CN111936622A - 重组痘苗病毒和包含其的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含sPD‑1编码基因或透明质酸酶编码基因的重组痘苗病毒，以及涉及包含该重组痘苗病毒的药物组合物。根据本发明的包含癌症治疗基因并且K3L、TK或VGF基因表达被抑制的重组痘苗病毒具有优异的抗肿瘤作用。因此，本发明的重组痘苗病毒可有利地用于癌症治疗。

Description

重组痘苗病毒和包含其的药物组合物
技术领域
本发明涉及包含癌症治疗基因的重组痘苗病毒，以及包含该重组痘苗病毒的药物组合物。
背景技术
近来，出于开发癌症治疗剂的目的，对通过遗传操作各种病毒而修饰的溶瘤病毒积极地进行了研究。然而，溶瘤病毒的问题尚未完全解决。例如，为了开发成抗癌剂，通过遗传操作产生了具有肿瘤选择性复制能力的病毒。但是，发现了以下问题：这种病毒不仅杀伤癌细胞，还杀伤正常细胞，并且抗癌作用不足。因此，存在对于开发使溶瘤病毒对癌细胞的选择性和功效增加而同时对正常细胞的影响最小化的技术的持续需求。
另一方面，痘苗病毒是具有编码约200个独立基因的约200kbp双链线性基因组DNA的包膜DNA病毒。痘苗病毒由Edward Jenner于18世纪首次用作天花的预防性疫苗。从那时起，痘苗病毒被开发成各种预防性疫苗。在早期的痘苗病毒疫苗中，使用了野生型病毒，接种疫苗的患者表现出严重的副作用，例如全身感染或进行性感染。因此，为了减少副作用，开发了毒性减弱的改良痘苗病毒，例如改良安卡拉痘苗(MVA)、LC16m8(源自利斯特(Lister)株)和纽约痘苗病毒(NYVAC，源自哥本哈根痘苗株)。基于这些痘苗病毒，已经开发了适用于各种疾病的疫苗。特别是，还正在将痘苗病毒(例如西储株(WR)、NYVAC株、惠氏(Wyeth)株和利斯特株)开发为溶瘤病毒。
发明内容
技术问题
本发明的目的是提供一种重组痘苗病毒以及包含作为活性成分的所述重组痘苗病毒的用于预防或治疗癌症的药物组合物，所述重组痘苗病毒包含癌症治疗基因并且任选地其中某些基因的表达被抑制。
技术方案
为了实现上述目的，本发明提供了一种重组痘苗病毒，所述重组痘苗病毒包含选自由可溶性程序化细胞死亡蛋白-1(sPD-1)编码基因、透明质酸酶编码基因及其组合组成的组中的任一种。
另外，本发明提供了用于预防或治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含作为活性成分的重组痘苗病毒。
另外，本发明提供了一种预防或治疗癌症的方法，所述方法包括以下步骤：将包含作为活性成分的重组痘苗病毒的组合物给药至个体。
有益效果
根据本发明，包含癌症治疗基因并且任选地其中某些基因的表达被抑制的重组痘苗病毒具有优异的抗肿瘤作用。因此，本发明的重组痘苗病毒可有效地用于治疗癌症。
附图说明
图1示出了缺失VGF、TK和K3L的IHD-W痘苗病毒(IHD-W-VV01)的基因结构的示意图。与病毒基因缺失和治疗基因导入有关的缩写术语具有如下表1所示的含义。
[表1]
Figure BDA0002693042930000031
图2示出了缺失VGF、TK和K3L并且插入有sPD1-Fc基因的IHD-W-VV02的基因结构的示意图。
图3示出了通过对IHD-W-VVO2 gDNA的PCR产物进行电泳获得的结果，该结果确认已经插入了sPD1-Fc基因。
图4示出了通过对感染了IHD-W-VVO2的HeLa细胞所分泌的蛋白质进行蛋白质印迹而获得的结果，该结果显示已经表达了sPD1-Fc基因。
图5示出了缺失VGF、TK和K3L并且插入有PH20基因的IHD-W-VV03的基因结构的示意图。
图6示出了通过对IHD-W-VV03 gDNA的PCR产物进行电泳获得的结果，该结果显示已经插入了PH20基因。
图7示出了通过对感染了IHD-W-VV03的HeLa细胞所分泌的蛋白质进行蛋白质印迹而获得的结果，该结果显示已经表达了PH20基因。
图8示出了缺失VGF、TK和K3L并且插入有IL-12基因的IHD-W-VV04的基因结构的示意图。
图9示出了通过对IHD-W-VV04 gDNA的PCR产物进行电泳获得的结果，该结果显示已经插入了IL-12基因。
图10示出了通过对感染了IHD-W-VV04的HeLa细胞所分泌的蛋白质进行蛋白质印迹而获得的结果，该结果显示已经表达了IL-12基因。
图11示出了缺失VGF、TK和K3L并且插入有sPD1-Fc和PH20基因的IHD-W-VV05的基因结构的示意图。
图12示出了通过对IHD-W-VV05 gDNA的PCR产物进行电泳而获得的结果，该结果确认了已经插入了sPD1-Fc和PH20基因。
图13示出了通过对感染了IHD-W-VV05的HeLa细胞所分泌的蛋白质进行蛋白质印迹而获得的结果，该结果显示已经表达了sPD1-Fc和PH20基因。
图14示出了缺失VGF、TK和K3L并且插入有sPD1-Fc、PH20和IL-12基因的IHD-W-VV06的基因结构的示意图。
图15示出了通过对IHD-W-VV06 gDNA的PCR产物进行电泳而获得的结果，该结果确认了已经插入了sPD1-Fc、PH20和IL-12基因。
图16示出了通过对感染了IHD-W-VV06的HeLa细胞所分泌的蛋白质进行蛋白质印迹而获得的结果，该结果显示已经表达了sPD1-Fc、PH20和IL-12基因。
图17示出了VGF、TK和K3L的表达失活的WR痘苗病毒(WR-VV01)的基因结构的示意图。与病毒基因失活和治疗基因导入有关的缩写术语具有如下表2所示的含义。
[表2]
Figure BDA0002693042930000041
图18示出了VGF、TK和K3L的表达失活并且插入有sPD1-Fc、PH20和IL-12基因的WR-VV06的基因结构的示意图。
图19示出了通过对WR-VV06gDNA的PCR产物进行电泳而获得的结果，该结果显示已经插入了sPD1-Fc、PH20和IL-12基因。
图20a示出了通过对感染了WR-VV06的HeLa细胞所分泌的蛋白质进行蛋白质印迹而获得的结果，该结果显示已经表达了sPD1-Fc、PH20基因。
图20b示出了通过对感染了WR-VV06的HeLa细胞所分泌的蛋白质进行ELISA而获得的结果，该结果显示已经表达了IL-12基因。
图21示出了缺失VGF、TK和K3L的利斯特痘苗病毒(Lister-VV01)的基因结构的示意图。与病毒基因缺失和治疗基因导入有关的缩写术语具有如下表3所示的含义。
[表3]
Figure BDA0002693042930000051
图22示出了缺失VGF、TK和K3L并且插入有sPD1-Fc、PH20和IL-12基因的Lister-VV06的基因结构的示意图。
图23示出了通过对Lister-VV06 gDNA的PCR产物进行电泳获得的结果，该结果显示已经插入了sPD1-Fc、PH20和IL-12基因。
图24a示出了通过对感染了Lister-VV06的HeLa细胞所分泌的蛋白质进行蛋白质印迹而获得的结果，该结果显示已经表达了sPD1-Fc、PH20基因。
图24b示出了通过对感染了Lister-VV06的HeLa细胞所分泌的蛋白质进行ELISA而获得的结果，该结果显示已经表达了IL-12基因。
图25示出了通过向小鼠结直肠肿瘤模型瘤内给药IHD-W-VV02、IHD-W-VV03和IHD-W-VV05，然后测量肿瘤生长而获得的结果。
图26示出了通过向小鼠黑素瘤模型瘤内给药IHD-W-VV01和IHD-W-VV05，然后测量肿瘤生长而获得的结果。
图27示出了通过向小鼠肺肿瘤模型瘤内给药IHD-W-VV01和IHD-W-VV05，然后测量肿瘤生长而获得的结果。
图28示出了通过向小鼠结直肠肿瘤模型瘤内给药IHD-W-VV02、IHD-W-VV03、IHD-W-VV04和IHD-W-VV06，然后测量肿瘤生长而获得的结果。
图29示出了通过向小鼠肺肿瘤模型瘤内给药IHD-W-VV02、IHD-W-VV03、IHD-W-VV04和IHD-W-VV06，然后测量肿瘤生长而获得的结果。
图30示出了通过向小鼠结直肠肿瘤模型瘤内给药IHD-W-VV05和IHD-W-VV06，然后测量肿瘤生长而获得的结果。
图31示出了通过向小鼠黑素瘤模型瘤内给药IHD-W-VV05和IHD-W-VV06，然后测量肿瘤生长而获得的结果。
图32示出了通过向小鼠肺肿瘤模型瘤内给药IHD-W-VV05和IHD-W-VV06，然后测量肿瘤生长而获得的结果。
图33示出了通过向小鼠黑素瘤模型瘤内给药IHD-W-VV01和IHD-W-VV06，然后测量肿瘤生长而获得的结果。
图34示出了通过向小鼠肺肿瘤模型瘤内给药IHD-W-VV01和IHD-W-VV06，然后测量肿瘤生长而获得的结果。
图35示出了通过向小鼠肺肿瘤模型瘤内给药WR-VV01和WR-VV06，然后测量肿瘤生长而获得的结果。
图36示出了通过向小鼠肺肿瘤模型瘤内给药Lister-VV01和Lister-VV06，然后测量肿瘤生长而获得的结果。
图37示出了通过确定IHD-W-VV06、WR-VV06和Lister-VV06的体外细胞杀伤能力而获得的结果。
具体实施方式
在本发明的一个方面，提供了一种重组痘苗病毒，所述重组痘苗病毒包含选自由可溶性程序化细胞死亡蛋白-1(sPD-1)编码基因、透明质酸酶编码基因及其组合组成的组中的任一种。重组痘苗病毒可进一步包含IL-12编码基因。
本文所用的术语“sPD-1”是指程序性死亡蛋白-1(PD-1)的胞外结构域或片段，所述PD-1是55kDa的I型跨膜蛋白，属于免疫球蛋白分子家族并且是众所周知的T细胞共抑制分子。另外，术语sPD-1可以具有包括sPD-1融合蛋白的含义，所述sPD-1融合蛋白中全长sPD-1或sPD-1片段与免疫球蛋白Fc区融合。融合蛋白的具体实例可以是sPD-1-Fc，所述sPD-1-Fc中sPD-1结合至免疫球蛋白Fc区。在此，sPD-1和Fc可以直接或通过接头彼此结合。在此，接头可以是由1至50、2至45、3至40、5至30或7至25个氨基酸组成的肽，并且特别地可以是由3至40个氨基酸组成的肽。接头可以是选自但不限于由以下组成的组中的氨基酸序列：GGGGS(SEQ ID NO:123)、GGGGSGGGGSGGGGSEPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:124)、SPKAQAGGGGSAQPQAEGSLGGGGSAKASAPAGGGGS(SEQ ID NO:125)、GGSGGSGGSGGSGGSEQEER(SEQ IDNO:126)、GGGGSGGGGSGGS(SEQ ID NO:127)、SGGGGSGGGGSGGGGSGTHTCPPCP(SEQ ID NO:128)、GGSGGGGS(SEQ ID NO:129)和GGGGSGGGGSGGGS(SEQ ID NO:130)。
sPD-1可以是GenBank：NM_008798.2的序列的一部分，并且不限于任一种序列。具体地，sPD-1可以是SEQ ID NO:131或SEQ ID NO:133的氨基酸序列。另外，sPD-1可以相对于SEQ ID NO:131的氨基酸序列具有约90％、91％、92％、93％、94％或更高，优选约95％、96％、97％、98％或99％或更高，最优选约99％或更高的同源性，只要sPD-1的功能没有改变。
另外，本文所用的术语“sPD-1基因”是指编码“sPD-1蛋白”的基因或编码融合了sPD-1蛋白、靶蛋白和其他蛋白质的“sPD-1融合蛋白”的基因。具体地，sPD-1基因可以编码包含Fc区的sPD-1融合蛋白(sPD1-Fc)。sPD-1基因可包含SEQ ID NO:132或134的核苷酸序列。此外，sPD-1基因可以相对于SEQ ID NO:134的核苷酸序列具有约90％、91％、92％、93％、94％或更高，优选约95％、96％、97％、98％或99％或更高，最优选约99％或更高的同源性，只要sPD-1的功能没有改变。
另外，本文所用的术语“透明质酸酶”是指分解透明质酸的酶。透明质酸酶可以源自绵羊、牛、小鼠或人。具体地，透明质酸酶可以是人透明质酸酶(PH20)或重组人透明质酸酶(rHuPH20)。透明质酸酶可以是但不限于GenBank：NM_003117.4的序列：。具体地，透明质酸酶可以具有SEQ ID NO:135的氨基酸序列。另外，具体地，透明质酸酶基因可以具有SEQID NO:136的核苷酸序列。另外，透明质酸酶基因可以相对于SEQ ID NO:136的核苷酸序列具有约90％、91％、92％、93％、94％或更高，优选约95％、96％、97％、98％或99％或更高，最优选约99％或更高的同源性，只要透明质酸酶的功能没有改变。
另外，本文所用的术语“IL-12”是属于细胞因子家族的分子，并且与免疫系统有关。IL-12可以与从任何动物中获得的IL-12相同，所述任何动物例如人(hIL-12)、小鼠(mIL-12)、马、牛和猪。IL-12可以是但不限于GenBank的NM_000882.3(hIL-12A)、AY008847.1(hIL-12B)、NM_001159424.2(mIL-12α)或NM_001303244.1(mIL-12β)公开的序列。具体地，IL-12可以是SEQ ID NO:137的氨基酸序列。具体地，IL-12基因可以包括由以下表示的接头：SEQ ID NO:138的核苷酸序列、SEQ ID NO:139的核苷酸序列(p35亚基)或SEQID NO:140的核苷酸序列(p40亚基)。另外，IL-12基因可以相对于SEQ ID NO:138至SEQ IDNO:140的核苷酸序列具有约90％、91％、92％、93％、94％或更高，优选约95％、96％、97％、98％或99％或更高，最优选约99％或更高的同源性，只要IL-12的功能没有改变。
重组痘苗病毒可以是包含sPD-1基因的痘苗病毒、包含透明质酸酶基因的痘苗病毒或包含IL-12基因的痘苗病毒。在此，可以将sPD-1基因、透明质酸酶基因和/或IL-12基因插入痘苗病毒的基因组中。另外，所述基因也可以插入在痘苗病毒基因组的不同位置；然而，这样的基因可以插入在相同或相似的位置。例如，每个这样的基因可以插入在痘苗病毒的TK、K3L或VGF位置。优选地，重组痘苗病毒可以在宿主细胞中表达sPD-1、透明质酸酶和/或IL-12。
另外，重组痘苗病毒可包含sPD-1基因、透明质酸酶基因或IL-12基因中的至少两种。例如，重组痘苗病毒可以是插入有sPD-1基因和透明质酸酶基因的痘苗病毒，插入有sPD-1基因和IL-12基因的痘苗病毒，或是插入有透明质酸酶基因和IL-12基因的痘苗病毒。优选地，重组痘苗病毒可包含sPD-1基因、透明质酸酶基因和IL-12基因的全部。即，重组痘苗病毒可以是能够表达sPD-1基因、透明质酸酶基因和IL-12基因的痘苗病毒。
前述痘苗病毒可以是如下痘苗病毒，其具有表达被抑制的选自由K3L编码基因、胸苷激酶(TK)编码基因、痘苗生长因子(VGF)及其组合组成的组中的任一种。在此，组合可以指K3L编码基因、TK编码基因和VGF编码基因的至少两种。
例如，重组痘苗病毒可以是具有sPD-1基因的痘苗病毒、具有透明质酸酶基因的痘苗病毒、具有sPD-1基因和透明质酸酶基因的痘苗病毒、具有sPD-1基因和IL-12基因的痘苗病毒、具有透明质酸酶基因和IL-12基因的痘苗病毒或具有sPD-1基因、透明质酸酶基因和IL-12基因的痘苗病毒，每种痘苗病毒均具有表达被抑制的选自由K3L基因、TK基因、VGF基因及其组合组成的组中的任一种。
本文所用的术语“VGF”是指痘苗生长因子。痘苗生长因子是表现出与上皮生长因子相似活性的酶。由VGF基因编码的痘苗生长因子在被病毒感染的情况下表现出生长因子活性，并且可在由病毒引起的感染的初始阶段合成。VGF可以是GenBank：AAO89288.1、ABD52455.1或AIX98927.1的序列，但不限于此。具体地，VGF可以具有SEQ ID NO:141的氨基酸序列。另外，VGF基因可以是SEQ ID NO:142的核苷酸序列。VGF可以相对于SEQ ID NO:141的氨基酸序列具有约70％或75％或更高，优选约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％或更高的同源性。另外，VGF基因可以相对于SEQ ID NO:142的核苷酸序列具有约90％、91％、92％、93％、94％或更高，优选约95％、96％、97％、98％或99％或更高，最优选约99％或更高的同源性。
本文所用的术语“TK”是指胸苷激酶。胸苷激酶是一种参与核苷酸生物合成的酶。由TK基因编码的胸苷激酶使ATP的γ位上的磷酸与胸苷结合，从而可以产生构成病毒DNA的核苷酸。TK可以是GenBank：AAO89373.1、ABD52560.1或AIX99011.1的序列，但不限于此。具体地，TK可以具有SEQ ID NO:143的氨基酸序列。TK基因可以是SEQ ID NO:144的核苷酸序列。TK可以相对于SEQ ID NO:143的氨基酸序列具有约70％或75％或更高，优选约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％或更高的同源性。另外，TK基因可以相对于SEQ ID NO:144的核苷酸序列具有约90％、91％、92％、93％、94％或更高，优选约95％、96％、97％、98％或99％或更高，最优选约99％或更高的同源性。
本文所用的术语“K3L”是指K3L蛋白。由K3L基因编码的K3L蛋白是与翻译起始因子-2α(eIF-2α)具有同源性的蛋白，并且可以抑制作为干扰素激活剂的蛋白激酶R(PKR)的作用。K3L可以是GenBank：AAO89313.1、ABD52483.1或AGB75754.1的序列，但不限于此。具体地，K3L可以具有SEQ ID NO:145的氨基酸序列。K3L基因可以是SEQ ID NO:146的核苷酸序列。K3L可以相对于SEQ ID NO:145的氨基酸序列具有约70％或75％或更高，优选约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％或更高的同源性。另外，K3L基因可以相对于SEQ ID NO:146的核苷酸序列具有约90％、91％、92％、93％、94％或更高，优选约95％、96％、97％、98％或99％或更高，最优选约99％或更高的同源性。
根据本发明的基因的表达被抑制是指不表达该基因或通过部分或全部缺失或将外来基因插入该基因以仅表达该基因的一部分，从而使得由该基因编码的蛋白活性不表现。缺失基因或插入外源基因的方法可以通过本领域熟知的方法进行。例如，这可以通过插入外源基因的方法来进行，该方法公开于Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatis的分子克隆实验指南(Molecular Cloning,A Laboratory Manual),第二版,(2003),冷泉港出版社，Brian W J Mahy和Hillar O Kangro编的病毒学方法手册(Virology Methods Manual)(1996),学术出版社，以及John Wiley and Son发表的痘苗病毒载体的基因表达以及分子生物学的当前方法(Expression of genes by Vaccinia virus vectors,and CurrentProtocols in Molecular Biology)(1998),第16章。具体来说，在在本发明的实施方式中，使用pGEM-T Easy(Promega，Cat No.A1360)或pGEM-T(Promega，Cat No.A3600)质粒系统插入外源基因。
痘苗病毒可以选自但不限于以下组成的组：西储(WR)、纽约痘苗病毒(NYVAC)、惠氏(纽约市卫生局；NYCBOH)、LC16m8、利斯特(Lister)、哥本哈根(Copenhagen)、天坛(TianTan)、USSR、塔什干(Tashkent)、埃文斯(Evans)、国际卫生部-J(IHD-J)、国际卫生部-白色(IHD-W)、其变体及其组合。具体地，痘苗病毒可以是WR、利斯特或IHD-W痘苗病毒，并且可以具有GenBank：AY243312.1、DQ121394.1或AIX98951.1的序列。在本发明的一个实施方式中，痘苗病毒可以是IHD-W。
本文所用的术语“V”或“病毒V”是指缺失痘苗生长因子基因VGF的重组痘苗病毒，由于缺失VGF基因，该病毒不表达VGF基因。
另外，本文所用的术语“T”或“病毒T”是指缺失胸苷激酶(TK)基因的重组痘苗病毒，由于缺失TK基因，该病毒不表达TK基因。
另外，本文使用的术语“K”或“病毒K”是指缺失K3L基因的重组痘苗病毒，由于缺失K3L基因，该病毒不表达K3L基因。
另外，本文所用的术语“VT”或“病毒VT”是指缺失VGF和TK基因的重组痘苗病毒。使痘苗生长因子和胸苷激酶表达失活的方法如上所述。
另外，本文使用的术语“IHD-W-VV01”是指缺失VGF、TK和K3L基因的重组IHD-W痘苗病毒。使痘苗生长因子、胸苷激酶和K3L蛋白表达失活的方法如上所述。
另外，在本发明的实施方式中使用的术语“IHD-W-VV02”是指缺失VGF、TK和K3L基因并诱导sPD1-Fc基因表达的重组IHD-W痘苗病毒。
另外，在本发明的实施方式中使用的术语“IHD-W-VV03”是指缺失VGF、TK和K3L基因并诱导PH20基因表达的重组IHD-W痘苗病毒。
另外，在本发明的实施方式中使用的术语“IHD-W-VV04”是指缺失VGF、TK和K3L基因并诱导IL-12基因表达的重组IHD-W痘苗病毒。
另外，在本发明的实施方式中使用的术语“IHD-W-VV05”是指缺失VGF、TK和K3L基因并诱导sPD1-Fc和PH20基因表达的重组IHD-W痘苗病毒。
另外，在本发明的实施方式中使用的术语“IHD-W-VV06”是指缺失VGF、TK和K3L基因并诱导sPD1-Fc、PH20和IL-12基因表达的重组IHD-W痘苗病毒。
具体地，作为根据本发明的重组痘苗病毒的实例，以下可能被提及。WR痘苗病毒的变体可以包括其中VGF、TK和K3L基因中的至少一种的表达被抑制并且sPD1-Fc、PH20和IL-12基因中的至少一种的表达被诱导的WR痘苗病毒。
另外，NYVAC痘苗病毒的变体可以包括其中VGF、TK和K3L基因中的至少一种的表达被抑制并且sPD1-Fc、PH20和IL-12基因中的至少一种的表达被诱导的NYVAC痘苗病毒。
另外，惠氏(Wyeth)痘苗病毒的变体可以包括其中VGF、TK和K3L基因中的至少一种的表达被抑制并且sPD1-Fc、PH20和IL-12基因中的至少一种的表达被诱导的惠氏痘苗病毒。
另外，利斯特痘苗病毒的变体可以包括其中VGF、TK和K3L基因中的至少一种的表达被抑制并且sPD1-Fc、PH20和IL-12基因中的至少一种的表达被诱导的利斯特痘苗病毒。
另外，天坛痘苗病毒的变体可以包括其中VGF、TK和K3L基因中的至少一种的表达被抑制并且sPD1-Fc、PH20和IL-12基因中的至少一种的表达被诱导的天坛痘苗病毒。
另外，USSR痘苗病毒的变体可以包括其中VGF、TK和K3L基因中的至少一种的表达被抑制并且sPD1-Fc、PH20和IL-12基因中的至少一种的表达被诱导的USSR痘苗病毒。
另外，塔什干痘苗病毒的变体可以包括其中VGF、TK和K3L基因中的至少一种的表达被抑制并且sPD1-Fc、PH20和IL-12基因中的至少一种的表达被诱导的塔什干痘苗病毒。
另外，IHD-J痘苗病毒的变体可以包括其中VGF、TK和K3L基因中的至少一种的表达被抑制并且诱导sPD1-Fc、PH20和IL-12基因中的至少一种的表达被诱导的IHD-J痘苗病毒。
此外，IHD-W痘苗病毒的变体可以包括其中VGF、TK和K3L基因中的至少一种的表达被抑制并且sPD1-Fc、PH20和IL-12基因中的至少一种的表达被诱导的IHD-W痘苗病毒。
本发明的另一方面，提供了用于预防或治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含作为活性成分的根据本发明的重组痘苗病毒。在此，如上所述，重组痘苗病毒可以是其中sPD1-Fc、PH20或IL-12基因或其组合的表达被诱导或VGF、TK或K3L基因或其组合的表达被抑制的重组痘苗病毒。sPD1-Fc、PH20、IL-12、VGF、TK和K3L基因如上所述。
本文所用的术语“癌症”可以是实体癌或血癌。在此，实体瘤可以选自由肺癌、结直肠癌、前列腺癌、甲状腺癌、乳腺癌、脑癌、头颈癌、纤维肉瘤、食道癌、皮肤癌、胸腺癌、胃癌、结肠癌、肝癌、卵巢癌、子宫癌、膀胱癌、直肠癌、胆囊癌、胆道癌、胰腺癌及其组合组成的组。根据本发明的实施方式，癌症可以是肺癌、肝癌、前列腺癌、头颈癌、纤维肉瘤、脑癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、皮肤癌或结直肠癌。另外，血癌可以选自由淋巴瘤、急性白血病、多发性骨髓瘤及其组合组成的组。
本发明的药物组合物还可包含一种或多种选自由赋形剂、润滑剂、润湿剂、甜味剂、香料和防腐剂组成的组中的药学上可接受的添加剂。
本发明的组合物可以根据常规方法配制。可以采用本领域已知的方法配制本发明的组合物，以提供活性成分的快速、持续或延迟释放，特别是在给药至哺乳动物后。取决于剂型，本发明的组合物可以适当地给药至个体。这样的给药可以是肠胃外给药，并且其实例可以包括肿瘤内、皮内、肌内、腹膜内、静脉内、动脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。用于肠胃外给药的制剂的形式可以是可注射制剂。
本发明的另一方面，提供了一种预防或治疗癌症的方法，该方法包括向个体给药包含作为活性成分的根据本发明的重组痘苗病毒组合物的步骤。在此，癌症如上所述。
该个体可以是哺乳动物，并且该哺乳动物可以包括但不限于灵长类动物(例如人)、牛、绵羊、山羊、马、猪、狗、猫、兔子、大鼠、小鼠、鱼、鸟等。具体地，哺乳动物可以是人。本发明的组合物可以由本领域技术人员根据患者的年龄、性别、体重、疾病症状的严重性和给药途径适当地给药。给药可以是一天一次或一天数次，并且可以以适当的周期重复给药。
包含本发明的重组痘苗病毒的组合物的优选剂量根据个体的状况和体重、疾病的严重性、药物形式、给药途径和持续时间而变化，并且可以由本领域技术人员适当地选择。具体地，所述剂量可以使得患者接受1×105至1×1018的病毒颗粒、具有感染性的病毒单位(TCID50)或空斑形成单位(pfu)，优选1×105、2×105、5×105、1×106、2×106、5×106、1×107、2×107、5×107、1×108、2×108、5×108、1×109、2×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011、5×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1017或更高，其中可包括它们之间的各个值和范围。另外，病毒的剂量可以是0.1ml、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml或更多，以及可包括它们之间的所有值和范围。
发明的实施方式
在下文中，将参考以下实施例更详细地描述本发明。然而，以下实施例仅旨在说明本发明，并且本发明不限于此。
I.重组痘苗病毒的产生
本发明人构建了缺失TK、VGF和K3L基因或其表达失活的重组痘苗病毒质粒。使用这些质粒，产生其中上述基因表达被抑制的重组痘苗病毒，并对上述重组痘苗病毒作为抗癌物质的性质进行比较。另外，本发明人构建了通过将sPD1-Fc、PH20、IL-12基因插入上述重组痘苗病毒质粒中而获得的重组痘苗病毒质粒。使用这些质粒，产生其中上述基因表达被诱导的重组痘苗病毒，并对上述重组痘苗病毒作为抗癌物质的性质进行比较。
实施例1.重组IHD-W痘苗病毒的产生
实施例1.1 IHD-W-VV01病毒的产生
实施例1.1.1缺失VGF基因的重组IHD-W痘苗病毒质粒的构建
首先，通过PCR扩增IHD-W痘苗病毒基因组DNA(ATCC，Cat No.VR-1441)中在VGF基因两侧的基因区域。在此，用于扩增VGF基因两侧的同源核苷酸序列的引物信息示于下表4中。以这样的方式，获得VGF-L(IHD-W)和VGF-R(IHD-W)片段，然后与pGEM-T Easy质粒连接构建pGEM-T Easy-VGF-L(IHD-W)或pGEM-T Easy-VGF-R(IHD-W)。
[表4]
Figure BDA0002693042930000171
将pGEM-T Easy-VGF-R(IHD-W)和pSP72各自用EcoRI和BglII处理，然后连接构建pSP72-VGF-R(IHD-W)。将构建的pSP72-VGF-R(IHD-W)和pGEM-T Easy-VGF-L(IHD-W)各自用HindIII和BamHI处理，连接构建pSP72-VGF-L-VGF-R(IHD-W)。
接下来，为了将p11启动子和LacZ基因引入pSP72-VGF-L-VGF-R(IHD-W)，将如下文实施例2.1.1中构建的在WR VGF(i)穿梭质粒中的p11-LacZ表达盒和pSP72-VGF-L-VGF-R(IHD-W)用NheI和PacI处理，连接构建pSP72-VGF-L-p11-LacZ-VGF-R(IHD-W)(以下称为“IHD-W VGF穿梭质粒”)。
实施例1.1.2缺失TK基因的重组IHD-W痘苗病毒质粒的构建
首先，为了获得IHD-W痘苗病毒基因组DNA中在TK基因两侧的基因区域，进行了PCR，结果获得TK-L(IHD-W)和TK-R(IHD-W)片段。在此，所用的引物示于下表5中。将获得的TK-R(IHD-W)片段和pSP72质粒各自用EcoRI和BglII处理，连接构建pSP72-TK-R(IHD-W)。另外，将pSP72-TK-R(IHD-W)和TK-L(IHD-W)片段各自用PstI和BamHI处理，连接构建pSP72-TK-L-TK-R(IHD-W)。
将构建的pSP72-TK-L-TK-R(IHD-W)质粒和如下文实施例2.1.2构建的WR TK(i)穿梭质粒pSP72-TK-L-EGFP-pSE/L-p7.5-TK-R(WR)各自用EcoRI和NotI处理，连接以最终构建pSP72-TK-L-TF-EGFP-pSE/L-p7.5-Gpt-TK-R(IHD-W)(以下称为“IHD-W TK穿梭质粒”)。
[表5]
Figure BDA0002693042930000181
实施例1.1.3缺失K3L基因的重组IHD-W痘苗病毒质粒的构建
首先，通过PCR扩增IHD-W痘苗病毒基因组DNA中在K3L基因两侧的基因区域，然后分别插入pGEM-T Easy中，以构建pGEM-T Easy-K3L-L(IHD-W)和pGEM-T Easy-K3L-R(IHD-W)。在此，所用的引物示于下表6中。
为了构建在K3L穿梭质粒内部的基因表达盒，使用如下文实施例2.1.3中构建的WRK3L(i)穿梭质粒作为模板，通过PCR扩增p7.5-DsRed基因盒，然后该p7.5-DsRed基因盒插入pGEM-T Easy中以构建pGEM-T Easy-p7.5-DsRed。用于扩增p7.5启动子和DsRed基因的引物的序列示于下表6中。
[表6]
Figure BDA0002693042930000182
将构建的pGEM-T Easy-p7.5-DsRed和pSP72质粒各自用HindIII和EcoRV处理，然后连接以完成pSP72-p7.5-DsRed。另外，将构建的pSP72-p7.5-DsRed和上述构建的pGEM-TEasy-K3L-R(IHD-W)用EcoRV和BamHI处理，然后连接构建pSP72-p7.5-DsRed-K3L-R(IHD-W)。接下来，将构建的pSP72-p7.5-DsRed-K3L-R(IHD-W)和pGEM-T Easy-K3L-L(IHD-W)各自用SalI和HindIII处理，然后连接以最终构建pSP72-K3L-L-p7.5-DsRed-K3L-R(IHD-W)(以下称为“IHD-W K3L穿梭质粒”)。
实施例1.1.4缺失VGF基因的重组IHD-W痘苗病毒的产生
使用如实施例1.1.1中构建的IHD-W VGF穿梭质粒，通过以下方法产生缺失VGF基因的重组IHD-W痘苗病毒。
为了获得重组病毒，在6孔板中以3×105个细胞/孔的条件并在含有2％胎牛血清的MEM培养基的状态下制备HeLa细胞。然后，使用jetPRIME用2μg IHD-W K3L穿梭质粒转染HeLa细胞，并同时用IHD-W野生型痘苗病毒以0.05MOI处理。孵育4小时后，用含有5％胎牛血清的MEM培养基替换该培养基，然后将细胞进一步孵育48小时。最后，用500μl的培养基收集被感染的细胞，然后通过反复冻融3次来裂解细胞，获得粗病毒。使用粗病毒并通过常规方法反复进行空斑分离，从而获得了纯化分离的重组IHD-W痘苗病毒V。
实施例1.1.5缺失VGF和TK基因的重组IHD-W痘苗病毒的产生
以与实施例1.1.4相同的条件和方法获得缺失VGF和TK基因的重组IHD-W痘苗病毒VT，不同之处在于使用了如实施例1.1.2构建的IHD-W TK穿梭质粒和如实施例1.1.4产生的重组IHD-W痘苗病毒V。
实施例1.1.6 IHD-W-VV01病毒的产生
以与实施例1.1.4相同的条件和方法获得缺失VGF、TK和K3L基因的重组IHD-W-VV01，不同之处在于使用了如实施例1.1.3构建的IHD-W K3L穿梭质粒和如实施例1.1.5产生的重组IHD-W痘苗病毒VT；其基因结构如图1所示。
实施例1.2 IHD-W-VV02病毒的产生
实施例1.2.1缺失TK基因并诱导sPD1-Fc基因表达的重组IHD-W痘苗病毒质粒的构建
为了构建在TK穿梭质粒内部的基因表达盒，使用pE3.1(EF1a.sPD-1.Fc)质粒(由国家癌症中心泌尿外科癌症研究部门提供)作为模板，通过PCR扩增了sPD1-Fc基因，然后插入pGEM-T easy中，构建pGEM-T easy-sPD1-Fc。另外，使用pGL4.1 p7.5荧光素酶质粒为模板，通过PCR扩增p7.5启动子，然后插入pGEM-T easy中，构建pGEM-T easy-p7.5。将构建的pGEM-T easy-p7.5和pGEM-T easy-sPD1-Fc质粒各自用PacI和NheI处理，然后连接以完成pGEM-T easy-p7.5-sPD1-Fc。用于扩增p7.5启动子和sPD1-Fc基因的引物的序列示于下表7中。将如实施例1.1.2中构建的IHD-W TK穿梭质粒用EcoRI和SalI处理，然后通过无缝克隆(infusion cloning)法将p7.5-sPD1-Fc基因盒插入其中，最终构建pSP72-TK-L-TF-pSE/L-EGFP-TF-TF-sPD1-Fc-p7.5-TK-R(IHD-W)(以下称为“IHD-W TK(sPD1-Fc)穿梭质粒”)。用于无缝克隆过程的引物序列示于下表7中。
[表7]
Figure BDA0002693042930000201
Figure BDA0002693042930000211
实施例1.2.2缺失VGF和K3L基因的重组IHD-W痘苗病毒的产生
以与实施例1.1.4相同的条件和方法获得缺失VGF和K3L基因的重组IHD-W痘苗病毒VK，不同之处在于使用了如实施例1.1.3中构建的IHD-W K3L穿梭质粒和如实施例1.1.4产生的重组IHD-W痘苗病毒V。
实施例1.2.3 IHD-W-VV02病毒的产生
以与实施例1.1.4相同的条件和方法获得缺失VGF、TK和K3L基因并诱导sPD1-Fc基因表达的重组IHD-W-VV02，不同之处在于使用了如实施例1.2.1中构建的IHD-W TK(sPD1-Fc)穿梭质粒和如实施例1.2.2中产生的重组IHD-W痘苗病毒VK；其基因结构如图2所示。
实施例1.2.4 IPD-W-VV02中sPD1-Fc基因的插入和表达的确认
使用Nucleospin prep试剂盒(Cat#740956250)获得了如实施例1.2.3产生的重组IHD-W-VV02的gDNA，并使用下表8中的引物确认了重组病毒的gDNA结构。如图3所示，通过确认VGF、TK和K3L位置每处的DNA结构而获得的结果显示，与对照组相比，在插入了基因的位置处PCR片段大小有变化。
进行蛋白质印迹以确认插入的sPD1-Fc基因通过重组病毒在感染的细胞中表达。首先，用重组IHD-W-VV02以0.05MOI处理HeLa细胞44至52小时。然后，用不含胎牛血清的MEM培养基替换该培养基，并将细胞进一步孵育16至20小时。将培养基和细胞彼此分离，并分别从中获得蛋白质。通过Bradford分析法对制备的蛋白质进行定量，然后使用蛋白质印迹确认蛋白质表达。在此，使用抗mPdcd1(E-18)(Santacruz，Cat#SC-10299)作为一抗，使用抗山羊作为二抗。表达结果如图4所示。
[表8]
名称 序列(5'→3') SEQ ID NO
VGF正向 AGGTTCCGTAAGCAAAGAATATAAG SEQ ID NO:21
VGF反向 AGGTAACTAGATTTTACTTTAATATGCCGAA SEQ ID NO:22
TK正向 GGAAGGGTCAAACTTAATAAAGGAT SEQ ID NO:23
TK反向 ACCGTGTCGCTGTAACTTACTA SEQ ID NO:24
K3L正向 GACGCTGAACACGTTAACGATAGT SEQ ID NO:25
K3L反向 ACTGCGACGAGATACAACCGGA SEQ ID NO:26
实施例1.3 IHD-W-VV03病毒的产生
实施例1.3.1缺失TK基因并诱导PH20基因表达的重组IHD-W痘苗病毒质粒的构建
使用下表9中所示的引物从pGL4.1-pHyb质粒合成pHyb启动子DNA，然后通过无缝克隆法将pHyb启动子DNA插入pGEM-T easy载体，以构建pGEM-T easy-pHyb。为了将PH20基因插入构建的pGEM-T Easy-pHyb中，通过PCR过程分别从A549细胞的gDNA合成了PH20Exon2、Exon3和Exon4。在此，所用的引物示于下表9中。
首先，为了插入PH20-Exon2，用SpeI处理pGEM-T easy-pHyb质粒。通过PCR过程合成PH20-Exon2，然后通过无缝克隆法将PH20-Exon2插入线性化的pGEM-T easy-pHyb中，以构建pGEM-T easy-pHyb-PH20-Exon2质粒。将构建的pGEM-T Easy-pHyb-PH20-Exon2质粒用SacI处理；通过PCR过程合成了PH20-Exon3和PH20-Exon4，然后通过无缝克隆法插入所述pGEM-T Easy-pHyb-PH20-Exon2质粒中，以构建pGEM-T easy-pHyb-PH20。将如实施例1.1.2中构建的IHD-W TK穿梭质粒用EcoRI和SalI处理，然后通过无缝克隆法将pHyb-PH20基因盒插入其中，最终构建pSP72-TK-L-TF-pSE/L-EGFP-TF-pHyb-PH20-TF-TK-R(IHD-W)(以下称为“IHD-W TK(PH20)穿梭质粒”)。无缝克隆过程中使用的引物的序列示于下表9中。
[表9]
Figure BDA0002693042930000231
实施例1.3.2 IHD-W-VV03病毒的产生
以与实施例1.1.4相同的条件和方法获得缺失VGF、TK和K3L基因并诱导PH20基因表达的重组IHD-W-VV03，不同之处在于使用了如实施例1.3.1构建的IHD-W TK(PH20)穿梭质粒和如实施例1.2.2产生的重组IHD-W痘苗病毒VK；其基因结构如图5所示。
实施例1.3.3 IHD-W-VV03中PH20基因的插入和表达的确认
使用Nucleospin prep试剂盒(Cat#740956250)获得了如实施例1.3.2产生的重组IHD-W-VV03的gDNA，并使用下表10中的引物确认了重组病毒的gDNA结构。如图6所示，通过确认VGF、TK和K3L位置每处的DNA结构而获得的结果显示，与对照组相比，在插入了基因的位置处PCR片段大小有变化。
进行蛋白质印迹以确认插入的PH20基因通过重组病毒在感染的细胞中表达。首先，用重组IHD-W-VV03以0.05MOI处理HeLa细胞44至52小时。然后，用不含胎牛血清的MEM培养基替换该培养基，并将细胞进一步孵育16至20小时。将培养基和细胞彼此分离，并分别从中获得蛋白质。通过Bradford分析法对制备的蛋白质进行定量，然后使用蛋白质印迹确认蛋白质表达。在此，使用抗hPH20(LsBio,Cat#LS-C331909)作为一抗，使用抗兔作为二抗。表达结果如图7所示。
[表10]
名称 序列(5'→3') SEQ ID NO
VGF正向 AGGTTCCGTAAGCAAAGAATATAAG SEQ ID NO:37
VGF反向 AGGTAACTAGATTTTACTTTAATATGCCGAA SEQ ID NO:38
TK正向 GGAAGGGTCAAACTTAATAAAGGAT SEQ ID NO:39
TK反向 ACCGTGTCGCTGTAACTTACTA SEQ ID NO:40
K3L正向 GACGCTGAACACGTTAACGATAGT SEQ ID NO:41
K3L反向 ACTGCGACGAGATACAACCGGA SEQ ID NO:42
实施例1.4 IHD-W-VV04病毒的产生
实施例1.4.1缺失K3L基因并诱导IL-12基因表达的重组IHD-W痘苗病毒质粒的构建
用下表11中的引物扩增作为DNA模板的pGL4.1-pI1L-B19R质粒，以合成pI1L-B19R启动子DNA，然后通过无缝克隆法插入以构建pGEM-T Easy-pI1L-B19R质粒。为了将编码单个肽的IL-12基因插入质粒中，使用pVAX1-IL-12质粒作为DNA模板，用下表11中的引物扩增IL-12p40和p35亚基基因。在此，将构成接头的序列插入反向引物p40的5'端和正向引物p35的3'端。通过无缝克隆法将上述扩增的IL-12基因插入已经用XhoI线性化的pGEM-T Easy-pI1L-B19R质粒中，以构建pGEM-T Easy-pI1L-B19R-IL-12质粒。将上述构建的pGEM-TEasy-pI1L-B19R-IL-12质粒和如实施例1.1.3中构建的IHD-W K3L穿梭质粒各自用NotI处理，然后连接构建pSP72-K3L-L-p7.5-DsRed-pI1L-B19R-IL-12-TF-TF-K3L-R质粒。
使用下表11中的引物从DH1 gDNA进行PCR，并将获得的gusA标记基因插入到pGEM-T easy中，以构建pGEM-T easy-gusA。使用质粒作为模板，使用下表11中的引物获得GusA片段。用BamHI和SacII处理上述构建的pSP72-K3L-L-p7.5-DsRed-pI1L-B19R-IL-12-TF-TF-K3L-R质粒，然后进行无缝克隆，最终构建pSP72-K3L-L-p7.5-gusA-TF-pI1L-B19R-IL-12-TF-TF-K3L-R(以下称为“IHD-W K3L(IL-12)穿梭质粒”)。上述方法中使用的引物序列示于下表11中。
[表11]
Figure BDA0002693042930000251
Figure BDA0002693042930000261
实施例1.4.2 IHD-W-VV04病毒的产生
以与实施例1.1.4相同的条件和方法获得缺失VGF、TK和K3L基因并诱导IL-12基因表达的重组IHD-W-VV04，不同之处在于使用了如实施例1.4.1中构建的IHD-W K3L(IL-12)穿梭质粒和如实施例1.1.5中产生的重组IHD-W痘苗病毒VT；其基因结构如图8所示。
实施例1.4.3 IHD-W-VV04中IL-12基因的插入和表达的确认
使用Maxwell纯化试剂盒(Cat#AS1330)获得了如实施例1.4.2产生的重组IHD-W-VV04的gDNA，并使用下表12中的引物确认了重组病毒的gDNA结构。如图9所示，通过确认VGF、TK和K3L位置每处的DNA结构而获得的结果显示，与对照组相比，在插入了基因的位置处PCR片段大小有变化。
进行蛋白质印迹以确认插入的IL-12基因通过重组病毒在感染的细胞中表达。首先，用重组IHD-W-VV04以0.05MOI处理HeLa细胞44至52小时。然后，用不含胎牛血清的MEM培养基替换该培养基，并将细胞进一步孵育16至20小时。将培养基和细胞彼此分离，并分别从中获得蛋白质。通过Bradford分析法对制备的蛋白质进行定量，然后使用蛋白质印迹确认蛋白质表达。在此，使用抗mIL-12/IL-23p40(R&D Systems,Cat#MAB4991)作为一抗，使用抗大鼠作为二抗。表达结果如图10所示。
[表12]
Figure BDA0002693042930000262
Figure BDA0002693042930000271
实施例1.5 IHD-W-VV05病毒的产生
实施例1.5.1缺失TK基因并诱导sPD1-Fc和PH20基因表达的重组IHD-W痘苗病毒质粒的构建
将如实施例1.1.2中构建的IHD-W TK穿梭质粒和pGEM-T Easy-p7.5-sPD1-Fc质粒用NheI和SalI处理，然后连接构建pSP72-TK-L-TF-TF-sPD1-Fc-p7.5-TK-R(IHD-W)质粒。将该质粒和pGEM-T Easy-pHyb-PH20质粒用SalI和BamHI处理，连接构建pSP72-TK-L-TF-pHyb-PH20-TF-TF-sPD1-Fc-p7.5-TK-R(IHD-W)。为了将标记基因EGFP插入质粒中，以IHD-WTK穿梭质粒为模板，通过PCR法合成了pSE/L-EGFP基因。在此，使用的引物示于下表13中。将pSP72TK-L-TF-pHyb-PH20-TF-TF-sPD1-Fc-p7.5-TK-R(IHD-W)穿梭质粒用PacI处理，并通过无缝克隆法将合成的pSE/L-EGFP基因插入其中，以构建pSP72-TK-L-TF-pSE/L-EGFP-TF-pHyb-PH20-TF-TF-sPD1-Fc-p7.5-TK-R(IHD-W)(以下称为“IHD-W TK(sPD1-Fc+PH20)穿梭质粒”)。
[表13]
Figure BDA0002693042930000272
实施例1.5.2 IHD-W-VV05病毒的产生
以与实施例1.1.4相同的条件和方法获得缺失VGF、TK和K3L基因并诱导sPD1-Fc和PH20基因表达的重组IHD-W-VV05，不同之处在于使用了如实施例1.5.1中构建的IHD-W TK(sPD1-Fc+PH20)穿梭质粒和如实施例1.2.2中产生的重组IHD-W痘苗病毒VK；其基因结构如图11所示。
实施例1.5.3重组IHD-W痘苗病毒IHD-W-VV05中sPD1-Fc和PH20基因的插入和表达的确认
使用Nucleospin prep试剂盒(Cat#740956250)获得了如实施例1.5.2产生的重组IHD-W-VV05的gDNA，并使用下表14中的引物确认了重组病毒的gDNA结构。如图12所示，通过确认VGF、TK和K3L位置每处的DNA结构而获得的结果显示，与对照组相比，在插入了基因的位置处PCR片段大小有变化。
进行蛋白质印迹以确认插入的sPD1-Fc和PH20基因通过重组病毒在感染的细胞中表达。首先，用重组IHD-W-VV05以0.05MOI处理HeLa细胞44至52小时。然后，用不含胎牛血清的MEM培养基替换该培养基，并将细胞进一步孵育16至20小时。将培养基和细胞彼此分离，并分别从中获得蛋白质。通过Bradford分析法对制备的蛋白质进行定量，然后使用蛋白质印迹确认蛋白质表达。在此，针对sPD1-Fc基因，使用抗mPdcd1(E-18)(Santacruz,Cat#SC-10299)作为一抗，使用抗兔作为二抗；针对PH20基因，使用抗hPH20(LsBio,Cat#LS-C331909)作为一抗，使用抗兔作为二抗。表达结果如图13所示。
[表14]
名称 序列(5'→3') SEQ ID NO
VGF正向 AGGTTCCGTAAGCAAAGAATATAAG SEQ ID NO:61
VGF反向 AGGTAACTAGATTTTACTTTAATATGCCGAA SEQ ID NO:62
TK正向 GGAAGGGTCAAACTTAATAAAGGAT SEQ ID NO:63
TK反向 ACCGTGTCGCTGTAACTTACTA SEQ ID NO:64
K3L正向 GACGCTGAACACGTTAACGATAGT SEQ ID NO:65
K3L反向 ACTGCGACGAGATACAACCGGA SEQ ID NO:66
实施例1.6 IHD-W-VV06病毒的产生
实施例1.6.1缺失VGF、TK和K3L基因并诱导sPD1-Fc、PH20和IL-12基因表达的重组IHD-W痘苗病毒的产生
以与实施例1.1.4相同的条件和方法获得缺失VGF、TK和K3L基因并诱导sPD1-Fc、PH20和IL-12基因表达的重组IHD-W-VV06，不同之处在于使用了如实施例1.4.1中构建的IHD-W K3L(IL-12)穿梭质粒和实施例1.5.2中产生的IHD-W-VV05；其基因结构如图14所示。
实施例1.6.2 IHD-W-VV06中sPD1-Fc、PH20和IL-12基因的插入和表达的确认
使用Maxwell纯化试剂盒(Cat#AS1330)获得了如实施例1.6.1产生的重组IHD-W-VV06的gDNA，并使用下表15中的引物确认了重组病毒的gDNA结构。如图15所示，通过确认VGF、TK和K3L位置每处的DNA结构而获得的结果显示，与对照组相比，在插入了基因的位置处PCR片段大小有变化。
进行蛋白质印迹以确认插入的sPD1-Fc、PH20和IL-12基因通过重组病毒在感染的细胞中表达。首先，用重组IHD-W-VV06以0.05MOI处理HeLa细胞44至52小时。然后，用不含胎牛血清的MEM培养基替换该培养基，并将细胞进一步孵育16至20小时。将培养基和细胞彼此分离，并分别从中获得蛋白质。通过Bradford分析法对制备的蛋白质进行定量，然后使用蛋白质印迹确认蛋白质表达。在此，针对sPD1-Fc基因，使用抗mPdcd1(E-18)(Santacruz,Cat#SC-10299)作为一抗，使用抗兔作为二抗；针对PH20基因，使用抗hPH20(LsBio,Cat#LS-C331909)作为一抗，使用抗兔作为二抗；针对IL-12基因，使用抗mIL-12/IL-23p40(R&DSystems,Cat#MAB4991)作为一抗，使用抗大鼠作为二抗。表达结果如图16所示。
[表15]
Figure BDA0002693042930000291
Figure BDA0002693042930000301
实施例2.重组WR痘苗病毒的产生
实施例2.1.WR-VV01病毒的产生
实施例2.1.1 VGF基因表达失活的重组WR痘苗病毒质粒的构建
通过PCR扩增WR痘苗病毒基因组DNA(ATCC，Cat No.VR-1354)中VGF基因两侧的基因区域，然后分别插入pGEM-T Easy中，构建pGEM-T Easy-VGF-L(WR)和pGEM-T Easy-VGF-R(WR)。用于扩增VGF基因两侧的同源核苷酸序列的引物信息示于下表16中。
[表16]
Figure BDA0002693042930000302
使用表达受p11启动子调控的LacZ作为用于筛选病毒的标记，该病毒在VGF基因位置处发生重组。通过PCR扩增WR gDNA中的p11启动子位点，并通过PCR扩增pAAV-LacZ(Stratagene，Cat No.240071-52)中的LacZ基因。然后，将所得物分别插入pGEM-T Easy和pGEM-T中，分别构建pGEM-T Easy-p11和pGEM-T-LacZ。用于扩增p11启动子和LacZ的引物信息示于表19中。
为了构建VGF基因功能部分缺失的穿梭质粒，将pGEM-T Easy-VGF-L(WR)用PvuII和PstI处理，并与通过用PvuII和PstI处理pSP72(Promega,Cat No.P2191)而获得的载体连接，以构建pSP72-VGF-L(WR)。另外，将pGEM-T Easy-VGF-L-VGF-R(WR)用EcoRV和BamHI处理，并与通过用EcoRV和BamHI处理上述构建的pSP72-VGF-L(WR)而获得的载体连接，以获得pSP72-VGF-L-VGF-R(WR)。为了引入LacZ表达盒，将PGEM-T Easy-p11用SalI和NheI处理，并与通过用SalI和NheI处理pSP72-VGF-L-VGF-R(WR)而获得的载体连接，以构建pSP72-VGF-L-p11-VGF-R(WR)。用EcoRI和PacI处理构建的pSP72-VGF-L-p11-VGF-R(WR)，然后用EcoRI和PacI切割上述构建的pGEM-T-LacZ。将所得物连接以完成pSP72-VGF-L-p11-LacZ-VGF-R(WR)(以下称为“WR VGF(i)穿梭质粒”)，其为VGF穿梭质粒。
实施例2.1.2TK基因表达失活的重组WR痘苗病毒质粒的构建
为了获得WR痘苗病毒基因组DNA中TK基因两侧的基因区域，通过PCR扩增WR gDNA，然后将位于TK基因左侧和右侧的同源核苷酸序列片段分别插入pGEM-T Easy，以构建pGEM-T Easy-TK-L(WR)和pGEM-T Easy-TK-R(WR)。用于扩增TK基因两侧的同源核苷酸序列的引物信息示于表17中。
[表17]
Figure BDA0002693042930000311
Figure BDA0002693042930000321
使用表达受pSE/L启动子调控的EGFP以及表达受p7.5启动子调控的Gpt作为用于筛选在TK基因位置处发生重组的病毒的标记。以WR gDNA为模板，通过PCR扩增p7.5启动子位点，并且还通过PCR扩增了pEGFP-N3(Clontech，Cat No.6080-1)中的EGFP基因和DH5α(Takara，Cat No.9057)中的Gpt基因。然后，将所得物分别插入pGEM-T Easy中，以分别构建pGEM-T Easy-p7.5、pGEM-T Easy-EGFP和pGEM-T Easy-Gpt。另外，通过引物退火构建了pSE/L启动子和TF。实验中使用的引物序列示于表17中。
将pGEM-T Easy-p7.5和退火的pSE/L启动子用BamHI和PstI分别处理，并连接以构建pGEM-T Easy-pSE/L-p7.5。将构建的pGEM-T Easy-pSE/L-p7.5和pGEM-T Easy-EGFP各自用BglII和XhoI处理，然后连接以构建pGEM-T Easy-EGFP-pSE/L-p7.5。
为了构建TK基因功能部分缺失的穿梭质粒，将pSP72用EcoRI和BamHI处理，并将pGEM-T Easy-TK-R(WR)用EcoRI和BamHI处理。然后，将所得物连接以构建pSP72-TK-R(WR)。将构建的pSP72-TK-R(WR)用XhoI和PstI处理，并与通过用SalI和PstI处理而获得的pGEM-TEasy-TK-L连接，从而构建pSP72-TK-L-TK-R(WR)。为了导入EGFP表达盒，将构建的pSP72-TK-L-TK-R(WR)和pGEM-T Easy-EGFP-pSE/L-p7.5各自用EcoRI和PstI处理，并连接以构建pSP72-TK-L-EGFP-pSE/L-p7.5-TK-R(WR)。
另外，将构建的pSP72-TK-L-EGFP-pSE/L-p7.5-TK-R(WR)和退火的TF低聚物各自用PstI和NotI处理，并连接以构建pSP72-TK-L-TF-EGFP-pSE/L-p7.5-TK-R(WR)。为了导入Gpt表达盒，将构建的pSP72-TK-L-TF-EGFP-pSE/L-p7.5-TK-R(WR)和pGEM-T Easy-Gpt各自用EcoRI和SpeI处理，然后连接以最终构建pSP72-TK-L-TF-EGFP-pSE/L-p7.5-Gpt-TK-R(WR)(以下称为“WR TK(i)穿梭质粒”)，该质粒是TK穿梭质粒。
实施例2.1.3 K3L基因表达失活的重组WR痘苗病毒质粒的构建
通过PCR扩增了WR痘苗病毒基因组DNA中K3L基因左侧的基因组区域和K3L基因的一部分。在此，用紧接在K3L-L序列之后的K3L基因的起始密码子进行扩增，用于在K3L基因的左侧的同源序列的扩增的引物示于表18中。在此，获得了扩增的K3L-L-K3Li(WR)片段，该片段包括除K3L基因的起始密码子以外的在K3L基因的起始密码子之后的部分，然后将该片段与pGEM-T Easy载体连接，以构建pGEM-T Easy-K3L-L-K3Li(WR)。
[表18]
名称 序列(5'→3') SEQ ID NO
K3L-Li正向 TGTACGTATATTTAGATGTTTTCAGCT SEQ ID NO:95
K3L-Li反向 ATAAGCTTCTTGCATTTTGTTATTCGT SEQ ID NO:96
K3L-Ri正向 CGCAGATAAAAACATATCCTTGTTAAC SEQ ID NO:97
K3L-Ri反向 GTTAACAAGGATATGTTTTTATCTGCG SEQ ID NO:98
将如实施例1.1.3中构建的IHD-W K3L穿梭质粒和pGEM-T Easy-K3L-L-K3Li(WR)用SnaBI和HindIII处理，并连接以构建pSP72-K3L-L-K3Li-p7.5-DsRed-TF-K3L-R(WR)。为了将K3L的起始密码子引入构建的pSP72-K3L-L-K3Li-p7.5-DsRed-TF-K3L-R(WR)中，使用上表18所示的引物进行点突变，从而最终构建了pSP72-K3L-L-K3Li-p7.5-DsRed-TF-K3LATG-K3L-R(WR)(以下称为“WR K3L(i)穿梭质粒”)。
实施例2.1.4 VGF和TK基因表达失活的重组WR痘苗病毒的产生
首先，以与实施例1.1.4相同的条件和方法获得VGF基因表达失活的重组WR痘苗病毒Vi，不同之处在于使用了WR VGF(i)穿梭质粒和WR野生型病毒。此后，以与上述相同的方法获得VGF和TK基因表达失活的重组WR痘苗病毒ViTi，不同之处在于使用了WR TK(i)穿梭质粒和重组WR痘苗病毒Vi。
实施例2.1.5 WR-VV01病毒的产生
首先，以与实施例1.1.4相同的条件和方法获得VGF、TK和K3L基因表达失活的重组WR痘苗病毒WR-VV01，不同之处在于使用了WR K3L(i)穿梭质粒和重组WR痘苗病毒ViTi；其基因结构如图17所示。
实施例2.2 WR-VV06病毒的产生
实施例2.2.1 TK基因表达失活并诱导sPD1-Fc和PH20基因表达的重组WR痘苗病毒质粒的构建
首先，将如实施例2.1.2中构建的WR TK(i)穿梭质粒和如实施例1.2.1中构建的IHD-W TK(sPD1-Fc)穿梭质粒各自用BamHI和EcoRI处理，然后连接以构建PSP72-TK-L-TF-TF-EGFP-pSE/L-TF-sPD1-Fc-p7.5-TK-R(WR)(以下称为“WR TKi(sPD1-Fc)穿梭质粒”)。此后，将如此构建的质粒和实施例1.3.1中构建的IHD-W TK(PH20)穿梭质粒各自用BamHI和PacI处理，然后连接以最终构建pSP72-TK-L-TF-pSE/L-EGFP-TF-pHyb-PH20-TF-TF-sPD1-Fc-p7.5-TK-R(WR)(以下称为“WR Tki(sPD1-Fc+PH20)穿梭质粒”)。
实施例2.2.2 K3L基因表达失活并诱导IL-12基因表达的重组WR痘苗病毒质粒的构建
为了在WR K3Li穿梭质粒内部构建基因表达盒，将如实施例2.1.3中构建的WRK3Li穿梭质粒和如实施例1.4.1中构建的IHD-W K3L(IL-12)穿梭质粒用Sa1I处理，并连接以最终构建pSP72K3L-L-p7.5-DsRed-TF-pI1L-B19R-IL-12-TF-TF_K3L-R(WR)(以下称为“WR K3Li(IL-12)穿梭质粒”)。
实施例2.2.3 WR-VV06病毒的产生
首先，以与实施例1.1.4相同的条件和方法获得VGF和K3L基因表达失活的重组WR痘苗病毒ViKi，不同之处在于使用了如实施例2.1.3中构建的WR K3Li穿梭质粒和如实施例2.1.4构建的重组WR痘苗病毒Vi。
以与实施例1.1.4相同的条件和方法获得VGF、TK和K3L基因表达失活并且诱导sPD1-Fc和PH20基因表达的重组WR痘苗病毒WR-VV05，不同之处在于使用了如实施例2.2.1中构建的WR TKi(sPD1-Fc+PH20)穿梭质粒和重组WR痘苗病毒ViKi。
以与实施例1.1.4相同的条件和方法获得VGF、TK和K3L基因表达失活并且诱导sPD1-Fc、PH20和IL-12基因表达的重组WR-VV06，不同之处在于使用了如实施例2.2.2中构建的WR K3Li(IL-12)穿梭质粒和重组WR-VV05；其基因结构如图18所示。
实施例2.2.4 WR-VV06中sPD1-Fc、PH20和IL-12基因的插入和表达的确认
使用Maxwell纯化试剂盒(Cat#AS1330)获得了如实施例2.2.2产生的重组WR-VV06的gDNA，并使用下表19中的引物确认了重组病毒的gDNA结构。如图19所示，通过确认VGF、TK和K3L位置每处的DNA结构而获得的结果显示，与对照组相比，在插入了基因的位置处PCR片段大小有变化。
进行蛋白质印迹以确认插入的sPD1-Fc和PH20基因通过重组病毒在感染的细胞中表达。首先，用重组WR-VV06以0.05MOI处理HeLa细胞44至52小时。然后，用不含胎牛血清的MEM培养基替换该培养基，并将细胞进一步孵育16至20小时。将培养基和细胞彼此分离，并分别从中获得蛋白质。通过Bradford分析法对制备的蛋白质进行定量，然后使用蛋白质印迹确认蛋白质表达。在此，针对sPD1-Fc基因，使用抗mPdcd1(E-18)(Santacruz,Cat#SC-10299)作为一抗，使用抗山羊作为二抗；针对PH20基因，使用抗hPH20(LsBio,Cat#LS-C331909)作为一抗，使用抗兔作为二抗。表达结果如图20a所示。
另外，进行ELISA以确认插入的IL-12基因通过重组病毒在感染的细胞中表达。首先，用重组WR-VV06以0.05MOI处理HeLa细胞。44至52小时后，仅分离培养基并从中获得表达的蛋白质。对于制备的蛋白质，使用小鼠IL-12p70Quantikine ELISA试剂盒(R&D Systems，Cat#M1270)来鉴定蛋白质表达水平。在此，将蛋白质储备溶液稀释至1/5,000并使用。测量结果在图20b中示出。
[表19]
Figure BDA0002693042930000361
Figure BDA0002693042930000371
实施例3.重组利斯特痘苗病毒的产生
实施例3.1 Lister-VV01病毒的产生
实施例3.1.1缺失VGF基因的重组利斯特痘苗病毒质粒的构建
首先，通过PCR扩增利斯特痘苗病毒基因组DNA(ATCC，VR-1549)中VGF基因两侧的基因区域，然后分别插入pGEM-T Easy中，以构建pGEM-T Easy-VGF-L(Lister)和pGEM-TEasy-VGF-R(Lister)。用于扩增VGF基因两侧的同源核苷酸序列的引物信息示于下表20中。
将pSP72载体和pGEM-T Easy-VGF-L(Lister)各自用HindIII和SalI处理，并连接以构建pSP72-VGF-L(Lister)。另外，将pSP72-VGF-L(Lister)和pGEM-T Easy-VGF-R(Lister)各自用PacI和KpnI处理，并连接以构建pSP72-VGF-L-VGF-R(Lister)。
将构建的pSP72-VGF-L-VGF-R(Lister)载体和如实施例1.1.1中构建的IHD-W VGF穿梭质粒各自用NheI和PacI处理，并连接以最终构建pSP72-VGF-L-p11-LacZ-VGF-R(Lister)(以下称为“Lister VGF穿梭质粒”)。
[表20]
Figure BDA0002693042930000372
实施例3.1.2缺失TK基因的重组利斯特痘苗病毒质粒的构建
通过PCR扩增利斯特痘苗病毒基因组DNA(ATCC，VR-1549)中TK基因两侧的基因区域，然后分别插入pGEM-T Easy中，以构建pGEM-T Easy-TK-L(Lister)和pGEM-T Easy-TK-R(Lister)。用于扩增TK基因两侧的同源核苷酸序列的引物信息示于下表21中。
将pGEM-T Easy-TK-L(Lister)和pGEM-T Easy-TK-R(Lister)各自用BamHI和XmaI处理，并连接以构建pGEM-T Easy-TK-L-TK-R(Lister)。另外，将pSP72载体和pGEM-T Easy-TK-L-TK-R(Lister)各自用SpeI和XmaI处理，并连接构建pSP72-TK-L-TK-R(Lister)。
将构建的pSP72-TK-L-TK-R(Lister)载体和如实施例1.1.2中构建的IHD-W TK穿梭质粒各自用NotI和SalI处理，并连接以最终构建pSP72-TK-L-TF-pSE/L-EGFP-TK-R(Lister)(下文称为“Lister TK穿梭质粒”)。
[表21]
Figure BDA0002693042930000381
实施例3.1.3缺失K3L基因的重组利斯特痘苗病毒质粒的构建
将如实施例1.1.3中构建的IHD-W K3L穿梭质粒用BglII和EcoRV处理，并通过PCR扩增位于利斯特痘苗病毒的基因组DNA(ATCC，VR-1549)中K3L基因右侧的基因(R-arm)。然后，使用无缝克隆法将上述基因插入，以构建pSP72-p7.5-DsRed-TF-TF-K3L-R(Lister)。
将构建的pSP72-p7.5-DsRed-TF-TF-K3L-R(Lister)用XhoI和HindIII处理，通过PCR扩增利斯特痘苗病毒的基因组DNA中位于K3L基因左侧的基因(L-arm)。然后，使用无缝克隆法将上述基因插入，以最终构建pSP72-K3L-L-p7.5-DsRed-TF-TF-K3L-R(Lister)(以下称为“Lister K3L穿梭质粒”)。在无缝克隆过程中使用的引物的序列示于下表22中。
[表22]
Figure BDA0002693042930000391
实施例3.1.4缺失VGF基因的重组利斯特痘苗病毒的产生
以与实施例1.1.4相同的条件和方法获得缺失VGF基因的重组利斯特痘苗病毒V，不同之处在于使用了利斯特野生型痘苗病毒和如实施例3.1.1构建的利斯特VGF穿梭质粒。
实施例3.1.5缺失VGF和TK基因的重组利斯特痘苗病毒的产生
以与实施例1.1.4相同的条件和方法获得缺失VGF和TK基因的重组利斯特痘苗病毒VT，不同之处在于使用了如实施例3.1.4中产生的重组利斯特痘苗病毒V和如实施例3.1.2中构建的Lister TK穿梭质粒。
实施例3.1.6 Lister-VV01病毒的产生
以与实施例1.1.4相同的条件和方法获得缺失VGF、TK和K3L基因的重组Lister-VV01，不同之处在于使用了如实施例3.1.5中产生的重组利斯特痘苗病毒VT和如实施例3.1.3中构建的Lister K3L穿梭质粒；其基因结构如图21所示。
实施例3.2 Lister-VV06病毒的产生
实施例3.2.1缺失TK基因并诱导sPD1-Fc和PH20基因表达的重组利斯特痘苗病毒质粒的构建
将如实施例3.1.2中构建的质粒和如实施例1.5.1中构建的IHD-W TK(sPD1-Fc+PH20)穿梭质粒各自用NotI和NheI处理，并连接以最终构建pSP72-TK-L-TF-pSE/L-EGFP-pHyb-PH20-TF-TF-sPD1-Fc-p7.5-TK-R(Lister)(以下称为“Lister TK(sPD1-Fc+PH20)穿梭质粒”)。
实施例3.2.2缺失K3L基因并诱导IL-12基因表达的重组利斯特痘苗病毒质粒的构建
为了在Lister K3L穿梭质粒内部构建基因表达盒，将如实施例3.1.3中构建的Lister K3L穿梭质粒和如实施例1.4.1中构建的IHD-W K3L(IL-12)穿梭质粒用SalI处理，并连接以最终构建pSP72K3L-L-p7.5-DsRed-TF-pI1L-B19R-IL-12-TF-TF-K3L-R(Lister)(以下称为“Lister K3L(IL-12)穿梭质粒”)。
实施例3.2.3 Lister-VV06病毒的产生
首先，以与实施例1.1.4相同的条件和方法获得缺失VGF和K3L基因的重组利斯特痘苗病毒VK，不同之处在于使用了如实施例3.1.4中产生的重组利斯特痘苗病毒V和如实施例3.1.3中构建的Lister K3L穿梭质粒。
以与实施例1.1.4相同的条件和方法获得缺失VGF、TK和K3L基因并诱导sPD1-Fc和PH20基因表达的重组利斯特痘苗病毒Lister-VV05，不同之处在于使用了如实施例3.2.1中构建的Lister TK(sPD1-Fc+PH20)穿梭质粒和重组利斯特痘苗病毒VK。
以与实施例1.1.4相同的条件和方法获得缺失VGF、TK和K3L基因并诱导了sPD1-Fc、PH20和IL-12基因表达的重组Lister-VV06，不同之处在于使用了如实施例3.2.2中构建的Lister K3L(IL-12)穿梭质粒和重组Lister-VV05；其基因结构如图22所示。
实施例3.2.4 Lister-VV06中sPD1-Fc、PH20和IL-12基因的插入和表达的确认
使用Maxwell病毒总核酸纯化试剂盒(Promega,Cat#AS1330)获得了如实施例3.2.3产生的重组Lister-VV06的gDNA，并使用下表23中的引物确认了重组病毒Lister-VV06的gDNA结构。如图23所示，通过确认VGF、TK和K3L位置每处的DNA结构而获得的结果显示，与对照组相比，在插入了基因的位置处PCR片段大小有变化。进行蛋白质印迹以确认插入的sPD1-Fc基因通过重组病毒在感染的细胞中表达。首先，用重组Lister-VV06以0.05MOI处理HeLa细胞44至52小时。然后，用不含胎牛血清的MEM培养基替换该培养基，并将细胞进一步孵育16至20小时。将培养基和细胞彼此分离，并分别从中获得蛋白质。
通过Bradford分析法对制备的蛋白质进行定量，然后使用蛋白质印迹确认蛋白质表达。在此，使用抗mPdcd1(E-18)(Santacruz,Cat#SC-10299)作为一抗，使用抗山羊作为二抗。另外，进行蛋白质印迹确认插入的PH-20基因通过重组病毒在感染的细胞中表达。在此，使用抗hPH20(LsBio，目录号LS-C331909)作为一抗，并使用抗兔作为二抗。表达结果示于图24a。另外，进行ELISA以确认插入的IL-12基因通过重组病毒在感染的细胞中表达。首先，用重组Lister-VV06以0.05MOI感染HeLa细胞。44至52小时后，仅分离培养基并从中获得表达的蛋白质。对于制备的蛋白质，使用小鼠IL-12p70 Quantikine ELISA试剂盒(R&DSystems，Cat#M1270)来鉴定蛋白质表达水平。在此，将蛋白质储备溶液稀释至1/5,000并使用。测量结果在图24b中示出。
[表23]
名称 序列(5'→3') SEQ ID NO
VGF正向 AGGTTCCGTAAGCAAAGAATATAAG SEQ ID NO:117
VGF反向 AGGTAACTAGATTTTACTTTAATATGCCGAA SEQ ID NO:118
TK正向 GGAAGGGTCAAACTTAATAAAGGAT SEQ ID NO:119
TK反向 ACCGTGTCGCTGTAACTTACTA SEQ ID NO:120
K3L正向 GACGCTGAACACGCTAACGATAGT SEQ ID NO:121
K3L反向 ACTGCGACGAGATACAACCGGA SEQ ID NO:122
Ⅱ.重组痘苗病毒体内杀伤肿瘤细胞能力的确定
实验例1.缺失VGF、TK和K3L基因并诱导sPD1-Fc或PH20或IL-12基因表达的重组IHD-W株痘苗病毒在动物模型中的肿瘤抑制功效的确定
实验例1.1.IHD-W-VV02、IHD-W-VV03和IHD-W-VV05病毒在动物模型中的肿瘤抑制功效的确定
对如实施例1中产生的重组IHD-W-VV02、IHD-W-VV03和IHD-W-VV05在小鼠模型中的抗肿瘤作用进行了比较。
结直肠肿瘤模型
首先，通过在含有10％胎牛血清的RPMI培养基中孵育来制备结直肠癌细胞系CT26.WT。当在培养箱中在37℃，5％CO2的条件下培养的细胞占培养皿的70％至80％时，制备细胞用于癌细胞接种。将制备的癌细胞在4℃以1,500rpm离心5分钟去除所有上清液，并通过向其中添加赋形剂(RPMI培养基)来制备细胞。将由此制备的1×106个细胞皮下注射在BALB/c小鼠(BALB/cAnHsd；KOATECH，韩国)的右侧腹中以制备小鼠结直肠肿瘤模型。一周后，当肿瘤体积增长到大约70至100mm3时，将制备的小鼠模型分组(每组4只小鼠)，分别给药PBS、IHD-W-VV02、IHD-W-VV03和IHD-W-VV05，然后将50ul PBS(Welgene，Cat No.LB001-02)或每种病毒以1×107TCID50/50ul一次地给药到肿瘤中。病毒给药后通过测量肿瘤体积获得的结果示于图25。
如图25所示，在病毒治疗后第14天通过测量肿瘤大小获得的结果显示，IHD-W-VV02给药组、IHD-W-VV03给药组和IHD-W-VV05给药组表现出肿瘤体积小于PBS给药组的肿瘤体积。确认了，当在病毒给药组中比较肿瘤体积时，IHD-W-VV05给药组表现出肿瘤体积小于IHD-W-VV02给药组或IHD-W-VV03给药组的肿瘤体积。
实验例1.2.IHD-W-VV01和IHD-W-VV05病毒在动物模型中的肿瘤抑制功效的确定
对如实施例1中产生的重组IHD-W-VV01和IHD-W-VV05在小鼠模型中的的抗肿瘤作用进行了比较。
皮肤肿瘤模型
接下来，通过在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中孵育来制备皮肤癌细胞系B16F10。当在培养箱中在37℃，5％CO2的条件下培养的细胞占培养皿的70％至80％时，制备细胞用于癌细胞接种。将制备的癌细胞在4℃以1,500rpm离心5分钟去除所有上清液，并通过向其中添加赋形剂(DMEM培养基)来制备细胞。将由此制备的5×105个细胞皮下注射在C57BL/6N小鼠(C57BL/6NHsd；KOATECH，韩国)的右侧腹中以制备小鼠皮肤肿瘤模型。一周后，当肿瘤体积增长到大约70至100mm3时，将制备的小鼠模型分组(每组6只小鼠)，分别给药PBS、IHD-W-VV01和IHD-W-VV05，然后将50ul PBS(Welgene，Cat No.LB001-02)或每种病毒以1×106TCID50/50ul一次地给药到肿瘤中。病毒给药后通过测量肿瘤体积获得的结果示于图26。
如图26所示，在病毒治疗后第12天通过测量肿瘤体积获得的结果显示，IHD-W-VV05给药组表现出肿瘤体积小于IHD-W-VV01给药组的肿瘤体积。在PBS给药组中，在病毒给药后第12天之前，肿瘤体积已经达到平均2,000mm3。因此，对PBS给药组实施安乐死，并且将12天后的数据从分析中排除。
肺肿瘤模型
接下来，使用由10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺和1％抗生素-抗真菌剂(GIBCO,Cat No.15240-062)组成的DMEM培养基在培养箱中在37℃，5％CO2的条件下孵育肺癌细胞系LLC1。进行三次传代，然后在最后一次传代期间，当细胞占培养板的70％至80％时，收获细胞。去除收获的细胞的上清液，并向其中添加赋形剂(DMEM)，使得细胞制备成浓度为1×107个/mL。将由此制备的含有1×106个细胞的细胞悬液皮下注射在C57BL/6N小鼠(C57BL/6NHsd；KOATECH，韩国)的右侧腹中以制备小鼠肺肿瘤模型。一周后，当肿瘤体积增长到大约70至100mm3时，将制备的小鼠模型分组(每组6只小鼠)，分别给药PBS、IHD-W-VV01和IHD-W-VV05，然后将50ul PBS(Welgene，Cat No.LB001-02)或每种病毒以1×106TCID50/50ul一次地给药到肿瘤中。病毒给药后通过测量肿瘤体积获得的结果示于图27。
如图27所示，在病毒治疗后第14天通过测量肿瘤大小获得的结果显示，IHD-W-VV01给药组和IHD-W-VV05给药组表现出肿瘤体积小于PBS给药组的肿瘤体积。确认了，当在病毒给药组中比较肿瘤体积时，IHD-W-VV05给药组表现出肿瘤体积小于IHD-W-VV01给药组的肿瘤体积。
实验例1.3.IHD-W-VV02、IHD-W-VV03、IHD-W-VV04和IHD-W-VV06病毒在动物模型中的肿瘤抑制功效的确定
对如实施例1中产生的重组IHD-W-VV02、IHD-W-VV03、IHD-W-VV04和IHD-W-VV06在小鼠模型中的的抗肿瘤作用进行了比较。
结直肠肿瘤模型
首先，通过在含有10％胎牛血清的RPMI培养基中孵育来制备结直肠癌细胞系CT26.WT。当在培养箱中在37℃，5％CO2的条件下培养的细胞占培养皿的70％至80％时，制备细胞用于癌细胞接种。将制备的癌细胞在4℃以1,500rpm离心5分钟去除所有上清液，并通过向其中添加赋形剂(RPMI培养基)来制备细胞。将由此制备的1×106个细胞皮下注射在BALB/c小鼠(BALB/cAnHsd；KOATECH，韩国)的右侧腹中以制备小鼠结直肠肿瘤模型。一周后，当肿瘤体积增长到大约70至100mm3时，将制备的小鼠模型分组(每组4只小鼠)，分别给药PBS、IHD-W-VV02、IHD-W-VV03、IHD-W-VV04和IHD-W-VV06，然后将50ul PBS(Welgene，CatNo.LB001-02)或每种病毒以1×107TCID50/50ul一次地给药到肿瘤中。病毒给药后通过测量肿瘤体积获得的结果示于图28。
如图28所示，在病毒治疗后第14天通过测量肿瘤体积获得的结果显示，IHD-W-VV02给药组、IHD-W-VV03给药组、IHD-W-VV04给药组和IHD-W-VV06给药组表现出肿瘤体积小于PBS给药组的肿瘤体积。确认了，当在病毒给药组中比较肿瘤体积时，IHD-W-VV06给药组表现出肿瘤体积小于IHD-W-VV02给药组、IHD-W-VV03给药组或IHD-W-VV04给药组的肿瘤体积。
肺肿瘤模型
接下来，使用由10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺和1％抗生素-抗真菌剂(GIBCO,Cat No.15240-062)组成的DMEM培养基在培养箱中在37℃，5％CO2的条件下孵育肺癌细胞系LLC1。进行三次传代，然后在最后一次传代期间，当细胞占培养板的70％至80％时，收获细胞。去除收获的细胞的上清液，并向其中添加赋形剂(DMEM)，使得细胞制备成浓度为1×107个/mL。将由此制备的含有1×106个细胞的细胞悬液皮下注射在C57BL/6N小鼠(C57BL/6NHsd；KOATECH，韩国)的右侧腹中以制备小鼠肺肿瘤模型。一周后，当肿瘤体积增长到大约70至100mm3时，将制备的小鼠模型分组(每组6只小鼠)，分别给药IHD-W-VV02、IHD-W-VV03、IHD-W-VV04和IHD-W-VV06，然后将50ul PBS(Welgene，Cat No.LB001-02)或每种病毒以1×106TCID50/50ul一次地给药到肿瘤中。病毒给药后通过测量肿瘤体积获得的结果示于图29。
如图29所示，在病毒治疗后第14天通过测量肿瘤大小而获得的结果显示，IHD-W-VV02给药组、IHD-W-VV03给药组、IHD-W-VV04给药组和IHD-W-VV06给药组表现出肿瘤体积小于PBS给药组的肿瘤体积。确认了，当在病毒给药组之间比较肿瘤体积时，IHD-W-VV06给药组表现出肿瘤体积小于IHD-W-VV02给药组、IHD-W-VV03给药组或IHD-W-VV04给药组的肿瘤体积。
实验例1.4.IHD-W-VV05和IHD-W-VV06病毒在动物模型中的肿瘤抑制功效的确定
对如实施例1中产生的重组IHD-W-VV05和IHD-W-VV06在小鼠模型中的抗肿瘤作用进行了比较。
结直肠肿瘤模型
首先，通过在含有10％胎牛血清的RPMI培养基中孵育来制备结直肠癌细胞系CT26.WT。当在培养箱中在37℃，5％CO2的条件下培养的细胞占培养皿的70％至80％时，制备细胞用于癌细胞接种。将制备的癌细胞在4℃以1,500rpm离心5分钟去除所有上清液，并通过向其中添加赋形剂(RPMI培养基)来制备细胞。将由此制备的1×106个细胞皮下注射在BALB/c小鼠(BALB/cAnHsd；KOATECH，韩国)的右侧腹中以制备小鼠结直肠肿瘤模型。一周后，当肿瘤体积增长到大约70至100mm3时，将制备的小鼠模型分组(每组4只小鼠)，分别给药PBS、IHD-W-VV05和IHD-W-VV06，然后将50ul PBS(Welgene，Cat No.LB001-02)或每种病毒以1×107TCID50/50ul一次地给药到肿瘤中。病毒给药后通过测量肿瘤体积获得的结果示于图30。
如图30所示，在病毒治疗后第14天通过测量肿瘤体积获得的结果显示，IHD-W-VV05给药组和IHD-W-VV06给药组表现出肿瘤体积小于PBS给药组的肿瘤体积。确认了，当在病毒给药组中比较肿瘤体积时，IHD-W-VV06给药组表现出肿瘤体积小于IHD-W-VV05给药组的肿瘤体积。
皮肤肿瘤模型
接下来，通过在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中孵育来制备皮肤癌细胞系B16F10。当在培养箱中在37℃，5％CO2的条件下培养的细胞占培养皿的70％至80％时，制备细胞用于癌细胞接种。将制备的癌细胞在4℃以1,500rpm离心5分钟去除所有上清液，并通过向其中添加赋形剂(DMEM培养基)来制备细胞。将由此制备的5×105个细胞皮下注射在C57BL/6N小鼠(C57BL/6NHsd；KOATECH，韩国)的右侧腹中以制备小鼠皮肤肿瘤模型。一周后，当肿瘤体积增长到大约70至100mm3时，将制备的小鼠模型分组(每组6只小鼠)，分别给药PBS、IHD-W-VV05和IHD-W-VV06，然后将50ul PBS(Welgene，Cat No.LB001-02)或每种病毒以1×106TCID50/50ul一次地给药到肿瘤中。病毒给药后通过测量肿瘤体积获得的结果示于图31。
如图31所示，在病毒治疗后第12天通过测量肿瘤体积获得的结果显示，IHD-W-VV06给药组表现出肿瘤体积小于HD-W-VV05给药组的肿瘤体积。在PBS给药组中，在病毒给药后第12天之前，肿瘤体积已经达到平均2,000mm3。因此，对PBS给药组实施安乐死，并且将12天后的数据从分析中排除。
肺肿瘤模型
接下来，使用由10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺和1％抗生素-抗真菌剂(GIBCO,Cat No.15240-062)组成的DMEM培养基在培养箱中在37℃，5％CO2的条件下孵育肺癌细胞系LLC1。进行三次传代，然后在最后一次传代期间，当细胞占培养板的70％至80％时，收获细胞。去除收获的细胞的上清液，并向其中添加赋形剂(DMEM)，使得细胞制备成浓度为1×107个/mL。将由此制备的含有1×106个细胞的细胞悬液皮下注射在C57BL/6N小鼠(C57BL/6NHsd；KOATECH，韩国)的右侧腹中以制备小鼠肺肿瘤模型。一周后，当肿瘤体积增长到大约70至100mm3时，将制备的小鼠模型分组(每组6只小鼠)，分别给药PBS、IHD-W-VV05和IHD-W-VV06，然后将50ul PBS(Welgene，Cat No.LB001-02)或每种病毒以1×106TCID50/50ul一次地给药到肿瘤中。病毒给药后通过测量肿瘤体积获得的结果示于图32。
如图32所示，在病毒治疗后第14天通过测量肿瘤体积获得的结果显示，IHD-W-VV05给药组和IHD-W-VV06给药组表现出肿瘤体积小于PBS给药组的肿瘤体积。确认了，当在病毒给药组中比较肿瘤体积时，IHD-W-VV06给药组表现出肿瘤体积小于IHD-W-VV05给药组的肿瘤体积。
实验例2.其中缺失VGF、TK和K3L基因或其表达失活并诱导sPD1-Fc或PH20或IL-12基因表达的各重组痘苗病毒在动物模型中的肿瘤抑制功效的确定
实验例2.1.IHD-W-VV01和IHD-W-VV06病毒在动物模型中的肿瘤抑制功效的确定
对如实施例1中产生的重组IHD-W-VV01和IHD-W-VV06在小鼠模型中的抗肿瘤作用进行了比较。
皮肤肿瘤模型
接下来，通过在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中孵育来制备皮肤癌细胞系B16F10。当在培养箱中在37℃，5％CO2的条件下培养的细胞占培养皿的70％至80％时，制备细胞用于癌细胞接种。将制备的癌细胞在4℃以1,500rpm离心5分钟去除所有上清液，并通过向其中添加赋形剂(DMEM培养基)来制备细胞。将由此制备的5×105个细胞皮下注射在C57BL/6N小鼠(C57BL/6NHsd；KOATECH，韩国)的右侧腹中以制备小鼠皮肤肿瘤模型。一周后，当肿瘤体积增长到大约70至100mm3时，将制备的小鼠模型分组(每组4只小鼠)，分别给药PBS、IHD-W-VV01和IHD-W-VV06，然后将50ul PBS(Welgene，Cat No.LB001-02)或每种病毒以1×106TCID50/50ul一次地给药到肿瘤中。病毒给药后通过测量肿瘤体积获得的结果示于图33。
如图33所示，在病毒治疗后第14天通过测量肿瘤体积获得的结果显示，IHD-W-VV01给药组表现出肿瘤体积小于HD-W-VV06给药组的肿瘤体积。在PBS给药组中，在病毒给药后第12天之前，肿瘤体积已经达到平均2,000mm3。因此，对PBS给药组实施安乐死，并且将12天后的数据从分析中排除。
肺肿瘤模型
接下来，使用由10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺和1％抗生素-抗真菌剂(GIBCO,Cat No.15240-062)组成的DMEM培养基在培养箱中在37℃，5％CO2的条件下孵育肺癌细胞系LLC1。进行三次传代，然后在最后一次传代期间，当细胞占培养板的70％至80％时，收获细胞。去除收获的细胞的上清液，并向其中添加赋形剂(DMEM)，使得细胞制备成浓度为1×107个/mL。将由此制备的含有1×106个细胞的细胞悬液皮下注射在C57BL/6N小鼠(C57BL/6NHsd；KOATECH，韩国)的右侧腹中以制备小鼠肺肿瘤模型。一周后，当肿瘤体积增长到大约70至100mm3时，将制备的小鼠模型分组(每组6只小鼠)，分别给药PBS、IHD-W-VV01和IHD-W-VV06，然后将50ul PBS(Welgene，Cat No.LB001-02)或每种病毒以1×106TCID50/50ul一次地给药到肿瘤中。病毒给药后通过测量肿瘤体积获得的结果示于图34。
如图34所示，在病毒治疗后第14天通过测量肿瘤大小获得的结果显示，IHD-W-VV01给药组和IHD-W-VV06给药组表现出肿瘤体积小于PBS给药组的肿瘤体积。发现了，当在病毒给药组中比较肿瘤体积时，IHD-W-VV06给药组表现出肿瘤体积小于IHD-W-VV01给药组的肿瘤体积。
实验例2.2.WR-VV01和WR-VV06病毒在动物模型中的肿瘤抑制功效的确定
对如实施例2中产生的重组WR-VV01和WR-VV06在小鼠模型中的的抗肿瘤作用进行了比较。
肺肿瘤模型
接下来，使用由10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺和1％抗生素-抗真菌剂(GIBCO,Cat No.15240-062)组成的DMEM培养基在培养箱中在37℃，5％CO2的条件下孵育肺癌细胞系LLC1。进行三次传代，然后在最后一次传代期间，当细胞占培养板的70％至80％时，收获细胞。去除收获的细胞的上清液，并向其中添加赋形剂(DMEM)，使得细胞制备成浓度为1×107个/mL。将由此制备的含有1×106个细胞的细胞悬液皮下注射在C57BL/6N小鼠(C57BL/6NHsd；KOATECH，韩国)的右侧腹中以制备小鼠肺肿瘤模型。一周后，当肿瘤体积增长到大约70至100mm3时，将制备的小鼠模型分组(每组6只小鼠)，分别给药PBS、WR-VV01和WR-VV06，然后将50ul PBS(Welgene，Cat No.LB001-02)或每种病毒以1×106TCID50/50ul一次地给药到肿瘤中。病毒给药后通过测量肿瘤体积获得的结果示于图35。
如图35所示，在病毒治疗后第14天通过测量肿瘤大小而获得的结果显示，WR-VV01给药组和WR-VV06给药组表现出肿瘤体积小于PBS给药组的肿瘤体积。发现了，当在病毒给药组之间比较肿瘤体积时，WR-VV06给药组表现出肿瘤体积小于WR-VV01给药组的肿瘤体积。
实验例2.3.Lister-VV01和Lister-VV06病毒在动物模型中的肿瘤抑制功效的确定
对如实施例3中产生的重组Lister-VV01和Lister-VV06在小鼠模型中的抗肿瘤作用进行了比较。
肺肿瘤模型
接下来，使用由10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺和1％抗生素-抗真菌剂(GIBCO,Cat No.15240-062)组成的DMEM培养基在培养箱中在37℃，5％CO2的条件下孵育肺癌细胞系LLC1。进行三次传代，然后在最后一次传代期间，当细胞占培养板的70％至80％时，收获细胞。去除收获的细胞的上清液，并向其中添加赋形剂(DMEM)，使得细胞制备成浓度为1×107个/mL。将由此制备的含有1×106个细胞的细胞悬液皮下注射在C57BL/6N小鼠(C57BL/6NHsd；KOATECH，韩国)的右侧腹中以制备小鼠肺肿瘤模型。一周后，当肿瘤体积增长到大约70至100mm3时，将制备的小鼠模型分组(每组6只小鼠)，分别给药PBS、Lister-VV01和Lister-VV06，然后将50ul PBS(Welgene，Cat No.LB001-02)或每种病毒以1×106TCID50/50ul一次地给药到肿瘤中。病毒给药后通过测量肿瘤体积获得的结果示于图36。
如图36所示，在病毒治疗后第14天通过测量肿瘤大小而获得的结果显示，Lister-VV06给药组表现出肿瘤体积小于PBS给药组的肿瘤体积。发现了，当在病毒给药组之间比较肿瘤体积时，Lister-VV06给药组表现出肿瘤体积小于Lister-VV01给药组的肿瘤体积。
Ⅲ.其中缺失VGF、TK和K3L基因或其表达失活并诱导sPD1-Fc或PH20或IL-12基因表达的重组痘苗病毒的体外细胞杀伤能力的确定
实验例1.由给药IHD-W-VV06、WR-VV06或Lister-VV06引起的肿瘤细胞杀伤功效的确定
进行CCK-8测定以确认实施例1中产生的重组痘苗病毒IHD-W-VV06、实施例2中产生的重组痘苗病毒WR-VV06或实施例3中产生的重组痘苗病毒Lister-VV06是否对多种类型的癌细胞表现出杀伤能力。
为了确认重组病毒在各种小鼠癌细胞系中的细胞杀伤能力，如下表24所示制备癌细胞系，并在培养箱中在37℃和5％CO2的条件下孵育。然后，将细胞系分配到96孔板中。
[表24]
癌 细胞系 使用的培养基(培养基：含10％胎牛血清)
结直肠癌 CT26-WT 含2％胎牛血清和2mM L-谷氨酰胺的RPMI培养基
肾癌 Renca 含2％胎牛血清和2mM L-谷氨酰胺的RPMI培养基
肝癌 Hep-55.1C 含2％胎牛血清和4mM L-谷氨酰胺的RPMI培养基
肺癌 LLC1 含2％胎牛血清和2mM L-谷氨酰胺的DMEM培养基
乳腺癌 JC 含2％胎牛血清和2mM L-谷氨酰胺的RPMI培养基
乳腺癌 4T1 含2％胎牛血清和2mM L-谷氨酰胺的RPMI培养基
直肠癌 CMT93 含2％胎牛血清和4mM L-谷氨酰胺的RPMI培养基
黑素瘤 B16F10 含2％胎牛血清和4mM L-谷氨酰胺的RPMI培养基
在此，分配各细胞系使得CT26-WT和Hep-55.1C的每孔细胞数为2×104个细胞，Renca、LLC1、4T1、CMT93和B16F10的每孔细胞数为1×104个细胞，JC的每孔细胞数为2×103个细胞。孵育24小时后，考虑到每种重组病毒的野生型病毒的杀伤细胞的能力，用重组痘苗病毒按如下方式感染细胞系：对于IHD-W-VV06为1MOI，对于WR-VV06为1MOI，对于Lister-VV06为10MOI。在此，将未经病毒处理的细胞用作相应的对照组。3天后，将细胞用CCK-8(Dojindo，Cat No.CK04)溶液染色以确定癌细胞系的细胞活力。结果在图37中示出。
如图37所示，无论哪种痘苗株，缺失VGF、TK和K3L基因或其表达失活并诱导sPD1-Fc、PH20和IL-12基因表达的重组痘苗病毒都对各种类型的癌细胞表现出杀伤能力。
序列表
<110> 可隆生命科学株式会社
<120> 重组痘苗病毒和包含其的药物组合物
<130> PCB812126KLS
<150> KR 10-2018-0007381
<151> 2018-01-19
<160> 146
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VGF-L forward primer (IHD-W)
<400> 1
cgaaagcttg taagatgttt agaaaatgga tatttc 36
<210> 2
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VGF-L reverse primer (IHD-W)
<400> 2
ctgggatcct aggctagcgt gtaaataata taaaaataac aatacaatat tg 52
<210> 3
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VGF-R forward primer (IHD-W)
<400> 3
ctggaattcg atttaattaa tttttataaa ttttttttat gagtattttt acaaaaaa 58
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VGF-R reverse primer (IHD-W)
<400> 4
tagggatccc atcgatagta caataacttt tatgaaat 38
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TK-L forward primer (IHD-W)
<400> 5
gatctgcagc cctcttcaag aacccattag 30
<210> 6
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TK-L reverse primer (IHD-W)
<400> 6
tagggatcct aggcggccgc atgacaataa agaattaatt attgttcact t 51
<210> 7
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TK-R forward primer (IHD-W)
<400> 7
catgaattct attatatttt ttatctaaaa aactaaaaat aaacat 46
<210> 8
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TK-R reverse primer(IHD-W)
<400> 8
agatctatcg ctttagtagt aggaaatgtt ttattg 36
<210> 9
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L-L forward primer (IHD-W)
<400> 9
tcggtcgacc atatgtttaa acgacgcatt atctg 35
<210> 10
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L-L reverse primer (IHD-W)
<400> 10
tcgaagcttt ttttataccg aacataaaaa taaggttaat tat 43
<210> 11
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L-R forward primer (IHD-W)
<400> 11
cgcagataaa aatcacttgt taacgggctc gtaa 34
<210> 12
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L-R reverse primer (IHD-W)
<400> 12
aagcgctaac atggattagg aagcgctaac atgg 34
<210> 13
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p7.5-DsRed forward primer (IHD-W)
<400> 13
aggaagcttt ccaaacccac ccgcttttta t 31
<210> 14
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p7.5-DsRed reverse primer (IHD-W)
<400> 14
cggatatctt tttatctgcg cggttaac 28
<210> 15
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sPD1-Fc forward primer
<400> 15
agtgaattca gtgctagcag taagcttatg tgggtccggc aggtac 46
<210> 16
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sPD1-Fc reverse primer
<400> 16
actttaatta atcatttacc cggagtccgg g 31
<210> 17
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p7.5 forward primer
<400> 17
gaattcatcg agctctccaa acccacccgc ttttta 36
<210> 18
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p7.5 reverse primer
<400> 18
actttaatta atcatttacc cggagtccgg g 31
<210> 19
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Infusion forward primer (sPD1-Fc)
<400> 19
aaatataata gaattcgatt tgctagctcc aaac 34
<210> 20
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Infusion reverse primer (sPD1-Fc)
<400> 20
tgggccctat gtcgacggat cccgagaaa 29
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VGF forward primer
<400> 21
aggttccgta agcaaagaat ataag 25
<210> 22
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VGF reverse primer
<400> 22
aggtaactag attttacttt aatatgccga a 31
<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TK forward primer
<400> 23
ggaagggtca aacttaataa aggat 25
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TK reverse primer
<400> 24
accgtgtcgc tgtaacttac ta 22
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L forward primer
<400> 25
gacgctgaac acgttaacga tagt 24
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L reverse primer
<400> 26
actgcgacga gatacaaccg ga 22
<210> 27
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pHyb promoter forward primer
<400> 27
tgtcgaccta gcacgcgtgt ttaaacgtt 29
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pHyb promoter reverse primer
<400> 28
caacagtacc ggattgccaa 20
<210> 29
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Exon2 forward primer
<400> 29
actgttgaat actagatggg agtgctaaaa ttcaagcac 39
<210> 30
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Exon2 reverse primer
<400> 30
ccgcgaattc actagagctc ttgagaaagg aatttcaaaa cttgat 46
<210> 31
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Exon3 forward primer
<400> 31
aattcctttc tcaagatgaa cttgtgtata catttggc 38
<210> 32
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Exon3 reverse primer
<400> 32
gagcaagcaa gatttcatac ttcgcattat actgagggtt 40
<210> 33
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Exon4 forward primer
<400> 33
aaatcttgct tgctcctaga caatt 25
<210> 34
<211> 64
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Exon4 reverse primer
<400> 34
atccaacgcg ttgggatccg cataaaaatg cataaaaatt tatagtgtgg agggtgaagc 60
attg 64
<210> 35
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Infusion forward primer (PH20)
<400> 35
tgggccctat gtcgacctag cacgcgtgtt taaa 34
<210> 36
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Infusion reverse primer (PH20)
<400> 36
aaatataata gaattcgcta gcgttgggat ccgcataa 38
<210> 37
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VGF forward primer
<400> 37
aggttccgta agcaaagaat ataag 25
<210> 38
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VGF reverse primer
<400> 38
aggtaactag attttacttt aatatgccga a 31
<210> 39
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TK forward primer
<400> 39
ggaagggtca aacttaataa aggat 25
<210> 40
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TK reverse primer
<400> 40
accgtgtcgc tgtaacttac ta 22
<210> 41
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L forward primer
<400> 41
gacgctgaac acgttaacga tagt 24
<210> 42
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L reverse primer
<400> 42
actgcgacga gatacaaccg ga 22
<210> 43
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pI1L-B19R promoter forward primer
<400> 43
actgtcgact ttgtatttaa aagttgtttg gtgaactt 38
<210> 44
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pI1L-B19R promoter reverse primer
<400> 44
gtatctcgag taggccttta tacggcacta aaatatttat ataatatc 48
<210> 45
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Infusion forward primer (IL-12 P40)
<400> 45
taaaggccta ctcgacatgt gtcctcagaa gctaaccatc 40
<210> 46
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Infusion reverse primer (IL-12 P40)
<400> 46
cgacccacca ccgcccgagc caccgccacc ggatcggacc ctgcaggga 49
<210> 47
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Infusion forward primer (IL-12 P35)
<400> 47
ggcggtggtg ggtcgggtgg cggcggatct agggtcattc cagtctctgg ac 52
<210> 48
<211> 64
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Infusion reverse primer (IL-12 P35)
<400> 48
gtgattgtat ctcgagtagt cgacctataa aaacctataa aaactcaggc ggagctcaga 60
tagc 64
<210> 49
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR forward primer (gusA)
<400> 49
atctgcagaa gcttcaatac tcgagatgtt acgtcctgta gaaaccc 47
<210> 50
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR reverse primer (gusA)
<400> 50
cgttctagag ttaattaatc attgtttgcc tccctgctg 39
<210> 51
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Infusion forward primer (gusA)
<400> 51
tattgcacgg ggatcagctc gagatgttac gtcct 35
<210> 52
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Infusion reverse primer (gusA)
<400> 52
agtaatcgaa ttcccagaaa aattcattgt ttgcctcc 38
<210> 53
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VGF forward primer
<400> 53
aggttccgta agcaaagaat ataag 25
<210> 54
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VGF reverse primer
<400> 54
aggtaactag attttacttt aatatgccga a 31
<210> 55
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TK forward primer
<400> 55
ggaagggtca aacttaataa aggat 25
<210> 56
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TK reverse primer
<400> 56
accgtgtcgc tgtaacttac ta 22
<210> 57
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L forward primer
<400> 57
cgaatagcca aacggcgaga ag 22
<210> 58
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L reverse primer
<400> 58
acggatacat gtggagcatc tatta 25
<210> 59
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSE/L-EGFP forward primer
<400> 59
cagataaaaa ttaattaaaa aaattgaaat tttatttttt ttttttggaa tataa 55
<210> 60
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSE/L-EGFP reverse primer
<400> 60
agagctcaga ttaatatcga tttacttgta cagctcgtcc atg 43
<210> 61
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VGF forward primer
<400> 61
aggttccgta agcaaagaat ataag 25
<210> 62
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VGF reverse primer
<400> 62
aggtaactag attttacttt aatatgccga a 31
<210> 63
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TK forward primer
<400> 63
ggaagggtca aacttaataa aggat 25
<210> 64
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TK reverse primer
<400> 64
accgtgtcgc tgtaacttac ta 22
<210> 65
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L forward primer
<400> 65
gacgctgaac acgttaacga tagt 24
<210> 66
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L reverse primer
<400> 66
actgcgacga gatacaaccg ga 22
<210> 67
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VGF forward primer
<400> 67
aggttccgta agcaaagaat ataag 25
<210> 68
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VGF reverse primer
<400> 68
aggtaactag attttacttt aatatgccga a 31
<210> 69
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TK forward primer
<400> 69
ggaagggtca aacttaataa aggat 25
<210> 70
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TK reverse primer
<400> 70
accgtgtcgc tgtaacttac ta 22
<210> 71
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L forward primer
<400> 71
cgaatagcca aacggcgaga ag 22
<210> 72
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L reverse primer
<400> 72
acggatacat gtggagcatc tatta 25
<210> 73
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VGF-L forward primer (WR)
<400> 73
cgcagctgtg ttatcgattg atagtggtgt cct 33
<210> 74
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VGF-L reverse primer (WR)
<400> 74
ctgcagcgct agcaccgcat aatctgatag ctggaata 38
<210> 75
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VGF-R forward primer (WR)
<400> 75
cgggatccgt taattaaact cgacgaacta aactacctat ac 42
<210> 76
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VGF-R reverse primer (WR)
<400> 76
cgatatcgga aaatgtctgt tagtaaataa ccatc 35
<210> 77
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p11 promoter forward primer
<400> 77
cggctagctc tagaagcgat gctacgctag 30
<210> 78
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p11 promoter reverse primer
<400> 78
caagcttcgg ttgcctcgag gaattcattt atagcataga a 41
<210> 79
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LacZ forward primer
<400> 79
cgctcgaggg atcccgtcgt tttacaacgt c 31
<210> 80
<211> 61
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LacZ reverse primer
<400> 80
aagcttctta attaaggatc ccccctgccc ggttattatt atttttgaca ccagaccaac 60
t 61
<210> 81
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TK-L forward primer (WR)
<400> 81
aggtcgactt gcgatcaata aatggatcac aac 33
<210> 82
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TK-L reverse primer (WR)
<400> 82
ttagctgcag tatgcggccg caacaatgtc tggaaagaac tgtcc 45
<210> 83
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TK-R forward primer (WR)
<400> 83
cggaattctg tgagcgtatg gcaa 24
<210> 84
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TK-R reverse primer (WR)
<400> 84
tcgggatcct cagtctcatg ttctcaccgg 30
<210> 85
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p7.5 forward primer
<400> 85
aggaagcttt ccaaacccac ccgcttttta t 31
<210> 86
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p7.5 reverse primer
<400> 86
gaattcgcac tagttccgat cgccgtgcaa taaattagaa tataccc 47
<210> 87
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFP forward primer
<400> 87
cgctcgagat ggtgagcaag ggcgagg 27
<210> 88
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFP reverse primer
<400> 88
tgagatcttt acttgtacag ctcgtccatg 30
<210> 89
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gpt forward primer
<400> 89
cgactagtac acaagacagg cttgcgag 28
<210> 90
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gpt reverse primer
<400> 90
cggaattcgg cccactcata aatccagtt 29
<210> 91
<211> 121
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSE/L promoter forward primer
<400> 91
cgagctgcag ataaaaatta attaattacc cgggtaccag gcctagatct gtcgactcga 60
gcttatttat attccaaaaa aaaaaaataa aatttcaatt tttaagcttc gggatccgca 120
a 121
<210> 92
<211> 121
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSE/L promoter reverse primer
<400> 92
ttgcggatcc cgaagcttaa aaattgaaat tttatttttt ttttttggaa tataaataag 60
ctcgagtcga cagatctagg cctggtaccc gggtaattaa ttaattttta tctgcagctc 120
g 121
<210> 93
<211> 82
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TF forward primer
<400> 93
atcggcggcc gctttttatc tgcgcggtta accgcctttt tatccatcag gtgatctgtt 60
tttattgtgg agctgcagcg at 82
<210> 94
<211> 82
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TF reverse primer
<400> 94
atcgctgcag ctccacaata aaaacagatc acctgatgga taaaaaggcg gttaaccgcg 60
cagataaaaa gcggccgccg at 82
<210> 95
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L-Li forward primer
<400> 95
tgtacgtata tttagatgtt ttcagct 27
<210> 96
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L-Li reverse primer
<400> 96
ataagcttct tgcattttgt tattcgt 27
<210> 97
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L-Ri forward primer
<400> 97
cgcagataaa aacatatcct tgttaac 27
<210> 98
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L-Ri reverse primer
<400> 98
gttaacaagg atatgttttt atctgcg 27
<210> 99
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VGF forward primer
<400> 99
aggttccgta agcaaagaat ataag 25
<210> 100
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VGF reverse primer
<400> 100
aggtaactag attttacttt aatatgccga a 31
<210> 101
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TK forward primer
<400> 101
ggaagggtca aacttaataa aggat 25
<210> 102
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TK reverse primer
<400> 102
accgtgtcgc tgtaacttac ta 22
<210> 103
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L forward primer
<400> 103
cgaatagcca aacggcgaga ag 22
<210> 104
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L reverse primer
<400> 104
acggatacat gtggagcatc tatta 25
<210> 105
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VGF-L forward primer (Lister)
<400> 105
atgaagcttt aaaacttgtc tgtatatgta agatgttt 38
<210> 106
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VGF-L reverse primer (Lister)
<400> 106
acccgggttt aattaacatg ctagcgtgta aataatataa aaataacaat acaatattg 59
<210> 107
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VGF-R forward primer (Lister)
<400> 107
gcttaattaa ggcggccgct ttttataaat tttttttatg agtattttta caaaaat 57
<210> 108
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VGF-R reverse primer (Lister)
<400> 108
tcccgggcat cgatagtaca ataactttta tgaaat 36
<210> 109
<211> 72
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TK-L forward primer (Lister)
<400> 109
ccccgggata ggatccatag tcgactttaa ttaatgcggc cgcatgacaa taaagaatta 60
attattgttc ac 72
<210> 110
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TK-L reverse primer (Lister)
<400> 110
agactagtcc ctcttcaaga acccattag 29
<210> 111
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TK-R forward primer (Lister)
<400> 111
ccccggggct ttagtagtag gaaatgtttt attg 34
<210> 112
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TK-R reverse primer (Lister)
<400> 112
taaggatcct ctgctagcta ttatattttt tatctaaaaa actaaaaata aacat 55
<210> 113
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L-L forward primer (Lister)
<400> 113
cactatagaa ctcgagcata tgtttaaacg acgcattatc tg 42
<210> 114
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L-L reverse primer (Lister)
<400> 114
tgggtttgga aagctttttt tataccgaac ataaaaataa gg 42
<210> 115
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L-R forward primer (Lister)
<400> 115
cgcagataaa aagatatcct tgttaacggg ctcgtaaatt g 41
<210> 116
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L-R reverse primer (Lister)
<400> 116
ggagaccggc agatcttgat aatacacata tttatttagg aagcg 45
<210> 117
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VGF forward primer
<400> 117
aggttccgta agcaaagaat ataag 25
<210> 118
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VGF reverse primer
<400> 118
aggtaactag attttacttt aatatgccga a 31
<210> 119
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TK forward primer
<400> 119
ggaagggtca aacttaataa aggat 25
<210> 120
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TK reverse primer
<400> 120
accgtgtcgc tgtaacttac ta 22
<210> 121
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L forward primer
<400> 121
gacgctgaac acgctaacga tagt 24
<210> 122
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L reverse primer
<400> 122
actgcgacga gatacaaccg ga 22
<210> 123
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linker
<400> 123
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 124
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linker
<400> 124
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
1 5 10 15
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
20 25 30
<210> 125
<211> 37
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linker
<400> 125
Ser Pro Lys Ala Gln Ala Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gln Pro Gln Ala
1 5 10 15
Glu Gly Ser Leu Gly Gly Gly Gly Ser Ala Lys Ala Ser Ala Pro Ala
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Ser
35
<210> 126
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linker
<400> 126
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Glu
1 5 10 15
Gln Glu Glu Arg
20
<210> 127
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linker
<400> 127
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 128
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linker
<400> 128
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
20 25
<210> 129
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linker
<400> 129
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 130
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linker
<400> 130
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 131
<211> 168
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sPD-1
<400> 131
Met Trp Val Arg Gln Val Pro Trp Ser Phe Thr Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Ser Trp Gln Ser Gly Trp Leu Leu Glu Val Pro Asn Gly Pro Trp
20 25 30
Arg Ser Leu Thr Phe Tyr Pro Ala Trp Leu Thr Val Ser Glu Gly Ala
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Leu Ser Asn Trp Ser Glu Asp Leu Met
50 55 60
Leu Asn Trp Asn Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala
65 70 75 80
Ala Phe Cys Asn Gly Leu Ser Gln Pro Val Gln Asp Ala Arg Phe Gln
85 90 95
Ile Ile Gln Leu Pro Asn Arg His Asp Phe His Met Asn Ile Leu Asp
100 105 110
Thr Arg Arg Asn Asp Ser Gly Ile Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
His Pro Lys Ala Lys Ile Glu Glu Ser Pro Gly Ala Glu Leu Val Val
130 135 140
Thr Glu Arg Ile Leu Glu Thr Ser Thr Arg Tyr Pro Ser Pro Ser Pro
145 150 155 160
Lys Pro Glu Gly Arg Phe Gln Gly
165
<210> 132
<211> 504
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sPD-1
<400> 132
atgtgggtcc ggcaggtacc ctggtcattc acttgggctg tgctgcagtt gagctggcaa 60
tcagggtggc ttctagaggt ccccaatggg ccctggaggt ccctcacctt ctacccagcc 120
tggctcacag tgtcagaggg agcaaatgcc accttcacct gcagcttgtc caactggtcg 180
gaggatctta tgctgaactg gaaccgcctg agtcccagca accagactga aaaacaggcc 240
gccttctgta atggtttgag ccaacccgtc caggatgccc gcttccagat catacagctg 300
cccaacaggc atgacttcca catgaacatc cttgacacac ggcgcaatga cagtggcatc 360
tacctctgtg gggccatctc cctgcacccc aaggcaaaaa tcgaggagag ccctggagca 420
gagctcgtgg taacagagag aatcctggag acctcaacaa gatatcccag cccctcgccc 480
aaaccagaag gccggtttca agga 504
<210> 133
<211> 405
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sPD1-Fc
<400> 133
Met Trp Val Arg Gln Val Pro Trp Ser Phe Thr Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Ser Trp Gln Ser Gly Trp Leu Leu Glu Val Pro Asn Gly Pro Trp
20 25 30
Arg Ser Leu Thr Phe Tyr Pro Ala Trp Leu Thr Val Ser Glu Gly Ala
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Leu Ser Asn Trp Ser Glu Asp Leu Met
50 55 60
Leu Asn Trp Asn Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala
65 70 75 80
Ala Phe Cys Asn Gly Leu Ser Gln Pro Val Gln Asp Ala Arg Phe Gln
85 90 95
Ile Ile Gln Leu Pro Asn Arg His Asp Phe His Met Asn Ile Leu Asp
100 105 110
Thr Arg Arg Asn Asp Ser Gly Ile Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
His Pro Lys Ala Lys Ile Glu Glu Ser Pro Gly Ala Glu Leu Val Val
130 135 140
Thr Glu Arg Ile Leu Glu Thr Ser Thr Arg Tyr Pro Ser Pro Ser Pro
145 150 155 160
Lys Pro Glu Gly Arg Phe Gln Gly Gly Gly Gly Arg Ser Pro Arg Gly
165 170 175
Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu
180 185 190
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val
195 200 205
Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
210 215 220
Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val
225 230 235 240
Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser
245 250 255
Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met
260 265 270
Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala
275 280 285
Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro
290 295 300
Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln
305 310 315 320
Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr
325 330 335
Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr
340 345 350
Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu
355 360 365
Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser
370 375 380
Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser
385 390 395 400
Arg Thr Pro Gly Lys
405
<210> 134
<211> 1218
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sPD1-Fc
<400> 134
atgtgggtcc ggcaggtacc ctggtcattc acttgggctg tgctgcagtt gagctggcaa 60
tcagggtggc ttctagaggt ccccaatggg ccctggaggt ccctcacctt ctacccagcc 120
tggctcacag tgtcagaggg agcaaatgcc accttcacct gcagcttgtc caactggtcg 180
gaggatctta tgctgaactg gaaccgcctg agtcccagca accagactga aaaacaggcc 240
gccttctgta atggtttgag ccaacccgtc caggatgccc gcttccagat catacagctg 300
cccaacaggc atgacttcca catgaacatc cttgacacac ggcgcaatga cagtggcatc 360
tacctctgtg gggccatctc cctgcacccc aaggcaaaaa tcgaggagag ccctggagca 420
gagctcgtgg taacagagag aatcctggag acctcaacaa gatatcccag cccctcgccc 480
aaaccagaag gccggtttca aggaggagga ggaagatctc ccagagggcc cacaatcaag 540
ccctgtcctc catgcaaatg cccagcacct aacctcttgg gtggaccatc cgtcttcatc 600
ttccctccaa agatcaagga tgtactcatg atctccctga gccccatagt cacatgtgtg 660
gtggtggatg tgagcgagga tgacccagat gtccagatca gctggtttgt gaacaacgtg 720
gaagtacaca cagctcagac acaaacccat agagaggatt acaacagtac tctccgggtg 780
gtcagtgccc tccccatcca gcaccaggac tggatgagtg gcaaggagtt caaatgcaag 840
gtcaacaaca aagacctccc agcgcccatc gagagaacca tctcaaaacc caaagggtca 900
gtaagagctc cacaggtata tgtcttgcct ccaccagaag aagagatgac taagaaacag 960
gtcactctga cctgcatggt cacagacttc atgcctgaag acatttacgt ggagtggacc 1020
aacaacggga aaacagagct aaactacaag aacactgaac cagtcctgga ctctgatggt 1080
tcttacttca tgtacagcaa gctgagagtg gaaaagaaga actgggtgga aagaaatagc 1140
tactcctgtt cagtggtcca cgagggtctg cacaatcacc acacgactaa gagcttctcc 1200
cggactccgg gtaaatga 1218
<210> 135
<211> 489
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hyaluronidase
<400> 135
Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His Ile Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys
1 5 10 15
Ser Ser Gly Val Ser Gln Ile Val Phe Thr Phe Leu Leu Ile Pro Cys
20 25 30
Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro
35 40 45
Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe
50 55 60
Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg
65 70 75 80
Ile Asn Ala Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu
85 90 95
Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly
100 105 110
Gly Ile Pro Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys
115 120 125
Lys Asp Ile Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val
130 135 140
Ile Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro
145 150 155 160
Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn
165 170 175
Val Gln Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe
180 185 190
Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys
195 200 205
Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys
210 215 220
Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn
225 230 235 240
Val Glu Ile Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser
245 250 255
Thr Ala Leu Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val
260 265 270
Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val
275 280 285
Ser Lys Ile Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr
290 295 300
Arg Ile Val Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu
305 310 315 320
Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile
325 330 335
Val Ile Trp Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu
340 345 350
Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn
355 360 365
Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln
370 375 380
Gly Val Cys Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu
385 390 395 400
Asn Pro Asp Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr
405 410 415
Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys
420 425 430
Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp
435 440 445
Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys
450 455 460
Ile Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile
465 470 475 480
Phe Tyr Asn Ala Ser Pro Ser Thr Leu
485
<210> 136
<211> 1470
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hyaluronidase
<400> 136
atgggagtgc taaaattcaa gcacatcttt ttcagaagct ttgttaaatc aagtggagta 60
tcccagatag ttttcacctt ccttctgatt ccatgttgct tgactctgaa tttcagagca 120
cctcctgtta ttccaaatgt gcctttcctc tgggcctgga atgccccaag tgaattttgt 180
cttggaaaat ttgatgagcc actagatatg agcctcttct ctttcatagg aagcccccga 240
ataaacgcca ccgggcaagg tgttacaata ttttatgttg atagacttgg ctactatcct 300
tacatagatt caatcacagg agtaactgtg aatggaggaa tcccccagaa gatttcctta 360
caagaccatc tggacaaagc taagaaagac attacatttt atatgccagt agacaatttg 420
ggaatggctg ttattgactg ggaagaatgg agacccactt gggcaagaaa ctggaaacct 480
aaagatgttt acaagaatag gtctattgaa ttggttcagc aacaaaatgt acaacttagt 540
ctcacagagg ccactgagaa agcaaaacaa gaatttgaaa aggcagggaa ggatttcctg 600
gtagagacta taaaattggg aaaattactt cggccaaatc acttgtgggg ttattatctt 660
tttccggatt gttacaacca tcactataag aaacccggtt acaatggaag ttgcttcaat 720
gtagaaataa aaagaaatga tgatctcagc tggttgtgga atgaaagcac tgctctttac 780
ccatccattt atttgaacac tcagcagtct cctgtagctg ctacactcta tgtgcgcaat 840
cgagttcggg aagccatcag agtttccaaa atacctgatg caaaaagtcc acttccggtt 900
tttgcatata cccgcatagt ttttactgat caagttttga aattcctttc tcaagatgaa 960
cttgtgtata catttggcga aactgttgct ctgggtgctt ctggaattgt aatatgggga 1020
accctcagta taatgcgaag tatgaaatct tgcttgctcc tagacaatta catggagact 1080
atactgaatc cttacataat caacgtcaca ctagcagcca aaatgtgtag ccaagtgctt 1140
tgccaggagc aaggagtgtg tataaggaaa aactggaatt caagtgacta tcttcacctc 1200
aacccagata attttgctat tcaacttgag aaaggtggaa agttcacagt acgtggaaaa 1260
ccgacacttg aagacctgga gcaattttct gaaaaatttt attgcagctg ttatagcacc 1320
ttgagttgta aggagaaagc tgatgtaaaa gacactgatg ctgttgatgt gtgtattgct 1380
gatggtgtct gtatagatgc ttttctaaaa cctcccatgg agacagaaga acctcaaatt 1440
ttctacaatg cttcaccctc cacactataa 1470
<210> 137
<211> 543
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-12
<400> 137
Met Cys Pro Gln Lys Leu Thr Ile Ser Trp Phe Ala Ile Val Leu Leu
1 5 10 15
Val Ser Pro Leu Met Ala Met Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr Val
20 25 30
Val Glu Val Asp Trp Thr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Thr Val Asn Leu
35 40 45
Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Asp Ile Thr Trp Thr Ser Asp Gln
50 55 60
Arg His Gly Val Ile Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Thr Val Lys
65 70 75 80
Glu Phe Leu Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Thr
85 90 95
Leu Ser His Ser His Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asn Gly Ile Trp
100 105 110
Ser Thr Glu Ile Leu Lys Asn Phe Lys Asn Lys Thr Phe Leu Lys Cys
115 120 125
Glu Ala Pro Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Ser Trp Leu Val Gln
130 135 140
Arg Asn Met Asp Leu Lys Phe Asn Ile Lys Ser Ser Ser Ser Ser Pro
145 150 155 160
Asp Ser Arg Ala Val Thr Cys Gly Met Ala Ser Leu Ser Ala Glu Lys
165 170 175
Val Thr Leu Asp Gln Arg Asp Tyr Glu Lys Tyr Ser Val Ser Cys Gln
180 185 190
Glu Asp Val Thr Cys Pro Thr Ala Glu Glu Thr Leu Pro Ile Glu Leu
195 200 205
Ala Leu Glu Ala Arg Gln Gln Asn Lys Tyr Glu Asn Tyr Ser Thr Ser
210 215 220
Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln
225 230 235 240
Met Lys Pro Leu Lys Asn Ser Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro
245 250 255
Asp Ser Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Lys Phe Phe Val
260 265 270
Arg Ile Gln Arg Lys Lys Glu Lys Met Lys Glu Thr Glu Glu Gly Cys
275 280 285
Asn Gln Lys Gly Ala Phe Leu Val Glu Lys Thr Ser Thr Glu Val Gln
290 295 300
Cys Lys Gly Gly Asn Val Cys Val Gln Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Asn
305 310 315 320
Ser Ser Cys Ser Lys Trp Ala Cys Val Pro Cys Arg Val Arg Ser Gly
325 330 335
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Val
340 345 350
Ile Pro Val Ser Gly Pro Ala Arg Cys Leu Ser Gln Ser Arg Asn Leu
355 360 365
Leu Lys Thr Thr Asp Asp Met Val Lys Thr Ala Arg Glu Lys Leu Lys
370 375 380
His Tyr Ser Cys Thr Ala Glu Asp Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Arg
385 390 395 400
Asp Gln Thr Ser Thr Leu Lys Thr Cys Leu Pro Leu Glu Leu His Lys
405 410 415
Asn Glu Ser Cys Leu Ala Thr Arg Glu Thr Ser Ser Thr Thr Arg Gly
420 425 430
Ser Cys Leu Pro Pro Gln Lys Thr Ser Leu Met Met Thr Leu Cys Leu
435 440 445
Gly Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Thr Glu Phe Gln Ala
450 455 460
Ile Asn Ala Ala Leu Gln Asn His Asn His Gln Gln Ile Ile Leu Asp
465 470 475 480
Lys Gly Met Leu Val Ala Ile Asp Glu Leu Met Gln Ser Leu Asn His
485 490 495
Asn Gly Glu Thr Leu Arg Gln Lys Pro Pro Val Gly Glu Ala Asp Pro
500 505 510
Tyr Arg Val Lys Met Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Ser Thr
515 520 525
Arg Val Val Thr Ile Asn Arg Val Met Gly Tyr Leu Ser Ser Ala
530 535 540
<210> 138
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linker
<400> 138
ggtggcggtg gctcgggcgg tggtgggtcg ggtggcggcg gatct 45
<210> 139
<211> 582
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> alpha-subunit
<400> 139
agggtcattc cagtctctgg acctgccagg tgtcttagcc agtcccgaaa cctgctgaag 60
accacagatg acatggtgaa gacggccaga gaaaagctga aacattattc ctgcactgct 120
gaagacatcg atcatgaaga catcacacgg gaccaaacca gcacattgaa gacctgttta 180
ccactggaac tacacaagaa cgagagttgc ctggctacta gagagacttc ttccacaaca 240
agagggagct gcctgccccc acagaagacg tctttgatga tgaccctgtg ccttggtagc 300
atctatgagg acttgaagat gtaccagaca gagttccagg ccatcaacgc agcacttcag 360
aatcacaacc atcagcagat cattctagac aagggcatgc tggtggccat cgatgagctg 420
atgcagtctc tgaatcataa tggcgagact ctgcgccaga aacctcctgt gggagaagca 480
gacccttaca gagtgaaaat gaagctctgc atcctgcttc acgccttcag cacccgcgtc 540
gtgaccatca acagggtgat gggctatctg agctccgcct ga 582
<210> 140
<211> 1005
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> beta-subunit
<400> 140
atgtgtcctc agaagctaac catctcctgg tttgccatcg ttttgctggt gtctccactc 60
atggccatgt gggagctgga gaaagacgtt tatgttgtag aggtggactg gactcccgat 120
gcccctggag aaacagtgaa cctcacctgt gacacgcctg aagaagatga catcacctgg 180
acctcagacc agagacatgg agtcataggc tctggaaaga ccctgaccat cactgtcaaa 240
gagtttctag atgctggcca gtacacctgc cacaaaggag gcgagactct gagccactca 300
catctgctgc tccacaagaa ggaaaatgga atttggtcca ctgaaatttt aaaaaatttc 360
aaaaacaaga ctttcctgaa gtgtgaagca ccaaattact ccggacggtt cacgtgctca 420
tggctggtgc aaagaaacat ggacttgaag ttcaacatca agagcagtag cagttccccc 480
gactctcggg cagtgacatg tggaatggcg tctctgtctg cagagaaggt cacactggac 540
caaagggact atgagaagta ttcagtgtcc tgccaggagg atgtcacctg cccaactgcc 600
gaggagaccc tgcccattga actggcgttg gaagcacggc agcagaataa atatgagaac 660
tacagcacca gcttcttcat cagggacatc atcaaaccag acccgcccaa gaacttgcag 720
atgaagcctt tgaagaactc acaggtggag gtcagctggg agtaccctga ctcctggagc 780
actccccatt cctacttctc cctcaagttc tttgttcgaa tccagcgcaa gaaagaaaag 840
atgaaggaga cagaggaggg gtgtaaccag aaaggtgcgt tcctcgtaga gaagacatct 900
accgaagtcc aatgcaaagg cgggaatgtc tgcgtgcaag ctcaggatcg ctattacaat 960
tcctcatgca gcaagtgggc atgtgttccc tgcagggtcc gatcc 1005
<210> 141
<211> 140
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VGF
<400> 141
Met Ser Met Lys Tyr Leu Met Leu Leu Phe Ala Ala Met Ile Ile Arg
1 5 10 15
Ser Phe Ala Asp Ser Gly Asn Ala Ile Glu Thr Thr Leu Pro Glu Ile
20 25 30
Thr Asn Ala Thr Thr Asp Ile Pro Ala Ile Arg Leu Cys Gly Pro Glu
35 40 45
Gly Asp Gly Tyr Cys Leu His Gly Asp Cys Ile His Ala Arg Asp Ile
50 55 60
Asp Gly Met Tyr Cys Arg Cys Ser His Gly Tyr Thr Gly Ile Arg Cys
65 70 75 80
Gln His Val Val Leu Val Asp Tyr Gln Arg Ser Glu Lys Pro Asn Thr
85 90 95
Thr Thr Ser Tyr Ile Pro Ser Pro Gly Ile Val Leu Val Leu Val Gly
100 105 110
Ile Ile Ile Met Cys Cys Leu Leu Ser Val Tyr Arg Phe Thr Arg Arg
115 120 125
Thr Asn Lys Leu Pro Leu Gln Asp Met Val Val Pro
130 135 140
<210> 142
<211> 423
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VGF
<400> 142
atgtcgatga aatatctgat gttgttgttc gctgctatga taatcagatc attcgccgat 60
agtggtaacg ctatcgaaac gacattgcca gaaattacaa acgctacaac agatattcca 120
gctatcagat tatgcggtcc agagggagat ggatattgtt tacacggtga ctgtatccac 180
gctagagata tcgacggtat gtattgtaga tgctctcatg gttatacagg cattagatgt 240
cagcatgtag tattagtaga ctatcaacgt tcagaaaaac caaacactac aacgtcatat 300
atcccatctc ccggtattgt gcttgtatta gtaggcatta ttattatgtg ttgtctatta 360
tctgtttata ggttcactcg aagaactaat aaactacctc tacaagatat ggttgtgcca 420
taa 423
<210> 143
<211> 177
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TK
<400> 143
Met Asn Gly Gly His Ile Gln Leu Ile Ile Gly Pro Met Phe Ser Gly
1 5 10 15
Lys Ser Thr Glu Leu Ile Arg Arg Val Arg Arg Tyr Gln Ile Ala Gln
20 25 30
Tyr Lys Cys Val Thr Ile Lys Tyr Ser Asn Asp Asn Arg Tyr Gly Thr
35 40 45
Gly Leu Trp Thr His Asp Lys Asn Asn Phe Glu Ala Leu Glu Ala Thr
50 55 60
Lys Leu Cys Asp Val Leu Glu Ser Ile Thr Asp Phe Ser Val Ile Gly
65 70 75 80
Ile Asp Glu Gly Gln Phe Phe Pro Asp Ile Val Glu Phe Cys Glu Arg
85 90 95
Met Ala Asn Glu Gly Lys Ile Val Ile Val Ala Ala Leu Asp Gly Thr
100 105 110
Phe Gln Arg Lys Pro Phe Asn Asn Ile Leu Asn Leu Ile Pro Leu Ser
115 120 125
Glu Met Val Val Lys Leu Thr Ala Val Cys Met Lys Cys Phe Lys Glu
130 135 140
Ala Ser Phe Ser Lys Arg Leu Gly Glu Glu Thr Glu Ile Glu Ile Ile
145 150 155 160
Gly Gly Asn Asp Met Tyr Gln Ser Val Cys Arg Lys Cys Tyr Ile Asp
165 170 175
Ser
<210> 144
<211> 534
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TK
<400> 144
atgaacggcg gacatattca gttgataatc ggccccatgt tttcaggtaa aagtacagaa 60
ttaattagac gagttagacg ttatcaaata gctcaatata aatgcgtgac tataaaatat 120
tctaacgata atagatacgg aacgggacta tggacgcatg ataagaataa ttttgaagca 180
ttggaagcaa ctaaactatg tgatgtcttg gaatcaatta cagatttctc cgtgataggt 240
atcgatgaag gacagttctt tccagacatt gttgaattct gtgagcgtat ggcaaacgaa 300
ggaaaaatag ttatagtagc cgcactcgat gggacatttc aacgtaaacc gtttaataat 360
attttgaatc ttattccatt atctgaaatg gtggtaaaac taactgctgt gtgtatgaaa 420
tgctttaagg aggcttcctt ttctaaacga ttgggtgagg aaaccgagat agaaataata 480
ggaggtaatg atatgtatca atcggtgtgt agaaagtgtt acatcgactc ataa 534
<210> 145
<211> 88
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L
<400> 145
Met Leu Ala Phe Cys Tyr Ser Leu Pro Asn Ala Gly Asp Val Ile Lys
1 5 10 15
Gly Arg Val Tyr Glu Lys Asp Tyr Ala Leu Tyr Ile Tyr Leu Phe Asp
20 25 30
Tyr Pro His Ser Glu Ala Ile Leu Ala Glu Ser Val Lys Met His Met
35 40 45
Asp Arg Tyr Val Glu Tyr Arg Asp Lys Leu Val Gly Lys Thr Val Lys
50 55 60
Val Lys Val Ile Arg Val Asp Tyr Thr Lys Gly Tyr Ile Asp Val Asn
65 70 75 80
Tyr Lys Arg Met Cys Arg His Gln
85
<210> 146
<211> 267
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K3L
<400> 146
ttattgatgt ctacacatcc ttttgtaatt gacatctata tatccttttg tataatcaac 60
tctaatcact ttaactttta cagttttccc taccagttta tccctatatt caacatatct 120
atccatatgc atcttaacac tctctgccaa gatagcttca gagtgaggat agtcaaaaag 180
ataaatatat agagcataat ccttctcgta tactctgccc tttattacat cgcccgcatt 240
gggcaacgaa taacaaaatg caagcat 267

Claims (19)

1.一种重组痘苗病毒，包含：
选自由可溶性程序化细胞死亡蛋白-1(sPD-1)编码基因、透明质酸酶编码基因及其组合组成的组中的任一种。
2.根据权利要求1所述的重组痘苗病毒，其特征在于，所述sPD-1包含SEQ ID NO:131或SEQ ID NO:133的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的重组痘苗病毒，其特征在于，所述sPD-1编码基因包含SEQ IDNO:132或SEQ ID NO:134的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的重组痘苗病毒，其特征在于，所述透明质酸酶包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的重组痘苗病毒，其特征在于，所述透明质酸酶编码基因包含SEQ ID NO:136的核苷酸序列。
6.根据权利要求1所述的重组痘苗病毒，所述重组痘苗病毒进一步包含白介素(IL)-12编码基因。
7.根据权利要求6所述的重组痘苗病毒，其特征在于，所述IL-12包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列。
8.根据权利要求6所述的重组痘苗病毒，其特征在于，所述IL-12编码基因包含SEQ IDNO:138至SEQ ID NO:140的核苷酸序列中的任何一种。
9.根据权利要求1所述的重组痘苗病毒，其特征在于，所述痘苗病毒的选自由K3L编码基因、胸苷激酶(TK)编码基因、痘苗生长因子(VGF)编码基因及其组合组成的组中的任一种的表达被抑制。
10.根据权利要求1所述的重组痘苗病毒，其特征在于，所述痘苗病毒是选自由以下组成的组中的任一种：西储(WR)、纽约痘苗病毒(NYVAC)、惠氏(纽约市卫生局；NYCBOH)、LC16m8、利斯特、哥本哈根、天坛、USSR、塔什干、埃文斯、国际卫生部-J(IHD-J)、国际卫生部-白色(IHD-W)、其变体及其组合。
11.根据权利要求1所述的重组痘苗病毒，其特征在于，所述痘苗病毒是IHD-W。
12.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，包含作为活性成分的根据权利要求1至11中任一项所述的重组痘苗病毒。
13.根据权利要求12所述的药物组合物，其特征在于，所述癌症是实体癌或血癌。
14.根据权利要求13所述的药物组合物，其特征在于，所述实体癌是选自由肺癌、结直肠癌、前列腺癌、甲状腺癌、乳腺癌、脑癌、头颈癌、食道癌、皮肤癌、胸腺癌、胃癌、结肠癌、肝癌、卵巢癌、子宫癌、膀胱癌、直肠癌、胆囊癌、胆道癌、胰腺癌及其组合组成的组中的任一种。
15.根据权利要求13所述的药物组合物，其特征在于，所述血癌是选自由淋巴瘤、急性白血病、多发性骨髓瘤及其组合组成的组中的任一种。
16.一种预防或治疗癌症的方法，包括：
向个体给药包含根据权利要求1至11中任一项所述的重组痘苗病毒作为活性成分的组合物的步骤。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述癌症是实体癌或血癌。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述实体癌是选自由肺癌、结直肠癌、前列腺癌、甲状腺癌、乳腺癌、脑癌、头颈癌、食道癌、皮肤癌、胸腺癌、胃癌、结肠癌、肝癌、卵巢癌、子宫癌、膀胱癌、直肠癌、胆囊癌、胆道癌、胰腺癌及其组合组成的组中的任一种。
19.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述血癌是选自由淋巴瘤、急性白血病、多发性骨髓瘤及其组合组成的组中的任一种。
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