CN112512560A - 副痘病毒属载体 - Google Patents

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Abstract

本发明属于病毒免疫疗法领域。本发明提供新型的假牛痘(PCPV)病毒，尤其是重组的PCPV，其组合物以及它们用于预防或治疗疾病尤其是增生性疾病比如癌症和再狭窄以及感染性疾病例如慢性感染性疾病的治疗用途。本发明还提供生成和扩增这种PCPV的方法以及用这种PCPV来引发或刺激和/或重定向免疫应答的方法。更具体地，本发明提供一种现有痘病毒属载体诸如MVA(修饰的安卡拉病毒)的替换方案，并且可以很大程度上用于治疗性疫苗接种。

Description

副痘病毒属载体
技术领域
本发明属于病毒免疫疗法领域。本发明提供新型的假牛痘(PCPV)病毒，尤其是重组的PCPV，其组合物以及它们用于预防或治疗疾病尤其是增生性疾病比如癌症和再狭窄以及感染性疾病的治疗用途。本发明还提供用于生成和扩增这种PCPV的方法以及用这种PCPV来引发或刺激和/或重定向(re-orienting)免疫应答的方法。更具体地，本发明提供一种现有痘病毒属载体诸如MVA(修饰的安卡拉病毒)的替换方案，并且可以很大程度上用于治疗性疫苗接种。
背景技术
免疫疗法致力于增强宿主的免疫系统，以帮助机体根除病原体和异常细胞。免疫疗法广泛应用于传统的疫苗接种，也正在积极研究免疫疗法作为治疗严重、慢性或威胁生命的疾病的一种潜在方式，以期刺激特异性和先天性免疫应答。几十年来，文献中已经描述了大量的免疫疗法。特别是，现在已经出现了数种病毒和非病毒载体，它们都有相对的优势和局限性，使它们更适合某些适应症(参见例如Cattaneo and Russell,2017,PLOSPathogens doi:10.1371/journalppat.1006190；Kaufman et al.,2015,Nature ReviewsDrug Discovery 14:642-661；Gomez et al.,2013expert Rev Vaccines12(12):1395-1416)。大量的免疫治疗平台正在临床试验中被评估，目前基于痘病毒疗法(无论是否溶瘤)的临床研究的数量，都反映了它们有吸引力的治疗潜力。例如，基于重组痘苗病毒(VV)的载体因其优越的安全性和将强大的细胞抗原特异性免疫应答与对固有免疫系统的普遍刺激相结合的能力而成为引入注目的候选物。TG4010(或其研究名称为MVATG9931)是一种治疗性癌症疫苗，其基于编码MUC1肿瘤相关抗原和人类白细胞介素2(IL-2)的修饰的安卡拉痘苗病毒(MVA)。TG4010与晚期转移性非小细胞肺癌(NSCLC)的一线护理化疗标准相结合，在两个不同的随机对照2b期临床试验中证明有疗效(Quoix et al.,2011,The LancetOncology 12(12):1125-33)。
副痘病毒代表着可用于载体疫苗的不同候选物。副痘病毒属(Parapoxviruses)属于痘病毒科(family Poxviridae)和脊椎动物痘病毒亚科(subfamilyChordopoxvirinae)。副痘病毒通常被认为是反刍动物皮肤病的病原体，导致丘疹状口炎和接触性脓疱性皮炎，尤其是在嘴唇、鼻孔、口腔黏膜和乳头区域。与痘病毒科的其他成员一样，副痘病毒是相对大的包膜双链DNA病毒，几何形呈卵圆，可感染脊椎动物，包括可供选择的多种哺乳动物和人类。副痘病毒有独特的螺旋状外壳，使其与其他痘病毒区别开来。
与痘病毒一样，副痘病毒的复制在细胞质内。病毒蛋白与宿主糖胺聚糖(GAG)结合介导病毒进入宿主细胞的内吞作用，从而得以进入宿主细胞。与细胞膜融合使核心物质(core)释放到宿主细胞质中。借助病毒RNA聚合酶在细胞质中转录早期基因。早期表达在感染后30分钟开始。在感染后大约100分钟，中期触发基因组DNA复制。然后晚期基因在感染后140分钟至48小时表达，产生所有结构蛋白。子代病毒粒体的组装开始于细胞质病毒工厂，产生球形的未成熟颗粒。病毒颗粒成熟为砖状细胞内成熟病毒粒体(IMV)。IMV病毒粒体可在细胞裂解时释放，也可从反式高尔基体(trans-Golgi)和芽中获得第二个双膜，作为外部有包膜的病毒粒体(EEV)宿主受体，介导细胞内吞作用。这种病毒在细胞死亡后通过存在于包含体(occlusion body)中离开宿主细胞，并在找到另一个宿主之前保持感染性。
复制活性的(Replication-competent)和灭活的副痘病毒以其免疫调节特性而闻名(Schulze et al.,2009,Vet Microbiol.137:260-7)。绵羊副痘病毒(ORFV)是副痘病毒属的原型种，已成功地应用于兽医，以提高动物慢性持续性病毒感染的一般抵抗力(参见例如US6,365,393；WO97/32029以及US2003-0013076)以及用于治疗HIV的人类药物(WO2006/005529)，并被一些人认为是溶瘤的(Rintoul et al.,2012,Mol.Ther.20(6):1148-57)。在ORFV基因组中鉴定了不同的插入位点(WO97/37031)。值得注意的是，编码犬瘟热病毒(CDV)抗原的重组ORFV在猪中被用作抗CDV的疫苗(WO2012/01145)和抗假性狂犬病病毒的疫苗(Rooij et al.,2010,Vaccine 28(7):1808-13)。
Figure BDA0002762298770000021
原名
Figure BDA0002762298770000022
是从株D1701衍生的化学灭活ORFV的制剂，用于预防性和治疗性治疗感染性疾病，以及用于预防动物应激性疾病。灭活的ORFV可能通过TLR-9依赖性途径的衔接(engagement)诱导浆细胞样树突状细胞(pDC)(Von Buttlar et al.,2014,PLOS One 9(8):e106188)。最近，Choi等人(2017,Surgery,doi 10.1016/j.surg.2017.09.030)报告了一种嵌合副痘病毒在三阴性乳腺癌(TNBC)肿瘤中具有强大的细胞毒性活性。嵌合ORF病毒注射后1周在肿瘤组织中检测到嵌合ORF病毒活跃的复制，在病毒处理的肿瘤组织周围观察到自然杀伤(NK)细胞浸润。
显然很有必要开发有效的方法来治疗威胁生命的疾病如癌症和感染性疾病。事实上，病变细胞已经进化出强大的免疫抑制机制来逃避免疫系统，造成有效免疫疗法的主要障碍。因此，触发先天性和特异性免疫机制可能是成功开发更有效的免疫疗法的关键。
本发明涉及使用副痘病毒属作为用于递送治疗基因的载体。本发明人惊奇地发现，鉴于其有限的致病性和免疫调节特性，假牛痘病毒(PCPV)提供了显著的优势，使得它特别适合于抗癌治疗。本发明人发现，PCPV提供了一种与其他痘病毒不同的强大的先天免疫特性，这表现在它活化许多细胞因子和趋化因子的分泌的能力，这些细胞因子和趋化因子刺激免疫效应细胞的水平高于传统的MVA和VV。副痘病毒属的另一个成员，牛丘疹状口炎病毒(bovine papular stomatitis virus，BPSV)在PBMC中表现出与PCPV相似的作用，其上清液中分泌的IFN-α显著增加。此外，在体外衍生的人M2型巨噬细胞中CD86表达的增加，表明PCPV在M2巨噬细胞向抑制性较低的表型重编程中起作用。最后，在同基因动物模型中，工程化成表达肿瘤相关抗原(TAA)的重组PCPV病毒对控制肿瘤生长和提高存活特别有效。PCPV联合抗PD1抗体在“双瘤”模型中表现出统计学显著的肿瘤控制改善。
由于PCPV和BPSV病毒所表现出的免疫原性特性的改善，本领域技术人员可以期望副痘病毒可成功地作为其他病毒疗法的替代品用于治疗或预防增生性疾病如癌症和感染性疾病(例如，慢性HBV)。因此，PCPV或BPSV是治疗性疫苗的候选物，它可以对肿瘤环境产生影响。
发明内容
本发明的一方面涉及假牛痘病毒(PCPV)，其中所述PCPV包含插入在其基因组中的至少一种外来(foreign)核酸。
在一个实施方案中，所述PCPV得自由ATCC编号ATCC VR-634TM确认的野生型TJS株或者得自相同或相似名称的病毒株或其功能片段和变体。
在另一个实施方案中，PCPV可以进一步对于PCPV基因组编码的病毒功能是缺损(defective)的，优选对于非必需病毒功能是缺损的，更优选对于所述外来核酸的插入位点处编码的病毒基因功能是缺损的。
在又一实施方案中，所述外来核酸编码选自以下的多肽：补偿对象中缺损或缺陷(deficient)的蛋白质的多肽；通过毒性作用限制或从机体清除病变细胞的多肽，诸如自杀基因产物；能够增强抗肿瘤功效的多肽，诸如武装基因(armed gene)产物；以及能诱导或活化免疫应答的多肽，诸如免疫刺激性多肽和抗原性多肽。优选地，所述免疫刺激性多肽选自：细胞因子，诸如白细胞介素、趋化因子、干扰素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子，APC外露蛋白(APC-exposed proteins)，具有抗血管生成作用的多肽，和影响细胞表面受体调节的多肽诸如免疫检查点的激动剂或拮抗剂，尤其优选白细胞介素或集落刺激因子，尤其是GM-CSF或者激动剂OX40针对性(OX40-directed)抗体。还优选癌症抗原诸如MUC-1抗原，病毒抗原性多肽例如HPV-16E7抗原或HBV抗原。
在另外又一实施方案中，所述至少一种外来核酸可操作地连接合适的用于在期望的宿主细胞或对象中表达的调节元件。
在另外的实施方案中，所述至少一种外来核酸插入在VEGF基因座中。
在另一方面，本发明进一步提供通过在包含外来核酸的转移质粒与PCPV基因组之间的同源重组生成本发明的PCPV的方法，所述外来核酸的5’和3’侧翼有分别存在于插入位点上游和下游的PCPV序列，其中所述方法包含生成所述转移质粒的步骤和将所述转移质粒引入到合适宿主细胞的步骤，尤其是与包含存在于转移质粒的侧翼序列的PCPV病毒一起引入。
在一个实施方案中，所述至少一种外来核酸在PCPV基因组中的插入位点是在病毒基因(优选非必需病毒基因)中，在基因间隔区中，在PCPV基因组的不编码基因产物的部分中，或者在重复基因座中，优选VEGF基因座。
在一个实施方案中，转移质粒进一步包含一个或多个选择和/或可检测的基因，以便于鉴定重组PCP，优选编码GFP、e-GFP或mCherry的选择GPT基因和/或可检测的基因。
在又一方面，本发明进一步涉及用于将本发明的PCPV或者通过本发明的方法生成的PCPV扩增的方法，包含以下步骤：a)制备生产者细胞系，b)转染或感染所制备的生产者细胞系，c)在合适的条件下培养转染的或感染的生产者细胞系以允许产生病毒，d)从所述生产者细胞系的培养物中回收所产生的病毒，以及任选地e)纯化所述回收的病毒。
在另外又一方面，本发明涉及一种组合物，其包含治疗有效量的本发明的PCPV或通过根据本发明的方法扩增的PCPV以及药学上可接受的媒剂(vehicle)。优选地，所述组合物被配制成包含约103至约1012pfu的单个(individual)剂量。优选地，其被配制用于静脉内、肌内、皮下或肿瘤内施用。
在一个实施方案中，该组合物用于治疗或预防由病原性生物体或不期望的细胞分裂引起的疾病或病理状况的用途。
在还有一方面，本发明提供治疗的方法和用于抑制肿瘤细胞生长的方法，包含将本发明的组合物以足以治疗或预防由病原性生物体或不期望的细胞分裂引起的疾病或病理状况的量施用于有需要的对象。
在一个实施方案中，所述癌症选自：肾癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌、肝癌、胃癌、胆管癌、子宫内膜癌、胰腺癌和卵巢癌以及过表达MUC1的癌症。
在另一个实施方案中，所述方法或用途与选自以下的一种或多种其他治疗(therapeutic agent)联合进行：手术、放疗、化疗、冷冻疗法、激素疗法、毒素疗法、免疫疗法、细胞因子疗法、靶向癌症治疗、基因治疗、光动力疗法和移植。
在又一实施方案中，所述方法或用途根据包含依次施用(一种或多种)初免组合物和(一种或多种)加强组合物的初免加强方法来进行。
在又一方面，本发明涉及引发或刺激和/或重定向免疫应答的方法，其包含以足以活化对象免疫的量向有需要的对象施用本发明的组合物。
在一个实施方案中，该方法产生以下中的至少一个特性：(a)PBMC分泌高水平的IFNα；(b)活化单核细胞衍生的树突状细胞；(c)诱导T细胞增殖(例如，通过高粒酶(granzyme)B+T细胞间接反映的)；(d)MDSC中更好的细胞因子/趋化因子谱；(e)活化APC；(f)人巨噬细胞M2到M1的转化；和/或(g)通过TLR9介导的途径或其他先天性免疫刺激途径诱导免疫。
附图说明
图1示出了在两个不同的实验(Exp 1和Exp 2)中以不同的MOI(MOI0.1，MOI 1和MOI 5)，来自2个供体的PBMC中的IFN-α分泌。空白(Mock)代表阴性对照，而被测试的不同病毒是副痘病毒(假牛痘病毒(PCPV)和绵羊副痘病毒(ORFV))、MVA(名为MVAN33.1的空MVA载体)、牛痘病毒(CPX)、哥本哈根痘苗病毒(Copwt)、鸡痘(FPV)、粘液瘤病毒(MYXV)、猪痘(SWPV)、浣熊痘病毒(RCN)、科蒂病毒(CTV)和亚巴样病病毒(YLDV)。
图2示出了通过流式细胞术测量的得自三个不同供体的感染病毒的moDC中活化标志物CD86的表达水平。所示为用空MVA载体MVAN33.1或PCPV以MOI 0.03、0.3或1感染后16h观察到的moDC(3个供体)中或作为阴性对照的空白中CD86的中值荧光强度(MedFI)。用抗CD86-PE染色通过流式细胞术定量细胞结合信号来测量表达水平。
图3示出了用MVAN33.1或PCPV以MOI 5、1和0.3孵育后，通过Luminex分析测量的由本文所描述的PBMC生成的CD163+CD206+M2巨噬细胞上清液中的细胞因子水平。
图4示出了A)用PCPV以MOI 0.03、0.3或3处理后，单独或与在20ng/ml GM-CSF、10ng/ml IL4和1μM前列腺素E2存在下衍生的MDSC共培养(MDSC/T比率为1/2)的相对CTL增殖。B)用PCPV以指定MOI处理的单独或与MDSC共培养(如A所示共培养)的高增殖T细胞中的相对粒酶B表达。C)用PCPV以指定MOI处理MDSC过夜后IFN-α分泌。
图5示出了A)用PCPV以MOI 0.03、0.3或3处理后，单独或与在10ng/ml GM-CSF和10ng/ml IL6存在下衍生的MDSC共培养(MDSC/T比率为1/2和1/1)的相对CTL增殖。B)用PCPV以指定MOI处理的单独或与MDSC共培养(如A所示共培养)的高增殖T细胞中的相对粒酶B表达。
图6示出了MC38肿瘤模型中肿瘤生长和动物存活的演变过程。动物被分成三组，每组十只。对于所有组，根据(A)中所示的方案对同基因C57BL/6小鼠皮下注射2.106个MC38细胞。注射部位用永久性标志物进行标记。动物接受三次瘤内注射1.107pfu的MVA-HPV16E7m(B)或PCPV-HPV16E7m(C)或缓冲剂(D)，分别在细胞移植后2天(在细胞系注射部位)以及第9天和第16天在新生肿瘤内注射。肿瘤生长是通过测量肿瘤体积随时间的变化来估计的。(E)：总存活(OS)率用Kaplan-Meier曲线表示。实线(-)表示用MVA-HPV16E7m处理的动物组(MVATG14197)，虚线(--)表示用PCPV-HPV16E7m处理的动物组(PCPV19178)，点线(..)表示用缓冲剂处理的动物组(S08)。
图7示出了PCPV对MC38细胞活力的影响。接种2x104个细胞，用PCPV-GFP、VV-GFP(标示为VVTG)作为阳性对照、空白作为阴性对照任一种以MOI 1、10-1、10-2和10-3进行感染。五天后，刮取收获细胞，用台盼蓝染色法和细胞计数器Vicell测定活细胞的数量和比例。
图8示出了皮下注射PCPV或MVA或缓冲剂(作为阴性对照)之后局部的细胞因子和趋化因子谱。在每组四只小鼠双侧剃毛的胁腹皮下注射5x105pfu病毒/胁腹。对于每只小鼠，16小时后取两侧胁腹的皮肤，机械分离保存细胞(间质/细胞外分析物的解离)。在300g离心后，将上清转移到Eppendorf管中并在18000g低温离心。根据制造商的建议，用Procartaplex mouse chemokine and cytokine multiplex试剂盒分析澄清的上清液。
图9示出了PCPV对TIL组合物的影响。对CD11b+Ly6G+CD45+细胞中的嗜中性粒细胞百分比进行了检测(A)。TAM被鉴定为Ly6G-CD11b+细胞中的CD11c-亚群。用MHCⅡ和Ly6C对不同亚群进行分层。根据Brauner等人，“TAM C”的特征是MHC IIlo和Ly6C+。
图10示出了(A)R9F肽刺激后合并的脾脏中HPV16 E7-特异性T细胞的生成，(B)T8V刺激后MVA-特异性T细胞的生成，(C)用所示病毒重复静脉(iv)处理的小鼠的合并肺中CD3dimCD8dimT细胞群的出现以及(D)CD3dimCD8dimT细胞群中合并肺中HPV-16E7-特异性T细胞的生成。
图11示出了用空MVA(MVATGN33.1)、HPV16E7-编码MVA(MVATG14197)和HPV16E7-编码PCPV感染后通过ICS测量的CD3dimCD8dimT细胞群中HPV16 E7-特异性T细胞出现的诱导倍数(特异性肽与对照肽)。
图12示出了MC38荷瘤小鼠瘤内注射1×107pfu的PCPV(A)或缓冲剂(E)以及腹膜内注射消耗性抗体抗Ly6G(B)、抗CD8(C)和抗CD4(D)以分别耗竭小鼠嗜中性粒细胞、CD8+细胞和CD4+细胞的肿瘤控制实验。每组包含13只小鼠。
图13示出了对已接受PCPV注射的存活小鼠脾细胞的ELISPOT分析，结果显示第34天MC38肿瘤减少或消退。收集5只存活动物(PCPV存活池)和两个个体存活者(PCPV存活者)和未进行处理
Figure BDA0002762298770000071
小鼠(Naives)的脾脏，从脾细胞悬浮液中分离淋巴细胞。将一份107个细胞/毫升置于ELISA板上，用丝裂霉素C处理的MC38细胞或无关的I8L肽或用完全培养基(培养基)进行刺激。用ELISPOT读取器(CTL Immunoqpot reader)对斑点进行计数。在每种条件下重复四次测试，结果表示为每1x106个脾淋巴细胞的斑点形成单位(sfu)的平均数。
图14示出了根据初免/加强设置在携带TC1的C57BL/6小鼠中进行的肿瘤控制实验。将TC1细胞经皮下移植到C57BL/6小鼠的胁腹。14天后，将荷瘤小鼠随机分组(每组10只)，瘤内注射1.106pfu的MVA-HPV16E7(A和B)或PCPV-HPV16E7(C)或缓冲剂(D)(初免注射)。一周后，用静脉注射1x106 pfu的对应病毒(即，PCPV-HPV16E7(D)或MVA-HPV16E7(A和C)或缓冲剂(在初免小鼠中缓冲剂是B)来进行加强。追踪肿瘤随时间的生长。
图15示出了MC38荷瘤小鼠单独地(深灰色)或与小鼠抗PD1联合(腹膜内注射)(中灰色)瘤内注射1×107pfu的PCPV(A)或VV(B)之后的肿瘤控制实验。对照组接受S08缓冲剂(最浅灰色)或单独的抗PD1抗体(浅色灰)。每组包含13只小鼠。
图16示出了得自代表性供体且用MVA、PCPV或BPSV以MOI 0.3感染的PBMC中的IFN-α分泌情况。空白代表阴性对照，ODN2216(CpG型TLR9配体)作为免疫刺激效应的对照。
具体实施方式
定义
如在整个申请中所使用的，术语“一(a)”和“一个(an)”意在“至少一个”、“至少第一个”、“一个或多个”或“多个”所引用的组分或步骤的意义上使用，除非上下文明确另有规定。例如，术语“细胞”包括细胞的复数含义，包括它们的混合物。
术语“一个或多个”是指一或一以上的数目(例如，2、3、4等)。
本文各处所使用的术语“和/或”包括“和”、“或”以及“由所述术语连接的元素的所有或任何其他组合”的含义。
本文所使用的术语“大约”或“近似”是指在给定值或范围的20％、优选10％、且更优选5％以内。
如本文所使用的，当用于限定产物和组合物时，术语“包含(comprising)”(以及“包含”的任何形式例如"comprise"和"comprises")、“具有(having)”(以及“具有”的任何形式例如"have"和"has")、“包括(including)”(以及“包括”的任何形式例如"includes"和"incIude")或“含有(containing)”(以及“含有”的任何形式例如"contains"和"contain")是开放式的，以及不排除额外的、未列出的元素或方法步骤。表述“基本由……组成”意思是排除其它具有实质意义的组分或步骤。因此，基本上由所述组分组成的组合物不排除痕量物、杂质和药学上可接受的载剂(carrier)。“由……组成”应当指排除其他组分或步骤超出痕量的元素。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”是指氨基酸残基的聚合物，其包含通过肽键结合的至少九个或更多氨基酸。聚合物可以是线性、支化或环状的，并且可以包含天然存在的和/或氨基酸类似物，且其可以被非氨基酸中断。作为一般指示，如果氨基酸聚合物超过50个氨基酸残基，则优选地将其称为多肽或蛋白质，而如果其长度等于或小于50个氨基酸，则将其称为“肽”。
在本发明的背景下，术语“核酸”、“核酸分子”、“多核苷酸”和“核苷酸序列”可以互换使用，并定义多聚脱氧核糖核酸(DNA)(例如，cDNA、基因组DNA、质粒、载体、病毒基因组、分离的DNA、探针、引物及其任何混合物)或多聚核糖核苷酸(RNA)(例如mRNA、反义RNA、SiRNA)或混合的多聚核糖-多聚脱氧核糖核苷酸中的任意长度的聚合物。它们包括单链或双链、线性或环状、天然的或合成的、修饰或未修饰的多核苷酸。此外，多核苷酸可包含非天然存在的核苷酸，并可被非核苷酸成分中断。
术语“变体”“类似物”“衍生物”等可以互换地用于指代表现出相对于天然对应物的一个或多个修饰的组分(多肽、核酸、病毒等)。可以设想任何(一个或多个)修饰，包括取代、插入和/或缺失一个或多个核苷酸/氨基酸残基。优选的是在与天然对应物的序列进行优化全局比对后(即，将待比较序列在其整个长度上取其整体比对后)，保留至少75％、有利的至少80％、理想的至少85％、优选的至少90％、更优选的至少95％、甚至更优选的至少98％相同性的序列相同性程度的变体。出于说明性的目的，“至少75％相同性”是指75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。按通常的方式，术语“相同性”是指两个多肽或核酸序列之间的氨基酸与氨基酸或核苷酸与核苷酸对应。考虑到需要引入以便于优化比对的缺口(gap)的数量以及每个缺口的长度，两个序列之间的相同性百分比是序列共有的相同位置的数量的函数。在本领域可获得不同的计算机程序和数学算法来确定氨基酸序列之间的相同性百分比，例如NCBI上可用的Blast程序或者Atlas of ProteinSequence and Structure中的ALIGN(Dayhoffed,1981,Suppl.,3:482-9)。用于确定核苷酸序列之间的相同性的程序也可在专门的数据库中获得(例如Genbank、Wisconsin SequenceAnalysis Package、BESTFIT、FASTA和GAP程序)。对于优化全局比对而言，可以使用Needleman和Wunsch的算法(Needleman and Wunsch.J.Mol.Biol.48,443–453,1970)，例如https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/上可用的Emboss Needle软件。该软件读取两个输入序列并将它们的最佳全局序列比对写入到文件。它使用Needleman-Wunsch比对算法来沿两个序列的全长找出它们的最佳比对(包括缺口)。该算法使用动态编程方法来确保比对结果是最佳的，通过探索所有可能的比对并选择最好的。对含有每个可能的残基或核苷酸匹配的值的得分矩阵进行读取。Needle找出具有最大可能得分的比对，在该得分中比对的得分等于从得分矩阵中获得的匹配的总和，减去在比对序列中开口和延伸缺口所产生的罚分。替换矩阵以及缺口开口和延伸罚分是用户指定的。在本发明的背景下，为了获得最佳的全局比对，可以使用具有默认参数的Emboss Needle软件，即：
·对于氨基酸序列：“Gap open”＝10.0，“Gap extend”＝0.5，“End gap penalty”＝“false”，“End gap open”＝10.0，“End gap extend”＝0.5，以及“Blosum62matrix”；
·对于核苷酸序列：“Gap open”＝10.0，“Gap extend”＝0.5，“End gap penalty”＝“false”，“End gap open”＝10.0，“End gap extend”＝0.5，以及“DNAfull”矩阵；
如本文所使用的，术语“宿主细胞”应当广义地理解，而不应局限于组织、器官或分离细胞中的特定组构(organization)。这种细胞可以是独特类型的细胞或不同类型细胞的群组，例如培养的细胞系、原代细胞和分裂细胞。在本发明的背景下，术语“宿主细胞”更具体地指真核细胞，尤其是哺乳动物(例如人类或非人类)细胞以及指能够产生本发明的PCPV病毒的细胞(例如，生产者细胞)。该术语还包括能够成为或曾经是本文所述病毒的受体的细胞以及这些细胞的后代。
术语“病毒”、“病毒颗粒”和“病毒粒体(virion)”可互换使用，并应广义地理解为意指包含野生型病毒基因组的至少一个元件(其可被包装到病毒颗粒中(也称为病毒载体)或包装成病毒颗粒本身)的媒剂。通常，病毒包含被包装到病毒衣壳中的DNA或RNA病毒基因组，如果是包膜病毒，则包括脂质和其他成分(例如，宿主细胞膜等)。本发明包括野生型和工程化的病毒。如上所示，术语“病毒”等应当广义地理解为包括病毒载体(例如，DNA病毒载体)以及由此产生的病毒颗粒。术语“传染的”是指病毒感染并进入到宿主细胞或对象的能力。
术语“天然存在的”、“天然”或“野生型”用于描述能在自然界中发现的不同于人工制造的生物分子或生物体。例如，天然存在的、天然的或野生型的病毒是指能从自然界的来源中分离出来或得自特定保藏(例如ECCAC、ATCC、CNCM等)的病毒。在实验室里被人为故意修饰的生物分子或生物体不是天然存在的。非天然存在的病毒的代表性实例(尤其)包括：通过在病毒基因组中插入一个或多个感兴趣的核酸而工程化的重组病毒和/或由病毒基因组中的一个或多个修饰(例如，病毒基因的全部或部分缺失)而产生的缺损病毒。
术语“得自”、“来源于”或“起源”是用来识别组分(如多肽、核酸分子、病毒等)的原始来源，但不是为了限制制造组分的方法，制造组分的方法可以是例如通过化学合成、同源重组、重组方式或任何其他方式。
本文所使用的术语“治疗”(以及治疗的任何形式例如“treating”、“treat”)包括预防(例如，在具有病理状况风险的对象中的预防措施)和/或治疗(例如，在被诊断为具有病理状况的对象中)，任选地与传统治疗方式联合。治疗的结果是减缓、治愈、改善或控制目标病理状况的进展。例如，如果对象在单独或联合地施用本文所述的PCPV后表现出临床状态得到可观察的改善，那么该患者的癌症就成功地得到了治疗。
本文所使用的术语“施用”(或者施用的任何形式例如“administered”)是指向对象递送治疗剂，诸如本文所述的PCPV。
术语“对象”通常是指需要或可能获益于本发明的任何产品和方法的生物体。通常，对象是哺乳动物，尤其是选自家养动物、农场动物、运动动物和灵长类动物的哺乳动物。优选地，对象是被诊断患有病理性疾病(例如，癌症)或有患病理性疾病(例如，癌症)风险的人。术语“对象”和“患者”在指代人类生物体时可以互换使用，包括男性和女性。待治疗的对象可以是新生儿、婴儿、少年、成年人或老年人。
假牛痘病毒
在第一方面，本发明提供一种假牛痘病毒(PCPV)，其包含插入在其基因组中的至少一种外来核酸。在一个实施方案中，所述PCPV用于治疗疾病诸如下文所述的增生性或感染性疾病的目的。
术语“假牛痘病毒”或“PCPV”在本文中根据其在病毒学中的普通意义而使用，是指在其宿主的细胞质中复制并属于副痘病毒属(Parapoxvirus genus)的痘病毒科(Poxviridae family)成员。PCPV具有线性双链DNA基因组，通常为130-150kb。本发明包括天然存在形式的假牛痘病毒的任何株以及出于各种目的(包括本文所述的那些目的)被修饰的其变体。
副痘病毒属包括一系列不同的种，包括绵羊副痘病毒(ORFV)、假牛痘病毒(PCPV)和牛丘疹状口炎病毒(BPSV)，并且本领域对每个种中的不同株进行了描述，同时公开了全部或部分基因组序列；例如，ORFV的01701、NZ2、NZ7、IA82、F07.821R、F09.1160S和SA00株以及牛丘疹状口炎病毒的AR02和V660株。用于本文的合适PCPV株的代表性实例包括但不限于：YG2828(Genbank登记号LC230119)，F07.801R(Genbank登记号JF773693)，F10.3081C(Genbank登记号JF773695)，F07.798R(Genbank登记号JF773692)，F99.177C(Genbank登记号AY453678)，IT1303/05(Genbank登记号JF800906)，F00.120R(Genbank登记号GQ329669；Tikkanen et al.,2004,J.Gen.Virol.85:1413-8)以及TJS(也称为VR634；Genbank登记号GQ329670；Friedman-Kien et al.,1963,Science 140:1335-6；以保藏号VR634在ATCC可得)。这些株可能彼此具有形态、结构和/或遗传差异，例如在ITR长度、预测基因数量和/或富含G C含量方面(参见例如，Hautaniemi et al.,2010,J.Gen.Virol.91:1560-76)。
在本发明的背景下，优选倾向于PCPV种。在优选实施方案中，本发明的PCPV病毒得自由ATCC编号ATCC VR-634TM确认的野生型TJS株或者有相同或相似名称的病毒株或其功能片段和变体。优选地，这种变体在核苷酸或氨基酸水平上与野生型TJS假牛痘病毒基因组中的至少一个10kb的节段(例如，10kb的连续序列)保持至少75％的相同性。
本发明背景下适当的示例性修饰包括但不限于：出于与野生型假牛痘病毒(例如，TJS株)相比时调节(例如，增加或减少)一个或多个病毒基因的表达或病毒感染性或提高其治疗功效(例如，提高PCPV病毒相对于健康细胞在病变细胞中差异表达的能力)的目的而在PCPV基因组内进行的一个或多个核苷酸的插入、取代和/或缺失，或者插入一个或多个治疗感兴趣的(therapeutic interest)的外来核酸或产生含有具有得自不同病毒来源的PCPV基因组片段的(一个或多个)PCPV基因组片段的嵌合病毒。
在一个优选实施方案中，本发明的PCPV包含在其基因组中插入的至少一种外来核酸(例如，产生重组PCPV病毒)。可选地，或者联合地，PCPV可以进一步对于PCPV基因组编码的病毒功能(例如，非必需病毒功能)是缺损的，优选对于所述外来核酸的(一个或多个)插入位点处编码的病毒基因功能是缺损的。
重组PCPV
结合本发明的病毒本文所使用的术语“重组”是指通过引入至少一种外来核酸(也称为重组基因或核酸)，特别是如本文所述治疗感兴趣的核酸而修饰过的病毒。在本发明的背景下，插入到PCPV基因组中的“外来核酸”在天然存在的PCPV基因组中未被发现或表达。然而，外来核酸可以与被引入重组PCPV的对象同源或异源。更具体地，它可以是人类来源或者不是人类来源(例如，细菌、酵母或PCPV之外的病毒来源)。有利的是，所述外来核酸编码多肽或者所述外来核酸是能够至少部分(通过杂交)与存在于病变细胞中的互补细胞核酸(例如，DNA、RNA、miRNA)结合的核酸序列，其目的是抑制与所述疾病有关的基因。多肽被理解为多核苷酸的任何翻译产物，不论大小，也不论是否糖基化，并且包括肽和蛋白质。这种外来核酸可以是天然基因或其部分(例如，cDNA)，或通过突变、缺失、取代和/或添加一个或多个核苷酸而获得的任何变体。
在优选实施方案中，所述外来核酸编码在当适当地施用于对象时能够提供治疗或预防活性的多肽(即，治疗感兴趣的多肽)，从而对待治疗的病理状况的过程或症状产生有益效果。可以设想大量治疗感兴趣的多肽。在一个实施方案中，外来核酸编码选自以下的多肽：补偿对象中缺损或缺陷的蛋白质的多肽，通过毒性作用限制或从机体清除病变细胞的多肽(诸如自杀基因产物)；能够增强抗肿瘤功效的多肽(例如，武装基因产物)；以及能诱导或活化免疫应答的多肽(例如，免疫刺激性多肽和抗原性多肽)。在本发明的背景下编码可检测的基因产物的外来核酸也是可用的。
免疫刺激性多肽
如本文所用的，术语“免疫刺激性多肽”是指具有以特异性或非特异性方式刺激免疫系统的能力的多肽。本领域已知大量因其能力发挥免疫刺激作用的多肽。本发明的背景下合适的免疫刺激性蛋白的实例包括但不限于：细胞因子，特别优选白细胞介素(例如，IL-2、IL-6、IL-12、IL-15、IL-24)，趋化因子(例如，CXCL10、CXCL9、CXCL11)，干扰素(例如，IFNα、IFNβ、IFNγ)，肿瘤坏死因子(TNF)，集落刺激因子(例如，GM-CSF、C-CSF、M-CSF……)，APC(表示抗原递呈细胞)-外露蛋白(例如，B7.1、B7.2等)，具有抗血管生成作用的多肽(例如，血管内皮生长因子抑制剂诸如贝伐珠单抗(bevacizumab)或雷珠单抗(ranibizumab))，以及影响细胞表面受体调节的多肽诸如免疫检查点的激动剂或拮抗剂(例如，针对PD1或其配体的抗体(例如，抗PD-L1)、CTLA4、LAG3、OX40等)。在优选实施方案中，免疫刺激性多肽是白细胞介素或集落刺激因子(例如，GM-CSF)或激动剂OX40针对性抗体。
抗原性多肽
如实施例部分所述，PCPV可刺激被注射对象的先天(非特异性)免疫。因此，将这种效应与抗原性多肽的表达结合起来可以提供一种既能刺激先天免疫应答又能刺激特异性免疫应答的病毒。这对于获得有效的抗癌应答和提供针对特定病原体的保护的疫苗接种目的非常重要。这种作用可持续数周。
术语“抗原性”是指在引入了编码具备抗原性的多肽的重组PCPV的对象中诱导或刺激可测量的免疫应答的能力。针对由所述重组PCPV表达的抗原性多肽的刺激或诱导的免疫应答可以是体液和/或细胞的(例如，产生参与效应免疫细胞活化的抗体、细胞因子和/或趋化因子)。所刺激或诱导的免疫应答通常有助于在所施用的对象中的保护作用。本领域可提供多种直接或间接生物试验来评估多肽在体内(动物或人类对象)或体外(例如，在生物样品中)的抗原性性质。例如，特定抗原刺激先天性免疫的能力可通过例如测量NK/NKT细胞(例如，活化的代表性和水平)以及IFN相关细胞因子和/或趋化因子产生级联反应、TLR的活化和其他先天性免疫标志物来进行(Scott-Algara et al.,2010PLOS One 5(1),e8761；Zhou et al.,2006,Blood 107,2461-2469；Chan,2008,Eur.J.Immunol.38,2964-2968)。如本文所述，特定抗原刺激细胞介导的免疫应答的能力可以例如通过以下来进行：使用常规生物试验对活化的T细胞(包括衍生自CD4+和CD8+T细胞的那些)产生的细胞因子进行定量(例如，通过ELISpot、通过多参数流式细胞术、ICS、通过使用多重技术或ELISA进行细胞因子谱分析来对T细胞进行表征和/或定量)，通过测定T细胞的增殖能力(例如，通过[3H]胸腺嘧啶核苷掺入试验进行T细胞增殖测定)、通过测定致敏对象中抗原特异性T淋巴细胞的细胞毒性能力或通过流式细胞术和通过免疫适当的动物模型鉴定淋巴细胞亚群。
可以预期术语抗原性多肽包括天然抗原以及片段(例如表位、免疫原性功能域等)及其变体，前提是该片段或变体能够成为免疫应答的靶标。本文中使用的优选抗原性多肽是肿瘤相关抗原和病原性生物体(细菌、病毒、寄生虫、真菌、类病毒或朊病毒)的抗原。选择一种或多种适合于治疗特定病理状况的抗原性多肽在本领域技术人员的能力范围内。
在一个实施方案中，由PCPV病毒编码的(一种或多种)抗原性多肽是与癌症相关联和/或用作癌症标志物的(一种或多种)癌抗原(也称为肿瘤相关抗原)。癌抗原包括各种类型的多肽，例如那些在健康细胞中通常沉默(即，不表达)的多肽，那些只在低水平或在某些分化阶段表达的多肽，那些暂时表达的多肽诸如胚胎抗原和胎儿抗原，以及那些细胞基因诸如癌基因(例如，活化的ras癌基因)、原癌基因(例如，ErbB家族)突变产生的多肽，或由于染色体易位产生的蛋白质。
癌抗原的一些非限制性实例包括但不限于：MART-1/Melan-A，gp100，二肽基肽酶IV(DPPIV)，腺苷脱氨酶结合蛋白(ADAbp)，亲环素b，结直肠相关抗原(CRC)-C017-1A/GA733，癌胚抗原(CEA)及其免疫原性表位CAP-1和CAP-2，etv6，aml1，前列腺特异性抗原(PSA)及其免疫原性表位PSA-1、PSA-2和PSA-3，前列腺特异性膜抗原(PSMA)，T细胞受体/CD3ζ链，肿瘤抗原MAGE家族(例如，MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-Xp2(MAGE-B2)、MAGE-Xp3(MAGE-B3)、MAGE-Xp4(MAGE-B4)、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-C4、MAGE-C5)，肿瘤抗原GAGE家族(例如，GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、GAGE-9)，BAGE，RAGE，LAGE-1，NAG，GnT-V，MUM-1，CDK4，酪氨酸酶，p53，MUC家族(例如，MUC1、MUC16等；参见例如US6,054,438；WO98/04727；或WO98/37095)，HER2/neu，p21ras，RCAS1，甲胎蛋白，E-钙粘素，α-连环蛋白，β连环蛋白和γ-连环蛋白，p120ctn，gp100.sup.Pmel117，PRAME，NY-ESO-1，cdc27，腺瘤性结肠息肉蛋白(APC)，胞衬蛋白，连接蛋白37，Ig-独特型，p15，gp75，GM2和GD2神经节苷脂，癌抗原Smad家族脑糖原磷酸化酶，SSX-1，SSX-2(HOM-MEL-40)，SSX-1，SSX-4，SSX-5，SCP-1和CT-7，以及c-erbB-2。
癌抗原还可以包括由能够在对象(尤其是慢性感染的对象)中诱导恶性状况的病原性生物体编码的抗原，例如RNA和DNA肿瘤病毒(例如，HPV、HCV、HBV、EBV等)和细菌(例如，幽门螺杆菌(Helicobacter pilon))。
在本发明中使用的病毒抗原性多肽包括例如来自以下的抗原：肝炎病毒A、B、C、D或E，免疫缺陷病毒(例如，HIV)，疱疹病毒(HSV)，巨细胞病毒，水痘带状疱疹，乳头状瘤病毒(HPV)，Epstein Barr病毒(EBV)，流感病毒，副流感病毒，腺病毒，柯萨奇病毒，细小核糖核酸病毒(picorna virus)，轮状病毒，呼吸道合胞病毒，痘病毒，鼻病毒，风疹病毒，papovirus，腮腺炎病毒，麻疹病毒。HIV抗原的一些非限制性实例包括gp120 gp40、gp160、p24、gag、pol、env、vif、vpr、vpu、tat、rev、nef tat、nef。人疱疹病毒抗原的一些非限制性实例包括gH、gL、gM、gB、gC、gK、gE或gD或者立即早期蛋白诸如来自HSV1或HSV2的ICP27、ICP47、ICP4、ICP36。巨细胞病毒抗原的一些非限制性实例包括gB。来自Epstein Barr病毒(EBV)的一些非限制性实例包括gp350和EBV编码的核抗原(EBNA)-1。水痘-带状疱疹病毒抗原的一些非限制性实例包括gp1、11、111以及IE63。丙型肝炎病毒(HCV)抗原的一些非限制性实例包括E1或E2 env蛋白、核心蛋白、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b。乙型肝炎病毒(HBV)抗原的一些非限制性实例包括聚合酶、核心和env多肽(例如，WO2013/007772中描述的HBV抗原组合)。人类乳头状瘤病毒(HPV)抗原的一些非限制性实例包括L1、L2、E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7。根据本发明，也可以使用衍生自其他病毒病原体的抗原，例如呼吸道合胞病毒(例如F和G蛋白)、副流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、黄病毒属(例如黄热病病毒、登革热病毒、蜱传脑炎病毒、日本脑炎病毒)和流感病毒细胞(如HA、NP、NA或M蛋白)。在优选实施方案中，本发明的PCPV被工程化成编码并表达HPV-16或HPV-18E6和/或E7抗原。
细菌抗原性多肽包括例如来自引起TB和麻疯病的分枝杆菌属(Mycobacteria)、肺炎球菌(pneumocci)、需氧革兰氏阴性杆菌(bacilli)、支原体属(mycoplasma)、葡萄球菌(staphyloccocus)、链球菌属(streptococcus)、沙门氏菌(salmonellae)、衣原体科(chlamydiae)、奈瑟菌(neisseriae)等的抗原。
寄生虫抗原性多肽包括例如来自疟疾(malaria)、利什曼病(leishmaniasis)、锥虫病(trypanosomiasis)、弓形体病(toxoplasmosis)、血吸虫病(schistosomiasis)和丝虫病(filariasis)的抗原。
通过本发明的PCPV来表达的优选抗原性多肽为
·在各种上皮性癌症中异常糖基化和过表达的MUC-1抗原；
·HPV-16E7抗原，尤其是其非致癌变体。
·HBV抗原，特别是包含HBV聚合酶、HBV核心蛋白和HBsAg免疫原性结构域的融合体(例如，如WO2013/007772中所描述的)
自杀基因产物
术语“自杀基因产物”是指能将药物前体(也称为“前药”)转化为细胞毒性化合物的多肽。下表中公开了自杀基因产物和相应的前药的实例：
表1
Figure BDA0002762298770000171
Figure BDA0002762298770000181
期望地，本发明的PCPV在其基因组中携带编码至少具有胞嘧啶脱氨酶(CDase)活性的多肽的自杀基因。在原核生物和低等真核生物(不存在于哺乳动物中)中，CDase参与嘧啶代谢途径，其中外源胞嘧啶通过水解脱氨作用转化为尿嘧啶。CDase还使胞嘧啶的类似物即5-氟胞嘧啶(5-FC)脱氨基，从而形成5-氟尿嘧啶(5-FU)，这是一种本身具有细胞毒性的化合物，但在通过尿嘧啶磷酸核糖转移酶(UPRTase)的作用转化为5-氟-UMP(5-FUMP)时，该化合物的毒性更大。
CDase和UPRTase编码核酸可以得自任何原核生物和低等真核生物。基因序列和编码酶已经发表，并可在专门的数据库中获得，如SWISSPROT EMBL、Genbank、Medline等)。在本发明的背景下，优选酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CDase(FCY1基因)和/或UPRTase(FUR1基因)(Kern et al.,1990,Gene,88:149-57)。这些基因的功能性变体也可以使用。此类变体优选地保留与天然对应物的氨基酸序列至少75％相同性的程度。N-末端截短的UPRTase功能性类似物在本发明的背景下特别有用，因为其表现出比天然酶更高的UPRTase活性的能力(例如，EP998568中所描述的缺失了天然蛋白直至第二个甲硫氨酸残基的前35个残基)。还优选通过融合两种酶活性而工程化的同时具有CDase和UPRTase活性的多肽(参见例如WO96/16183、EP998568以及WO2005/07857中描述的FCY1::FUR1和FCY1::FUR1[Delta]105(FCU1)以及FCU1-8多肽)。特别令人感兴趣的是编码包含WO2009/065546以序列标识符SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列的多肽FCU1自杀基因(或FCY1::FUR1[Delta]105融合体)。
武装基因(Armement gene)产物
在本发明的背景下，可使用其它外来核酸来武装PCPV病毒，其目的是增强抗肿瘤功效。在一个实施方案中，武装基因产物选自以下：核苷池调节剂(nucleoside poolmodulators)(例如，胞苷脱氨酶，尤其是酵母胞苷脱氨酶(CDD1)或人胞苷脱氨酶(hCD)；参见EP16306831.5)；作用于代谢和免疫途径的多肽(例如，腺苷脱氨酶，尤其是人腺苷脱氨酶huADA1或huADA2；参见EP17306012.0)；作用于细胞凋亡途径的多肽；核酸内切酶(比如限制性内切酶，CRISPR/Cas9)，以及靶向-特异性RNA(例如，miRNA、shRNA、siRNA)。
可检测的基因产物
通常，这种多肽可通过光谱、光化学、生化、免疫化学、化学或其他物理手段检测到，因此可允许识别宿主细胞或对象内的重组PCPV。合适的可检测的基因产物的非限制性实例包括通过荧光手段可检测的mCherry、Emerald、萤火虫荧光素酶和绿色荧光蛋白(GFP及其增强版e-GFP)以及用比色法手段可检测的β-半乳糖苷酶。
本发明还包括表达如本文所述的两种或多种感兴趣的多肽的PCPV，例如至少两种抗原性多肽(例如，HPV-16E6和E7多肽)、至少一种抗原和一种细胞因子(例如，MUC1抗原和IL-2)、至少两种抗原和一种细胞因子(例如，HPV E6和E7抗原以及IL-2)等。
在本发明的背景下，本文中使用的编码的感兴趣的多肽可掺入有利于其通过本发明的PCPV表达以及它在对象中的治疗效果的结构特征；例如允许在PCPV基因组中促进克隆(潜在切割位点的修饰)、增强抗原性性质(糖基化位点的修饰)和/或改善MHCⅠ类和/或MHCⅡ类递呈(例如，膜锚定)的特征。如果天然多肽缺乏膜锚定序列和分泌序列(即，信号肽)，则可以通过将膜锚定序列和分泌序列掺入到感兴趣的多肽中来实现膜锚定。简而言之，信号肽通常包含15到35个基本上疏水的氨基酸，这些氨基酸随后被位于ER(内质网)的特异性内肽酶除去，得到成熟的多肽。跨膜肽在本质上也是高度疏水性的，并用于将多肽锚定在细胞膜内。可以在本发明的背景下使用的跨膜和/或信号肽的选择是广泛的。它们可以得自细胞或病毒多肽，例如免疫球蛋白、组织纤溶酶原活化剂、胰岛素、狂犬病糖蛋白、HIV病毒包膜糖蛋白或麻疹病毒F蛋白的那些，也可以是合成的。优选地，将分泌序列插入在起始翻译密码子下游的多肽的N端，而膜锚定序列插入在C端，优选紧靠终止密码子的上游。
(一种或多种)外来核酸的生成和表达
待由本发明的PCPV表达的(一种或多种)外来核酸可以通过本领域技术人员已知的多种方式容易地生成(例如，克隆、PCR扩增、DNA改组)。例如，可以使用技术人员可用的序列数据(例如出版物、专利申请文件、Genbank等)从任何可用来源(例如，本领域描述的生物材料、cDNA和基因组文库，或已知包括其的任何现有技术载体)中分离出这样的外来核酸，然后适当地插入在PCPV基因组中。或者，它们也可以在自动化工艺中通过化学合成来生成(例如，由重叠的合成寡核苷酸或合成基因组装而成)。优选地，这样的外来核酸得自cDNA并且不包含内含子序列。可以通过本领域技术人员已知的多种方法来生成(一种或多种)修饰，例如化学合成、定点诱变、PCR诱变等。
在本发明的背景下，可以对外来核酸进行优化以便在特定宿主细胞或对象中提供高水平表达。事实上已经观察到，生物体的密码子使用模式是高度非随机的，不同宿主之间密码子的使用可能有明显的差异。由于外来核酸可能来自原核生物(例如，细菌或病毒抗原)或低等真核生物来源(例如，自杀基因产物)，它可能具有与在高等真核细胞(如人类)中有效表达不相称的密码子使用模式。通常，密码子优化是通过用待治疗的对象中更常用的编码相同氨基酸的一个或多个密码子置换一个或多个与不常使用的密码子相对应的一个或多个“天然”密码子来进行。不需要将不常用密码子对应的所有天然密码子都置换，因为即使部分置换也可以增加表达。
为了进一步优化密码子使用，还可以通过对外来核酸进行额外修饰来提高表达。例如，可以对核酸序列进行修饰以防止在集中区域出现稀有非最佳密码子的聚集，和/或抑制或修饰预期会对表达水平产生负面影响的“负面”序列元件。这种负面序列元件包括但不限于GC含量非常高(>80％)或非常低(<30％)的区域；富含AT或富含GC序列的段(stretch)；不稳定的正向或反向重复序列；R A二级结构；和/或内部隐匿调节元件，诸如内部TATA盒、chi位点、核糖体进入位点和/或剪接供体/受体位点。
此外，当需要通过本发明的PCPV来表达同源的外来核酸时，可以对至少一个同源序列(其至少一部分)在全长核酸或其(一个或多个)部分上进行简并，以减少序列相同性。确实可取的做法是，将显示高度(例如，至少70％)序列相同性的序列部分进行简并以避免生产过程中的同源重组问题，本领域技术人员能够通过序列比对来识别这些部分。WO2008/092854中可以找到适用于得自不同血清型的HPV抗原(例如，HPV-16和HPV-18E6和/或E7抗原)的合适的序列简并的实例。
在一个实施方案中，待插入并由本发明的PCPV表达的(一种或多种)外来核酸可操作地连接到合适的用于在期望的宿主细胞或对象中表达的调节元件。
如本文所使用的，术语”调节元件“或”调节序列“是指允许、有助于或调节(一种或多种)核酸在给定宿主细胞或对象中表达的任何元件，包括(一种或多种)核酸或其衍生物(即mRNA)的复制、重复、转录、剪接、翻译、稳定性和/或转运。如本文所使用的，“可操作地连接”意思是指被连接的元件被布置成在其预期目的下协同工作。例如，如果启动子至少在允许的宿主细胞中从转录起始影响转录到所述核酸的终止子，则将启动子可操作地连接所述核酸。
本领域技术人员将认识到，调节序列的选择可取决于以下因素：诸如(一种或多种)核酸本身、所需的表达水平等。启动子具有特殊重要性。在本发明的背景下，它可以组成型地指导外来核酸在多种类型细胞中的表达，或特异于某些类型细胞或组织，或根据病毒周期的阶段(如晚期、中期或早期)进行调节。为了优化重组PCPV的生产和规避所表达的(一种或多种)多肽的潜在毒性，本领域技术人员也可以使用在生产步骤中因特定事件或外源因素(例如，特定成分、温度等)而受到抑制的启动子。
痘病毒启动子特别适合用于在重组PCPV中进行表达。在一个实施方案中，插入PCPV基因组中的外来核酸被置于痘病毒启动子，优选痘苗病毒启动子，更优选选自以下的启动子、合成的启动子(诸如Chakrabarti et al.中所描述的那些启动子(1997,Biotechniques 23:1094-7；Hammond et al,1997,J.Virol Methods 66:135-8；以及Kumarand Boyle,1990,Virology 179:151-8))以及早期/晚期嵌合启动子的控制之下：7.5K，H5R，11K7.5(Erbs et al.,2008,Cancer Gene Ther.15(1):18-28)，SE，TK，pB2R，p28，p11和K1L启动子。
本领域技术人员将认识到，控制至少一种外来核酸表达的调节元件可进一步包括用于以下的额外元件：正确起始、调节和/或终止转录(例如，polyA转录终止序列)、mRNA转运(例如，核定位序列)、翻译(例如，起始子Met、三联先导序列等)、加工(例如，信号肽、跨膜锚定序列等)和纯化步骤(如标签)。
在PCPV基因组中插入和重组PCPV的生成
通过常规方法(或者使用适当的限制性内切酶，或者优选通过同源重组)来完成在PCPV基因组中插入至少一种外来核酸(装配有适当的调节元件)。
在另一方面，本发明提供一种通过在包含外来核酸(具有其调节元件)的转移质粒与PCPV基因组之间的同源重组来生成本发明的重组PCPV的方法，该外来核酸的5’和3’侧翼有分别存在于插入位点上游和下游的PCPV序列。在一个实施方案中，所述方法包含生成所述转移质粒的步骤(例如，通过常规的分子生物学方法)和将所述转移质粒引入到合适宿主细胞的步骤，尤其是与包含转移质粒中存在的侧翼序列的PCPV病毒(例如，野生型PCPV病毒)一起引入。优选地，通过转染将转移质粒引入到宿主细胞，通过感染将PCPV病毒引入到宿主细胞。
每个侧翼PCPV序列的大小可能不同。在待插入的外来核酸的每侧通常为至少100bp且至多1500bp，优选在外来核酸的每侧约150至500bp，有利地为180至450bp、优选200至400bp、更优选250至350bp，特别优选约300bp。
可在PCPV基因组中考虑不同的插入位点，包括但不限于在病毒基因(优选非必需病毒基因)中，在基因间隔区中，在PCPV基因组中不编码基因产物的部分中，或在重复基因座(在天然病毒基因组中出现2个或多个拷贝的基因或基因座)中。根据本发明的方法将(一种或多种)外来核酸插入PCPV基因组后，插入位点处的病毒基因座可以至少部分地被缺失。在一个实施方案中，该缺失或部分缺失可导致抑制由所缺失的PCPV序列编码的病毒基因产物的表达，从而导致所述病毒功能的缺损PCPV病毒。
US 6,365,393中给出了插入位点的实例。在优选的实施方案中，(一种或多种)外来核酸被插入在PCPV基因组的非必需和重复基因座中，优选VEGF基因座(Rziha et al.,2000,J.Biotechnol.83(1-2):137-145)。需要注意的是，VEGF基因在PCPV基因组中存在2个拷贝，并且本发明设想同时在两个VEGF基因座或仅一个基因座(保留一个完整的拷贝以提供病毒功能)进行插入。优选地，外来核酸插入到两个VEGF基因座中，导致两个拷贝的外来核酸插入PCPV基因组中。
在某些实施方案中，本发明的方法进一步使用选择基因和/或可检测的基因以便于鉴定重组PCPV。在优选实施方案中，转移质粒还包括优选为允许在选择性培养基(例如，存在霉酚酸、黄嘌呤和次黄嘌呤)中生长的GPT基因(编码鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)的选择标志物，或编码可检测的基因产物诸如GFP、e-GFP或mCherry的可检测的基因。在一个实施方案中，在能够在所述选择或可检测的基因中提供双链断裂的内切核酸酶的存在下将转移质粒引入宿主细胞。所述内切核酸酶可以是蛋白质的形式或者是由表达载体表达的。在实施例部分中示出了代表性实施方案。
允许生成重组PCPV的同源重组优选地在适当的宿主细胞中进行(例如，牛鼻甲骨(Bovine Turbinate)细胞)。
特别优选的实施方案是用于生成以下的方法：
·PCPV病毒，其包含在一个或两个VEGF基因座插入有优选在早期/晚期痘苗pH5R启动子转录控制下的编码人MUC-1抗原的核酸(例如，如WO92/07000和US 5,861,381中所描述的)；或者
·PCPV病毒，其包含在一个或两个VEGF基因座插入有优选在早期/晚期痘苗p7.5启动子转录控制下的编码膜锚定的HPV-16非致癌E7抗原的核酸(如WO99/03885所描述)。
PCPV病毒的生产
在另一方面，本发明涉及用于扩增本发明的PCPV的方法。优选地，所述方法包含以下步骤：a)制备生产者细胞系，b)转染或感染所制备的生产者细胞系，c)在合适的条件下培养转染的或感染的生产者细胞系以允许产生病毒(例如，感染性病毒颗粒)，d)从所述生产者细胞系的培养物中回收所产生的病毒，以及任选地e)纯化所述回收的病毒。
在一个实施方案中，生产者细胞是哺乳动物(例如，人类或非人类)细胞，优选是HeLa细胞(例如，ATCC-CRM-CCL-2TM或者ATCC-CCL-2.2TM)。
生产者细胞优选在适当的培养基中培养，如有需要，该培养基中可补充或不补充血清和/或适当的(一种或多种)生长因子(例如，化学成分确定的培养基，优选不含动物源或人源产品)。本领域技术人员可根据生产者细胞容易地选择适当的培养基。这种培养基可以商购获得。生产者细胞优选在包含+30℃至+38℃之间的温度(更优选在大约37℃)在感染前培养1至8天。如果需要的话，为了增加细胞总数，可以进行1-8天的若干次传代。
在步骤b)，用本文所述的PCPV病毒在适当的条件下用适当的感染复数(MOI)感染生产者细胞以允许对生产者细胞的生产性感染。为了说明性的目的，适当的MOI范围为10-3至50，特别优选的MOI包含0.01至5。感染步骤是在与用于培养生产者细胞的培养基相同或不同的培养基中进行的。
在步骤c)，接下来在本领域技术人员熟知的适当条件下培养受感染的生产者细胞，直到产生子代病毒(例如，传染性病毒颗粒)。受感染的生产者细胞的培养还优选在与用于培养生产者细胞和用于感染步骤的培养基相同或不同的培养基中进行，在+32℃至+37℃之间的温度，持续1至5天。
在步骤d)，从培养上清液和/或生产者细胞中收集步骤c)中产生的病毒。从生产者细胞中回收可能需要允许破坏生产者细胞膜以允许病毒释放的步骤。可通过本领域技术人员熟知的各种技术来对生产者细胞膜进行破坏，包括但不限于：冷冻/解冻、低张度裂解、超声处理、微流体化、高剪切(也称为高速)均质化或高压均质化。
然后可以使用本领域熟知的纯化步骤进一步纯化病毒载体。可以设想各种纯化步骤，包括澄清、酶处理(例如，内切酶、蛋白酶等)、色谱和过滤步骤。现有技术描述了适当的方法(例如，在WO2007/147528中)。
药物组合物
在一方面，提供一种组合物，其包含治疗有效量的本文所述的PCPV和药学上可接受的媒剂。在实施方案中，PCPV是重组的，包含插入在其基因组中的一种或多种外来核酸(具有如前所述的合适的调节元件)，尤其是编码抗原性多肽诸如癌症抗原、来源于病原性生物体的抗原和/或免疫刺激性多肽等的一种或多种外来核酸。在具体实施方案中，该组合物可包含PCPV感染后生成的外泌体。
“治疗有效量”对应于足以产生有益结果的PCPV的量。这种治疗有效量可以以各种参数的函数变化，诸如施用方式；对象的年龄和体重；症状的性质和程度；对象对治疗的应答能力，并行治疗的种类；治疗的频率和/或预防或治疗的需求等。
当涉及“预防性”用途时，该组合物以足以预防病理状况或延迟病理状况的发作和/或建立和/或复发的剂量施用，尤其是在有风险的对象中。对于“治疗性”用途，将该组合物施用于被诊断为患有疾病或病理状况的个体，其目的在于治疗该疾病或病理状况，任选地与一种或多种常规治疗方式相结合。
术语“药学上可接受的媒剂”意欲包括与在哺乳动物特别是人类对象中施用时相容的任何和所有载剂、溶剂、稀释剂、赋形剂、佐剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、吸收剂等。药学上可接受的媒剂的非限制性实例包括水、NaCl、生理盐水溶液、乳酸林格氏液、糖类溶液(例如，葡萄糖、海藻糖、蔗糖、右旋糖等)、醇、油、明胶、碳水化合物(例如乳糖、直链淀粉或淀粉)、脂肪酸酯、羟甲基纤维素等，也可以使用其他水性生理平衡的盐溶液(例如，参见最新版本的Remington:The Science and Practice of Pharmacy,A.Gennaro,Lippincott,Williams&Wilkins)。
在一个实施方案中，将本发明的PCPV组合物进行适当配制以确保其在冷冻(例如，-70℃，-20℃)、冷藏(例如，4℃)或环境温度(例如，20-25℃)的温度在制造和长期储存(即至少6个月，优选至少两年)的条件下的稳定性。此类制剂通常包括液体载剂，例如水溶液。
有利的是，对本文所用的制剂进行适当缓冲以供人类使用，优选在生理pH值或弱碱性的pH值(例如，约pH7到约pH9，特别优选包含7到8之间的pH，尤其是接近7.5)。合适的缓冲剂包括但不限于：TRIS(三(羟基甲基)甲基胺)，TRIS-HCl(三(羟基甲基)甲基胺-HCl)，HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)，磷酸盐缓冲剂(例如，PBS)，ACES(N-(2-乙酰氨基)-氨基乙磺酸)，PIPES(哌嗪-N，N′-双(2-乙磺酸)，MOPSO(3-(N-吗啉)-2-羟基丙磺酸)，MOPS(3-(N-吗啉代)丙磺酸)，TES(2-{[三(羟甲基)甲基]氨基}乙磺酸)，DIPSO(3-[双(2-羟乙基)氨基]-2-羟基丙烷-1-磺酸)、MOBS(4-(N-吗啉代)丁磺酸)、TAPSO(3-[N-三(羟甲基)甲胺基]-2-羟基丙磺酸)、HEPPSO(4-(2-羟乙基)-哌嗪-1-(2-羟基)-丙磺酸，POPSO(2-羟基-3-[4-(2-羟基-3-磺丙基)哌嗪-1-基]丙烷-1-磺酸)、TEA(三乙醇胺)、EPPS(N-(2-羟乙基)-哌嗪-N'-3-丙磺酸)和TRICINE(N-[三(羟甲基)-甲基]-甘氨酸)。优选地，所述缓冲剂选自TRIS-HCl、TRIS、Tricine、HEPES和包含Na2HPO4与KH2PO4的混合物或Na2HPO4与NaH2PO4的混合物的磷酸盐缓冲剂。所述缓冲剂(尤其是上述缓冲剂，尤其是TRIS-HCl)优选以10-50mM的浓度存在。在这种制剂中还包括单价盐以确保适当的渗透压可能是有益的。所述单价盐可特别地选自NaCl和KCl，优选地，所述单价盐为NaCl，优选浓度为10至500mM。
该制剂还可包括冷冻保护剂，以在低储存温度保护该基于病毒的组合物。合适的冷冻保护剂包括但不限于蔗糖(sucrose)(或蔗糖(saccharose))、海藻糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇、山梨醇和甘油，优选浓度为0.5至20％(重量(以g计)/体积(以L计)，称为w/v)。例如，蔗糖优选以5％到15％(w/v)的浓度存在。
PCPV组合物，尤其是其液体组合物，可进一步包含药学上可接受的螯合剂，尤其是螯合阳离子以改善稳定性的物质。药学上可接受的螯合剂可特别地选自乙二胺四乙酸(EDTA)、1,2-双(邻氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸(BAPTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)、二巯基丁二酸(DMSA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)和2,3-二巯基-1-丙磺酸(DMPS)。药学上可接受的螯合剂优选以至少50μM的浓度存在，特别优选浓度为50至1000μM。优选地，所述药学上可接受的螯合剂是EDTA，其以接近150μM的浓度存在。
可进一步存在额外化合物以增加PCPV组合物的稳定性。此类额外的化合物包括但不限于：C2-C3醇(理想浓度为0.05至5％(体积/体积或v/v))、谷氨酸钠(理想浓度低于10mM)、非离子表面活性剂(US7,456,009，US2007-0161085)，诸如低于0.1％的低浓度的吐温80(也称为聚山梨酯80)。二价盐，如MgCl2或CaCl2，已被发现可以诱导各种生物制品在液态的稳定(参见Evans et al.2004,J Pharm Sci.93:2458-75and US7,456,009)。已经发现氨基酸，特别是组氨酸、精氨酸或甲硫氨酸在液态下诱导各种病毒的稳定(参见WO2016/087457)。
高分子量聚合物诸如葡聚糖或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的存在特别适合于冻干组合物，通常通过涉及真空干燥和冷冻干燥的工艺获得，并且这些聚合物的存在有助于在冷冻干燥期间形成饼料(参见例如WO03/053463；WO2006/085082；WO2007/056847；WO2008/114021和WO2014/053571)。
根据本发明，PCPV组合物的制剂也可适应于施用模式，以确保在体内的适当分布或延迟释放。可使用可生物降解的、可生物相容的聚合物，例如乙烯-醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、多正酯类、聚乳酸和聚乙二醇。(参见例如J.R.Robinson in“Sustainedand Controlled Release Drug Delivery Systems”,ed.,Marcel Dekker,Inc.,NewYork,1978；WO01/23001；WO2006/93924；WO2009/53937)。
为了说明性的目的，包含5％(w/v)蔗糖、10mM谷氨酸钠和50mM NaCl的Tris缓冲制剂(Tris-HCl，pH8)适于在-20℃至5℃保存本发明的组合物。
剂量
本发明的组合物可以以单个剂量配制，根据所使用的定量技术，每个剂量含有大约103至1012vp(病毒颗粒)、iu(感染单位)或pfu(嗜斑形成单位)的所限定的PCPV。可通过常规的滴定技术测定样品中存在的所限定的PCPV的数量，例如，通过计数感染容许性细胞(例如，HeLa细胞)后的嗜斑数目以获得嗜斑形成单位(pfu)滴度，通过测量A260吸光度(vp滴度)，或仍然通过定量免疫荧光，例如使用抗病毒抗体(iu滴度)。医师可根据相关因素对为一个对象或一组对象调整适当剂量所需的计算进行进一步细化。作为一般指导，适合于PCPV组合物的单个剂量包括约103至约1012pfu，有利地为约104pfu至约1011pfu，优选约105pfu至约1010pfu；更优选为约106pfu至约109pfu，特别优选为约107、5x107、108或5x108pfu的单个剂量。
施用
任何常规的施用途径在本发明的背景下都是适用的，包括非经肠道、表面(topical)或粘膜途径。非经肠道途径用于以注射或输注施用，包括全身和局部途径。可用于施用PCPV组合物的非经肠道注射类型包括静脉内(进入静脉，例如供给肝脏的门静脉)、血管内(进入血管)、动脉内(进入动脉，例如肝动脉)、皮内(进入真皮)、皮下(皮肤之下)、肌内(进入肌肉)、腹膜内(进入腹膜)和瘤内(进入肿瘤或其附近)以及划痕。施用可以以单次推注剂量的形式，也可以是例如通过连续的灌注泵。黏膜施用包括但不限于口服/消化道、鼻内、气管内、肺内、阴道内或直肠内途径。也可使用经皮途径(例如贴片等)进行表面施用。优选地，PCPV组合物被配制用于静脉内、肌内、皮下或瘤内施用。
施用可使用常规注射器和针头(例如，Quadrafuse注射针头)或本领域现有的任何能够促进或改善病毒在对象中递送的化合物或装置(例如用于促进肌肉内施用的电穿孔)。另一种方法是使用无针注射装置(例如，Biojector TM装置)。也可考虑使用经皮贴片。
本发明的组合物适合用于单次施用或一系列施用。也可以通过休息期后重复的顺序施用周期来进行。每次施用间隔为3天到6个月(例如，24小时、48小时、72小时、每周、每两周、每月或每季度等)。间隔也可以是不规律的。在上述范围内，每次施用的剂量可变化。
PCPV组合物的治疗用途和治疗方法
在另一方面，本发明涉及本发明的重组假牛痘病毒(PCPV)或组合物(尤其是药物组合物)，其用作药物，特别是用于根据本文所述的方式治疗或预防由病原性生物体或不期望的细胞分裂引起的疾病或病理状况，以及一种治疗方法，该治疗方法包含以足以治疗或预防该疾病或病理状况的量向有需要的对象施用本发明的重组假牛痘病毒(PCPV)或组合物。本发明还涉及本发明的重组假牛痘病毒(PCPV)或组合物在制备用于根据本文所述的方式治疗或预防由病原性生物体或不期望的细胞分裂引起的疾病或病理状况的药物中的用途。本发明还涉及本发明的重组假牛痘病毒(PCPV)或组合物用于根据本文所述的方式治疗或预防由病原性生物体或不期望的细胞分裂引起的疾病或病理状况的用途。优选的治疗方案或治疗方法涉及2至6次每周施用、随后可能以3周间隔施用2至15次包含106至109pfu的所述PCPV组合物。
在优选实施方案中，待治疗的疾病或病理状况是增生性疾病。因此，本发明还涉及一种抑制肿瘤细胞生长的方法，包含将本发明的组合物施用于有需要的对象。在本发明的背景下，根据本发明的方法和用途旨在减缓、治愈、改善或控制所针对的疾病的发生或进展。
“疾病”(以及疾病的任何形式，诸如“病症”或“病理状况”等)通常特征在于可识别的症状。示例性疾病包括但不限于因感染病原性生物体(例如，细菌、寄生虫、病毒、真菌等)而引起的感染性疾病和涉及细胞异常增殖的增生性疾病。如本文所用，术语“增生性疾病”包括由不受控制的细胞生长和扩散引起的任何疾病或病理状况，包括癌症和一些心血管疾病(例如，血管壁平滑肌细胞增殖引起的再狭窄等)。术语“癌症”可与术语“肿瘤”、“恶性肿瘤”、“赘生物(neoplasm)”等中的任一个互换使用。这些术语意指包括任何类型的组织、器官或细胞、任何恶性阶段(例如从病变前到第四阶段)，并包括实体瘤、血源性肿瘤以及原发性和转移性癌症。
可使用本发明的组合物和方法进行治疗的癌症的代表性实例包括但不限于：癌，淋巴瘤，母细胞瘤，肉瘤，以及白血病，且更具体地为骨癌，胃肠道癌，肝癌，胰腺癌，胃癌，结直肠癌，食管癌，口咽癌，喉癌，涎腺癌，甲状腺癌，肺癌，头或颈部的癌，皮肤癌，鳞状细胞癌，黑素瘤，子宫癌，宫颈癌，子宫内膜癌，外阴癌，卵巢癌，乳腺癌，前列腺癌，内分泌系统癌症，软组织肉瘤，膀胱癌，肾癌，成胶质细胞瘤和中枢神经系统(CNS)的各种类型等。在一个实施方案中，根据本发明的方法和用途是用于治疗选自以下的癌症：肾癌(例如，透明细胞癌)，前列腺癌(例如，激素难治性前列腺腺癌)，乳腺癌(例如，转移性乳腺癌)，结直肠癌，肺癌(例如，非小细胞肺癌)，肝癌(例如，肝癌(hepatocarcinoma))，胃癌，胆管癌，子宫内膜癌，胰腺癌和卵巢癌以及过表达MUC1的癌症。优选实施方案涉及如本文所述编码MUC1抗原的PCPV用于治疗患有非小细胞肺癌(NSCL)的对象的用途，以及如本文所述编码HPV16 E7抗原的PCPV用于治疗患有HPV阳性癌症(例如，宫颈癌或头颈癌)的对象的用途。
可使用本发明的组合物和方法治疗的感染性疾病的代表性实例包括但不限于：a)病毒性疾病，例如由疱疹病毒(HSV1、HSV2或VZV)、乳头状瘤病毒(HPV)、引起天花或水痘的痘病毒、肠道病毒、逆转录病毒诸如引起艾滋病的HIV、巨细胞病毒、黄病毒(例如，引起日本脑炎、丙型肝炎、登革热和黄热病)、嗜肝性DNA病毒(例如，HBV)、正粘病毒(例如，流感病毒)、副粘病毒(例如，副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒和呼吸道合胞病毒(RSV))、冠状病毒(例如，SARS)、弹状病毒和轮状病毒导致的疾病；b)由细菌感染引起的疾病，例如大肠杆菌属(Escherichia)、肠杆菌属(Enterobacter)、沙门氏菌属(Salmonella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、志贺氏菌属(Shigella)、李斯特菌属(Listeria)、气杆菌属(Aerobacter)、螺旋杆菌属(Helicobacter)、克雷伯菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链球菌属(Streptococcus)、衣原体(Chlamydia)、支原体(Mycoplasma)、肺炎球菌属(Pneumococcus)、奈瑟菌属(Neisseria)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)、杆菌属(Bacillus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、弧菌属(Vibrio)、沙雷菌属(Serratia)，普罗维登氏菌属(Providencia)、色杆菌属(Chromobacterium)、布鲁氏菌属(Brucella)、耶尔森菌属(Yersinia)、嗜血杆菌属(Haemophilus)或博德特菌属(Bordetella)；以及c)真菌疾病，包括但不限于念珠菌病、曲菌病、组织胞浆菌病、隐球菌脑膜炎；以及d)寄生虫疾病，包括但不限于疟疾、卡氏肺孢子虫肺炎、利什曼病、隐孢子虫病、弓形虫病和锥虫感染。
通常，根据本文所述的方式施用之后，本发明的组合物向被治疗的对象提供治疗益处，其可通过可观察到的临床状态相对于基线状态或在未经治疗的情况下超过预期状态的改善来证明。临床状态的改善可以很容易地通过医师或其他熟练的医护人员使用的任何相关临床测量来进行评估。在本发明的背景下，治疗益处可以是短暂的(停止施用后的一个或几个月)或持续的(几个月或几年)。由于临床状态的自然过程可能相当地因对象而异，因此无需在每名接受治疗的对象中观察到治疗益处，而是在显著数量的对象中观察到(例如，可通过本领域已知的任何统计检验来确定两组之间在统计学上的显著差异，如Tukey参数检验、Kruskal-Wallis检验、根据Mann和Whitney的U检验、Student's t检验、Wilcoxon检验等)。
当本发明的方法或用途旨在治疗增生性疾病，特别是癌症时，治疗益处至少可通过以下而暂时证明：例如肿瘤数目减少；肿瘤大小缩小，转移的数目或程度减少，缓解期延长，病情稳定(即，不恶化)，疾病进展或严重程度延迟或减缓，存活延长，对标准治疗应答更好，生活质量提高，降低死亡率等。“治疗”也可以意味着延长对象的存活，超出了预期的不治疗时的存活。
当本发明的方法或用途旨在治疗感染性疾病时，治疗益处可通过以下来证明：例如被治疗的对象的血液、血浆或血清中量化的感染病原性生物体的数量的减少，和/或感染性疾病的稳定(即，不恶化)状况(例如，稳定通常与感染性疾病有关的状况，如炎症状态)，和/或特异性血清标志物水平的降低(例如，与通常在慢性丙型肝炎中观察到的肝不良状况有关的丙氨酸转氨酶(ALT)和/或天冬氨酸转氨酶(AST)的降低)，和/或与感染性疾病发生相关的任何抗原水平的降低，和/或针对病原性生物体的抗体水平的出现或改变，和/或被治疗对象对常规疗法(例如，抗生素)应答的改善，和/或与不接受组合物治疗时预期的存活相比存活延长。
适当的测量方法诸如血液检验、生物流体的分析和活检以及医学成像技术可用于评估临床益处。它们可以在施用前(基线)以及治疗期间和停止治疗后的不同时间点进行。作为一般指导，此类测量通常在医学实验室和医院进行评估，大量的试剂盒可商购获得(例如免疫测定、定量PCR测定)。
在另一方面，本发明的组合物用于或施用于引发或刺激和/或重定向被治疗对象中的免疫应答。因此，本发明还包括用于引发或刺激和/或重定向(例如针对肿瘤或感染的细胞的)免疫应答的方法，其包含根据本文所述的方式以足以活化对象免疫的量向有需要的对象施用本发明的组合物。引发、刺激或重定向的免疫应答可以是特异性的(即，针对表位/抗原)和/或非特异性(先天的)、体液和/或细胞的，尤其是CD4+或CD8+介导的T细胞应答。本文所述组合物引发、刺激或重定向免疫应答的能力可在体外(例如使用从对象收集的生物样品)或使用本领域标准的各种直接或间接试验在体内进行评估(参见例如Coliganet al.,1992and 1994,Current Protocols in Immunology；ed J Wiley&Sons Inc,National Institute of Health或随后版本)。以上提到的与多肽的抗原性性质有关的那些也是适当的。
在优选实施方案中，根据本发明的方法产生以下特性中的至少一种：
√从PBMC分泌高水平的IFN-α，优选是在相同条件下比施用MVA后观察到的水平高至少50倍，或至少比在相同条件下施用ORFV后观察到的水平高10倍；
√活化单核细胞衍生的树突状细胞(例如，可以通过诱导活化标志物CD86来反映，优选在相同条件下施用MVA后观察到的水平的至少两倍)；
√诱导T细胞活化或增殖(例如，通过高粒酶B+T细胞间接反映的)；
√MDSC中更好的细胞因子/趋化因子谱(例如，能通过MDSC感染PCPV后分泌的IFNα和MIP1α中至少一种的水平高于MVA感染后来反映)；
√APC的活化(例如，能通过施用PCPV后人巨噬细胞中CD86的上调来反映)；
√人巨噬细胞M2到M1的转化(例如，能通过施用PCPV后人巨噬细胞中IL-18、IL-6和IP-10的分泌比MVA感染后高来反映；和/或
√通过TLR9介导的途径或其他先天性免疫刺激途径(如cGAS STING和RIG-I样受体(RLR)(例如，维甲酸诱导基因I(RIG-I)和黑素瘤分化相关基因5(MDA5))诱导免疫。
因此，本发明还包括增加免疫细胞诸如PBMC分泌IFNα、诱导活化单核细胞衍生的树突状细胞、诱导T细胞的活化和/或增殖、诱导人类巨噬细胞M2到M1的转化的方法、减少MDSC相关免疫抑制、和/或减少免疫抑制的方法，这些方法中的任何一个包括向有需要的对象施用本发明的组合物(体内方法)或将前体细胞与本发明的组合物接触(体外方法)以获得期望的结果。
在一个实施方案中，本发明的组合物或方法能与可用于治疗或预防要治疗或预防的疾病或病理状况的一种或多种其它治疗一起使用或实施。在一个实施方案中，其它治疗选自：手术、放疗、化疗、冷冻疗法、激素疗法、毒素疗法、免疫疗法、细胞因子疗法、靶向癌症治疗、基因疗法、光动力疗法和移植等。根据本发明的方法或用途可包括第三或甚至进一步的治疗。
本发明的PCPV组合物之前、之后、基本上同时或以穿插方式对对象以标准实践施用这些额外的抗癌疗法。基本上同时施用两种或更多种的治疗，并不要求同时或以相同途径施用，只要药物发挥治疗作用的时间段有重叠。同时施用包括在与其它治疗相同的一天内(例如0.5、1、2、4、6、8、10、12小时)施用本发明组合物。尽管本发明设想了任何顺序，但优选的是，本发明的组合物先于其他治疗施用于对象。
在具体实施例中，根据本发明的方法或用途可与手术联合进行。例如，该组合物可在肿瘤部分或全部手术切除后施用(例如，通过在被切除区内局部施用)。
在其它实施方案中，根据本发明的方法或用途可与放疗联合使用。本领域技术人员能够容易地制定适当的放射治疗方案和参数(参见例如Perez and Brady,1992,Principles and Practice of Radiation Oncology,2nd Ed.JB Lippincott Co；使用对本领域技术人员来说明显的适当调整和修改)。可特别地用于癌症治疗的放射类型是本领域中熟知的，包括电子束、来自线性加速器或来自诸如钴或铯等放射源的高能光子、质子和中子。放射性同位素的剂量范围变化很大，取决于同位素的半衰期、放射发出的强度和类型以及赘生细胞的吸收。本发明将长时间(3至6周)的常规X射线剂量或高单次剂量列入考虑。
在本发明的某些实施方案中，本发明的组合物可与化疗联合使用。目前可用于治疗癌症的适当化疗物质的代表性实例包括但不限于：烷基化剂、拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂、铂衍生物、酪氨酸激酶受体抑制剂、环磷酰胺、抗代谢物、DNA损伤剂及抗有丝分裂剂。目前可用于治疗感染性疾病的合适化疗物质的代表性实例尤其包括抗生素、抗代谢药、抗有丝分裂药和抗病毒药物(例如干扰素α)。
在其它实施方案中，本发明的组合物可与免疫治疗剂诸如抗赘生物抗体以及siRNA和反义多核苷酸联合使用。代表性实例尤其包括阻断特定免疫检查点的单克隆抗体，如抗PD-1、抗PD-L1、抗CTLA-4、抗LAG3、抗OX40等(例如，伊匹木单抗、曲美木单抗、pembrolizumab、纳武单抗、pidilizumab、durvalumab、达克珠单抗、avelumab、atezolizumab等)，阻断表皮生长因子受体的单克隆抗体(尤其是西妥昔单抗、帕木单抗、扎芦木单抗、尼妥珠单抗、马妥珠单抗、曲妥珠单抗(HerceptinTM)等)以及阻断血管内皮生长因子的单克隆抗体(尤其是贝伐珠单抗和雷珠单抗)。
在又一实施方案中，本发明的组合物可与佐剂结合使用。合适佐剂的代表性实例包括但不限于：TLR3配体(Claudepierre et al.,2014,J.Virol.88(10):5242-55)，TLR9配体(例如，CpG诸如ODN1826(Fend et al.,2014,Cancer Immunol.Res.2,1163-74)以及利尼莫德(Li28)(Carpentier et al.,2003,Frontiers in Bioscience 8,e115-127；Carpentier et al.,2006,Neuro-Oncology8(1):60-6；EP 1 162 982；US 7,700,569和US7,108,844)以及PDE5抑制剂诸如西地那非(US 5,250,534、US 6,469,012和EP 463 756)。
在另外的实施方案中，本发明的组合物或方法可以根据包含依次施用(一种或多种)初免组合物和(一种或多种)加强组合物的初免加强方法来使用。通常，初免组合物和加强组合物使用共同包含或编码至少一个抗原结构域的不同载体。此外，初免组合物和加强组合物可通过相同的施用途径或不同的施用途径在同一部位或替代部位施用。在本发明背景下，优选的初免加强方法涉及如本文所述的PCPV组合物和编码相同感兴趣的多肽(例如相同抗原)的MVA组合物。在一个实施方案中，MVA用于初免，而本发明的PCPV组合物用于加强，反之亦然(PCPV用于初免，MVA用于加强施用)。本发明包括一次或多次施用(一种或多种)初免和/或加强组合物，优选皮下、肿瘤内和静脉内途径。特别优选的初免-加强方案包括通过肿瘤内途径施用的PCPV初免组合物和通过静脉内途径施用的MVA加强组合物。在优选实施方案中，PCPV和MVA组合物编码相同的肿瘤相关抗原。在另一个实施方案中，分开初免施用和加强施用的时间段从一周到六个月不等，优选一周到一个月，甚至更优选一到两周的时间段。约106pfu至约109pfu的单个剂量特别适合于初免组合物和加强组合物，特别是约为106、5x106107、5x107、108或5x108 pfu的单个剂量。
在另一方面中，本发明还提供一种牛丘疹状口炎病毒(BPSV)，优选包含插入在其基因组中的至少一种外来核酸的重组BPSV。术语“牛丘疹状口炎病毒”或“BPSV”在本文中根据其在病毒学中的普通意义而使用，是指属于副痘病毒属的痘病毒科成员。
待被重组BPSV表达的(一种或多种)外来核酸与PCPV相关描述的那些以及在期望的宿主细胞或对象中表达所需的调节元件类似。(一种或多种)外来核酸在BPSV基因组内的(一个或多个)插入位置和产生重组BPSV的方法也在本领域技术人员的范围内。扩增BPSV的方法是基于本文针对PCPV病毒给出的描述和常识的常规方法，但是本领域技术人员可将生产者细胞系、MOI、培养基等适应于BPSV病毒。
包含治疗有效量的BPSV和药学上可接受的媒剂的组合物也是本发明的一部分。合适的剂量、施用途径和治疗用途与上文针对包含PCPV的组合物所描述的一样。
上述所有专利、出版物和数据库条目的内容均以引用的方式全部并入本文。通过说明书、附图以及权利要求书，本发明的其他特征、目标和优点将变得明显。下列包括的实施例用于说明本发明的优选实施方案。然而，根据本发明，本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体实施方案进行改变。
实施例
已开发出若干种表达肿瘤抗原和细胞因子的病毒和株，其中一些正在进行后期临床试验。然而，还在寻找具有改进的免疫原性性质的新病毒株。从这个角度，我们筛选了副痘病毒属诸如假牛痘病毒(PCPV)和绵羊副痘病毒(ORF)，并将它们与其他多种痘病毒进行了比较。用人原代免疫细胞进行体外的比较，用同基因小鼠肿瘤模型进行体内的比较。
实施例1：受感染的人外周血单个核细胞(PBMC)中分泌的细胞因子/趋化因子谱。
从两名健康供体的人全血中分离人外周血单个核细胞(PBMC)(EFS,Etablissement de Strasbourg；供体A和B)。用Ficoll-Paque-PLUS(GE-HealthCare)和血液分离管(Greiner)通过密度梯度离心分离PBMC，并将其储存在液氮中。
将PBMC的冷冻等分试样在补充有10％胎牛血清(FSC)的RPMI中解冻，并将其分配到24孔板中(5.105个细胞500μL/孔)。5到6小时后，以10-3至10之间的感染复数(MOI)用不同的病毒(见下文)感染细胞。过夜孵育(16小时)后，刮下细胞，将细胞和上清液转移到Eppendorf管中，以300g离心10分钟。分离上清液并冷冻于-80℃。通过Multiplex方法在上清液中使用Procartaplex 20plex inflammation panel(EPX200-12185-901)对细胞因子和趋化因子谱进行定量。根据制造商的建议，使用MagPix设备进行分析。
被检的不同病毒是副痘病毒属假牛痘病毒(PCPV)和绵羊副痘病毒(ORFV)，以及MVA、牛痘病毒(cowpox virus，CPX)、哥本哈根痘苗病毒(Copenhagen vaccinia virus，Copwt)、鸡痘(fowlpox，FPV)、粘液瘤病毒(Myxomavirus，MYXV)、猪痘(Swine pox，SWPV)、浣熊痘病毒(raccoonpoxvirus，RCN)、科蒂病毒(Cotia virus，CTV)和亚巴样病病毒(Yaba-like disease virus，YLDV)。病毒分别得自ATCC保藏，分别为ATCC-VR-644(PCPV TJS)、ATCC VR-1548(ORFV NZ2)、ATCC VR-302(CPX Brighton)、ATCC VR-115(MYXV Lausanne)、ATCC VR-363(SWPX Kasza)、ATCC VR-838(RCN Herman)、ATCC VR-464(CTV SP AN 32)和ATCC VR-937(YLDV Davis)；除了使用名为MVAN33的空MVA载体(Genbank登录号EF675191)的MVA，哥本哈根痘苗病毒(参见例如WO2009/065546)和FPV(参见例如Laidlaw andSkinner,2004；J.Gen.Virol.,85:305-22)。
如图1所示，PCPV感染的PBMC以MOI依赖的方式诱导了非常高水平的IFNα分泌。尽管PCPV感染的PBMC分泌的水平在两个实验中有所不同，但它们远远高于观察到的感染SWPX和ORFV(另一种副痘病毒)的中等的IFN-α分泌水平。与MVA相比，PCPV在人PBMC中诱导了1000倍更高的IFN-α表达，而SWPX和ORF表现出低10-100倍的诱导。哥本哈根VV和其他溶瘤载体(例如，RCN、RPV、CTV、CPX和MYX)并没有提高IFNα水平。
对病毒感染后的活力进行了研究。用LiveDead“NearIR”对细胞进行染色并用流式细胞仪(MacsQuant)进行分析，以确定死细胞和活细胞的比例。结果表明，ORFV和YLDV的毒性特别强：以MOI为5感染的细胞中，90％在16小时内死亡，而所有其他病毒，包括PCPV，观察到至少50％的活细胞。
实施例2：PCPV对人单核细胞衍生的树突状细胞、M2巨噬细胞和骨髓衍生的抑制细胞(MDSC)的影响
如Parker等人(2016,Nat Rev Cancer 16(3):131-44)和Zitvogel等人(2015,NatRev Immunol.15(7):405-14)所描述的，I型干扰素比如IFNα是癌症免疫疗法的关键角色，并且改变了免疫抑制肿瘤环境，改善了针对疫苗编码的和/或肿瘤递呈的抗原的适应性抗肿瘤应答。为了解决这些方面，我们在体外观察了人类原代免疫细胞中人单核细胞衍生的树突状细胞(moDC)的活化以及PCPV处理后对免疫抑制细胞群(免疫抑制细胞如M2巨噬细胞和MDSC的重编程)的影响。在小鼠同基因肿瘤模型中也探讨了先天免疫和适应性免疫的临床前研究。
moDC的刺激
为了探讨抗原递呈细胞(APC)的活化，我们用单核细胞衍生的树突状细胞(moDC)进行了研究。为了获得这些细胞，通过从PBMC中耗竭而富集人单核细胞(Miltenyi,Monocyte Isolation kit II)。通过在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF 20ng/ml)和IL-4(10ng/ml)中孵育3天，单核细胞分化成树突状细胞(moDC)。针对刺激试验，将来自三个不同供体(供体12Jul16、供体24Aug16和供体31Aug16)的moDC置于24孔板中并以MOI为0.03、0.3和1用MVAN33.1或PCPV进行感染。第二天，用流式细胞仪对成熟标志物CD86进行定量。表达水平是通过流式细胞术借助用抗CD86-PE染色定量细胞结合信号来测量的。
如图2所示，与MVAN33.1处理的细胞相比，PCPV处理的moDC显示出更高的活化标志物CD86的表达水平。在低MOI(0.03)时，观察到对moDC刺激的有利作用，并且在MOI 0.3和3时增加。如预期，空白处理后未检测到moDC刺激。因此，似乎PCPV感染使所有MOI的所有供体的CD86表达增加到高于MVAN33的水平。Copwt对moDC CD86表达无影响(数据未显示)。
对M2巨噬细胞的影响
接下来，我们致力于免疫抑制细胞类型是否能够以及在多大程度上可以被PCPV改变/重塑的问题。
我们根据改编自Mia等人(2014,Scand.J.Immunol.79(5):305-14)的方案在体外衍生出CD163+CD206+“M2型”巨噬细胞。简单地说，使用单核细胞分离试剂盒II(Miltenyi，Biotec)通过CD14+阳性选择或通过阴性选择得自健康供体的PBMC中分离后，将4x105个单核细胞培养在48孔板上，培养基为500μl Macrophage Base Medium DXF(Promcell)，并补充有50ng/ml M-CSF(Miltenyi Biotec)。在第3天和第7天更换培养基。在第7天，CD16hiCD68+CD11b+M0巨噬细胞向M2表型极化，加入浓度为20ng/ml的IL-4、IL-10和TGFβ(MiltenyiBiotec)。两天后，将CD163+CD206+M2巨噬细胞与MVAN33.1或PCPV以5、1和0.3的MOI孵育，并用流式细胞术或Luminex分析测定IL-18、IL-6、IP-10和CD86的分泌。为此，将细胞与人FcR阻断试剂(Miltenyi Biotec)和APC标记的抗CD86(clone FM95，Miltenyi Biotec)孵育20分钟。死亡细胞用自动碘化丙啶染色法标记，然后用MACSQuant细胞仪(Miltenyi)记录细胞获取。使用Kaluza软件(Beckman Coulter)对数据进行分析。刺激细胞上清液中的细胞因子水平通过MAGPIX设备(Luminex XMAP Technologies)上的Luminex分析(ProcartaPlex，eBiosciences)进行量化。
如图3所示，与MVA相比，PCPV在MOI 5和1时增加了IL-18分泌，在MOI 5时增加了IL-6和IP-10的分泌。因此，看起来PCPV使M2巨噬细胞的表型向M1型转变。M2巨噬细胞与人NSCLC的阴性结果相关，而M1巨噬细胞代表阳性的预后标志物(Yuan et al,2015,Nature,Scientific Reports)。这些数据表明，与MVA处理相比，PCPV处理后转化为抑制性较低的表型。
对骨髓衍生的抑制细胞MDSC的影响
用磁珠技术(Miltenyi)从健康供体中分离自体CD14+单核细胞和CD8+T细胞。对两种模型进行了研究。用20ng/ml GM-CSF、10ng/ml IL-4和1μM前列腺素E2(图4)或10ng/mlGM-CSF和10ng/ml IL-6(图5)孵育6至7天，从单核细胞中产生MDSC。在包被有抗CD2、抗CD3和抗CD28或TransAct T细胞试剂+IL-2的T细胞活化珠(Miltenyi Biotec)的存在下将获得的MDSC与自体CFSE标记的CD8+T细胞共培养。4至5天后，用流式细胞仪测量T细胞增殖和增殖T细胞中粒酶B的表达。另外，用PCPV单独处理MDSC，第二天取上清液定量分析物如细胞因子和趋化因子。如图4所示，活化T细胞的增殖被共培养的体外衍生的MDSC抑制(参见图4A中未受感染的对照组；MDSC/T比为1/2)。然而，添加到共培养物中的PCPV处理后，MDSC对CTL增殖的抑制活性可被抑制，如PCPV在增加的MOI时恢复CTL增殖的能力所证明的(图4A)，这与PCPV处理的共培养物中粒酶B的产生上调有关(图4B)。值得强调的是，即使在低MOI时，也能检测到PCPV存在下的抗抑制作用。这些观察结果与用PCPV处理后第二天在MDSC培养物中测得的IFNα分泌量相关(图4C)。
如上所示，如图5所示GM-CSF、IL-6衍生的MDSC模型所示，体外衍生的MDSC对活化T细胞的增殖有强烈的抑制作用。在MOI增加时，用PCPV处理共培养物时增殖得到部分恢复，并且粒酶B表达上调。
总之，在触发原代moDC中CD86的表达中，PCPV比MVA和VV更优异。此外，PCPV处理增加了体外衍生的CD163+CD206+“M2”型巨噬细胞中CD86的表达，提示抗原递呈表型的转变。在这些细胞中，PCPV显著增加IL-18、IL-6和IP-10的分泌，标志着向抑制性较低的巨噬细胞表型转化。PCPV对MDSC的作用方式可能是成熟至抑制性较低的表型或PCPV对MDSC的毒性作用。
实施例3：重组PCPV的构建和抗肿瘤特性
通过生成编码肿瘤抗原的重组PCPV并在肿瘤控制实验中对其进行检测，评价了PCPV作为病毒骨架的意义。
从野生型菌株TJS(ATTC，VR-634)构建重组PCPV载体。PCPV就像所有的副痘病毒一样缺乏其他痘病毒存在或保守的基因。这些基因包括可能参与核苷酸代谢的大多数痘病毒基因的同源物，包括核糖核苷酸还原酶(RR)、胸腺嘧啶激酶(TK)、鸟苷酸激酶和胸苷酸激酶的同源物。因此，通常用于产生重组痘苗病毒的TK基因座不能用于PCPV中重组基因的引入。然而，有研究表明，通过将转基因插入非必需VEGF基因中可以产生重组ORF病毒(Rziha etal.,2000,J.Biotechnol.83(1-2):137-145)。因此，该基因座被用于评估重组PCPV的生成。值得注意的是，VEGF基因在PCPV基因组的基因组左右端存在两个拷贝。
通过在pUC18质粒(可从例如Thermo Fisher Scientific购得)中克隆PCPV VEGF基因侧翼约300bp的两个序列来生成转移质粒。VEGF基因上游序列对应于PCPV(GenbankNC_013804)的6391至6089或138899至139201的核苷酸位置。VEGF基因下游的序列对应于PCPV的5545至5225或139745至140065的核苷酸位置。这些序列将允许转移质粒和PCPV病毒之间的同源重组，从而导致外来核酸插入到两个VEGF基因座中的重组病毒。
PCP-GFP(PCPTG19106)的生成
选择盒(eGFP/GPT)，编码增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的基因和编码鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(GPT)的基因的融合体(参见例如，WO2009/065546)置于p11K7.5痘苗启动子的控制下，并插入到转移质粒中得到pTG19106。
在感染PCPV的牛鼻甲骨细胞(BT，ATCC CRL-1390)中通过进行同源重组并用pTG19106通过核转染进行转染产生PCPTG19106(根据Amaxa Nucleofector technology)。对荧光和选择性(GPT+)嗜斑进行选择。更具体地，GPT+重组PCPV在选择性培养基(霉酚酸、黄嘌呤和次黄嘌呤)中具有生长优势，在分离重组PCPV的过程中保持GPT选择标记。从GFP荧光噬斑中分离出重组病毒，并在BT细胞中进行进一步的嗜斑纯化。表达盒的多个PCR和DNA测序证实了病毒结构和亲本PCPV的缺失。在BT细胞中扩增得到的病毒PCPTG19106。用嗜斑试验在BT细胞上对病毒储液进行滴定。
PCP-mCherry(PCPTG19153)的生成
编码mCherry荧光蛋白的序列置于pH5R痘苗启动子的控制下，并插入到转移质粒中得到pTG19153。
通过在感染PCPTG19106的BT细胞中进行同源重组并用pTG19153通过核转染进行转染来生成PCPTG19153。通过选择的mCherr荧光嗜斑分离重组病毒，并在BT细胞中进行进一步的嗜斑纯化。表达盒的多个PCR和DNA测序证实了病毒结构和亲本PCPTG19106的缺失。在BT细胞中扩增得到的病毒PCPTG19153。
PCP-HPV16E7(PCPTG19178)的生成
将编码SR-E7*Tm的序列(WO99/03885)置于p7.5K启动子的控制下，并插入到转移质粒中得到pTG19178。通过在感染PCPTG19106的BT细胞中进行同源重组并且在内切核酸酶的存在下用pTG19178通过核转染来转染来生成PCPTG19178，该内切核酸酶在GFP基因中产生双链断裂。通过选择的GFP荧光阴性嗜斑分离重组病毒，并在BT细胞中进行进一步的嗜斑纯化。表达盒的多个PCR和DNA测序证实了病毒结构和亲本PCPTG19106的缺失。在BT细胞中扩增得到的病毒PCPTG19178。
临床前批次的PCPTG19178的生产是通过感染的Hela细胞(
Figure BDA0002762298770000401
CCL-2TM)在若干个F500烧瓶中进行的。在34至37℃、5％CO2下进行72h病毒扩增。然后将感染的细胞和培养基沉淀并冷冻。使用高剪切均质器(SILVERSON L4R)对粗收获物进行破碎，并进行纯化过程(例如，如W02007/147528中描述的)。简而言之，裂解的病毒制备物可以通过过滤澄清，并通过切向流过滤(TFF)步骤进行纯化。将纯化的病毒重新悬浮在合适的病毒制剂缓冲剂中(例如5％(w/v)蔗糖、50mM NaCl、10mM Tris/HCl、10mM谷氨酸钠、pH8)。
PCP-MUC1(PCPTG19194)的生成
编码Muc1的序列(US5,861,381)置于pH5R启动子的控制下，并插入到转移质粒中得到pTG19194。通过在感染PCPTG19153的BT细胞中进行同源重组并在内切核酸酶的存在下用pTG19106通过核转染来转染来生成PCPTG19194，所述内切核酸酶在m-Cherry基因中产生双链断裂。通过选择的mCherry荧光阴性嗜斑分离重组病毒，并在BT细胞中进行进一步的嗜斑纯化。表达盒的多个PCR和DNA测序证实了病毒结构和亲本PCPTG19194的缺失。在BT细胞中扩增得到的病毒PCPTG19194。如上所述在Hela细胞中生产临床前批次。
PCP-HBV(PCPTG19179)的生成
将编码HBV核心Pol和env抗原融合体的序列(如WO2013/007772中所描述的)置于p7.5K启动子的控制下，并插入到转移质粒中得到pTG19179。通过在感染PCPTG19106的BT细胞中进行同源重组并在内切核酸酶的存在下用pTG19179通过核转染进行转染来生成PCPTG19179，所述内切核酸酶在GFP基因中产生双链断裂。通过选择的GFP荧光阴性嗜斑分离重组病毒，并在BT细胞中进行进一步的嗜斑纯化。表达盒的多个PCR和DNA测序证实了病毒结构和亲本病毒的缺失。
在同基因MC38模型中的肿瘤控制实验：
在预先剃毛的皮下注射了结肠癌细胞系MC38(2x106个细胞)(可从Kerafast购得)的同基因C57BL/6小鼠中研究了PCPV控制肿瘤生长和提高存活率的能力。注射部位用永久性标志物进行标记。第2天，在细胞系注射部位(D2)注射1x107 pfu的HPV-16E7编码PCPV或MVA病毒或缓冲剂，然后在第9天和第16天(D9和D16)在新出现的肿瘤中注射。注射每组十只小鼠。在MC38细胞植入后一个月内观察肿瘤生长和存活情况。图6A中示出了施用方案。
在用缓冲剂处理的所有动物中，在MC38植入后的11到18天内肿瘤迅速生长，超过1500mm3的体积(图6D)。相反，用重组HPV-16E7编码MVA处理的动物表现出肿瘤生长延迟。更具体地，在第18天观察到的肿瘤超过1500mm3的有5/10，而其他5个肿瘤生长中等(在肿瘤植入后第18天<1000mm3)，如图6B所示。令人惊讶的是，PCPV处理比MVA处理提供了更强的抗肿瘤保护。事实上，在肿瘤植入后15到24天，只有4/10的动物观察到体积达1500mm3的肿瘤，而其他6只动物没有肿瘤生长(图6C)。在同一条线上，PCPV增加了被处理动物的存活(图6E)。
总之，当肿瘤内注射到快速生长的MC38肿瘤中时，与注射缓冲剂或MVA的动物相比，PCPV注射肿瘤生长控制并提高存活。
耗竭实验
重复MC38荷瘤小鼠的肿瘤控制实验，但在PCPV治疗前和治疗期间应用注射适当的耗竭抗体，耗竭特定细胞群，分别是CD4+、CD8+和嗜中性粒细胞。更具体地，在第-1、-2、6和13天，通过腹膜内(ip)注射200ug抗小鼠CD8的大鼠单克隆抗体(MAb)(克隆53-6-7；BioXCell)来完成CD8+细胞的耗竭。在第-1、-2、6和13天，腹膜内注射200ug抗小鼠CD4的大鼠MAb(克隆GK1.5，可从BioXCell获得)来导致CD4+细胞耗竭。按照Wozniak等人(2012,BMCImmunology,13:65)的方案，使用抗小鼠Ly6G的大鼠MAb(克隆1A8；BioXCell)以200ug的剂量在第-2天然后每隔一天或每三天注射一次至一周结束进行腹膜内注射来完成嗜中性粒细胞的耗竭。
如上文所述，将结肠癌细胞系MC38(2x106个细胞)皮下注射到2天前剃毛的同基因C57BL/6小鼠。注射部位用永久性标志物进行标记。第2天在细胞系注射部位注射一剂107pfu的PCPV或缓冲剂(阴性对照)，随后在新出现的肿瘤中注射(第9天和第16天)。注射每组13只小鼠。
在第14天处死的小鼠的血液和脾脏(外周)中证实了CD4+、CD8+和Ly6G+细胞的耗竭(数据未显示)。然而，用Ly6G处理的小鼠MC38肿瘤中缺少嗜中性粒细胞不能被证明(髓过氧化物酶MPO信号仍然可以检测到)。由于缺乏定量测量，不能证实嗜中性粒细胞计数的减少。由于技术原因，无法探测肿瘤中CD4+和CD8+细胞的耗竭。
正如预期的，在缓冲剂处理的动物中肿瘤生长迅速(图12E)，而PCPV处理延迟了肿瘤生长(图12A)。与PCPV单独处理组相比，PCPV和抗Ly6G处理组的肿瘤大小在第16天到29天之间得到更多的控制(p值<0.001)(图12B)。与PCPV处理组相比，PCPV和抗CD8处理导致更大的肿瘤大小(p值0.05)(图12C)，而CD4耗竭抗体处理对肿瘤生长没有显著影响(图12D)。此外，PCPV和抗CD8处理降低了存活，而PCPV和抗Ly6G处理提高了存活(p值0.001)。
该结果提示CD8+细胞在PCPV诱导的抗肿瘤应答中起作用。用Ly6G处理可提高存活，这很可能是由于循环MDSC和N2嗜中性粒细胞的耗竭所致。Shaul和Fridlender(2017,J.Leuko.Biol.102(2):343-9)描述了嗜中性粒细胞的功能可塑性(在特定细胞因子的影响下浸润到肿瘤中的嗜中性粒细胞具有亲肿瘤(N2)和抗肿瘤(N1)性质。
长期存活者中肿瘤特异性T细胞的诱导
在第34天MC38肿瘤减少/消退的长期小鼠存活者中研究了MC38特异性T细胞的存在，并与未处理动物进行了比较。脾细胞分离和处理基本如下。收集5只存活者小鼠的脾脏，并将其合并(PCPV存活者池)或收集2只存活者小鼠的单个脾脏，置于完全培养基(CM)中，然后用注射器柱塞压碎。用CM稀释脾细胞悬液，置于4ml的
Figure BDA0002762298770000431
-M分离细胞培养基(Cedarlane)。通过离心收集含淋巴细胞的中间相，重悬于红细胞(RBC)裂解缓冲剂(BDPharmLyse,BD BioScience)中，直到RBC发生裂解。将淋巴细胞在CM中再悬浮，计数(Beckman Coulter)，细胞浓度用CM调整为每毫升1×107个细胞。用丝裂霉素C处理MC38细胞，用培养基(阴性对照)或不相关肽i8L(阴性对照)刺激细胞。根据标准方案进行抗原特异性产生IFN-gamma(IFNg)的脾细胞的ELISpot分析。
图13显示，PCPV处理后，经Mitocytin C处理的MC38细胞刺激后，在合并或单个存活者小鼠(在第34天MC38肿瘤减少/消退)的脾细胞中检测到肿瘤特异性(MC-38)-特异性T细胞。相反，阴性对照(CM或不相关肽刺激)或未处理小鼠没有显示任何产生IFNg的细胞。
PCPV的溶瘤潜能
对PCPV在各种小鼠和人类肿瘤细胞系中的溶瘤潜能进行了研究，这些肿瘤细胞系得自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Rockville，MD)，诸如LoVo(
Figure BDA0002762298770000432
CCL-229TM)、HCT116(
Figure BDA0002762298770000433
CCL-247TM)、胶质母细胞瘤人类癌细胞系U-87MG(
Figure BDA0002762298770000435
HTB-14)，人宫颈癌细胞系HeLa(
Figure BDA0002762298770000434
CCL-2TM)和MIA-Paca-2(
Figure BDA0002762298770000436
CRL-1420TM)(数据未显示)以及小鼠结肠癌MC38细胞系。在所有这些细胞系中，PCPV表现出温和的或不具有溶瘤活性。在此，我们证实了以MOI 1、10-1、10-2和10-3用PCPV-GFP或作为阳性对照的工程化成表达GFP的VV(VVTG)感染的MC38细胞的活力。五天后，刮取收获细胞，用台盼蓝染色法和细胞计数器Vicell测定活细胞的数目和比例。如图7所示，对MC38细胞的VV感染严重损害了MC38的活力(MOI 0.1和1时仍有55％和30％的细胞存活)。19％的MC38感染了PCPV-GFP，但病毒在感染细胞中没有表现出溶解作用(从MOI 10-3增加到1时相同数量的活细胞证明了这一点)。空白处理对MC38的活力如预期没有影响。
基于这些结果，可以预期观察到的PCPV的肿瘤控制不能用该病毒在MC38细胞中的溶瘤作用来解释。因此，还研究了与PCPV体内功效相关的其他因素，如细胞因子/趋化因子谱和肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。
皮下(sc)应用MVAN33.1或PCPV后的体内局部细胞因子谱
针对局部细胞因子和趋化因子检测，采用5.105pfu/侧对小鼠进行双侧胁腹注射。将每只小鼠的两个皮肤样品切成小块，放入C型管(Miltenyi Biotec)中的500μl PBS中，并机械分离(GentleMACS；Miltenyi Biotec)。在300g离心后，将上清转移到Eppendorf管中并在18000g低温离心。根据制造商的建议，用Procartaplex mouse chemokine and cytokinemultiplex kits分析澄清的上清液。
分析每组4只小鼠。注射MVA和PCPV后获得的谱与缓冲剂(阴性对照)进行比较。一般来说，注射PCPV后，每种分析物的分泌量程度都高于注射MVA或缓冲剂后。与预期的一样，缓冲剂处理对细胞因子的分泌没有影响。令人惊讶的是，与MVAN33.1相比，PCPV诱导的局部IP-10、IFN-γ、TNF-α、IL-12、IL-1β、RANTES、IL-18、MCP-1和MIP1-β(如图8所示)以及IL-4、GM-CSF、MIP-1α、Eotaxin、IL-6、GRO-α、MCP-3、G-CSF、M-CSF和LIF(数据未显示)的局部水平显著更高。
PCPV对小鼠MC38模型中的TIL的影响
将小鼠分为3组，每组6只。皮下植入MC38细胞后可触及的肿瘤(可触及肿瘤至少为100mm3)在肿瘤细胞植入后9天肿瘤内注射1x107 pfu重组PCPV或MVA(两种病毒编码HPV16E7m，与该肿瘤模型无关的抗原)或缓冲剂(阴性对照)。注射病毒后第二天处死小鼠，分离肿瘤，酶解(Miltenyi产品：tumor dissociation kit，C tube，Gentle Macs program：Tumors m_imp tumor 02followed by 40min at 37℃under agitation terminated withprogramm_imptumor_03twice)，并富集TIL。对得到的细胞悬浮液(70μm孔)和红细胞裂解物(BD PharmLyse，5分钟)过滤后，使用磁珠技术富集CD45+细胞(Miltenyi产品：CD45 TILsMicroBeads，在MultiMAVS Cell24上分离，程序：prog POSSEL+bloc 24)。根据Brauner等人的研究，通过流式细胞术鉴定CD45+富集细胞内的亚群(AACR 2017 poster abstract N°1672)。对CD11b+Ly6G+CD45+细胞中的嗜中性粒细胞百分比进行检测。TAM被鉴定为Ly6G-CD11b+细胞中的CD11c-亚群。用MHCⅡ和Ly6C对不同亚群进行分层。根据Brauner等人的报道，“TAM C”的特征是MHC IIlo和Ly6C。
图9示出了PCPV提高生长的肿瘤中嗜中性粒细胞百分比(9A)而降低TAM C群的百分比(9B)的能力。这些结果可能预示着PCPV介导的肿瘤控制。
在癌症中，嗜中性粒细胞异质性也越来越受到重视，不同的嗜中性粒细胞群促进了癌症的控制或进展(综述于Singel and Segal,2016,Immunol Rev.273:329-43)。进一步表征亚群以及亚群对CTL群和功能的影响可能是有用的。
关于TAM C巨噬细胞(MHC IIlo)，Movahedi等人(2010,Cancer Res70:5728-39)描述了小鼠乳房肿瘤中不同的TAM亚组。MHC-IIlo-TAMS更具M2样表型，在低氧性肿瘤区域富集，在体内具有优异的促血管生成活性，并且随着肿瘤的进展数量增加。减少这种群可能预示着更好的肿瘤控制预后。
实施例4：用表达HPV-E7m的PCPV进行体内免疫原性研究
ELISPOT分析
用ELISPOT检测PCPV疫苗载体诱导的免疫原性，并与MVA进行比较，将动物分为4组，每组6只，一组用编码HPV16 E7mut的PCPV进行处理，一组用其MVA对应物(MVA-HPV16E7mut)进行处理，一组用空MVA(MVA N33)进行处理，以及一组接受缓冲剂的阴性组。在第1天和第8天向C57BL/6小鼠静脉内注射1x105 pfu病毒。第二次免疫后1周(第15天)，处死小鼠，分离脾脏和肺，合并一组所有小鼠的脾脏进行ELISPOT分析。针对抗原特异性CD8+T细胞通过细胞内细胞因子染色对肺脏进行合并(exp ICS24)或单独检测(exp ICS28)。用HPV16E7特异性肽R9F、MVA特异性肽T8V和无关肽I8L或K9i-3C CTRL对两次检测中的抗原特异性进行探究。
根据标准方案针对抗原特异性IFNγ产生脾细胞进行ELISPOT分析。
准备培养板
用35％的乙醇(15μl/孔)预处理板(Millipore，MSIPS4W10)1分钟，并用无菌水(200μl/孔)清洗五次。用100μl 15μg/ml抗小鼠IFNγ抗体(Mabtech，AN18，3321-3-1000；稀释于PBS中)包被孔，并孵育过夜或在+4℃孵育至一周结束。在实验当天，用无菌PBS(200μL/孔)清洗板五次，并在37℃用完全培养基(CM 200μL/孔)浸透至少1小时。
制备样品
用新鲜脾淋巴细胞进行离体ELISPOT。针对每个实验，每组收集5只动物的脾脏并合并。将脾脏收集在4mL完全培养基(CM；X-Vivo，Lonza BE04-380Q)中，然后在6孔板中用针筒柱塞通过70μm细胞过滤器压碎。获得的脾细胞悬液在CM内稀释2倍，放置在4mL的
Figure BDA0002762298770000461
-M分离细胞培养基(Cedarlane,ref:CL5035)上，并在室温以1500g离心20分钟。收集含有淋巴细胞的中间相，并在10mL PBS中洗涤两次(室温以400g离心5分钟)。将淋巴细胞重新悬浮在2mL红细胞(RBC)裂解缓冲剂(BD PharmLyse，BD BioScience，ref555899)中，并在室温孵育5至15分钟以裂解红细胞。一步CM中清洗后(室温400g离心5分钟)，将淋巴细胞重新悬浮在10mL的CM中，并使用Beckman Coulter的<<Z2 Coulterparticle count and size analyzer>>进行计数。用CM将细胞浓度调整为每毫升1×107个细胞。
测定
首先，通过清空板去除浸透培养基，并在所有孔中添加50μL CM。将50μL每种肽溶液以4μg/mL于CM中或50μL CM(阴性对照)添加到相关孔中(根据先前定义的移液方案；每个条件检测四个重复)。作为阳性对照，将50μL的20μg/mL的刀豆球蛋白A(ConA)添加到预限定的孔中。其次，将100μL的每个淋巴细胞悬浮液(1x 106个细胞)添加到孔中(除了只添加3x105个细胞的T8V孔外)，并在37℃和5％CO2中孵育板18到20h。
第二天，通过清空板去除细胞，用PBS(200μL/孔)洗涤板5次，并在每个孔中分配生物素化的抗小鼠IFNg单克隆抗体(Mabtech，R4-6A2，3321-6-1000；于PBS 0.5％FCS中最终浓度为1μg/mL)分配在每个孔(100μL/孔)中。将板于室温孵育2小时，然后用PBS洗涤5次，并将Extravidin-Phosphatase alkaline(SIGMA，E236，于PBS 0.5％FCS中1/5000e)分配在每个孔(100μL/孔)中。于室温再次将培养板孵育1小时，用PBS洗涤5次，并将100μl BCIP/NBT底物溶液(BCIP/NBT片剂，SIGMA，B5655；0.45μM过滤)分配在每个孔中。在室温黑暗孵育板，直到阳性孔中出现明显的斑点(持续5至10分钟)。通过清空板并用自来水大量清洗来终止显色。将板保持于黑暗，不揭开盖，直到它们在室温干燥至少1小时。
获取数据
用ELISpot reader(CTL Immunoqpot reader，S5UV)对斑点进行计数。对每个孔进行质量控制，以确保ELISpot reader提供的计数与图片的真实情况相匹配。针对每四个重复以每1×106个脾淋巴细胞中斑点形成单位(sfu)的平均值来表示结果。通过R script(livelink Biostat)确定阳性率。
结果
从用HPV16E7m-编码PCPV和MVA处理的动物组中提取的脾细胞显示出R9F特异性IFNγ分泌，如图10A所示，显示了两种重组病毒诱发针对编码抗原的特异性免疫应答的能力。另一方面，在施用空MVA或缓冲剂后或者用无关肽K9i-3刺激后，均未检测到IFNγ的分泌。另一方面，只有MVA载体(无论是空的还是重组的MVA)在用MVA特异性肽T8V刺激后才会应答(图10B)。
对合并肺样品的ICS分析
免疫小鼠的肺要么合并(ICS 024)要么单独处理(ICS 028)，如Remy-Ziller等人所述(2018,Hum Vaccin Immunother.14:140-5)。首先，将肺脏进行酶解和机械分离(Miltenyi产品：tumor dissociation kit,C-tubes and GentleMacs)。在1μg抗CD28(abcam)和HPV16E7特异性肽R9F、MVA特异性肽T8V或无关肽I8L存在下，在150μl TexMACS培养基(Miltenyi)中对2x 106个细胞进行离体刺激。在Brefeldin存在下孵育5小时后，用抗CD3和抗CD8抗体对细胞进行流式细胞术分析。透化(Cytofix/cytorem，BD Bioscience)后通过用抗IFN-γ-FITC(克隆XMG1.2，BD-Pharmingen)或其同型对照进行细胞内染色来评估活化。将包含短寿命效应细胞和早期效应细胞的淋巴细胞亚群定义为CD3dimCD8dim亚群。斑点杂交分析显示，两次注射重组MVA或PCPV导致出现由效应细胞CD8+T细胞组成(数据未显示)的CD3dimCD8dim细胞群(如Remy-Ziller et al,2018,Hum Vaccin Immunother.14:140-5中所描述的)。对于MVA，该细胞群扩增的程度优于PCPV(图10C)。然而，在注射HPV16 E7m-编码PCPV或MVA后，在这些亚群中检测到相当数量的R9F特异性T细胞，如图10D所示。换言之，即使PCPV诱导的CD3dimCD8dim细胞总数较低，但用HPV16E7m-编码PCPV和MVA施用的动物体内，R9F特异性IFNγ分泌细胞的绝对数量相当。这表明疫苗接种PCPV载体后HPV16 E7特异性CD8+T细胞的诱导倍数高于MVA载体。
对疫苗接种了MVAN33.1、HPV16E-编码MVA和HPV16E7-编码PCPV(即，其非致癌形式)的小鼠的个体肺，就CD3dimCD8dim群内R9F特异性IFNγ分泌CD8+T细胞的倍数增加进行了分析。如图11所示，与HPVE7-MVA处理组相比，发现HPVE7-PCPV处理组的计数显著更高(倍增加)。
总之，这些数据表明，与MVA-E7一样，PCPV-E7诱导了强烈的细胞应答(脾细胞上的ELISPOT和抗原特异性短寿命效应细胞的频率)，但PCPV-E7在注射部位表现出不同的谱，促免疫细胞因子水平增加，包括IP-10、IFN-γ、GM-CSF、IL-18，MIP-1α、MIP-1β、IL-12和IL-6。当肿瘤内注射到快速生长的MC-38肿瘤中时，PCPV导致肿瘤控制。肿瘤浸润分析显示，PCPV处理导致更高水平的嗜中性粒细胞，MHCIIlo(M2)TAM频率降低。
总的来说，我们的数据表明，就局部应答和引发活性而言，PCPV在诱导效应T细胞和重塑肿瘤浸润分布的能力可能比目前的病毒载体表现出更好的特性。尽管与其他痘病毒相比，PCPV有许多基因差异，但PCPV具有编码和递送大基因载荷的能力，这对于设计先进的抗肿瘤疫苗非常有用。
异源初免加强(PCPV/MVA)
据报道，PCPV感染的患者对痘苗/MVA没有发展出免疫，反之亦然(Friedman-Kienet al.,1963,Science 140:1335-6)。因此，在TC1肿瘤模型中研究了MVA-HPV16E7和PCPV-HPV16E7的联合处理。
为此，将HPV16E7阳性的TC1细胞皮下植入C57BL/6小鼠的胁腹。14天后，将荷瘤小鼠随机分组(每组10只)，肿瘤内注射1×106pfu的MVA-HPV16E7或PCPV-HPV16E7。1周后，静脉内注射1×106pfu的PCPV-HPV16E7或MVA-HPV16E7进行加强。在相同条件下(种瘤内初免和静脉内加强)，在用同源MVA/MVA、异源MVA/PCPV、PCPV/MVA设置或作为阴性对照的缓冲剂处理的小鼠中追踪肿瘤生长和存活随时间的变化。
如图14所示，与用同源MVA-HPV16E7初免加强处理相比，异源处理获得更好的肿瘤控制。有趣的是，相对于MVA初免/MVA加强组，MVA初免/PCPV加强或PCPV初免/MVA加强均产生了下降的肿瘤生长，尽管PCPV初免/MVA加强有更好地控制肿瘤生长的趋势(如图14C所示，更高数目小鼠中的肿瘤控制)。正如所料，在缓冲剂处理的动物体内，肿瘤生长相当迅速。
实施例5：PCPV与ICI(免疫检查点抑制剂)联合处理
在MC38肿瘤模型上对PCPV联合全身性ICI处理的效果进行评价。选择大鼠抗mPD-1(m表示小鼠)抗体RMP1-14(可从BioXcell购得)。该抗体显示阻断mPD1与其配体的相互作用(Yamazaki et al.,2005,J.Immunol.175(3):1586-92)。
在第1天(D1)，将结肠癌细胞系MC38(2x106个细胞)皮下(sc)注射到2天前剃毛的同基因C57BL/6小鼠的右胁腹。注射部位用永久性标志物进行标记。同一天，将少4倍的MC38细胞(5x105)sc注射到左胁腹。将一剂编码HPV16E7m(与MC38模型无关)的107pfu的PCPV(PCPTG19178)或VV病毒(VVTG5095)或者缓冲剂(S08)均在右侧的细胞系注射部位(第2天)和随后出现的右侧肿瘤(第9天和第16天)进行肿瘤内注射。另一方面，在第5、9和16天腹膜内(ip)注射200μg抗mPD-1(RMPI1-14)。追踪右(注射过)和左侧肿瘤的生长及存活随时间的变化。
总共将动物分为6组，每组13只小鼠，分别是：
·接受S08缓冲剂的对照组(在第2、9和16三次it注射)，
·用E7-表达PCPV病毒处理的小鼠组(在第2、9和16天三次it注射107pfu的PCPTG19178)，
·用E7-表达溶瘤VV病毒处理的小鼠组(在第2、9和16天三次it注射107pfu的VVTG5095)，
·用抗PD1抗体处理的小鼠组(在第5、9和16天三次ip注射RMP1-14抗体)，
·同时接受E7-表达PCPV病毒和抗PD1抗体的组(在第2、9和16天三次it注射107pfu的PCPTG19178，在第5、9和16天三次ip注射RMP1-14抗体)，以及
·同时接受E7-表达溶瘤VV病毒和抗PD1抗体的组(在第2、9和16天三次it注射107pfu的VVTG5095，在第5、9和16天三次ip注射RMP1-14抗体)。
图15显示了在以PCPV(A)或VV(B)单独或与小鼠抗PD1联合处理的小鼠组中，植入右侧胁腹肿瘤的直径演变。更具体地，对照组(S08)的肿瘤在D13就迅速生长，平均超过2000mm3，而抗mPD1的处理使平均2000mm3的体积推迟了几天(D16)。如图15B所示，在使用溶瘤VVTG5095(深灰色)处理后观察到相同的趋势。但VVTG5095和抗mPD1联合处理(中灰色)的小鼠肿瘤生长得到控制，在D22获得平均2000mm3的体积。相反，如图15A所示，在使用PCPV病毒(深灰色)处理后，肿瘤生长显著延迟，其中D22时肿瘤的平均体积远低于2000mm3，在同时接受PCPTG19178和抗PD1的联合组(中灰色)更甚。值得注意的是，在联合PCPV-HPV16E7+抗PD-1组中，与其他三组PCPV-HPV16E7、anti-PD-1和S08相比，肿瘤大小有显著差异。
在对侧肿瘤(左侧胁腹)，用抗mPD1抗体处理可延缓肿瘤进展。与其他组相比，抗PD1组肿瘤大小显著缩小(数据未显示)。
对于存活分析(未显示数据)，PCPV-HPV16E7组和PCPV-HPV16E7+抗PD-1联合组的OS显著高于S08缓冲剂组(校正后的p值均为0.036)。平均存活分别差4.4天和3.4天。VV-HPV16E7+抗PD-1联合组OS显著高于VV-HPV16E7和对照组(校正后p值均为0.040和0.004)。平均存活分别差2.9天和3.6天。
这些结果强调了重组PCPV与ICI诸如抗-PD1的联合可以增强抗肿瘤保护作用。
实施例6：牛丘疹口炎病毒的作用
副痘病毒属包含包括ORF病毒、PCPV和牛丘疹状口炎病毒(BPSV)的不同成员，均能引起反刍动物及其处理者的感染(Zhao et al,2013,J Virol Methods,194:229-34)。人感染PAPV诱导强烈和短暂的细胞介导免疫应答和较差和短暂的体液应答，约8-12％的个体有二次感染处理者(Zhao et al.,2013,J Virol Methods,194:229-34)。
对副痘病毒属的另一成员(BPSV)进行了检测，以检测其诱导得自2个不同供体的PBMC中分泌IFN-α的能力，并与MVA和PCPV相比较(参见实施例1)。分离新鲜PBMC，孵育过夜(静置)，第二天以MOI 0,3用病毒进行感染。加入CpG型TLR9配体(从Invivogen获得的ODN2216)作为pDC，B细胞介导的IFN-α分泌的对照。感染后2、4、6、16或24小时取上清液，如上所述用Luminex技术定量上清液中的IFN-α。
如图16所示，BPSV感染的PBMC和PCPV感染的PBMC在细胞感染后16和24小时诱导分泌非常高水平的IFNα。两种情况下的IFN-α分泌水平均远高于MVA感染后观察到的IFNα中等分泌水平，证实了实施例1的结果，且高于ODN2216对照。
综上所述，BPSV显示与PCPV相似的作用，即得自不同供体的PBMC上清液中分泌的IFN-α强烈增加。
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Claims (36)

1.一种假牛痘病毒(PCPV)，其中所述PCPV包含插入在其基因组中的至少一种外来核酸。
2.如权利要求1所述的PCPV，其中所述PCPV得自由ATCC编号ATCC VR-634TM确认的野生型TJS株或者得自具有相同或相似名称的病毒株或其功能片段和变体。
3.如权利要求1或2所述的PCPV，其中所述PCPV进一步对于PCPV基因组编码的病毒功能是缺损的，优选对于非必需病毒功能是缺损的，更优选对于所述外来核酸的插入位点处编码的病毒基因功能是缺损的。
4.如权利要求1至3中任一项所述的PCPV，其中所述外来核酸编码选自以下的多肽：补偿对象中缺损或缺陷蛋白质的多肽，通过毒性作用限制或从机体清除病变细胞的多肽，诸如自杀基因产物；能够增强抗肿瘤功效的多肽，诸如武装基因产物；以及能诱导或活化免疫应答的多肽，诸如免疫刺激性和抗原性多肽。
5.如权利要求4所述的PCPV，其中所述免疫刺激性多肽选自：细胞因子诸如白细胞介素、趋化因子、干扰素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子，APC外露蛋白，具有抗血管生成作用的多肽，和影响细胞表面受体调节的多肽诸如免疫检查点的激动剂或拮抗剂。
6.如权利要求5所述的PCPV，其中所述免疫刺激性多肽是白细胞介素或集落刺激因子，特别是GM-CSF，或者是激动剂OX40-针对性抗体。
7.如权利要求4所述的PCPV，其中所述抗原性多肽是癌症抗原诸如MUC-1抗原，病毒抗原性多肽诸如HPV-16E7抗原或HBV抗原。
8.如权利要求1至7中任一项所述的PCPV，其中所述至少一种外来核酸可操作地连接合适的用于在期望的宿主细胞或对象中表达的调节元件。
9.如权利要求4所述的PCPV，其中所述至少一种外来核酸置于痘病毒属启动子、优选痘苗病毒启动子且更优选选自以下的启动子、合成的启动子以及早期/晚期嵌合启动子的控制下：7.5K、H5R、11K7.5、SE、TK、pB2R、p28、p11和K1L启动子。
10.如权利要求1至9中任一项所述的PCPV，其中所述至少一种外来核酸插入在VEGF基因座中。
11.一种通过在包含外来核酸的转移质粒与PCPV基因组之间的同源重组生成权利要求1至10中任一项所述的PCPV的方法，所述外来核酸的5’和3’侧翼有分别存在于插入位点上游和下游的PCPV序列，其中所述方法包含生成所述转移质粒的步骤和将所述转移质粒引入到合适的宿主细胞的步骤，尤其是与包含存在于转移质粒中的侧翼序列的PCPV病毒一起引入。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述至少一种外来核酸在PCPV基因组中的插入位点是在病毒基因中、在基因间隔区中、在PCPV基因组不编码基因产物的部分中或者在重复基因座中，所述病毒基因优选非必需病毒基因。
13.如权利要求12所述的方法，其中将所述外来核酸插入所述PCPV基因组之后，插入位点处的病毒基因座至少部分地缺失，产生所述病毒功能的缺损PCPV病毒。
14.如权利要求12或13所述的方法，其中所述至少一种外来核酸插入到VEGF基因座中。
15.如权利要求11至14中任一项所述的方法，其中所述转移质粒进一步包含一种或多种选择和/或可检测的基因，以便于鉴定重组PCPV。
16.如权利要求15所述的方法，其中在能够在所述选择或可检测的基因中提供双链断裂的内切核酸酶的存在下将所述转移质粒引入宿主细胞。
17.如权利要求15或16所述的方法，其中所述选择基因是编码允许在选择性培养基中生长的鸟嘌呤磷酸核糖转移酶的GPT基因，和/或所述可检测的基因编码GFP、e-GFP或mCherry。
18.如权利要求11至17中任一项所述的方法，其中所述合适的宿主细胞是牛鼻甲骨(BT)细胞。
19.如权利要求11至18中任一项所述的方法，用于生成(a)PCPV病毒，其包含在一个或两个VEGF基因座插入有优选在早期/晚期痘苗pH5R启动子转录控制下的编码人MUC-1抗原的核酸；或者(b)PCPV病毒，其包含在一个或两个VEGF基因座插入有优选在早期/晚期痘苗p7.5启动子转录控制下的编码膜锚定的HPV-16非致癌E7抗原的核酸。
20.一种用于扩增如权利要求1至10中任一项所述的PCPV或者通过如权利要求11至19中任一项所述的方法生成的PCPV的方法，包含以下步骤：a)制备生产者细胞系，b)转染或感染所制备的生产者细胞系，c)在合适的条件下培养转染的或感染的生产者细胞系以允许产生病毒，d)从所述生产者细胞系的培养物中回收所产生的病毒，以及任选地e)纯化所述回收的病毒。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述生产者细胞是HeLa。
22.一种组合物，其包含治疗有效量的如权利要求1至10中任一项所述的PCPV或通过如权利要求20至21中任一项所述的方法扩增的PCPV以及药学上可接受的媒剂。
23.如权利要求22所述的组合物，其中所述组合物被配制成包含以下的单个剂量：约103至约1012pfu，有利地约104pfu至约1011pfu，优选约105pfu至约1010pfu；更优选约106pfu至约109pfu的PCPV。
24.如权利要求22或23所述的组合物，其中所述组合物被配制用于静脉内、肌内、皮下或者肿瘤内施用。
25.如权利要求22至24中任一项所述的组合物，其用于治疗或预防由病原性生物体或不期望的细胞分裂引起的疾病或病理状况的用途。
26.一种治疗方法，其包含以足以治疗或预防由病原性生物体或不期望的细胞分裂引起的疾病或病理状况的量向有需要的对象施用权利要求22至25中任一项所述的组合物。
27.一种抑制肿瘤细胞生长的方法，其包含向有需要的对象施用权利要求22至25中任一项所述的组合物。
28.如权利要求25至27中任一项所述的用途或方法，包含2至6次每周施用、随后可能以3周间隔施用2至15次包含106至109pfu的所述PCPV组合物。
29.如权利要求25至28中任一项所述的用途或方法，其中所述方法或用途用于治疗选自以下的癌症：肾癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌、肝癌、胃癌、胆管癌、子宫内膜癌、胰腺癌和卵巢癌以及过表达MUC1的癌症。
30.如权利要求29所述的用途或方法，其用于用编码MUC1抗原的PCPV治疗患有非小细胞肺癌(NSCL)的对象。
31.如权利要求29所述的用途或方法，其用于用编码HPV16 E7抗原的PCPV治疗HPV阳性的癌症诸如宫颈癌或头颈癌。
32.如权利要求25至31中任一项所述的用途或方法，其与选自以下的一种或多种其他治疗联合进行：手术、放疗、化疗、冷冻疗法、激素疗法、毒素疗法、免疫疗法、细胞因子疗法、靶向癌症治疗、基因治疗、光动力疗法和移植。
33.如权利要求32所述的用途或方法，其根据包含依次施用一种或多种初免组合物和一种或多种加强组合物的初免加强方法来进行。
34.如权利要求33所述的用途或方法，其中所述初免组合物是通过肿瘤内途径施用的PCPV组合物，且所述加强组合物是通过静脉内途径施用的MVA组合物。
35.一种用于引发或刺激和/或重定向免疫应答的方法，其包含以足以活化对象免疫的量向有需要的对象施用权利要求22至25中任一项所述的组合物。
36.如权利要求35所述的方法，其产生以下特性中的至少一种：
√从PBMC分泌高水平的IFNα；
√活化单核细胞衍生的树突状细胞；
√诱导T细胞活化或增殖；
√MDSC中更好的细胞因子/趋化因子谱；
√活化APC；
√人巨噬细胞M2到M1的转化；和/或
√通过TLR9介导的途径或其他先天免疫刺激途径诱导免疫。
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