KR20190097240A - 종양용해성 바이러스 및 치료 분자 - Google Patents

종양용해성 바이러스 및 치료 분자 Download PDF

Info

Publication number
KR20190097240A
KR20190097240A KR1020197021416A KR20197021416A KR20190097240A KR 20190097240 A KR20190097240 A KR 20190097240A KR 1020197021416 A KR1020197021416 A KR 1020197021416A KR 20197021416 A KR20197021416 A KR 20197021416A KR 20190097240 A KR20190097240 A KR 20190097240A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
virus
oncolytic
oncolytic virus
cancer
tumor
Prior art date
Application number
KR1020197021416A
Other languages
English (en)
Inventor
필리프 에르브
조안 폴로프
Original Assignee
트랜스진 에스.에이.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 트랜스진 에스.에이. filed Critical 트랜스진 에스.에이.
Publication of KR20190097240A publication Critical patent/KR20190097240A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A61K35/768—Oncolytic viruses not provided for in groups A61K35/761 - A61K35/766
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A61K9/0029—Parenteral nutrition; Parenteral nutrition compositions as drug carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/04—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in cyclic amidines (3.5.4)
    • C12Y305/04005—Cytidine deaminase (3.5.4.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24132—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24151—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2710/24152—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24171—Demonstrated in vivo effect
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

본 발명은 시티딘 데아미나제 (CDAse) 폴리펩티드를 코딩하는 종양용해성 바이러스, 그를 포함하는 조성물, 뿐만 아니라 예방적 또는 치료적 목적을 위한, 보다 특히 암의 치료를 위한 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 종양용해성 바이러스 또는 그의 조성물의 투여를 포함하는, 질환 또는 병리학적 상태를 치료하는 방법 및 이러한 종양용해성 바이러스를 제조하기 위한 방법을 제공한다.

Description

종양용해성 바이러스 및 치료 분자
본 발명은 종양용해성 바이러스 및 치료 유전자 분야이다. 본 발명은 하나 이상의 치료 유전자를 포함하는 종양용해성 바이러스를 제공한다. 보다 정확히, 본 발명의 치료 유전자는 뉴클레오시드 풀 조정제이다. 보다 특히, 본 발명의 뉴클레오시드 풀 조정제는 시티딘 데아미나제이거나 또는 시티딘 데아미나제 활성을 갖는다. 본원에 정의된 바와 같은 종양용해성 바이러스 및 하나 이상의 치료 유전자의 조합은 종양용해성 바이러스에게 증가된 항종양 효능을 부여한다. 본 발명은 최종적으로 증식성 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 종양용해성 바이러스를 제공한다.
종양용해성 바이러스는 종양-의존성 자기-영속화의 독특한 특성을 갖는 치료제의 한 부류이다 (Hermiston et al., 2006, Curr. Opin. Mol. Ther., 8(4):322-30). 이들 바이러스를 사용하는 이익은 이들이 복제할 때 이들의 숙주 세포를 용해한다는 것이다. 종양용해성 바이러스는 비-분열 세포 (예를 들어 정상 세포)를 손상되지 않도록 두면서 분열 세포 (예를 들어 암 세포)에서 선택적 복제를 할 수 있다. 감염된 분열 세포는 용해에 의해 파괴될 때, 이들은 새로운 감염성 입자를 방출하여 주위 분열 세포를 감염시킨다. 따라서, 종양용해성 바이러스는, 임의로 암에 대한 통상적인 치료법과 함께, 암을 치료하기 위한 새로운 영역을 제공한다 (Fisher et al., 2006, Curr. Opin. Mol. Ther., 8(4):301-13). 암 세포는 불활성화된 항바이러스 인터페론 경로를 갖거나 또는 바이러스 복제가 방해받지 않고 진행될 수 있도록 하는 돌연변이된 종양 억제 유전자를 갖기 때문에 이들은 많은 바이러스에 대해 이상적인 숙주이다 (Chernajovsky et al., 2006, BMJ, 332(7534):170-2). 아데노바이러스, 레오바이러스, 홍역, 단순 헤르페스, 뉴캐슬병 바이러스 및 백시니아 바이러스를 포함한 여러 바이러스는 지금 종양용해성제로서 임상적으로 시험되고 있다.
일부 바이러스는 자연 종양용해성이고 종양 세포를 선택적으로 감염시키고 사멸시키는 선천성 능력을 갖는다. 그러나, 종양용해성 바이러스는 또한 자연 발생 바이러스를 변형시킴으로써 조작될 수 있다. 이러한 목적상, 바이러스를 변형시키기 위해 현재 사용되는 주요 전략은, 많은 다른 가능성 중에서, 바이러스 유전자에서의 기능적 결실, 이들 바이러스 유전자의 발현을 제어하기 위한 종양- 또는 조직-특이적 프로모터의 사용, 바이러스를 암 세포 표면으로 재지시하는 향성 변형을 포함한다.
자연 종양용해성 바이러스 중에서, 백시니아 바이러스 (폭스비리다에(Poxviridae))는 종양용해성 바이러스요법에 사용하기 위한 이상적인 바이러스 백본에 필수적인 핵심 속성 중 많은 것들을 보유한다. 이들은 급속한 세포-대-세포 확산으로 짧은 생활주기, 강한 용해 능력, 큰 클로닝 용량 및 널리-정의된 분자 생물학을 포함한다. 게다가, 인간 세포에서 복제할 수 있을지라도, 이들은 자연 건강 문제로 고려되지 않고, 천연두 박멸 캠페인 동안 수백만명의 개체에게 전달된 것으로 특히 널리 특징화되어 있다. 백신 균주 또는 유전적으로 변형된 백시니아 균주를 사용한 초기 임상적 결과는 항종양 효과를 입증한 바 있다 (Thorne et al., 2005, Curr. Opin. Mol. Ther., 7(4):359-65).
바이러스의 바이러스 변형은 생체내 맥락에서 달성하기 어려운 종양 세포의 100%를 감염시키고 용해하는 바이러스의 능력을 증진시키기 위해 실행될 수 있다. 따라서, 종양용해성 바이러스는 종종, 강한 방관자 효과를 발휘하고 이에 따라 인접한 비감염된 종양 세포의 제거를 허용함으로써 바이러스 요법의 종양용해성 효능을 증진시키는 효소-전구약물 시스템으로 "무장된다". 예를 들어, FCY1 및 FUR1의 효소적 활성을 조합한 이중기능적 키메라 단백질을 코딩하는 소위 FCU1 자살 유전자로의 무장은, 비독성 항진균제인 5-플루오로우라실 (5-FC)의 독성 대사물 5-플루오로우라실 (5-FU) 및 5-플루오로우리딘-5'모노포스페이트 (5-FUMP)로의 직접 전환을 효율적으로 촉매하며, 이에 따라 5-플루오로우라실에 대한 특정 인간 종양 세포의 자연 내성을 우회한다 (Erbs et al., 2000, Cancer Res., 60(14):3813-22).
바이러스 변형은 또한 안전성을 증가시키는데 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 티미딘 키나제 (TK) 결실된 바이러스는 야생형 바이러스와 비교하여 저하된 병원성을 갖는 것으로 제시되었지만, 종양 세포에서의 복제는 보존되었다 (Buller et al., 1985, Nature, 317(6040):813-5). 폴로페(Foloppe) 등은 FCU1 유전자를 발현하는 TK 유전자-결실된 VACV가 인간 결장 종양의 뮤린 모델에서 시험관내 및 생체내 둘 다에서 강력한 항종양 효과를 갖는 것으로 제시하였다 (Foloppe et al., 2008, Gene Ther., 15:1361-71).
암의 치료에 대한 효과적인 접근법을 개발할 중요한 필요가 분명히 있다. 약독화 종양용해성 바이러스 균주는 치료적 및 진단적 적용을 위해 개발되어 있고, 임상적 연구에서 평가되고 있다. 그러나, 종양용해성 바이러스를 약독화하는 방법은 그의 효능의 저하로 이어진다. 치료적 관점에서, 효능의 이러한 저하는 전체 반응의 감소, 환자 생존의 감소, 사망률의 증가, 병리상태 내성 등을 초래할 수 있다. 그 결과, 더 효율적이어야 하는 새로운 안전한 종양용해성 바이러스의 필요가 있다.
본 발명의 맥락에서, 본 발명자들은 하나 이상의 치료 유전자를 포함하는 종양용해성 바이러스를 시험한 바 있다. 보다 특히, 치료 유전자는 뉴클레오시드 데아미나제이다. 보다 더 특히, 치료 유전자는 시티딘 데아미나제이다.
데옥시시티딘 데아미나제 또는 시티딘 아미노히드롤라아제로도 명명되는, 시티딘 데아미나제 (CDAse)는 피리미딘 샐비지 경로에 수반되고, 결과적으로 데스옥시리보뉴클레오티드 (dNTP)의 균형에 수반되는 뉴클레오시드 풀 조정제이다.
dNTP의 적절한 균형은 DNA 복제의 충실도에 필수적이다. 실제로, dNTP 풀 균형의 조정이 DNA 완전성, 게놈 안정성에 영향을 미치고, 유전자독성 손상을 초래할 수 있는 것으로 보인다. 핵 게놈의 2개 DNA 가닥은 이러한 dNTP 풀 불균형으로부터 초래되는 돌연변이의 유사한 위험에 있고, 이러한 위험은 심지어 주요 복제 오류 수정 메카니즘 둘 다가 유전적으로 무손상인 경우에서도 완전히 저해되지 않는다. (Buckland et al., 2014 Dec, PLoS Genet., 10(12):e1004846). dNTP에서의 감소 또는 불균형은 유전자독성 및 증가된 돌연변이유발을 초래하는 것으로 알려져 있는 반면, dNTP에서의 증가는 종종 암 발생에 기여할 수 있는 감소된 충실도를 갖는 비제어된 DNA 복제를 초래한다 (Kohnken et al., 2015, Mol. Cancer; 14:176).
dNTP 합성 및 대사를 표적화하는 치료제가 여러 유형의 암의 치료에 사용될 수 있다. 여러 연구에도 불구하고, 세포내 dNTP 수준을 조절하고 그의 항상성을 유지하는 분자 메카니즘이 완전히 이해되지 않는다. (Kohnken et al. 2015, Mol. Cancer; 14:176)
CDAse 결핍은 데옥시시티딘 트리포스페이트 (dCTP)의 과잉으로 이어지는 것으로 보고된 바 있다. CDAse-결핍 세포에서의 DNA 복제는 기저 폴리-ADP-리보스 폴리머라제 1 (PARP-1) 활성의 부분적 억제로 인해 성공하지 못한다. 사실상, dCTP의 세포내 축적은 체크포인트 키나제 1의 활성화 및 하류 체크포인트 효율을 절충하는 PARP-1 활성을 억제하여, 유사분열에서의 비복제된 DNA의 후속 축적을 허용한다. 이러한 비복제된 DNA는 동원체 및 취약 부위와 같은 "복제하기 어려운" 부위에서 자매-염색분체 사이의 초미세 후기 가교 (UFB)의 형성으로 이어진다. (Gemble et al., 2015, PLoS Genet, 11(7) e1005384)
CDAse는 항바이러스 효과를 갖는 것으로 알려져 있다. 복합체화된 시티딘을 탈아미노화하는 CDAse인 APOBEC3G는, 레트로바이러스 및 레트로트랜스포손에 대한 활성을 제시하는 선천성 방어 단백질이다 (Oliva et al., 2016, Immunol. Cell. Biol. 94:689-700). 바이러스 감염의 억제에서의 APOBEC3 단백질의 역할은 HIV-1에 대해 처음 기재되었다. 그러나, 많은 연구는 HTLV, HCV, HBV, HPV, HSV-1, 및 EBV를 포함한, 인간 질환과 연관된 다른 바이러스에 대한 APOBEC3 작용의 증거를 또한 제시한 바 있다. APOBEC3G는 일련의 편집-의존성 및 비의존성 메카니즘을 통해 이들 바이러스를 억제한다. 많은 바이러스는 APOBEC 효과를 상쇄시키는 메카니즘을 진화시켜 왔고, APOBEC3 활성을 증진시키는 전략은 항바이러스 약물 개발에 대한 새로운 접근법을 구성한다. (Vieira et al., 2013, Biomed. Res. Int., 2013:ID 683095).
APOBEC는 다중 DNA-함유 바이러스에 대한 제한 인자인 것으로 보고된 바 있다 (Moris et al., 2014, Front Microbiol, 5:534). 그러나, APOBEC3 패밀리 구성원이 백시니아 바이러스, 폭스바이러스의 복제를 위한 제한 인자가 아니며, 백시니아 바이러스가 APOBEC3G를 분해할 수 없는 것으로 제시된 바 있다 (Kremer et al., 2006, Virol. J., 3:86).
APOBEC 유전자는 비소세포 폐암에서 과다발현되는 것으로 보고된 바 있다. APOBEC3G는 유방암, 폐암, 두경부암과 같은 다양한 암에서의 돌연변이의 클러스터의 기원일 수 있다. mRNA APOBEC의 비율은 암성 및 정상 폐 조직에서 비교된 바 있고, mRNA APOBEC이 정상 조직에서보다 암성 조직에서 유의하게 더 상승된 것으로 나타났다 (Hidefumi et al., 2014, Biomed. Rep., 2(3):392-395).
더욱이, 연구는 플라틴-겜시타빈으로 치료된 NSCLC 환자의 임상적 이슈에 대한 CDAse의 효소적 활성의 영향에 대해 추진되었다. HPLC에 의해 검출된 바와 같은, CDAse의 효소적 활성이 백금-겜시타빈 요법의 활성 및 효능 둘 다와 상관관계가 있었다는 것으로 보고되었다. 보다 정확히, 저-CDAse 활성을 갖는 환자는 고-CDAse 활성을 갖는 환자보다 더 우수한 반응률, 더 우수한 임상적 이익, 더 우수한 진행까지의 시간 및 더 우수한 전체 생존을 가졌다. 40명의 췌장암 환자에서의 또 다른 예비 연구는 고-CDAse 활성 및 겜시타빈-기반 치료 후 진행 사이에의 유사한 상관관계를 보고하였다. 저자들은 백금-겜시타빈 레지멘으로 치료된 환자에서의 활성 및 효능의 바이오마커로서의 CDAse-효소적 활성의 사용을 제안하였다 (Tibaldi et al., 2012, Ann. Oncol., 23:670-677).
시티딘 데아미나제 또는 시티딘 데아미나제 활성을 갖는 뉴클레오시드 풀 조정제가 사용될 때 일부 문제점이 보고된 바 있다. 일련의 편집-의존성 및 비의존성 메카니즘으로, APOBEC3은 바이러스를 억제할 뿐만 아니라, 바이러스 유전학의 다양화 및 진화의 소스를 나타낸다. 많은 바이러스가 APOBEC 효과를 상쇄시키는 새로운 메카니즘을 개발하였다 (Vieira et al., 2013, Biomed. Res. Int., 2013, Article ID 683095). 더욱이, 상기 언급된 바와 같이, CDAse는 일부 암-치료를 억제할 수 있다. WO2010118013 및 WO2010118010은 CDAse 억제제 및 시티딘계 항신생물, 예컨대 데시타빈, 겜시타빈, ara-C 및 5-아자시티딘의 조합에 관한 것이다. 실제로, CDAse는 시티딘계 약물을 탈아미노화하고, 결과적으로 그의 효과를 저하시킨다. 이들 적용은 또한 암의 치료를 위한 이들 조합의 사용에 관한 것이다. A2780 인간 난소암 이종이식편 모델에서의 CDAse 억제제 (ER-876437) 및 겜시타빈의 생체내 효능 연구는, ER-876437 단독 및 겜시타빈 단독이 종양 성장에 대해 영향을 미치지 않는 반면, 겜시타빈의 투여 30분 전의 ER-876437의 투여가 평가된 마우스의 10% 및 30%에서 각각 완전 퇴행 및 부분적 종양 퇴행으로 이어졌다는 것을 제시하였다.
본 발명의 맥락에서, 본 발명자들은, 모든 예상과는 달리, 시티딘 데아미나제를 발현하도록 조작된 종양용해성 바이러스가 개선된 효능을 갖는다는 것을 발견하였다. 시티딘 데아미나제-발현 종양용해성 백시니아 바이러스의 투여를 포함하는 항종양 바이러스요법은 종양 진행의 유의한 감소를 초래한다. 더욱이, 다른 뉴클레오시드 풀 조정제 예컨대 시토신 데아미나제와는 대조적으로, CDAse-발현 종양용해성 바이러스에 의해 제공된 항종양 효과는 어떠한 전구약물의 추가도 요구하지 않으며, 이는 또한 본 발명의 사용의 용이함 및 안전성에 기여한다.
이들 결과를 기반으로, 본 발명의 종양용해성 바이러스가 다른 기존 종양용해성 바이러스에 대한 대안으로서 성공적으로 사용될 수 있고, 더 우수한 효율 프로파일을 가질 수 있을 것으로 기대할 수 있다. 본 발명의 종양용해성 바이러스는 또한 추가적인 항종양 요법(들)과의 조합으로 활용될 수 있다.
본 발명의 한 측면은 시티딘 데아미나제 (CDAse) 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 종양용해성 바이러스에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 종양용해성 바이러스는 오르토폭스바이러스에 속하는 폭스바이러스, 특히 백시니아 바이러스 또는 우두바이러스이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 종양용해성 바이러스는 티미딘 키나제 코딩 J2R 로커스가 결손된 것 (TK-)이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 종양용해성 바이러스는 I4L 및/또는 F4L 로커스가 결손된 것이다 (대안적으로 또는 결손 TK- 로커스와의 조합으로).
추가 실시양태에서, 상기 종양용해성 바이러스는 관심 핵산, 특히 CDAse와 상이한 치료 분자, 예컨대 면역자극 폴리펩티드, 항원, 퍼미아제 또는 임의의 다른 관심 분자를 코딩하는 유전자를 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 종양용해성 바이러스 및 제약상 허용되는 비히클을 포함하는 조성물을 추가로 제공한다. 한 실시양태에서, 종양용해성 바이러스는 바람직하게는 정맥내 또는 종양내 투여를 위해 제제화된다.
추가 측면에서, 본 발명은 또한 종양용해성 바이러스를 제조하는 방법으로서, 상기 종양용해성 바이러스를 생산자 세포 내로 도입하는 단계, 상기 생산자 세포를 상기 종양용해성 바이러스가 생산될 수 있도록 하기에 적절한 조건 하에 배양하는 단계 및 생산된 바이러스를 세포 배양물로부터 회수하는 단계를 적어도 포함하는 방법에 관한 것이다. 임의로, 회수된 종양용해성 바이러스는 적어도 부분적으로 정제될 수 있다.
또 다른 추가 측면에서, 본 발명은 질환의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한, 본 발명의 종양용해성 바이러스 또는 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 질환은 증식성 질환 예컨대 암, 종양 및 재협착이다. 상기 암은 바람직하게는 신암, 방광암, 전립선암, 유방암, 결장직장암, 폐암, 간암, 위암, 췌장암, 흑색종, 난소암 및 교모세포종으로 이루어진 군, 특히 전이성인 것들로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 상기 질환은 증가된 파골세포 활성과 연관된 질환 예컨대 류마티스 관절염 및 골다공증이다.
또 다른 추가 측면에서, 본 발명은 본 발명의 종양용해성 바이러스 또는 조성물의 치료 유효량을 질환의 치료를 필요로 하는 숙주 유기체에 투여하는 것을 포함하는 질환의 치료 방법을 제공한다. 상기 치료 방법은 수술, 방사선요법, 화학요법, 동결요법, 호르몬 요법, 독소 요법, 면역요법 또는 시토카인 요법으로 이루어진 군으로부터 선택된 것들과 같은 하나 이상의 추가적인 요법과 함께 사용될 수 있다.
특정한 실시양태에서, 시티딘 데아미나제는 치료 유전자로서 사용되고, 어떠한 전구약물도 시티딘 데아미나제의 존재 하에 치료 효과를 수득하는데 요구되지 않는 한, 자살 유전자로서 사용되지 않는다. 구체적으로, 카페시타빈 (젤로다(Xeloda)®)은 5'-DFCR (데옥시-5-플루오로시티딘)로 변환되고, 이는 이어서 시티딘 데아미나제에 의해 5'-DFUR (5'-데옥시-5-플루오로우리딘)로 변환되며, 이는 최종적으로 독성 5-FU (5-플루오로-우라실)로 변환된다. 반응의 이러한 캐스케이드는 본 발명의 종양용해성 바이러스의 세포용해 활성을 수득하는데 요구되지 않는다. 따라서, 본 발명의 종양용해성 바이러스는 카페시타빈과의 조합으로 사용되지 않고 본 발명에 따른 치료 방법은 카페시타빈과 같은 약물의 전구체를 투여하는 어떠한 단계도 포함하지 않는다. 통상적으로, CDAse 이외의 뉴클레오시드 풀 조정제는 상기 뉴클레오시드 풀 조정제의 작용에 의해 세포독성 약물로 변환되는 전구약물과의 조합으로 사용된다. 이러한 효소적 변환은 일반적으로 항종양 효과에 기여한다. 예를 들어, 시토신 데아미나제를 코딩하는 종양용해성 바이러스에 의존하는 치료 방법은 감염된 세포에서 세포독성 5-플루오로우라실 (5-FU)로 변환되는 5-플루오로시토신 (5-FC)과 함께 투여될 때 효과적인 항종양 효과를 제공하고 그의 용해에 기여한다.
도 1. CDA (시티딘 데아미나제) 단백질의, 인간 CDA (hCD)에 대한 항체에 의한 웨스턴 블롯 상에서의 특이적 검출.
MIA PaCa-2 및 LoVo 세포를 VVTK-RR- 및 VV-TK-RR-/hCD로 감염시켰다. hCD (16 kDa)의 존재를 나타낸다 (화살표).
도 2. VVTK-RR-/GFP 또는 VVTK-RR-/CDD1의 1회 i.v. 주사 후 s.c. 이식된 인간 결장직장 LoVo 종양의 성장 억제.
약어: GFP: 녹색 형광 단백질; CDD1: 효모 시티딘 데아미나제
1 x 107 PFU의 종양용해성 백시니아 바이러스로의 전신 치료 (화살표로 나타냄) 후 평균 종양 부피. LoVo s.c. 이종이식편을 보유하는 마우스를 제11일에 비히클 단독 (◇: 대조군)으로 또는 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현하는 TK 및 RR-결손 바이러스 (□: VVTK-RR-/GFP) 또는 효모 CDAse를 발현하는 TK 및 RR-결손 바이러스 (■: VVTK-RR-/CDD1)로의 1회 i.v. 투여 (꼬리 정맥 내)로 치료하였다. 데이터는 12마리 동물의 평균을 나타낸다.
도 3. VVTK-RR-/GFP 또는 VVTK-RR-/CDD1의 1회 i.v. 주사 후 s.c. 이식된 인간 결장직장 HCT-116 종양의 성장 억제.
1 x 105 PFU의 종양용해성 백시니아 바이러스로의 전신 치료 (화살표로 나타냄) 후 평균 종양 부피. HCT-116 s.c. 이종이식편을 보유하는 마우스를 제16일에 비히클 단독 (◇: 대조군)으로 또는 GFP를 발현하는 TK 및 RR 결손 바이러스 (□: VVTK-RR-/GFP) 또는 효모 CDAse를 발현하는 TK 및 RR 결손 바이러스 (■: VVTK-RR-/CDD1)로의 1회 i.v. 투여 (꼬리 정맥 내)로 치료하였다. 데이터는 12마리 동물의 평균을 나타낸다.
도 4. VVTK-RR-/GFP 또는 VVTK-RR-/CDD1의 1회 i.v. 주사 후 s.c. 이식된 인간 식도 OE-19 종양의 성장 억제.
1 x 106 PFU의 종양용해성 백시니아 바이러스로의 전신 치료 (화살표로 나타냄) 후 평균 종양 부피. OE-19 s.c. 이종이식편을 보유하는 마우스를 제13일에 비히클 단독 (◇: 대조군)으로 또는 GFP를 발현하는 TK 및 RR 결손 바이러스 (□: VVTK-RR-/GFP) 또는 효모 CDAse를 발현하는 TK 및 RR 결손 바이러스 (■: VVTK-RR-/CDD1)로의 1회 i.v. 투여 (꼬리 정맥 내)로 치료하였다. 데이터는 12마리 동물의 평균을 나타낸다.
도 5. VVTK-RR-/GFP 또는 VVTK-RR-/hCD의 1회 i.v. 주사 후 s.c. 이식된 인간 식도 OE-19 종양의 성장 억제.
5 x 105 PFU의 종양용해성 백시니아 바이러스로의 전신 치료 (화살표로 나타냄) 후 평균 종양 부피. OE-19 s.c. 이종이식편을 보유하는 마우스를 제14일에 비히클 단독 (◇: 대조군)으로 또는 GFP를 발현하는 TK 및 RR 결손 바이러스 (□: VVTK-RR-/GFP) 또는 인간 CDAse를 발현하는 TK 및 RR 결손 바이러스 (■: VVTK-RR-/hCD)로의 1회 i.v. 투여 (꼬리 정맥 내)로 치료하였다. 데이터는 12마리 동물의 평균을 나타낸다.
도 6. VVTK-RR- 또는 VVTK-RR-/FCU1의 1회 i.v. 주사 후 s.c. 이식된 인간 결장직장 LoVo 종양의 성장 억제
1 x 107 PFU의 종양용해성 백시니아 바이러스로의 전신 치료 (화살표로 나타냄) 후 평균 종양 부피. LoVo s.c. 이종이식편을 보유하는 마우스를 제27일에 비히클 단독 (◇: 대조군)으로 또는 비-재조합 TK 및 RR 결손 바이러스 (●: VVTK-RR-) 또는 효모 시토신 데아미나제 및 UPRTase를 발현하는 TK 및 RR 결손 바이러스 (△: VVTK-RR-FCU1)로의 1회 i.v. 투여 (꼬리 정맥 내)로 치료하였다. 데이터는 12마리 동물의 평균을 나타낸다.
도 7. VVTK-RR-/GFP 또는 VVTK-RR-/APOBEC2의 1회 i.v. 주사 후 s.c. 이식된 인간 결장직장 HCT-116 종양의 성장 억제.
1 x 105 PFU의 복제 백시니아 바이러스로의 전신 치료 (화살표로 나타냄) 후 평균 종양 부피. HCT-116 s.c. 이종이식편을 보유하는 마우스를 제17일에 비히클 단독 (◇: 대조군)으로 또는 나타낸 바이러스 (□: VVTK-RR-/GFP; ■: VVTK-RR-/APOBEC2)로의 1회 i.v. 투여 (꼬리 정맥 내)로 치료하였다. 데이터는 9마리 동물의 평균을 나타낸다.
정의
출원 전반에 걸쳐 사용될 때, 단수형 용어는, 달리 문맥상 명확하게 지시되지 않는 한, "적어도 하나", "적어도 제1", "하나 이상" 또는 "복수"의 지칭된 성분 또는 단계를 의미한다는 의미로 사용된다. 예를 들어, 용어 "종양용해성 바이러스"는 그의 혼합물을 포함한 복수의 종양용해성 바이러스를 포함한다.
용어 "하나 이상"은 하나 또는 하나 초과의 수 (예를 들어 2, 3, 4 등)를 지칭한다.
용어 "및/또는"은 본원에 어디에서 사용되든지 "및", "또는" 및 "상기 용어에 의해 연결되는 요소들의 전부 또는 임의의 다른 조합"의 의미를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "약" 또는 "대략"은 주어진 값 또는 범위의 20% 이내, 바람직하게는 10% 이내, 보다 바람직하게는 5% 이내를 의미한다.
산물 및 조성물을 정의하는데 사용될 때, 본원에 사용된 용어 "포함하는" (및 포함하는의 임의의 형태, 예컨대 "포함하다" 및 "포함한다"), "갖는" (및 갖는의 임의의 형태, 예컨대 "갖다" 및 "갖는다"), "포괄하는" (및 포괄하는의 임의의 형태, 예컨대 "포괄한다" 및 "포괄하다") 또는 "함유하는" (및 함유하는의 임의의 형태, 예컨대 "함유한다" 및 "함유하다")는 개방형이며 추가적인 비인용된 요소 또는 방법 단계를 배제하지는 않는다. 표현 "로 본질적으로 이루어진"은 임의의 본질적인 의미의 다른 성분 또는 단계를 배제하는 것을 의미한다. 이에 따라, 언급된 성분으로 본질적으로 이루어진 조성물은 미량물질, 오염물 및 제약상 허용되는 담체를 배제하지는 않을 것이다. "로 이루어진"은 다른 성분 또는 단계의 미량 요소보다 많은 것을 배제하는 것을 의미할 것이다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 펩티드 결합을 통해 결합된 적어도 9개 이상의 아미노산을 포함하는 아미노산 잔기의 중합체를 지칭한다. 중합체는 선형, 분지형 또는 시클릭일 수 있고, 자연 발생 및/또는 아미노산 유사체를 포함할 수 있고, 이는 비-아미노산에 의해 개재될 수 있다. 일반적 지표로서, 아미노산 중합체가 50개 초과의 아미노산 잔기이면, 이는 바람직하게는 폴리펩티드 또는 단백질로서 지칭되지만, 50개 아미노산 길이 이하이면, 이는 "펩티드"로서 지칭된다.
본 발명의 맥락 내에서, 용어 "핵산", "핵산 분자", "폴리뉴클레오티드" 및 "뉴클레오티드 서열"은 상호교환가능하게 사용되고, 폴리데옥시리보뉴클레오티드 (DNA) (예를 들어 cDNA, 게놈 DNA, 플라스미드, 벡터, 바이러스 게놈, 단리된 DNA, 프로브, 프라이머 및 그의 임의의 혼합물) 또는 폴리리보뉴클레오티드 (RNA) (예를 들어 mRNA, 안티센스 RNA, SiRNA) 또는 혼합된 폴리리보-폴리데옥시리보뉴클레오티드의 임의의 길이의 중합체를 정의한다. 이들은 단일 또는 이중-가닥, 선형 또는 원형, 자연 또는 합성, 변형된 또는 비변형된 폴리뉴클레오티드를 포괄한다. 더욱이, 폴리뉴클레오티드는 비-자연 발생 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 비-뉴클레오티드 성분에 의해 개재될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "유사체", "돌연변이체" 또는 "변이체"는 천연 대응물에 대한 하나 이상의 변형(들)을 나타내는 분자 (폴리펩티드 또는 핵산)를 지칭한다. 하나 이상의 뉴클레오티드/아미노산 잔기(들)의 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함한 임의의 변형(들)이 구상될 수 있다. 여러 돌연변이가 고려될 때, 이들은 연속적인 잔기 및/또는 비-연속적인 잔기에 관한 것일 수 있다. 천연 대응물의 서열과 적어도 80%, 유리하게는 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 보다 더 바람직하게는 적어도 98% 동일성의 서열 동일성 정도를 보유하는 유사체가 바람직하다. 예시적 목적상, "적어도 80% 동일성"은 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%를 의미한다. 일반적 방식에서, 용어 "동일성"은 2개 폴리펩티드 또는 핵산 서열 사이의 아미노산 대 아미노산 또는 뉴클레오티드 대 뉴클레오티드 대응을 지칭한다. 2개 서열 사이의 동일성의 백분율은 최적 전역 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각 갭의 길이를 고려하여, 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다. 전역 정렬 후 아미노산 서열 사이의 동일성의 백분율을 결정하기 위한 다양한 컴퓨터 프로그램 및 수학적 알고리즘, 예컨대 예를 들어 니들만 및 분쉬의 알고리즘 [J.Mol. Biol. 48,443-453, 1970], 및 NCBI에서 입수가능한 Blast 프로그램 또는 ALIGN (Atlas of Protein Sequence and Structure (Dayhoffed, 1981, Suppl., 3: 482-9))이 관련 기술분야에서 입수가능하다. 뉴클레오티드 서열 사이의 동일성을 결정하기 위한 프로그램은 또한 전문화된 데이터 베이스 (예를 들어 진뱅크, 위스콘신 서열 분석 패키지, BESTFIT, FASTA 및 GAP 프로그램, 및 명칭 ≪ Align ≫ 하에 ebi.ac.uk 월드와이드로부터 입수가능한 니들 소프트웨어)에서 입수가능하다.
본원에 사용된 용어 "숙주 세포"는 조직, 기관, 또는 단리된 세포 내 특정한 조직화에 관하여 임의의 제한 없이 광범위하게 이해되어야 한다. 이러한 세포는 독특한 유형의 세포 또는 일군의 상이한 유형의 세포 예컨대 배양된 세포주, 1차 세포 및 분열 세포일 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "숙주 세포"는 원핵 세포, 하등 진핵 세포 예컨대 효모, 및 다른 진핵 세포 예컨대 곤충 세포, 식물 및 포유동물 (예를 들어 인간 또는 비-인간) 세포 뿐만 아니라 본 발명의 종양용해성 바이러스를 생산할 수 있는 세포를 포함한다. 이러한 용어는 또한 본원에 기재된 바이러스의 수용자일 수 있거나 또는 수용자였던 세포 뿐만 아니라 이러한 세포의 자손을 포함한다.
용어 "바이러스", "바이러스 입자", "바이러스 벡터" 및 "비리온"은 상호교환가능하게 사용되고, 야생형 바이러스 게놈의 적어도 하나의 요소를 포함하는 비히클을 의미하는 것으로서 광범위하게 이해되어야 하고, 바이러스 입자 내로 또는 바이러스 입자에 패키징될 수 있다. 바이러스 입자가 핵산 (즉, 바이러스 게놈)을 함유할 수 있거나 또는 함유하지 않을 수 있을지라도, 바이러스가 바이러스 입자 (또는 비리온) 내로 패키징된 DNA 또는 RNA 바이러스 게놈을 포함하고 감염성인 (즉, 숙주 세포 또는 대상체를 감염시키고 진입할 수 있는) 것이 바람직하다. 바람직하게는, 본 발명의 바이러스는 DNA 게놈, 가장 바람직하게는 이중-가닥 DNA 게놈과 연관된다. 본 개시내용의 맥락에서, "바이러스"는 야생형 및 조작된 바이러스를 포함한다.
용어 "자연 발생" 또는 "야생형" 또는 "천연"은 사람에 의해 인공적으로 생산된 것과는 달리 자연에서 발견될 수 있는 생물학적 분자 또는 유기체를 기재하는데 사용된다. 예를 들어, 자연에서의 공급원으로부터 단리될 수 있는 바이러스는 야생형이다. 본 발명은 또한 특정한 콜렉션 (예를 들어 ECCAC, ATCC, CNCM 등)으로부터 수득될 수 있는 야생형 바이러스를 포괄한다. 실험실에서 사람에 의해 의도적으로 변형되어 있는 생물학적 분자 또는 유기체는 자연 발생이 아니다. 비-자연 발생 바이러스의 대표적인 예는, 많은 여러 것들 중에서도, 하나 이상의 관심 유전자(들)의 바이러스 게놈에의 삽입에 의해 조작된 재조합 바이러스 및 코딩된 유전자 산물이 결손된 변형된 바이러스 (예를 들어 tk- 바이러스)를 제조하도록 바이러스 유전자의 전체 또는 부분 결실에 의해 조작된 돌연변이된 바이러스 뿐만 아니라 상이한 바이러스 기원으로부터 수득되는 게놈 단편을 함유하는 키메라 바이러스를 포함한다.
용어 "로부터 수득된", "기원하는" 또는 "기원하다"는 성분의 원래 공급원 (예를 들어 폴리펩티드, 핵산 분자, 바이러스 등)을 확인하는데 사용되지만, 예를 들어, 화학적 합성 또는 재조합 수단에 의한 것일 수 있는, 성분이 만들어질 수 있는 방법을 제한하려는 것은 아니다.
본원에 사용된 용어 "종양용해성 바이러스"는, 비-분열 세포 (예를 들어 1차 세포)에서 전혀 복제하지 않거나 최소 복제를 제시하면서, 시험관내 또는 생체내에서, 분열 세포 (예를 들어 증식성 세포 예컨대 암 세포)의 성장을 둔화시키고/거나 그를 용해하려는 목적으로 상기 분열 세포에서 선택적으로 복제할 수 있는, 자연 발생, 조작된 또는 달리 변형된 임의의 바이러스를 지칭한다.
용어 "복제" 및 "전파"는 상호교환가능하게 사용되고, 재생 및 증식시키는 바이러스의 능력을 지칭한다. 바이러스 복제는 바이러스 역가 검정, 플라크 검정, 흡광도, 형광 검출, 질량 분광측정법 등과 같은 관련 기술분야 내 및 본원에 기재된 검정 표준을 사용하여 핵산의 수준으로 또는 감염성 바이러스 입자의 수준으로 정량화될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "치료 유전자"는 대상체에게, 특히 질환 또는 질병 상태를 겪고 있거나 또는 이러한 질환 또는 상태에 대하여 보호되어야 하는 환자에게 적절하게 투여될 때 생물학적 활성을 제공할 수 있는, "치료 분자"로도 불리는, 산물을 코딩하는 핵산 서열을 지칭한다. 이러한 생물학적 활성은 항종양 효능을 증강시키거나 또는 바이러스의 종양용해성 성질을 강화시킴으로써 치료할 병리학적 상태의 경과 또는 증상에 대한 유익한 효과를 야기할 것으로 예상된다.
본원에 사용된 용어 "치료" (및 치료의 임의의 형태 예컨대 "치료하는", "치료하다")는, 임의로 통상적인 치료 양식과 함께, 예방 (예를 들어 치료할 병리학적 상태를 가질 위험이 있는 대상체에서의 예방적 조치) 및/또는 요법 (예를 들어 병리학적 상태를 갖는 것으로서 진단된 대상체에서)을 포괄한다. 치료의 결과는 표적화된 병리학적 상태의 진행을 둔화시키거나, 치유하거나, 호전시키거나 또는 제어하는 것이다. 예를 들어, 단독으로 또는 조합으로의, 본원에 기재된 바와 같은 종양용해성 바이러스의 투여 후, 대상체가 그의 임상적 스테이터스의 관찰가능한 개선을 제시하는 경우에, 대상체는 암에 대해 성공적으로 치료된다.
본원에 사용된 용어 "투여하는" (또는 투여의 임의의 형태, 예컨대 "투여된")은 본원에 기재된 종양용해성 바이러스와 같은 치료제의 대상체로의 전달을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "증식성 질환"은 암, 종양 및 일부 심혈관 질환 (혈관 벽의 평활근 세포의 증식으로부터 초래되는 재협착 등)을 포함한 비제어된 세포 성장 및 확산으로부터 초래되는 임의의 질환 또는 상태를 포괄한다. 용어 "암"은 "종양", "악성종양", "신생물" 등의 임의의 용어와 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 이들 용어는 임의의 유형의 조직, 기관 또는 세포, 임의의 병기의 악성종양 (예를 들어 병변전부터 병기 IV까지)을 포함하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "증가된 파골세포 활성과 연관된 질환"은 골 흡수 또는 파괴를 초래하는 임의의 질환 또는 상태 (예를 들어 류마티스 관절염, 골다공증 등)를 포괄한다.
용어 "대상체"는 일반적으로 본 발명의 임의의 산물 및 방법이 필요하거나 또는 유익할 수 있는 유기체를 지칭한다. 전형적으로, 유기체는 포유동물, 특히 가축, 농장 동물, 스포츠 동물, 및 영장류로 이루어진 군으로부터 선택된 포유동물이다. 바람직하게는, 대상체는 암과 같은 증식성 질환을 갖거나 또는 가질 위험이 있는 것으로 진단된 인간이다. 용어 "대상체" 및 "환자"는 인간 유기체를 지칭할 때 상호교환가능하게 사용될 수 있고 남성 및 여성을 포괄한다. 치료할 대상체는 신생아, 유아, 청소년, 성인 또는 노인일 수 있다.
용어 "조합 치료", "조합 요법", "조합된 치료" 또는 "조합적 치료"는, 상호교환가능하게 사용될 수 있고, 적어도 2종의 상이한 치료제로의 대상체의 치료를 지칭한다. 한 실시양태에서, 치료제 중 하나는 상기 종양용해성 바이러스이다. 제2 치료제는 임의의 임상적으로 달성되는 치료제, 특히 수술, 방사선요법, 화학요법, 동결요법, 호르몬 요법, 독소 요법, 면역요법, 시토카인 요법, 표적화된 암 요법, 유전자 요법, 광역학 요법, 이식 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 조합적 치료는 제3 또는 심지어 추가의 치료제를 포함할 수 있다. 조합 치료의 경우에, 조합의 각 성분의 최적 농도가 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있는 것으로 인지된다. 구체적 실시양태에서, 본 발명의 종양용해성 바이러스 (예를 들어 야생형 종양용해성 바이러스, 또는 변형된 유도체 종양용해성 바이러스)는 시티딘 데아미나제와의 조합으로 전달될 수 있으며, 여기서 상기 시티딘 데아미나제는 종양용해성 바이러스에 의해 코딩되지는 않는다. 시티딘 데아미나제는 폴리펩티드의 형태 (예를 들어 재조합적으로 생산된 시티딘 데아미나제, 또는 그의 유사체) 또는 핵산 분자의 형태 (예를 들어 이러한 시티딘 데아미나제(들)를 발현하기 위해 조작된 벡터에 의해 운반됨), 뿐만 아니라 폴리펩티드(들) 및 핵산 분자(들) (예를 들어 시티딘 데아미나제(들) 및 발현 벡터(들))의 혼합물일 수 있다.
종양용해성 바이러스
본 발명의 "종양용해성 바이러스"는 현재 확인된 바이러스의 임의의 구성원으로부터 수득될 수 있으며, 단 비-분열 세포와 비교하여 분열 세포에서 복제하고 그를 사멸시키는 더 높은 성향에 의해 종양용해성이다. 이는 자연 종양용해성인 천연 바이러스일 수 있거나 또는 DNA 복제, 핵산 대사, 숙주 향성, 표면 부착, 병독성, 용해 및 확산에 수반되는 것들과 같은, 분열 세포에서의 종양 선택성 및/또는 우선적 복제를 증가시키도록 하나 이상의 바이러스 유전자를 변형시킴으로써 조작될 수 있다 (예를 들어 문헌 [Kirn et al., 2001, Nat. Med. 7: 781; Wong et al., 2010, Viruses 2: 78-106] 참조). 또한 하나 이상의 바이러스 유전자(들)를 이벤트 또는 조직-특이적 조절 요소 (예를 들어 프로모터)의 제어 하에 배치하는 것을 구상할 수 있다.
예시적인 종양용해성 바이러스는 제한 없이 레오바이러스, 세네카 밸리 바이러스 (SVV), 수포성 구내염 바이러스 (VSV), 뉴캐슬병 바이러스 (NDV), 단순 헤르페스 바이러스 (HSV), 모르빌리바이러스, 아데노바이러스, 폭스바이러스, 레트로바이러스, 홍역 바이러스, 포말 바이러스, 알파 바이러스, 렌티바이러스, 인플루엔자 바이러스, 신비스 바이러스, 점액종 바이러스, 랍도바이러스, 피코르나바이러스, 콕사키바이러스, 파르보바이러스 등을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 종양용해성 바이러스는 레오바이러스로부터 수득된다. 대표적인 예는 레올리신 (온콜리틱스 바이오테크(Oncolytics Biotech)에 의해 개발 중; NCT01166542)을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 종양용해성 바이러스는 세네카 밸리 바이러스로부터 수득된다. 대표적인 예는 NTX-010을 포함한다 (Rudin et al., 2011, Clin. Cancer. Res. 17(4): 888-95).
한 실시양태에서, 본 발명의 종양용해성 바이러스는 수포성 구내염 바이러스 (VSV)로부터 수득된다. 대표적인 예는 문헌 (예를 들어 [Stojdl et al., 2000, Nat. Med. 6(7): 821-5; Stojdl et al., 2003, Cancer Cell 4(4): 263-75])에 기재되어 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 종양용해성 바이러스는 뉴캐슬병 바이러스로부터 수득된다. 대표적인 예는 제한 없이 73-T PV701 및 HDV-HUJ 균주 뿐만 아니라 문헌 (예를 들어 [Phuangsab et al., 2001, Cancer Lett. 172(1):27-36; Lorence et al., 2007, Curr. Cancer Drug Targets 7(2):157-67; Freeman et al., 2006, Mol. Ther. 13(1):221-8])에 기재된 것들을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 종양용해성 바이러스는 헤르페스 바이러스로부터 수득된다. 헤르페스비리다에(Herpesviridae)는 모두가 공통 구조를 공유하는 DNA 바이러스의 거대 패밀리이고, 지질 이중층 막에 둘러싸여 있는 이십면체 캡시드 내에 캡시드화된 100-200개 유전자를 코딩하는 상대적으로 큰 이중-가닥, 선형 DNA 게놈으로 구성된다. 종양용해성 헤르페스 바이러스가 상이한 유형의 HSV로부터 유래될 수 있을지라도, HSV1 및 HSV2가 특히 바람직하다. 헤르페스 바이러스는 종양에서의 바이러스 복제를 제한하거나 또는 비-분열 세포에서의 그의 세포독성을 감소시키도록 유전적으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 핵산 대사에 수반되는 임의의 바이러스 유전자, 예컨대 티미딘 키나제 (Martuza et al., 1991, Science 252: 854-6), 리보뉴클레오티드 리덕타제 (RR) (Boviatsis et al., Gene Ther. 1: 323-31; Mineta et al., 1994, Cancer Res. 54: 3363-66), 또는 우라실-N-글리코실라제 (Pyles et al., 1994, J. Virol. 68: 4963-72)는 불활성화될 수 있다. 또 다른 측면은 ICP34.5 유전자와 같은 병독성 인자를 코딩하는 유전자의 기능에서의 결손을 갖는 바이러스 돌연변이체를 수반한다 (Chambers et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 1411-5). 종양용해성 헤르페스 바이러스의 대표적인 예는 NV1020 (예를 들어 문헌 [Geevarghese et al., 2010, Hum. Gene Ther. 21(9): 1119-28]) 및 T-VEC (Harrington et al., 2015, Expert Rev. Anticancer Ther. 15(12):1389-1403)를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 종양용해성 바이러스는 파라믹소비리다에(paramyxoviridae) 패밀리로부터 수득될 수 있는 모르빌리바이러스, 특별히 바람직하게는 홍역 바이러스로부터 수득된다. 종양용해성 홍역 바이러스의 대표적인 예는 제한 없이 MV-Edm (McDonald et al., 2006; Breast Cancer Treat. 99(2): 177-84) 및 HMWMAA (Kaufmann et al., 2013, J. Invest. Dermatol. 133(4): 1034-42)를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 종양용해성 바이러스는 아데노바이러스로부터 수득된다. 종양용해성 아데노바이러스를 조작하는 방법이 관련 기술분야에서 입수가능하다. 유리한 전략은 바이러스 프로모터의 종양-선택적 프로모터로의 대체 또는 종양 세포에서 변경되는 p53 또는 망막모세포종 (Rb) 단백질과의 그들의 결합 기능을 불활성화시키기 위한 E1 아데노바이러스 유전자 산물(들)의 변형을 포함한다. 자연 맥락에서, 아데노바이러스 E1B55kDa 유전자는 또 다른 아데노바이러스 산물과 협력하여 p53을 불활성화시키며 (p53은 암 세포에서 빈번하게 이상조절됨), 이에 따라 아폽토시스를 방지한다. 종양용해성 아데노바이러스의 대표적인 예는 ONYX-015 (예를 들어 문헌 [Khuri et al., 2000, Nat. Med 6(8): 879-85]) 및 온코린으로도 명명되는 H101 (Xia et al., 2004, Ai Zheng 23(12): 1666-70)을 포함한다.
하나의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 종양용해성 바이러스는 폭스바이러스이다. 본원에 사용된 용어 "폭스바이러스" 또는 "폭스바이러스 벡터"는 폭스비리다에 패밀리에 속하는 바이러스, 특별히 바람직하게는 코르도폭스비리다에 서브패밀리, 보다 바람직하게는 오르토폭스바이러스 속에 속하는 폭스바이러스를 지칭한다. 다양한 폭스바이러스의 게놈, 예를 들어, 백시니아 바이러스, 우두 바이러스, 카나리폭스 바이러스, 엑트로멜리아 바이러스, 점액종 바이러스 게놈의 서열이 관련 기술분야 및 전문화된 데이터베이스 예컨대 진뱅크 (각각 수탁 번호 NC_006998, NC_003663 또는 AF482758.2, NC_005309, NC_004105, NC_001132)에서 입수가능하다.
유리하게는, 종양용해성 폭스바이러스는 종양용해성 우두 바이러스이고, 예를 들어 CPXV_GER1980_EP4 (진뱅크 HQ420895), CPXV_GER2002_MKY (진뱅크 HQ420898), CPXV_GER1991_3 (진뱅크 DQ 437593), CPXV_FRA2001_NANCY (진뱅크 HQ420894), CPXV_GER1990_2 (진뱅크 HQ420896), CPXV_UK2000_K2984 (진뱅크 HQ420900), CPXV_BR (진뱅크 AF482758.2 또는 NC 003663) 및 CPXV_NOR1994-MAN (진뱅크 HQ420899), CPXV_GER1998_2 (진뱅크 HQ420897), CPXV_gri (진뱅크 X94355), CPXV_FIN2000_MAN (진뱅크 HQ420893) 및 CPXV_AUS1999_867 (진뱅크 HQ407377)과 같은 임의의 우두 균주로부터 유래할 수 있다.
바람직하게는, 종양용해성 폭스바이러스는 종양용해성 백시니아 바이러스이다. 백시니아 바이러스는 바이러스가 숙주 세포 기구로부터 독립적으로 복제할 수 있도록 하는 수많은 바이러스 효소 및 인자를 코딩하는 200kb 이중-가닥 DNA 게놈을 특징으로 하는 폭스바이러스 패밀리의 구성원이다. 백시니아 바이러스 입자의 대부분은 단일 지질 외피를 갖는 세포내 (세포내 성숙 비리온의 경우에 IMV)이고, 용해할 때까지 감염된 세포의 시토졸에 남아있다. 다른 감염성 형태는 그를 용해하지 않으면서 감염된 세포로부터 출아하는 이중 외피보유 입자 (세포외 외피보유 비리온의 경우에 EEV)이다.
이것은 임의의 백시니아 바이러스 균주로부터 유래할 수 있을지라도, 엘스트리, 와이어쓰, 코펜하겐 및 웨스턴 리저브 균주가 특히 바람직하다. 본원에 사용된 유전자 명명법은 코펜하겐 백시니아 균주의 것이다. 이것은 또한 달리 나타내지 않는 한 다른 폭스비리다에의 상동 유전자에 대해 본원에 사용된다. 그러나, 유전자 명명법은 폭스 균주에 따라 상이할 수 있지만, 코펜하겐 및 다른 백시니아 균주 사이의 대응은 일반적으로 문헌에서 입수가능하다.
바람직하게는, 본 발명의 종양용해성 백시니아 바이러스는 하나 이상의 바이러스 유전자(들)를 변경함으로써 변형된다. 상기 변형(들)은 바람직하게는 비변형된 유전자에 의해 정상 조건 하에 생산된 단백질의 활성을 보장할 수 없는 결손 단백질의 합성 (또는 합성의 결여)으로 이어진다. 변형은 바이러스 유전자 또는 그의 조절 요소 내에서의 (근접하거나 또는 근접하지 않은) 하나 이상의 뉴클레오티드(들)의 결실, 돌연변이 및/또는 치환을 포괄한다. 변형(들)은 통상적인 재조합 기술을 사용하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 알려진 다수의 방식으로 이루어질 수 있다. 예시적인 변형, 특별히 바람직하게는 DNA 대사, 숙주 병독성, IFN 경로에 수반되는 바이러스 유전자를 변경시키는 것들 (예를 들어 문헌 [Guse et al., 2011, Expert Opinion Biol. Ther.11(5): 595-608] 참조) 등이 문헌에 개시되어 있다.
보다 바람직하게는, 본 발명의 종양용해성 바이러스는 티미딘 키나제-코딩 유전자 (로커스 J2R)를 변경함으로써 변형된다. TK 효소는 데옥시리보뉴클레오티드의 합성에 수반된다. TK는 정상 세포가 일반적으로 저농도의 뉴클레오티드를 가지므로 이들 세포에서의 바이러스 복제에는 필요하지만 높은 뉴클레오티드 농도를 함유하는 분열 세포에서는 불필요하다.
대안적으로, 또는 조합으로, 본 발명의 종양용해성 바이러스는 리보뉴클레오티드 리덕타제 (RR)를 코딩하는 적어도 하나의 유전자 또는 유전자 둘 다를 변경함으로써 변형된다. 자연 맥락에서, 이러한 효소는 DNA 생합성에서의 중대한 단계를 나타내는 리보뉴클레오티드의 데옥시리보뉴클레오티드로의 환원을 촉매한다. 바이러스 효소는 포유동물 효소와 서브유닛 구조에서 유사하며, 이는 I4L 및 F4L 로커스에 의해 각각 코딩되는 R1 및 R2로 지정된 2개의 이종 서브유닛으로 구성된다. 다양한 폭스바이러스의 게놈에서의 I4L 및 F4L 유전자에 대한 서열 및 그의 위치는 공중 데이터베이스에서, 예를 들어 수탁 번호 DQ437594, DQ437593, DQ377804, AH015635, AY313847, AY313848, NC_003391, AF482758.2, NC_003389, NC_003310, AY243312, DQ011157, DQ011156, DQ011155, DQ011154, DQ011153, Y16780, AF438165, U60315, AF410153, AF380138, L22579, NC_006998, DQ121394 및 NC_008291을 통해 입수가능하다. 본 발명의 맥락에서, I4L 유전자 (R1 큰 서브유닛을 코딩함) 또는 F4L 유전자 (R2 작은 서브유닛을 코딩함) 또는 둘 다가 불활성화될 수 있다.
대안적으로, 또는 조합으로, 바이러스 종양-특이성을 추가로 증가시키기 위한 다른 전략이 또한 추구될 수 있다. 적합한 변형의 대표적인 예는 바이러스 게놈으로부터의 VGF-코딩 유전자의 붕괴를 포함한다. VGF (VV 성장 인자의 경우)는 세포 감염 후 초기에 발현되는 분비된 단백질이고 그의 기능은 정상 세포에서의 바이러스 확산에 중요한 것으로 보인다. 또 다른 예는, 임의로 TK 결실과의 조합으로, 헤마글루티닌을 코딩하는 A56R 유전자의 붕괴이다 (Zhang et al., 2007, Cancer Res. 67:10038-46). 인터페론 조정 유전자(들) (예를 들어 B8R 또는 B18R 유전자) 또는 카스파제-1 억제제 B13R 유전자의 붕괴가 또한 유리할 수 있다. 또 다른 적합한 변형은 DNA 복제의 충실도를 유지하는 것 및 티미딜레이트 신타제에 의한 TMP의 생산을 위한 전구체를 제공하는 것 둘 다에 수반되는 바이러스 dUTPase를 코딩하는 F2L 유전자의 붕괴를 포함한다 (Broyles et al., 1993, Virol. 195: 863-5). 백시니아 바이러스 F2L 유전자의 서열은 수탁 번호 M25392를 통해 진뱅크에서 입수가능하고, F2L 로커스가 결손된 폭스바이러스는 WO2009/065547로부터 입수가능하다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 종양용해성 바이러스는 바이러스 TK 활성이 결여되도록 하는, 불활성화 돌연변이로부터 초래되는, J2R 로커스가 결손된 폭스바이러스이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 종양용해성 바이러스는 바이러스 게놈에 의해 운반되는 J2R 로커스 및 RR-코딩 I4L 및/또는 F4L 로커스 중 적어도 하나 둘 다에서의 불활성화 돌연변이로부터 초래되는, TK 및 RR 활성 둘 다가 결손된 폭스바이러스이다 (예를 들어 WO2009/065546 및 문헌 [Foloppe et al., 2008, Gene Ther., 15: 1361-71]에 기재된 바와 같음).
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 종양용해성 바이러스는, 임의로 TK 및 RR 활성 중 적어도 하나 또는 둘 다의 붕괴와의 조합으로, F2L 유전자 (예를 들어 WO2009/065547에 기재된 바와 같음)에서의 불활성화 돌연변이 (F2L; F2L 및 J2R 유전자; F2L 및 I4L; 또는 F2L, J2R 및 I4L에서의 불활성화 돌연변이를 갖는 바이러스를 초래함)로부터 초래되는, dUTPase가 결손된 폭스바이러스이다.
뉴클레오시드 풀 조정제 및 시티딘 데아미나제
용어 "뉴클레오시드"는 당, 통상적으로 리보스 또는 데옥시리보스, 및 퓨린 또는 피리미딘 염기로 이루어진 임의의 다양한 화합물을 지칭한다. 보다 정확히, 용어 "리보뉴클레오시드"는 리보스에 연결된 임의의 퓨린 또는 피리미딘 염기를 나타낸다. 유사하게, 용어 "데옥시리보뉴클레오시드"는 데옥시리보스에 연결된 임의의 퓨린 또는 피리미딘 염기를 지칭한다. 그 결과, 표현 "뉴클레오시드"는 리보뉴클레오시드 및 데옥시리보뉴클레오시드 둘 다를 나타낸다. 뉴클레오시드의 예는 시티딘 및 데옥시시티딘이다.
용어 "뉴클레오티드"는 뉴클레오시드 및 하나 이상의 포스페이트로 이루어진 임의의 다양한 화합물을 지칭한다. 표현 "뉴클레오티드"는 리보뉴클레오티드 및 데옥시리보뉴클레오티드 둘 다를 나타낸다. 뉴클레오티드의 예는 시티딘-모노포스페이트, 시티딘-디포스페이트 또는 시티딘 트리-포스페이트이다.
본원에 사용된 용어 "뉴클레오시드 풀 조정제" 또는 "뉴클레오시드 풀의 조정제"는, 네가티브 또는 포지티브 방식으로, 뉴클레오시드 풀에 대해 직접적으로 또는 간접적으로 작용하는 임의의 성분을 지칭한다. 유사하게, 용어 "뉴클레오티드 풀 조정제" 또는 "뉴클레오티드 풀의 조정제"는 네가티브 또는 포지티브 방식으로 뉴클레오티드 풀에 대해 직접적으로 또는 간접적으로 작용하는 임의의 성분을 지칭한다. 용어 "조정제"는 전체 조정제(들), 그의 부분 (예를 들어 말단절단된 것) 및 유사체를 의미한다. 용어 "조정제"는 숙주 세포에서, 예컨대 인간, 동물, 곤충 또는 미생물 (예를 들어 바이러스, 박테리아)에서 자연적으로 존재하는 "세포성" 조정제를 포괄한다. 세포성 뉴클레오시드 풀 조정제의 발현은 분열 세포에서 증가될 수 있다 (De Pas et al., 2008, J. Clin. Oncol., 20;26:14644). 본 발명의 맥락에서, 이러한 "조정제(들)"는 뉴클레오시드/뉴클레오티드의 풀을 증가시키는 조정제 뿐만 아니라 뉴클레오시드/뉴클레오티드의 풀을 저하시키는 조정제를 포함한다. 이러한 조정제(들)는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드의 풀에 대해 직접적으로 또는 간접적으로 작용할 수 있다. 본 발명의 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 내인성 (예를 들어 신생 생합성, 샐비지 경로) 또는 외인성 (예를 들어 식품 또는 약물의 분해)일 수 있다. 이들은 또한 유리 상태 (예를 들어 세포질에서)이거나 또는 복합체화된 것 (예를 들어 DNA에서)일 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 플루오린화된다.
유리하게는, 이러한 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 풀 조정제는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 데아미나제이다. 데아미나제는 분자로부터의 아민 기의 제거인 탈아미노화의 반응을 촉매하는 효소이다. 뉴클레오시드 데아미나제는 뉴클레오시드 상에서의 탈아미노화의 반응을 촉매한다. 바람직하게는, 본 발명에 사용하기 위한 뉴클레오시드 풀 조정제는 시티딘 데아미나제 활성을 갖는다. 보다 바람직하게는, 이는 자연 발생 시티딘 데아미나제 또는 그의 유사체이다. 본원에 사용된 용어 "시티딘 데아미나제" 또는 "CDAse"는 시티딘 데아미나제 및 그의 임의의 유사체를 나타내며, 단 이러한 유사체는 상당한 시티딘 데아미나제 효소적 활성 (야생형 대응물의 적어도 50%)을 보유한다. 용어 유사체는 CDAse의 단편 (예를 들어 말단절단된 CDAse) 뿐만 아니라 바람직하게는 촉매 부위 밖의 하나 이상의 아미노산 변형(들)을 포함하는 돌연변이된 CDAse를 포괄한다. 문헌에서, 시티딘 데아미나제는 "데옥시시티딘 데아미나제" 및 "시티딘 아미노히드롤라제"로도 명명된다.
시티딘 데아미나제는 상응하는 우라실 산물에 대한 그의 기질의 가수분해성 탈아미노화를 촉매하는 다중-서브유닛 효소의 패밀리에 속한다 (Somasekaram et al., 1999, J. Biol. Chem. 274 (40):28405-12). CDAse는 피리미딘 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드 샐비지에서 주요 역할을 한다. 보다 정확히, CDAse는, 예를 들어 시티딘 (C)의 우리딘 (U)으로의, 및 데옥시시티딘 (dC)의 데옥시우리딘 (dU)으로의 탈아미노화와 같은, 시티딘계 성분의 우리딘계 성분으로의 탈아미노화를 촉매한다 (Demontis et al., 1998, Biochim. Biophys. Acta. 1443:323-33). 이러한 탈아미노화는 다른 시티딘계 성분에 대해 지시될 수 있다. 예를 들어, CDAse에 의한 dC 및 5-메틸-2'-데옥시시티딘 (5mdC)의 탈아미노화는 dU 및 티미딘 (T)를 초래하며, 이는 티민 트리포스페이트 합성을 위한 정상 전구체이다. 또 다른 예는 5-히드록시메틸-2'데옥시시티딘 (5hmdC) 및 5-포르밀-2'데옥시시티딘 (5fdC)의 우리딘의 변이체, 각각 5hmdU 및 5fdU로의 전환이며, 이들은 DNA 내로 혼입될 때 세포에 독성이어서, 이들은 손상된 염기로서 인식된다 (Zauri et al., 2015, Nature, 524:114-118). 추가의 예는 화학요법 뉴클레오시드 유사체 예컨대 Ara-C, 5-아자시티딘 및 2,2-디플루오로데옥시시티딘 (겜시타빈)의 탈아미노화이며, 이는 이들의 세포독성 및 항종양 활성의 손실을 초래한다 (Fitzgerald et al., 2006, Hum. Genet., 119(3):276-83).
시티딘 데아미나제의 2개 패밀리는, 시티딘 데아미나제 (CDA 또는 CDD; EC 3.5.4.5)에 의해 수행된 바와 같이 유리 시티딘을 탈아미노화하거나, 또는 AID/APOBEC (활성화-유도된 데아미나제, 및 아포지단백질 B mRNA 편집 촉매 폴리펩티드 유사) 단백질에 의해 수행된 바와 같이 DNA 또는 RNA 중합체 내에 혼입된 시티딘을 탈아미노화하는, 상이한 생물학적 기능을 나타낸다 (Mameri et al., 2016, Clin. Cancer. Res. DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-16-0626; Conticello et al., 2005, Mol. Biol. Evol. 22:367-77).
포유동물 (예를 들어 인간), 곤충, 박테리아 또는 하등 진핵 시티딘 데아미나제를 포함한 다양한 시티딘 데아미나제가 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 종양용해성 바이러스는 코딩되거나, 또는 인간 기원의 CDAse와의 조합으로 사용된다. 인간 시티딘 데아미나제의 대표적인 예는, 제한 없이, hCD로도 명명되는 인간 CDA (진뱅크 수탁 번호 NM_001785; NP_001776), 활성화-유도된 시티딘 데아미나제 (AID 또는 AICDA, 진뱅크 수탁 번호 NM_020661; EAW88615.1; BAB12721), APOBEC 단백질 패밀리의 구성원 (APOBEC1 (진뱅크 수탁 번호 NM 001644; BAA23882), APOBEC2 (진뱅크 수탁 번호 NM_006789; AF161698_1), APOBEC3A (진뱅크 수탁 번호 KM_266646; AKE33285), APOBEC3B (진뱅크 수탁 번호 NM_004900; AAH53859), APOBEC3C (진뱅크 수탁 번호 NM_014508), APOBEC3D (진뱅크 수탁 번호 NM_152426), APOBEC3E (진뱅크 수탁 번호 NM_152426), APOBEC3F (진뱅크 수탁 번호 NM_145298), APOBEC3G (진뱅크 수탁 번호 NM_021822; AAH61914.1), APOBEC3H (진뱅크 수탁 번호 NM_001166003), APOBEC4 (진뱅크 수탁 번호 NM-203454.2)) 및 시티딘 데아미나제-유사 단백질을 포함한다.
시티딘 데아미나제는 또한 진균, 효모, 바이러스 또는 박테리아와 같은 미생물로부터 기원할 수 있다. 비-인간 시티딘 데아미나제의 예는 효모 (예를 들어 CDD1: 진뱅크 수탁 번호 NM_001182132; EDN59461), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata) (진뱅크 수탁 번호 KTB24532), 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) (진뱅크 수탁 번호 AJ005687), 이. 콜라이(E. coli) (진뱅크 수탁 번호 NP_416648) 등으로부터 기원한다.
한 실시양태에서, 종양용해성 바이러스는 CDA, CDD, EC 3.5.4.5, APOBEC, AID 및 시티딘 데아미나제-유사 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 CDAse 폴리펩티드를 코딩한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 종양용해성 바이러스는 효모 시티딘 데아미나제 (CDD1)를 코딩하며, 상기 CDD1은 서열식별번호: 1과 적어도 80%, 바람직하게는 90% 초과, 보다 바람직하게는 95% 초과의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 종양용해성 바이러스는 인간 시티딘 데아미나제 (hCD)를 코딩하며, 상기 hCD는 서열식별번호: 2와 적어도 80%, 바람직하게는 90% 초과, 보다 바람직하게는 95% 초과의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
추가의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 종양용해성 바이러스는 인간 APOBEC2를 코딩하며, 상기 APOBEC2는 서열식별번호: 3과 적어도 80%, 바람직하게는 90% 초과, 보다 바람직하게는 95% 초과의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 바람직하게는 하나 이상의 시티딘 데아미나제 코딩 핵산 분자를 포함하는 종양용해성 바이러스에 관한 것이다. 예를 들어, 효모 시티딘 데아미나제 (CDD1) 및 인간 시티딘 데아미나제 (hCD)를 코딩하는 핵산 분자는 이하에 기재된 바와 같은 적절한 조절 요소의 제어 하에 바이러스 게놈에 (예를 들어 상이한 위치에) 삽입될 수 있다. CDAse-코딩 핵산 분자(들)는 바이러스 게놈의 임의의 위치에, 특별히 바람직하게는 비-필수 로커스에 삽입될 수 있다. 예를 들어, TK 유전자, RR 유전자 또는 유전자간 구역은 종양용해성 백시니아 바이러스에의 삽입에 특히 적절하다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 바이러스 TK 및 RR-코딩된 활성이 결손되고 인간 또는 효모 CDAse를 코딩하는 약독화 백시니아 바이러스, 예컨대 실시예 섹션에 예시된 VVTK-RR-/CDD1, VVTK-RR-/hCD 또는 VVTK-RR-/APOBEC2에 관한 것이다.
"시티딘 데아미나제 코딩 핵산 분자"는 클로닝에 의해, PCR에 의해, 또는 화학적 합성에 의해 본원에 제공된 정보 및 통상의 기술자의 일반적 지식에 기반하여용이하게 수득될 수 있다. 본원에 사용하기 위한 CDAse-코딩 핵산 분자는 천연 CDAse-코딩 서열 (예를 들어 cDNA) 또는 하나 이상의 뉴클레오티드의 돌연변이, 결실, 치환 및/또는 부가에 의해 그로부터 유래될 그의 유사체일 수 있다. 더욱이, CDAse-코딩 핵산 분자는 이하에 기재된 바와 같은 특정한 숙주 세포 또는 대상체에서 높은 수준 발현을 제공하기 위해 최적화될 수 있다.
관심 핵산(들)
구체적 실시양태에 따르면, 본 발명의 종양용해성 바이러스는 그의 게놈에 삽입된 CDAse-코딩 핵산 분자와 상이한 하나 이상의 관심 핵산(들)을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 따르면, 관심 핵산(들)은 도입되는 숙주 유기체에 대해 동종이거나 또는 이종일 수 있다. 보다 구체적으로, 이는 인간 기원의 것일 수 있거나 아닐 수 있다 (예를 들어 박테리아, 효소 또는 바이러스 기원의 것). 유리하게는, 상기 관심 핵산은 폴리펩티드의 전부 또는 일부를 코딩한다. 폴리펩티드는 크기와 상관없이, 및 글리코실화 되든지 아니든지 폴리뉴클레오티드의 임의의 번역 산물인 것으로 이해되고, 펩티드 및 단백질을 포함한다.
방대한 수의 관심 핵산, 예컨대 치료할 병리학적 상태의 경과 또는 증상에 대한 유익한 효과를 야기할 것으로 예상되는 폴리펩티드, 예컨대 대상체에서 결손 또는 결핍 단백질을 보상할 수 있는 폴리펩티드를 코딩하는 것들, 또는 신체로부터 해로운 세포를 제한하거나 또는 제거하기 위해 독성 효과를 통해 작용하는 폴리펩티드 또는 면역 부여 폴리펩티드 (예를 들어, 면역 체액성 및/또는 세포성 반응을 유도하거나 또는 활성화시키기 위한 면역자극 폴리펩티드 및/또는 항원), 또는 많은 여러 것들 중에서도 세포성 뉴클레오시드/뉴클레오티드 풀을 증가시키는 퍼미아제를 코딩하는 것들이 본 발명의 맥락에서 구상될 수 있다. 이러한 관심 핵산은 자연 발생 서열로부터 수득되거나 또는 하나 이상의 뉴클레오티드의 돌연변이, 결실, 치환 및/또는 부가에 의해 변형될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 관심 핵산은 원핵생물 (박테리아, 고세균의 계를 포함함), 무핵생물 (바이러스를 포함함) 또는 진핵생물 (원생생물, 진균, 식물계, 동물계의 계를 포함함)로부터 기원할 수 있다.
적합한 관심 핵산의 예는 하기 목록에 주어진다: 본 발명의 종양용해성 바이러스는 효소 (우레아제, 레닌, 트롬빈, 메탈로프로테이나제, 산화질소 신타제 NOS, SOD, 카탈라제, 히알루로니다제, ...), 효소 억제제 (알파1-항트립신, 항트롬빈 III, 바이러스 프로테아제 억제제, 플라스미노겐 활성화제 억제제 PAI-1), 단백질, 클래스 I 또는 II의 MHC 항원, 세포성 유전자의 발현을 조정/조절할 수 있는 폴리펩티드, 박테리아, 기생충 또는 바이러스 감염 또는 그의 발생을 억제할 수 있는 폴리펩티드 (항원성 폴리펩티드, 항원성 에피토프, 경쟁에 의해 천연 단백질의 작용을 억제하는 트랜스우성 변이체....), 아폽토시스 유도제 또는 억제제, (Bax, Bak, Bok, Bad, Bid et Bim, Bax 억제제, Bak 억제제, Bok 억제제, Bad 억제제, Bid 억제제, Bim 억제제, Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, Nr13, Bcl2 억제제, Bcl-xL-억제제, Bcl-w 억제제, Nr13 억제제), 세포증식억제제 (p21, p16, Rb...), 아포지단백질 (ApoAI, ApoAIV, ApoE...), 혈관신생의 억제제 (안지오스타틴, 엔도스타틴...), 항-VEGF 항체 또는 scFv, 산소 라디칼 스캐빈저, 항종양 효과를 갖는 폴리펩티드, 항체, 독소, 면역독소, 마커 (베타-갈락토시다제, 루시페라제...)로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 또는 임상적 상태의 치료 또는 예방에 유용한 것으로서 관련 기술분야에 인식되는 임의의 다른 관심 핵산을 추가로 운반할 수 있다. 적합한 항종양 핵산은 종양 억제 유전자 (예를 들어 Rb, p53, DCC, NF-1, 윌름스 종양, NM23, BRUSH-1, p56, p73 뿐만 아니라 그의 각각의 돌연변이체), 항체, 세포 분열 또는 형질도입 신호를 억제하는 폴리펩티드를 코딩하는 것들을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
면역자극 폴리펩티드
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 종양용해성 바이러스는 면역자극 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "면역자극 폴리펩티드"는 특이적 또는 비-특이적 방식으로, 면역계를 자극하는 능력을 갖는 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭한다. 방대한 수의 단백질은 면역자극 효과를 발휘하는 그의 능력에 대해 관련 기술분야에 알려져 있다. 본 발명의 맥락에서 적합한 면역자극 단백질의 예는, 제한 없이, 항-PD1, 항-PDL1, 항-PDL-2, 항-CTLA4, 항-Tim3, 항-LAG3, 항-BTLA를 포함하나 이에 제한되지는 않는 면역 체크포인트 억제제; 알파, 베타 또는 감마 인터페론, 인터류킨 (특히 IL-2, IL-6, IL-10 또는 IL-12) 또는 종양 괴사 인자 (TNF)와 같은 시토카인; 세포 표면 수용체의 조절에 영향을 미치는 작용제 예컨대, 예를 들어 표피 성장 인자 수용체의 억제제 (특히 세툭시맙, 파니투무맙, 잘루투무맙, 니모투주맙, 마투주맙, 게피티닙, 에를로티닙 또는 라파티닙) 또는 인간 표피 성장 인자 수용체-2의 억제제 (특히 트라스투주맙); 혈관신생에 영향을 미치는 작용제 예컨대, 예를 들어 혈관 내피 성장 인자의 억제제 (특히 베바시주맙 또는 라니비주맙); 과립구 (호중구, 호산구, 및 호염기구), 대식세포를 생산하도록 줄기 세포를 자극하는 작용제 예컨대, 예를 들어 과립구 대식세포 - 콜로니 자극 인자 (GM-CSF, C-CSF, M-CSF...), 및 B7 단백질 (B7.1, B7.2 등)을 포함한다.
항원
용어 "항원"은 일반적으로, 면역 반응을 촉발하기 위해, 항체에 의해 또는 T 세포 항원 수용체에 의해 인식되고 선택적으로 결합되는 물질을 지칭한다. 용어 항원이 천연 항원 뿐만 아니라 그의 단편 (예를 들어 에피토프, 면역원성 도메인 등) 및 유도체를 포괄하며, 단 이러한 단편 또는 유도체가 면역 반응의 표적일 수 있는 것으로 고려된다. 본 발명의 맥락에서 적합한 항원은 바람직하게는, 하나 이상의 B 세포 에피토프(들) 또는 하나 이상의 T 세포 에피토프(들) 또는 B 및 T 세포 에피토프(들) 둘 다를 포함하고 면역 반응, 바람직하게는 해당 항원에 대해 특이적일 수 있는 체액성 또는 세포성 반응을 일으킬 수 있는 폴리펩티드 (예를 들어 펩티드, 폴리펩티드, 번역후 변형된 폴리펩티드 등)이다. 전형적으로, 하나 이상의 항원(들)은 치료하기 위한 질환과 관련하여 선택된다. 본원에 사용하기에 바람직한 항원은 암 항원 또는 종양-유도 병원체의 항원이다.
특정 실시양태에서, 종양용해성 바이러스에 함유되거나 그에 의해 코딩되는 항원(들)은 암에 대한 마커와 연관되고/거나 그로서 작용하는 암 항원(들) (종양-연관 항원으로도 명명됨)이다. 암 항원은 다양한 카테고리의 폴리펩티드, 예를 들어 정상 세포에서 정상적으로 침묵인 (즉, 발현되지 않는) 것들, 단지 낮은 수준으로 또는 분화의 특정 단계에서 발현되는 것들 및 배아 및 태아 항원과 같은 일시적으로 발현되는 것들 뿐만 아니라 종양유전자 (예를 들어 활성화된 ras 종양유전자), 원종양유전자 (예를 들어 ErbB 패밀리), 또는 염색체 전위로부터 초래되는 단백질과 같은 세포성 유전자의 돌연변이로부터 초래되는 것들을 포괄한다. 암 항원은 또한 대상체 (특히 만성적으로 감염된 대상체)에서 악성 상태를 유도할 수 있는 병원성 유기체 (박테리아, 바이러스, 기생충, 진균, 비로이드 또는 프리온) 예컨대 RNA 및 DNA 종양 바이러스 (예를 들어 HPV, HCV, EBV 등) 및 박테리아 (예를 들어 헬리코박터 필로리(Helicobacter pilori))에 의해 코딩되는 항원을 포괄한다.
암 항원의 일부 비제한적 예는, 제한 없이, MART-1/Melan-A, gp100, 디펩티딜 펩티다제 IV (DPPIV), 아데노신 데아미나제-결합 단백질 (ADAbp), 시클로필린 b, 결장직장 연관 항원 (CRC)-C017-1A/GA733, 암배아 항원 (CEA) 및 그의 면역원성 에피토프 CAP-1 및 CAP-2, etv6, aml1, 전립선 특이적 항원 (PSA) 및 그의 면역원성 에피토프 PSA-1, PSA-2 및 PSA-3, 전립선-특이적 막 항원 (PSMA), T-세포 수용체/CD3-제타 쇄, MAGE-패밀리의 종양 항원 (예를 들어, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, MAGE-Xp2 (MAGE-B2), MAGE-Xp3 (MAGE-B3), MAGE-Xp4 (MAGE-B4), MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-C4, MAGE-C5), GAGE-패밀리의 종양 항원 (예를 들어, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8, GAGE-9), BAGE, RAGE, LAGE-1, NAG, GnT-V, MUM-1, CDK4, 티로시나제, p53, MUC 패밀리 (예를 들어 MUC1, MUC16 등; 예를 들어 US6,054,438; WO98/04727; 또는 WO98/37095 참조), HER2/neu, p21ras, RCAS1, 알파-태아단백질, E-카드헤린, 알파-카테닌, 베타-카테닌 및 감마-카테닌, p120ctn, gp100.sup.Pmel117, PRAME, NY-ESO-1, cdc27, 선종성 폴립증 코일 단백질 (APC), 포드린, 코넥신 37, Ig-이디오타입, p15, gp75, GM2 및 GD2 강글리오시드, Smad 패밀리의 암 항원 뇌 글리코겐 포스포릴라제, SSX-1, SSX-2 (HOM-MEL-40), SSX-1, SSX-4, SSX-5, SCP-1 및 CT-7, 및 c-erbB-2 및 바이러스 항원 예컨대 HPV-16 및 HPV-18 E6 및 E7 항원 및 EBV-코딩된 핵 항원 (EBNA)-1을 포함한다.
본 발명에 사용하기에 적합한 다른 항원은 마커 항원 (베타-갈락토시다제, 루시페라제, 녹색 형광 단백질 등)이다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 바와 같은 2종 이상의 관심 폴리펩티드, 예를 들어 적어도 2종의 항원, 적어도 1종의 항원 및 1종의 시토카인, 적어도 2종의 항원 및 1종의 시토카인 등을 발현하는 종양용해성 바이러스를 포괄한다.
퍼미아제
또 다른 실시양태에 따르면, 본 발명의 종양용해성 바이러스는 퍼미아제인 적어도 하나의 관심 핵산을 추가로 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "퍼미아제"는 뉴클레오시드 및 핵염기의 전위에 수반되는 막횡단 단백질을 지칭한다. 뉴클레오시드, 뉴클레오시드 유사체 및 핵염기의 전위에 수반되는 퍼미아제의 예는 hCNT1, hCNT2, hCNT3, hENT1 및 hENT2이다. hCNT1, hCNT2 및 hCNT3 단백질은 뉴클레오시드를 Na+ 커플링된 방식으로 고친화도 및 일부 기질 선택성으로 전위시키며, hCNT1 및 hCNT2는 각각 피리미딘-선호 및 퓨린-선호이고, hCNT3은 광범위 선택성 수송체이다. hENT1 및 hENT2는 뉴클레오시드 및 핵염기의 전위에 명백히 연루된다 (Pastor-Anglada et al., 2015, Front. Pharmacol., 6(13):1-14).
다른 관심 핵산:
한 실시양태에서, 본 발명의 종양용해성 바이러스는 하기를 포함하나 이에 제한되지는 않는 적어도 하나의 관심 핵산을 추가로 포함할 수 있다:
- 엔도뉴클레아제, 예컨대 제한 효소 (예를 들어 유형 I, II, III, IV 또는 V의 제한 효소, 인공 제한 효소 예컨대 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN) 또는 아연 핑거 뉴클레아제), CRISPR/Cas9를 코딩하는 핵산;
- 표적-특이적 miRNA, shRNA, siRNA를 포함하나 이에 제한되지는 않는 RNA.
관심 핵산 서열은 클로닝에 의해, PCR에 의해 또는 화학적 합성에 의해 통상적인 기술을 사용하여 용이하게 수득될 수 있다. 더욱이, 그의 서열은 관련 기술분야의 통상의 기술자가 참고할 수 있는 문헌에 광범위하게 기재되어 있다. CDAse-코딩 핵산 분자에 관해서는, 관심 핵산(들)은 바이러스 게놈의 임의의 위치에, 특별히 바람직하게는 비-필수 로커스에 삽입될 수 있다. 예를 들어, TK 유전자, RR 유전자 또는 유전자간 구역은 종양용해성 백시니아 바이러스에의 삽입에 특히 적절하다.
CDAse-코딩 핵산 분자 및 관심 핵산(들)의 발현
이전에 언급된 바와 같은 본 발명의 종양용해성 바이러스의 게놈에 삽입될 CDAse-코딩 핵산 분자(들) 및/또는 관심 핵산(들)은 특정한 숙주 세포 또는 대상체에서 높은 수준 발현을 제공하도록 최적화될 수 있다. 유기체의 코돈 용법 패턴이 고도로 비-무작위이고 코돈의 사용이 상이한 숙주 사이에 현저하게 상이할 수 있다는 것이 실제로 관찰된 바 있다. 이러한 핵산(들)은 박테리아 또는 하등 진핵생물 기원으로부터의 것일 수 있으므로, 이들은 고등 진핵 세포 (예를 들어 인간)에서의 효율적인 발현에 대한 부적절한 코돈 용법 패턴을 가질 수 있다. 전형적으로, 코돈 최적화는 관심 숙주 유기체에서 드물게 사용되는 코돈에 상응하는 하나 이상의 "천연" (예를 들어 박테리아 또는 효모) 코돈을 보다 빈번하게 사용되는 동일한 아미노산을 코딩하는 하나 이상의 코돈으로 대체함으로써 수행된다. 심지어 부분적인 치환으로도 증가된 발현이 달성될 수 있으므로 드물게 사용되는 코돈에 상응하는 모든 천연 코돈을 대체할 필요는 없다.
코돈 용법의 최적화에 추가하여, 숙주 세포 또는 대상체에서의 발현은 핵산 서열의 추가적인 변형을 통해 추가로 개선될 수 있다. 예를 들어, 집중된 영역에 존재하는 희귀한 비-최적 코돈의 클러스터링을 방지하는 것 및/또는 발현 수준에 네가티브하게 영향을 미칠 것으로 예상되는 "네가티브" 서열 요소를 저해 또는 변형시키는 것이 유리할 수 있다. 이러한 네가티브 서열 요소는 제한 없이 매우 높은 (>80%) 또는 매우 낮은 (<30%) GC 함량을 갖는 영역; AT-풍부 또는 GC-풍부 서열 스트레치; 불안정한 동향 또는 역위 반복 서열; 및/또는 내부 잠재 조절 요소 예컨대 내부 TATA-박스, chi-부위, 리보솜 엔트리 부위, 및/또는 스플라이싱 공여자/수용자 부위를 포함한다.
본 발명에 따르면, 종양용해성 바이러스는 관심 핵산(들)의 발현에 필요한 요소를 포함한다. 보다 정확히, 본 발명의 종양용해성 바이러스의 게놈에 삽입된 CDAse-코딩 핵산 분자(들) 및/또는 관심 핵산(들)은 숙주 세포 또는 대상체에서의 그의 발현에 적합한 조절 요소에 작동가능하게 연결된다. 본원에 사용된 용어 "조절 요소" 또는 "조절 서열"은 주어진 숙주 세포 또는 대상체에서의 발현을 허용하거나, 그에 기여하거나 또는 그를 조정하는 임의의 서열을 지칭하며, 이는 핵산(들) 또는 그의 유도체 (즉, mRNA)의 복제, 복사, 전사, 스플라이싱, 번역, 안정성 및/또는 수송을 포함한다. 본원에 사용된 "작동가능하게 연결된"은, 연결되는 요소가 그의 의도된 목적을 위해 협동하여 기능하도록 배열되는 것을 의미한다. 예를 들어, 프로모터가 허용 숙주 세포에서 핵산 분자의 전사 개시로부터 종결인자까지의 전사를 수행하는 경우에 프로모터는 상기 핵산 분자에 작동가능하게 연결된다.
관련 기술분야의 통상의 기술자라면 조절 서열의 선택이 핵산 분자 그 자체, 그가 삽입되는 바이러스, 숙주 세포 또는 대상체, 원하는 발현 수준 등과 같은 인자에 따를 수 있다는 것으로 인지할 것이다. 프로모터는 특별히 중요한 것이다. 본 발명의 맥락에서, 이는 많은 유형의 숙주 세포에서의 코딩된 산물 (예를 들어 CDAse 및 치료 분자)의 발현을 지시하는 구성적 프로모터 또는 특정 숙주 세포에 특이적인 프로모터 (예를 들어 간-특이적 조절 서열) 또는 특이적 이벤트 또는 외인성 인자 (예를 들어 온도, 영양 첨가제, 호르몬 등에 의해)에 반응하여 또는 바이러스 사이클의 단계 (예를 들어 말기 또는 초기)에 따라 조절된 프로모터일 수 있다. 바이러스 생산을 최적화하고 발현된 폴리펩티드(들)의 잠재적 독성을 피하기 위해, 특이적 이벤트 또는 외인성 인자에 반응하여 생산 단계 동안 저해되는 프로모터를 또한 사용할 수 있다.
하지만 시토메갈로바이러스 (CMV) 극초기 프로모터 (US 5,168,062), RSV 프로모터, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 포스포글리세로 키나제 (PGK) 프로모터 (Adra et al., 1987, Gene 60: 65-74), 단순 헤르페스 바이러스 (HSV)-1의 티미딘 키나제 (TK) 프로모터 및 T7 폴리머라제 프로모터 (WO98/10088)와 같은 통상적인 프로모터가 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있다. 백시니아 바이러스 프로모터는 특히 종양용해성 폭스바이러스에서의 발현에 적합화된다. 대표적인 예는 제한 없이 백시니아 7.5K, H5R, 11K7.5 (Erbs et al., 2008, Cancer Gene Ther. 15(1): 18-28), TK, p28, p11 Pr13.5 (WO2014/063832), pB8R, pF11L, pA44L, pC11R (WO2011/128704) 및 K1L 프로모터, 뿐만 아니라 합성 프로모터 예컨대 문헌 [Chakrabarti et al., 1997, Biotechniques, 23: 1094-7; Hammond et al., 1997, J. Virol. Methods, 66: 135-8; 및 Kumar and Boyle, 1990, Virology, 179: 151-8]에 기재된 것들 뿐만 아니라 초기/말기 키메라 프로모터 (예를 들어 US 8,394,385; US 8,772,023)를 포함한다. 또한 우두 프로모터가 역시 적합하다 (예를 들어 ATI 프로모터). 바람직한 실시양태에서, CDAse 핵산 분자는 본 발명의 종양용해성 바이러스의 TK 로커스에 삽입되고, 백시니아 p11.5K 프로모터의 제어 하에 배치된다.
관련 기술분야의 통상의 기술자라면 핵산 발현을 제어하는 조절 요소가 전사의 적절한 개시, 조절 및/또는 종결 (예를 들어 전사 종결 서열), mRNA 수송 (예를 들어 핵 국소화 신호 서열), 프로세싱 (예를 들어 스플라이싱 신호), 및 안정성 (예를 들어 인트론 및 비-코딩 5' 및 3' 서열), 번역 (예를 들어 개시인자 Met, 3부분 리더 서열, IRES 리보솜 결합 부위, 신호 펩티드 등)을 위한 추가적인 요소, 표적화 서열, 수송 서열, 분비 신호, 및 복제 및 통합에 수반되는 서열을 추가로 포함할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 상기 서열은 문헌에 보고되어 있고 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 수득될 수 있다.
종양용해성 바이러스를 제조하는 방법
본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는, 본 발명의 종양용해성 바이러스를 제조하는 방법에 관한 것이다:
(i) 본 발명의 종양용해성 바이러스를 생산자 세포 내로 도입하는 단계,
(ii) 상기 생산자 세포를 상기 종양용해성 바이러스가 생산될 수 있도록 하기에 적절한 조건 하에 배양하는 단계, 및
(iii) 상기 종양용해성 바이러스를 세포 배양물로부터 회수하는 단계.
전형적으로, 본 발명의 종양용해성 바이러스는 형질감염된 또는 감염된 숙주 세포를 감염성 바이러스 입자의 생산을 허용하도록 하는 적합한 조건 하에 배양하는 것 및 생산된 감염성 바이러스 입자를 상기 세포의 배양물로부터 회수하는 것 및 임의로, 상기 회수된 감염성 바이러스 입자를 정제하는 것을 포함한 통상적인 기술을 사용하여 적합한 숙주 세포주 내에 생산된다. 종양용해성 바이러스의 생산에 적합한 숙주 세포는 제한 없이 인간 세포주 예컨대 HeLa (ATCC), 293 세포 (Graham et al., 1997, J. Gen. Virol. 36: 59-72), HER96, PER-C6 (Fallaux et al., 1998, Human Gene Ther. 9: 1909-17), 원숭이 세포 예컨대 Vero (ATCC CCL-081), CV1 (ATCC CCL-70) 및 BSC1 (ATCC CCL-26) 세포주, 조류 세포 예컨대 WO2005/042728, WO2006/108846, WO2008/129058, WO2010/130756, WO2012/001075 등에 기재된 것들), 햄스터 세포주 예컨대 BHK-21 (ATCC CCL-10) 뿐만 아니라 수정란으로부터 수득된 닭 배아로부터 제조된 1차 닭 배아 섬유모세포 (CEF)를 포함한다. 숙주 세포는 바람직하게는 동물 또는 인간 기원의 산물의 부재 하에 화학적으로 정의된 배지를 사용하여, 동물- 또는 인간-유래 산물이 없는 배지에서 배양된다. 배양은 생산자 세포에 적절한 온도, pH 및 산소 함량에서 수행된다. 이러한 배양 조건은 관련 기술분야의 통상의 기술자의 전문 지식 내에 있다. 성장 인자가 존재하는 경우에, 이들은 바람직하게는 재조합적으로 생산되고 동물 재료로부터 정제되지 않는다. 적합한 동물-무함유 배지 매질, 예를 들어 CEF 생산자 세포를 배양하기 위한 VP-SFM 배지가 상업적으로 입수가능하다. 생산자 세포는 바람직하게는 +30℃ 내지 +38℃에 포함된 온도에서 (보다 바람직하게는 약 +37℃에서) 감염 전 1 내지 8일 동안 (바람직하게는 CEF의 경우에 1 내지 5일 및 불멸화 세포의 경우에 2 내지 7일 동안) 배양된다. 필요한 경우에, 1 내지 8일의 여러 계대가 세포의 총 수를 증가시키기 위해 이루어질 수 있다.
생산자 세포는 종양용해성 바이러스에 의해 적절한 감염 다중도 (MOI)로 감염되며, 이는 생산적 감염을 허용하도록 0.001 (보다 바람직하게는 0.05 내지 5)만큼 낮을 수 있다.
단계 ii)에서, 감염된 생산자 세포는 이어서 자손 바이러스 벡터가 생산될 때까지 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 알려진 적절한 조건 하에 배양된다. 감염된 생산자 세포의 배양은 또한 바람직하게는 +30℃ 내지 +37℃의 온도에서 1 내지 5일 동안 동물- 또는 인간-유래 산물이 없는 화학적으로 정의된 배지 (이는 생산자 세포의 배양 및/또는 감염 단계에 사용된 배지와 동일하거나 또는 상이할 수 있음)에서 수행된다.
단계 iii)에서, 바이러스 입자는 배양물 상청액 및/또는 생산자 세포로부터 수집될 수 있다. 생산자 세포로부터의 (및 임의로 또한 배양물 상청액으로부터의) 회수는, 생산자 세포 막의 붕괴를 허용하여 생산자 세포로부터의 바이러스의 유리를 허용하는 단계를 요구할 수 있다. 생산자 세포 막의 붕괴는 동결/해동, 저장성 용해, 초음파처리, 마이크로유동화, 또는 고속 균질화를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 알려진 다양한 기술에 의해 유도될 수 있다.
회수된 종양용해성 바이러스는 본 발명에 따라 사용되기 전에 적어도 부분적으로 정제될 수 있다. 정화, 효소적 처리 (예를 들어 엔도뉴클레아제 예컨대 벤조나제, 프로테아제), 초원심분리 (예를 들어 수크로스 구배 또는 염화세슘 구배), 크로마토그래피 및 여과 단계를 포함한 다양한 정제 단계가 구상될 수 있다. 적절한 방법은 관련 기술분야에 기재되어 있다 (예를 들어 WO2007/147528; WO2008/138533, WO2009/100521, WO2010/130753, WO2013/022764).
종양용해성 바이러스 조성물
본 발명은 또한 본 발명의 종양용해성 바이러스의 치료 유효량을 포함하거나 또는 본원에 기재된 방법에 따라 제조된 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, 조성물은 제약상 허용되는 비히클을 추가로 포함한다.
"치료 유효량"은 하나 이상의 유익한 결과를 생성하기에 충분한 본 발명의 조성물에 포함되는 각 활성제의 양에 상응한다. 이러한 치료 유효량은 다양한 파라미터, 예를 들어 투여 방식; 질환 상태; 대상체의 연령 및 체중; 치료에 반응하는 대상체의 능력; 공동 치료의 종류; 치료 빈도; 및/또는 예방 또는 요법에 대한 필요의 함수로서 달라질 수 있다. 예방적 용도를 고려할 때, 본 발명의 조성물은, 특히 위험이 있는 대상체에서, 병리학적 상태 (예를 들어 증식성 질환 예컨대 암)의 발병 및/또는 확립 및/또는 재발을 예방하거나 또는 지연시키기에 충분한 용량으로 투여된다. "치료적" 용도를 위해, 본 발명의 조성물은, 임의로 하나 이상의 통상적인 치료 양식과 함께, 질환 치료의 목적으로 병리학적 상태 (예를 들어 증식성 질환 예컨대 암)를 갖는 것으로 진단된 대상체에게 투여된다. 특히, 치료 유효량은, 이하에 기재된 바와 같이, 기저 스테이터스에 비해 또는 치료되지 않은 경우에 예상된 스테이터스에 비해 임상적 스테이터스의 관찰가능한 개선을 야기하는데 필요한 양일 수 있다. 임상적 스테이터스의 개선은 의사 및 숙련된 건강관리 스태프에 의해 전형적으로 사용되는 임의의 관련 임상적 측정법에 의해 용이하게 평가될 수 있다. 예를 들어, 실험실에서 상용적으로 사용되는 기술 (예를 들어 유동 세포측정법, 조직학, 영상화 기술 등)이 종양 감시를 수행하는데 사용될 수 있다. 치료 유효량은 또한 효과적인 비-특이적 (선천성) 및/또는 특이적 항종양 반응의 발생을 야기하는데 필요한 양일 수 있다. 전형적으로, 특정한 T 세포 반응에서의 면역 반응의 발생은 시험관내에서, 적합한 동물 모델에서 또는 대상체로부터 수집된 생물학적 샘플을 사용하여 평가될 수 있다. 또한 치료된 대상체에 존재하는 항종양 반응에 수반되는 상이한 면역 세포 집단, 예컨대 세포독성 T 세포, 활성화 세포독성 T 세포, 자연 킬러 세포 및 활성화 자연 킬러 세포를 확인하도록 다양한 입수가능한 항체를 사용할 수 있다.
종양용해성 바이러스의 적절한 투여량은 다양한 파라미터의 함수로서 적합화될 수 있고, 관련 상황에 비추어 진료의에 의해 상용적으로 결정될 수 있다. 적합하게는, 종양용해성 바이러스에 대한 개별 용량은 사용되는 바이러스 및 정량적 기술에 따라 대략 103에서 대략 1012 vp (바이러스 입자), iu (감염 단위) 또는 PFU (플라크-형성 단위)까지 연장되는 범위 내에서 달라질 수 있다. 예시적 목적상, 인간 사용을 위한 종양용해성 백시니아 바이러스의 적합한 용량은 대략 104 내지 대략 1011 PFU, 바람직하게는 대략 105 PFU 내지 대략 1010 PFU에 포함되며; 대략 106 PFU 내지 대략 5x109 PFU 용량이 특히 바람직하다 (예를 들어 106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108, 109, 2x109, 3x109, 4x109 또는 5x109 PFU 용량). 샘플에 존재하는 바이러스의 수량은 상용 적정 기술에 의해, 예를 들어 허용 세포 (예를 들어 BHK-21 또는 CEF)의 감염 후 플라크의 수를 카운팅함으로써, 면역염색 (예를 들어 항-바이러스 항체를 사용함; 문헌 [Caroll et al., 1997, Virology 238: 198-211])에 의해, A260 흡광도 (vp 역가)를 측정함으로써, 또는 또한 정량적 면역형광 (iu 역가)에 의해 결정될 수 있다.
용어 "제약상 허용되는 비히클"은 포유동물 및 특히 인간 대상체에서의 투여와 상용성인 임의의 및 모든 담체, 용매, 희석제, 부형제, 아주반트, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 흡수제 등을 포함하는 것으로 의도된다.
본 발명의 종양용해성 바이러스는 독립적으로 인간 또는 동물 사용에 적절한 용매 또는 희석제에 배치될 수 있다. 용매 또는 희석제는 바람직하게는 등장성, 저장성 또는 약하게 고장성이고, 상대적으로 낮은 이온 강도를 갖는다. 대표적인 예는 멸균수, 생리 염수 (예를 들어 염화나트륨), 링거액, 글루코스, 트레할로스 또는 사카로스 용액, 행크 용액, 및 다른 수성 생리학상 평형 염 용액을 포함한다 (예를 들어 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, A. Gennaro, Lippincott, Williams&Wilkins]의 가장 최근 판 참조).
다른 실시양태에서, 종양용해성 바이러스는 인간 사용을 위해 적합하게 완충된다. 적합한 완충제는 제한 없이 포스페이트 완충제 (예를 들어 PBS), 생리학적 또는 다소 염기성 pH (예를 들어 대략 pH 7 내지 대략 pH 9)를 유지할 수 있는 비카르보네이트 완충제 및/또는 트리스 완충제를 포함한다.
본 발명의 조성물은 또한 예를 들어 제제의 오스몰농도, 점도, 선명도, 컬러, 멸균성, 안정성, 용해 속도를 포함한 바람직한 제약적 또는 약동학적 특성을 제공하기 위해, 인간 또는 동물 대상체 내로의 방출 또는 흡수를 변형 또는 유지하기 위해, 혈액 장벽을 가로지른 수송 또는 특정한 기관에의 침투를 촉진하기 위해 다른 제약상 허용되는 부형제를 함유할 수 있다.
추가 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 투여 시 추가로 면역 (특히 T 세포-매개 면역)을 증진시키거나 또는 종양 세포의 감염을 용이하게 하기 위해 아주반트첨가될 수 있다. 적합한 아주반트의 대표적인 예는, 제한 없이, 명반, 미네랄 오일 에멀젼 예컨대, 프로인트 완전 및 불완전 (IFA), 리포폴리사카라이드 또는 그의 유도체 (Ribi et al., 1986, Plenum Publ. Corp.,407-419), 사포닌 예컨대 QS21 (Sumino et al., 1998, J.Virol. 72: 4931; WO98/56415), 이미다조-퀴놀린 화합물 예컨대 이미퀴모드 (Suader, 2000, J. Am Acad Dermatol. 43:S6), S-27609 (Smorlesi, 2005, Gene Ther. 12: 1324) 및 관련 화합물 예컨대 WO2007/147529에 기재된 것들, 폴리사카라이드 예컨대 아주박스 및 스쿠알렌, 수중유 에멀젼 예컨대 MF59, 이중-가닥 RNA 유사체 예컨대 폴리(I:C), 단일 가닥 시토신 포스페이트 구아노신 올리고데옥시뉴클레오티드 (CpG) (Chu et al., 1997, J. Exp. Med., 186: 1623; Tritel et al., 2003, J. Immunol., 171: 2358) 및 양이온성 펩티드 예컨대 IC-31 (Kritsch et al., 2005, J. Chromatogr. Anal. Technol. Biomed. Life Sci., 822: 263-70)을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 그의 안정성을 개선시키기 위한 목적으로, 특히 제조 및 장기 저장 (즉 적어도 6개월 동안, 바람직하게는 적어도 2년 동안)의 조건 하에 동결 (예를 들어 -70℃, -20℃), 냉각 (예를 들어 4℃) 또는 주위 온도에서 제제화될 수 있다. 다양한 바이러스 제제가 동결된, 액체 형태 또는 동결건조된 형태로 관련 기술분야에서 입수가능하다 (예를 들어 WO98/02522, WO01/66137, WO03/053463, WO2007/056847 및 WO2008/114021 등). 고체 (예를 들어 건조분말된 또는 동결건조된) 조성물은 진공 건조 및 동결-건조를 수반하는 공정에 의해 수득될 수 있다. 예시적 목적상, NaCl 및/또는 당을 포함하는 완충된 제제는 특히 바이러스의 보존에 적합화된다 (예를 들어 사카로스 5 % (W/V)를 함유하는 트리스 10 mM pH 8, 나트륨 글루타메이트 10 mM, 및 NaCl 50 mM 또는 글리세롤 (10%) 및 NaCl을 함유하는 포스페이트-완충 염수).
종양용해성 바이러스 조성물은 바람직하게는 생체내에서의 적절한 분포 및 방출을 보증하기 위한 투여 방식에 적합화된 방식으로 제제화된다. 예를 들어, 경구 투여를 위한 위-내성 캡슐 및 과립, 임의로 점막의 공극 크기를 증가시키는데 유용한 흡수 증진제와 조합된, 직장 또는 질 투여를 위한 좌제가 특히 적절하다. 이러한 흡수 증진제는 전형적으로 점막의 인지질 도메인에 대한 구조적 유사성을 갖는 물질이다 (예컨대 데옥시콜산나트륨, 글리코콜산나트륨, 디메틸-베타-시클로덱스트린, 라우릴-1-리소포스파티딜콜린). 또 다른 및 특히 적절한 예는 미세바늘 수단을 통한 투여에 적합화된 제제 (예를 들어 경피 또는 피내 패치)이다. 이러한 제제는 내독소-무함유 포스페이트-완충 염수 (PBS) 중 면역요법제 산물의 재현탁액을 포함할 수 있다.
투여
본 발명의 종양용해성 바이러스, 또는 조성물은, 단일 용량 또는 다중 용량으로 투여될 수 있다. 다중 용량이 고려되면, 투여는 동일하거나 상이한 경로에 의해 수행될 수 있고, 동일한 부위에서 또는 대안적 부위에서 일어날 수 있다. 각 투여 사이의 간격은 수시간 내지 8주 (예를 들어 24시간, 48시간, 72시간, 매주, 2 또는 3주마다, 매월 등)일 수 있다. 간격은 또한 불규칙할 수 있다. 또한 휴지 기간 후 반복된 투여의 순차적 사이클 (예를 들어 3 내지 6회 매주 투여 이어서 3 내지 6주의 휴지 기간의 사이클)을 통해 진행될 가능성이 있다. 용량은 상기 기재된 범위 내에서 각 투여 동안 달라질 수 있다.
비경구, 국소 또는 점막 경로를 포함한 임의의 통상적인 투여 경로가 본 발명의 맥락에서 적용가능하다. 비경구 경로는 주사 또는 주입으로서 투여를 위해 의도되고, 전신 뿐만 아니라 국부 경로를 포괄한다. 통상의 비경구 주사 유형은 정맥내 (정맥에), 동맥내 (동맥에), 피내 (진피에), 피하 (피부 아래에), 근육내 (근육에) 및 종양내 (종양에 또는 그의 근접부에)이다. 주입은 전형적으로 정맥내 경로에 의해 주어진다. 국소 투여는 경피 수단 (예를 들어 패치 등)을 사용하여 수행될 수 있다. 점막 투여는 제한 없이 경구/소화관, 비강내, 기관내, 폐내, 질내 또는 직장내 경로를 포함한다. 비강내, 폐내 및 기관내 경로의 경우에, 에어로졸에 의하여 또는 점적주입에 의하여 일어나는 투여가 유리하다. 본 발명의 종양용해성 바이러스를 위한 바람직한 투여 경로는 정맥내 및 종양내 경로를 포함한다.
투여는 통상적인 시린지 및 바늘 (예를 들어 콰드라퓨즈 주사 바늘) 또는 대상체에서의 활성제(들)의 전달을 용이하게 하거나 또는 개선시킬 수 있는 관련 기술분야에서 입수가능한 임의의 화합물 또는 장치를 사용할 수 있다. 예를 들어, 고체, 중공, 코팅된 또는 용해성 미세바늘을 사용한 경피 시스템이 또한 적절하고 (예를 들어, 문헌 [Van der Maaden et al., 2012, J. Control release 161: 645-55] 참조), 실리콘 및 수크로스 미세바늘 패치가 바람직하다 (예를 들어, 문헌 [Carrey et al., 2014, Sci Rep 4: 6154 doi 10.1038; 및 Carrey et al., 2011, PLoS ONE, 6(7) e22442] 참조).
특히 바람직한 조성물은 정맥내 또는 종양내 투여를 위해 제제화된, CDAse-코딩 핵산 분자를 포함하는 종양용해성 바이러스, 바람직하게는 J2R 로커스가 결손된 (TK-), I4L 및/또는 F4L 로커스가 결손된 (RR-) 또는 J2R 로커스 (TK-) 및 I4L/ F4L 로커스 둘 다가 결손된 (TK- RR-) 종양용해성 백시니아 바이러스, 특별히 바람직하게는 TK 로커스 대신에 삽입되고 p11.5K 프로모터 하에 배치된 CDAse 핵산 분자를 갖는 백시니아 예컨대 본원에 기재된 VVTK-RR-/CDD1 또는 VVTK-RR-/hCD 106 PFU 내지 5x109 PFU를 포함한다.
방법 및 용도
또 다른 측면에서, 본 발명은 질환 또는 병리학적 상태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병리학적 상태를 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 종양용해성 바이러스 또는 그의 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 질환 또는 병리학적 상태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병리학적 상태를 치료 또는 예방하기에 충분한 양으로 종양용해성 바이러스 또는 그의 조성물을 투여하는 것을 포함하는 치료 방법에 관한 것이다.
"질환" (및 질환의 임의의 형태 예컨대 "장애" 또는 "병리학적 상태")은 전형적으로 확인가능한 증상을 특징으로 한다.
본 발명의 종양용해성 바이러스 또는 그의 조성물을 사용하여 예방 또는 치료될 수 있는 질환의 예는 증식성 질환 예컨대 암, 종양 또는 재협착, 및 증가된 파골세포 활성와 연관된 질환 예컨대 류마티스 관절염 및 골다공증을 포함한다.
본 발명은 암, 및 특히 부신피질 암종, 부신피질암, 항문암, 위장 카르시노이드 종양 (예를 들어 충수암 및 카르시노이드 종양), 담관암 (예를 들어 담관암종), 방광암, 골암 (예를 들어 유잉 육종, 골의 악성 섬유성 조직구종 및 골육종), 뇌 종양 (예를 들어 성상세포종, 배아성 종양, 배세포 종양, 중추 신경계 비정형 기형종/횡문근양 종양, 두개인두종, 상의세포종, 신경교종 및 교모세포종), 유방암 (예를 들어 관 상피내 암종), 기관지 종양, 원인불명 원발성 암종, 강심성 (심장) 종양, 자궁경부암, 척삭종, 만성 골수증식성 신생물, 결장직장암 (예를 들어 직장암), 감각신경모세포종, 두개외 배세포 종양, 생식선외 배세포 종양, 망막모세포종, 담낭암, 위장 카르시노이드 종양, 고환암, 임신성 영양막 질환, 결구 및 경부암 (예를 들어 하인두암, 인두암, 후두암, 구순 및 구강암, 잠재성 원발성인 전이성 편평 경부암, 구강암, 비강 및 부비동 암, 비인두암, 타액선암, 인후암, 식도암), 간세포성암 (간암), 조직구증, 랑게르한스 세포, 신장암 (예를 들어 윌름스 종양, 신세포암, 신우 및 요관의 이행 세포암), 랑게르한스 세포 조직구증, 후두암 및 유두종증, 백혈병 (예를 들어 모발상 세포 백혈병, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 만성 골수 백혈병 (CML), 급성 골수성 백혈병 (AML), 급성 림프모구성 백혈병 (ALL)), 간암, 폐암 (소세포 폐암 및 비소세포 폐암), 림프종 (예를 들어 AIDS-관련 림프종, 원발성 CNS 림프종, 피부 T-세포 림프종, 호지킨 림프종, 버킷 림프종, 원발성 림프종, 균상 식육종, 비-호지킨 림프종, 마크로글로불린혈증, 발덴스트룀, 원발성 중추 신경계 (CNS) 림프종, 세자리 증후군, T-세포 림프종), 안내 흑색종, 중피종, NUT 유전자를 수반하는 정중선 관 암종, 다발성 내분비 신생물 증후군, 다발성 골수종/형질 세포 신생물 골수이형성 증후군, 만성 골수증식성 신생물, 신경모세포종, 난소암 (예를 들어 원발성 복막암 및 난관암), 췌장암 및 췌장 신경내분비 종양 (도세포 종양), 유두종증, 부신경절종, 부갑상선암, 음경암, 크롬친화세포종, 뇌하수체 종양, 형질 세포 신생물/다발성 골수종, 흉막폐 모세포종, 전립선암, 망막모세포종, 혈관 종양, 피부암 (예를 들어 기저 세포 암종, 흑색종, 편평 세포 암종 및 메르켈 세포 암종), 소장암, 연부 조직 육종 (예를 들어 위장 기질 종양 (GIST), AIDS-관련 암 카포시 육종, 카포시 육종 및 횡문근육종), 위암 (위장암), 고환암, 흉선종 및 흉선 암종, 갑상선암, 요도암, 자궁암, 자궁내막 및 자궁 육종, 질암 및 외음부암을 치료 또는 예방하기에 특히 적합하다. 본 발명은 또한 전이성 암의 치료에 유용하다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 종양용해성 바이러스 또는 조성물은 식도, 담낭, 간, 췌장, 위, 소장, 장 (대장 또는 결장 및 직장) 및 항문의 암을 포함한 위장관암을 치료하는데 사용된다. 특히 바람직한 방법은 매주 내지 매월 간격으로 주어진 본 발명의 종양용해성 바이러스 또는 그의 조성물의 1 내지 6회 정맥내 또는 종양내 투여, 특별히 바람직하게는 그의 게놈에 삽입된 CDAse-코딩 핵산 분자 (예를 들어 p11.5K 프로모터 하에 배치됨)를 포함하는 종양용해성 백시니아 바이러스, 바람직하게는 J2R 로커스가 결손된 (TK-), I4L 및/또는 F4L 로커스가 결손된 (RR-) 또는 J2R 로커스 (TK-) 및 I4L/ F4L 로커스 둘 다가 결손된 (TK- RR-) 종양용해성 백시니아 바이러스, 예컨대 VVTK-RR-/CDD1 또는 VVTK-RR-/hCD 106-5x109 PFU를 포함하는 조성물의 3회 격주 투여 (예를 들어 대략 D1, D14 및 D29에)를 포함한다.
본 발명의 방법에 의해 제공된 유익한 효과는 기저 스테이터스에 비해 또는 본원에 기재된 양식에 따라 치료되지 않은 경우에 예상된 스테이터스에 비해 임상적 스테이터스의 관찰가능한 개선에 의해 입증될 수 있다. 임상적 스테이터스의 개선은 의사 및 숙련된 건강관리 스태프에 의해 전형적으로 사용된 임의의 관련 임상적 측정법에 의해 용이하게 평가될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 치료 이익은 일시적일 수 있거나 (투여의 중지 후 1개월 또는 몇개월 동안) 또는 지속될 수 있다 (수개월 또는 수년 동안). 임상적 스테이터스의 자연 경과가 한 대상체에서 또 다른 대상체까지 상당히 다를 수 있으므로, 치료 이익이 치료된 각 대상체에서 관찰되지만 유의한 수의 대상체에서 관찰될 필요는 없다 (예를 들어 두 그룹 간의 통계적으로 유의한 차이는 터키 파라미터 검정, 크루스칼-왈리스 검정, 만 및 휘트니에 따른 U 검정, 스튜던트 t-검정, 윌콕슨 검정 등과 같은 관련 기술분야에 알려진 임의의 통계 검정에 의해 결정될 수 있음).
특정한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 암을 치료하기에 특히 적절하므로, 이러한 방법은 하기 중 하나 이상과 상관관계가 있을 수 있다: 본 발명에 따라 치료된 대상체에서 종양 성장, 증식 및 전이를 억제 또는 둔화시키는 것, 종양 침습 (이웃 조직에서의 종양 세포의 확산)을 방지 또는 지연시키는 것, 종양 수를 감소시키는 것; 종양 크기를 감소시키는 것, 전이의 수 또는 정도를 감소시키는 것, 연장된 전체 생존률 (OS)을 제공하는 것, 무진행 생존 (PFS)을 증가시키는 것, 완화의 길이를 증가시키는 것, 질환의 상태를 안정화시키는 것 (즉 악화시키지 않는 것), 표준 치료에 대한 더 우수한 반응을 제공하는 것, 삶의 질을 개선시키는 것 및/또는 항종양 반응 (예를 들어 비-특이적 (선천성) 및/또는 특이적 예컨대 세포독성 T 세포 반응)을 유도하는 것.
임상적 이익을 평가하는데 사용될 수 있는 적절한 측정법 예컨대 혈액 검사, 생물학적 유체 및 생검의 분석 뿐만 아니라 의학적 영상화 기술은 의료 실험실 및 병원에서 상용적으로 평가되고, 많은 수의 키트가 상업적으로 입수가능하다. 이들은 투여 전에 (기저) 및 치료 동안 및 치료의 중단 후 다양한 시점에서 수행될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 또는 본원에 기재된 방법에 따라 제조된 종양용해성 바이러스 또는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 병리학적 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병리학적 상태를 치료하는 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 상기 질환은 증식성 질환 예컨대 암, 종양 및 재협착이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 질환은 증가된 파골세포 활성과 연관된 질환 예컨대 류마티스 관절염 및 골다공증이다. 보다 정확히, 본 발명은 종양의 성장을 억제하도록 종양 세포 성장의 억제를 필요로 하는 대상체에게 종양용해성 바이러스 또는 그의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 생체내 종양 세포 성장을 억제하는 방법에 관한 것이다. 일반적 지침을 위해, 종양 세포 성장의 억제는 상용적으로, 예를 들어 방사선촬영 수단에 의해 평가될 수 있다. 종양용해성 바이러스 또는 그의 조성물의 투여(들)는 바람직하게는 종양 질량의 적어도 10% 저하를 초래한다.
조합 요법
본 발명에 따른 임의의 방법에서, 종양용해성 바이러스 또는 조성물은 표적화된 질환 또는 병리학적 상태를 치료 또는 예방하기 위해 이용가능한 임의의 통상적인 치료 양식과 함께 투여될 수 있다. 통상적인 요법의 대표적인 예는, 제한 없이, 수술, 방사선요법, 화학요법, 동결요법, 호르몬 요법, 독소 요법, 면역요법, 시토카인 요법, 이식 (예를 들어 줄기 세포), 고온요법 및 광역학 요법을 포함한다. 이러한 통상적인 요법은 종양용해성 바이러스 또는 그의 조성물 전에, 그 후에, 그와 본질적으로 동시에 또는 그와 산재된 방식으로 표준 관례에 따라 대상체에게 투여된다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 종양용해성 바이러스, 조성물 또는 방법은 방사선요법과 함께 사용될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 적절한 방사선 요법 프로토콜 및 파라미터를 용이하게 제제화할 수 있다 (예를 들어 문헌 [Perez and Brady, 1992, Principles and Practice of Radiation Oncology, 2nd Ed. JB Lippincott Co] 참조; 해당 분야에서의 통상의 기술자에게 용이하게 명백할 적절한 적합화 및 변형을 사용함). 사용될 수 있는 방사선의 유형은 관련 기술분야에 널리 알려져 있고, 전자 빔, 선형 가속기로부터의 또는 코발트 또는 세슘과 같은 방사선원으로부터의 고에너지 광자, 양성자, 및 중성자를 포함한다. 방사성동위원소에 대한 투여량 범위는 동위원소의 반감기, 방출된 방사선의 강도 및 유형, 및 신생물 세포에 의한 흡수에 따라 진료의에 의해 정의될 수 있다. 연장된 기간 (3 내지 6주) 동안 정규 X-선 용량, 또는 높은 단일 용량이 본 발명에 의해 고려된다.
다른 실시양태에서, 방법은 수술과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 종양용해성 바이러스 또는 그의 조성물은 종양의 절제 시 투여될 수 있다 (예를 들어 절제된 구역 내의 국부 적용에 의함).
본 발명의 임의의 방법의 추가 실시양태에서, 종양용해성 바이러스 또는 그의 조성물은 화학요법 약물 또는 면역요법 산물과 같은, 항암 요법에서 효과적인 하나 이상의 물질과의 조합으로 사용될 수 있다.
구체적 실시양태에서, 본 발명의 종양용해성 바이러스 또는 조성물은 암을 치료하기 위해 현재 사용되는 화학요법 약물과 함께 사용될 수 있다. 임의의 항암 화학요법 약물이 본 발명의 종양용해성 바이러스 또는 그의 조성물과의 조합으로 사용될 수 있을지라도, 보다 구체적으로 알킬화제, 토포이소머라제 I 억제제, 토포이소머라제 II 억제제, 백금 유도체, 티로신 키나제 수용체의 억제제, 항대사물 및 항유사분열제가 언급될 수 있다.
추가 실시양태에서, 본 발명의 종양용해성 바이러스 또는 조성물은 면역요법과 함께, 특히 항신생물성 항체 뿐만 아니라 siRNA 및 안티센스 폴리뉴클레오티드와 함께 사용될 수 있다. 대표적인 예는, 여러 것들 중에서, 면역 체크포인트를 차단하는 모노클로날 항체 (예를 들어 이필리무맙, 트레멜리무맙 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, AMP-224MEDI4736, MPDL3280A, BMS-936559 등), 알파, 베타 또는 감마 인터페론, 인터류킨 (특히 IL-2, IL-6, IL-10 또는 IL-12) 또는 종양 괴사 인자; 세포 표면 수용체의 조절에 영향을 미치는 작용제 예컨대, 예를 들어 표피 성장 인자 수용체를 차단하는 모노클로날 항체 (특히 세툭시맙, 파니투무맙, 잘루투무맙, 니모투주맙, 마투주맙, 트라스투주맙 (헤르셉틴(Herceptin)™), 게피티닙, 에를로티닙, 라파티닙 등) 및 혈관 내피 성장 인자를 차단하는 모노클로날 항체 (특히 베바시주맙 및 라니비주맙)를 포함한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 이러한 면역요법제 산물의 다른 대표적인 예는, 많은 여러 것들 중에서도, 플라스미드 DNA 벡터, 백시니아 바이러스 (예를 들어 코펜하겐, WR, 와이어쓰, MVA 등), 아데노바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 바이러스, 재조합 폴리펩티드이다.
본 발명의 또 다른 측면은 종양용해성 바이러스 (예를 들어 야생형 종양용해성 바이러스, 또는 변형된 유도체 종양용해성 바이러스)와 적어도 하나의 시티딘 데아미나제와의 조합에 관한 것이며, 여기서 상기 시티딘 데아미나제는 종양용해성 바이러스에 의해 코딩되지 않는다. 시티딘 데아미나제는, 예를 들어 DNA 분자 (플라스미드, 비-종양용해성 바이러스 벡터, 코스미드 및 인공 염색체), RNA 분자, 나노입자 등과 같은 또 다른 벡터에 의해 코딩될 수 있다. 시티딘 데아미나제는 또한 그의 폴리펩티드 형태일 수 있다. 폴리펩티드는 임의의 기원, 예를 들어 인간, 인간화, 동물, 곤충, 미생물 또는 키메라의 것일 수 있다. 게다가, 폴리펩티드는 글리코실화 또는 비-글리코실화될 수 있다.
추가 실시양태에서, 종양용해성 바이러스 또는 그의 조성물은 또한 시티딘 데아미나제 활성을 증진시키는 물질 (예를 들어 시티딘 데아미나제의 발현의 인핸서, DNA 메틸화의 억제제, 예컨대 5-아자-dZ)과의 조합으로 사용될 수 있다.
대상체에게는 종양용해성 바이러스 및 추가적인 항암 요법을 순차적으로 또는 산재된 방식으로 제공할 수 있지만 동일한 기간 내의 요법 둘 다의 병용 투여가 또한 고려된다. 치료 과정은 진료의에 의해 상용적으로 결정될 수 있고, 다양한 프로토콜이 본 발명에 포괄된다. 예를 들어, 종양용해성 바이러스의 1 내지 10회 투여 (예를 들어 3 내지 6회 격주 주사)는 추가적인 항암 요법의 1회 또는 다수회 투여 내에 산재될 수 있다 (예를 들어 화학요법은 1주 또는 수주의 하나 이상의 사이클에서 주어질 수 있음). 더욱이, 치료 과정 후에, 항암 치료가 치료 사이클(들)의 반복 전에 투여되지 않는 기간이 있다는 것이 고려된다.
특허, 공개 및 데이터베이스 엔트리의 모든 상기 인용된 개시내용은 그의 전문이 본원에 참조로 구체적으로 포함된다. 본 발명의 다른 특색, 목적, 및 이점은 명세서, 도면 및 청구범위로부터 명백할 것이다. 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 실시양태를 입증하기 위해 포함된다. 그러나, 본 개시내용에 비추어, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명의 취지 및 범주로부터 벗어나지 않으면서 개시된 구체적 실시양태에서 변화가 이루어질 수 있다는 것을 인지하여야 한다.
실시예
물질 & 방법
바이러스 및 세포
본 연구에 사용된 모든 재조합 바이러스는 코펜하겐 균주로부터 유래된 이중 결실된 티미딘 키나제 (J2R) 및 리보뉴클레오티드 리덕타제 (I4L) 백시니아 바이러스이다. VVTK-RR-/GFP는 유전자 마커 GFP (녹색 형광 단백질)를 발현하는 이중 결실된 백시니아 바이러스이다. VVTK-RR-/CDD1은 효모 시티딘 데아미나제 CDD1 유전자를 발현하는 이중 결실된 백시니아 바이러스이다 (Kurtz et al., 1999, Curr. Genet., 36(3):130-6). VVTK-RR-/hCD는 인간 시티딘 데아미나제 CDA cDNA를 발현하는 이중 결실된 백시니아 바이러스이다 (Laliberte et Momparler, 1994, Cancer Res., 54(20):5401-7). VVTK-RR-/APOBEC2는 인간 APOBEC2 유전자를 발현하는 이중 결실된 백시니아 바이러스이다. GFP, CCD1, hCD 및 APOBEC2 유전자는 티미딘 키나제 로커스에 삽입되고 p11K.5 프로모터의 제어 하에 배치된다. 바이러스 구조를 다중 PCR에 의해 확증하였다. 최종 재조합 백시니아 바이러스를 1차 닭 배아 섬유모세포 (CEF)에서 증폭시켰고, 바이러스 스톡을 플라크 검정에 의해 CEF 상에서 적정하였다.
인간 결장암 세포주 LoVo (ATCC CCL-229), MIA PaCa-2 (ATCC CRL-1420) 및 HCT 116 (ATCC CCL-247)을 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC, 메릴랜드 록빌)으로부터 수득하였다. 인간 식도암 세포주 OE-19를 유럽 콜렉션 오브 셀 컬쳐 (ECACC 96071721)로부터 수득하였다. 모든 인간 종양 세포주를 10% 소 태아 혈청 (FCS)으로 보충된 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM)에서 성장시켰다. 1차 닭 배아 섬유모세포 (CEF)를 바이러스 벡터의 재조합, 증폭 및 적정에 사용하였다. CEF 세포를 이전에 습한 대기에서 37℃에서 11 또는 12일 배양된 수정란 (찰스 리버 SPAFAS)으로부터 수득된 닭 배아로부터 제조하였다. 닭 배아를 해부하고, 트립신 2.5% (w/v) 용액으로 처리하였다. CEF 세포를 5% 소 태아 혈청으로 보충된 이글-기반 배지 (MBE)에서 유지하였다.
웨스턴 블롯 분석.
인간 종양 췌장 암종 MIA PaCa-2 세포 및 인간 결장직장 암종 LoVo 세포를 VVTK-RR- 및 VV-TK-RR-/hCD에 의해 0.1의 MOI로 감염시키고, 24시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 용해물 단백질 30 μg을 10% SDS/PAGE 겔 상에서 환원 조건 하에 전개시키고, 니트로셀룰로스 막 상에 옮겼다. 막을 토끼 폴리클로날 항체 인간 hCD (압캠(Abcam))와 함께 인큐베이션하고, 세척하고, 2차 항체 커플링된 양고추냉이 퍼옥시다제 (아머샴(Amersham))와 함께 인큐베이션하였다. 신호 검출을 증진된 화학발광 (아머샴)에 의해 행하였다.
생체내 항종양 활성
암컷 스위스 누드 마우스를 찰스 리버 래보러토리즈(Charles River Laboratories)로부터 수득하였다. 연구에 사용된 동물들은 연령 (6주) 및 체중 (20-23 g)이 균일하였다.
인간 이종이식 종양 모델에서 백시니아 벡터의 치료 활성을 평가하기 위해, 5 x 106개 인간 암 세포 (LoVo, HCT-116 또는 OE-19)를 마우스의 측복부 내에 피하로 (s.c.) 주사하였다. 종양이 70-100 mm3의 직경에 도달하였을 때, 마우스를 맹검 방식으로 무작위화하고 나타낸 벡터로 치료하였다.
확립된 s.c. LoVo 종양을 보유하는 누드 마우스를 나타낸 벡터로 1x107 PFU 용량으로 1회 정맥내로 (꼬리 정맥 주사) 감염시켰다.
확립된 s.c. HCT-116 종양을 보유하는 누드 마우스를 나타낸 벡터로 1x105 PFU 용량으로 1회 정맥내로 (꼬리 정맥 주사) 감염시켰다.
확립된 s.c. OE-19 종양을 보유하는 누드 마우스를 나타낸 벡터로 1x106 PFU 또는 5x105 PFU 용량으로 1회 정맥내로 (꼬리 정맥 주사) 감염시켰다.
종양 크기를 캘리퍼를 사용하여 1주 2회 측정하였다. 종양 부피를 식 (Π/6) (길이 x 폭2)을 사용하여 mm3으로 계산하였다.
액체 크로마토그래피-고해상도 질량 분광측정법 분석
본 연구는 인간 HCT-116 및 LoVo 종양 세포에서의 세포내 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드의 정량화를 위해 "호스피스 시빌 드 리옹(Hospices Civils de Lyon)"에 의해 수행되었다. 분석 방법론 및 샘플의 제조를 위한 방법론은 문헌 [Machon et al., 2015, J. Chromatogr. A.; 1405:116-25 및 Machon et al., 2014, Anal. Bioanal. Chem.; 406(12):2925-41]에 기재되어 있다. 사용된 질량 분광계는 Q 이그젝티브(Exactive)™ 플러스 (써모피셔(ThermoFicher)), 고해상도 및 오비트랩 유형 검출기였다.
T-25 플라스크에 플레이팅된 1.5 x 106개 HCT-116 및 LoVo 세포를 VVTK-RR-/GFP 및 VVTK-RR-/hCD에 의해 0.01의 MOI로 감염시키고, 5% C02의 존재 하에 37℃에서 인큐베이션하였다. HCT-116의 경우에 36시간 후에 및 LoVo의 경우에 60시간 후에, 배양 배지를 제거하고, 세포를 차가운 PBS로 3회 세척한 후에 차가운 메탄올/물 (70/30, v/v) 3 ml를 첨가하였다. 5분 인큐베이션 후, 상청액을 분석할 때까지 -80℃에서 저장하였다.
뉴클레오티드 및 뉴클레오시드 농도를 HCT-116에서 감염후 36시간째 및 LoVo에서 감염후 60시간째 평가하였다. 시티딘 및 우리딘을 정량화하였다.
결과
바이러스 조작
백시니아 바이러스에서의 인간 CDA (hCD) 단백질의 발현을 토끼 폴리클로날 항체 인간 CDA을 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 확증하였다 (도 1). 웨스턴 블롯은 VVTK-RR-/hCD가 MiaPaca-2 및 LoVo 세포 상에서 예상된 16 kDa CDA를 발현했다는 것을 제시한다.
시티딘 데아미나제를 발현하는 VVTK-RR-의 다중 종양 모델에서의 항종양 활성
종양용해성 바이러스로서 기능하는 시티딘 데아미나제를 발현하는 VVTK-RR-의 능력을 인간 암의 상이한 모델에서 검사하였다.
본 발명자들은 먼저 백시니아 바이러스 종양용해에 약하게 허용되는 모델인 결장직장 LoVo 모델에서 GFP를 발현하는 이중 결실된 바이러스 및 CDD1을 발현하는 이중 결실된 바이러스의 종양용해성 활성을 비교하였다. LoVo 종양을 보유하는 마우스에 바이러스 둘 다를 1 x 107 PFU로 i.v. 주사하였다. 도 2에 제시된 바와 같이, VVTK-RR-/GFP의 단일 i.v. 주사는 대조군 (비히클 단독)과 비교하여 종양 성장의 억제를 초래하였다. 더욱이, 시티딘 데아미나제를 발현하는 바이러스의 항종양 활성은 마커 유전자 GFP를 발현하는 바이러스의 항종양 활성에 비해 유의하게 우월하였으며, 이는 효모 시티딘 데아미나제 유전자가 종양용해성 백시니아 바이러스의 치료 효능을 개선시킨다는 것을 나타낸다.
VVTK-RR-/CDD1의 항종양 효능을 추가로 특징화하기 위해, 본 발명자들은 이러한 바이러스의 종양용해성 활성을 VV 종양용해에 보다 감수성인 인간 종양 모델 이종이식편에서 VVTK-RR-/GFP와 비교하여 시험하였다. 바이러스 둘 다를 각각 HCT-116 및 OE-19 모델에 1 x 105 PFU 및 1 x 106 PFU로 1회 i.v. 주사하였다. 도 3 및 도 4에 제시된 바와 같이, 모델 둘 다에서, VVTK-RR-/GFP의 단일 i.v. 주사는 대조군과 비교하여 약한 항종양 효능을 유도하였고, 이러한 효과는 VVTK-RR-/CDD1의 단일 i.v. 주사에 의해 극적으로 증가하였다.
인간 시티딘 데아미나제 유전자를 발현하는 이중 결실된 백시니아 바이러스 (VVTK-RR-/hCD)의 항종양 효과를 또한 OE-19 모델에서 평가하였다. 본 발명자들은 VVTK-RR-/hCD 및 VVTK-RR-/GFP의 단일 i.v. 주사를 5 x 105 PFU로 수행하였다. 도 5에 제시된 바와 같이, 인간 시티딘 데아미나제 유전자를 발현하는 바이러스의 단일 i.v. 주사는 또한 유전자 마커 GFP를 발현하는 바이러스와 비교하여 종양 성장의 강한 억제를 초래하였다.
이들 데이터는 상이한 기원 (효모 및 인간)으로부터의 시티딘 데아미나제가 종양용해성 백시니아 벡터의 항종양 활성을 증가시킨다는 것을 나타내었다.
FCU1을 발현하는 VVTK-RR-의 LoVo 종양 모델에서의 항종양 활성
코딩된 CDAse 효소에 의해 제공된 항종양 활성을 동일한 맥락에서 또 다른 뉴클레오시드 풀 조정제에 의해 제공된 것과 비교하였다. 여기서, 비교를 위해 사용된 산물은 FCU1 유전자를 코딩하는 TK 및 RR 이중 결실된 백시니아 바이러스 (VVTK-RR-FCU1)이다. 소위 FCU1 유전자를 효모 시토신 데아미나제 및 우라실 포스포리보실트랜스퍼라제 서열의 융합으로부터 수득한다. 뉴클레오시드 풀 조정제인 시토신 데아미나제는 5-FC 전구약물의 독성 5-FU로의 변환을 촉매한다. VVTK-RR-FCU1을 LoVo 종양 모델 뿐만 아니라 VVTK-RR- 대조군에서 평가하였다. 도 6에 제시된 바와 같이, 5-FC (전구약물) 투여 없이 VVTK-RR- 또는 VVTK-RR-FCU1 바이러스의 단일 i.v. 주사는 비히클 단독과 비교하여 종양 성장의 유사한 및 약한 억제를 초래하였다. 이는 전구약물 치료 없이, FCU1-코딩된 시토신 데아미나제 및 우라실 포스포리보실트랜스퍼라제 뉴클레오시드 풀 조정제가 적어도 LoVo 종양 모델에서 항종양 효과를 야기하지 않는다는 것을 나타낸다. 대조적으로, 시티딘 데아미나제-발현 백시니아 바이러스는 항종양 보호에 효과적인 어떠한 전구약물 투여도 요구하지 않는다.
APOBEC2를 발현하는 VVTK-RR-의 생체내 항종양 활성
본 발명자들은 결장직장 HCT-116 모델에서 GFP를 발현하는 이중 결실된 바이러스 및 APOBEC2를 발현하는 이중 결실된 바이러스의 종양용해성 활성을 비교하였다. HCT-116 종양을 보유하는 마우스에 바이러스 둘 다를 1 x 105 PFU로 i.v. 주사하였다. 도 7에 제시된 바와 같이, VVTK-RR-/GFP의 단일 i.v. 주사는 대조군 (비히클 단독)과 비교하여 종양 성장의 억제를 초래하였다. 더욱이, APOBEC2를 발현하는 바이러스의 항종양 활성은 마커 유전자 GFP를 발현하는 바이러스의 항종양 활성에 비해 유의하게 우월하였으며, 이는 APOBEC2 유전자가 종양용해성 백시니아 바이러스의 치료 효능을 개선시킨다는 것을 나타낸다.
인간 HCT-116 및 LoVo 종양 세포에서의 세포내 시티딘 및 우리딘의 정량화.
표 1: HCT-116에서의 감염후 36시간째 세포내 뉴클레오시드의 정량화
결과는 내인성 시티딘 또는 우리딘, 및 상응하는 내부 표준 사이의 크로마토그래피 피크 표면 비를 나타낸다. 결과는 1백만개 세포당 표현된다.
이러한 평가는 대조군 또는 비어있는 바이러스 (VVTK-RR-)로 감염된 세포에서, 1.60 내지 1.88에 포함된 비 C/U의 수준이 유사하다는 것을 제시한다. 이에 비해, 시티딘 데아미나제를 코딩하는 바이러스 (VVTK-RR-/hCD)로 감염된 세포는 비 C/U의 비정상적 수준 (0.204)을 제시한다. 이러한 낮은 비는 VVTK-RR-/hCD가 뉴클레오시드 풀 불평형을 유발한다는 것을 나타낸다.
표 2: LoVo에서의 감염후 60시간째 세포내 뉴클레오시드의 정량화
Figure pct00002
결과는 내인성 시티딘 또는 우리딘, 및 상응하는 내부 표준 사이의 크로마토그래피 피크 표면 비를 나타낸다. 결과는 1백만개 세포당 표현된다. 시티딘은 VVTK-RR-/hCD 감염후 36시간째 LoVo 세포에서 검출되지 않았다.
이러한 평가는 대조군 또는 비어있는 바이러스 (VVTK-RR-)로 감염된 세포에서, 2.44 내지 2.67에 포함된 비 C/U의 수준이 유사하다는 것을 제시한다. 이에 비해, 시티딘은 시티딘 데아미나제를 코딩하는 바이러스 (VVTK-RR-/hCD)로 감염된 LoVo 세포에서 검출되지 않았다. 0.02의 검출 한계 (본 실험에서 검출된 시티딘의 최저 수준, 표 1 참조)를 고려하면, 비 C/U는 0.51 미만일 것이다. 이러한 낮은 비는 VVTK-RR-/hCD가 뉴클레오시드 풀 불평형을 유발한다는 것을 확증한다.
참고 문헌
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
SEQUENCE LISTING <110> TRANSGENE SA <120> Oncolytic viruses and therapeutic molecules <130> AA3170 PCT S3 <150> EP 16 30 6831.5 <151> 2016-12-28 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 142 <212> PRT <213> yeast <400> 1 Met Glu Val Gly Gly Ile Glu Asp Arg Gln Leu Glu Ala Leu Lys Arg 1 5 10 15 Ala Ala Leu Lys Ala Cys Glu Leu Ser Tyr Ser Pro Tyr Ser His Phe 20 25 30 Arg Val Gly Cys Ser Ile Leu Thr Asn Asn Asp Val Ile Phe Thr Gly 35 40 45 Ala Asn Val Glu Asn Ala Ser Tyr Ser Asn Cys Ile Cys Ala Glu Arg 50 55 60 Ser Ala Met Ile Gln Val Leu Met Ala Gly His Arg Ser Gly Trp Lys 65 70 75 80 Cys Met Val Ile Cys Gly Asp Ser Glu Asp Gln Cys Val Ser Pro Cys 85 90 95 Gly Val Cys Arg Gln Phe Ile Asn Glu Phe Val Val Lys Asp Phe Pro 100 105 110 Ile Val Met Leu Asn Ser Thr Gly Ser Arg Ser Lys Val Met Thr Met 115 120 125 Gly Glu Leu Leu Pro Met Ala Phe Gly Pro Ser His Leu Asn 130 135 140 <210> 2 <211> 146 <212> PRT <213> human <400> 2 Met Ala Gln Lys Arg Pro Ala Cys Thr Leu Lys Pro Glu Cys Val Gln 1 5 10 15 Gln Leu Leu Val Cys Ser Gln Glu Ala Lys Lys Ser Ala Tyr Cys Pro 20 25 30 Tyr Ser His Phe Pro Val Gly Ala Ala Leu Leu Thr Gln Glu Gly Arg 35 40 45 Ile Phe Lys Gly Cys Asn Ile Glu Asn Ala Cys Tyr Pro Leu Gly Ile 50 55 60 Cys Ala Glu Arg Thr Ala Ile Gln Lys Ala Val Ser Glu Gly Tyr Lys 65 70 75 80 Asp Phe Arg Ala Ile Ala Ile Ala Ser Asp Met Gln Asp Asp Phe Ile 85 90 95 Ser Pro Cys Gly Ala Cys Arg Gln Val Met Arg Glu Phe Gly Thr Asn 100 105 110 Trp Pro Val Tyr Met Thr Lys Pro Asp Gly Thr Tyr Ile Val Met Thr 115 120 125 Val Gln Glu Leu Leu Pro Ser Ser Phe Gly Pro Glu Asp Leu Gln Lys 130 135 140 Thr Gln 145 <210> 3 <211> 224 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Ala Gln Lys Glu Glu Ala Ala Val Ala Thr Glu Ala Ala Ser Gln 1 5 10 15 Asn Gly Glu Asp Leu Glu Asn Leu Asp Asp Pro Glu Lys Leu Lys Glu 20 25 30 Leu Ile Glu Leu Pro Pro Phe Glu Ile Val Thr Gly Glu Arg Leu Pro 35 40 45 Ala Asn Phe Phe Lys Phe Gln Phe Arg Asn Val Glu Tyr Ser Ser Gly 50 55 60 Arg Asn Lys Thr Phe Leu Cys Tyr Val Val Glu Ala Gln Gly Lys Gly 65 70 75 80 Gly Gln Val Gln Ala Ser Arg Gly Tyr Leu Glu Asp Glu His Ala Ala 85 90 95 Ala His Ala Glu Glu Ala Phe Phe Asn Thr Ile Leu Pro Ala Phe Asp 100 105 110 Pro Ala Leu Arg Tyr Asn Val Thr Trp Tyr Val Ser Ser Ser Pro Cys 115 120 125 Ala Ala Cys Ala Asp Arg Ile Ile Lys Thr Leu Ser Lys Thr Lys Asn 130 135 140 Leu Arg Leu Leu Ile Leu Val Gly Arg Leu Phe Met Trp Glu Glu Pro 145 150 155 160 Glu Ile Gln Ala Ala Leu Lys Lys Leu Lys Glu Ala Gly Cys Lys Leu 165 170 175 Arg Ile Met Lys Pro Gln Asp Phe Glu Tyr Val Trp Gln Asn Phe Val 180 185 190 Glu Gln Glu Glu Gly Glu Ser Lys Ala Phe Gln Pro Trp Glu Asp Ile 195 200 205 Gln Glu Asn Phe Leu Tyr Tyr Glu Glu Lys Leu Ala Asp Ile Leu Lys 210 215 220

Claims (30)

  1. 시티딘 데아미나제 (CDAse) 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 종양용해성 바이러스.
  2. 제1항에 있어서, 상기 CDAse 폴리펩티드가 CDA, CDD, EC 3.5.4.5, APOBEC, AID 및 시티딘 데아미나제-유사 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 종양용해성 바이러스.
  3. 제2항에 있어서, 상기 APOBEC가 APOBEC1, APOBEC2, APOBEC3A, APOBEC3B, APOBEC3C, APOBEC3D, APOBEC3E, APOBEC3F, APOBEC3G, APOBEC3H 및 APOBEC4로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 상기 APOBEC가 APOBEC2인 종양용해성 바이러스.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 CDAse가 효모 시티딘 데아미나제 (CDD1) 또는 인간 시티딘 데아미나제 (hCD)인 종양용해성 바이러스.
  5. 제4항에 있어서, 상기 CDD1이 서열식별번호: 1과 적어도 80%, 바람직하게는 90% 초과, 보다 바람직하게는 95% 초과의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 종양용해성 바이러스.
  6. 제4항에 있어서, 상기 hCD가 서열식별번호: 2와 적어도 80%, 바람직하게는 90% 초과, 보다 바람직하게는 95% 초과의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 종양용해성 바이러스.
  7. 제3항에 있어서, 상기 APOBEC2가 서열식별번호: 3과 적어도 80%, 바람직하게는 90% 초과, 보다 바람직하게는 95% 초과의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 종양용해성 바이러스.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CDAse 폴리펩티드가 시티딘의 우리딘으로의 및 데옥시시티딘 (dC)의 데옥시우리딘 (dU)으로의 탈아미노화와 같은 시티딘계 성분의 우리딘계 성분으로의 탈아미노화를 촉매하는 것인 종양용해성 바이러스.
  9. 제8항에 있어서, 상기 시티딘계 성분이 유리 상태이거나 또는 복합체화된 것인 종양용해성 바이러스.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스가 폭스바이러스, 단순 헤르페스 바이러스 (HSV), 레오바이러스, 세네카 밸리 바이러스 (SVV), 수포성 구내염 바이러스 (VSV), 뉴캐슬병 바이러스 (NDV), 모르빌리바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 홍역 바이러스, 포말 바이러스, 알파 바이러스, 렌티바이러스, 인플루엔자 바이러스, 신비스 바이러스, 점액종 바이러스, 랍도바이러스, 피코르나바이러스, 콕사키바이러스, 파르보바이러스 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 종양용해성 바이러스.
  11. 제10항에 있어서, 상기 바이러스가 오르토폭스바이러스 속에 속하는 폭스바이러스인 종양용해성 바이러스.
  12. 제11항에 있어서, 상기 폭스바이러스가 백시니아 바이러스 (VV) 종 또는 우두 바이러스 종에 속하는 것인 종양용해성 바이러스.
  13. 제12항에 있어서, 상기 백시니아 바이러스가 코펜하겐, 와이어쓰 및 웨스턴 리저브 (WR)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 종양용해성 바이러스.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스가 J2R 로커스가 결손된 것인 종양용해성 바이러스.
  15. 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스가 I4L 및/또는 F4L 로커스가 결손된 것인 종양용해성 바이러스.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 바이러스가, 인간 또는 효모 CDAse를 코딩하는, 바이러스 TK 및 RR 코딩된 활성이 결손된 백시니아 바이러스, 예컨대 VVTK-RR-/CDD1, VVTK-RR-/hCD 또는 VVTK-RR-/APOBEC2인 종양용해성 바이러스.
  17. 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스가 하나 이상의 관심 핵산(들)을 추가로 포함하는 것인 종양용해성 바이러스.
  18. 제17항에 있어서, 상기 관심 핵산이 면역자극 폴리펩티드, 항원 또는 퍼미아제를 코딩하는 것인 종양용해성 바이러스.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스가 상기 시티딘 데아미나제 및 상기 하나 이상의 관심 핵산(들)의 발현에 필요한 요소를 추가로 포함하는 것인 종양용해성 바이러스.
  20. 하기 단계를 포함하는, 종양용해성 바이러스를 제조하는 방법:
    (i) 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 종양용해성 바이러스를 생산자 세포 내로 도입하는 단계;
    (ii) 상기 생산자 세포를 상기 종양용해성 바이러스가 생산될 수 있도록 하기에 적절한 조건 하에 배양하는 단계; 및
    (iii) 상기 종양용해성 바이러스를 세포 배양물로부터 회수하는 단계.
  21. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 또는 제20항에 따라 제조된 종양용해성 바이러스를 포함하며, 제약상 허용되는 비히클을 추가로 포함하는 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 상기 조성물이, 106 내지 5x109 PFU에 포함된 종양용해성 바이러스의 용량을 포함하는 것인 조성물.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 종양용해성 바이러스가 비경구 경로 투여를 위해, 바람직하게는 정맥내 또는 종양내 경로를 위해 제제화되는 것인 조성물.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 증식성 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 종양용해성 바이러스 또는 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 상기 증식성 질환이 암, 종양 및 재협착인, 사용하기 위한 종양용해성 바이러스 또는 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 상기 암이 식도, 담낭, 간, 췌장, 위, 소장, 장 (대장 또는 결장 및 직장) 및 항문의 암을 포함한 위장관암인, 사용하기 위한 종양용해성 바이러스.
  27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 항암 요법에 효과적인 하나 이상의 물질의 투여를 추가로 포함하는, 사용하기 위한 종양용해성 바이러스.
  28. 제27항에 있어서, 시티딘 데아미나제 활성을 증진시키는 하나 이상의 물질의 투여를 추가로 포함하는, 사용하기 위한 종양용해성 바이러스.
  29. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른, 또는 제20항에 따라 제조된, 또는 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 조성물에 포함된 종양용해성 바이러스의 투여를 포함하는, 질환 또는 병리학적 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병리학적 상태를 치료하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 질환 또는 병리학적 상태가 증식성 질환 예컨대 암, 종양 및 재협착, 바람직하게는 위장관암인 방법.
KR1020197021416A 2016-12-28 2017-12-21 종양용해성 바이러스 및 치료 분자 KR20190097240A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP16306831.5 2016-12-28
EP16306831 2016-12-28
PCT/EP2017/084022 WO2018122088A1 (en) 2016-12-28 2017-12-21 Oncolytic viruses and therapeutic molecules

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20190097240A true KR20190097240A (ko) 2019-08-20

Family

ID=57794099

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020197021416A KR20190097240A (ko) 2016-12-28 2017-12-21 종양용해성 바이러스 및 치료 분자

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20190330655A1 (ko)
EP (1) EP3562946B1 (ko)
JP (1) JP7110203B2 (ko)
KR (1) KR20190097240A (ko)
CN (1) CN110168092A (ko)
AU (1) AU2017387549B2 (ko)
CA (1) CA3045228C (ko)
DK (1) DK3562946T3 (ko)
ES (1) ES2905478T3 (ko)
IL (1) IL267639A (ko)
WO (1) WO2018122088A1 (ko)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112020014727A2 (pt) * 2018-01-19 2020-12-08 Kolon Life Science, Inc. Vírus vaccinia recombinante e composição farmacêutica compreendendo o mesmo
AU2019412516A1 (en) 2018-12-28 2021-07-15 Transgene M2-defective poxvirus
CN110747174A (zh) * 2019-10-30 2020-02-04 青岛宁逸生物科技有限公司 一种用于肿瘤治疗的重组病毒
WO2021211902A2 (en) * 2020-04-15 2021-10-21 Humane Genomics Artificial oncolytic viruses and related methods
CN116421734A (zh) * 2021-12-30 2023-07-14 深圳复诺健生物科技有限公司 适用于溶瘤病毒的冻干保护剂及其应用
CN115820721B (zh) * 2022-07-26 2024-03-22 贵州大学 提高贵州优质特色稻大白果糯分蘖和产量的方法和一种启动子核心序列及应用
WO2024038175A1 (en) 2022-08-18 2024-02-22 Transgene Chimeric poxviruses

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
US6054438A (en) 1987-01-07 2000-04-25 Imperial Cancer Research Technology Limited Nucleic acid fragments encoding portions of the core protein of the human mammary epithelial mucin
IL115156A (en) * 1994-09-06 2000-07-16 Univ Georgia Pharmaceutical compositions for the treatment of cancer comprising 1-(2-hydroxymethyl-1,3-dioxolan-4-yl) cytosines
FR2751343B1 (fr) 1996-07-16 1998-12-18 Transgene Sa Procede de conservation de virus recombinants infectieux, suspension aqueuse virale et utilisation comme medicament
CA2261989C (en) 1996-07-25 2008-09-30 Therion Biologics Corporation Recombinant pox virus for immunization against tumor-associated antigens
WO1998010088A1 (en) 1996-09-06 1998-03-12 Trustees Of The University Of Pennsylvania An inducible method for production of recombinant adeno-associated viruses utilizing t7 polymerase
AU727308B2 (en) 1997-02-24 2000-12-07 Dana-Farber Cancer Institute Recombinant pox virus for immunization against muc1 tumor-associated antigen
EP0988053A1 (en) 1997-06-11 2000-03-29 Aquila Biopharmaceuticals, Inc. Purified saponins as oral adjuvants
WO2001066137A1 (en) 2000-03-07 2001-09-13 Merck & Co., Inc. Adenovirus formulations
NZ533302A (en) 2001-12-10 2005-11-25 Bavarian Nordic As Poxvirus containing formulations and process for preparing stable, poxvirus containing compositions containing a disaaccharide and a pharmaceutically acceptable polymer i.e. dextran or polyvinylpyrrolidon (PVP)
US20040009951A1 (en) * 2002-06-13 2004-01-15 Malim Michael H DNA deamination mediates innate immunity to (retro)viral infection
EP1528101A1 (en) 2003-11-03 2005-05-04 ProBioGen AG Immortalized avian cell lines for virus production
FR2884255B1 (fr) 2005-04-11 2010-11-05 Vivalis Utilisation de lignees de cellules souches aviaires ebx pour la production de vaccin contre la grippe
JP5138601B2 (ja) 2005-11-21 2013-02-06 サノフィ パストゥール リミテッド 組換えウイルス安定化製剤
GB0607063D0 (en) * 2006-04-07 2006-05-17 Cellcentric Ltd Compositions and methods for epigenetic modification of nucleic acid sequences in vivo
DK2029756T3 (en) 2006-06-20 2017-02-13 Transgene Sa PROCEDURE FOR PREPARING POXVIRA AND POXVIRUS COMPOSITIONS
BRPI0713711A2 (pt) 2006-06-20 2012-10-30 Transgene Sa vacina viral recombinante, kit para vacinação, e, método para usar pelo menos um composto
GB0705245D0 (en) 2007-03-19 2007-04-25 Stabilitech Ltd Stable biological products
EP1985305A1 (en) 2007-04-24 2008-10-29 Vivalis Duck embryonic derived stem cell lines for the production of viral vaccines
JP2010526546A (ja) 2007-05-14 2010-08-05 バヴァリアン・ノルディック・アクティーゼルスカブ ワクシニアウイルス系及び組換えワクシニアウイルス系ワクチンの精製
WO2008156655A2 (en) * 2007-06-15 2008-12-24 Genelux Corporation Vaccinia virus vectors encoding a sodium-dependent transporter protein for imaging and/or treatment of tumors
US8357531B2 (en) 2007-07-03 2013-01-22 Transgene S.A. Immortalized avian cell lines
KR101039235B1 (ko) * 2007-08-29 2011-06-07 메디포스트(주) 제대혈 유래 간엽줄기세포를 포함하는 인터루킨-8 또는지알오-알파 발현 세포가 관련된 질병의 진단, 예방 또는치료용 조성물
NZ584199A (en) 2007-11-19 2012-07-27 Transgene Sa Poxviral oncolytic vectors comprising a defective 14l and/or f4l gene
MX2010005273A (es) 2007-11-19 2010-08-31 Transgene Sa Vectores oncoliticos poxvirales.
CN102257134B (zh) 2008-02-12 2014-03-05 赛诺菲巴斯德有限公司 使用离子交换和凝胶过滤色谱进行痘病毒纯化的方法
JP2012509678A (ja) 2008-11-27 2012-04-26 バヴァリアン・ノルディック・アクティーゼルスカブ 組換えウイルス発現のためのプロモーター
US8394385B2 (en) 2009-03-13 2013-03-12 Bavarian Nordic A/S Optimized early-late promoter combined with repeated vaccination favors cytotoxic T cell response against recombinant antigen in MVA vaccines
EP2416781B1 (en) 2009-04-06 2017-03-08 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Combination of cytidine-based antineoplastic drugs with cytidine deaminase inhibitor and use thereof in the treatment of cancer
TWI503121B (zh) 2009-04-06 2015-10-11 Otsuka Pharma Co Ltd 用以治療癌症之組成物及方法
CA2760465A1 (en) 2009-05-12 2010-11-18 Transgene Sa Method for orthopoxvirus production and purification
WO2011075627A1 (en) * 2009-12-18 2011-06-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Use of cytidine deaminase-related agents to promote demethylation and cell reprogramming
GB201006405D0 (en) 2010-04-16 2010-06-02 Isis Innovation Poxvirus expression system
PL2739293T3 (pl) 2011-08-05 2020-11-16 Sillajen Biotherapeutics, Inc. Sposoby i kompozycje wytwarzania wirusa krowianki
FI20115914L (fi) * 2011-09-16 2013-03-17 Oncos Therapeutics Ltd Muunnettu onkolyyttinen virus
KR20200087880A (ko) 2012-10-28 2020-07-21 버베리안 노딕 에이/에스 강력한 ｔ-세포 및 항체 반응을 위한 ｐｒ13.5 프로모터

Also Published As

Publication number Publication date
DK3562946T3 (da) 2022-01-31
JP2020503040A (ja) 2020-01-30
EP3562946A1 (en) 2019-11-06
AU2017387549A1 (en) 2019-07-04
US20190330655A1 (en) 2019-10-31
CN110168092A (zh) 2019-08-23
EP3562946B1 (en) 2021-11-24
JP7110203B2 (ja) 2022-08-01
CA3045228C (en) 2024-01-02
AU2017387549B2 (en) 2023-07-06
WO2018122088A1 (en) 2018-07-05
ES2905478T3 (es) 2022-04-08
CA3045228A1 (en) 2018-07-05
IL267639A (en) 2019-08-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3562946B1 (en) Oncolytic viruses and therapeutic molecules
AU2015289125B2 (en) Oncolytic virus for expression of immune checkpoint modulators
ES2833425T3 (es) Combinación de virus oncolítico con moduladores de punto de control inmunitario
US20200338149A1 (en) Novel genetically engineered vaccinia viruses
JP5710262B2 (ja) ポックスウイルス腫瘍細胞崩壊性ベクター
WO2018091680A1 (en) Cowpox-based oncolytic vectors
WO2019020543A1 (en) ONCOLYTIC VIRUSES EXPRESSING AGENTS TARGETING METABOLIC IMMUNE MODULATORS
CN112512560A (zh) 副痘病毒属载体
US10813957B2 (en) Engineered oncolytic viruses containing hyper-binding sites to sequester and suppress activity of oncogenic transcription factors as a novel treatment for human cancer
US20190134190A1 (en) Combination therapy with cpg tlr9 ligand
WO2020011754A1 (en) Chimeric vaccinia viruses
AU2015243297B2 (en) Poxviral oncolytic vectors
ES2908854T3 (es) Método para producir un arenavirus antitumoral así como mutantes de arenavirus
WO2016131945A1 (en) Combination product with autophagy modulator
WO2018067165A1 (en) Engineered oncolytic viruses containing hyper-binding sites to sequester and suppress activity of oncogenic transcription factors as a novel treatment for human cancer
WO2024038175A1 (en) Chimeric poxviruses

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right