CN116121207A - 一种表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的重组羊口疮病毒及其制备方法和应用 - Google Patents

一种表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的重组羊口疮病毒及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的重组羊口疮病毒，所述重组羊口疮病毒为：先将羊口疮病毒的132基因替换为核苷酸序列如SEQ ID NO：5的基因序列1得到重组病毒1，再将重组病毒1中核苷酸序列如SEQ ID NO：5的基因序列1替换为核苷酸序列如SEQ ID NO：6的基因序列2，得到的重组羊口疮病毒。本发明以ORFV作为载体，将PCV3经过优化的Cap基因替换ORFV病毒的132基因制备重组羊口疮病毒。该重组羊口疮病毒可以稳定表达猪圆环病毒3型Cap蛋白，为预防猪圆环病毒3型相关疾病提供疫苗侯选株，也为开展其他病毒的重组羊口疮病毒的研制提供可行的技术平台。

Description

一种表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的重组羊口疮病毒及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体地，涉及一种表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的重组羊口疮病毒及其制备方法和应用。
背景技术
猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3，PCV3)属圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus)，为单链、环状DNA病毒，基因组大小为2000nt，包含3个主要的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，ORF1编码复制酶相关蛋白(Rep)经病毒正向DNA转录，ORF2编码衣壳蛋白(Cap)经病毒DNA互补链转录并翻译，ORF3转录方向与ORF1一致，但编码蛋白的功能还尚未可知。Cap蛋白是PV3的免疫原性蛋白，可刺激机体发生特异性免疫反应，目前作为致病机制和免疫相关研究的重要蛋白。自2015年在美国首次发现猪圆环病毒3型以来，该病毒已在亚洲、欧洲和美洲的猪群中广泛流行。
PCV3感染主要引起猪皮炎肾病综合征和母猪繁殖障碍，剖检病猪可见肺部有不同程度的水肿和气肿，伴有肺门淋巴结和腹股沟淋巴结肿大，肾、小肠、大肠出血性病变，心、肝、脾、脑等器官淤血。相关研究表明，PCV3可逃避宿主的先天性免疫反应，导致淋巴细胞发育不良和坏死，造成免疫系统损伤，常与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、经典猪瘟病毒(CSFV)等多种病原体共感染，给养猪场的防疫难度带来了不小挑战，同时对养猪业的健康发展造成严重威胁。
目前，对于PCV3的防控仍停留在消毒、早发现早淘汰等常规策略上，缺乏针对该病的有效防控措施。疫苗是病毒疾病防控的重要手段之一，而PCV2疫苗对于PCV3无交叉免疫保护性，所以PCV3疫苗的研发是控制该病的重要方法；但是目前仍没有建立PCV3稳定的细胞增殖体系，这也为PCV3相关疫苗的研发带来了巨大困难。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的重组羊口疮病毒及其制备方法和应用。
羊口疮病毒(Orf virus，ORFV)属痘病毒科(Poxviridae)、副痘病毒属(Parapoxvirus)，与PCV3同为DNA病毒。研究证实，外源性插入基因会在ORFV的编码区得到很好的表达，这个特性决定了ORFV可以作为外源基因表达的活病毒载体。另外，ORFV作为后病毒载体的优势包括：①具有严格的宿主选择性和皮肤适应性；②引起的损伤具有皮肤局限性、快速痊愈、不会造成病毒感染的全身化；③快速启动机体的非特异性细胞免疫反应，树突状细胞参与反应，即使在非宿主体内也产生类似的反应；④可以快速启动机体的特异性免疫反应，包括自然杀伤细胞、巨噬细胞、细胞毒性和辅助性T细胞的快速激活和补体介导的细胞杀伤作用；⑤免疫后不产生中和性的血清抗体，和痘病毒属等其他病毒无交叉反应，可以多次重复免疫。所有的这些优势保证了利用ORFV作为活载体疫苗进行重复免疫的可行性。
本发明的第一目的是提供一种表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的重组羊口疮病毒。
本发明的第二目的是提供一种表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的重组羊口疮病毒的制备方法。
本发明的第三目的是提供上述制备方法制备得到的重组羊口疮病毒。
本发明的第四目的是提供上述重组羊口疮病毒作为病毒载体在制备猪圆环病毒3型疫苗中的应用。
本发明的第五目的是提供一种猪圆环病毒3型疫苗。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
一种表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的重组羊口疮病毒，所述重组羊口疮病毒为：先将羊口疮病毒的132基因替换为核苷酸序列如SEQ ID NO：5的基因序列1得到重组病毒1，再将重组病毒1中核苷酸序列如SEQ ID NO：5的基因序列1替换为核苷酸序列如SEQ IDNO：6的基因序列2，得到的重组羊口疮病毒。
优选地，所述重组羊口疮病毒的制备方法为：在宿主细胞中，羊口疮病毒和重组质粒1进行同源重组得到重组病毒1，重组病毒1再与重组质粒2进行同源重组获得重组羊口疮病毒；
所述重组质粒1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述重组质粒2的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
更优选地，所述宿主细胞为羊胚胎鼻甲骨细胞(OFTu)。
一种表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的重组羊口疮病毒的制备方法，包括以下步骤：
S1.利用羊口疮病毒感染宿主细胞得到感染细胞1，将核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的重组质粒1转染到感染细胞1中，进行同源重组，收获重组病毒1；
S2.利用步骤S1得到的重组病毒1感染宿主细胞得到感染细胞2，将核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的重组质粒2转染到感染细胞2中，进行同源重组，收获病毒，即得重组羊口疮病毒。
优选地，步骤S1中所述羊口疮病毒的MOI值为0.1～1。
更优选地，步骤S1中所述羊口疮病毒的MOI值为0.2。
优选地，步骤S2中所述重组病毒1的MOI值为0.1～1。
更优选地，步骤S2中所述重组病毒1的MOI值为0.2。
优选地，步骤S1和步骤S2中所述宿主细胞为羊胚胎鼻甲骨细胞(OFTu)。
本发明还请求保护上述制备方法制备得到的重组羊口疮病毒。
本发明还请求保护上述任一所述重组羊口疮病毒和/或上述制备方法制备得到的重组羊口疮病毒作为病毒载体在制备圆环病毒3型疫苗中的应用。
本发明还请求保护一种猪圆环病毒3型疫苗，所述猪圆环病毒3型疫苗中表达抗原的病毒株为上述的重组羊口疮病毒和/或上述制备方法制备得到的的重组羊口疮病毒。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的重组羊口疮病毒，所述重组羊口疮病毒为：先将羊口疮病毒的132基因替换为核苷酸序列如SEQ ID NO：5的基因序列1得到重组病毒1，再将重组病毒1中核苷酸序列如SEQ ID NO：5的基因序列1替换为核苷酸序列如SEQ ID NO：6的基因序列2，得到的重组羊口疮病毒。本发明以ORFV作为载体，将PCV3经过优化的Cap基因替换ORFV病毒的132基因制备重组羊口疮病毒。该重组羊口疮病毒可以稳定表达猪圆环病毒3型Cap蛋白，为预防猪圆环病毒3型相关疾病提供疫苗侯选株，也为开展其他病毒的重组羊口疮病毒的研制提供可行的技术平台。
附图说明
图1为重组质粒pEGFP-132LF-7SC7E-132RF和pEGFP-132LF-7SC-132RF的示意图；
图2为扩增电泳鉴定图；M：DL 2000DNAMarker；1：132LF片段；2：132RF片段；3：VV7.5启动子片段；4：ORFV 127基因信号肽片段(SP片段)；5：EGFP片段；6：截短型PCV3Cap片段；
图3为质粒双酶切电泳鉴定图；A：pEGFP-7E质粒的双酶切电泳鉴定图；B：pEGFP-132LF-7E质粒的双酶切电泳鉴定图；C：pEGFP-132LF-7E-132RF质粒的双酶切电泳鉴定图；
图4为pEGFP-132LF-7SC7E-132RF质粒和pEGFP-132LF-7SC-132RF质粒的双酶切电泳鉴定图；A：pEGFP-132LF-7SC7E-132RF质粒的双酶切电泳鉴定图；B：pEGFP-132LF-7SC-132RF质粒的双酶切电泳鉴定图；
图5为pEGFP-132LF-7SC7E-132RF质粒和携带ORFV病毒的OFTu细胞的ORFV GDZC病毒株的同源重组示意图；
图6为重组病毒rORFVΔ132-PCV3Cap-EGFP的荧光观察结果图；其中，GFP为荧光视野；BF为白光视野；Merge为荧光视野与白光视野叠加；
图7为重组病毒的PCR鉴定图；其中，A为ORFV 132基因鉴定图：M：DL 2000DNAMarker；1：重组病毒rORFVΔ132-PCV3Cap-EGFP的132基因扩增产物；2：重组羊口疮病毒(rORFVΔ132-PCV3Cap)的132基因扩增产物；3：ORFV GDZC病毒株的132基因扩增产物；B为Cap基因鉴定图：M：DL 2000DNA Marker；1：重组病毒rORFVΔ132-PCV3Cap-EGFP的Cap基因扩增产物；2：重组羊口疮病毒(rORFVΔ132-PCV3Cap)的Cap基因扩增产物；3：ORFV GDZC病毒株的Cap基因扩增产物；
图8为重组病毒rORFVΔ132-PCV3Cap-EGFP和重组羊口疮病毒(rORFVΔ132-PCV3Cap)的Westernblot鉴定图。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1重组质粒pEGFP-132LF-7SC7E-132RF和pEGFP-132LF-7SC-132RF的构建
重组质粒pEGFP-132LF-7SC7E-132RF和pEGFP-132LF-7SC-132RF的示意图如图1所示。
(1)利用艾科瑞通用基因组DNA提取试剂盒(AG21009/AG21010)提取羊口疮病毒GDZC株(ORFV GDZC)和猪圆环病毒3型GDHN株(PCV3 GDHN，SEQ ID NO：37)进行全基因组提取，得到ORFV GDZC全基因组DNA和PCV3 GDHN全基因组DNA。
(2)根据GenBank公开的ORFV全基因组序列(No.KF234407)的基因组序列设计ORFV132基因左右臂引物和ORFV 127基因信号肽引物；其中ORFV 132基因左臂引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示，ORFV 132基因右臂引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示，ORFV 127基因信号肽引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：11和SEQ IDNO：12所示。
根据步骤(1)得到的PCV3 GDHN全基因组DNA，确认Cap基因序列，使用NovoPro在线工具去除其核定位序列，接着根据OFTu细胞的密码子偏好性，优化合成截短型PCV3Cap基因(SEQ ID NO：3)；根据截短型PCV3Cap基因设计PCV3Cap基因引物，PCV3Cap基因引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示。
根据pEGFP-N1载体序列(SEQ ID NO：4)设计EGFP基因特异性引物，EGFP基因特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示。
基于GenBank公开的pSPV-EGFP载体序列(No.GU062789)合成VV 7.5启动子(SEQID NO：34)，并设计VV 7.5启动子引物，VV 7.5启动子引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36所示。
引物具体信息如表1所示。
表1引物具体信息
引物 引物序列(5’→3’)
132LF-F(SEQ ID NO：7) CCATCGAGAACCGCAAGATCTCGGG
132LF-R(SEQ ID NO：8) TCCTCACCCTTAAAAGTTGGGCGTT
132RF-F(SEQ ID NO：9) CAGCAGTTTTTGTAGCGGGACGTTT
132RF-R(SEQ ID NO：10) TACGGTCACTTGTTTTCTCGTCTCT
SP-F(SEQ ID NO：11) ATGTCGAAGAACAAAATTCTGGT
SP-R(SEQ ID NO：12) CGCATCTGTGTATAATGTATAAG
Cap-F(SEQ ID NO：13) ATGCCTACCGCTGGAACCTACTACA
Cap-R(SEQ ID NO：14) TTACGCAGCACGCTCTTGTATCTGA
EGFP-F(SEQ ID NO：15) ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG
EGFP-R(SEQ ID NO：16) TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG
VV 7.5-F(SEQ ID NO：35) CTGCAGATATACTATATAGTAATAC
VV 7.5-R(SEQ ID NO：36) CGTCACTGTTCTTTATGATTCTACT
以步骤(1)得到的ORFV GDZC全基因组DNA作为模板，以132LF-F(SEQ ID NO：7)和132LF-R(SEQ ID NO：8)作为扩增引物进行PCR扩增，得到132LF片段；以132RF-F(SEQ IDNO：9)和132RF-R(SEQ ID NO：10)作为扩增引物进行PCR扩增，得到132RF片段；以SP-F(SEQID NO：11)和SP-R(SEQ ID NO：12)作为扩增引物进行PCR扩增，得到SP片段(ORFV 127基因信号肽片段，SEQ ID NO：39)。
以截短型PCV3Cap基因(SEQ ID NO：3)作为模板，以Cap-F(SEQ ID NO：13)和Cap-R(SEQ ID NO：14)作为扩增引物进行PCR扩增，得到截短型PCV3Cap片段。
以pEGFP-N1载体序列(SEQ ID NO：4)作为模板，以EGFP-F(SEQ ID NO：15)和EGFP-R(SEQ ID NO：16)作为扩增引物进行PCR扩增，得到EGFP片段(SEQ ID NO：40)。
以VV 7.5启动子(SEQ ID NO：34)作为模板，以VV 7.5-F(SEQ ID NO：35)和VV7.5-R(SEQ ID NO：36)作为扩增引物进行PCR扩增，得到VV 7.5启动子片段。
以132LF-F(SEQ ID NO：7)和132LF-R(SEQ ID NO：8)为例，按照表2所示PCR反应体系进行PCR扩增，具体如下：
表2PCR反应体系
Figure BDA0004085701460000061
PCR反应程序：98℃，5min；98℃，10s，56℃，15s，72℃，10s；35个循环；72℃，10min。
PCR反应结束后收集PCR产物，即为132LF片段，进行琼脂糖凝胶电泳。
分别用132RF-F和132RF-R、SP-F和SP-R、Cap-F和Cap-R、EGFP-F和EGFP-R、VV 7.5-F和VV 7.5-R替换表2中所示上上引物和下上引物，并替换对应的模板DNA，进行PCR扩增，得到132RF片段、ORFV 127基因信号肽片段(SP片段)、EGFP片段、截短型PCV3Cap片段和VV 7.5启动子片段；并对上述片段进行琼脂糖凝胶电泳。
琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示，结果显示：132LF片段大小为984bp，132RF片段大小为1001bp，ORFV 127基因信号肽片段(SP片段)的大小为66bp，EGFP片段的大小为720bp，截短型PCV3Cap片段的大小为552bp，VV 7.5启动子片段的大小为269bp。利用聚合美生物科技有限公司的DNA凝胶回收试剂盒回收各个片段，分别将各个片段克隆至不同的pMD18-T载体上，得到pMD18-T-132LF质粒、pMD18-T-132RF质粒、pMD18-T-VV 7.5质粒、pMD18-T-SP质粒、pMD18-T-EGFP质粒和pMD18-T-Cap质粒。
(3)7E片段的合成
以步骤(2)得到的pMD18-T-VV 7.5质粒为模板，利用引物VV 7.5-1-F(SEQ ID NO：17)和VV 7.5-1-R(SEQ ID NO：18)进行PCR扩增。PCR反应体系如表3所示。
表3PCR反应体系
试剂 体体(μL)
ApexHF FS PCR Master Mix(2×) 25
VV 7.5-1-F(SEQ ID NO：17) 2
VV 7.5-1-R(SEQ ID NO：18) 2
模板(pMD18-T-VV 7.5质粒) 1
灭菌超灭水 20
总体体 50
PCR程序：98℃，5min；98℃，10s，56℃，15s，72℃，5s；30个循环；72℃，10min。
PCR反应结束后，用聚合美生物科技有限公司的DNA凝胶回收试剂盒进行回收，得到VV 7.5-1片段。
将引物VV 7.5-1-F(SEQ ID NO：17)和VV 7.5-1-R(SEQ ID NO：18)替换成EGFP-1-F(SEQ ID NO：19)和EGFP-1-R(SEQ ID NO：20)，将模板替换为步骤(2)得到的pMD18-T-EGFP质粒，进行同等反应得到EGFP-1片段。
引物信息如表4所示。
表4引物信息
Figure BDA0004085701460000071
以VV 7.5-1片段和EGFP-1片段作为模板，进行Overlap PCR反应，PCR反应体系如表5所示。
表5PCR反应体系
试剂 体体(μL)
ApexHF FS PCR Master Mix(2×) 25
VV 7.5-1-F(SEQ ID NO：17) 2
EGFP-1-R(SEQ ID NO：20) 2
VV 7.5-1片段 1
EGFP-1片段 1
灭菌超灭水 19
总体体 50
PCR程序：98℃，5min；98℃，10s，56℃，15s，72℃，5s；35个循环；72℃，10min。
利用聚合美生物科技有限公司的DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物，得到7E片段。
(4)7SC-1片段和7SC-2片段的合成
将表3所示PCR反应体系中的引物VV 7.5-1-F(SEQ ID NO：17)和VV 7.5-1-R(SEQID NO：18)替换为VV 7.5-2-F(SEQ ID NO：21)和VV 7.5-2-R(SEQ ID NO：22)，进行PCR反应，得到VV 7.5-2片段。
将表3所示PCR反应体系中的引物VV 7.5-1-F(SEQ ID NO：17)和VV 7.5-1-R(SEQID NO：18)替换为SP-1-F(SEQ ID NO：23)和SP-1-R(SEQ ID NO：24)，将模板替换为步骤(1)制备得到的pMD18-T-SP质粒，进行PCR反应，得到SP-1片段。
将表3所示PCR反应体系中的引物VV 7.5-1-F(SEQ ID NO：17)和VV 7.5-1-R(SEQID NO：18)替换为Cap-1-F(SEQ ID NO：25)和Cap-1-R(SEQ ID NO：26)，将模板替换为步骤(1)制备得到的pMD18-T-Cap质粒，进行PCR反应，得到Cap-1片段。
将表3所示PCR反应体系中的引物VV 7.5-1-F(SEQ ID NO：17)和VV 7.5-1-R(SEQID NO：18)替换为Cap-1-F(SEQ ID NO：25)和Cap-2-R(SEQ ID NO：27)，将模板替换为步骤(1)制备得到的pMD18-T-Cap质粒，进行PCR反应，得到Cap-2片段。
各个引物的核苷酸信息如表6所示。
表6各个引物的核苷酸信息
Figure BDA0004085701460000081
Figure BDA0004085701460000091
以VV 7.5-2片段和SP-1片段为模板，进行Overrlap PCR反应；PCR反应体系如表7所示。
表7PCR反应体系
试剂 体体(μL)
ApexHF FS PCR Master Mix(2×) 25
VV 7.5-2-F(SEQ ID NO：21) 2
SP-1-R(SEQ ID NO：24) 2
VV 7.5-2片段 1
SP-1片段 1
灭菌超灭水 19
总体体 50
PCR程序：98℃，5min；98℃，10s，56℃，15s，72℃，5s；35个循环；72℃，10min。
利用聚合美生物科技有限公司的DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物，得到7S片段。
以Cap-1片段和7S片段为模板，进行Overlap PCR反应；反应体系如表8所示。
表8PCR反应体系
试剂 体体(μL)
ApexHF FS PCR Master Mix(2×) 25
VV 7.5-2-F(SEQ ID NO：21) 2
Cap-1-R(SEQ ID NO：26) 2
7S片段 1
Cap-1片段 1
灭菌超灭水 19
总体体 50
PCR程序：98℃，5min；98℃，10s，56℃，15s，72℃，5s；35个循环；72℃，10min。
利用聚合美生物科技有限公司的DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物，得到7SC-1片段。
将表8所示反应体系中的VV 7.5-2-F(SEQ ID NO：21)替换为VV 7.5-1-F(SEQIDNO：17)，将Cap-1-R(SEQ ID NO：26)替换为Cap-2-R(SEQ ID NO：27)，将Cap-1片段替换为Cap-2片段，进行PCR反应，得到7SC-2片段。
(5)132LF-1片段和132RF-1片段的合成
以步骤(1)得到的pMD18-T-132LF质粒作为模板，利用引物132LF-1-F(SEQ ID NO：28)和132LF-1-R(SEQ ID NO：29)进行PCR扩增，PCR反应体系如表9所示。
表9PCR反应体系
试剂 体体(μL)
ApexHF FS PCR Master Mix(2×) 25
132LF-1-F(SEQ ID NO：28) 2
132LF-1-R(SEQ ID NO：29) 2
模板(pMD18-T-132LF质粒) 1
灭菌超灭水 20
总体体 50
PCR程序：98℃，5min；98℃，10s，56℃，15s，72℃，5s；30个循环；72℃，10min。
PCR反应结束后，用聚合美生物科技有限公司的DNA凝胶回收试剂盒进行回收，得到132LF-1片段。
将表9所示反应体系中的引物132LF-1-F(SEQ ID NO：28)和132LF-1-R(SEQ IDNO：29)替换为132RF-1-F(SEQ ID NO：30)和132RF-1-R(SEQ ID NO：31)，将模板替换为步骤(1)制备得到的pMD18-T-132RF质粒，进行PCR反应得到132RF-1片段。
各个引物的核苷酸信息如表10所示。
表10各个引物的核苷酸信息
Figure BDA0004085701460000101
Figure BDA0004085701460000111
(6)重组质粒pEGFP-132LF-7SC7E-132RF的构建
将步骤(3)得到的7E片段和pEGFP-N1载体，分别用EcoR I酶和Kpn I酶进行双酶切，利用聚合美生物科技有限公司的DNA凝胶回收试剂盒回收酶切产物，得到酶切后的7E片段和线性化的pEGFP-N1载体；7E片段酶切反应体系如表11所示，pEGFP-N1载体酶切反应体系如表12所示。
表11 7E片段酶切反应体系
试剂 体体(μL)
EcoR I酶 1
Kpn I酶 1
10×M Buffer 2
7E片段 10
灭菌超灭水 6
总体体 20
表12pEGFP-N1载体酶切反应体系
试剂 体体(μL)
EcoR I酶 1
Kpn I酶 1
10×M Buffer 2
pEGFP-N1载体 3
灭菌超灭水 13
总体体 20
酶切条件为：37℃酶切3h。
将酶切后的7E片段和线性化的pEGFP-N1载体用DNA连接酶进行连接，连接反应条件为：16℃连接3h；连接反应体系如表13所示。
表13连接反应体系
试剂 体体(μL)
酶切后的7E片段 3
线性化的pEGFP-N1载体 2
DNA连接酶 5
总体体 10
连接反应结束后得到连接产物，将连接产物转化至DH5α感受态细胞中，在含有卡那霉素的LB固体培养基中培养14h，挑选阳性灭落接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，180r/min培养12～14h后，提取质粒，用EcoR I酶和Kpn I酶进行双酶切鉴定，鉴定结果如图3A所示。并将质粒送至擎科生物科技有限公司测序，测序正确(含有7E片段)的重组质粒为pEGFP-7E质粒。
将pEGFP-7E质粒和步骤(5)得到的132LF-1片段，分别用Hind III酶和EcoR I酶进行双酶切，利用聚合美生物科技有限公司的DNA凝胶回收试剂盒回收酶切产物，得到酶切后的132LF-1片段和线性化的pEGFP-7E质粒；132LF-1片段酶切反应体系如表14所示，pEGFP-7E质粒酶切反应体系如表15所示。
表14 132LF-1片段酶切反应体系
试剂 体体(μL)
Hind III酶 1
EcoR I酶 1
10×M Buffer 2
132LF-1片段 10
灭菌超灭水 6
总体体 20
表15pEGFP-7E质粒酶切反应体系
试剂 体体(μL)
Hind III酶 1
EcoR I酶 1
10×M Buffer 2
pEGFP-7E质粒 3
灭菌超灭水 13
总体体 20
酶切条件为：37℃酶切3h。
将酶切后的132LF-1片段和线性化的pEGFP-7E质粒用DNA连接酶进行连接，连接反应条件为：16℃连接3h；连接反应体系如表16所示。
表16连接反应体系
试剂 体体(μL)
酶切后的132LF-1片段 3
线性化的pEGFP-7E载体 2
DNA连接酶 5
总体体 10
连接反应结束后得到连接产物1，将连接产物1转化至DH5α感受态细胞中，在含有卡那霉素的LB固体培养基中培养14h，挑选阳性灭落接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，180r/min培养12～14h后，提取质粒，用Hind III酶和KpnI酶进行双酶切鉴定，鉴定结果如图3B所示。并将质粒送至擎科生物科技有限公司测序，测序正确(含有132LF-1片段)的重组质粒为pEGFP-132LF-7E质粒。
将步骤(5)得到的132RF-1片段和pEGFP-132LF-7E质粒分别用KpnI酶和BamH I内切酶进行双酶切，利用聚合美生物科技有限公司的DNA凝胶回收试剂盒回收酶切产物，得到酶切后的132RF-1片段和线性化的pEGFP-132LF-7E质粒；132RF-1片段酶切反应体系如表17所示，pEGFP-132LF-7E质粒酶切反应体系如表18所示。
表17 132RF-1片段酶切反应体系
试剂 体体(μL)
BamH I酶 1
Kpn I酶 1
10×M Buffer 1
132RF-1片段 10
灭菌超灭水 7
总体体 20
表18pEGFP-132LF-7E质粒酶切反应体系
试剂 体体(μL)
BamH I酶 1
Kpn I酶 1
10×M Buffer 1
pEGFP-132LF-7E载体 3
灭菌超灭水 14
总体体 20
酶切条件为：37℃酶切3h。
将酶切后的132RF-1片段和线性化的pEGFP-132LF-7E质粒用DNA连接酶进行连接，连接反应条件为：16℃连接3h；连接反应体系如表19所示。
表19连接反应体系
试剂 体体(μL)
酶切后的132RF-1片段 3
线性化的pEGFP-132LF-7E载体 2
DNA连接酶 5
总体体 10
连接反应结束后得到连接产物2，将连接产物2转化至DH5α感受态细胞中，在含有卡那霉素的LB固体培养基中培养14h，挑选阳性灭落接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，180r/min培养12～14h后，提取质粒，用Hind III酶和BamH I酶进行双酶切鉴定，鉴定结果如图3C所示。并将质粒送至擎科生物科技有限公司测序，测序正确(含有132RF-1片段)的重组质粒为pEGFP-132LF-7E-132RF质粒。
将pEGFP-132LF-7E-132RF质粒用EcoR I酶进行单酶切，利用聚合美生物科技有限公司的DNA凝胶回收试剂盒回收酶切产物，得到线性化的pEGFP-132LF-7E-132RF质粒；酶切条件为：37℃酶切3h；酶切反应体系如表20所示。
表20酶切反应体系
试剂 体体(μL)
EcoR I酶 1
10×H Buffer 2
pEGFP-132LF-7E-132RF质粒 3
灭菌超灭水 14
总体体 20
将线性化的pEGFP-132LF-7E-132RF质粒和步骤(4)得到的7SC-1片段利用艾科瑞生物有限公司OK clon DNA连接试剂盒进行无缝克隆；反应条件为：50℃连接15min；反应体系如表21所示。
表21反应体系
试剂 体体(μL)
OK clon Master Mix(5×) 2
线性化的pEGFP-132LF-7E-132RF质粒 3
7SC-1片段 1
灭菌超灭水 4
总体体 10
反应结束后得到连接产物3，将连接产物3转化至DH5α感受态细胞中，在含有卡那霉素的LB固体培养基中培养14h，挑选阳性灭落接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，180r/min培养12～14h后，提取质粒，用EcoR I酶和Kpn I酶进行双酶切鉴定，鉴定结果如图4A所示。并将质粒送至擎科生物科技有限公司测序，测序正确(含有7SC-1片段)的重组质粒为pEGFP-132LF-7SC7E-132RF质粒(SEQ ID NO：1)。
(7)重组质粒pEGFP-132LF-7SC-132RF的构建
将pEGFP-132LF-7SC7E-132RF质粒和步骤(4)得到的7SC-2片段分别用EcoR I酶和Kpn I酶进行双酶切，利用聚合美生物科技有限公司的DNA凝胶回收试剂盒回收酶切产物，得到线性化的pEGFP-132LF-7SC7E-132RF质粒和酶切后的7SC-2片段；pEGFP-132LF-7SC7E-132RF质粒的酶切反应体系如表22所示，7SC-2片段的酶切反应体系如表23所示。
表22pEGFP-132LF-7SC7E-132RF质粒的酶切反应体系
试剂 体体(μL)
EcoR I酶 1
Kpn I酶 1
10×M Buffer 1
pEGFP-132LF-7SC7E-132RF质粒 3
灭菌超灭水 14
总体体 20
表23 7SC-2片段酶切反应体系
试剂 体体(μL)
EcoR I酶 1
Kpn I酶 1
10×M Buffer 1
7SC-2片段 10
灭菌超灭水 7
总体体 20
酶切条件为：37℃酶切3h。
将酶切后的7SC-2片段和线性化的pEGFP-132LF-7SC7E-132RF质粒用DNA连接酶进行连接，连接反应条件为：16℃连接3h；连接反应体系如表24所示。
表24连接反应体系
试剂 体体(μL)
酶切后的7SC-2片段 3
线性化的pEGFP-132LF-7SC7E-132RF质粒 2
DNA连接酶 5
总体体 10
连接反应结束后得到连接产物4，将连接产物4转化至DH5α感受态细胞中，在含有卡那霉素的LB固体培养基中培养14h，挑选阳性灭落接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，180r/min培养12～14h后，提取质粒，用Hind III酶和BamH I酶进行双酶切鉴定，鉴定结果如图4B所示。并将质粒送至擎科生物科技有限公司测序，测序正确的重组质粒为pEGFP-132LF-7SC-132RF质粒(SEQ ID NO：2)。
实施例2重组羊口疮病毒的构建及筛选
重组羊口疮病毒的构建过程中，先将羊口疮病毒的132基因(NO：AAR98227)替换为核苷酸序列如SEQ ID NO：5的基因序列1得到重组病毒1，再将重组病毒1中核苷酸序列如SEQ ID NO：5的基因序列1替换为核苷酸序列如SEQ ID NO：6的基因序列2，得到重组羊口疮病毒。
其中基因序列1(SEQ ID NO：5)位于pEGFP-132LF-7SC7E-132RF质粒的序列中；基因序列2(SEQ ID NO：6)位于pEGFP-132LF-7SC-132RF质粒的序列中。
1、重组病毒rORFVΔ132-PCV3Cap-EGFP的构建
S1.利用MOI＝0.2的ORFV GDZC病毒株感染羊胚胎鼻甲骨细胞(OFTu细胞)，将OFTu细胞用ORFV GDZC病毒株孵育2h后，得到携带ORFV病毒的OFTu细胞，按照Lipofectamine2000转染试剂的使用说明，将实施例1制备得到的pEGFP-132LF-7SC7E-132RF质粒转染携带ORFV病毒的OFTu细胞；其中pEGFP-132LF-7SC7E-132RF质粒和携带ORFV病毒的OFTu细胞的ORFV GDZC病毒株的同源重组示意图如图5所示。
待细胞出现80％病变时，收集细胞反复冻融3次，收取上清液。
S2.取100μL步骤S1收取的上清液，利用MEM将上清液进行10-1～10-11稀释，每个稀释倍数的稀释液均取100μL加入96孔板中，每个稀释倍数重复8个孔。24h后，观察荧光，收集10-1～10-4稀释倍数的孔洞中发出荧光的细胞和细胞液，反复冻融3次，收集上清液1。
按照步骤S2所述方法将收集得到的上清液1进行3次稀释，并将挑选的细胞冻融，收集上清液2(病毒液)。
S3.将步骤S2收集的上清液2(病毒液)进行10-1～10-5稀释，加入6孔板中，2h后弃液体，向6孔板中加入2mL的1％(w/w)低熔酶琼脂，48h后观察荧光。观察结果如图6所示，结果显示：病毒蚀斑可以表达荧光。
使用灭灭枪头在倒置荧光显微镜下挑取单个发荧光的病毒蚀斑，接种至新的6孔板中，向6孔板中加入2mL的1％(w/w)低熔酶琼脂，48h观察荧光并挑取单个发荧光的病毒蚀斑。(视为完成一轮荧光蚀斑筛选)
经过3轮荧光蚀斑筛选后，扩大培养，收集病毒，得到重组病毒rORFVΔ132-PCV3Cap-EGFP。
2、重组羊口疮病毒的构建
利用步骤1得到的重组病毒rORFVΔ132-PCV3Cap-EGFP(MOI＝0.2)感染OFTu细胞，将OFTu细胞用rORFVΔ132-PCV3Cap-EGFP孵育2h后，得到携带病毒的OFTu细胞，按照Lipofectamine 2000转染试剂的使用说明，将实施例1制备得到的pEGFP-132LF-7SC-132RF质粒转染携带病毒的OFTu细胞。
待细胞出现80％病变时，收集细胞反复冻融3次，收取上清液3。
S2.取100μL步骤S1收取的上清液3，利用MEM将上清液进行10-1～10-11稀释，每个稀释倍数的稀释液均取100μL加入96孔板中，每个稀释倍数重复8个孔。24h后，观察荧光，收集10-1～10-4稀释倍数的孔洞中发出荧光的细胞和细胞液，反复冻融3次，收集上清液4。
按照步骤S2所述方法将收集得到的上清液4进行3次稀释，并将挑选的细胞冻融，收集上清液5(病毒液)。
S3.将步骤S2收集的病毒液进行10-1～10-5稀释，加入6孔板中，2h后弃液体，向6孔板中加入2mL的1％(w/w)低熔酶琼脂，48h后挑取不发光的蚀斑，使用灭灭枪头在倒置荧光显微镜下挑取单个不发荧光的病毒蚀斑，接种至新的6孔板中，向6孔板中加入2mL的1％(w/w)低熔酶琼脂，48h观察荧光并挑取单个不发荧光的病毒蚀斑。(视为完成一轮蚀斑筛选)
经过3轮蚀斑筛选后，扩大培养，收集病毒，即为重组羊口疮病毒(rORFVΔ132-PCV3Cap)。
实施例3重组羊口疮病毒的鉴定
1、实验方法
(1)PCR鉴定
提取实施例2得到的重组羊口疮病毒(rORFVΔ132-PCV3Cap)的DNA，得到重组羊口疮病毒的DNA，以其作为模板，利用引物Cap-F(SEQ ID NO：13)和Cap-R(SEQ IDNO：14)进行PCR扩增，检测其Cap基因；反应体系如表25所示。
表25反应体系
Figure BDA0004085701460000171
Figure BDA0004085701460000181
PCR反应程序：98℃，5min；98℃，10s，56℃，15s，72℃，5s；35个循环；72℃，10min。
PCR反应结束后收集产物并进行电泳，观察电泳结果。
将表25所示反应体系中的Cap-F(SEQ ID NO：13)和Cap-R(SEQ ID NO：14)替换为132-F(SEQ ID NO：32)和132-R(SEQ ID NO：33)，进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行电泳，检测重组羊口疮病毒的132基因。
具体地，引物核苷酸序列信息如表26所示。
表26引物核苷酸序列
引物 引物序列(5’→3’)
Cap-F(SEQ ID NO：13) ATGCCTACCGCTGGAACCTACTACA
Cap-R(SEQ ID NO：14) TTACGCAGCACGCTCTTGTATCTGA
132-L(SEQ ID NO：32) AGGGTGAGGAGCCATGAAGTTGC
132-R(SEQ ID NO：33) GGCGCCGTCTAGGTGGCGTCGGT
对照组设置为检测ORFV GDZC病毒株的DNA的Cap基因和132基因。
并同步检测实施例2得到的重组病毒rORFVΔ132-PCV3Cap-EGFP的DNA的Cap基因和132基因。
(2)蛋白表达鉴定
以实施例3得到的重组羊口疮病毒(rORFVΔ132-PCV3Cap)为例，将重组羊口疮病毒接种OFTu细胞，培养48h后用磷酸缓冲盐溶液洗涤细胞2次，得到洗涤后细胞。
基于RIPA说明书将pmsf和RIPA裂解液混匀得到混合液，将150μL混合液和洗涤后细胞混合均匀，用枪头吹打细胞3min，静置5min，重复吹打细胞3次后转移至1.5mL的EP管中，以4℃，12000rpm的条件离心10min，收集上清液并转移至新的EP管中，加入5×SDS-PAGELoading Buffer缓冲液，沸水浴6min，得到处理好的蛋白样品。
将处理好的蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，将电泳后分离的蛋白切下对应大小的胶块(含蛋白的聚丙烯酰胺凝胶)，得到PCV3Cap蛋白、EGFP蛋白和β-actin蛋白，分别将3种蛋白进行检测；以PCV3Cap蛋白为例：
转膜板按照三层滤纸、含PCV3Cap的聚丙烯酰胺凝胶、PVDF膜和三层滤纸依次摆放组成，其中蛋白胶靠近负极，在150mA电流下转模1h。
转膜结束后，取出PVDF膜，置于现配的5％(w/w)的脱脂奶中，在摇床上以50rpm，50℃的条件封闭2h。接着用TBST洗涤缓冲液洗涤3次，每次洗涤5min，然后加入按照多克隆抗体：5％(w/w)脱脂奶＝1：10000的比例加入10mL兔抗PCV3Cap蛋白多克隆抗体，置于4℃孵育16h。
其中，兔抗PCV3Cap蛋白多克隆抗体为将核苷酸序列如SEQ ID NO：38所示的PCV3Cap蛋白多克隆抗体中Cap蛋白序列连接至pET-32a(+)载体进行原核表达，灭化蛋白接种新西兰大白兔，收获抗体即得。
孵育结束后，用TBST洗涤缓冲液洗涤3次，每次洗涤5min，洗涤结束后加入10mL的HRP标记的山羊抗兔IgG(H+L)，室温孵育2h。
然后用TBS洗涤液洗涤3次，每次5min，根据ECL说明书配置发光液，将PVDF膜置于化学发光分析仪中，加入1mL的ECL化学发光显色液进行显色，观察结果。
EGFP蛋白检测与PCV3Cap蛋白检测的区别在于：将10mL的兔抗PCV3Cap蛋白多克隆抗体替换为10mL的兔抗EGFP多克隆抗体，其余步骤相同。
β-actin蛋白检测与PCV3Cap蛋白检测的区别在于：将10mL的兔抗PCV3Cap蛋白多克隆抗体替换为10mL的鼠抗β-actin蛋白多克隆抗体，将10mL的HRP标记的山羊抗兔IgG(H+L)替换为HRP标记的山羊抗小鼠IgG(H+L)，其余步骤相同。
2、实验结果
重组羊口疮病毒中的132基因的检测结果如图7A所示，Cap基因的检测结果如图7B所示；结果显示：在重组病毒rORFVΔ132-PCV3Cap-EGFP和重组羊口疮病毒(rORFVΔ132-PCV3Cap)，均不能检测到132基因，说明ORFV病毒中的132基因被成功替换；在重组病毒rORFVΔ132-PCV3Cap-EGFP和重组羊口疮病毒(rORFVΔ132-PCV3Cap)，均可以检测到Cap基因，说明Cap基因成功转入ORFV病毒中。
蛋白表达鉴定结果如图8所示，结果显示：重组病毒rORFVΔ132-PCV3Cap-EGFP和重组羊口疮病毒(rORFVΔ132-PCV3Cap)，均可以表达Cap蛋白；而重组病毒rORFVΔ132-PCV3Cap-EGFP除表达Cap蛋白外还能够正常表达EGFP蛋白。
实施例4一种猪圆环3型病毒疫苗的制备
将实施例2得到的重组羊口疮病毒(rORFVΔ132-PCV3Cap)以MOI＝1的剂量接种OFTu细胞，48h后收获重组羊口疮病毒(rORFVΔ132-PCV3Cap)上清液，并浓缩重组羊口疮病毒(rORFVΔ132-PCV3Cap)上清液液至TCID50＝107，真空冷冻干燥得到重组羊口疮病毒(rORFVΔ132-PCV3Cap)疫苗，即猪圆环3型病毒疫苗。
对比例1利用重组质粒pEGFP-132LF-7SC-132RF转染细胞
1、实验方法
利用MOI＝0.2的ORFV GDZC病毒株感染羊胚胎鼻甲骨细胞(OFTu细胞)，将OFTu细胞用ORFV GDZC病毒株孵育2h后，得到携带ORFV病毒的OFTu细胞，按照Lipofectamine 2000转染试剂的使用说明，将实施例1制备得到的pEGFP-132LF-7SC-132RF质粒转染携带ORFV病毒的OFTu细胞。待细胞出现80％病变时，收集细胞反复冻融3次，收集上清液。
将收集得到的上清液按照实施例2步骤2步骤S2和步骤S3所示方法操作，得到病毒液。
将病毒液按照实施例3步骤(1)PCR鉴定所示方法进行鉴定。
2、实验结果
PCR鉴定结果显示：病毒液中未检测到PCV3Cap基因，不能表达Cap蛋白。
对比例2利用重组质粒pEGFP-132LF-7SCE-132RF转染细胞
1、实验方法
将实施例1制备得到的pEGFP-132LF-7SC-132RF质粒通过无缝克隆技术在Cap蛋白后插入EGFP基因，得到重组质粒pEGFP-132LF-7SCE-132RF。
ORFV GDZC株病毒以MOI＝0.2接种细胞2h后，采用PCV3 GDHN株Cap基因与EGFP基因融合表达的重组质粒pEGFP-132LF-7SCE-132RF转染细胞，在37℃，5％的CO2培养箱继续培养至出现80％细胞病变；将细胞在反复冻融3次，去除细胞碎屑，收集上清液；将收集的上清液进行有限稀释，根据荧光情况进行蚀斑实验，使用特异性引物验证后，得到灭化病毒。然后，收取细胞蛋白，进行Westernblot试验确定蛋白的表达。
2、实验结果
结果发现，使用荧光筛选可以得到灭化的病毒，但Westernblot试验未出现条带，未检测到PCV3Cap蛋白的表达。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的重组羊口疮病毒，其特征在于，所述重组羊口疮病毒为：先将羊口疮病毒的132基因替换为核苷酸序列如SEQ ID NO：5的基因序列1得到重组病毒1，再将重组病毒1中核苷酸序列如SEQ ID NO：5的基因序列1替换为核苷酸序列如SEQ ID NO：6的基因序列2，得到的重组羊口疮病毒。
2.根据权利要求1所述的重组羊口疮病毒，其特征在于，所述重组羊口疮病毒的制备方法为：在宿主细胞中，羊口疮病毒和重组质粒1进行同源重组得到重组病毒1，重组病毒1再与重组质粒2进行同源重组获得重组羊口疮病毒；
所述重组质粒1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述重组质粒2的核苷酸序列如SEQID NO：2所示。
3.根据权利要求2所述的重组羊口疮病毒，其特征在于，所述宿主细胞为羊胚胎鼻甲骨细胞。
4.一种表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的重组羊口疮病毒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.利用羊口疮病毒感染宿主细胞得到感染细胞1，将核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的重组质粒1转染到感染细胞1中，进行同源重组，收获重组病毒1；
S2.利用步骤S1得到的重组病毒1感染宿主细胞得到感染细胞2，将核苷酸序列如SEQID NO：2所示的重组质粒2转染到感染细胞2中，进行同源重组，收获病毒，即得重组羊口疮病毒。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述羊口疮病毒的MOI值为0.1～1。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中所述重组病毒1的MOI值为0.1～1。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤S1和步骤S2中所述宿主细胞为羊胚胎鼻甲细胞。
8.权利要求4～7任一所述制备方法制备得到的重组羊口疮病毒。
9.权利要求1～3任一所述的重组羊口疮病毒和/或权利要求8所述的重组羊口疮病毒作为病毒载体在制备猪圆环病毒3型疫苗中的应用。
10.一种猪圆环病毒3型疫苗，其特征在于，所述猪圆环病毒3型疫苗中表达抗原的病毒株为权利要求1～3任一所述的重组羊口疮病毒和/或权利要求8所述的重组羊口疮病毒。
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