • a suitable carrier or excipient is one of saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injection solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, and the like.
  • the above components may be used alone or in combination, and if necessary, other conventional pharmaceutical additives such as antioxidants, buffers, and bacteriostats may be added.
  • the pharmaceutical composition of the present invention when formulated for oral administration, it can be prepared in the form of tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers, etc. It can be prepared in multiple dosage forms.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be prepared in the form of a solution, suspension, tablet, pill, capsule, sustained release formulation, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is formulated in a dosage form of a unit dosage form suitable for administration in the body of a patient according to a conventional method in the pharmaceutical field, and an oral administration route using an administration method commonly used in the art, or dermal, intralesional, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intraventricular, pulmonary, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, gastrointestinal, topical, sublingual, intravaginal, It may be administered by a parenteral route, such as a rectal route.
  • the dosage (effective amount) of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on factors such as formulation method, administration method, patient's age, weight, sex, medical condition, food, administration time, administration route, excretion rate, and response sensitivity. may be prescribed, and a person skilled in the art can appropriately determine the dosage in consideration of these factors.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is prepared as an injection in the form of a unit dose, and when prepared as an injection in the form of a unit dose, the amount of recombinant HSV virus contained per unit dose of the pharmaceutical composition of the present invention is 10 2 -10 in the range of 14 pfu, in particular in the range of 10 4 -10 11 pfu.
  • the present invention relates to a method for treating or preventing cancer (ie, a method for treating or preventing a tumor) comprising administering to a subject, such as a patient, an effective amount of a pharmaceutical composition comprising the recombinant HSV as described above. .
  • This cancer treatment method is made possible by recombinant HSV lysing and killing cancer cells having a target molecule targeted by the cancer cell targeting region of the adapter. Therefore, the treatment method of the present invention can be applied to any carcinoma having such a target molecule. In particular, the treatment method of the present invention is preferably applied to a carcinoma expressing HER2 or EpCAM.
  • the treatment method of the present invention may be used in combination with the above other cancer treatment methods without limitation.
  • the aforementioned cytotoxic anticancer drugs, cytokine drugs, antibody drugs, immune checkpoint inhibitor drugs, cell therapy drugs (car-T cell therapy, car-NK cell therapy) drugs, radiation therapy, surgical therapy, etc. are the pharmaceuticals of the present invention. It may be used in combination before and after administration of the composition or in a simultaneous administration mode.
  • an effective amount is the present invention that can exhibit intended medical effects, such as cancer treatment or prevention effect, when the pharmaceutical composition of the present invention is administered during the administration period recommended by a medical professional, etc.
  • an effective amount can be appropriately determined by a person skilled in the art, such as a medical professional, according to the patient's age, weight, sex, pathological condition, and the like.
  • the pharmaceutical composition is preferably administered to a patient or the like as an injection, for example, intralesional (intralesional, intratumoral), intravenous, intramuscular, intraarterial, etc. can be administered by parenteral administration route.
  • a recombinant HSV capable of multiple targeting can be provided by multiple expression of an adapter, which is a fusion protein of a cancer cell targeting region and an extracellular domain of HVEM, and a cancer cell targeting region and an extracellular domain of HVEM.
  • an adapter which is a fusion protein of a cancer cell targeting region and an extracellular domain of HVEM
  • an adapter which is a fusion protein of a cancer cell targeting region and an extracellular domain of HVEM
  • a pharmaceutical composition for anticancer treatment or prevention comprising the multi-targeting recombinant HSV as an active ingredient, and a method for preventing or treating cancer in which the pharmaceutical composition is administered to a subject, such as a patient, in an effective amount.
  • the multi-targeting recombinant HSV of the present invention has high infection efficiency and high killing function against cancer cells compared to single-targeted HSV.
  • 1 is a schematic diagram of the structure of the KOS-37 BAC genome.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of the genomic structure of HVEM-restricted HSV-1 virus.
  • FIG. 3 is a schematic diagram of the genomic structure of an HVEM-restricted HSV-1 virus expressing EmGFP.
  • FIG. 4 is a result showing the fluorescence expression of HVEM-restricted HSV-1 virus expressing EmGFP and specific point infection into cells having HVEM receptor.
  • FIG. 5 is a schematic diagram of the genome structure of HSV-1 virus expressing HER2 targeting adapter, HSV-1 virus expressing EpCAM targeting adapter and HSV-1 virus expressing HER2 and EpCAM dual targeting adapter.
  • FIG. 6 shows the entire sequence of the HER2scFv-HveA adapter and the EpCAMscFv-HveA adapter and the configuration of the sequences.
  • FIG. 7 is a schematic diagram of the genomic structure of (i) a single targeting virus with a HER2 targeting modified glycoprotein gH and (ii) a HER2 dual targeting HSV-1 virus with a HER2 targeting modified glycoprotein gH and expressing a HER2 targeting adapter. to be.
  • FIG. 9 is a schematic diagram of the genomic structure of (i) a single targeting virus with EpCAM targeting modified glycoprotein gH and (ii) an EpCAM dual targeting HSV-1 virus with EpCAM targeting modified glycoprotein gH and expressing an EpCAM targeting adapter. to be.
  • HVEM cell receptor
  • HBDa-S virus expressing a HER2scFv-HveA adapter
  • Vero-HVEM cells and SK-OV-3 cells are the results of measuring the spread of a virus having a HER2scFv ligand at gH (HgH-S), and a dual targeting virus having a HER2scFv ligand at gH and expressing the HER2scFv-HveA adapter
  • HgH-S a virus expressing the fluorescent protein EmGFP and entering using only HVEM as a cell receptor (gDm), a virus expressing the HER2scFv-HveA adapter (HADa-S), and a virus having a HER2scFv ligand in gH in Vero-HVEM cells.
  • HgH-S a result of measuring the amplification of a dual-targeting virus (HADa-HgH-D) having a HER2scFv ligand at gH and expressing the HER2scFv-HveA adapter.
  • FIG. 13 shows a virus expressing the fluorescent protein EmGFP and entering using only HVEM as a cell receptor (gDm), a virus expressing a HER2scFv-HveA adapter (HADa-S), in Vero-HVEM cells and SK-OV-3 cells;
  • HVEM cell receptor
  • HFDa-S virus expressing the HER2scFv-HveA adapter
  • HgH-S virus having a HER2scFv ligand in gH
  • HgH-S virus having a HER2scFv ligand in gH
  • HVEM cell receptor
  • HFDa-S virus expressing the HER2scFv-HveA adapter
  • HgH-S virus having a HER2scFv ligand in gH
  • HgH-S double-targeting virus
  • FIG. 16 is a result showing tumor suppression by a dual targeting virus (HADa-HgH-D) having a HER2scFv ligand in gH and expressing a HER2scFv-HveA adapter in an animal experiment.
  • HFDa-HgH-D dual targeting virus having a HER2scFv ligand in gH and expressing a HER2scFv-HveA adapter in an animal experiment.
  • FIG. 17 shows a virus expressing the fluorescent protein EmGFP and entering using only HVEM as a cellular receptor (gDm), a virus expressing the EpCAMscFv-HveA adapter (EADa-S), a virus having an EpCAMscFv ligand in gH (EgH-S);
  • EADa-EgH-D a dual-targeting virus having an EpCAMscFv ligand in gH and expressing an EpCAMscFv-HveA adapter showed specific infection according to the expression of EpCAM in BT-474 cells and the like.
  • EADa-EgH-D a dual-targeting virus having an EpCAMscFv ligand in gH and expressing an EpCAMscFv-HveA adapter shows specific cell death according to the expression of EpCAM in BT-474 cells and the like.
  • FIG. 19 is a schematic diagram of the genomic structure of a dual targeting HSV-1 virus (EADa-HgH-D) having a HER2 targeting modified glycoprotein gH and expressing an EpCAM targeting adapter.
  • EADa-HgH-D dual targeting HSV-1 virus
  • Figure 20 shows that dual targeting HSV-1 virus (EADa-HgH-D) having HER2-targeting modified glycoprotein gH and expressing EpCAM-targeting adapter shows dual targeting according to whether HER2 and EpCAM are expressed in CHO-K1 cells, etc. The results show that it is possible. .
  • HSV-1 virus EADa-HADa-D
  • EpCAM dual targeting adapter is capable of dual targeting depending on whether HER2 and EpCAM are expressed in CHO-K1 cells or the like.
  • HSV-1 gene consists of a large gene of about 152 kb, and KOS-37/BAC (Genbank Accession No. MF156583) (Gierasch WW et al. J) to insert a foreign gene or insert a mutation at a specific position. Virol Methods. 2006. 135:197-206) was used.
  • HSV-1 KOS strain (HSV-1 KOS strain) is a kind of HSV-1 strain mainly used in laboratories because its characteristics are well known and useful for investigation of gene function and etiology (Smith KO. Proc. Soc. Exp) (. Biol. Med. 1964. 115:814-816).
  • KOS-37/BAC constructed by inserting the BAC plasmid into the KOS genome, enables cloning at the bacterial level through transformation into DH10B bacteria (Invitrogen) (Gierasch WW et al.; J. Virol Methods. 2006. 135:197-206).
  • KOS-37/BAC has BAC (bacterial artificial chromosomes) inserted at the position between UL37 and UL38 of the HSV-1 KOS genome along with LoxP sites on both sides. It was made so that the BAC gene could be removed later using the Cre-Lox system. A schematic diagram thereof is shown in FIG. 1 .
  • HSV-1 gD amino acid sequence (GenBank Accession No. ASM47818, SEQ ID NO: 16) of arginine (arginine, R) at position 222 and phenylalanine at position 223 (phenylalanime, F) at position 223 asparagine (asparagine, N) and isoleucine, respectively
  • arginine arginine, R
  • phenylalanine at position 223
  • isoleucine was prepared.
  • HVEM HVEM
  • FIG. 2 A schematic diagram of the genome structure of the HVEM-restricted KOS-gD-R222N/F223I virus is shown in FIG. 2 .
  • the E. coli clone containing KOS-37/BAC was transformed with a pRed/ET plasmid capable of expressing RecE and RecT capable of performing homologous recombination (Muyrers JP et al. ; Nucleic Acids Res. 1999. 27(6):1555-1557).
  • gD-rpsL using a homologous region primer set forward primer gD-rpsL For: SEQ ID NO: 17, reverse primer gD-rpsL Rev: SEQ ID NO: 18
  • a homologous region primer set forward primer gD-rpsL For: SEQ ID NO: 17, reverse primer gD-rpsL Rev: SEQ ID NO: 18
  • the gD-rpsL-neo/kan cassette consists of the gD homologous region at the insertion site, the rpsL gene, a selective marker that gives sensitivity to streptomycin, and the neo/kan gene that makes kanamycin resistance. It is to be configured.
  • the rpsL gene makes it sensitive to streptomycin antibiotics, and the neo/kan gene makes E. coli with kanamycin resistance. RecE and RecT to enable homologous recombination by adding L-arabinose (Sigma-Aldrich) to the E.
  • E. coli selected in kanamycin medium, it was determined that gD-rpsL-neo/kan was inserted, and the final gene was inserted.
  • L-arabinose Sigma-Aldrich
  • KOS 37-BAC gD-rpsL-neo/kan clone was added to E. coli with KOS 37-BAC gD-rpsL-neo/kan clone to activate the function of pRed/ET, enabling homologous recombination with RecE and After inducing the expression of RecT, 100 pmol of R222N_F223I_mutant (SEQ ID NO: 19), which is an oligonucleotide substituted for N and I in R at position 222 and F at position 223 in gD, was added and transformed.
  • R222N_F223I_mutant SEQ ID NO: 19
  • Candidate groups were selected in streptomycin medium using the principle that rpsL-blocked streptomycin resistance is activated while the existing gD-rpsL-neo/kan cassette and the inserted oligonucleotide are replaced (Heermann R et al., Microb Cell Fact) (. 2008. 14:. doi: 10.1186).
  • the selected candidate group was subjected to DNA isolation using the DNA prep method (Horsburgh BC et al., Methods enzymol. 1999. 306:337-352), and whether N and I were introduced at positions 222 and 223 in gD, respectively. was confirmed by PCR (ploymerase chain recation) and DNA sequencing.
  • the following virus construction is performed by extracting the completed KOS-37/BAC-gD-R222N/F223I DNA using a large construct DNA purification kit (Macherey-Nagel) and then 2 ⁇ 10 5 of Cre- Vero-HVEM cells were transfected with 1 ug of DNA using Lipofectamine 2000 reagent (Invitrogen). Cells were cultured using 100 U/ml penicillin/100 ⁇ g/ml streptomycin (Welgene) and 10% FBS (fetal bovine serum, Wellgen) in DMEM medium (Dulbecco's Modified Eagle's Medium (Welgene)).
  • DMEM medium Dulbecco's Modified Eagle's Medium (Welgene)
  • the Cre -Vero-HVEM cell line is a cell line in which HVEM protein expression is induced by inserting HVEM gene into Cre-Vero cell line (Gierasch et al.; J. Virol Methods. 2006. 135:197 ⁇ 206).
  • the reason for the use is that the BAC gene of KOS-37/BAC-gD-R222N/F223I can be removed using Cre recombinase of the cell, and infection of the KOS-gD-R222N/F223I virus by HVEM overexpression is effective.
  • EmGFP Emerald Green Fluorescent Protein
  • pCDNA6.2-GW/EmGFP-miR plasmid was used to construct the EmGFP cassette.
  • FIG. 3 A schematic diagram of the genome of KOS-EmGFP-gD-R222N/F223I expressing EmGFP is shown in FIG. 3 .
  • pCMV a gene promoter of cytomegalovirus
  • tkpA a polyadenylation signal of Herpes simplex virus thymidine kinase (HSV TK)
  • HSV TK Herpes simplex virus thymidine kinase
  • a clone containing KOS-37/BAC-gD-R222N/F223I was transformed with a pRed/ET plasmid capable of expressing RecE and RecT capable of performing homologous recombination (Muyrers JP et al. al.; Nucleic Acids Res. 1999. 27(6):1555-1557).
  • a set of homologous region primers between UL26 and UL27 including the position to introduce the target gene (forward primer UL26/27-rpsL_For: SEQ ID NO: 20, reverse primer UL26/27-rpsL_Rev: SEQ ID NO: 21) was used to prepare a UL26/27-rpsL-neo/kan cassette.
  • coli into which UL26/27-rpsL-neo/kan is inserted has kanamycin resistance, but streptomycin resistance is blocked by the rpsL gene.
  • E. coli selected in kanamycin medium was judged to have been inserted into UL26/27-rpsL-neo/kan, and the final step, the step of inserting the target gene, proceeded.
  • the UL26/27-tkpA-EmGFP-pCMV cassette uses the pCDNA6.2-GW/EmGFP-miR plasmid (Invitrogen) as a template, and the forward primer UL26/27-tkpA_For (SEQ ID NO: 22) and the reverse primer UL26/27 It was produced using -pCMV_Rev (SEQ ID NO: 23).
  • Candidate groups were selected in streptomycin medium using the principle that the existing UL26/27-rpsL-neo/kan cassette and the inserted UL26/27-tkpA-EmGFP-pCMV were replaced and streptomycin resistance blocked by rpsL was activated ( Heermann R et al., Microb Cell Fact. 2008. 14:. doi: 10.1186). The selected candidate group was subjected to DNA isolation using the DNA prep method (Horsburgh BC et al., Methods enzymol. 1999.
  • virus-containing cells were picked and KOS-EmGFP was subjected to three freeze-thaw methods (Gierasch WW et al.; J. Virol Methods. 2006. 135:197-206) and sonication. -gD-R222N/F223I virus (gDm) was obtained.
  • J1 and J-Nectin cell lines without HVEM
  • J-HVEM cell lines expressing HVEM
  • J1 cells are juvenile hamster kidney cell lines that lack the viral HSV-1 receptors HVEM and Nectin-1 (Petrovic B et al ., 2017. PLoS Pathog. 19;13(4):e1006352).
  • J-Nectin and J-HVEM cell lines are cell lines that overexpress Nectin-1 and HVEM, respectively, in J1 cells (Petrovic B et al ., 2017. PLoS Pathog. 19;13(4):e1006352).
  • Each cell line was cultured using 100 U/ml penicillin/100 ⁇ g/ml streptomycin (Welgene) and 10% fetal bovine serum (FBS) in DMEM medium (Welgene). 1 ⁇ 10 4 cells were infected with the KOS-EmGFP-gD-R222N/F223I virus obtained above at a multiplicity of infection (MOI) of 10, and 24 hours later, the expression of fluorescent protein and the degree of virus infection were observed through a fluorescence microscope ( BaeK HJ et al ., Mol Ther. 2011. 19(3):507-514).
  • MOI multiplicity of infection
  • KOS-EmGFP-gD-R222N/F223I virus enters using only HVEM without using Nectin-1 as an entry route and it is easy to observe virus proliferation due to the expression of fluorescent protein. confirmed that
  • Example 3 Construction of HSV-1 expressing HER2 targeting adapter, HSV-1 expressing EpCAM targeting adapter and HSV-1 virus expressing HER2 and EpCAM dual targeting adapter
  • -HveA adapter expression cassette and adapter expression cassette expressing HER2scFv-HveA and EpCAM-HveA together were inserted.
  • the scFv for HER2 is a configuration in which the VH of SEQ ID NO: 4 and the VL of SEQ ID NO: 5 are linked via the linker peptide of SEQ ID NO: 24, and the scFv for EpCAM is the VL of SEQ ID NO: 6 and the VH of SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 25, HveA is HER2scFv-HveA adapter and EpCAMscFv-HveA adapter, HveA82 of SEQ ID NO: 8 was used for HVEM.
  • the leader sequence of SEQ ID NO: 26 is contained at the N-terminus thereof, that is, the VH front part of HER2scFv and the VL front part of EpCAMscFv.
  • EF base sequence: GAATTC
  • pCMV is a gene promoter of the cytomegalovirus
  • bGH-pA is a bovine growth hormone polyadenylation (bGH-PolyA) signal sequence
  • an adapter expression cassette pCMV-HER2scFv- expressing HER2scFv-HveA and EpCAM-HveA together.
  • P2A is 2A (P2A) of Pocine Teschovirus-1.
  • amino acid sequence and gene sequence of the full-length HER2scFv-HveA adapter including the leader sequence used in this Example are disclosed in SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28, respectively, and the amino acid sequence of the full length of the EpCAMscFv-HveA adapter including the leader sequence, and The gene sequences are shown in SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 30, respectively.
  • Insertion of the HER2scFv-HveA adapter expression cassette, the EpCAMscFv-HveA adapter expression cassette, and the EpCAM-HveA-HER2scFv-HveA dual adapter expression cassette was performed with a counter selection BAC modification kit as in Examples 1 and 2 above. ; GeneBridges. Inc) was used according to the manufacturer's protocol.
  • pRed/ET expressing RecE and RecT performing homologous recombination in the E. coli clone containing the KOS-37/BAC-EmGFP-gD-R222N/F223I genome prepared in Example 2 above.
  • the plasmid was transformed (Muyrers JP et al .; Nucleic Acids Res. 1999. 27(6):1555-1557).
  • a homologous region primer set (forward primer UL3/4-rpsL-neo_for: SEQ ID NO: 31, reverse primer UL3/4-rpsL-neo_rev: SEQ ID NO: 32) was used to construct a UL3/4-rpsL-neo/kan cassette.
  • E. coli into which UL3/4-rpsL-neo/kan is inserted has kanamycin resistance, but streptomycin resistance is blocked by the rpsL gene.
  • E. coli selected in kanamycin medium was judged to have been inserted into UL3/4-rpsL-neo/kan, and the final step, the step of inserting the target gene, proceeded.
  • the selected candidates were isolated from DNA using the DNA prep method (Horsburgh BC et al., Methods enzymol. 1999. 306:337-352), and UL3/4 to UL3/4-pCMV-HER2scFv-HveA-bGHpA and UL3 /4-pCMV-EpCAMscFv-HveA-bGHpA and UL3/4-pCMV-EpCAMscFv-HveA-P2A-HER2scFv-HveA-bGHpA Restriction enzyme EcoRI, XhoI treatment and PCR (ploymerase chain recation) were performed to determine whether introduction or not. was confirmed, and the correct gene sequence was confirmed by sequencing the PCR product.
  • KOS-UL3/4_HER2scFv-HveA-EmGFP-gD-R222N/F223I virus expressing adapter HSDa-S
  • KOS-UL3/4_EpCAMscFv-HveA-EmGFP-gD/R222N/F223I virus expressing EpCAM targeting adapter EADa -S
  • KOS-UL3/4_EpCAMscFv-HveA-P2A-HER2scFv-HveA-EmGFP-gD/R222N/F223I virus EADa-HADa-D
  • HER2 and EpCAM dual targeting adapters were obtained.
  • a ligand (HER2 scFv) for recognizing HER2 specifically expressed in cancer cells was inserted between the 29th and 30th amino acids of the gH amino acid sequence (GenBank Accession No. ASM47773, SEQ ID NO: 3), which is a glycoprotein of HSV-1.
  • HER2scFv ligand inserted into gH of HSV-1 KOS-gH/HER2scFv-EmGFP-gD/R222N/F223I virus HgH-S
  • KOS-UL3/4_HER2scFv-HveA-gH/HER2scFv-EmGFP-gD/R222N/F223I virus HSDa-HgH-D genome schematic diagram. 7 shows the entire sequence of the gH-HER2scFv ligand and the composition of the sequence in FIG. 8 .
  • the scFv for HER2 has a configuration in which the VH of SEQ ID NO: 4 and the VL of SEQ ID NO: 5 are linked via the linker peptide of SEQ ID NO: 24, and the linker peptide of SEQ ID NO: 35 is linked to the N-terminus of this scFv, and C - The linker peptide of SEQ ID NO: 36 is linked to the end.
  • amino acid sequence and gene sequence of the full-length HER2scFv used in this Example are shown in SEQ ID NO: 37 and SEQ ID NO: 38, respectively.
  • Insertion of the gH-HER2scFv ligand was performed according to the manufacturer's protocol using a counter selection BAC modification kit (GenBridges. Inc) as in Examples 1, 2, and 3 above.
  • the second embodiment the KOS-37 / BAC-EmGFP- gD-R222N / F223I DNA and KOS-37 / BAC-UL3 / 4_HER2scFv-HveA-EmGFP-gD-R222N / F223I E containing the DNA produced in three
  • the .coli clone was transformed with a pRed/ET plasmid expressing RecE and RecT performing homologous recombination functions (Muyrers JP et al .; Nucleic Acids Res. 1999. 27(6):1555-1557). .
  • a set of homologous region primers (forward primer gH29/30-rpsL-neo_for: SEQ ID NO: 39, reverse primer gH29/30) containing the position at which the target gene is to be introduced between amino acids 29 and 30 of gH -rpsL-neo_rev: SEQ ID NO: 40) was used to construct a gH29/30-rpsL-neo/kan cassette.
  • coli into which gH29/30-rpsL-neo/kan is inserted has kanamycin resistance, but streptomycin resistance is blocked by the rpsL gene.
  • E. coli selected in kanamycin medium it was determined that gH29/30-rpsL-neo/kan was inserted, and the final step, the step of inserting the target gene, was performed.
  • the pCAGGSMCS-gH-HER2scFv plasmid was prepared by inserting HER2scFv into the pCAGGSMCS plasmid (Atanasiu D, et al., J. Virol. 2013, Nov. 87(21):11332-11345). Specifically, pCAGGSMCS plasmid and PCR HER2scFv (Carter. p et al., Proc Natl Acad Sci US A.
  • Candidate groups were selected in streptomycin medium using the principle that the previously inserted gH29/30-rpsL-neo/kan cassette and the previously inserted gH29/30-HER2scFv were replaced and streptomycin resistance blocked by rpsL was activated (Heermann). R et al., Microb Cell Fact. 2008. 14:. doi: 10.1186). The selected candidate group was subjected to DNA isolation using the DNA prep method (Horsburgh BC et al., Methods enzymol. 1999. 306:337-352), and the introduction of HER2scFv in gH29/30 was checked by restriction enzymes EcoRI, XhoI. It was confirmed by processing and PCR (ploymerase chain recation), and the correct gene sequence was confirmed by sequencing the PCR product.
  • EmGFP protein and cell plaque formation were observed using a fluorescence microscope. After confirming the formation of plaques, virus-containing cells were picked up and KOS-gH/HER2scFv was subjected to three freeze-thaw methods (Gierasch WW et al.; J. Virol Methods. 2006.135:197-206) and sonication. -EmGFP-gD-R222N/F223I virus (HgH-S) and KOS-UL3/4_HER2scFv-HveA-gH/HER2scFv-EmGFP-gD-R222N/F223I virus (HADa-HgH-D) were obtained.
  • a gene capable of expressing EpCAMscFv was inserted between amino acids 29 and 30 of the glycoprotein gH in
  • EpCAMscFv ligand inserted into gH of HSV-1 Genome schematics of KOS-gH/EpCAMscFv-EmGFP-gD/R222N/F223I virus (EgH-S) and KOS-UL3/4_EpCAMscFv-HveA-gH/EpCAMscFv-EmGFP-gD/R222N/F223I virus (EADa-EgH-D) It is shown in Fig. 9, and Fig. 10 shows the entire sequence of the gH-EpCAMscFv ligand and the composition of the corresponding sequence.
  • the scFv for EpCAM is a configuration in which the VL of SEQ ID NO: 6 and the VH of SEQ ID NO: 7 are linked via the linker peptide of SEQ ID NO: 25, and the linker peptide of SEQ ID NO: 43 at the N-terminus and the sequence at the C-terminus of this scFv The linker peptide of No. 44 is linked.
  • amino acid sequence and gene sequence of HER2scFv used in this Example are shown in SEQ ID NO: 45 and SEQ ID NO: 46, respectively.
  • Insertion of the gH-EpCAMscFv ligand was performed according to the manufacturer's protocol using a counter selection BAC modification kit (GenBridges. Inc) as in Example 4 above.
  • a set of homologous region primers (forward primer gH29/30-rpsL-neo_for: SEQ ID NO: 40, reverse primer gH29/30) containing the position at which the target gene is to be introduced between amino acids 29 and 30 of gH -rpsL-neo_rev:
  • a gH29/30-rpsL-neo/kan cassette was constructed using SEQ ID NO: 41.
  • KOS-37/BAC-EmGFP-gD-R222N/F223I DNA and KOS-37/BAC -UL3/4_EpCAMscFv-HveA-EmGFP-gD-R222N/F223I Add L-arabinose (Sigma-Aldrich) to the clone containing pRed/ET in DNA to enable homologous recombination After induction, transform into 200 ng of the gH29/30-rpsL-neo/kan cassette prepared above. By this homologous recombination, the gH29/30-rpsL-neo/kan cassette is formed between amino acids 29 and 30 of gH. E.
  • E. coli into which gH29/30-rpsL-neo/kan is inserted has kanamycin resistance, but streptomycin resistance is blocked by the rpsL gene.
  • E. coli selected in kanamycin medium is gH29/30- It was determined that rpsL-neo/kan was inserted, and the last step, the step of inserting the target gene, was performed.
  • the gH29/30-EpCAMscFv ligand was constructed using the pCAGGSMCS-gH-EpCAMscFv plasmid as a template, using the forward primer gH29/30-scFv_For (SEQ ID NO: 42) and the reverse primer gH29/30_scFv_Rev (SEQ ID NO: 43).
  • the pCAGGSMCS-gH-EpCAMscFv plasmid was prepared by inserting EpCAMscFv into the pCAGGSMCS plasmid (Atanasiu D, et al., J. Virol. 2013, Nov. 87(21):11332-11345).
  • pCAGGSMCS plasmid and PCR EpCAMscFv (Willuda J et al., Cancer Res. 1999, 15;59(22):5758-67) amplified with NotI was treated with NotI restriction enzyme (NEB, R3189), and pCAGGSMCS plasmid cut with NotI and EpCAMscFv were treated with T4 DNA ligase. (NEB, M0202) was prepared by bonding.
  • Candidate groups were selected in streptomycin medium using the principle that the previously inserted gH29/30-rpsL-neo/kan cassette and the previously inserted gH29/30-EpCAMscFv were replaced and streptomycin resistance blocked by rpsL was activated (Heermann R et al., Microb Cell Fact. 2008. 14:. doi: 10.1186). The selected candidate group was subjected to DNA isolation using the DNA prep method (Horsburgh BC et al., Methods enzymol. 1999.
  • EpCAMscFv was introduced in gH29/30 with restriction enzymes EcoRI, XhoI It was confirmed by processing and PCR (ploymerase chain recation), and the correct gene sequence was confirmed by sequencing the PCR product.
  • EgH-S EmGFP-gD-R222N/F223I virus
  • EADa-EgH-D KOS-gH/EpCAMscFv-UL3/4_EpCAMscFv-HveA-EmGFP-gD-R222N/F223I virus
  • KOS-UL3/4_HER2scFv-HveA-EmGFP-gD-R222N/F223I virus HFDa-S
  • HFDa-S KOS-UL3/4_HER2scFv-HveA-EmGFP-gD-R222N/F223I virus
  • HgH-S KOS-UL3/4_HER2scFv-HveA-EmGFP-gD-R222N/F223I virus
  • HgH-S EmGFP-gD-R222N/F223I virus
  • HgH-S HER2scFv-HveA adapter
  • KOS-UL3/4_HER2scFv-HveA-gH/HER2scFv-EmGFP-gD-R222N/F223I HSDa-HgH-D
  • the experiment was conducted as follows.
  • Vero-HVEM cells and SK-OV-3 cells were spread in a 12-well plate at 2.0 X 10 5 .
  • Virus HgH-S having HER2scFv ligand, double targeting virus HADa-HgH-D expressing HER2scFv-HveA adapter with HER2scFv ligand to gH prepared in Example 4 diluted and infected. After 90 minutes, the remaining initial virus was removed and replaced with a medium containing 0.2% methylcellulose to prevent virus spread. After 3 days, virus spread was measured through the size of virus plaques using a fluorescence microscope.
  • FIG. 11 The results are shown in FIG. 11 .
  • the plaque sizes of gDm, HgH-S, HADa-S and HADa-HgH-D were 18% and 49%, respectively, compared to the wild-type virus (KOS). , 4%, and 29% were formed smaller.
  • the plaque size of HgH-S was reduced by 53% compared to wild-type virus (KOS), but HADa-S and HADa-HgH-D viruses were 20% and 19, respectively. % increase was observed.
  • the decrease in the plaque size of HgH-S is that when gD binds to the entry receptor, gH transmits an activation signal to gB by this binding to induce cell fusion, and also integrins ) and induces endocytosis, and as scFv is inserted into gH, it is thought that virus spread or replication is inhibited by affecting signal transduction or endocytosis due to structural change.
  • Vero-HVEM cells were laid out in a 96-well plate at 1.0 X 10 4 .
  • gDm and gH were infected with HgH-S expressing HER2scFv ligand, HADa-S expressing HER2scFv-HveA adapter, and dual targeting HADa-HgH-D virus at 0.1 MOI.
  • the medium was replaced with fresh medium to remove residual initial virus.
  • virus cultures were obtained at 3, 24, and 48 hours, and the number of viruses in the culture was measured.
  • FIG. 12 The results are shown in FIG. 12 .
  • the virus proliferation activities of gDm, HADa-S and HADa-HgH-D in the Vero-HVEM cell line are similar, but in the results of FIG. 11 and in HgH-S due to the decrease in virus spreading ability. It was confirmed that the proliferation activity of the virus was reduced.
  • Vero-HVEM and SK-OV-3 cells were spread in a 12-well plate at 2.0 X 10 5 .
  • gDm and gH were infected with HgH-S expressing HER2scFv ligand, HADa-S expressing HER2scFv-HveA adapter, and HADa-HgH-D virus, a dual targeting virus, at 0.1 MOI.
  • the medium was replaced with fresh medium without FBS in order to remove residual initial virus.
  • a virus culture medium was obtained, and protein expression levels were measured through Western blot to measure adapters in the culture medium.
  • the results are shown in FIG. 13 .
  • the HADa-HgH-D dual-targeting virus expressed three times more adapters than the HADa-S virus expressing only the adapter.
  • no adapters were detected in the unadapted gDm and HgH-S virus cultures.
  • HER2-expressing SK-OV-3 cells only adapters of the HADa-HgH-D dual targeting virus were detected. The reason for this is that, compared to the HADa-S virus, the HADa-HgH-D double-targeting virus has a higher infection rate in the cell line expressing HER2, and thus the expression of the adapter is proportionally higher.
  • the HADa-HgH-D double-targeting virus was confirmed to have relatively improved ability compared to other viruses in virus spread and amplification and adapter expression level.
  • Example 7 Infection and cytotoxicity of HER2-expressing cancer cells using HER2-targeting anticancer virus
  • the HADa-HgH-D virus was tested in a cancer cell line expressing HER2. The experiment was conducted as follows to determine whether each virus induces virus infection into surrounding cancer cells by the HER2scFv ligand or adapter expressed in gH glycoprotein or induces cytotoxicity after infection.
  • the cell lines used in the experiment were a HER2-expressing cell line (MDA-MB-231) and a HER2-expressing cell line (SK-OV-3, MCF-7, MDA-MB-453, BT-474).
  • Breast cancer cell line MDA-MB-231 (ATCC, HTB-26), MCF-7 (ATCC, HTB-22), , BT-474 (ATCC, HTB-20), ovarian cancer cell line SK-OV-3 (ATCC , HTB-77) were cultured using 100 U/ml penicillin/100 ⁇ g/ml streptomycin (Welgene) and 10% FBS in DMEM medium
  • breast cancer cell line MDA-MB-453 ATCC, HTB-131) RPMI 1640 The culture medium was cultured using 100 U/ml penicillin/100 ⁇ g/ml streptomycin (Welgene) and 10% FBS.
  • HER2-specific virus infection experiment 8 ⁇ 10 3 SK-OV-3 and MDA-MB-231, 4.0 ⁇ 10 4 MCF-7, 8.0 ⁇ 10 4 MDA-MB-453, 7.0 ⁇ 10 4
  • the BT-474 cell line was treated with HER2scFv ligand-expressing HgH-S, HER2scFv-HveA adapter-expressing HADa-S and dual-targeting HADa-HgH-D viruses at gH and gDm virus without HER2-targeting as a control, at an MOI of 2 infected. After 90 minutes, the medium was replaced with fresh medium to remove residual initial virus.
  • the adapter-expressing HADa-S virus had a high infection rate in SK-OV-3 and MCF7 cells, but a low infection rate was observed in MDA-MB-453 and BT-474 cells.
  • the HgH-S virus expressing the HER2scFv ligand in gH had a high infection rate in SK-OV-3, MCF7 and MDA-MB-453 cells, but a low infection rate in BT-474 cells.
  • the dual-targeting HADa-HgH-D virus observed a high infection rate in all cells expressing HER2.
  • MDA-MB-453 and BT-474 The low infection rate in MDA-MB-453 and BT-474 is considered to be due to the cell morphology and characteristics of MDA-MB-453 and BT-474 and the low initial infection of HADa-S virus resulting therefrom.
  • FIG. 15 shows the results of observing the cytotoxicity of cancer cells by the virus for 4 days after infection.
  • HgH-S, HAD-S HADa-HgH-D viruses showed 41%, 27% and 25% cell viability in SK-OV-3 and 61%, 52% and 39% cell viability in MCF-7, In MDA-MB-453, cell viability of 49%, 100%, and 23% was observed.
  • MDA-MB-453 MDA-MB-453
  • gDm virus did not observe cytotoxicity because it did not target HER2, and it was observed that the three viruses did not participate in cytotoxicity because it did not infect MDA-MB-231, which does not express HER2.
  • the reason that there was no effect on the viability of MDA-MB-453 cells seems to be because the initial infection of HADa-S virus was significantly lower than that of other viruses.
  • mice After subcutaneously injecting 5 X 10 6 cells/mouse of SK-OV-3 into 5-week-old Balb/c nude mice (Orient Bio), the tumor was observed until the size of the tumor became 100 mm 3 .
  • the HER2 double-targeting HADa-HgH-D virus was intratumoral injection into 5 tumor-generating mice at 2 X 10 7 pfu/mouse, and PBS was also injected into 5 mice in the control group. After virus injection, the size of the tumor generated in mice was observed for 28 days.
  • the results are shown as a graph of the size of the tumor for 28 days in FIG. 16 .
  • the tumor grew from 116.46 ⁇ 11.21 mm 3 to 815.28 ⁇ 141.36 mm 3 , but in mice injected with the HER2 double-targeting HADa-HgH-D virus, it was 108.85 ⁇ 15.54 mm 3 to 110.02 ⁇ 55.44 mm 3 from the initial stage. It was observed that tumor growth was inhibited compared to the control group.
  • EpCAMscFv-HveA adapter-expressing EADa-S virus prepared in Examples 3 and 5, the EgH-S virus expressing the EpCAMscFv ligand in gH, and the EpCAMscFv-HveA adapter and dual targeting EADa expressing both the EpCAMscFv ligand in gH- Experiments were carried out in cancer cell lines using EgH-D virus.
  • the cell lines used in the experiment were a cell line in which EpCAM is not expressed (Mia-PaCa-2) and a cell line in which EpCAM is expressed (MCF-7, MDA-MB-453, BT-474).
  • MCF-7 a cell line in which EpCAM is not expressed
  • MDF-7 a cell line in which EpCAM is expressed
  • MCF-7 a cell line in which EpCAM is expressed
  • MDA-MB-453 MDA-MB-453
  • BT-474 a cell line in which EpCAM is expressed
  • Breast cancer cell lines MCF-7 (ATCC, HTB-22), BT-474 (ATCC, HTB-20) and pancreatic cancer cell lines Mia-PaCa-2 (ATCC, CRL-1420) were mixed with 100 U/ml penicillin/ml in DMEM medium.
  • MDA-MB-453 ATCC, HTB-131
  • a breast cancer cell line was cultured in RPMI medium with 100 U/ml penicillin/100 ⁇ g/ml streptomycin. It was cultured using mycin (Welgene) and 10% FBS.
  • EpCAM-specific virus infection experiment 4.0 ⁇ 10 4 of MCF-7, 8.0 ⁇ 10 4 of MDA-MB-453, and 7.0 ⁇ 10 4 of The BT-474 cell line was 1 MOI, EADa-S expressing EpCAMscFv-HveA adapter prepared in Example 3, EgH-S virus expressing EpCAMscFv ligand in gH prepared in Example 4, adapter and ligand
  • the expressing double-targeted EADa-EgH-D virus and the non-EpCAM-targeted gDm virus prepared in Example 2 as a control were infected. After 90 minutes, the medium was replaced with fresh medium to remove residual initial virus.
  • FIG. 17 The results are shown in FIG. 17 .
  • EADa-S virus expressing only EpCAM-HveA adapter in BT-474 and MDA-MB-453 and MCF7 cells EgH-S virus expressing EpCAMscFv ligand in gH, adapter and ligand together All of the expressed dual-targeted EADa-EgH-D viruses were observed to infect cells by fluorescence, but the double-targeted EADa-EgH-D virus showed a higher infection rate compared to EADa-S and EgH-S viruses. It was observed that gDm virus did not infect cancer cell lines because it did not target EpCAM, and virus did not infect Mia-PaCa-2 cells that did not express EpCAM.
  • FIG. 18 shows the results of observing the cytotoxicity of cancer cells by the virus for 5 days after infection.
  • EgH-S, EAD-S EADa-EgH-D viruses showed cell viability of 35%, 34%, and 26% in BT-474 and 22%, 19%, and 17% in MDA-MB-453, In MCF-7, cell viability of 36%, 31%, and 20% was observed.
  • MCF-7 cell viability of 36%, 31%, and 20% was observed.
  • the highest cytotoxicity by EADa-EgH-D double-targeting virus infection was observed.
  • gDm virus did not observe cytotoxicity because it did not target EpCAM, and it was observed that neither virus was involved in cytotoxicity because it was not infected even in Mia-PaCa-2, which does not express EpCAM.
  • KOS-UL3/4_EpCAMscFv-HveA-EmGFP-gD-R222N/F223I EADa-S
  • a ligand (HER2 scFv) that recognizes HER2 specifically expressed in cancer cells was inserted between the 29th and 30th amino acids of the gH amino acid sequence (GenBank Accession No. ASM47773, SEQ ID NO: 35), which is a viral glycoprotein. .
  • FIG. 19 A schematic diagram of the KOS-UL3/4_EpCAMscFv-HveA-gH/HER2scFv-EmGFP-gD/R222N/F223I virus genome in which the HER2scFv ligand is inserted into the gH of HSV-1 is shown in FIG. 19, and the entire sequence of the gH-HER2scFv ligand and the corresponding The structure of the sequence is shown in FIG. 8 .
  • the scFv for HER2 has a configuration in which the VH of SEQ ID NO: 4 and the VL of SEQ ID NO: 5 are linked via the linker peptide of SEQ ID NO: 24, and the linker peptide of SEQ ID NO: 36 is linked to the N-terminus of this scFv, and C - The linker peptide of SEQ ID NO: 37 is connected to the end.
  • amino acid sequence and gene sequence of the full-length HER2scFv used in this Example are shown in SEQ ID NO: 38 and SEQ ID NO: 39, respectively.
  • Insertion of the gH-HER2scFv ligand was performed according to the manufacturer's protocol using a counter selection BAC modification kit (GenBridges. Inc) as in Example 4 above.
  • RecE and RecT performing a homologous recombination function in the E.coli clone containing KOS-37/BAC-UL3/4_EpCAMscFv-HveA-EmGFP-gD-R222N/F223I DNA prepared in Example 3
  • the pRed/ET plasmid expressing the was transformed (Muyrers JP et al .; Nucleic Acids Res. 1999. 27(6):1555-1557).
  • a set of homologous region primers (forward primer gH29/30-rpsL-neo_for: SEQ ID NO: 40, reverse primer gH29/30) containing the position at which the target gene is to be introduced between amino acids 29 and 30 of gH -rpsL-neo_rev: SEQ ID NO: 41) was used to construct a gH29/30-rpsL-neo/kan cassette.
  • KOS-37/BAC-UL3/4_EpCAMscFv-HveA-EmGFP-gD-R222N/F223I DNA and pRed/ET L-arabinose (L-arabinose; Sigma-Aldrich) was added to the clone containing the homologous recombination (homologous) recombination) was induced, and 200 ng of the prepared gH29/30-rpsL-neo/kan cassette was transformed.
  • the gH29/30-rpsL-neo/kan cassette is inserted between the 29th and 30th amino acids of gH.
  • coli into which gH29/30-rpsL-neo/kan is inserted has kanamycin resistance, but streptomycin resistance is blocked by the rpsL gene.
  • E. coli selected in kanamycin medium it was determined that gH29/30-rpsL-neo/kan was inserted, and the final step, the step of inserting the target gene, was performed.
  • Candidate groups were selected in streptomycin medium using the principle that the previously inserted gH29/30-rpsL-neo/kan cassette and the previously inserted gH29/30-HER2scFv were replaced and streptomycin resistance blocked by rpsL was activated (Heermann). R et al., Microb Cell Fact. 2008. 14:. doi: 10.1186). The selected candidate group was subjected to DNA isolation using the DNA prep method (Horsburgh BC et al., Methods enzymol. 1999. 306:337-352), and the introduction of HER2scFv in gH29/30 was checked by restriction enzymes EcoRI, XhoI. It was confirmed by processing and PCR (ploymerase chain recation), and the correct gene sequence was confirmed by sequencing the PCR product.
  • EpCAMscFv-HveA was subjected to three freeze-thaw methods (Gierasch WW et al.; J. Virol Methods. 2006. 135:197-206) and sonication.
  • the cell lines used in the experiment were a cell line expressing neither HER2 nor EpCAM (CHO-K1), a cell line expressing HER2 (CHO-HER2), and a cell line expressing EpCAM (CHO-EpCAM).
  • Chinese hamster ovary cell lines CHO-K1, CHO-HER2, CHO-EpCAM (Kuroki M et al., J Biol Chem. 1991. 74:10132-10141) were mixed in HaM's F-12K medium (Welgene) at 100 U/ml Penicillin/100 ⁇ g/ml streptomycin (Welgene) and 10% FBS (fetal bovine serum) were used for incubation.
  • HER2/EpCAM dual targeting virus For specific virus infection, 2.5 ⁇ 10 4 CHO-K1, CHO-HER2, and CHO-EpCAM cell lines are spread in a 96-well plate. After 24 hours, the HER2 double-targeting virus (HADa-HgH-D) prepared in Example 4, the EpCAM double-targeting virus (EADa-EgH-D) prepared in Example 5, and the production in Example 10 HER2/EpCAM dual targeting virus (EADa-HgH-D) was each infected at an MOI of 5. After 90 minutes, the medium was replaced with fresh medium to remove residual initial virus and adapter. Two days after infection, viral infection in each cell line was observed under a fluorescence microscope by fluorescence expression (BaeK HJ et al ., Mol Ther. 2011. 19(3):507-514).
  • FIG. 20 The results are shown in FIG. 20 .
  • a photograph of each virus being infected with a cell line was taken with a fluorescence microscope. It was observed that all viruses were not infected in the CHO-K1 cell line in which HER2 and EpCAM were not expressed.
  • the HER2 dual targeting virus (HADa-HgH-D) was only infected with CHO-HER2, and the EpCAM dual targeting virus (EADa-EgH-D) was only infected with CHO-EpCAM.
  • HER2/EpCAM dual targeting virus confirmed infection in both CHO-HER2 and CHO-EpCAM cells. Through this result, it was possible to confirm the possibility of a strategy for targeting two or more target molecules by a virus that can target two target molecules together.
  • the cell lines used in the experiment were a cell line expressing neither HER2 nor EpCAM (CHO-K1), a cell line expressing HER2 (CHO-HER2), and a cell line expressing EpCAM (CHO-EpCAM).
  • Chinese hamster ovary cell lines CHO-K1, CHO-HER2, CHO-EpCAM (Kuroki M et al., J Biol Chem. 1991. 74:10132-10141) were mixed in HaM's F-12K medium (Welgene) at 100 U/ml Penicillin/100 ⁇ g/ml streptomycin (Welgene) and 10% FBS (fetal bovine serum) were used for incubation.
  • CHO-K1, CHO-HER2, and CHO-EpCAM cell lines are spread in a 96-well plate. After 24 hours, the virus expressing only the HER2scFv-HveA adapter (HADa-S), the virus expressing only the EpCAMscFv-HveA adapter (EADa-S), and the EpCAMscFv-HveA adapter and the HER2scFv-HveA adapter prepared in Example 3
  • a double-targeting virus (EADa-HADa-D), which also expresses After 90 minutes, the medium was replaced with fresh medium to remove residual initial virus and adapter. Two days after infection, viral infection in each cell line was observed under a fluorescence microscope by fluorescence expression (BaeK HJ et al ., Mol Ther. 2011. 19(3):507-514).
  • FIG. 21 a photograph taken with a fluorescence microscope of each virus being infected with a cell line. It was observed that all viruses were not infected in the CHO-K1 cell line in which HER2 and EpCAM were not expressed.
  • the virus expressing only the HER2scFv-HveA adapter (HADa-S) was infected only with CHO-HER2, and the virus expressing only the EpCAMscFv-HveA adapter (EADa-S) was infected only with CHO-EpCAM.
  • the dual-targeting virus (EADa-HADa-D) expressing both the EpCAMscFv-HveA adapter and the HER2scFv-HveA adapter confirmed infection in both CHO-HER2 and CHO-EpCAM cells.

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Abstract

본 발명은 다중 표적화 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스 및 그 용도를 개시한다. 구체적으로 본 발명은 암세포 표적화 영역과 HVEM의 세포외 도메인의 융합 단백질인 어댑터를 다중으로 발현함으로써 다중 표적화가 가능한 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스와 또 암세포 표적화 영역과 HVEM의 세포외 도메인의 융합 단백질인 어댑터를 발현할 수 있는 이외에 또 재표적화가 가능하도록 변형된 당단백질을 가짐으로써 다중 표적화가 가능한 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스 그리고 이들 바이러스 항염 치료 용도를 개시한다.

Description

다중 표적화 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스 및 그 용도
본 발명은 다중 표적화 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스 및 그 용도에 관한 것이다.
암 치료에는 현재까지 수술 요법, 항암 화학 요법, 방사선 요법 등이 널리 이용되어 있으나 대부분이 부작용을 수반하고 불완전한 치료 효과, 암 재발과 전이 등의 문제점을 가지고 있다. 따라서 새롭고 효과적인 암 치료법 개발이 지속적으로 요구되어 왔으며, 최근 몇년 사이 항암 바이러스, CAR-T 세포 치료법(chimeric antigen receptor T cell therapy) 등 항암 면역 요법에 있어 급속한 발전이 있었다.
항암 면역 요법 중 항암 바이러스는 살아있는 바이러스의 유전자를 조작해 암세포에서 선택적으로 증식하여 암세포를 용해하는 특성을 가진 바이러스로서, 정상세포에서의 증식은 제한적이다. 암세포를 용해하여 방출된 바이러스는 주변 암세포를 계속 감염시킴으로써 지속적이고 상승적인 치료 효과를 낼 수 있다. 또한 항암 바이러스는 암세포를 용해하는 과정에서 면역원성을 가진 종양 항원이 방출되어 인체의 면역반응을 자극시킴으로써 항암 효과를 높일 수 있으며, 또 이러한 항암 효과는 사이토카인, 케모카인 등을 발현하도록 인위적으로 조작함으로써 증진될 수도 있다.
현재의 개발되는 항암 바이러스는 아데노 바이러스와 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes Simplex Virus, HSV), 백시니아 바이러스를 포함하여 10종 이상으로 나눌 수 있는데, 이중 HSV는 152kb 크기의 선상의 이중가닥 DNA를 포함하는 다면체성 바이러스(enveloped icosahedral virion)로서, HSV-1형과 HSV-2형으로 나뉜다. HSV는 많은 비필수 유전자(non-essential genes)를 가지고 있고 게놈의 크기가 커서 외부 유전자의 조작이나 운반이 용이하고, 복제 주기가 짧으며, 또 감염 효율이 높고, 세포 부착과 감염에 관여하는 당단백질의 조작이 용이하여 암세포에 대한 표적화를 개선시킬 수 있는 장점을 가진다.
2015년 10월 미국 FDA의 승인을 받은 T-VEC(Talimogene Laherparepvec, 제품명: 임리직)은 HSV-1을 이용한 악성 흑색종에 대한 항암 바이러스 치료제이다. T-VEC은 병원성을 약화시키기 위하여 ICP34.5와 ICP47 유전자가 결실되어 있고, 인체 면역 반응을 촉진시키기 위한 GM-CSF(granulocyte-macrophage colony stimulating factor)를 발현하는 약화된(attenuated) HSV-1형 바이러스이다. 그러나 T-VEC은 일부 유전자가 소실됨에 따라 바이러스 증식이 제한되어 치료 효능이 낮은 한계점을 갖고 있다.
HSV는 외피(envelope)를 가진 바이러스로, HSV의 세포 진입은 외피에 존재하는 당단백질 gD, gB, gH/gL 및 gC의 복잡한 상호 작용에 의해 이루어진다. 먼저 gB와 gC가 세포 표면의 3-O-S HS(3-O-sulfated heparan sulfate)에 부착하면, gD가 세포 수용체인 HVEM(herpesvirus entry mediator, HveA), 넥틴-1(nectin-1, HveC), 넥틴-2(nectin-2, HveB) 중 적어도 하나의 수용체 결합하여 바이러스와 세포막 사이의 융합을 유도함으로써 HSV가 세포로 진입한다(Hiroaki Uchida et al., Generation of Herpesvirus Entry Mediator (HVEM)-restricted Herpes Simplex Virus Type 1 Mutant Viruses: Resistance of HVEM-expressing Cells and Identification of Mutations That Rescue nectin-1 Recognition. J Virol. 2009 Apr;83(7):2951-61).
2015년 10월 미국 FDA의 승인을 받은 T-VEC(Talimogene Laherparepvec, 제품명: 임리직)은 HSV-1을 이용한 악성 흑색종에 대한 항암 바이러스 치료제이다. T-VEC은 병원성을 약화시키기 위하여 ICP34.5와 ICP47 유전자가 결실되어 있고, 인체 면역 반응을 촉진시키기 위한 GM-CSF(granulocyte-macrophage colony stimulating factor)를 발현하는 약화된(attenuated) HSV-1형 바이러스이다. 그러나 T-VEC은 일부 유전자가 소실됨에 따라 바이러스 증식이 제한되어 치료 효능이 낮은 한계점을 갖고 있다.
이러한 한계를 극복하기 위하여, 바이러스를 약화시키지 않으면서 HSV의 세포 진입에 관여하는 외피 당단백질 gD, gB, gH, gC를 조작하여 암세포를 특이적으로 표적화하기 위한 재표적화(retargeting)가 시도되었다. 이러한 재표적화는 암세포 표적분자에 대한 표적화 도메인을 암호화하는 외인성 서열을 당단백질 gD, gB, gH, gC 서열에 도입하는 것으로서 야생형 당단백질 대신에 당단백질에 외인성 서열의 표적화 도메인(리간드라고도 함)이 삽입되어 있는 키메라 당단백질을 갖는 재조합 바이러스를 이용하는 방법이다. 이러한 재조합 바이러스는 표적화 영역이 특이적으로 인식하여 결합하는 표적분자를 갖는 암세포로의 진입이 가능하다. 이러한 표적화 영역은 일반적으로 scFv(single-chain variable fragment)가 사용되고, 현재 재표적화가 시도된 표적 분자는 EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule), HER2(Human epidermal growth factor receptor 2) 등이며, 당단백질로서 gB, gH, gC 등의 변형이 이루어졌다.
한편 HSV의 세포 수용체 중 HVEM은 종양괴사인자 수용체 단백질 패밀리(tumor necrosis factor receptor protein family, TNFR family)에 속하며, 주로 T, B 림프구, 마크로페이지, DC 세포, 감각 신경 세포(sensory neuron), 점막 상피 세포(mucosal epithelial cell)에서 발현되지만(Shui JW, Kronenberg M. 2013. Gut Microbes 4(2):146-151), B, T 림프종, 흑색종, 직장암(colorectal cancer), 간세포암(hepatocellular carcinoma), 유방암(breast cancer), 난소의 장액 선암종(ovarian serous adenocarcinoma), 투명신세포암(clear renal cell carcinoma), 교모세포종(glioblastoma) 같은 여러 종양조직에서도 많이 발현되는 것으로 알려져 있다 (Pasero C et al., Curr Opin Pharmacol. 2012. 2(4):478-85, Malissen N et al., ONCOIMMUNOLOGY 2019, VOL. 8(12):e1665976) HVEM은 TNFR 패밀리의 특징인 4개의 CRD(cystein-rich domain)를 가지며, 이 중 2개의 CRD가 HSV의 gD와 결합하여 HSV-1과 HSV-2의 세포 진입을 유도하는 것으로 보고 있다(Sarah A Connolly et al., Structure-based Analysis of the Herpes Simplex Virus Glycoprotein D Binding Site Present on Herpesvirus Entry Mediator HveA (HVEM). J Virol. 2002 Nov;76(21):10894-904. ).
본 발명자들은 이전에 CEA(carcinoembryonal antigen)에 대한 scFv(single-chain variable fragment)와 HSV 세포 표면 수용체의 하나인 HVEM의 세포외 도메인의 융합 단백질(CEAscFv-HveA)을 제작하여, 그 융합 단백질을 HSV와 함께 CEA을 발현하는 세포주에 처리할 경우, 그 융합 단백질이 어탭터(adapter)로 작용하여 HSV가 해당 세포주를 표적하여 감염시키도록 유도함을 이전에 보고한 바 있다(한국 등록특허 제10-0937774호 및 미국 등록특허 제8318662호 참조).
본 발명자들은 HER2(Human epidermal growth factor receptor 2) 또는 EpCAM를 표적화할 수 있는 어댑터인 융합 단백질(HER2scFv-HveA, EpCAM2scFv-HveA)을 암호화하는 유전자를 HSV의 게놈에 발현 가능하게 삽입하여 그 융합 단백질이 HSV에 감염된 세포 내에서 발현되도록 할 경우, 그 융합 단백질이 HSV를, HER2 또는 EpCAM을 발현하는 세포주를 표적하여 감염시키도록 유도함을 확인하였으며, 나아가 어댑터에 의한 다중 표적화가 가능하도록, HER2에 대한 표적화 기능을 가지는 어댑터인 융합 단백질(HER2scFv-HveA)을 발현할 수 있는 그 발현 카세트와 EpCAM에 대한 표적화 기능을 가지는 어댑터인 융합 단백질(EpCAM-HveA)을 발현할 수 있는 그 발현 카세트를 HSV의 게놈에 다중(dual)으로 삽입하여 그 융합 단백질들이 HSV에 감염된 세포 내에서 발현되도록 할 경우, 그 융합 단백질들이 HSV 비리온을, HER2 및/또는 EpCAM을 발현하는 세포주에 대해 다중으로 표적하여 감염시키도록 유도함을 확인하는 한편, 이러한 어댑터의 발현 카세트를 HSV의 게놈에 삽입하고 추가로는 당단백질을 변형하여 HER2 및/또는 EpCAM에 대한 재표적화가 가능하도록 한 재조합 HSV가 HER2 및/또는 EpCAM를 발현하는 세포주에 대해 다중으로 표적하여 감염시킴을 확인하였다.
전술한 바를 고려할 때, 본 발명의 목적은 암세포 표적화 영역과 HVEM의 세포외 도메인의 융합 단백질인 어댑터를 다중으로 발현함으로써 다중 표적화가 가능한 재조합 HSV를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 암세포 표적화 영역과 HVEM의 세포외 도메인의 융합 단백질인 어댑터를 발현할 수 있는 이외에 또 재표적화가 가능하도록 변형된 당단백질을 가짐으로써 다중 표적화가 가능한 재조합 HSV를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 HSV를 유효성분으로 포함하는 항암 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 약제학적 조성물을 유효량으로 환자 등 대상체에 투여하는 암 예방 또는 치료 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.
본 발명은 다중 표적화가 가능한 재조합 HSV에 관한 것으로서, 본 발명의 다중 표적화가 가능한 재조합 HSV는 일 측면에 있어서, 헤르페스 심플렉스 바이러스의 증식을 저해하지 않으면서 그 게놈에, 암세포 표적화 영역(즉 암세포 표면의 표적분자에 특이적으로 결합하는 도메인임)과 HVEM의 세포외 도메인의 융합 단백질(즉 어댑터)이 2개 이상 다중으로 발현될 수 있도록 그 융합 단백질 발현 카세트가 1개 이상 삽입된 구성을 가짐으로써 다중 표적화가 가능한 재조합 HSV로 파악할 수 있다.
이러한 본 발명의 다중 표적화 재조합 HSV에서 2개 이상 즉 다중으로 융합 단백질이 발현됨으로써 그 다중으로 발현된 융합 단백질은 그 표적화 영역이 동일 표적분자를 다중으로 표적화하거나 서로 다른 표적분자를 다중으로 표적화하는 것일 수 있다. 상기 표적분자는 융합 단백질의 표적화 영역이 특이적으로 인식하여 결합하는 암세포의 표면에 존재하는 임의의 항원 또는 임의의 수용체를 말하는데, 본 발명의 재조합 HSV는 하나의 표적분자로서 예컨대 HER2를 표적화할 수 있는 융합 단백질을 다중으로 발현할 수 있는 발현 카세트가 1개 이상 그 게놈에 삽입된 것이거나, 서로 다른 표적분자로서 예컨대 HER2와 EpCAM를 각각 표적화할 수 있는 융합 단백질을 발현할 수 있는 발현 카세트가 1개 이상 그 게놈에 삽입된 것일 수 있다.
본 발명의 재조합 HSV가 암세포인 표적세포를 감염시켜 표적세포 내로 들어가게 되면, HSV가 증식됨과 함께 2개 이상 다중의 융합 단백질인 어댑터가 세포 내에서 발현되어 세포 용해에 의하여 증식된 HSV 비리온과 함께 세포 외부로 방출되거나 어댑터가 리더 서열을 가질 경우에는 세포 용해에 의한 비리온 방출 이전에도 방출되게 되는데, 그러면 이 세포 외부로 방출된 다중의 어댑터는 HSV 비리온을, 어댑터의 암세포 표적화 영역이 인식하는 표적분자를 발현하는 주변 암세포로 감염을 다중으로 유도함으로써 단일 표적화 재조합 HSV(즉 암세포 표적화 영역과 HVEM의 세포외 도메인의 융합 단백질을 발현할 수 있는 발현 카세트를 하나만 포함하는 재조합 HSV)에 비해 그 감염 효율을 보다 높이고 주변 암세포로의 지속적인 확산 효율을 보다 높이는 작용을 하게 된다. 이는 결과적으로 보다 효과적인 암세포의 사멸로 이어지게 된다.
다른 측면에 있어서, 본 발명의 다중 표적화가 가능한 재조합 HSV는 (i) 헤르페스 심플렉스 바이러스의 증식을 저해하지 않으면서 그 게놈에, 암세포 표적화 영역과 HVEM의 세포외 도메인의 융합 단백질인 어댑터를 발현할 수 있는 발현 카세트가 1개 이상 삽입되어 있고, 또한 (ii) 그 당단백질에 암세포 표적화 영역이 삽입되어 융합됨으로써 다중 표적화가 가능한 재조합 HSV로 파악될 수 있다.
이러한 본 발명의 다중 표적화 재조합 HSV는 암세포 표적화 영역이 삽입되어 융합됨에 의해 재표적화가 가능한 변형된 당단백질을 가짐으로써 어댑터에 의한 표적화 이외에 당단백질에 의해 추가적인 표적화가 가능하게 된다. 이러한 다중 표적화 재조합 HSV도 전술한 바의 다중의 어댑터 발현 카세트를 가진 재조합 HSV와 같이 비리온의 암세포의 감염 효율이나 비리온의 주변 암세포로의 지속적인 확산 효율, 암세포 사멸 효율에서 있어서 보다 효과적이다.
일반적으로 재조합 HSV는 야생형 HSV 바이러스와 비교할 때 인위적인 돌연변이가 도입됨으로써(즉 일부 핵산 서열이 결실, 치환 또는 삽입됨으로써) 일정 기능이 상실 또는 변경되거나 의도한 목적 단백질을 발현할 수 있도록 유전적으로 조작된 HSV를 의미하는데, 본 발명에서 재조합 HSV는 HSV 게놈에, HSV의 증식을 저해하지 않으면서, 어댑터의 발현 카세트(adapter expressionl cassette)(즉 어댑터 유전자가 이의 발현을 가능하게 하는 프로모터 서열 및 폴리아데닐화 시그널 서열과 작동가능하게 연결된 구성체)를 도입(즉 삽입)함으로써 그 재조합 HSV가 감염된 암세포 내에서 어댑터를 발현할수 있고, 또한 재표적화를 위하여 변형된 당단백질을 갖는 HSV를 의미한다.
이러한 바이러스의 유전자 조작과 비리온의 생산 등 재조합 바이러스 제조 기술은 당업계에 매우 잘 공지되어 있으며, 구체적으로는 문헌[Sandri-Goldin RM et al, Alpha Herpesviruses: Molecular and Cellular Biology, Caister Academic Press, 2006], 문헌[Robin H Lachmann, Herpes simplex virus-based vectors, Int J Exp Pathol. 2004 Aug; 85(4): 177-190] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌을 포함하여 본 명세서에서 인용되는 문헌들은 모두 본 명세서의 일부로 간주된다.
본 발명의 재조합 HSV는, 특히 이러한 어댑터를 발현하도록 조작되는 이외에, 진입 수용체(entry receptor)로서 넥틴-1(nectin-1)을 통하여 세포 내로 진입하지 못하고 오직 HVEM 수용체를 통해서만 세포 내로 진입하도록 추가로 조작될 수 있다. 본 발명은 아래의 실시예에서 HSV 당단백질(envelope glycoprotein) gD의 서열을 조작하여 HVEM 수용체를 통해서만 HSV가 세포 내로 진입하도록 하였다. 구체적으로 gD의 222번 위치의 아르기닌(arginine, R)과 223번 위치의 페닐알라닌(phenylalanime, F)을 각각 아스파라긴(asparagine, N)과 이소루신(isoleucine, I)로 치환시켜 gD의 기능이 변경되도록 조작하였으며, 이러한 gD 기능이 변경된 재조합 HSV는 오직 HVEM(HveA) 수용체를 통해서만 숙주세포 내로 들어갈 수 있다(Hiroaki Uchida et al. Generation of Herpesvirus Entry Mediator (HVEM)-restricted Herpes Simplex Virus Type 1 Mutant Viruses: Resistance of HVEM-expressing Cells and Identification of Mutations That Rescue nectin-1 Recognition. J Virol. 2009 Apr;83(7):2951-61). HVEM(HveA) 수용체는 정상세포에는 거의 존재하지 않고 림프종 등에만 존재하는데 반해, 넥틴-1은 대부분의 정상세포에 존재하므로, HVEM 수용체를 통해서만 세포 진입이 가능하고 넥틴-1 수용체를 통해서는 세포 진입이 불가한, 상기 gD 기능이 변경된 재조합 HSV는 정상세포를 감염시키지 못하므로 안전성 측면에서 유리한 특성을 가지게 된다.
또한 본 발명의 재조합 HSV는 어댑터를 통한 표적화 이외에 당단백질에의 암세포 표적화 영역의 삽입과 융합을 통해 추가적인 표적화가 가능하도록 조작되는데, 추가적인 표적화에 사용될 수 있는 당단백질로서는 gB, gC, gH 등이 사용될 수 있으며, 당단백질에의 암세포 표적화 영역이 삽입·융합된 HSV는 그 당단백질 유전자가 일부 결실되거나 결실되지 않고, 암세포의 표적화 영역에 대한 유전자가 오픈 리딩 프레임(open reading frame)으로 삽입됨으로써 제조될 수 있다. 이러한 당단백질 유전자에 암세포 표적화 영역의 유전자가 삽입될 경우 암세포 표적화 영역은, 당단백질에 융합된 형태로 재조합 HSV가 세포내에서 생산될 때 비리온의 외피에 통합되게 된다.
암세포 표적화 영역의 당단백질에의 삽입과 융합은 gB, gC, gD, gH 등의 당단백질에, 그 당단백질의 아미노산 서열이 결실되지 않고 그 아미노산 서열의 임의의 위치에서 이루어지거나, 일부 길이(특히 1개의 아미노산 내지 40의 연속된 아미노산)의 아미노산 서열이 결실되고 그 결실된 위치에서 이루어지거나, 일부 길이의 아미노산 서열이 결실, 치환되지만 결실, 치환되지 않은 아미노산 서열의 임의의 위치에서도 이루어질 수 있다. 여기서 일부 길이의 아미노산의 결실, 치환은 당단백질의 특정 세포 수용체 예컨대 HVEM, 넥틴-1 등과의 결합 부위를 불활성화시키기 위하여 이루어질 수 있다.
gB 당단백질에 암세포 표적화 영역이 삽입되어 융합될 경우 N-말단(N-terminus)을 포함한 임의의 위치일 수 있으나, HSV-1에 있어서 바람직한 위치는 gB의 아미노산 서열(서열번호 1, GenBank Accession No. ASM47779)에서, 아미노산 9번 내지 896번 영역 내의 임의의 위치일 수 있다. 또 바람직한 위치는 아미노산 31번 내지 78번 영역 내의 임의의 위치, 아미노산 80번 내지 363번 영역 내의 임의의 위치 또는 아미노산 408번 내지 896번 영역 내의 임의의 위치일 수 있다. 또 바람직한 위치는 gB의 43번 아미노산 다음 위치, 52번 아미노산 다음 위치, 70번 아미노산 다음 위치, 76번 아미노산 다음 위치, 80번 아미노산 다음 위치, 81번 아미노산 다음 위치, 95번 아미노산 다음 위치, 100번 아미노산 다음 위치, 137번 아미노산 다음 위치, 185번 아미노산 다음 위치, 187번 아미노산 다음 위치, 241번 아미노산 다음 위치, 261번 아미노산 다음 위치, 265번 아미노산 다음 위치, 304번 아미노산 다음 위치, 334번 아미노산 다음 위치, 361번 아미노산 다음 위치, 408번 아미노산 다음 위치, 419번 아미노산 다음 위치, 430번 아미노산 다음 위치, 458번 아미노산 다음 위치, 470번 아미노산 다음 위치, 481번 아미노산 다음 위치, 495번 아미노산 다음 위치, 497번 아미노산 다음 위치, 546번 아미노산 다음 위치, 608번 아미노산 다음 위치, 630번 아미노산 다음 위치, 663번 아미노산 다음 위치, 664번 아미노산 다음 위치, 665번 아미노산 다음 위치, 671번 아미노산 다음 위치, 673번 아미노산 다음 위치, 690번 아미노산 다음 위치, 725번 아미노산 다음 위치, 730번 아미노산 다음 위치, 732번 아미노산 다음 위치, 742번 아미노산 다음 위치, 772번 아미노산 다음 위치, 868번 아미노산 다음 위치, 869번 아미노산 다음 위치, 886번 아미노산 다음 위치, 893번 아미노산 다음 위치, 894번 아미노산 다음 위치, 895번 아미노산 다음 위치일 수 있다. 상기 위치는 gB의 서열번호 1의 아미노산 서열을 기준으로 한 것이나, gB의 서열에서 일부 차이가 있는 변이 균주에 있어서는 이에 상응하는 상동 서열(homologous sequence)을 기준으로 한다.
gC 당단백질에 세포 표적화 영역이 추가로 삽입되어 융합될 경우도 그 N-말단(N-terminus)을 포함한 임의의 위치일 수 있으나, HSV-1에 있어서 바람직한 위치는 gC의 아미노산 서열(서열번호 2, GenBank Accession No. ASM47796)에서, 아미노산 1번 내지 442번 영역 내의 임의의 위치, 또 바람직한 위치는 아미노산 33번 내지 154번 영역 내의 임의의 위치일 수 있다. 또 바람직한 위치는 gC의 33번 아미노산 다음 위치, 82번 아미노산 다음 위치, 148번 아미노산 다음 위치, 149번 아미노산 다음 위치, 153번 아미노산 다음 위치일 수 있다. 상기 위치는 gC의 서열번호 3의 아미노산 서열을 기준으로 한 것이나, gC의 서열에서 일부 차이가 있는 변이 균주에 있어서는 이에 상응하는 상동 서열(homologous sequence)을 기준으로 한다.
gH 당단백질에 암세포 표적화 영역이 삽입되어 융합될 경우, N-말단(N-terminus), H1A 도메인의 N-말단 등을 포함한 임의의 위치일 수 있으나, HSV-1에 있어서 바람직한 위치는 gH의 아미노산 서열(서열번호 3, GenBank Accession No. ASM47773)에서, 아미노산 12번 내지 88번 영역 내의 위치, 아미노산 116번 내지 137번 영역 내의 위치 또는 아미노산 209번 내지 839번 영역 내의 위치일 수 있다. 또 바람직한 위치는 아미노산 12번 내지 49번 영역 내의 위치 또는 아미노산 116번 내지 137번 영역 내의 위치일 수 있다. 또 바람직한 위치는 12번 아미노산 다음 위치, 22번 아미노산 다음 위치, 23번 아미노산 다음 위치, 29번 아미노산 다음 위치, 83번 아미노산 다음 위치, 116번 아미노산 다음 위치, 209번 아미노산 다음 위치, 215번 아미노산 다음 위치, 225번 아미노산 다음 위치, 277번 아미노산 다음 위치, 386번 아미노산 다음 위치, 437번 아미노산 다음 위치, 447번 아미노산 다음 위치, 472번 아미노산 다음 위치, 636번 아미노산 다음 위치, 637번 아미노산 다음 위치, 666번 아미노산 다음 위치, 731번 아미노산 다음 위치, 763번 아미노산 다음 위치, 764번 아미노산 다음 위치, 775번 아미노산 다음 위치, 806번 아미노산 다음 위치, 824번 아미노산 다음 위치, 838번 아미노산 다음 위치일 수 있다. 상기 위치는 gH의 서열번호 3의 아미노산 서열을 기준으로 한 것이나, gH의 서열에서 일부 차이가 있는 변이 균주에 있어서는 이에 상응하는 상동 서열(homologous sequence)을 기준으로 한다.
당단백질의 바람직한 삽입 위치와 관련해서 더 구체적인 것은 문헌[JOHN R. GALLAGHER et al., Functional Fluorescent Protein Insertions in Herpes Simplex Virus gB Report on gB Conformation before and after Execution of Membrane Fusion, PLoS Pathog, 2014, Sep 18, 10(9):e1004373], 문헌[Gatta V et al, The Engineering of a Novel Ligand in gH Confers to HSV an Expanded Tropism Independent of gD Activation by Its Receptors, PLoS Pathog. 2015 May 21;11(5):e1004907], 문헌[Tina M. Cairns et al., Structure-Function Analysis of Herpes Simplex Virus Type 1 gD and gH-gL: Clues from gDgH Chimeras, JOURNAL OF VIROLOGY, June 2003, p.6731-6742], 문헌[E.U. Lorentzen et al., Replication-Competent Herpes simplex Virus Type 1 Mutant Expressing an Autofluorescent Glycoprotein H Fusion Protein, Intervirology 2001;44:232-242], 문헌[Qing Fan et al., Differential Effects on Cell Fusion Activity of Mutations in Herpes Simplex Virus 1 Glycoprotein B (gB) Dependent on Whether a gD Receptor or a gB Receptor Is Overexpressed, JOURNAL OF VIROLOGY, Aug. 2009, 83(15):7384-7390], 문헌[Erick Lin et al., Random linker-insertion mutagenesis to identify functional domains of herpes simplex virus type 1 glycoprotein B, Proc Natl Acad Sci U S A. Aug. 2007, 104(32):13140-13145], 문헌[Julia O. Jackson et al., Insertion Mutations in Herpes Simplex Virus 1 Glycoprotein H Reduce Cell Surface Expression, Slow the Rate of Cell Fusion, or Abrogate Functions in Cell Fusion and Viral Entry, JOURNAL OF VIROLOGY, Feb. 2010, 84(4):2038-2046], 문헌[Guoying Zhou et al., Engineered herpes simplex virus 1 is dependent on IL13R*2 receptor for cell entry and independent of glycoprotein D receptor interaction, Proc Natl Acad Sci U S A. Nov. 2002, 99(23):15124-15129], 문헌[AR Frampton Jr et al., HSV trafficking and development of gene therapy vectors with applications in the nervous system, Gene Therapy, 2005, 12:891-901], 문헌[Paola Grandi et al., HSV-1 Virions Engineered for Specific Binding to Cell Surface Receptors, MOLECULAR THERAPY, Mar. 2004, 9(3):419-427], 문헌[William F Goins et al., Retargeting of Herpes Simplex Virus (HSV) Vectors, Curr Opin Virol, 2016 Dec, 21:93-101], 문헌[Xiaodan Wang et al., Targeted gene transfer to nigrostriatal neurons in the rat brain by helper virus-free HSV-1 vector particles that contain either a chimeric HSV-1 glycoprotein C-GDNF or a gC-BDNF protein, Brain Res Mol Brain Res. 2005 Sep, 139(1):88-102] 등을 참조할 수 있다.
당단백질에 암세포 표적화 영역이 삽입되어 융합될 경우 그 암세포 표적화 영역의 N 말단과 C 말단에는 링커 펩티드가 존재할 수 있다. 이러한 링커 펩티드는, 당단백질에 융합되는 암세포 표적화 영역이 당단백질과의 융합됨에 의하여 그 고유 3차원 구조를 형성하는데 방해를 받지 않도록, 암세포 표적화 영역과 당단백질 사이에 거리를 두기 위한 것으로, 그것의 표적분자와의 특이적인 결합 능력을 가지도록 하는 한, 임의의 길이, 임의의 서열의 링커 펩티드일 수 있다. 링커는 유연성(flexibility), 용해성(solubility), 단백분해에 대한 저항성 등을 고려할 때, Ser, Gly, Ala, Thr 등의 아미노산 중 한 종류 이상의 아미노산으로 이루어지는 것이 바람직하며, 길이는 1~30개 아미노산, 바람직하게는 3~25개 아미노산, 더 바람직하게는 8~20개 아미노산일 수 있다.
본 발명의 재조합 HSV는 HSV의 증식(즉 생존과 복제)에 필요하지 않은 비필수 유전자(non-essential genes)가 결실되거나 기능을 발휘하지 않도록(즉 전사나 번역이 방해를 받도록) 돌연변이(mutation) 될 수도 있다. 구체적으로 그러한 비필수 유전자는 UL3 유전자(예컨대, Genbank Accession No. AFE62830.1 참조), UL4 유전자(예컨대, Genbank Accession No. AFE62831.1 참조), UL14 유전자(예컨대, Genbank Accession No. AFE62841.1), UL16 유전자(예컨대, Genbank Accession No. AFE62843.1 참조), UL21 유전자(예컨대, Genbank Accession No. AFE62848.1 참조), UL24 유전자(예컨대, Genbank Accession No. AFE62851.1 참조), UL31 유전자(예컨대, Genbank Accession No. AFE62859.1 참조), UL32 유전자(예컨대, Genbank Accession No. AFE62860.1 참조), US3 유전자(예컨대, Genbank Accession No. AFE62891.1 참조), UL51 유전자(예컨대, Genbank Accession No. AFE62880.1 참조), UL55 유전자(예컨대, Genbank Accession No. AFE62884.1 참조), UL56 유전자(예컨대, Genbank Accession No. AFE62885.1 참조), US2 유전자(예컨대, Genbank Accession No. AFE62890.1), US12 유전자(예컨대, Genbank Accession No. AFE62901.1; 즉, ICP47 유전자 참조), LAT 유전자(예컨대, Genbank Accession No. JQ673480.1 참조), gB 유전자(예컨대, Genbank Accession No. GU734771.1의 52996과 55710 사이 서열), gL 유전자(예컨대, Genbank Accession No. AFE62828.1 참조), gH 유전자(예컨대, Genbank Accession No. AFE62849.1 참조), gD 유전자(예컨대, Genbank Accession No. AFE62894.1 참조) 1) 등을 들 수 있다.
HSV 바이러스의 비필수 유전자에 대해 더 구체적인 것은 문헌[DM Knipe and PM Howley(ed.) Fields virology(vol.2) Lippincot Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa. 2001. p.2399-2460)], 문헌[Subak-Sharpe J H, Dargan D J HSV molecular biology: general aspects of herpes simplex virus molecular biology Virus Genes, 1998, 16(3): 239-251], 문헌[Travis J. Taylor 및 David M. Knipe, Proteomics of Herpes Simplex Virus Replication Compartments: Association of Cellular DNA Replication, Repair, Recombination, and Chromatin Remodeling Proteins with ICP8, J Virol. 2004 Jun; 78(11): 5856-5866] 등을 참조할 수 있다.
본 발명의 재조합 HSV는 재조합 HSV-1 바이러스, 재조합 HSV-2 바이러스, 또는 HSV-1/HSV-2 키메라 바이러스(즉, 게놈이 HSV-1로부터 유래된 DNA 및 HSV-2로부터 유래된 DNA 둘 모두를 포함하는 재조합 HSV 바이러스임)일 수 있으며, 바람직하게는 재조합 HSV-1 바이러스, 더 바람직하게는 HSV-1 KOS 균주로부터 유래된 재조합 HSV-1이다. HSV-1 KOS 균주는 ATCC(Cat No VR-1493TM)로부터 구입이 가능하고 그 균주의 게놈 서열은 전체 서열 분석이 완료되어 GenBank Accession No. JQ673480.1에 제시되어 있다(Stuart J Macdonald et al. Genome Sequence of Herpes Simplex Virus 1 Strain KOS. J Virol. 2012 Jun;86(11):6371-2).
HSV-1 바이러스의 게놈은 총 84개의 유전자를 암호화하는 152 kb의 이중가닥 선형 DNA로 구성되어 있으며, 이는 서로 연결된 두 개의 단편 즉 긴 단편(L 영역)와 짧은 단편(S 영역)으로 구성된다. 긴 단편(L 영역)은 게놈의 약 82%를 차지하고, 짧은 단편(S 영역)은 게놈의 약 18%를 차지하며, 긴 단편과 짧은 단편은 접합 영역인 2개의 IRL((intermediate inverted repeat sequence) 의해 결합되며, 각 단편의 말단에는 TRL(terminal inverted repeat segment)이 존재한다. L 영역(UL)에는 56개의 UL1~UL56 유전자와 10개의 유전자(UL8.5, 9.5, 10.5, 12.5, 15.5, 20.5, 26.5, 27.5, 43.5, 49.5)가 존재하고, S 영역(US)에는 12개의 US1~US12 유전자와 2개의 유전자(US1.5, 8.5)가 존재하며, 접합 영역인 2개의 IRL에 4개의 유전자(ICP4, ICP34.5, ICP0 및 LAT)가 포함되어 있다.
본 발명에서, 어댑터 발현 카세트는 어댑터 유전자가 그것의 발현을 가능하게 하기 위한 프로모터 서열과 전사 종결 신호 서열인 폴리아데닐화 시그널(polyadenylation signal) 서열과 작동 가능하게 연결되어 구성된다. 여기서 "작동 가능하게 연결된다"는 것은 발현되는 어댑터 유전자의 전사 및/또는 번역이 가능하도록 연결된다는 의미이다. 예컨대 어떠한 프로모터가 그것에 연결된 어댑터 유전자의 전사에 영향을 준다면 그 프로모터는 그 어댑터 유전자에 작동 가능하게 연결된 것이다.
일반적으로 프로모터는 어떤 유전자의 전사 개시점을 기준으로 상위(5'쪽)에 위치하고, DNA-의존 RNA 중합효소에 대한 결합 부위, 전사 개시점, 전사 인자 결합 부위 등을 포함하는, 하나 이상의 유전자의 전사를 제어하는 기능을 갖는 핵산 서열을 의미한다. 이러한 프로모터는 진핵생물 유래일 경우 전사 개시점 상위에 있는 TATA 박스(통상 전사 개시점(+1) -20 내지 -30 위치에 존재), CAAT 박스(통상 전사 개시 부위와 비교하여 대략 -75 위치에 존재), 인핸서, 전사 인자 결합 부위 등을 포함한다.
프로모터는 그것에 연결된 목적유전자를 발현시킬 수 있는 프로모터라면 구성적 프로모터(상시적으로 유전자의 발현을 유도하는 프로모터), 유도성 프로모터(특정 외부 자극에 반응하여 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터), 조직 특이성 프로모터(특징 조직이나 세포에서 유전자의 발현을 유도하는 프로모터), 조직 비특이적 프로모터(모든 조직이나 세포에서 유전자의 발현을 유도하는 프모모터), 내인성 프로모터(바이러스가 감염되는 세포에서 유래된 프로모터), 외인성 프로모터(바이러스가 감염되는 세포 이외의 세포에서 유래된 프로모터) 모두 사용이 가능하다. 이러한 프로모터는 당업계에 많은 것이 공지되어 있으며 공지된 것 중 적절한 것을 선택하여 사용할 수 있다. 예컨대 CMV(cytomegalovirus) 프로모터 promotor), 라우스 육종 바이러스(RSV, rous sarcoma virus) 프로모터, HSV(herpes simplex virus) TK(thymidine kinase) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 75K 프로모터, SV40 프로모터, 메탈로티오닌(metallothionein) 프로모터, CD45 프로모터(조혈모세포 특이적 프로모터), CD14 프로모터(단핵구세포 특이적 프로모터), 서비빈(Survivin), 미드킨(Midkine), TERT, CXCR4 등의 암세포 특이적 프로모터(tumor specific promoter) 등을 사용할 수 있다. 특히 암세포 특이적 프로모터를 사용할 경우 암세포에서만 어댑터의 발현을 유도함으로써 어댑터가 정상세포에서 발현되는 것을 억제하여 본 발명의 재조합 HSV의 안전성을 높일 수 있다.
상기 어댑터 발현 카세트는 프로모터 이외에 전사 종결 신호 서열을 포함하여 구성되는데, 전사 종결 신호 서열은 poly(A) 첨가 신호(polyadenylation signal)로 작용하는 서열로서 전사의 완결성 및 효율성을 높이기 위한 것이다. 많은 전사 종결 신호 서열이 당업계에 공지되어 있으며, 이중에서 적절한 것 예컨대 SV40 전사 종결 신호 서열, HSV TK(Herpes simplex virus thymidine kinase)의 전사 종결 신호 서열 등을 선택하여 사용할 수 있다.
상기 어댑터 발현 카세트는 HSV의 증식을 저해하지 않으면서 HSV 게놈에 발현 가능하도록 삽입되는데, 그러한 삽입은 HSV 게놈의 결실 없이 삽입되거나, 또는 HSV 게놈 중 비필수 유전자가 일부 또는 전부 결실되고 그 결실된 위치에 삽입될 수 있다. 어댑터 발현 카세트가 HSV 게놈의 결실 없이 삽입될 경우 각 유전자 사이에 삽입될 수 있는데, 삽입되는 위치로서 바람직한 위치는 예컨대 UL3과 UL4 유전자 사이, UL26과 UL27 유전자 사이, UL37과 UL38 유전자 사이, UL48과 UL49 유전자 사이, UL53과 UL54 유전자 사이, US1과 US2 유전자 사이 등을 들 수 있다.
어댑터 발현 카세트가 HSV 게놈에 비필수 유전자가 일부 또는 전부 결실되고 그 결실된 위치에 삽입될 경우, 결실되는 비필수 유전자는 앞서 예시한 바의 임의의 비필수 유전자일 수 있다.
어댑터를 다중으로 발현하기 위해서, 폴리시스트론(polycistron) 구성을 가진 어댑터 발현 카세트가 1개 이상 HSV 게놈에 삽입되거나, 모노시스트론(monocistron) 구성을 가진 어댑터 발현 카세트가 2개 이상 HSV 게놈에 삽입될 수 있다.
폴리시스트론 구성을 가진 어댑터 발현 카세트는 프로모터와 전사 종결 신호 서열 이외에 그 사이에 2개 이상의 어댑터 유전자를 포함하고, 이들 유전자 사이에는 각각 단백질이 발현될 수 있도록 IRES(Internal Ribosome Entry Site, 내부 리보솜 유입 부위)나 2A 펩타이드 암호화하는 핵산 서열이 위치하게 된다. 여기서 2A 펩타이드는 피코르나바이러스(Picornavirus), 곤충 바이러스. 유형 C 로타바이러스(Type C rotavirus)로부터 확인된 것으로, 바람직한 2A 펩타이드는 토세아아시그나 바이러스(Thoseaasigna virus)의 2A(T2A), 돼지 테스코바이러스-1(Pocine Teschovirus-1)의 2A(P2A), ERAV(Equine Rhinitis A Virus)의 2A(E2A), FMDV(Foot-and-mouth disease virus)의 2A(F2A) 등이 예시될 수 있다. IRES나 2A 펩타이드에 대해 더 구체적인 것은 문헌[Edith Renaud-Gabardos et al., Internal ribosome entry site-based vectors for combined gene therapy, World J Exp Med. 2015 Feb 20; 5(1): 11-20], 문헌[Szymczak et al., Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors, (2005) Expert Opin Biol Ther 5:627-638], 문헌[Kim et al., High Cleavage Efficiency of a 2A Peptide Derived from Porcine Teschovirus-1 in Human Cell Lines, Zebrafish and Mice, (2011) PLosONE 6(4):e18556] 등을 참조할 수 있다.
어댑터를 다중으로 발현하기 위해서, 어댑터 발현 카세트가 모노시스트론 구성을 가질 경우 그러한 어댑터 발현 카세트는 HSV 게놈에 2개 이상 삽입되게 되는데, 이 경우 2개 이상의 어댑터 발현 카세트는 HSV 게놈에서 동일 위치에 연속하여 삽입되거나, 각각 다른 위치에 삽입될 수 있다. 예컨대 HER2를 표적분자를 하는 어댑터 발현 카세트와 EpCAM을 표적분자로 하는 어댑터 발현 카세트가 모두 동일 위치인 UL3과 UL4 유전자 사이에 삽입되거나 또는 서로 다른 위치로서 HER2를 표적분자를 하는 어댑터는 UL3과 UL4 유전자 사이에 삽입되고, EpCAM을 표적분자로 하는 어댑터는 UL26과 UL27 유전자 사이에 삽입될 수 있다. 2개 이상 삽입되는 어댑터 발현 카세트가 동일 위치에 연속하여 삽입될 경우 발현 카세트 사이에는 비암호 영역이 게재될 수 있다. 이러한 비암호 영역은 2개 이상의 발현 카세트가 서로 그 발현(전사 및/또는 번역)에 방해를 받지 않도록 하기 위한 것으로, 이러한 비암호영역은 3~60개 뉴클레오티드로 이루어질 수 있다.
본 발명에서 3종류의 이상의 어댑터를 다중으로 발현할 필요가 있을 때 2종류의 어댑터를 발현할 수 있는 폴리시스트론(polycistron) 구성을 가진 어댑터 발현 카세트와 나머지 어댑터를 발현할 수 있는 모노시스트론(monocistron) 구성을 가진 어댑터 발현 카세트가 함께 HSV의 게놈의 동일 위치나 서로 다른 위치에 삽입될 수 있다.
본 발명의 재조합 HSV에서, 어댑터의 암세포 표적화 영역은 표적세포인 암세포의 표적분자를 특이적으로 인식하여 결합하는 부분으로서, 이러한 암세포 표적화 영역이 인식하는 표적분자는 암세포의 표면에 존재하는 임의의 항원 또는 임의의 수용체이다.
이러한 항원 또는 수용체는 바람직하게는 암세포에서만 발현되거나 정상세포에 비해 암세포에서 과발현되는 항원 또는 수용체를 말한다. 예컨대 교모세포종(glioblastoma)에서 발현되는 EGFRvⅢ(epidermal growth factor receptor variantⅢ), 역형성 갑상선암이나 유방암, 폐암, 신경교종(glioma) 등에 과발현되는 EGFR(Epidermal growth factor receptor), 유두성 갑상선 암(papillary thyroid cancer) 등에서 과발현 메타스틴 수용체(Metastin receptor), 유방암 등에서 과발현되는 ErbB 계열의 수용체 타이로신 카이나제(Receptor tyrosine kinases), 유방암, 방광암, 담낭암(Gallbladder cancers), 담관암(Cholangiocarcinomas), 위식도접합부암(esophagogastric junction cancers) 등에서 과발현되는 HER2(Human epidermal growth factor receptor 2), 육두성 신암종 등에서 과발현되는 타이로신 카이나제-18-수용체(c-Kit), 식도 선암 등에 과발현되는 HGF 수용체 c-Met, 유방암 등에서 과발현되는 CXCR4 또는 CCR7, 전림선암에서 과발현되는 엔도테린-A 수용체, 직장암 등에서 과발현되는 PPAR-δ(peroxisome proliferator activated receptor δ), 난소암 등에서 과발현되는 PDGFR-α(Platelet-derived growth factor receptor α), 간암, 다발성 골수종 등에서 과발현되는 CD133, 폐암, 대장암, 위암, 췌장암, 유방암, 직장암, 결장암, 갑상선 수질암 등에서 과발현되는 CEA(carcinoembryonic antigen), 간암, 위암, 대장암, 췌장암, 유방암 등에서 과발현되는 EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule), 폐암, 유방암, 췌장암, 난소암 등에서 과발현되는 MSLN(Mesothelin), 신경모세포종 등에서 과발현되는 GD2(disialoganglioside), 간세포암 등에서 과발현되는 GPC3(Glypican 3), 전립선암 등에서 과발현되는 PSMA(Prostate Specific Membrane Antigen), 난소암, 유방암, 결장암, 폐암, 췌장암 등에서 과발현되는 TAG-72(tumor-associated glycoprotein 72), 흑색종 등에서 과발현되는 GD3(disialoganglioside), 혈액암, 고형암 등에서 과발현되는 HLA-DR(human leukocyte antigen-DR), 진행성 고형암 등에서 과발현되는 MUC1(Mucin 1), 진행성 폐암(advanced non-small-cell lung cancer) 등에서 과발현되는 NY-ESO-1(New York esophageal squamous cell carcinoma 1), 비인두종양(Nasopharyngeal neoplasms) 등에서 과발현되는 LMP1(Latent membrane protein 1), 폐암, 비호지킨 림프종, 난소암, 결장암, 대장암, 췌장암 등에서 과발현되는 TRAILR2(tumor-necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor), 혈관 신생 인자 수용체인 VEGFR2(vascular endothelial growth factor receptor 2), 간세포암 등에서 과발현되는 HGFR(hepatocyte growth factor receptor) 등이 표적분자일 수 있으며, 또한 암 줄기세포의 표면 항원인 CD44, CD166 등이 또한 표적 분자일 수 있다. 당업계에는 정상세포에 비해 암세포에서 과발현되는 많은 표적분자가 알려져 있으며, 상기 예시된 것 이외의 기타의 표적분자와 관련해서 더 구체적인 것은 문헌[Anne T Collins et al. Prospective Identification of Tumorigenic Prostate Cancer Stem Cells. Cancer Res. 2005 Dec 1;65(23):10946-51], 문헌[Chenwei Li et al. Identification of Pancreatic Cancer Stem Cells. Cancer Res. 2007 Feb 1;67(3):1030-7], 문헌[Shuo Ma et al. Current Progress in CAR-T Cell Therapy for Solid Tumors. Int J Biol Sci. 2019 Sep 7;15(12):2548-2560], 문헌[Dhaval S Sanchala et al. Oncolytic Herpes Simplex Viral Therapy: A Stride Toward Selective Targeting of Cancer Cells. Front Pharmacol. 2017 May 16;8:270] 등을 참조할 수 있다.
특히 본 발명에서 표적분자는 바람직하게는 HER2 또는 EpCAM이다.
본 발명의 재조합 HSV가 어댑터에 의해 표적화하는 표적세포는 본 발명에서의 어댑터의 암세포 표적화 영역이 표적할 수 있는 표적분자를 가지는 임의의 암세포이다. 암세포라면 식도암, 위암, 대장암, 직장암, 구강암, 인두암, 후두암, 폐암, 결장암, 유방암, 자궁 경부암, 자궁 내막체암, 난소암, 전립선암, 고환암, 흑색종, 방광암, 신장암, 간암, 췌장암, 골암, 결합 조직암, 피부암, 뇌암, 갑상선암, 백혈병, 호지킨(Hodgkin) 질환, 림프종, 다발성 골수종, 혈액암 등 암종을 불문한다.
본 발명에서, 어댑터의 세포 표적화 영역은 표적분자와 특이적 결합능을 가지는 완전한 항체 이외에도 항체 유도체, 항체 유사체일 수 있다. 항체 유도체는 표적분자와 특이적 결합능을 가지는 항체 가변 영역을 적어도 하나 이상 포함하는 완전한 항체의 단편 또는 변형 항체을 의미한다. 이러한 항체 유도체로서는 Fab, scFv, Fv, VhH, VH, VL 등의 항체 단편, Fab2, Fab3, 미니바디, 디아바디, 트리바디, 테트라바디, 비스-scFv 등의 다가성 또는 다중특이적 변형 항체 등을 들 수 있다. 항체 유사체는 항체와 마찬가지로 표적분자와 특이적 결합능을 갖지만 구조상 항체와는 다르고 일반적으로 항체보다 낮은 분자량을 갖는 인위적 펩티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 항체 유사체로서 ABD, 애드히론 (adhiron), 애피바디(affibody), 애필린(affilin), 애피머(affimer), 알파바디(alphabody), 안티칼린(anticalin), 아르마딜로(armadillo) 반복 단백질, 센티린 (centyrin), 달핀(DARPin), 피노머(fynomer), Kunitz 영역, 프로넥틴 (pronectin), 리피바디(repebody) 등을 들 수 있다.
이러한 항체, 항체 유도체, 항체 유사체, 그 제조와 관련해서는 당업계에 상당히 많은 문헌이 축적되어 있으며, 그러한 문헌으로서는 예컨대 문헌[Renate Kunert & David Reinhart, Advances in recombinant antibody manufacturing. Appl Microbiol Biotechnol. 2016 Apr;100(8):3451-61], 문헌[Holliger P1, Hudson PJ., Engineered antibody fragments and the rise of single domains, Nat Biotechnol. 2005 Sep;23(9):1126-36], 문헌[Xiaowen Yu et al., Beyond Antibodies as Binding Partners: The Role of Antibody Mimetics in Bioanalysis, Annual Review of Analytical Chemistry, 2017, 10:293-320], 문헌[Abdul Rasheed Baloch et al., Antibody mimetics: promising complementary agents to animal-sourced antibodies, Critical Reviews in Biotechnology, 2016, 36:268-275] 등을 들 수 있다.
본 발명에서, 어댑터의 세포 표적화 영역은 바람직하게는 scFv(Single-chain variable fragment)이다. scFv는 면역글로불린의 중쇄(VH)의 가변 영역과 경쇄(VL)의 가변 영역의 짧은 링커 펩티드를 매개로 연결된 단일사슬항체를 말한다. scFv에서 VH의 C-말단은 VL의 N-말단과 연결되거나, 또는 VL의 C-말단은 VH의 N-말단과 연결된다. scFv에서 링커 펩티드는 중쇄와 경쇄의 고유 3차원 구조를 방해하지 않으면서 이들 중쇄와 경쇄가 공간적으로 인접하여 표적분자와의 특이적인 결합 능력을 가지도록 하는 한, 임의의 길이, 임의의 서열의 링커 펩티드일 수 있다. 바람직하게는 링커는 유연성(flexibility), 용해성(solubility), 단백분해에 대한 저항성 등을 고려할 때, Ser, Gly, Ala, Thr 등의 아미노산 중 한 종류 이상의 아미노산으로 이루어지는 것이 바람직하며, 길이는 1~30개 아미노산, 바람직하게는 3~25개 아미노산, 더 바람직하게는 8~20개 아미노산일 수 있다.
본 발명에서 특히 scFv는 표적분자를 HER2 또는 EpCAM을 표적분자로 하고, HER2에 대한 scFv는 서열번호 4의 VH와 서열번호 5의 VL이 링커 펩티드를 매개로, VH, 링커 펩티드 VL 순서로 연결된 것(즉 VH의 C-말단이 VL의 N-말단과 링커 펩티드를 매개로 연결된 것)이 바람직하고, EpCAM에 대한 scFv는 서열번호 6의 VL와 서열번호 7의 VH이 링커 펩티드를 매개로 VL, 링커 펩티드, VH 순서로 결합된 것(즉 VL의 C-말단이 VH의 N-말단과 링커 펩티드를 매개로 연결된 것)이 바람직하다.
본 발명에서 HVEM의 세포외 도메인은 아래의 실시예에서 사용된, 서열번호 8의 HveA82(리더 서열까지 포함된 HveA82 서열은 서열번호 9에 개시되어 있음) 이외에 한국 등록특허 제10-0937774호 및 미국 등록특허 제8318662호(본 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주된다)가 개시하는 서열번호 10의 HveA87(리더 서열까지 포함된 HveA87 서열은 서열번호 11에 개시되어 있음), 서열번호 12의 HveA102(리더 서열까지 포함된 HveA102 서열은 서열번호 13에 개시되어 있음) 또는 서열번호 14의 HveA107(리더 서열까지 포함된 HveA107 서열은 서열번호 15에 개시되어 있음)일 수도 있다. 서열번호 9, 11, 13 및 15의 서열에 포함된 리더 서열은 HveA의 신호 펩티드 서열이다. HveA87, HveA102, HveA107은 각각 HveA82보다 5, 20, 25개 아미노산을 더 포함하고 있으며, 상기 한국 등록특허 및 미국 등록특허에서 모두 어댑터의 HSV 리셉터로 사용 가능함을 확인한 바 있다.
또 본 발명에서 암세포 표적화 영역과 HVEM의 세포외 도메인 사이에 링커 서열이 게재될 수 있는데, 이 링커 서열은 이들 어댑터의 각 도메인의 기능을 저해 하지 않는 한 임의의 길이, 임의의 서열의 링커일 수 있다. 바람직하게는 링커는 Ser, Gly, Ala, Thr 4가지 아미노산 중 한 종류 이상의 아미노산으로 이루어질 수 있으며, 길이는 1~30개, 아미노산, 바람직하게는 3~25개 아미노산, 더 바람직하게는 8~20개 아미노산일 수 있다.
또 본 발명의 어댑터는 NH2-암세포 표적화 도메인-HVEM 세포외 도메인-COOH 순이거나 그 역순의 구성을 가질 수 있다. 링커 펩티드가 매개될 경우는 NH2-암세포 표적화 영역-링커 펩타이드-HVEM 세포외 도메인-COOH 순이거나 그 역순의 구성일 수 있다.
본 발명의 어댑터는 그 N-말단에, 구체적으로 어댑터의 구성이 NH2-암세포 표적화 영역-링커 펩타이드-HVEM 세포외 도메인-COOH 순일 경우는 암세포 표적화 도메인의 N-말단(scFv가 사용될 경우 VH나 VL의 N-말단)에, 어댑터의 구성이 NH2-HVEM 세포외 도메인-링커 펩타이드-암세포 표적화 도메인-COOH 순일 경우에는 HVEM 세포외 도메인의 N-말단에 리더 서열(즉 분비 유도 신호 서열)이 더 포함될 수 있다. 리더 서열은 세포질에서 발현된 단백질이 세포막을 투과하여 세포 외부로 분비되도록 유도하는 기능을 가진 서열로 통상적으로 약 15 내지 30개의 연속적인 소수성 아미노산 잔기를 포함한다. 사용될 수 있는 리더 서열은 특별한 제한이 없으나 HveA의 리더서열, 항체 가변부 VL(kaapa)의 리더서열, t-PA(tissue plasminogen activator)의 리더 서열, 혈청 알부민의 리더 서열, 락토페린의 리더 서열, α- 카제인의 리더 서열, 인간성장호르몬을 포함한 여러 호르몬의 리더 서열, 효모나 세균에서 분비되는 폴리펩티드의 리더 서열 등 세포막 외부로 분비되는 단백질의 N-말단에 존재하는 임의의 서열일 수 있다.
이러한 리더 서열은 표적세포에서 어댑터가 발현되어 세포 밖으로 어댑터가 유출되도록 유도하는 작용을 하는 서열로, 표적세포가 용해되어 HSV 바이러스가 방출된 후에야 어댑터가 HSV 바이러스를 인접 표적세포로 감염되도록 유도하는 작용을 하기 때문에 생략될 수도 있다.
또 본 발명에서 세포 표적화 영역으로 표적분자에 대한 scFv을 사용할 경우, VH와 VL 사이에, VH와 VL 사이에 링커 펩타이드가 매개될 경우는 VH 또는 VL와 링커 펩타이드 사이, scFv와 HVEM 사이, scFv와 HVEM 사이에 링커 펩타이드가 매개될 경우에는 scFv와 링커 사이, 링커와 HVEM 사이에, 클로닝을 용이하게 하기 위하여 임의의 제한효소 작용 부위에 해당하는 아미노산이 게재될 수 있다. 예컨대 제한효소 EcoRI가 작용하는 EF(염기서열: GAATTC), BamHI이 작용하는 GS((염기서열: GGATCC), XhoI이 작용하는 LEEL(염기서열: CTCGAGGAGCTC) 등이 게재될 수 있다.
본 발명에서, 재조합 HSV는 암세포에 대한 면역반응을 유도 또는 증진시키기 위한 인자들을 단독으로 또는 임의의 조합으로 발현하도록 해당 인자에 대한 유전자가 HSV 게놈에 삽입될 수 있다. 그러한 인자들은 사이토카인, 케모카인, 면역관문(immune checkpoint)에 대한 길항제(예컨대 항체, 항체 유도체 또는 항체 유사체, 특히 scFv), 면역세포(T 세포 또는 NK 세포)의 활성화를 유도할 수 있는 보조 자극 인자(co-stimulatory factor), 암세포에 대한 면역반응을 억제하는 TGFβ의 기능을 저해할 수 있는 길항제(예컨대 항체, 항체 유도체 또는 항체 유사체, 특히 scFv), 고형암 종양미세환경을 구성하는 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(heparan sulfate proteoglycan)을 분해할 수 있는 헤파라나아제(heparanase), 혈관 신생 인자 수용체인 VEGFR-2(VEGF receptor-2)의 기능을 저해할 수 있는 길항제(예컨대 항체, 항체 유도체 또는 항체 유사체, 특히 scFv) 등을 발현하도록 조작될 수 있다.
사이토카인은 예컨대 IL-2, IL-4, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, IL-24 등의 인터류킨, IFNα, IFNβ, IFNγ 등의 인터페론, TNFα 등의 종양 괴사 인자, GM-CSF, G-CSF, FLT3L 등의 콜로니 자극 인자 등이 단독으로 또는 2 이상의 임의의 조합으로 재조합 HSV에서 발현되도록 사용될 수 있다.
케모카인은 예컨대 CCL2(C-C Motif Chemokine Ligand 2), CCL5(RANTES), CCL7, CCL9, CCL10, CCL12, CCL15, CCL19, CCL21, CCL20, XCL-1( (X-C Motif Chemokine Ligand 1)) 등이 단독으로 또는 조합함으로 재조합 HSV에서 발현되도록 사용될 수 있다.
면역관문에 대한 항체는 PD-1(programmed cell death-1), PD-L1(programmed cell deathligand 1), PD-L2(programmed cell death-ligand 2), CD27(cluster of differentiation 27), CD28(cluster of differentiation 28), CD70(cluster of differentiation 70), CD80(cluster of differentiation 80), CD86(cluster of differentiation 86), CD137(cluster of differentiation 137), CD276(cluster of differentiation 276), KIRs(killer-cell immunoglobulin-like receptors), LAG3(lymphocyte-activation gene 3), GITR(glucocorticoid-induced TNFR-related protein), GITRL(glucocorticoid-induced TNFR-related protein ligand), CTLA-4(cytolytic T lymphocyte associated antign-4) 등에 대한 길항제가 단독으로 또는 조합으로 재조합 HSV에서 발현되도록 사용될 수 있다.
보조 자극 인자는 CD2, CD7, LIGHT, NKG2C,CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, LFA-1(림프구 기능 연관 항원-1), ICOS(유도성 T 세포 공동자극인자), CD3γ, CD3δ, CD3ε 등이 단독으로 또는 조합으로 재조합 HSV에서 발현되도록 사용될 수 있다.
본 발명에서, 재조합 HSV는 프로드럭(prodrug)을 암세포에 독성을 나타내는 약물(drug)으로 전환시켜주는 프로드럭 활성화 효소(prodrug-activating enzymes)를 발현하도록 조작될 수 있다. 이러한 프로드럭 활성화 효소로서는, 프로드럭인 5-FC(5-fluorocytosine)을 5-FU(5-fluorouracil)인 약물로 전환시켜 주는 시토신 디아민나아제(Cytosine deaminase), 프로드럭인 CPA(cyclophosphamide)를 PM( phosphoramide mustard)인 약물로 전환시키주는 랫드 사이토크롬 P450(rat cytochrome P450, CYP2B1), 프로드럭인 이리노테칸(irinotecan, SN-38150)을 SN-38인 약물로 전환시켜주는 카르복실에스터라제(carboxylesterase), 프로드럭인 BC1954를 DNA 교차결합제인 4-하이드록시아민151(4-hydroxylamine151)로 전환시켜주는 세균 니트로리덕타아제(bacterial nitroreductase), 프로드럭인 6-메틸퓨린-2'-디옥시리보시드(6-methypurine-2'-deoxyriboside)를 6-메틸퓨린(6-methylpurine)으로 전환시켜주는 대장균에서 분리된 PNP(purine nucleoside phosphorylase) 등을 들 수 있다.
또한 본 발명에서, 재조합 HSV는 TRAIL(TNF-Related Apoptosis Inducing Ligand)를 발현하도록 조작될 수도 있다. TRAIL는 암세포에서 과발현되는 그것의 수용체에 결합하여 암세포의 사멸을 유도한다고 알려져 있다(Kaoru Tamura et al. Multimechanistic Tumor Targeted Oncolytic Virus Overcomes Resistance in Brain Tumors. Mol Ther. 2013 Jan;21(1):68-77).
이러한 면역반응을 유도 또는 증진시키기 위한 인자들이나 프로드럭 활성화 효소의 사용과 관련해서 더 구체적인 것은 문헌[Michele Ardolino et al., Cytokine treatment in cancer immunotherapy, J. Oncotarget, Oncotarget. 2015 Aug 14;6(23):], 문헌Bernhard Homey et al. Chemokines: Agents for the Immunotherapy of Cancer. Nat Rev Immunol. 2002 Mar;2(3):175-84], 문헌[Marianela Candolfi et al, Evaluation of proapototic transgenes to use in combination with Flt3L in an immune-stimulatory gene therapy approach for Glioblastoma multiforme(GBM), J. FASEB J, 2008, 22:107713], 문헌[Danny N Khalil et al. The Future of Cancer Treatment: Immunomodulation, CARs and Combination Immunotherapy. Nat Rev Clin Oncol. 2016 May;13(5):273-90], 문헌[Paul E Hughes et al. Targeted Therapy and Checkpoint Immunotherapy Combinations for the Treatment of Cancer. Trends Immunol. 2016 Jul;37(7):462-476], 문헌[Cole Peters1, Samuel D Rabkin, Designing herpes viruses as oncolytics, Mol Ther Oncolytics. 2015;2:15010] 등을 참조할 수 있다.
본 발명에서, 면역반응을 유도 또는 증진시키기 위한 인자들이나 프로드럭 활성화 효소는 전술한 바의 어텝터에서와 같이, 그 유전자의 발현 카세트(즉 그 유전자가 이의 발현을 가능하게 하는 프로모터 서열 및 폴리아데닐화 시그널 서열과 작동가능하게 연결된 구성체)가 HSV의 증식을 저해하지 않으면서 HSV 게놈에 삽입되는데, 그러한 삽입은 HSV 게놈의 결실 없이, 또는 HSV 게놈 중 비필수 유전자가 일부 또는 전부 결실되고 그 결실된 위치에 삽입될 수 있다. 이때 HSV 게놈의 결실 없이 삽입될 경우 각 유전자 사이에 삽입될 수 있으며 바람직한 삽입 위치는 예컨대 UL3과 UL4 유전자 사이, UL26과 UL27 유전자 사이, UL37과 UL38 유전자 사이, UL48과 UL49 유전자 사이, UL53과 UL54 유전자 사이, US1과 US2 사이 등을 들 수 있다. 비필수 유전자가 결실되고 그 결실된 위치에 삽입되거나 비필수 유전자의 결실 없이 그 유전자 중에 삽입될 경우, 그러한 비필수 유전자는 전술한 바의 임의의 비필수 유전자 중에서 선택될 수 있다.
다른 측면에 있어서 본 발명은 전술한 바의 재조합 HSV를 유효성분으로 포함하는 항암용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 재조합 HSV이 발현하는 어댑터의 표적화 영역이 표적하는 표적분자를 발현하는 암종에 대해 항암 용도를 갖는다. 그러한 암종은 앞서 표적분자와 관련하여 설명한 바와 같다.
특히 본 발명의 조성물은 HER2나 EpCAM을 발현하는 종양세포를 갖는 암종에 대해 항암 용도를 갖는 것이 바람직하다. 예컨대 HER2를 발현하는 종양세포는 유방암 세포, 난소암 세포, 위암 세포, 폐암 세포, 두경부암 세포, 골육종 세포, 다형성 신경교모종 세포(glioblastoma multiforme), 침샘 종양(salivary gland tumor) 세포 등을 들 수 있다. 또 예컨대 EpCAM을 발현하는 종양세포는 간암 세포, 전립선암 세포, 유방암 세포, 대장암 세포, 폐암 세포, 담낭암 세포, 췌장암 세포, 위암 세포 등을 들 수 있다.
본 발명에서 항암은 암세포의 사멸, 암세포의 생존능 저하, 암세포의 증식 억제에 따른 암이 가지는 병리적 증상의 억제나 지연, 그러한 병리적 증상의 발병 억제나 지연, 암 전이 억제, 암 재발 억제를 포함하는 의미이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분인 전술한 바의 재조합 HSV 이외에, 재조합 어댑터 분자를 추가로 포함할 수 있다. 재조합 어댑터 분자는 전술한 바의 재조합 HSV가 발현하는 어댑터 즉 암세포 표적화 영역과 HVEM의 세포외 도메인의 융합 단백질과 동일하게 암세포 표적화 영역을 가지는 융합 단백질이 재조합 방법으로 제조된 것을 말한다. 여기서 재조합 HSV가 발현하는 어댑터와 동일하게 암세포 표적화 영역을 가진다는 것은 HSV가 발현하는 어댑터의 암세포 표적화 영역이 HER2를 표적 분자로 하는 경우, 어댑터 분자의 암세포 표적화 영역도 HER2를 표적 분자로 한다는 것을 의미한다. 재조합 방법에 의해 의도하는 목적 단백질의 제조 방법은 일반적으로 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현벡터를 제조하여, 대장균, 효모, 동물세포(CHO 세포, NSO 세포, BHK 세포, Sp2 세포, HEK-293 세포) 등 숙주세포에 형질전환시키고 배양한 후 목적 단백질을 분리하는 단계 등으로 이루어지는데, 이러한 재조합 방법에 의한 목적 단백질의 제조 방법은 당업계에 매우 잘 공지되어 있으며(Sambrook et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001)), 특히 본 발명에 사용되는 재조합 어댑터 분자의 제조와 관련해서는 한국 등록특허 제10-0937774호 및 미국 등록특허 제8318662호를 참조할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물에 이러한 재조합 어댑터 분자를 추가로 포함될 경우, 본 발명의 유효성분인 재조합 HSV과 재조합 어댑터 분자가 함께 환자에 투여될 경우 재조합 HSV의 암세포 초기 감염 효율이 증가되는 효과가 있다.
또 본 발명의 약제학적 조성물은 허가된 항암제와 병용 또는 혼합되어 사용될 수 있다. 그러한 항암제로는 대사 길항제, 알킬화제, 토포아이소머라제 길항제, 미세소관 길항제, 식물유래 알칼로이드 등 암세포에 세포독성을 나타내는 임의의 항암제, 임의의 사이토카인 의약품, 임의의 항체 의약품, 임의의 면역관문 억제제 의약품, 임의의 세포 치료제(car-T cell therarpy, car-NK cell therapy) 의약품 등을 포함한다. 구체적으로 탁솔, 나이트로젠 머스타드, 이마티닙, 옥살리플라틴, 제피티닙, 보르테조밉, 수니티닙, 카보플라틴, 시스플라틴, 리툭시맙, 엘로티닙, 소라페닙, IL-2 의약품, INF-α 의약품, INF-γ 의약품, 트라스투주맙, 블리나투모맙, 이필리무맙, 펩브롤리주맙, 니볼리주맙, 아테졸리주맙(Atezolizumab), 두발루맙(Durvalumab), 베바시주맙, 세툭시맙, 티사젠렉루셀(Tisagenlecleucel, 킴리아), 액시캡타젠 실로루셀(Tisagenlecleucel Axicabtagene Ciloleucel, 예스카타) 등이 예시될 수 있으며, 이들 예시된 항암제 이외에도 당업계에 공지된 여타의 항암제도 제한없이 본 발명의 약제학적 조성물과 혼합되어 사용되거나 병용 사용될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하여 투여 경로에 따라 당업계에 공지된 통상의 방법으로 경구용 제형 또는 비경구용 제형으로 제조될 수 있다.
그러한 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제는 인체에 특별한 독성을 가지지 않으면서 약물의 활성이나 특성을 저해하지 않는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물(예를 들면, 식염수 및 멸균수), 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일, 링거액, 완충제, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 덱스트란, 알부민, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 특히 본 발명의 약제학적 조성물이 액상 용액으로 제제화될 경우 적합한 담체 또는 부형제로서는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등의 성분 중에서 하나 이상의 성분을 단독 또는 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 의약품 첨가제 등을 첨가하여 사용할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물이 경구 투여제로 제제될 경우는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있고, 비경구 투여제 특히 주사제로 제제화 경우 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 서방형 제제 등의 형태로도 제조화할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위 투여형의 제제 형태로 제형화시켜 당업계에서 통상적으로 사용하는 투여 방법을 이용하여 경구 투여 경로나, 또는 피부, 병변 내(intralesional), 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 수막강 내, 심실 내, 폐, 경피, 피하, 복 내, 비강 내, 소화관 내, 국소, 설하, 질 내, 직장 경로 등 비경구 투여 경로에 의하여 투여될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 투여량(유효량)은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 결정할 수 있다. 바람직한 양태에 있어 본 발명의 약제학적 조성물은 단위 용량 형태의 주사제로 제조되며, 단위 용량 형태의 주사제로 제조될 경우 본 발명의 약제학적 조성물의 단위 용량 당 포함되는 재조합 HSV 바이러스의 양은 102-1014 pfu 범위, 특히 104-1011 pfu 범위일 수 있다.
다른 양태에 있어서, 본 발명은 전술한 바의 재조합 HSV를 포함하는 약제학적 조성물을 유효량으로 환자 등의 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 또는 예방 방법(즉 종양 치료 또는 예방 방법)에 관한 것이다.
이러한 암 치료 방법은 재조합 HSV가 그 어댑터의 암세포 표적화 영역이 표적하는 표적분자를 가진 암세포를 용해하여 사멸시킴으로써 가능해진다. 따라서 본 발명의 치료 방법은 그러한 표적분자를 가진 임의의 암종에 대해서 적용이 가능하다. 특히 본 발명의 치료 방법은 HER2나 EpCAM을 발현하는 암종에 적용되는 것이 바람직하다.
본 발명의 치료 방법은 상기 다른 암 치료법과 제한없이 병용되어 사용될 수 있다. 예컨대 앞서 예시된 세포독성 항암제, 사이토카인 의약품, 항체 의약품, 면역관문 억제제 의약품, 세포 치료제(car-T cell therarpy, car-NK cell therapy) 의약품, 방사선 치료 요법, 수술 요법 등이 본 발명의 약제학적 조성물의 투여 전·후나 동시 투여 방식으로 병용 사용될 수 있다.
본 발명의 치료 방법에서 유효량은 그 적용 대상인 환자 등에 의료 전문가 등의 제언에 의한 투여 기간 동안 본 발명의 약제학적 조성물이 투여될 때, 암 치료 또는 예방 효과 등 의도한 의학적 효과를 나타낼 수 있는, 본 발명의 약제학적 조성물이 투여되는 양을 말한다. 이러한 유효량은 전술한 바와 같이 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태 등에 따라 의료 전문가 등 당업자가 적절히 결정할 수 있다.
본 발명의 치료 방법에서, 그 약제학적 조성물은 바람직하게는 환자 등에 주사제로, 비경구 투여 경로에 의하여 예컨대 병변 내(intralesional, 종양 내), 정맥 내, 근육 내, 동맥 내 등에 투여될 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 암세포 표적화 영역과 HVEM의 세포외 도메인의 융합 단백질인 어댑터를 다중으로 발현함으로써 다중 표적화가 가능한 재조합 HSV를 제공할 수 있고, 또 암세포 표적화 영역과 HVEM의 세포외 도메인의 융합 단백질인 어댑터를 발현할 수 있는 이외에 또 재표적화가 가능하도록 변형된 당단백질을 가짐으로써 다중 표적화가 가능한 재조합 HSV를 제공할 수 있다.
또 본 발명에 따르면 상기 다중 표적화가 가능한 재조합 HSV를 유효성분으로 포함하는 항암 치료 또는 예방용 약제학적 조성물과 이러한 약제학적 조성물을 유효량으로 환자 등 대상체에 투여하는 암 예방 또는 치료 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 다중 표적화가 가능한 재조합 HSV는 단일 표적화 HSV에 비해 암세포에서 대해 높은 감염 효율과 높은 사멸 기능을 가진다.
도 1은 KOS-37 BAC 게놈 구조의 개요도이다.
도 2는 HVEM-제한 HSV-1 바이러스의 게놈 구조의 개요도이다.
도 3은 EmGFP를 발현하는 HVEM-제한 HSV-1 바이러스의 게놈 구조의 개요도이다.
도 4는 EmGFP를 발현하는 HVEM-제한 HSV-1 바이러스의 형광 발현 및 HVEM 수용체를 가진 세포에의 특이점 감염을 보여주는 결과이다.
도 5는 HER2 표적화 어댑터를 발현하는 HSV-1 바이러스, EpCAM 표적화 어댑터를 발현하는 HSV-1 바이러스 그리고 HER2 및 EpCAM 이중(dual) 표적화 어댑터를 발현하는 HSV-1 바이러스의 게놈 구조의 개요도이다.
도 6은 HER2scFv-HveA 어댑터와 EpCAMscFv-HveA 어댑터의 전체 서열과 해당 서열의 구성을 도시한 것이다.
도 7는 (i) HER2 표적화 변형된 당단백질 gH를 갖는 단일 표적화 바이러스와 (ii) HER2 표적화 변형된 당단백질 gH를 갖고 또 HER2 표적화 어댑터를 발현하는 HER2 이중 표적화 HSV-1 바이러스의 게놈 구조의 개요도이다.
도 8은 gH에 삽입·융합된 HER2scFv 리간드의 전체 아미노산 서열과 해당 서열의 구성을 도시한 것이다.
도 9는 (i) EpCAM 표적화 변형된 당단백질 gH를 갖는 단일 표적화 바이러스와 (ii) EpCAM 표적화 변형된 당단백질 gH를 갖고 또 EpCAM 표적화 어댑터를 발현하는 EpCAM 이중 표적화 HSV-1 바이러스의 게놈 구조의 개요도이다.
도 10은 gH에 삽입·융합된 EpCAMscFv 리간드의 전체 아미노산 서열과 해당 서열의 구성을 도시한 것이다.
도 11은 Vero-HVEM 세포와 SK-OV-3 세포에서, 형광단백질 EmGFP을 발현하고 세포 수용체로서 HVEM만을 사용하여 진입하는 바이러스(gDm), HER2scFv-HveA 어댑터를 발현하는 바이러스(HADa-S), gH에 HER2scFv를 리간드 갖는 바이러스(HgH-S), gH에 HER2scFv를 리간드 갖고 HER2scFv-HveA 어댑터를 발현하는 이중 표적화 바이러스(HADa-HgH-D)의 확산을 측정한 결과이다.
도 12는 Vero-HVEM 세포에서, 형광단백질 EmGFP을 발현하고 세포 수용체로서 HVEM만을 사용하여 진입하는 바이러스(gDm), HER2scFv-HveA 어댑터를 발현하는 바이러스(HADa-S), gH에 HER2scFv를 리간드 갖는 바이러스(HgH-S), gH에 HER2scFv를 리간드 갖고 HER2scFv-HveA 어댑터를 발현하는 이중 표적화 바이러스(HADa-HgH-D)의 증폭을 측정한 결과이다.
도 13은 Vero-HVEM 세포와 SK-OV-3 세포에서, 형광단백질 EmGFP을 발현하고 세포 수용체로서 HVEM만을 사용하여 진입하는 바이러스(gDm), HER2scFv-HveA 어댑터를 발현하는 바이러스(HADa-S), gH에 HER2scFv를 리간드 갖는 바이러스(HgH-S), gH에 HER2scFv를 리간드 갖고 HER2scFv-HveA 어댑터를 발현하는 이중 표적화 바이러스(HADa-HgH-D)의 HER2scFv-HveA 어댑터 발현 정도를 측정한 결과이다.
도 14는 형광단백질 EmGFP을 발현하고 세포 수용체로서 HVEM만을 사용하여 진입하는 바이러스(gDm), HER2scFv-HveA 어댑터를 발현하는 바이러스(HADa-S), gH에 HER2scFv를 리간드 갖는 바이러스(HgH-S), gH에 HER2scFv를 리간드 갖고 HER2scFv-HveA 어댑터를 발현하는 이중 표적화 바이러스(HADa-HgH-D)가 SK-OV-3 세포 등에서 HER2 발현 여부에 따른 특이적 감염을 보여주는 결과이다.
도 15는 형광단백질 EmGFP을 발현하고 세포 수용체로서 HVEM만을 사용하여 진입하는 바이러스(gDm), HER2scFv-HveA 어댑터를 발현하는 바이러스(HADa-S), gH에 HER2scFv를 리간드 갖는 바이러스(HgH-S), gH에 HER2scFv를 리간드 갖고 HER2scFv-HveA 어댑터를 발현하는 이중 표적화 바이러스(HADa-HgH-D)가 SK-OV-3 세포 등에서 HER2 발현 여부에 따른 특이적 세포 사멸을 보여주는 결과이다.
도 16은 동물실험에서 gH에 HER2scFv를 리간드 갖고 HER2scFv-HveA 어댑터를 발현하는 이중 표적화 바이러스(HADa-HgH-D)에 의한 종양 억제를 나타낸 결과이다.
도 17은 형광단백질 EmGFP을 발현하고 세포 수용체로서 HVEM만을 사용하여 진입하는 바이러스(gDm), EpCAMscFv-HveA 어댑터를 발현하는 바이러스(EADa-S), gH에 EpCAMscFv를 리간드 갖는 바이러스(EgH-S), gH에 EpCAMscFv를 리간드 갖고 EpCAMscFv-HveA 어댑터를 발현하는 이중 표적화 바이러스(EADa-EgH-D)가 BT-474 세포 등에서 EpCAM 발현 여부에 따른 특이적 감염을 보여주는 결과이다.
도 18은 형광단백질 EmGFP을 발현하고 세포 수용체로서 HVEM만을 사용하여 진입하는 바이러스(gDm), EpCAMscFv-HveA 어댑터를 발현하는 바이러스(EADa-S), gH에 EpCAMscFv를 리간드 갖는 바이러스(EgH-S), gH에 EpCAMscFv를 리간드 갖고 EpCAMscFv-HveA 어댑터를 발현하는 이중 표적화 바이러스(EADa-EgH-D)가 BT-474 세포 등에서 EpCAM 발현 여부에 따른 특이적 세포 사멸을 보여주는 결과이다.
도 19는 HER2 표적화 변형된 당단백질 gH를 갖고 EpCAM 표적화 어댑터를 발현하는 이중(dual) 표적화 HSV-1 바이러스(EADa-HgH-D)의 게놈 구조의 개요도이다.
도 20은 HER2 표적화 변형된 당단백질 gH를 갖고 EpCAM 표적화 어댑터를 발현하는 이중(dual) 표적화 HSV-1 바이러스(EADa-HgH-D)가 CHO-K1 세포 등에서 HER2와 EpCAM 발현 여부에 따라 이중 표적화가 가능함을 보여주는 결과이다. .
도 21은 HER2 및 EpCAM 이중(dual) 표적화 어댑터를 발현하는 HSV-1 바이러스(EADa-HADa-D)가 CHO-K1 세포 등에서 HER2와 EpCAM 발현 여부에 따라 이중 표적화가 가능함을 보여주는 결과이다.
이하 본 발명을 실시예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> HVEM 제한 HSV-1(HVEM-restricted HSV-1) 바이러스 제작
HSV-1 유전자는 약 152kb에 달하는 커다란 유전자로 구성이 되어 있어, 외래 유전자를 삽입하거나 특정 위치에서의 변이를 삽입하기 위해서 KOS-37/BAC(Genbank Accession No. MF156583)(Gierasch WW et al. J. Virol Methods. 2006. 135:197~206)을 사용하였다. HSV-1 KOS 스트레인(HSV-1 KOS strain)은 그 특성이 잘 알려져 있고, 유전자의 기능 및 병인 조사에 유용하여 실험실에서 주로 사용되는 HSV-1 스트레인의 일종이다(Smith KO. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1964. 115:814-816). KOS 게놈에 BAC 플라스미드 삽입을 통해서 제작된 KOS-37/BAC은 DH10B 박테리아(Invitrogen)에 형질 전환(transformation)을 통해 박테리아 수준에서 클로닝을 가능케 한다(Gierasch WW et al.; J. Virol Methods. 2006. 135:197~206). KOS-37/BAC는 HSV-1 KOS 게놈의 UL37과 UL38 사이의 위치에 BAC(bacterial artificial chromosomes)가 양쪽에 LoxP 사이트와 함께 삽입되어 있다. 차후 Cre-Lox system을 이용하여 BAC 유전자를 제거할 수 있게 제작됐다. 그 개요도를 도 1에 나타내었다.
HVEM 세포 수용체를 통해서만 세포 진입하는 HVEM 제한 HSV-1 제작하기 위하여, HSV-1 gD 아미노산 서열(GenBank Accession No. ASM47818, 서열번호 16)의 222번 위치의 아르기닌(arginine, R)과 223번 위치의 페닐알라닌(phenylalanime, F)을 각각 아스파라긴(asparagine, N)과 이소루신(isoleucine, I)로 치환한 gD-R222N/F223I HSV-1 바이러스를 제작하였다.
이러한 돌연변이에 의해 만들어진 gD-R222N/F223I HSV-1 바이러스는 세포 감염 수용체(entry receptor)로 넥틴-1(nectin-1)을 사용하지 못하고 오직 HVEM(HveA)을 통해서만 숙주세포 내로 감염이 가능하기 때문에(Uchida H et al., J Virol. 2009. 83(7):2951-2961), 넥틴-1(nectin-1) 수용체를 가진 정상세포를 감염시키지 못하여 안전성에 있어서도 유리하다.
HVEM 제한 KOS-gD-R222N/F223I 바이러스의 게놈 구조의 개요도를 도 2에 나타내었다.
KOS-gD-R222N/F223I HSV-1 바이러스를 제작을 위하여, 카운터 셀렉션 BAC 변형 키트(Counter selection BAC modification kit; GeneBridges, Inc.)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 KOS-37/BAC의 gD 부분에 R222N/F223I 돌연변이를 도입하였다.
구체적으로 KOS-37/BAC이 들어있는 E.coli 클론에, 상동 재조합(homologous recombination) 기능을 수행할 수 있는 RecE와 RecT를 발현할 수 있는 pRed/ET 플라스미드를 형질 전환하였다(Muyrers JP et al.; Nucleic Acids Res. 1999. 27(6):1555-1557). gD에 돌연변이를 도입하고자 하는 위치를 포함하는 상동 영역의 프라이머(homologous region primer) 세트(정방향 프라이머 gD-rpsL For: 서열번호 17, 역방향 프라이머 gD-rpsL Rev: 서열번호 18)를 사용하여 gD-rpsL-neo/kan 카세트(cassette)를 제작하였다. gD-rpsL-neo/kan 카세트는 삽입할 위치의 gD 상동 영역과 스트렙토마이신(streptomycin)에 민감성을 갖게 하는 선별마커(selective marker)인 rpsL 유전자와 카나마이신(kanamycin) 저항성을 갖게 하는 neo/kan 유전자로 구성되게 된다. gD-rpsL-neo/kan 카세트가 삽입되면, rpsL 유전자에 의하여 스트렙토마이신 항생제에 민감하게 되고, neo/kan 유전자에 의하여 카나마이신 저항성을 갖는 E.coli가 만들어지게 된다. KOS-37/BAC과 pRed/ET가 들어있는 E.coli 클론에 L-아라비노오스(L-arabinose; Sigma-Aldrich)를 첨가하여 pRed/ET의 기능을 활성화시켜 상동 재조합이 가능하도록 RecE와 RecT의 발현을 유도한 후(Muyrers JP et al.; Nucleic Acids Res. 1999. 27(6):1555-1557), 제작한 gD-rpsL-neo/kan 카세트 200 ng을 형질전환(transformation)하였다. 상동 재조합에 의하여 gD-rpsL-neo/kan 카세트가 KOS-37/BAC의 gD 위치에 삽입되게 된다. KOS-37/BAC에 gD-rpsL-neo/kan가 삽입된 E.coli는 카나마이신 저항성을 갖고 있지만, 스트렙토마이신 저항성은 rpsL 유전자 때문에 차단된 상태이다. 카나마이신 배지에서 선별된 E.coli는 gD-rpsL-neo/kan가 삽입되었다고 판단하여, 최종적인 유전자를 삽입하는 단계로 진행하였다. KOS 37-BAC gD-rpsL-neo/kan 클론이 있는 E.coli에 L-아라비노오스(L-arabinose; Sigma-Aldrich)를 첨가하여 pRed/ET의 기능을 활성화시켜 상동 재조합이 가능하도록 RecE와 RecT의 발현을 유도한 후, gD에서 222번 위치의 R 및 223번 위치의 F에서 각각 N 및 I를 치환해 준 올리고뉴클레오티드인 R222N_F223I_mutant(서열번호 19)을 100 pmol을 넣고 형질 전환하였다. 기존 gD-rpsL-neo/kan 카세트와 삽입된 올리고뉴클레오티드가 교체되면서 rpsL에 의해 차단된 스트렙토마이신 저항성이 활성화되는 원리를 이용하여 후보군을 스트렙토마이신 배지에서 선별하였다(Heermann R et al., Microb Cell Fact. 2008. 14:. doi: 10.1186). 선별된 후보군은 DNA prep 방법을 이용하여 DNA 분리를 하였고(Horsburgh BC et al., Methods enzymol. 1999. 306:337-352), gD에서 222번 위치 및 223번 위치에서 각각 N 및 I가 도입 여부를 PCR (ploymerase chain recation)과 DNA 시퀀싱으로 확인하였다.
다음 바이러스 제작은 상기 완성된 KOS-37/BAC-gD-R222N/F223I DNA를 라지 컨스트럭트 DNA 분리 키트(Large construct DNA purification kit, Macherey-Nagel)를 이용하여 추출한 후 2×105의 Cre-Vero-HVEM 세포에 리포펙타민 2000 시약(Lipofectamine 2000 reagent, Invitrogen)을 이용하여 DNA 1 ug을 형질주입(transfection)하였다. DMEM 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium(Welgene)에 100 U/ml 페니실린(penicillin)/100 μg/ml 스트렙토마이신 (Welgene)와 10% FBS(fetal bovine serum, Wellgen)를 이용하여 세포 배양을 하였다. 상기 Cre-Vero-HVEM 세포주는 Cre-Vero 세포주(Gierasch et al.; J. Virol Methods. 2006. 135:197~206)에 HVEM 유전자를 삽입시켜 HVEM 단백질 발현을 유도한 세포주이다. Cre-Vero-HVEM을 사용한 이유는 세포의 Cre 재조합 효소(recombinase)를 이용하여 KOS-37/BAC-gD-R222N/F223I의 BAC 유전자를 제거할 수 있으며, HVEM 과발현에 의한 KOS-gD-R222N/F223I 바이러스의 감염이 효과적이어서 차후 바이러스 대량생산이 용이하기 때문이다. 유전자 도입 3~4일 경과 후, 플라크 (plaque)의 형성을 확인한 다음 바이러스가 포함된 세포를 걷어서 3회의 freeze-thaw 방법(Gierasch WW et al.; J. Virol Methods. 2006. 135:197~206)과 초음파 파쇄(sonication)을 통해 최종적으로 KOS-gD-R222N/F223I 바이러스를 획득하였다.
<실시예 2> EmGFP를 발현하는 HVEM-제한 HSV-1 바이러스 제작
EmGFP를 발현하는 HVEM-제한 HSV-1 제작을 위하여 상기 실시예 1에서 제작된 KOS-37/BAC-gD-R222N/F223I DNA의 UL26/UL27 위치에, EmGFP(Emerald Green Fluorescent Protein)를 발현할 수 있는 발현 카세트(expression cassette)를 삽입하였다(Tiffany A et al., J Virol Methods. 2015. 231:18-25). 이는 마커로서 EmGFP를 이용하여 바이러스의 생산과 감염 정도의 관찰을 용이하게 하기 위한 것이다. EmGFP 카세트 제작에는 pCDNA6.2-GW/EmGFP-miR 플라스미드(Invitrogen)를 이용하였다.
EmGFP를 발현하는 KOS-EmGFP-gD-R222N/F223I의 지놈 개요도는 도 3에 나타내었다.
EmGFP 발현을 위하여 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus)의 유전자 프로모터인 pCMV와 HSV TK(Herpes simplex virus thymidine kinase)의 폴리아데닐레이션 시그널(polyadenylation signal)인 tkpA를 이용하여 pCMV-EmGFP-tkpA의 구조로 KOS-37/BAC-gD-R222N/F223I DNA에 삽입하였다.
모든 삽입 방법은 상기 실시예 1에서 같이 카운터 셀렉션 BAC 변형 키트(counter selection BAC modification kit; GeneBridges. Inc)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 진행하였다.
구체적으로 KOS-37/BAC-gD-R222N/F223I이 들어있는 클론에 상동 재조합(homologous recombination) 기능을 수행할 수 있는 RecE와 RecT를 발현할 수 있는 pRed/ET 플라스미드를 형질 전환하였다(Muyrers JP et al.; Nucleic Acids Res. 1999. 27(6):1555-1557). UL26와 UL27 사이에 타겟 유전자를 도입하고자 하는 위치를 포함하는 상동 영역의 프라이머(homologous region primer) 세트(정방향 프라이머 UL26/27-rpsL_For: 서열번호 20, 역방향 프라이머 UL26/27-rpsL_Rev: 서열번호 21)를 사용하여 UL26/27-rpsL-neo/kan 카세트(cassette)를 제작하였다. KOS-37/BAC-gD-R222N/F223I DNA와 pRed/ET가 들어있는 클론에 L-아라비노오스(L-arabinose; Sigma-Aldrich)를 첨가하여 상동 재조합(homologous recombination)이 가능하도록 유도한 후, 제작한 UL26/27-rpsL-neo/kan 카세트 200 ng을 형질 전환하였다. 이러한 상동 재조합에 의하여 UL26/27-rpsL-neo/kan 카세트가 KOS-37/BAC의 UL26/27 위치에 삽입되게 된다. UL26/27-rpsL-neo/kan가 삽입된 E.coli는 카나마이신 저항성을 갖고 있지만, 스트렙토마이신 저항성은 rpsL 유전자로 인해 차단된 상태이다. 카나마이신 배지에서 선별된 E.coli는 UL26/27-rpsL-neo/kan가 삽입되었다고 판단하여, 마지막 단계인 타겟 유전자를 삽입하는 단계로 진행하였다.
UL26/27-rpsL-neo/kan 카세트가 있는 E.coli에 pRed/ET의 기능을 활성화시키는 L-아라비노오스(L-arabinose; Sigma-Aldrich)를 첨가하여 상동 재조합(homologous recombination)이 가능하도록 유도하고, 그 다음 UL26/27-tkpA-EmGFP-pCMV 카세트 200 ng을 형질 전환하였다. UL26/27-tkpA-EmGFP-pCMV 카세트는 pCDNA6.2-GW/EmGFP-miR 플라스미드(Invitrogen)를 주형(Template)으로 사용하고 정방향 프라이머 UL26/27-tkpA_For(서열번호 22)와 역방향 프라이머 UL26/27-pCMV_Rev(서열번호 23)를 사용하여 제작한 것이다.
기존 UL26/27-rpsL-neo/kan 카세트와 삽입된 UL26/27-tkpA-EmGFP-pCMV가 교체되면서 rpsL에 의해 차단된 스트렙토마이신 저항성이 활성화되는 원리를 이용하여 후보군을 스트렙토마이신 배지에서 선별하였다(Heermann R et al., Microb Cell Fact. 2008. 14:. doi: 10.1186). 선별된 후보군은 DNA prep 방법을 이용하여 DNA 분리를 하였고(Horsburgh BC et al., Methods enzymol. 1999. 306:337-352), UL26/27에서 tkpA-EmGFP-pCMV의 도입 여부를 제한효소 EcoRI, XhoI 처리와 PCR (ploymerase chain recation)를 수행으로 확인했고, PCR 산물을 시퀀싱하여 정확한 유전자 서열을 확인하였다.
형광단백질의 정상적인 발현과 바이러스의 생산을 위하여 실험을 진행하였다. 완성된 KOS-37/BAC-EmGFP-gD-R222N/F223I DNA를 라지 컨스트럭트 DNA 분리 키트(Large construct DNA purification kit, Macherey-Nagel)를 이용하여 추출한 후, Cre 재조합 효소(recombinase)를 이용하여 BAC 유전자를 제거하기 위하여 2×105의 Cre-Vero-HVEM 세포에 리포펙타민 2000 시약(Lipofectamine 2000 reagent, Invitrogen)을 이용하여 DNA 1 ug을 형질주입하였다. 형질주입 3일 후, EmGFP 단백질의 발현을 형광현미경을 통하여 관찰하고, Cre-Vero-HVEM 세포의 플라크(plaqe) 형성을 통해 바이러스 생산을 관찰하였다. 플라크의 형성을 확인한 다음 바이러스가 포함된 세포를 걷어서 3회의 freeze-thaw 방법(Gierasch WW et al.; J. Virol Methods. 2006. 135:197~206)과 초음파 파쇄(sonication)을 통해 KOS-EmGFP-gD-R222N/F223I 바이러스(gDm) 획득하였다.
KOS-EmGFP-gD-R222N/F223I 바이러스의 감염과 형광 발현은 HVEM가 없는 세포주(J1 및 J-Nectin)와 HVEM이 발현되는 세포주(J-HVEM)를 사용하였다. J1 세포는 어린 햄스터 신장세포주로 바이러스 HSV-1 리셉터인 HVEM와 Nectin-1이 결핍되어 있는 세포주이다(Petrovic B et al., 2017. PLoS Pathog. 19;13(4):e1006352). J-Nectin, J-HVEM 세포주는 J1세포에 각각 Nectin-1과 HVEM을 과발현하는 세포주이다(Petrovic B et al., 2017. PLoS Pathog. 19;13(4):e1006352). 각 세포주는 DMEM 배지(Welgene)에 100 U/ml 페니실린/100 μg/ml 스트렙토마이신 (Welgene)와 10% FBS(fetal bovine serum)를 이용하여 배양하였다. 1×104의 세포에, 상기 얻어진 KOS-EmGFP-gD-R222N/F223I 바이러스를 10 MOI (multiplicity of infection)로 감염시키고 24시간 후, 형광단백질 발현 및 바이러스 감염 정도를 형광현미경을 통하여 관찰하였다(BaeK HJ et al., Mol Ther. 2011. 19(3):507-514).
결과를 도 4에 형광현미경 모드로 촬영한 사진과 광학현미경 모드로 촬영한 사진을 각각 상하에 나타내었다. 도 4의 윗쪽 형광현미경 사진을 참조하여 보면, JI 세포주와 J-Nectin 세포주는 감염되지 않고, J-HVEM 세포주만 감염됨을 알 수 있다.
이러한 결과를 통하여, 의도한 바와 같이 KOS-EmGFP-gD-R222N/F223I 바이러스(gDm)가 형광단백질의 발현으로 바이러스 증식의 관찰이 용이하고 진입 경로로 Nectin-1을 사용하지 못하고 HVEM만을 사용하여 진입하는 것을 확인하였다.
<실시예 3> HER2 표적화 어댑터를 발현하는 HSV-1, EpCAM 표적화 어댑터를 발현하는 HSV-1 및 HER2 및 EpCAM 이중(dual) 표적화 어댑터를 발현하는 HSV-1 바이러스의 제작
상기 실시예 2에서 제작된, EmGFP 발현 카세트(pCMV-EmGFP-tkpA)가 삽입된 KOS-37/BAC-EmGFP-gD-R222N/F223I DNA의 UL3/UL4 위치에, HER2scFv-HveA 어댑터 발현 카세트와 EpCAM-HveA 어댑터 발현 카세트 그리고 HER2scFv-HveA와 EpCAM-HveA를 같이 발현하는 어댑터 발현 카세트 삽입하였다.
HER2scFv-HveA 어댑터 발현 카세트인 pCMV-HER2scFv-HveA-bGHpA가 삽입된 KOS-UL3/4-HER2scFv-HveA-EmGFP-gD/R222N/F223I 바이러스 게놈 개요도와 EpCAMscFv-HveA 어댑터 발현 카세트인 pCMV-EpCAMscFv-HveA-bGHpA이 삽입된 KOS-UL3/4-EpCAMscFv-HveA-EmGFP-gD/R222N/F223I 바이러스 게놈 개요도 그리고 EpCAM-HveA과 HER2scFv-HveA를 같이 발현하는 어댑터 발현 카세트 pCMV-EpCAMscFv-HveA-P2A-HER2scFv-HveA-bGHpA가 삽입된 KOS-UL3/4-EpCAMscFv-HveA-HER2scFv-HveA-EmGFP-gD/R222N/F223I 바이러스 게놈 개요도를 도 5에 나타내었으며, 또 도 6에 HER2scFv-HveA 어댑터와 EpCAMscFv-HveA 어댑터의 전체 서열과 해당 서열의 구성을 나타내었다.
여기서 HER2에 대한 scFv는 서열번호 4의 VH와 서열번호 5의 VL이 서열번호 24의 링커 펩티드를 매개로 연결된 구성이고, EpCAM에 대한 scFv는 서열번호 6의 VL과 서열번호 7의 VH가 서열번호 25의 링커 펩티드를 매개로 연결된 구성이며, HveA는 HER2scFv-HveA 어댑터 및 EpCAMscFv-HveA 어댑터에서 HVEM은 서열번호 8의 HveA82이 사용되었다. 또 HER2scFv-HveA 어댑터 및 EpCAMscFv-HveA 어댑터에 있어서는 그 N 말단 즉 HER2scFv의 VH의 앞부분과 EpCAMscFv 의 VL 앞부분에 서열번호 26의 리더 서열이 포함되어 있다.
HER2 또는 EpCAM에 대한 scFv 서열과 HveA 서열의 링커 서열인 NH2-GGGGS 서열 다음에는 클로닝을 용이하게 하기 위한 제한효소 EcoRI 작용 부위인 EF(염기서열: GAATTC) 추가되어 있다. 그리고 pCMV는 상기 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus)의 유전자 프로모터이고, bGH-pA는 bGH-PolyA(bovine growth hormone polyadenylation) 시그널 서열이며, HER2scFv-HveA와 EpCAM-HveA를 같이 발현하는 어댑터 발현 카세트 pCMV-HER2scFv-HveA-P2A-EpCAMscFv-HveA-bGHpA에서 P2A는 돼지 테스코바이러스-1(Pocine Teschovirus-1)의 2A(P2A)이다.
본 실시예에서 사용된, 리더 서열까지 포함한 HER2scFv-HveA 어댑터 전장의 아미노산 서열과 유전자 서열은 각각 서열번호 27과 서열번호 28에 개시되어 있고, 또 리더 서열까지 포함한 EpCAMscFv-HveA 어댑터 전장의 아미노산 서열과 유전자 서열은 각각 서열번호 29와 서열번호 30에 개시되어 있다.
HER2scFv-HveA 어댑터 발현 카세트와 EpCAMscFv-HveA 어댑터 발현 카세트 그리고 EpCAM-HveA-HER2scFv-HveA 듀얼(dual) 어댑터 발현 카세트의 삽입은 상기 실시예 1과 2와 마찬가지로 카운터 셀렉션 BAC 변형 키트(counter selection BAC modification kit; GeneBridges. Inc)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 진행하였다.
구체적으로 상기 실시예 2에서 제작된 KOS-37/BAC-EmGFP-gD-R222N/F223I 유전체가 들어있는 E.coli 클론에 상동 재조합(homologous recombination) 기능을 수행하는 RecE와 RecT를 발현하는 pRed/ET 플라스미드를 형질 전환하였다(Muyrers JP et al.; Nucleic Acids Res. 1999. 27(6):1555-1557). UL3와 UL4 사이에 타겟 유전자를 도입하고자 하는 위치를 포함하는 상동 영역의 프라이머(homologous region primer) 세트(정방향 프라이머 UL3/4-rpsL-neo_for: 서열번호 31, 역방향 프라이머 UL3/4-rpsL-neo_rev: 서열번호 32)를 사용하여 UL3/4-rpsL-neo/kan 카세트(cassette)를 제작하였다. KOS-37/BAC-EmGFP-gD-R222N/F223I와 pRedET가 들어있는 클론에 L-아라비노오스(L-arabinose; Sigma-Aldrich)를 첨가하여 상동 재조합(homologous recombination)이 가능하도록 유도한 후, 상기 제작한 UL3/4-rpsL-neo/kan 카세트 200 ng 를 형질 전환한다. 이러한 상동 재조합에 의하여 UL3/4-rpsL-neo/kan 카세트가 KOS-37/BAC-EmGFP-gD-R222N/F223I의 UL3/4 위치에 삽입되게 된다. UL3/4-rpsL-neo/kan가 삽입된 E.coli는 카나마이신 저항성을 갖고 있지만, 스트렙토마이신 저항성은 rpsL 유전자로 인해 차단된다. 카나마이신 배지에서 선별된 E.coli는 UL3/4-rpsL-neo/kan가 삽입되었다고 판단하여, 마지막 단계인 타겟 유전자를 삽입하는 단계로 진행하였다.
UL3/4-rpsL-neo/kan카세트가 있는 E.coli에 pRed/ET의 기능을 활성화시키는 L-아라비노오스(L-arabinose; Sigma-Aldrich)를 첨가하여 상동 재조합(homologous recombination)이 가능하도록 유도한 후, UL3/4-pCMV-HER2scFv-HveA-bGHpA 카세트와 UL3/4-pCMV-EpCAMscFv-HveA-bGHpA 카세트 그리고 UL3/4-pCMV-EpCAMscFv-HveA-P2A-HER2scFv-HveA-bGHpA 카세트 200 ng을 형질 전환 시켰다. 상기 UL3/4-pCMV-HER2scFv-HveA-bGHpA 카세트와 UL3/4-pCMV-EpCAMscFv-HveA-bGHpA 카세트 그리고 UL3/4-pCMV-EpCAMscFv-HveA-P2A-HER2scFv-HveA-bGHpA는 pCDNA3.1-HER2scFv-HveA 플라스미드와 pCDNA3.1-EpCAMscFv-HveA 플라스미드 그리고 pCDNA3.1-pCMV-EpCAMscFv-HveA-P2A-HER2scFv-HveA(BaeK HJ et al., Mol Ther. 2011. 19(3):507-514; Carter. p et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1992, 15;89(10):4285-9, Willuda J et al., Cancer Res. 1999, 15;59(22):5758-67)를 주형으로 사용하여 정방향 프라이머 UL3/4_pCMV_For(서열번호 33)와 역방향 프라이머 UL3/4_bGH_poly_R(서열번호 34)를 사용하여 제작하였다.
기존 삽입된 UL3/4-rpsL-neo/kan 카세트와 앞서 삽입된 UL3/4-pCMV-HER2scFv-HveA-bGHpA와 UL3/4-pCMV-EpCAMscFv-HveA-bGHpA 그리고 UL3/4-pCMV-EpCAMscFv-HveA-P2A-HER2scFv-HveA-bGHpA가 교체되면서 rpsL에 의해 차단된 스트렙토마이신 저항성이 활성화되는 원리를 이용하여 후보군을 스트렙토마이신 배지에서 선별하였다(Heermann R et al., Microb Cell Fact. 2008. 14:. doi: 10.1186). 선별된 후보군은 DNA prep 방법을 이용하여 DNA 분리를 하였고(Horsburgh BC et al., Methods enzymol. 1999. 306:337-352), UL3/4에서 UL3/4-pCMV-HER2scFv-HveA-bGHpA와 UL3/4-pCMV-EpCAMscFv-HveA-bGHpA 그리고 UL3/4-pCMV-EpCAMscFv-HveA-P2A-HER2scFv-HveA-bGHpA의 도입 여부를 도입 여부를 제한효소 EcoRI, XhoI 처리와 PCR (ploymerase chain recation)를 수행으로 확인했고, PCR 산물을 시퀀싱하여 정확한 유전자 서열을 확인하였다.
완성된 KOS-37/BAC-UL3/4_HER2scFv-HveA-EmGFP-gD-R222N/F223I와 KOS-37/BAC-UL3/4_EpCAMscFv-HveA-EmGFP-gD/R222N/F223I 그리고 KOS-37/BAC-UL3/4_EpCAMscFv-HveA-P2A-HER2scFv-HveA-EmGFP-gD/R222N/F223I DNA를 라지 컨스트럭트 DNA 분리 키트(Large construct DNA purification kit, Macherey-Nagel)를 이용하여 추출한 후, Cre recombinase를 이용하여 BAC 유전자를 제거하기 위하여 2×105의 Cre-Vero-HVEM 세포에 리포펙타민 2000 시약(Lipofectamine 2000 reagent, Invitrogen)을 이용하여 DNA 1ug을 형질주입 하였다. 형질주입 3일 후, 형광현미경을 이용하여 EmGFP 단백질의 형광발현과 세포의 플락(plaque) 형성을 관찰하였다. 플라크의 형성을 확인한 다음 바이러스가 포함된 세포를 걷어서 3회의 freeze-thaw 방법(Gierasch WW et al.; J. Virol Methods. 2006. 135:197~206)과 초음파 파쇄(sonication)을 통해, HER2 표적화 어댑터를 발현하는 KOS-UL3/4_HER2scFv-HveA-EmGFP-gD-R222N/F223I 바이러스(HADa-S)와 EpCAM 표적화 어댑터를 발현하는 KOS-UL3/4_EpCAMscFv-HveA-EmGFP-gD/R222N/F223I 바이러스(EADa-S) 그리고 HER2 및 EpCAM 이중(dual) 표적화 어댑터를 발현하는 KOS-UL3/4_EpCAMscFv-HveA-P2A-HER2scFv-HveA-EmGFP-gD/R222N/F223I 바이러스(EADa-HADa-D)를 획득하였다.
<실시예 4> HER2 표적화 변형된 당단백질 gH를 갖는 HSV-1과 HER2 표적화 변형된 당단백질 gH를 갖고 HER2 표적화 어댑터를 발현하는 HSV-1 바이러스 제작
특정 암에서 발현하는 표적분자를 표적화할 수 있는 재표적화 HSV의 제작을 위하여, HSV-1의 당단백질인 gH 아미노산 서열(GenBank Accession No. ASM47773, 서열번호 3)의 29번과 30번째 아미노산 사이에 암세포에 특이적으로 발현하는 HER2를 인지하는 리간드(HER2 scFv)를 삽입하였다. 상기 실시예 2, 3에서 제작된, KOS-37/BAC-EmGFP-gD-R222N/F223I DNA와 KOS-37/BAC-UL3/4_HER2scFv-HveA-EmGFP-gD/R222N/F223I DNA에 있는 당단백질 gH의 아미노산 29번과 30번 사이에 HER2scFv를 발현할 수 있는 유전자를 삽입하였다.
HSV-1의 gH에 HER2scFv 리간드가 삽입된 KOS-gH/HER2scFv-EmGFP-gD/R222N/F223I 바이러스 (HgH-S)와 KOS-UL3/4_HER2scFv-HveA-gH/HER2scFv-EmGFP-gD/R222N/F223I 바이러스 (HADa-HgH-D) 게놈 개요도를 도 7에 나타내었으며, 또 도 8에 gH-HER2scFv 리간드의 전체 서열과 해당 서열의 구성을 나타내었다. 여기서 HER2에 대한 scFv는 서열번호 4의 VH와 서열번호 5의 VL이 서열번호 24의 링커 펩티드를 매개로 연결된 구성이고, 이 scFv의 N-말단에 서열번호 35의 링커 펩티드가 연결되어 있고 또 C-말단에 서열번호 36의 링커 펩티드가 연결되어 있다.
본 실시예에서 사용된 전장의 HER2scFv의 아미노산 서열과 유전자 서열은 각각 서열번호 37와 서열번호 38에 개시되어 있다.
gH-HER2scFv 리간드의 삽입은 상기 실시예 1, 2, 3과 마찬가지로 카운터 셀렉션 BAC 변형 키트(counter selection BAC modification kit; GeneBridges. Inc)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 진행하였다.
구체적으로 상기 실시예 2, 3에서 제작된 KOS-37/BAC-EmGFP-gD-R222N/F223I DNA 와 KOS-37/BAC-UL3/4_HER2scFv-HveA-EmGFP-gD-R222N/F223I DNA가 들어있는 E.coli 클론에 상동 재조합(homologous recombination) 기능을 수행하는 RecE와 RecT를 발현하는 pRed/ET 플라스미드를 형질전환하였다(Muyrers JP et al.; Nucleic Acids Res. 1999. 27(6):1555-1557). gH의 아미노산 29번째와 30번째 사이에 타겟 유전자를 도입하고자 하는 위치를 포함하는 상동 영역의 프라이머(homologous region primer) 세트(정방향 프라이머 gH29/30-rpsL-neo_for: 서열번호 39, 역방향 프라이머 gH29/30-rpsL-neo_rev: 서열번호 40)를 사용하여 gH29/30-rpsL-neo/kan 카세트(cassette)를 제작하였다. 각각의 KOS-37/BAC-EmGFP-gD-R222N/F223I DNA와 KOS-37/BAC-UL3/4_HER2scFv-HveA-EmGFP-gD-R222N/F223I DNA에 pRed/ET가 들어있는 클론에 L-아라비노오스(L-arabinose; Sigma-Aldrich)를 첨가하여 상동 재조합(homologous recombination)이 가능하도록 유도한 후, 상기 제작한 gH29/30-rpsL-neo/kan 카세트 200 ng를 형질 전환한다. 이러한 상동 재조합에 의하여 gH29/30-rpsL-neo/kan 카세트가 gH의 아미노산 29번째와 30번째 사이 위치에 삽입되게 된다. gH29/30-rpsL-neo/kan가 삽입된 E.coli는 카나마이신 저항성을 갖고 있지만, 스트렙토마이신 저항성은 rpsL 유전자로 인해 차단된다. 카나마이신 배지에서 선별된 E.coli는 gH29/30-rpsL-neo/kan가 삽입되었다고 판단하여, 마지막 단계인 타겟 유전자를 삽입하는 단계로 진행하였다.
gH29/30-rpsL-neo/kan 카세트가 있는 E.coli에 pRed/ET의 기능을 활성화시키는 L-아라비노오스(L-arabinose; Sigma-Aldrich)를 첨가하여 상동 재조합(homologous recombination)이 가능하도록 유도한 후, gH29/30-HER2scFv 리간드 200 ng을 형질 전환하였다. 상기 gH29/30-HER2scFv 리간드는 pCAGGSMCS-gH-HER2scFv 플라스미드를 주형으로 사용하여 정방향 프라이머 gH29/30-scFv_For(서열번호 41)와 역방향 프라이머 gH29/30-scFv_Rev(서열번호 42)를 사용하여 제작하였다. 상기 pCAGGSMCS-gH-HER2scFv 플라스미드는 pCAGGSMCS 플라스미드(Atanasiu D, et al., J. Virol. 2013, Nov. 87(21):11332-11345)에 HER2scFv를 삽입하여 제작한 것으로, 구체적으로 pCAGGSMCS 플라스미드와 PCR로 증폭한 HER2scFv(Carter. p et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1992, 15;89(10):4285-9)에 NotI 제한효소(NEB, R3189)를 처리하고 NotI으로 잘려진 pCAGGSMCS 플라스미드와 HER2scFv를 T4 DNA ligase(NEB, M0202)를 이용하여 결합시켜 제작하였다.
기존 삽입된 gH29/30-rpsL-neo/kan 카세트와 앞서 삽입된 gH29/30-HER2scFv가 교체되면서 rpsL에 의해 차단된 스트렙토마이신 저항성이 활성화되는 원리를 이용하여 후보군을 스트렙토마이신 배지에서 선별하였다(Heermann R et al., Microb Cell Fact. 2008. 14:. doi: 10.1186). 선별된 후보군은 DNA prep 방법을 이용하여 DNA 분리를 하였고(Horsburgh BC et al., Methods enzymol. 1999. 306:337-352), gH29/30에서 HER2scFv의 도입 여부를 도입 여부를 제한효소 EcoRI, XhoI 처리와 PCR (ploymerase chain recation)를 수행으로 확인했고, PCR 산물을 시퀀싱하여 정확한 유전자 서열을 확인하였다.
완성된 KOS-37/BAC-gH/HER2scFv-EmGFP-gD-R222N/F223I DNA 와 KOS-37/BAC-UL3/4_HER2scFv-HveA-gH/HER2scFv-EmGFP-gD-R222N/F223I DNA를 라지 컨스트럭트 DNA 분리 키트(Large construct DNA purification kit, Macherey-Nagel)를 이용하여 추출한 후, Cre 재조합 효소(recombinase)를 이용하여 BAC 유전자를 제거하기 위하여 2×105의 Cre-Vero-HVEM 세포에 리포펙타민 2000 시약(Lipofectamine 2000 reagent, Invitrogen)을 이용하여 각각의 DNA 1 ug을 형질주입하였다. 형질주입 3일 후, 형광현미경을 이용하여 EmGFP 단백질의 형광 발현과 세포의 플락(plaque) 형성을 관찰하였다. 플라크의 형성을 확인한 다음 바이러스가 포함된 세포를 걷어서 3회의 freeze-thaw 방법(Gierasch WW et al.; J. Virol Methods. 2006.135:197~206)과 초음파 파쇄(sonication)을 통해 KOS-gH/HER2scFv-EmGFP-gD-R222N/F223I 바이러스(HgH-S)와 KOS-UL3/4_HER2scFv-HveA-gH/HER2scFv-EmGFP-gD-R222N/F223I 바이러스(HADa-HgH-D)를 획득하였다.
<실시예 5> EpCAM 표적화 변형된 당단백질 gH를 갖는 HSV-1과 EpCAM 표적화 변형된 당단백질 gH를 갖고 EpCAM 표적화 어댑터를 발현하는 HSV-1 바이러스 제작
특정 암에서 발현하는 표적분자를 표적화할 수 있는 재표적화 HSV의 제작을 위하여, HSV-1의 당단백질인 gH 아미노산 서열(GenBank Accession No. ASM47773, 서열번호 35)의 29번과 30번째 아미노산 사이에 암세포에 특이적으로 발현하는 EpCAM를 인지하는 리간드(EpCAM scFv)를 삽입하여 하였다. 상기 실시예 2와 3에서 제작된, KOS-37/BAC-EmGFP-gD-R222N/F223I DNA와 KOS-37/BAC-UL3/4_EpCAMscFv-HveA-EmGFP-gD/R222N/F223I (EADa-S) DNA에 있는 당단백질 gH의 아미노산 29번과 30번 사이에 EpCAMscFv를 발현할 수 있는 유전자를 삽입하였다.
HSV-1의 gH에 EpCAMscFv 리간드가 삽입된 KOS-gH/EpCAMscFv-EmGFP-gD/R222N/F223I 바이러스 (EgH-S)와 KOS-UL3/4_EpCAMscFv-HveA-gH/EpCAMscFv-EmGFP-gD/R222N/F223I 바이러스 (EADa-EgH-D) 게놈 개요도를 도 9에 나타내었으며, 또 도 10에 gH-EpCAMscFv 리간드의 전체 서열과 해당 서열의 구성을 나타내었다. 여기서 EpCAM에 대한 scFv는 서열번호 6의 VL와 서열번호 7의 VH이 서열번호 25의 링커 펩티드를 매개로 연결된 구성이고, 이 scFv의 N-말단에 서열번호 43의 링커 펩티드와 C-말단에 서열번호 44의 링커 펩티드가 연결되어 있다.
본 실시예에서 사용된 HER2scFv의 아미노산 서열과 유전자 서열은 각각 서열번호 45와 서열번호 46에 개시되어 있다.
gH-EpCAMscFv 리간드의 삽입은 상기 실시예 4와 마찬가지로 카운터 셀렉션 BAC 변형 키트(counter selection BAC modification kit; GeneBridges. Inc)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 진행하였다.
구체적으로 상기 실시예 2와 3에서 제작된 KOS-37/BAC-EmGFP-gD-R222N/F223I DNA와 KOS-37/BAC-UL3/4_EpCAMscFv-HveA-EmGFP-gD-R222N/F223I DNA가 들어있는 E.coli 클론에 상동 재조합(homologous recombination) 기능을 수행하는 RecE와 RecT를 발현하는 pRed/ET 플라스미드를 형질 전환하였다(Muyrers JP et al.; Nucleic Acids Res. 1999. 27(6):1555-1557). gH의 아미노산 29번째와 30번째 사이에 타겟 유전자를 도입하고자 하는 위치를 포함하는 상동 영역의 프라이머(homologous region primer) 세트(정방향 프라이머 gH29/30-rpsL-neo_for: 서열번호 40, 역방향 프라이머 gH29/30-rpsL-neo_rev: 서열번호 41를 사용하여 gH29/30-rpsL-neo/kan 카세트(cassette)를 제작하였다. 각각의 KOS-37/BAC-EmGFP-gD-R222N/F223I DNA와 KOS-37/BAC-UL3/4_EpCAMscFv-HveA-EmGFP-gD-R222N/F223I DNA에 pRed/ET가 들어있는 클론에 L-아라비노오스(L-arabinose; Sigma-Aldrich)를 첨가하여 상동 재조합(homologous recombination)이 가능하도록 유도한 후, 상기 제작한 gH29/30-rpsL-neo/kan 카세트 200 ng 를 형질 전환한다. 이러한 상동 재조합에 의하여 gH29/30-rpsL-neo/kan 카세트가 gH의 아미노산 29번째와 30번째 사이에 삽입되게 된다. gH29/30-rpsL-neo/kan가 삽입된 E.coli는 카나마이신 저항성을 갖고 있지만, 스트렙토마이신 저항성은 rpsL 유전자로 인해 차단된다. 카나마이신 배지에서 선별된 E.coli는 gH29/30-rpsL-neo/kan가 삽입되었다고 판단하여, 마지막 단계인 타겟 유전자를 삽입하는 단계로 진행하였다.
gH29/30-rpsL-neo/kan카세트가 있는 E.coli에 pRed/ET의 기능을 활성화시키는 L-아라비노오스(L-arabinose; Sigma-Aldrich)를 첨가하여 상동 재조합(homologous recombination)이 가능하도록 유도한 후, gH29/30-EpCAMscFv 리간드 200 ng을 형질 전환하였다. 상기 gH29/30-EpCAMscFv 리간드는 pCAGGSMCS-gH-EpCAMscFv 플라스미드를 주형으로 사용하여 정방향 프라이머 gH29/30-scFv_For(서열번호 42)와 역방향 프라이머 gH29/30_scFv_Rev(서열번호 43)를 사용하여 제작하였다. 상기 pCAGGSMCS-gH-EpCAMscFv 플라스미드는 pCAGGSMCS 플라스미드(Atanasiu D, et al., J. Virol. 2013, Nov. 87(21):11332-11345)에 EpCAMscFv를 삽입하여 제작한 것으로, 구체적으로 pCAGGSMCS 플라스미드와 PCR로 증폭한 EpCAMscFv(Willuda J et al., Cancer Res. 1999, 15;59(22):5758-67)에 NotI 제한효소(NEB, R3189)를 처리하고 NotI으로 잘려진 pCAGGSMCS 플라스미드와 EpCAMscFv를 T4 DNA ligase(NEB, M0202)를 이용하여 결합시켜 제작하였다.
기존 삽입된 gH29/30-rpsL-neo/kan 카세트와 앞서 삽입된 gH29/30-EpCAMscFv가 교체되면서 rpsL에 의해 차단된 스트렙토마이신 저항성이 활성화되는 원리를 이용하여 후보군을 스트렙토마이신 배지에서 선별하였다(Heermann R et al., Microb Cell Fact. 2008. 14:. doi: 10.1186). 선별된 후보군은 DNA prep 방법을 이용하여 DNA 분리를 하였고(Horsburgh BC et al., Methods enzymol. 1999. 306:337-352), gH29/30에서 EpCAMscFv의 도입 여부를 도입 여부를 제한효소 EcoRI, XhoI 처리와 PCR (ploymerase chain recation)를 수행으로 확인했고, PCR 산물을 시퀀싱하여 정확한 유전자 서열을 확인하였다.
완성된 KOS-37/BAC-gH_EpCAMscFv-EmGFP-gD-R222N/F223I와 KOS-37/BAC-UL3/4_EpCAMscFv-HveA-gH/EpCAMscFv-EmGFP-gD-R222N/F223I DNA를 라지 컨스트럭트 DNA 분리 키트(Large construct DNA purification kit, Macherey-Nagel)를 이용하여 추출한 후, Cre 재조합 효소(recombinase)를 이용하여 BAC 유전자를 제거하기 위하여 2×105의 Cre-Vero-HVEM 세포에 리포펙타민 2000 시약(Lipofectamine 2000 reagent, Invitrogen)을 이용하여 각각의 DNA 1 ug을 형질주입하였다. 형질주입 2일 후, 형광현미경을 이용하여 EmGFP 단백질의 형광발현과 세포의 플락(plaque) 형성을 관찰하였다. 플라크의 형성을 확인한 다음 바이러스가 포함된 세포를 걷어서 3회의 freeze-thaw 방법(Gierasch WW et al.; J. Virol Methods. 2006.135:197~206)과 초음파 파쇄(sonication)을 통해 KOS-gH/EpCAMscFv-EmGFP-gD-R222N/F223I 바이러스(EgH-S)와 KOS-gH/EpCAMscFv-UL3/4_EpCAMscFv-HveA-EmGFP-gD-R222N/F223I 바이러스(EADa-EgH-D)를 획득하였다.
<실시예 6> HER2 이중 표적화 항암 바이러스의 활성 측정
상기 실시예 3, 4에서 제작된 HER2scFv-HveA 어댑터를 발현하는 KOS-UL3/4_HER2scFv-HveA-EmGFP-gD-R222N/F223I 바이러스 (HADa-S) 와 gH에 HER2scFv를 발현하는 KOS-gH/HER2scFv-EmGFP-gD-R222N/F223I 바이러스 (HgH-S) 그리고 HER2scFv-HveA 어댑터와 gH에 HER2scFv를 발현하는 KOS-UL3/4_HER2scFv-HveA-gH/HER2scFv-EmGFP-gD-R222N/F223I (HADa-HgH-D) 이중 표적화(double-targeting) 바이러스의 바이러스 확산 및 증폭, HER2scFv-HveA 어댑터 발현량을 확인하기 위하여 다음과 같이 실험을 진행하였다.
바이러스 확산 실험을 진행하기 위하여 Vero-HVEM 세포와 SK-OV-3 세포를 2.0 X 105으로 12 well 플레이트에 깔아주었다. HSV-1 야생형 바이러스 (KOS)와
실시예 2에서 제조된 형광단백질 EmGFP을 발현하고 세포 수용체로서 HVEM만을 사용하여 진입하는 바이러스 gDm, 실시예 3에서 제조된 HER2scFv-HveA 어댑터를 발현하는 바이러스 HADa-S, 실시예 4에서 제조된 gH에 HER2scFv를 리간드 갖는 바이러스 HgH-S, 실시예 4에서 제조된 gH에 HER2scFv를 리간드 갖고 HER2scFv-HveA 어댑터를 발현하는 이중 표적화 바이러스 HADa-HgH-D를 하나의 well에 20~50개가 될 수 있도록 바이러스를 희석하여 감염시켰다. 90분 후, 잔류하는 초기 바이러스를 제거하고 바이러스의 확산을 방지하기 위하여 0.2% 메틸셀룰로오스(methylcellulose)가 들어있는 배지로 교체하였다. 3일 후 형광현미경을 이용하여 바이러스 플락(plaque)의 크기를 통하여 바이러스 확산을 측정하였다.
결과를 도 11에 나타내었다. 도 11에서와 확인되는 바와 같이, Vero-HVEM 세포주에서는 야생형 바이러스(KOS)에 대비하여 gDm, HgH-S, HADa-S 그리고 HADa-HgH-D의 플락(plaque) 크기가 각각 18%, 49%, 4%, 29% 작게 형성이 되었다. HER2 발현 세포주인 SK-OV-3 세포에서는 야생형 바이러스(KOS)에 대비하여 HgH-S의 플락(plaque) 크기가 53% 감소 되었지만, HADa-S과 HADa-HgH-D 바이러스는 각각 20%, 19% 증가한 것을 관찰하였다. HgH-S의 플락(plaque) 크기가 감소한 것은 gD가 진입 수용체(entry receptor)에 결합을 하면 gH가 이러한 결합에 의해 활성 시그널을 gB로 전달하여 세포융합을 유도하는 역할을 하며, 또한 인테그린(integrins)과 결합하여 엔도시토시스(endocytosis)를 유도하게 되는데, gH에 scFv가 삽입되면서 구조적인 변화로 인한 이러한 시그널 전달 또는 엔도시토시스에 영향을 주어 바이러스 확산이나 복제가 저해되는 것으로 판단된다.
바이러스 복제 실험을 진행하기 위하여 Vero-HVEM 세포를 1.0 X 104 으로 96 well 플레이트에 깔아주었다. gDm, gH에 HER2scFv를 리간드 발현하는 HgH-S, HER2scFv-HveA 어댑터를 발현하는 HADa-S 그리고 이중 표적화 HADa-HgH-D 바이러스 0.1 MOI를 감염시켰다. 90분 후, 잔류하는 초기 바이러스를 제거하기 위하여 새로운 배지로 교체하였다. 감염 후, 3, 24, 48시간에 바이러스 배양액을 획득하고, 배양액에 있는 바이러스의 수를 측정하였다.
결과를 도 12에 나타내었다. 도 12에서와 확인되는 바와 같이, Vero-HVEM 세포주에 gDm, HADa-S 그리고 HADa-HgH-D의 바이러스 증식 활성은 비슷하지만, 도 11의 결과에서와 바이러스 확산 능력의 감소로 인한 HgH-S에서 바이러스의 증식 활성이 감소되는 것을 확인하였다.
어댑터의 발현량을 측정하는 실험을 진행하기 위하여 Vero-HVEM과 SK-OV-3 세포를 2.0 X 105으로 12 well 플레이트에 깔아주었다. gDm, gH에 HER2scFv 리간드 발현하는 HgH-S, HER2scFv-HveA 어댑터를 발현하는 HADa-S 그리고 이중 표적화 바이러스인 HADa-HgH-D 바이러스 0.1 MOI를 감염시켰다. 90분 후, 잔류하는 초기 바이러스를 제거하기 위하여 FBS가 없는 새로운 배지로 교체하였다. 감염 48시간 후, 바이러스 배양액을 획득하였고, 배양액에 있는 어댑터를 측정하기 위하여 웨스턴 블럿(Western blot)을 통하여 단백질 발현량을 측정하였다.
결과를 도 13에 나타내었다. 도 13에서와 확인되는 바와 같이, Vero-HVEM 세포주에서는 HADa-HgH-D 이중 표적화 바이러스가 어댑터만 발현하는 HADa-S 바이러스에 비하여 3배 이상의 어댑터가 발현되었다. 하지만 어댑터가 없는 gDm과 HgH-S 바이러스 배양액에서는 어댑터가 측정되지 않았다. HER2가 발현하는 SK-OV-3 세포에서는 HADa-HgH-D 이중 표적화 바이러스의 어댑터만 검출되었다. 이러한 이유는 HADa-S 바이러스에 비하여 HADa-HgH-D 이중 표적화 바이러스가 HER2가 발현되는 세포주에 감염률이 높아 비례적으로 어댑터의 발현이 높기 때문이다.
종합적으로 HADa-HgH-D 이중 표적화 바이러스는 바이러스 확산 및 증폭 그리고 어댑터 발현량에서 다른 바이러스와 비교하여 상대적으로 향상된 능력을 확인하였다.
<실시예 7> HER2 이중 표적화 항암 바이러스를 이용한 HER2 발현 암세포의 감염 및 세포독성
상기 실시예 2, 3, 4에서 제작된 gDm, gH에 HER2scFv 리간드를 발현하는 HgH-S, HER2scFv-HveA 어댑터를 발현하는 HADa-S 그리고 HER2scFv-HveA 어댑터와 gH에 HER2scFv 리간드를 모두 발현하는 이중 표적화 HADa-HgH-D 바이러스를 HER2를 발현하는 암 세포주에서 실험을 진행하였다. 각각의 바이러스가 당단백질 gH에서 발현하는 HER2scFv 리간드 또는 어댑터에 의하여 주변의 암세포로의 바이러스의 감염을 유도하는지, 감염 후 세포독성을 유도하는지를 확인하기 위하여 다음과 같이 실험을 진행하였다.
실험에 사용된 세포주는 HER2가 발현되지 않는 세포주(MDA-MB-231)와 HER2가 발현되는 세포주(SK-OV-3, MCF-7, MDA-MB-453, BT-474)이다. 유방암 세포주인 MDA-MB-231(ATCC, HTB-26), MCF-7(ATCC, HTB-22), , BT-474(ATCC, HTB-20), 난소암 세포주인 SK-OV-3(ATCC, HTB-77)는 DMEM 배지에 100 U/ml 페니실린/100 μg/ml 스트렙토마이신 (Welgene)와 10% FBS를 사용하여 배양했고 유방암 세포주인 MDA-MB-453 (ATCC, HTB-131) RPMI 1640 배지에 100 U/ml 페니실린/100 μg/ml 스트렙토마이신 (Welgene)와 10% FBS를 사용하여 배양하였다.
HER2 특이적 바이러스 감염실험을 위하여 8×103의 SK-OV-3과 MDA-MB-231, 4.0×104의 MCF-7, 8.0×104의 MDA-MB-453, 7.0×104의 BT-474 세포주들은 2 MOI로, gH에 HER2scFv를 리간드 발현하는 HgH-S, HER2scFv-HveA 어댑터를 발현하는 HADa-S 그리고 이중 표적화 HADa-HgH-D 바이러스와 대조군으로 HER2 타겟팅이 되지 않는 gDm 바이러스를 감염시켰다. 90분 후, 잔류하는 초기 바이러스를 제거하기 위하여 새로운 배지로 교체하였다. 감염 2일 후, 각각의 세포주에서 바이러스 감염을 EmGFP 형광 발현으로 확인하였다 (BaeK HJ et al., Mol Ther. 2011. 19(3):507-514). 또한 감염 후, 4일 동안 세포독성을 측정하기 위하여 EZ-Cytox (DoGenBio) 시약을 사용하여 살아있는 세포에서만 형성되는 발색물질인 포르마잔(formazan)의 발색정도를 ELISA 리더기를 이용하여 흡광도 450 nm에서 측정하였다. 흡광도를 수치화하여 각각의 바이러스에 의한 암 세포주의 세포독성을 측정하였다.
결과를 도 14에 나타내었다. 도 14에서 확인되는 바와 같이, 어댑터를 발현하는 HADa-S 바이러스는 SK-OV-3와 MCF7 세포에서 감염률이 높지만, MDA-MB-453과 BT-474에서 낮은 감염률을 관찰하였다. gH에 HER2scFv 리간드를 발현하는 HgH-S 바이러스는 SK-OV-3와 MCF7 그리고 MDA-MB-453 세포에서 감염률이 높지만, BT-474에서 낮은 감염률을 관찰하였다. 리간드와 어댑터를 각각 하나씩 발현하는 바이러스와는 다르게 이중 표적화 HADa-HgH-D 바이러스는 HER2가 발현하는 모든 세포에서 높은 감염률을 관찰하였다. 하지만, gDm 바이러스는 HER2 표적화가 되지 않기 때문에 암 세포주에 감염이 되지 않았고, 대조군인 HER2가 발현하지 않는 MDA-MB-231 세포에서는 모든 바이러스의 감염이 관찰되지 않았다. 상기 MDA-MB-453과 BT-474에서의 낮은 감염율은 MDA-MB-453과 BT-474의 세포형태 및 특성 그리고 그것으로 인한 HADa-S 바이러스의 초기 낮은 감염에 기인한 것으로 판단된다.
또한 도 15에서는 감염 후, 4일 동안 바이러스에 의한 암세포의 세포독성을 관찰한 결과를 나타내었다. HgH-S, HAD-S HADa-HgH-D 바이러스는 SK-OV-3에서 41%, 27%, 25%의 세포 생존율을, MCF-7에서는 61%, 52%, 39%의 세포 생존율을, MDA-MB-453에서는 49%, 100%, 23%의 세포 생존율을 관찰하였다. HER2가 발현하는 3가지 세포주에서 이중 표적화 HADa-HgH-D 바이러스 감염에 의한 세포독성이 가장 높은 것을 관찰하였다. 하지만 gDm 바이러스는 HER2 타겟팅이 되지 않기 때문에 세포독성을 관찰하지 못했고, HER2가 발현하지 않는 MDA-MB-231에서도 감염이 되지 않기 때문에 3가지 바이러스가 세포독성에 관여하지 않는다는 것을 관찰하였다. MDA-MB-453 세포의 생존율에 영향이 없었던 것은 HADa-S 바이러스가 초기 감염이 다른 바이러스에 비하여 현저히 낮았기 때문인 것으로 보인다.
<실시예 8> 마우스에서 HER2 이중 표적화 항암 바이러스에 의한 종양세포의 생장 억제
상기 실시예 4에서 제작된 이중 표적화 HADa-HgH-D 바이러스가 마우스에서 HER2를 발현하는 암세포 성장의 억제를 유도하는지를 확인하기 위하여 다음과 같이 실험을 진행하였다.
5주령 Balb/c nude mice (오리엔트 바이오)의 피하에 5 X 106 cells/mouse의 SK-OV-3를 주입한 후, 종양의 크기가 100mm3가 될 때까지 관찰하였다. 종양이 생성된 마우스 5마리에 HER2 더블 타겟팅 HADa-HgH-D 바이러스를 2 X 107 pfu/mouse로 종양내 주입(Intratumoral injection)하였고, 대조군 역시 5마리의 마우스에 PBS를 주입하였다. 바이러스 주입 후, 28일 동안 마우스에 생성된 종양의 크기를 관찰하였다.
결과를 도 16에 28일 동안 종양의 크기를 그래프로 나타내었다. PBS를 넣은 대조군은 초기 116.46 ± 11.21 mm3 에서 815.28 ± 141.36 mm3로 종양이 성장했지만, HER2 더블 타겟팅 HADa-HgH-D 바이러스를 주입한 마우스에서는 108.85 ± 15.54 mm3 초기에서 110.02 ± 55.44 mm3으로 종양의 성장이 대조군과 비교하여 억제되는 것을 관찰하였다.
<실시예 9> EpCAM 이중 표적화 항암 바이러스를 이용한 EpCAM 발현 암세포의 감염 및 세포독성
상기 실시예 3, 5에서 제작된 EpCAMscFv-HveA 어댑터가 발현되는 EADa-S 바이러스와 gH에 EpCAMscFv 리간드를 발현되는 EgH-S 바이러스 그리고 EpCAMscFv-HveA 어댑터와 gH에 EpCAMscFv 리간드를 모두 발현하는 이중 표적화 EADa-EgH-D 바이러스를 이용하여 암세포주에서 실험을 진행하였다.
각각의 바이러스가 당단백질 gH에 발현하는 EpCAMscFv 리간드 또는 어댑터에 의하여 주변의 암세포로 바이러스의 감염을 유도하는지, 감염 후 세포독성을 유도하는지를 확인하기 위하여 다음과 같이 실험을 진행하였다.
실험에 사용된 세포주는 EpCAM가 발현되지 않는 세포주(Mia-PaCa-2)와 EpCAM가 발현되는 세포주(MCF-7, MDA-MB-453, BT-474)이다. 유방암 세포주인 MCF-7(ATCC, HTB-22), BT-474(ATCC, HTB-20), 췌장암 세포주인 Mia-PaCa-2(ATCC, CRL-1420)는 DMEM 배지에 100 U/ml 페니실린/100 μg/ml 스트렙토마이신 (Welgene))와 10% FBS를 사용하여 배양했고, 유방암 세포주인 MDA-MB-453 (ATCC, HTB-131)는 RPMI 배지에 100 U/ml 페니실린/100 μg/ml 스트렙토마이신 (Welgene)와 10% FBS를 사용하여 배양하였다.
EpCAM 특이적 바이러스 감염실험을 위하여 4.0×104의 MCF-7, 8.0×104의 MDA-MB-453, 7.0×104의 BT-474 세포주들은 1 MOI로, 상기 실시예 3에서 제작된 EpCAMscFv-HveA 어댑터가 발현되는 EADa-S, 실시예 4에서 제작된 gH에 EpCAMscFv 리간드를 발현하는 EgH-S 바이러스, 어댑터와 리간드가 같이 발현하는 이중 표적화 EADa-EgH-D 바이러스와 대조군으로 실시예 2에서 제작된 EpCAM 표적화가 되지 않는 gDm 바이러스를 감염시켰다. 90분 후, 잔류하는 초기 바이러스를 제거하기 위하여 새로운 배지로 교체하였다. 감염 2일 후, 각각의 세포주에서 바이러스 감염을 EmGFP 형광 발현으로 확인하였다 (BaeK HJ et al., Mol Ther. 2011. 19(3):507-514). 또한 감염 후, 5일 동안 세포독성을 측정하기 위하여 EZ-Cytox (DoGenBio) 시약을 사용하여 살아있는 세포에서만 형성되는 발색물질인 포르마잔(formazan)의 발색정도를 ELISA 리더기를 이용하여 흡광도 450 nm에서 측정하였다. 흡광도를 수치화하여 각각의 바이러스에 의한 암 세포주의 세포독성을 측정하였다.
결과를 도 17에 나타내었다. 도 17에서 확인되는 바와 같이, BT-474와 MDA-MB-453 그리고 MCF7 세포에서 EpCAM-HveA 어댑터만 발현되는 EADa-S 바이러스, gH에 EpCAMscFv 리간드가 발현하는 EgH-S 바이러스, 어댑터와 리간드가 같이 발현되는 이중 표적화 EADa-EgH-D 바이러스가 모두 세포을 감염시키는 것을 형광으로 관찰하였지만, 이중 표적화 EADa-EgH-D 바이러스가 EADa-S, EgH-S 바이러스와 비교하여 높은 감염률을 관찰하였다. gDm 바이러스는 EpCAM 표적화가 되지 않기 때문에 암 세포주에 감염이 되지 않았고, EpCAM가 발현하지 않는 Mia-PaCa-2 세포에서는 바이러스가 감염되지 않는 것을 관찰하였다.
또한 도 18에 감염 후, 5일 동안 바이러스에 의한 암세포의 세포독성을 관찰한 결과를 나타내었다. EgH-S, EAD-S EADa-EgH-D 바이러스는 BT-474에서 35%, 34%, 26%의 세포 생존율을, MDA-MB-453에서는 22%, 19%, 17%의 세포 생존율을, MCF-7에서는 36%, 31%, 20%의 세포 생존율을 관찰하였다. EpCAM을 발현하는 3가지 세포주에서 EADa-EgH-D 더블 타겟팅 바이러스 감염에 의한 세포독성이 가장 높은 것을 관찰하였다. 하지만 gDm 바이러스는 EpCAM 타겟팅이 되지 않기 때문에 세포독성을 관찰하지 못했고, EpCAM을 발현하지 않는 Mia-PaCa-2에서도 감염이 되지 않기 때문에 바이러스 모두 세포독성에 관여하지 않는다는 것을 관찰하였다.
<실시예 10> HER2 표적화 변형된 당단백질 gH를 갖고 EpCAM 표적화 어댑터를 발현하는 HSV-1 제작
특정 암에서 발현하는 2가지 표적분자(HER2/EpCAM)를 이중으로 표적화할 수 있는 HSV의 제작을 위하여, EpCAMscFv-HveA 어댑터가 발현되는 KOS-UL3/4_EpCAMscFv-HveA-EmGFP-gD-R222N/F223I (EADa-S) 바이러스 당단백질인 gH 아미노산 서열(GenBank Accession No. ASM47773, 서열번호 35)의 29번과 30번째 아미노산 사이에 암세포에 특이적으로 발현하는 HER2를 인지하는 리간드(HER2 scFv)를 삽입하였다.
상기 실시예 3에서 제작된 KOS-37/BAC-UL3/4_EpCAMscFv-HveA-EmGFP-gD/R222N/F223I (EADa-S) DNA 에 있는 당단백질 gH의 아미노산 29번과 30번 사이에 HER2scFv를 발현할 수 있는 유전자를 삽입하였다.
HSV-1의 gH에 HER2scFv 리간드가 삽입된 KOS-UL3/4_EpCAMscFv-HveA-gH/HER2scFv-EmGFP-gD/R222N/F223I 바이러스 게놈 개요도를 도 19에 나타내었으며, 또 gH-HER2scFv 리간드의 전체 서열과 해당 서열의 구성은 도 8에 나타나 있다. 여기서 HER2에 대한 scFv는 서열번호 4의 VH와 서열번호 5의 VL이 서열번호 24의 링커 펩티드를 매개로 연결된 구성이고, 이 scFv의 N-말단에 서열번호 36의 링커 펩티드가 연결되어 있고 또 C-말단에 서열번호 37의 링커 펩티드가 연결되어 있다.
본 실시예에서 사용된 전장의 HER2scFv의 아미노산 서열과 유전자 서열은 각각 서열번호 38와 서열번호 39에 개시되어 있다.
gH-HER2scFv 리간드의 삽입은 상기 실시예 4와 마찬가지로 카운터 셀렉션 BAC 변형 키트(counter selection BAC modification kit; GeneBridges. Inc)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 진행하였다.
구체적으로 상기 실시예 3에서 제작된 KOS-37/BAC-UL3/4_EpCAMscFv-HveA-EmGFP-gD-R222N/F223I DNA 가 들어있는 E.coli 클론에 상동 재조합(homologous recombination) 기능을 수행하는 RecE와 RecT를 발현하는 pRed/ET 플라스미드를 형질전환하였다(Muyrers JP et al.; Nucleic Acids Res. 1999. 27(6):1555-1557). gH의 아미노산 29번째와 30번째 사이에 타겟 유전자를 도입하고자 하는 위치를 포함하는 상동 영역의 프라이머(homologous region primer) 세트(정방향 프라이머 gH29/30-rpsL-neo_for: 서열번호 40, 역방향 프라이머 gH29/30-rpsL-neo_rev: 서열번호 41)를 사용하여 gH29/30-rpsL-neo/kan 카세트(cassette)를 제작하였다.
KOS-37/BAC-UL3/4_EpCAMscFv-HveA-EmGFP-gD-R222N/F223I DNA와 pRed/ET가 들어있는 클론에 L-아라비노오스(L-arabinose; Sigma-Aldrich)를 첨가하여 상동 재조합(homologous recombination)이 가능하도록 유도한 후, 상기 제작한 gH29/30-rpsL-neo/kan 카세트 200 ng을 형질전환하였다. 이러한 상동 재조합에 의하여 gH29/30-rpsL-neo/kan 카세트가 gH의 아미노산 29번째와 30번째 사이에 삽입되게 된다. gH29/30-rpsL-neo/kan가 삽입된 E.coli는 카나마이신 저항성을 갖고 있지만, 스트렙토마이신 저항성은 rpsL 유전자로 인해 차단된다. 카나마이신 배지에서 선별된 E.coli는 gH29/30-rpsL-neo/kan가 삽입되었다고 판단하여, 마지막 단계인 타겟 유전자를 삽입하는 단계로 진행하였다.
gH29/30-rpsL-neo/kan카세트가 있는 E.coli에 pRed/ET의 기능을 활성화시키는 L-아라비노오스(L-arabinose; Sigma-Aldrich)를 첨가하여 상동 재조합(homologous recombination)이 가능하도록 유도한 후, gH29/30-HER2scFv 리간드 200 ng을 형질전환하였다. 상기 gH29/30-HER2scFv 리간드는 pCAGGSMCS-gH-HER2scFv 플라스미드를 주형으로 사용하여 정방향 프라이머 gH29/30-scFv_For(서열번호 42)와 역방향 프라이머 gH29/30scFv_Rev(서열번호 43)를 사용하여 제작하였다.
기존 삽입된 gH29/30-rpsL-neo/kan 카세트와 앞서 삽입된 gH29/30-HER2scFv가 교체되면서 rpsL에 의해 차단된 스트렙토마이신 저항성이 활성화되는 원리를 이용하여 후보군을 스트렙토마이신 배지에서 선별하였다(Heermann R et al., Microb Cell Fact. 2008. 14:. doi: 10.1186). 선별된 후보군은 DNA prep 방법을 이용하여 DNA 분리를 하였고(Horsburgh BC et al., Methods enzymol. 1999. 306:337-352), gH29/30에서 HER2scFv의 도입 여부를 도입 여부를 제한효소 EcoRI, XhoI 처리와 PCR (ploymerase chain recation)를 수행으로 확인했고, PCR 산물을 시퀀싱하여 정확한 유전자 서열을 확인하였다.
완성된 KOS-37/BAC-gH/HER2scFv-UL3/4_EpCAMscFv-HveA-EmGFP-gD-R222N/F223I DNA를 라지 컨스트럭트 DNA 분리 키트(Large construct DNA purification kit, Macherey-Nagel)를 이용하여 추출한 후, Cre recombinase를 이용하여 BAC 유전자를 제거하기 위하여 2×105의 Cre-Vero-HVEM 세포에 리포펙타민 2000 시약(Lipofectamine 2000 reagent, Invitrogen)을 이용하여 각가의 DNA 1 ug을 형질주입하였다. 형질주입 3일 후, 형광현미경을 이용하여 EmGFP 단백질의 형광발현과 세포의 플락(plaque) 형성을 관찰하였다. 플라크의 형성을 확인한 다음 바이러스가 포함된 세포를 걷어서 3회의 freeze-thaw 방법(Gierasch WW et al.; J. Virol Methods. 2006. 135:197~206)과 초음파 파쇄(sonication)를 통해 EpCAMscFv-HveA 어댑터와 gH에 HER2scFv 리간드를 발현되는 KOS-UL3/4_EpCAMscFv-HveA-gH_HER2scFv-EmGFP-gD-R222N/F223I 이중(dual) 표적화 바이러스(EADa-HgH-D)를 획득하였다.
<실시예 11> HER2 표적화 변형된 당단백질 gH를 갖고 EpCAM 표적화 어댑터를 발현하는 HSV-1의 이중 표적화 효과 실험
상기 실시예 10에서 제작된 EpCAMscFv-HveA 어댑터와 gH에 HER2scFv 리간드를 발현하는 KOS-UL3/4_EpCAMscFv-HveA-gH/HER2scFv-EmGFP-gD-R222N/F223I 듀얼 타겟팅 바이러스(EADa-HgH-D)가 HER2와 EpCAM 단백질이 발현되는 세포에 감염을 유도하는지를 확인하기 위하여 다음과 같이 실험을 진행하였다.
실험에 사용된 세포주는 HER2와 EpCAM이 발현되지 않는 세포주(CHO-K1)와 HER2가 발현되는 세포주(CHO-HER2) 그리고 EpCAM이 발현되는 세포주(CHO-EpCAM)이다. 중국 햄스터 난소 세포주인 CHO-K1, CHO-HER2, CHO-EpCAM (Kuroki M et al., J Biol Chem. 1991. 74:10132-10141)는 HaM's F-12K 배지(Welgene))에 100 U/ml 페니실린/100 μg/ml 스트렙토마이신 (Welgene)와 10% FBS(fetal bovine serum)를 사용하여 배양하였다.
특이적 바이러스 감염을 위하여 2.5×104의 CHO-K1, CHO-HER2, CHO-EpCAM 세포주들을 96 well 플레이트에 깔아준다. 24시간이 지난 후, 상기 실시예 4에서 제작된 HER2 이중 표적화 바이러스(HADa-HgH-D), 상기 실시예 5에서 제작된 EpCAM 이중 표적화 바이러스(EADa-EgH-D) 그리고 상기 실시예 10에서 제작된 HER2/EpCAM 이중(dual) 표적화 바이러스(EADa-HgH-D)를 각각 5 MOI를 감염시켰다. 90분 후, 잔류하는 초기 바이러스 및 어댑터를 제거하기 위하여 새로운 배지로 교체하였다. 감염 2일 후, 형광 발현으로 각각의 세포주에 바이러스 감염을 형광현미경으로 관찰하였다(BaeK HJ et al., Mol Ther. 2011. 19(3):507-514).
결과를 도 20에 나타내었다. 도 20에서 확인되는 바와 같이 각각의 바이러스가 세포주에 감염된 현상을 형광현미경으로 촬영한 사진을 나타내었다. HER2와 EpCAM이 발현하지 않는 CHO-K1 세포주에는 모든 바이러스가 감염되지 않은 것을 관찰하였다. HER2 이중 표적화 바이러스(HADa-HgH-D)는 CHO-HER2에만 감염되었고, EpCAM 이중 표적화 바이러스(EADa-EgH-D)는 CHO-EpCAM에서만 감염이 되었다. 하지만, HER2/EpCAM 이중(dual) 표적화 바이러스(EADa-HgH-D)는 CHO-HER2와 CHO-EpCAM 세포 모두에서 감염을 확인하였다. 이 결과를 통하여 2가지 표적분자를 함께 표적화할 수 있는 바이러스에 의한 2가지 이상의 표적분자를 표적화하는 전략의 가능성을 확인할 수 있었다.
<실시예 12> HER2 및 EpCAM 이중(dual) 표적화 어댑터를 발현하는 HSV-1의 이중 표적화 효과 실험
상기 실시예 3에서 제작된 EpCAMscFv-HveA 어댑터와 HER2scFv-HveA 어댑터를 같이 발현하는 HER2 및 EpCAM 이중(dual) 표적화 바이러스 (EADa-HADa-D)가 HER2와 EpCAM 단백질이 발현되는 세포에 감염을 유도하는지를 확인하기 위하여 다음과 같이 실험을 진행하였다.
실험에 사용된 세포주는 HER2와 EpCAM이 발현되지 않는 세포주(CHO-K1)와 HER2가 발현되는 세포주(CHO-HER2) 그리고 EpCAM이 발현되는 세포주(CHO-EpCAM)이다. 중국 햄스터 난소 세포주인 CHO-K1, CHO-HER2, CHO-EpCAM (Kuroki M et al., J Biol Chem. 1991. 74:10132-10141)는 HaM's F-12K 배지(Welgene))에 100 U/ml 페니실린/100 μg/ml 스트렙토마이신 (Welgene)와 10% FBS(fetal bovine serum)를 사용하여 배양하였다.
특이적 바이러스 감염을 위하여 2.5×104의 CHO-K1, CHO-HER2, CHO-EpCAM 세포주들을 96 well 플레이트에 깔아준다. 24시간이 지난 후, 상기 실시예 3에서 제작된 HER2scFv-HveA 어댑터만을 발현하는 바이러스(HADa-S)와 EpCAMscFv-HveA 어댑터만을 발현하는 바이러스(EADa-S) 그리고 EpCAMscFv-HveA 어댑터와 HER2scFv-HveA 어댑터를 같이 발현하는 이중 표적화 바이러스(EADa-HADa-D)를 각각 5 MOI를 감염시켰다. 90분 후, 잔류하는 초기 바이러스 및 어댑터를 제거하기 위하여 새로운 배지로 교체하였다. 감염 2일 후, 형광 발현으로 각각의 세포주에 바이러스 감염을 형광현미경으로 관찰하였다(BaeK HJ et al., Mol Ther. 2011. 19(3):507-514).
결과를 도 21에 각각의 바이러스가 세포주에 감염된 현상을 형광현미경으로 촬영한 사진을 나타내었다. HER2와 EpCAM이 발현하지 않는 CHO-K1 세포주에는 모든 바이러스가 감염되지 않은 것을 관찰하였다. HER2scFv-HveA 어댑터만을 발현하는 바이러스(HADa-S)는 CHO-HER2에만 감염되었고, EpCAMscFv-HveA 어댑터만을 발현하는 바이러스(EADa-S)는 CHO-EpCAM에서만 감염이 되었다. 하지만, EpCAMscFv-HveA 어댑터와 HER2scFv-HveA 어댑터를 같이 발현하는 이중 표적화 바이러스(EADa-HADa-D)는 CHO-HER2와 CHO-EpCAM 세포 모두에서 감염을 확인하였다.
이 결과를 통하여 2가지 표적분자를 함께 표적화할 수 있는 어댑터를 발현하는 바이러스에 의한 2가지 이상의 표적분자를 표적화하는 전략의 가능성을 확인할 수 있었다.

Claims (46)

  1. 헤르페스 심플렉스 바이러스의 증식을 저해하지 않으면서 그 게놈에, 암세포 표적분자에 특이적으로 결합하는 표적화 영역과 HVEM의 세포외 도메인의 융합 단백질이 다중으로 발현될 수 있도록 그 융합 단백질의 발현 카세트가 하나 이상 삽입되어 있는, 다중 표적화 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 융합 단백질의 발현 카세트는 2개 이상의 융합 단백질 유전자를 포함하고 이들 유전자 사이에 IRES(Internal Ribosome Entry Site) 또는 2A 펩타이드 암호화하는 핵산 서열이 위치하는 폴리시스트론(polycistron) 구성을 갖는, 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 융합 단백질의 발현 카세트는 모노시트론(monocistron) 구성을 가지고 2개 이상 상기 바이러스 게놈에 삽입되어 있는, 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 다중으로 발현되는 융합 단백질은 (i) 모두 동일한 표적분자에 특이적으로 결합하는 표적화 영역을 갖거나, (ii) 서로 다른 표적분자에 특이적으로 결합하는 서로 다른 표적화 영역을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 HVEM의 세포외 도메인은 서열번호 8 또는 9의 아미노산 서열로 이루어진 HveA82, 서열번호 10또는 11의 아미노산 서열로 이루어진 HveA87, 서열번호 12 또는 13의 아미노산 서열로 이루어진 HveA102 또는 서열번호 14 또는 15의 아미노산 서열로 이루어진 HveA107인 것을 특징으로 하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 융합 단백질은 그 암세포 표적화 영역과 그 HVEM(HveA)의 세포외 도메인은 1 내지 30개 아미노산으로 이루어진 링커 펩티드에 의해 연결되어 있는 융합 단백질이고,
    상기 링커 펩티드의 아미노산은 Ser, Gly, Ala 및 Thr 중 하나 이상의 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 표적분자는 암세포에서만 발현되거나 정상세포에 비해 암세포에서 과발현되는 암세포 표면의 항원 또는 수용체인 것을 특징으로 하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 항원 또는 수용체는 EGFRvⅢ, EGFR, 메타스틴 수용체(Metastin receptor), 수용체 타이로신 카이나제(Receptor tyrosine kinases), HER2(Human epidermal growth factor receptor 2), 타이로신 카이나제-18-수용체(c-Kit), HGF 수용체 c-Met, CXCR4, CCR7, 엔도테린-A 수용체, PPAR-δ(peroxisome proliferator activated receptor δ), PDGFR-α(Platelet-derived growth factor receptor α), CD133, CEA(carcinoembryonic antigen), EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule), MSLN(Mesothelin), GD2(disialoganglioside), GPC3(Glypican 3), PSMA(Prostate Specific Membrane Antigen), TAG-72(tumor-associated glycoprotein 72), GD3(disialoganglioside), HLA-DR(human leukocyte antigen-DR), MUC1(Mucin 1), NY-ESO-1(New York esophageal squamous cell carcinoma 1), LMP1(Latent membrane protein 1), TRAILR2(tumor-necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor), VEGFR2(vascular endothelial growth factor receptor 2), HGFR(hepatocyte growth factor receptor), CD44 또는 CD166인 것을 특징으로 하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 표적분자는 HER2이고,
    상기 표적화 영역은 서열번호 4의 VH와 서열번호 5의 VL이 링커 펩티드를 매개로 VH, 링커 펩티드, VL 순서로 연결된 scFv인 것을 특징으로 하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 표적분자는 EpCAM이고,
    상기 표적화 영역은 서열번호 6의 VL와 서열번호 7의 VH이 링커 펩티드를 매개로 VL, 링커 펩티드, VH 순서로 연결된 scFv인 것을 특징으로 하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스는 서열번호 16의 gD(glycoprotein D) 아미노산 서열 222번 위치의 아르기닌(arginine, R)과 223번 위치의 페닐알라닌(phenylalanime, F)이 각각 아스파라긴(asparagine, N)과 이소루신(isoleucine, I)로 치환된 것을 특징으로 하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스는 재조합 HSV-1 바이러스, 재조합 HSV-2 바이러스, 또는 HSV-1와 HSV-2 키메라 바이러스인 것을 특징으로 하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스는 HSV-1 KOS 균주로부터 유래된 재조합 HSV-1인 특징으로 하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스에는 헤르페스 심플렉스 바이러스의 증식을 저해하지 않으면서 그 게놈에, (i) 사이토카인, (ii) 케모카인, (iii) 면역관문(immune checkpoint)에 대한 길항제, (iv) 면역세포의 활성화를 유도할 수 있는 보조 자극 인자(co-stimulatory factor), (v) 암세포에 대한 면역반응을 억제하는 TGFβ에 대항 길항제, (vi) 고형암 종양미세환경을 구성하는 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(heparan sulfate proteoglycan)을 분해할 수 있는 헤파라나아제(heparanase), (vii) 혈관 신생 인자 수용체인 VEGFR-2(VEGF receptor-2)의 기능을 저해할 수 있는 길항제, 및 (viii) 프로드럭(prodrug)을 암세포에 독성을 나타내는 약물(drug)으로 전환시켜주는 프로드럭 활성화 효소(prodrug-activating enzymes) 중에 선택된 것을 발현하는 발현 카세트가 추가로 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 사이토카인은 IL-2, IL-4, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, IL-24 등의 인터류킨, IFNα, IFNβ, IFNγ 등의 인터페론, TNFα 등의 종양 괴사 인자, GM-CSF, G-CSF 및 FLT3L 중 하나 이상이고,
    상기 케모카인은 CCL2, RANTES, CCL7, CCL9, CCL10, CCL12, CCL15, CCL19, CCL21, CCL20 및 XCL-1 중 하나 이상이며,
    상기 면역관문은 PD-1(programmed cell death-1), PD-L1(programmed cell deathligand 1), PD-L2(programmed cell death-ligand 2), CD27(cluster of differentiation 27), CD28(cluster of differentiation 28), CD70(cluster of differentiation 70), CD80(cluster of differentiation 80), CD86(cluster of differentiation 86), CD137(cluster of differentiation 137), CD276(cluster of differentiation 276), KIRs(killer-cell immunoglobulin-like receptors), LAG3(lymphocyte-activation gene 3), GITR(glucocorticoid-induced TNFR-related protein), GITRL(glucocorticoid-induced TNFR-related protein ligand) 및 CTLA-4(cytolytic T lymphocyte associated antign-4) 중 하나 이상이며,
    상기 보조 자극 인자는 CD2, CD7, LIGHT, NKG2C,CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, LFA-1(림프구 기능 연관 항원-1), ICOS(유도성 T 세포 공동자극인자), CD3γ, CD3δ 및 CD3ε 중 하나 이상이며,
    상기 프로드럭 활성화 효소(prodrug-activating enzymes)는 시토신 디아민나아제(Cytosine deaminase), 랫드 사이토크롬 P450(rat cytochrome P450, CYP2B1), 카르복실에스터라제(carboxylesterase), 세균 니트로리덕타아제(bacterial nitroreductase) 및 대장균에서 분리된 PNP(purine nucleoside phosphorylase) 중 하나 이상인 것을 특징으로 하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 융합 단백질의 발현 카세트는 상기 바이러스 게놈에, UL3와 UL4 유전자 사이, UL26과 UL27 유전자 사이, UL37과 UL38 유전자 사이, UL48과 UL49 유전자 사이, UL53과 UL54 유전자 사이, US1과 US2 사이에 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  17. 제14항에 있어서,
    상기 발현 카세트가 상기 바이러스 게놈에, UL3와 UL4 유전자 사이, UL26과 UL27 유전자 사이, UL37과 UL38 유전자 사이, UL48과 UL49 유전자 사이, UL53과 UL54 유전자 사이, US1과 US2 사이에 삽입되어 있되, 상기 융합 단백질의 발현 카세트와는 다른 위치에 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  18. 제1항에 있어서,
    상기 융합 단백질은 NH2-암세포 표적화 도메인-HVEM 세포외 도메인-COOH 순이거나 그 역순인 것을 특징으로 하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  19. 제1항에 있어서,
    상기 융합 단백질은 암세포 표적화 영역과 HVEM의 세포외 도메인이 링커 펩타이드를 매개로 연결되고, 상기 융합 단백질은 NH2-암세포 표적화 영역-링커 펩타이드-HVEM 세포외 도메인-COOH 순이거나 그 역순인 것을 특징으로 하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  20. 헤르페스 심플렉스 바이러스의 증식을 저해하지 않으면서 (i) 그 게놈에, 암세포 표적분자에 특이적으로 결합하는 표적화 영역과 HVEM의 세포외 도메인의 융합 단백질인 어댑터를 발현할 수 있는 발현 카세트가 하나 이상 삽입되어 있고, 또한 (ii) 그 당단백질에, 암세포 표적분자에 특이적으로 결합하는 표적화 영역이 삽입되어 융합되어 있는, 다중 표적화 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 당단백질은 gB, gC, gD 또는 gH인 것을 특징으로 하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  22. 제20항에 있어서,
    상기 당단백질은 gB이고,
    상기 당단백질에 삽입되어 융합되어 있는 표적화 영역은 서열번호 1의 gB 아미노산 서열에서, N-말단, 아미노산 31번 내지 78번 영역 내의 임의의 위치, 아미노산 80번 내지 363번 영역 내의 임의의 위치 또는 아미노산 408번 내지 896번 영역 내의 위치에 삽입되어 융합되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  23. 제20항에 있어서,
    상기 당단백질은 gB이고,
    상기 당단백질에 삽입되어 융합되어 있는 표적화 영역은 서열번호 1의 gB 아미노산 서열에서 N-말단, 43번 아미노산 다음 위치, 52번 아미노산 다음 위치, 70번 아미노산 다음 위치, 76번 아미노산 다음 위치, 80번 아미노산 다음 위치, 81번 아미노산 다음 위치, 95번 아미노산 다음 위치, 100번 아미노산 다음 위치, 137번 아미노산 다음 위치, 185번 아미노산 다음 위치, 187번 아미노산 다음 위치, 241번 아미노산 다음 위치, 261번 아미노산 다음 위치, 265번 아미노산 다음 위치, 304번 아미노산 다음 위치, 334번 아미노산 다음 위치, 361번 아미노산 다음 위치, 408번 아미노산 다음 위치, 419번 아미노산 다음 위치, 430번 아미노산 다음 위치, 458번 아미노산 다음 위치, 470번 아미노산 다음 위치, 481번 아미노산 다음 위치, 495번 아미노산 다음 위치, 497번 아미노산 다음 위치, 546번 아미노산 다음 위치, 608번 아미노산 다음 위치, 630번 아미노산 다음 위치, 663번 아미노산 다음 위치, 664번 아미노산 다음 위치, 665번 아미노산 다음 위치, 671번 아미노산 다음 위치, 673번 아미노산 다음 위치, 690번 아미노산 다음 위치, 725번 아미노산 다음 위치, 730번 아미노산 다음 위치, 732번 아미노산 다음 위치, 742번 아미노산 다음 위치, 772번 아미노산 다음 위치, 868번 아미노산 다음 위치, 869번 아미노산 다음 위치, 886번 아미노산 다음 위치, 893번 아미노산 다음 위치, 894번 아미노산 다음 위치, 895번 아미노산 다음 위치에 삽입되어 융합되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  24. 상기 당단백질은 gC이고,
    상기 당단백질에 삽입되어 융합되어 있는 표적화 영역은 서열번호 2의 gC 아미노산 서열에서 33번 내지 154번 영역 내의 위치에 삽입되어 융합되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  25. 제20항에 있어서,
    상기 당단백질은 gC이고,
    상기 당단백질에 삽입되어 융합되어 있는 표적화 영역은 서열번호 2의 gC 아미노산 서열에서
    33번 아미노산 다음 위치, 82번 아미노산 다음 위치, 148번 아미노산 다음 위치, 149번 아미노산 다음 위치, 153번 아미노산 다음 위치에 삽입되어 융합되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  26. 제20항에 있어서,
    상기 당단백질은 gH이고,
    상기 당단백질에 삽입되어 융합되어 있는 표적화 영역은 서열번호 3의 gD 아미노산 서열에서, N-말단, 아미노산 12번 내지 88번 영역 내의 위치, 아미노산 116번 내지 137번 영역 내의 위치 또는 아미노산 209번 내지 839번 영역 내의 위치에 삽입되어 융합되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  27. 제20항에 있어서,
    상기 당단백질은 gH이고,
    상기 당단백질에 삽입되어 융합되어 있는 표적화 영역은 서열번호 3의 gD 아미노산 서열에서, N-말단, 아미노산 12번 내지 49번 영역 내의 위치 또는 아미노산 116번 내지 137번 영역 내의 위치일 수 있다. 또 바람직한 위치는 12번 아미노산 다음 위치, 22번 아미노산 다음 위치, 23번 아미노산 다음 위치, 29번 아미노산 다음 위치, 83번 아미노산 다음 위치, 116번 아미노산 다음 위치, 209번 아미노산 다음 위치, 215번 아미노산 다음 위치, 225번 아미노산 다음 위치, 277번 아미노산 다음 위치, 386번 아미노산 다음 위치, 437번 아미노산 다음 위치, 447번 아미노산 다음 위치, 472번 아미노산 다음 위치, 636번 아미노산 다음 위치, 637번 아미노산 다음 위치, 666번 아미노산 다음 위치, 731번 아미노산 다음 위치, 763번 아미노산 다음 위치, 764번 아미노산 다음 위치, 775번 아미노산 다음 위치, 806번 아미노산 다음 위치, 824번 아미노산 다음 위치, 838번 아미노산 다음 위치에 삽입되어 융합되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  28. 제20항에 있어서,
    상기 융합 단백질의 표적화 영역과 상기 삽입되어 융합되어 있는 표적화 영역은 (i) 모두 동일한 표적분자에 특이적으로 결합하는 표적화 영역을 갖거나, (ii) 서로 다른 표적분자에 특이적으로 결합하는 서로 다른 표적화 영역을 가진 것을 특징으로 하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  29. 제20항에 있어서,
    상기 HVEM의 세포외 도메인은 서열번호 8 또는 9의 아미노산 서열로 이루어진 HveA82, 서열번호 10또는 11의 아미노산 서열로 이루어진 HveA87, 서열번호 12 또는 13의 아미노산 서열로 이루어진 HveA102 또는 서열번호 14 또는 15의 아미노산 서열로 이루어진 HveA107인 것을 특징으로 하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  30. 제20항에 있어서,
    상기 융합 단백질은 그 암세포 표적화 영역과 그 HVEM(HveA)의 세포외 도메인은 1 내지 30개 아미노산으로 이루어진 링커 펩티드에 의해 연결되어 있는 융합 단백질이고,
    상기 링커 펩티드의 아미노산은 Ser, Gly, Ala 및 Thr 중 하나 이상의 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  31. 제20항에 있어서,
    상기 표적분자는 암세포에서만 발현되거나 정상세포에 비해 암세포에서 과발현되는 암세포 표면의 항원 또는 수용체인 것을 특징으로 하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  32. 제31항에 있어서,
    상기 항원 또는 수용체는 EGFRvⅢ, EGFR, 메타스틴 수용체(Metastin receptor), 수용체 타이로신 카이나제(Receptor tyrosine kinases), HER2(Human epidermal growth factor receptor 2), 타이로신 카이나제-18-수용체(c-Kit), HGF 수용체 c-Met, CXCR4, CCR7, 엔도테린-A 수용체, PPAR-δ(peroxisome proliferator activated receptor δ), PDGFR-α(Platelet-derived growth factor receptor α), CD133, CEA(carcinoembryonic antigen), EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule), MSLN(Mesothelin), GD2(disialoganglioside), GPC3(Glypican 3), PSMA(Prostate Specific Membrane Antigen), TAG-72(tumor-associated glycoprotein 72), GD3(disialoganglioside), HLA-DR(human leukocyte antigen-DR), MUC1(Mucin 1), NY-ESO-1(New York esophageal squamous cell carcinoma 1), LMP1(Latent membrane protein 1), TRAILR2(tumor-necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor), VEGFR2(vascular endothelial growth factor receptor 2), HGFR(hepatocyte growth factor receptor), CD44 또는 CD166인 것을 특징으로 하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  33. 제20항에 있어서,
    상기 당당단백질에 삽입되어 융합되는 표적화 영역이 특이적으로 결합하는 표적분자는 HER2이고,
    상기 당당단백질에 삽입되어 융합되는 표적화 영역은 서열번호 4의 VH와 서열번호 5의 VL이 링커 펩티드를 매개로 VH, 링커 펩티드, VL 순서로 연결된 scFv인 것을 특징으로 하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  34. 제20항에 있어서,
    상기 당당단백질에 삽입되어 융합되는 표적화 영역이 특이적으로 결합하는 표적분자는 EpCAM이고,
    상기 표적화 영역은 서열번호 6의 VL와 서열번호 7의 VH이 링커 펩티드를 매개로 VL, 링커 펩티드, VH 순서로 연결된 scFv인 것을 특징으로 하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  35. 제20항에 있어서,
    상기 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스는 서열번호 16의 gD(glycoprotein D) 아미노산 서열 222번 위치의 아르기닌(arginine, R)과 223번 위치의 페닐알라닌(phenylalanime, F)이 각각 아스파라긴(asparagine, N)과 이소루신(isoleucine, I)로 치환된 것을 특징으로 하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  36. 제20항에 있어서,
    상기 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스는 재조합 HSV-1 바이러스, 재조합 HSV-2 바이러스, 또는 HSV-1와 HSV-2 키메라 바이러스인 것을 특징으로 하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  37. 제20항에 있어서,
    상기 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스는 HSV-1 KOS 균주로부터 유래된 재조합 HSV-1인 특징으로 하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  38. 제20항에 있어서,
    상기 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스에는 헤르페스 심플렉스 바이러스의 증식을 저해하지 않으면서 그 게놈에, (i) 사이토카인, (ii) 케모카인, (iii) 면역관문(immune checkpoint)에 대한 길항제, (iv) 면역세포의 활성화를 유도할 수 있는 보조 자극 인자(co-stimulatory factor), (v) 암세포에 대한 면역반응을 억제하는 TGFβ에 대항 길항제, (vi) 고형암 종양미세환경을 구성하는 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(heparan sulfate proteoglycan)을 분해할 수 있는 헤파라나아제(heparanase), (vii) 혈관 신생 인자 수용체인 VEGFR-2(VEGF receptor-2)의 기능을 저해할 수 있는 길항제, 및 (viii) 프로드럭(prodrug)을 암세포에 독성을 나타내는 약물(drug)으로 전환시켜주는 프로드럭 활성화 효소(prodrug-activating enzymes) 중에 선택된 것을 발현하는 발현 카세트가 추가로 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  39. 제38항에 있어서,
    상기 사이토카인은 IL-2, IL-4, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, IL-24 등의 인터류킨, IFNα, IFNβ, IFNγ 등의 인터페론, TNFα 등의 종양 괴사 인자, GM-CSF, G-CSF 및 FLT3L 중 하나 이상이고,
    상기 케모카인은 CCL2, RANTES, CCL7, CCL9, CCL10, CCL12, CCL15, CCL19, CCL21, CCL20 및 XCL-1 중 하나 이상이며,
    상기 면역관문은 PD-1(programmed cell death-1), PD-L1(programmed cell deathligand 1), PD-L2(programmed cell death-ligand 2), CD27(cluster of differentiation 27), CD28(cluster of differentiation 28), CD70(cluster of differentiation 70), CD80(cluster of differentiation 80), CD86(cluster of differentiation 86), CD137(cluster of differentiation 137), CD276(cluster of differentiation 276), KIRs(killer-cell immunoglobulin-like receptors), LAG3(lymphocyte-activation gene 3), GITR(glucocorticoid-induced TNFR-related protein), GITRL(glucocorticoid-induced TNFR-related protein ligand) 및 CTLA-4(cytolytic T lymphocyte associated antign-4) 중 하나 이상이며,
    상기 보조 자극 인자는 CD2, CD7, LIGHT, NKG2C,CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, LFA-1(림프구 기능 연관 항원-1), ICOS(유도성 T 세포 공동자극인자), CD3γ, CD3δ 및 CD3ε 중 하나 이상이며,
    상기 프로드럭 활성화 효소(prodrug-activating enzymes)는 시토신 디아민나아제(Cytosine deaminase), 랫드 사이토크롬 P450(rat cytochrome P450, CYP2B1), 카르복실에스터라제(carboxylesterase), 세균 니트로리덕타아제(bacterial nitroreductase) 및 대장균에서 분리된 PNP(purine nucleoside phosphorylase) 중 하나 이상인 것을 특징으로 하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  40. 제20항에 있어서,
    상기 융합 단백질의 발현 카세트는 상기 바이러스 게놈에, UL3와 UL4 유전자 사이, UL26과 UL27 유전자 사이, UL37과 UL38 유전자 사이, UL48과 UL49 유전자 사이, UL53과 UL54 유전자 사이, US1과 US2 사이에 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  41. 제38항에 있어서,
    상기 발현 카세트가 상기 바이러스 게놈에, UL3와 UL4 유전자 사이, UL26과 UL27 유전자 사이, UL37과 UL38 유전자 사이, UL48과 UL49 유전자 사이, UL53과 UL54 유전자 사이, US1과 US2 사이에 삽입되어 있되, 상기 융합 단백질의 발현 카세트와는 다른 위치에 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  42. 제20항에 있어서,
    상기 융합 단백질은 NH2-암세포 표적화 도메인-HVEM 세포외 도메인-COOH 순이거나 그 역순인 것을 특징으로 하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  43. 제20항에 있어서,
    상기 융합 단백질은 암세포 표적화 영역과 HVEM의 세포외 도메인이 링커 펩타이드를 매개로 연결되고, 상기 융합 단백질은 NH2-암세포 표적화 영역-링커 펩타이드-HVEM 세포외 도메인-COOH 순이거나 그 역순인 것을 특징으로 하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  44. 제20항에 있어서,
    상기 융합 단백질의 발현 카세트는 2개 이상의 융합 단백질 유전자를 포함하고 이들 유전자 사이에 IRES(Internal Ribosome Entry Site) 또는 2A 펩타이드 암호화하는 핵산 서열이 위치하는 폴리시스트론(polycistron) 구성을 갖고, 1개가 사입되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항의 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스를 유효성분으로 포함하는 항암용 약제학적 조성물.
  46. 제45항에 있어서,
    상기 조성물은 암세포 표적화 영역과 HVEM의 세포외 도메인이 융합된 재조합 어댑터 분자를 추가로 포함하는 조성물.
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109735558B (zh) * 2018-12-12 2022-04-15 中南大学 一种重组car19-il24基因、慢病毒载体、car19-il24-t细胞及应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20090028971A (ko) * 2007-09-17 2009-03-20 재단법인 한국원자력의학원 헤르페스바이러스의 세포 감염 효율을 증가시키는 수용성재조합 단백질 ｓＨｖｅＡ 및 유전자 치료에 이의 적용
US20100233758A1 (en) * 2009-03-16 2010-09-16 Korea Institute Of Radiological & Medical Sciences Protein increasing cell infectivity of herpes simplex virus and use thereof
US20170035819A1 (en) * 2013-10-28 2017-02-09 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Oncolytic hsv vector
US20170035818A1 (en) * 2014-04-12 2017-02-09 Psioxus Therapeutics Limited Group b adenovirus modified in the e4orf4 region

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109642218A (zh) * 2016-06-09 2019-04-16 大学之母博洛尼亚大学 用于在细胞中增殖的具有经修饰的糖蛋白h的疱疹病毒
EP3886860A4 (en) 2018-11-29 2022-08-03 Virogin Biotech Canada Ltd HSV VECTOR WITH REDUCED NEUROTOXICITY

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20090028971A (ko) * 2007-09-17 2009-03-20 재단법인 한국원자력의학원 헤르페스바이러스의 세포 감염 효율을 증가시키는 수용성재조합 단백질 ｓＨｖｅＡ 및 유전자 치료에 이의 적용
KR100937774B1 (ko) 2007-09-17 2010-01-20 재단법인 한국원자력의학원 헤르페스바이러스의 세포 감염 효율을 증가시키는 수용성재조합 단백질 ｓＨｖｅＡ 및 유전자 치료에 이의 적용
US20100233758A1 (en) * 2009-03-16 2010-09-16 Korea Institute Of Radiological & Medical Sciences Protein increasing cell infectivity of herpes simplex virus and use thereof
US8318662B2 (en) 2009-03-16 2012-11-27 Korea Institute Of Radiological & Medical Sciences Protein increasing cell infectivity of herpes simplex virus and use thereof
US20170035819A1 (en) * 2013-10-28 2017-02-09 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Oncolytic hsv vector
US20170035818A1 (en) * 2014-04-12 2017-02-09 Psioxus Therapeutics Limited Group b adenovirus modified in the e4orf4 region

Non-Patent Citations (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Fields Virology", vol. 2, 2001, LIPPINCOTT WILLIAMS & WILKINS, pages: 2399 - 2460
"GenBank", Database accession no. AFE62894.1
ABDUL RASHEED BALOCH ET AL.: "Antibody mimetics: promising complementary agents to animal-sourced antibodies", CRITICAL REVIEWS IN BIOTECHNOLOGY, vol. 36, 2016, pages 268 - 275
AR FRAMTON JR: "HSV trafficking and development of gene therapy vectors with applications in the nervous system", GENE THERAPY, vol. 12, 2005, pages 891 - 901
ATANASIU D. ET AL., J. VIROL., vol. 7, no. 21, 8 November 2013 (2013-11-08), pages 11332 - 11345
BAEK H.J. ET AL., MOL. THER., vol. 19, no. 3, 2011, pages 507 - 514
BAEK, H. ET AL.: "Bispecific adapter-mediated retargeting of a receptor-restricted HSV-1 vector to CEA- bearing tumor cells", MOLECULAR THERAPY, vol. 19, no. 3, 2011, pages 507 - 514, XP055573299, DOI: 10.1038/mt.2010.207 *
BERNHARD HOMEY ET AL.: "Chemokines: Agents for the Immunotherapy of Cancer", NAT REV IMMUNOL, vol. 2, no. 3, March 2002 (2002-03-01), pages 175 - 84
CARTER P. ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA., vol. 89, no. 10, 1992, pages 4285 - 9
CHENWEI LI ET AL.: "Identification of Pancreatic Cancer Stem Cells", CANCER RES., vol. 67, no. 3, 1 February 2007 (2007-02-01), pages 1030 - 7, XP002461762, DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-06-2030
COLE PETERSSAMUEL D. RABKIN: "Designing herpes viruses as oncolytics", MOL. THER. ONCOLYTICS., vol. 2, 2015, pages 15010
DANNY N KHALIL ET AL.: "The Future of Cancer Treatment: Immunomodulation, CARs and Combination Immunotherapy", NAT REV CLIN ONCOL, vol. 13, no. 5, May 2016 (2016-05-01), pages 273 - 90, XP055548085, DOI: 10.1038/nrclinonc.2016.25
DHAVAL S. SANCHALA ET AL.: "Oncolytic Herpes Simplex Viral Therapy: A Stride Toward Selective Targeting of Cancer Cells", FRONT PHARMACOL, vol. 8, 16 May 2017 (2017-05-16), pages 270
E.U. LORENTZEN ET AL.: "Replication-Competent Herpes Simplex Virus Type 1 Mutant Expressing an Autofluorescent Glycoprotein H Fused protein", INTERVIROLOGY, vol. 44, 2001, pages 232 - 242, XP009185040, DOI: 10.1159/000050053
EDITH RENAUD-GABARDOS ET AL.: "Internal ribosome entry site-based vectors for combined gene therapy", WORLD J. EXP. MED., vol. 5, no. 1, 20 February 2015 (2015-02-20), pages 11 - 20, XP055815234, DOI: 10.5493/wjem.v5.i1.11
ERICK LIN ET AL.: "Random linker-insertion mutagenesis to identify functional domains of herpes simplex virus type 1 glycoprotein B", PROC. NATL. ACAD. SCI. USA., vol. 104, no. 32, 2007, pages 13140 - 13145, XP055294681, DOI: 10.1073/pnas.0705926104
GATTA V. ET AL.: "The Engineering of a Novel Ligand in gH Confers to HSV an Expanded Tropism Independent of gD Activation by Its Receptors", PLOS PATHOG, vol. 11, no. 5, 21 May 2015 (2015-05-21), pages e1004907, XP055198421, DOI: 10.1371/journal.ppat.1004907
GIERASCH W.W. ET AL., J. VIROL. METHODS., vol. 135, 2006, pages 197 - 206
GUOYING ZHOU ET AL.: "Engineered herpes simplex virus 1 is dependent on IL13R*2 receptor for cell entry and independent of glycoprotein D receptor interaction", PROC. NATL. ACAD. SCI. USA., vol. 99, no. 23, 2002, pages 15124 - 15129, XP002414023, DOI: 10.1073/pnas.232588699
HEERMANN R. ET AL., MICROB. CELL FACT., 2008, pages 14
HIROAKI UCHIDA ET AL.: "Generation of Herpesvirus Entry Mediator (HVEM)-restricted Herpes Simplex Virus Type 1 Mutant Viruses: Resistance of HVEM-expressing Cells and Identification of Mutations That Rescue nectin-1 Recognition", J. VIROL., vol. 83, no. 7, April 2009 (2009-04-01), pages 2951 - 61
HOLLIGER P.HUDSON P.J.: "Engineered antibody fragments and the rise of single domains", NAT. BIOTECHNOL., vol. 23, no. 9, September 2005 (2005-09-01), pages 1126 - 36, XP008076746, DOI: 10.1038/nbt1142
HORSBURGH B.C. ET AL., METHODS ENZYMOL., vol. 306, 1999, pages 337 - 352
JOHN R. GALLAGHER ET AL.: "Functional Fluorescent Protein Insertions in Herpes Simplex Virus gB Report on gB Conformation before and after Execution of Membrane Fusion", PLOS PATHOG., vol. 10, no. 9, 18 September 2014 (2014-09-18), pages e1004373, XP055294668, DOI: 10.1371/journal.ppat.1004373
JULIA O. JACKSON ET AL.: "Insertion Mutations in Herpes Simplex Virus 1 Glycoprotein H Reduce Cell Surface Expression, Slow the Rate of Cell Fusion, or Abrogate Functions in Cell Fusion and Viral Entry", JOURNAL OF VIROLOGY, vol. 84, no. 4, 2010, pages 2038 - 2046
KAORU TAMURA ET AL.: "Multimechanistic Tumor Targeted Oncolytic Virus Overcomes Resistance in Brain Tumors", MOL. THER., vol. 21, no. 1, 2013, pages 68 - 77, XP055369717, DOI: 10.1038/mt.2012.175
KIM ET AL.: "High Cleavage Efficiency of a 2A Peptide Derived from Porcine Teschovirus-1 in Human Cell Lines, Zebrafish and Mice", PLOS ONE, vol. 6, no. 4, 2011, pages e18556, XP055175691, DOI: 10.1371/journal.pone.0018556
KUROKI M ET AL., J. BIOL. CHEM., vol. 74, 1991, pages 10132 - 10141
MALISSEN N. ET AL., ONCOIMMUNOLOGY, vol. 8, no. 12, 2019, pages l665976
MARINELA CANDOLFI: "Evaluation of proapoptotic transgenes to use in combination with Flt3L in an immune-stimulatory gene therapy approach for Glioblastoma multiforme (GBM", J. FASEB J., vol. 22, 2008, pages 107713
MENOTTI, L. ET AL.: "HSV as a platform for the generation of retargeted, armed, and reporter-expressing oncolytic viruses", VIRUSES, vol. 10, no. 352, 2018, pages 1 - 29, XP055781971, DOI: 10.3390/v10070352 *
MICHELE ARDOLINO ET AL.: "Cytokine treatment in cancer immunotherapy", J. ONCOTARGET, ONCOTARGET., vol. 6, 14 August 2015 (2015-08-14), pages 23
MUYRERS J.P. ET AL., NUCLEIC ACIDS RES, vol. 27, no. 6, 1999, pages 1555 - 1557
MUYRERS J.P. ET AL., NUCLEIC ACIDS RES., vol. 27, no. 6, 1999, pages 1555 - 1557
PAOLA GRANDI ET AL.: "HSV-1 Virions Engineered for Specific Binding to Cell Surface Receptors", MOLECULAR THERAPY, vol. 9, no. 3, 2004, pages 419 - 427
PASERO C. ET AL., CURR. OPIN. PHARMACOL., vol. 2, no. 4, 2012, pages 478 - 85
PAUL E HUGHES ET AL.: "Targeted Therapy and Checkpoint Immunotherapy Combinations for the Treatment of Cancer", TRENDS IMMUNOL, vol. 37, no. 7, July 2016 (2016-07-01), pages 462 - 476, XP029622833, DOI: 10.1016/j.it.2016.04.010
PETROVIC B. ET AL., PLOS PATHOG, vol. 19, no. 4, 2017, pages e1006352
QING FAN: "Differential Effects on Cell Fusion Activity of Mutations in Herpes Simplex Virus 1 Glycoprotein B (gB) dependent on Whether a gD Receptor or a gB Receptor Is Overexpressed", JOURNAL OF VIROLOGY, vol. 83, no. 15, August 2009 (2009-08-01), pages 7384 - 7390
RENATE KUNERTDAVID REINHART: "Advances in recombinant antibody manufacturing", APPL. MICROBIOL. BIOTECHNOL., vol. 100, no. 8, April 2016 (2016-04-01), pages 3451 - 61, XP035870818, DOI: 10.1007/s00253-016-7388-9
ROBIN H. LACHMANN: "Herpes simplex virus-based vectors", INT. J. EXP. PATHOL., vol. 85, no. 4, August 2004 (2004-08-01), pages 177 - 1901
SARAH A CONNOLLY ET AL.: "Structure-based Analysis of the Herpes Simplex Virus Glycoprotein D Binding Site Present on Herpesvirus Entry Mediator HveA (HVEM", J. VIROL., vol. 76, no. 21, November 2002 (2002-11-01), pages 10894 - 904, XP055186165, DOI: 10.1128/JVI.76.21.10894-10904.2002
SHUI J.W.KRONENBERG M, GUT MICROBES, vol. 4, no. 2, 2013, pages 146 - 151
SHUO MA ET AL.: "Current Progress in CAR-T Cell Therapy for Solid Tumors", INT. J. BIOL. SCI., vol. 15, no. 12, 7 September 2019 (2019-09-07), pages 2548 - 2560
SMITH KO, PROC. SOC. EXP. BIOL. MED., vol. 115, 1964, pages 814 - 816
STUART J. MACDONALD ET AL.: "Genome Sequence of Herpes Simplex Virus 1 Strain KOS", J. VIROL., vol. 86, no. 11, June 2012 (2012-06-01), pages 6371 - 2, XP055717351, DOI: 10.1128/JVI.00646-12
SUBAK-SHARPE J. H.DARGAN D. J.: "HSV Molecular Biology", GENERAL ASPECTS OF HERPES SIMPLEX VIRUS MOLECULAR BIOLOGY VIRUS GENES, vol. 16, no. 3, 1998, pages 239 - 251, XP009076468, DOI: 10.1023/A:1008068902673
SZYMCZAK ET AL.: "Development of 2A peptide-based strategies in the design of polycistronic vectors", EXPERT OPIN. BIOL. THER., vol. 5, 2005, pages 627 - 638
T. COLLINS ET AL.: "Prospective Identification of Tumorigenic Prostate Cancer Stem Cells", CANCER RES., vol. 65, no. 23, 1 December 2005 (2005-12-01), pages 10946 - 51, XP008128778, DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-05-2018
TIFFANY A. ET AL., J. VIROL METHODS., vol. 231, 2015, pages 18 - 25
TINA M. CAIRNS ET AL.: "Structure-Function Analysis of Herpes Simplex Virus Type 1 gD and gH-gL: Clues from gDgH Chimeras", JOURNAL OF VIROLOGY, June 2003 (2003-06-01), pages 6731 - 6742, XP055198259, DOI: 10.1128/JVI.77.12.6731-6742.2003
TRAVIS J. TAYLORDAVID M. KNIPE: "Proteomics of Herpes Simplex Virus Replication Compartments: Association of Cellular DNA Replication, Repair, Recombination, and Chromatin-Remodeling Proteins with ICP8", J. VIROL., vol. 78, no. 11, June 2004 (2004-06-01), pages 5856 - 5866
UCHIDA H ET AL., J. VIROL., vol. 83, no. 7, 2009, pages 2951 - 2961
WILLIAM F GOINS: "Retargeting of Herpes Simplex Virus (HSV) Vectors", CURR. OPIN. VIROL., 21 December 2016 (2016-12-21), pages 93 - 101, XP055319623, DOI: 10.1016/j.coviro.2016.08.007
WILLUDA J. ET AL., CANCER RES., vol. 59, no. 22, 1999, pages 5758 - 67
XIAODAN WANG: "Targeted gene transfer to nigrostriatal neurons in the rat brain by helper virus-free HSV-1 vector particles that contain either a chimeric HSV-1 glycoprotein C-GDNF or a gC-BDNF protein", BRAIN RES. MOL. BRAIN RES., vol. 9, no. 1, 13 September 2005 (2005-09-13), pages 88 - 102
XIAOWEN YU ET AL.: "Beyond Antibodies as Binding Partners: The Role of Antibody Mimetics in Bioanalysis", ANNUAL REVIEW OF ANALYTICAL CHEMISTRY, vol. 10, 2017, pages 293 - 320

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