PL213326B1 - Formulacja zawierajaca wirus ospy, sposób jej otrzymywania i zastosowanie - Google Patents

Formulacja zawierajaca wirus ospy, sposób jej otrzymywania i zastosowanie

Info

Publication number
PL213326B1
PL213326B1 PL369954A PL36995402A PL213326B1 PL 213326 B1 PL213326 B1 PL 213326B1 PL 369954 A PL369954 A PL 369954A PL 36995402 A PL36995402 A PL 36995402A PL 213326 B1 PL213326 B1 PL 213326B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
formulation
product
virus
temperature
freeze
Prior art date
Application number
PL369954A
Other languages
English (en)
Other versions
PL369954A1 (pl
Inventor
Paul Howley
Karl Heller
Ingmar Räthe
Original Assignee
Bavarian Nordic As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=8160885&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL213326(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Bavarian Nordic As filed Critical Bavarian Nordic As
Publication of PL369954A1 publication Critical patent/PL369954A1/pl
Publication of PL213326B1 publication Critical patent/PL213326B1/pl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/275—Poxviridae, e.g. avipoxvirus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/32—Macromolecular compounds obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. carbomers, poly(meth)acrylates, or polyvinyl pyrrolidone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Opis wynalazku
Niniejszy wynalazek dotyczy formulacji, w szczególności formulacji wodnej składającej się z (i) wirusa ospy jednego z rodzajów Orthopoxvirus, Avipoxvirus, Parapoxvirus, Capropoxvirus i Suipoxvirus; (ii) disacharydu; (iii) dopuszczalnego farmaceutycznie polimeru i, dowolnie, (iv) buforu. Formulacja wodna jest szczególnie odpowiednia do procesów suszenia sublimacyjnego, prowadzących do otrzymania stabilnej, liofilizowanej kompozycji zawierającej wirus ospy. Wynalazek dotyczy ponadto sposobu otrzymywania suszonych sublimacyjnie kompozycji zawierających wirus ospy i otrzymanego w ten sposób produktu.
Tło wynalazku
Grupa wirusów Poxviridae obejmuje dużą rodzinę złożonych wirusów DNA, ulegających replikacji w cytoplazmie komórek kręgowców i bezkręgowców. W przypadku ludzi, ospa była dotychczas najważniejszą infekcją wywołaną wirusem z grupy wirusów ospy. Czynnikiem wywołującym chorobę jest należący do rodzaju Orthopoxvirus wirus variola (wirus ospy). Wirus krowianki (vaccinia), również członek rodzaju Orthopoxviru rodziny Poxviridae, został zastosowany jako żywa szczepionka do immunizacji przeciwko ospie. Ogólnoświatowy sukces szczepienia wirusem krowianki sprawił, że wirus variola został całkowicie wytępiony (Dokumenty WHO: The global eradication of smallpox. Final report of the global commission for the certification of smallpox eradication; History of Public Health, nr 4, Genewa: Światowa Organizacja Zdrowia, 1980). W związku z tym, większość zasobów szczepionek zakaźnych wirusów variola została zniszczona. Jednakże, nie można wykluczyć, że wirusy ospy wywołujące ospę lub inne ospo-podobne choroby, mogą ponownie stać się głównym problemem zdrowotnym. Konieczne jest, zatem, odpowiednie przygotowanie do produkcji stabilnych szczepionek przeciwko infekcjom powodowanym przez wirusy ospy, w szczególności infekcjom wirusem variola, takich jak szczepionki oparte na wirusie krowianki.
W przeszłości, wirusy krowianki znalazły zastosowanie również w projektowaniu wektorów wirusowych, użytecznych do ekspresji genów rekombinowanych i jako potencjalne, żywe, rekombinowane szczepionki (Mackett, M.. Smith, G.L. i Moss, B. [1982] P.N.A.S. USA 79, 7415-7419; Smith. G.L., Mackett, M. i Moss, B. [1984] Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 2. 383-407). Było to związane, między innymi, z użyciem sekwencji DNA (genów), kodujących obce antygeny wprowadzane do genomu wirusów krowianki za pomocą technik rekombinacji DNA. Jeżeli gen został zintegrowany w DNA wirusa, w miejscu nieistotnym dla cyklu życiowego wspomnianego wirusa, możliwe jest, że tak otrzymany nowy, rekombinowany wirus krowianki będzie zakaźny, tj. wirus ten będzie zdolny do zainfekowania obcych komórek, a zatem do ekspresji wbudowanej w jego genomie sekwencji DNA (EP 83286 oraz EP 110385). Otrzymane tym sposobem rekombinowane wirusy krowianki mogą być zastosowane, z jednej strony, jako żywe szczepionki w profilaktyce chorób zakaźnych, z drugiej, do otrzymywania białek heterologicznych w komórkach eukariotycznych. Innymi przykładami rekombinowanych wirusów krowianki są wirusy posiadające geny terapeutyczne, takie jak geny samobójcze, geny rybozymów lub geny antysensowne.
Zmodyfikowany wirus krowianki Ankara (MVA) uznawany jest za wyjątkowo bezpieczny. MVA został otrzymany w wyniku długotrwałych pasaży szczepu Ankara wirusa krowianki (CVA) w flbroblastach embrionów kurcząt (praca przeglądowa na ten temat, patrz. Mayr, A., Hochstein-Mintzel, V. i Stickl, H. [1975] Infection 3, 6-14; Swiss Patent Nr 568, 392). Przyk ł adami szczepów wirusa MVA zdeponowanych zgodnie z wymaganiami Traktatu Budapesztańskiego są szczepy: MVA 572 przechowywane w Europejskiej Kolekcji Kultur Komórek Zwierzęcych (ECACC), Salisbury (UK), pod numerem depozytu ECACC V94012707, MVA 575 zdeponowany pod numerem ECACC V00120707 i MVA-BN pod numerem ECACC V00083008.
MVA wyróżnia bardzo wysoka atenuacja, tj. zmniejszona zjadliwość lub infekcyjność, przy jednoczesnym zachowaniu dobrego poziomu immunogenności. Wirus MVA poddano analizie pod kątem zmian w genomie w stosunku do dzikiego typu szczepu CVA. Zidentyfikowano sześć głównych delecji genomowego DNA (delecja I, II, III, IV, V i VI), obejmujących w całości 31,000 par zasad (Meyer, H., Sutter. G. i Mayr A. [1991] J.Gen.Virol. 72, 1031-1038). Uzyskane wirusy MVA były ściśle ograniczone do komórek ptasich jako komórek gospodarza. Ponadto, MVA charakteryzuje bardzo silna atenuacja.
Testowany w szerokim zakresie modeli zwierzęcych, MVA przejawiał brak wirulencji nawet w przypadku zwierząt o obniżonej odporności. Jeszcze bardziej istotny jest fakt, że wykazano doskonałe właściwości szczepu MVA w licznych próbach klinicznych (Mayr i wsp., Zbl.Bakt.Hyg.I, Abt.Org.B 167. 375-390 [1987], Stickl i wsp., Dtsch. med.Wschr. 99, 2386-2392 [1974]). Podczas wspomnianych
PL 213 326 B1 badań, przeprowadzonych na 120,000 osobach, włączając pacjentów o wysokim stopniu ryzyka, nie odnotowano żadnych efektów ubocznych związanych z zastosowaniem szczepionki MVA. Rekombinowane wirusy MVA, użyteczne jako szczepionki, zostały już skonstruowane (patrz, np., WO 97/02355) i wykorzystane w próbach klinicznych. W WO 98/13500 ujawniono rekombinowany MVA zawierający i zdolny do ekspresji sekwencji DNA kodujących antygeny wirusa denga. Sekwencje obcego DNA wstawiono drogą rekombinacji do wirusowego DNA w miejscu naturalnie występującej delecji w genomie MVA.
Szczepem MVA wykazującym jeszcze silniejszą atenuację i charakteryzującym się podwyższonym poziomem bezpieczeństwa jest szczep MVA-BN, zdeponowany w Europejskiej Kolekcji Kultur Komórek Zwierzęcych (ECACC), Salisbury, UK pod numerem depozytu V00083008.
Oprócz wirusa krowianki również inne wirusy ospy stosowane były jako wektory dostarczające informację genetyczną do komórek ssaczych. Dotyczy to wirusów ospy ptaków, takich jak wirus ospy drobiu. Wirusy ospy drobiu zawierające geny HIV w genomie zostały ujawnione w US 5,736,368 i US 6,051,410.
Specjalistom w dziedzinie znane są sposoby otrzymywania kompozycji zawierających wirus ospy, odpowiednich do zastosowania jako szczepionki (patrz, na przykład, Joklik W.K., Virology (1962), 18, 9-18; Richter. K.H., Abhandlungen aus dem Budesgesundheitsamt (1970), 9, 53-57). Znane sposoby oczyszczania pozwalają na otrzymanie roztworów wodnych, zawierających wirus lub sedymentatów zawierających wirus. Wirusy ospy w takich roztworach i sedymentatach nie są stabilne, tj. infekcyjność wirusa szybko spada. Jednakże, konieczne jest, aby szczepionka przechowywana była i rozdzielana w stabilnej postaci, szczególnie, gdy szczepionki te mają być transportowane do regionów tropikalnych o ograniczonej infrastrukturze. Produkty suszone sublimacyjnie mogą być przechowywane w zakresie temperatur od 4°C do 25°C. Jest to oczywista zaleta w: porównaniu ze standardowymi warunkami przechowywania formulacji ciekłych, które powinny być przechowywane w temperaturze poniż ej -20°C („Cryopreservation and freeze-drying protocols Day J, McLellan M; Methods in Molecular Biology, 38, 1995, Humana Press).
Znane są sposoby suszenia sublimacyjnego wirusów ospy, w szczególności wirusa krowianki i kompozycji zawierają cych wirus oraz roztworów odpowiednich do tego celu (Burke i wsp., Critical Reviews in Terapeutic Drug Carrier Systems (1999), 16, 1-83). W ogólnym znaczeniu, suszenie sublimacyjne szczepionki obejmuje zamrożenie szczepionki zawierającej formulację wodną, odpowiednią do suszenia sublimacyjnego, następnie usunięcie wody na drodze sublimacji w warunkach obniżonego ciśnienia i niskich temperatur, po czym usunięcie wody poprzez desorpcję w warunkach zredukowanego ciśnienia i wyższych temperatur.
Znane formulacje zawierające wirus ospy, przeznaczone do suszenia sublimacyjnego związane są z istotnymi niedogodnościami. Wiele kompozycji zawierających wirus krowianki, do suszenia sublimacyjnego zawiera pepton lub preparat hemowy (haemaccel), często pochodzenia zwierzęcego. Istnieją jednak obawy, że pewne choroby zwierzęce, takie jak BSE mogą być przenoszone ze zwierząt na człowieka poprzez produkty zwierzęce, takie jak pepton, żelatyna lub preparat hemowy. Ponadto, wirusy ospy w znanych, zawierających wirusy formulacjach do suszenia sublimacyjnego nie były oczyszczone. Zatem, znane dotychczas w stanie techniki kompozycje zawierające wirus ospy, do suszenia sublimacyjnego zawierają inter alia duże ilości białek pochodzących, odpowiednio, z komórek z hodowli tkankowych lub komórkowych oraz z surowicy wołowej, stosowanej w hodowli komórkowej.
Specjaliści w dziedzinie potrafią przygotować kompozycje suszone sublimacyjnie, które nie zawierają dodatkowych składników pochodzenia zwierzęcego (np., peptonu lub preparatu hemowego). W tym wypadku, kompozycje obejmują nastę pują ce skł adniki, pojedynczo lub w okreś lonych kombinacjach: glutaminian sodu, sorbitol, laktozę, sole, aminokwasy i glicerynę. Jednakże, produkt uzyskany w wyniku procesu suszenia sublimacyjnego jest często niestabilny, tj. sumaryczna strata miana wirusa podczas przechowywania jest niedopuszczalnie wysoka. Ponadto, wykazano, że wirusy ospy przejawiają tendencję do tworzenia agregatów w pewnych typach formulacji i, że inne składniki formulacji ulegają wytrąceniu przed lub podczas zamrażania.
W US 3,577,526 ujawniono szczepionkę przeciwko ospie charakteryzują c ą się tym, ż e został a sporządzona z materiału wirusa podstawowego szczepionki rozproszonego w sacharozie. Ilość sacharozy mieściła się w zakresie 20-40%. Formulacja może ponadto zawierać 5% dekstranu. Wspomniany termin wirus podstawowy dotyczy wirusa otrzymanego z miazgi i krost. W zasadzie, limfa jest
PL 213 326 B1 podstawą rozpadu guzków i oddzielenia płynu od martwych włosów i skóry. Zatem, obciążenie białkiem preparatu szczepionkowego jest bardzo wysokie i uczestniczy w stabilizacji wirusa.
Cel wynalazku
Celem niniejszego wynalazku jest udostępnienie formulacji zawierającej wirus, w szczególności formulacji wodnej zawierającej wirus ospy, odpowiedniej do suszenia sublimacyjnego, prowadzącego do uzyskania stabilnego, liofilizowanego produktu, w którym wirus ospy jest korzystnie oczyszczonym lub przynajmniej częściowo oczyszczonym wirusem. Kolejnym celem niniejszego wynalazku jest zapewnienie formulacji wodnej zawierającej wirusy ospy, w której wirusy te nie wykazują skłonności do agregacji i w której składniki nie ulegają wytrąceniu przed lub podczas zamrażania. Kolejnym celem niniejszego wynalazku jest zapewnienie formulacji zawierającej wirus ospy, w szczególności formulacji wodnej zawierającej wirus ospy, zawierającej niskie ilości białek pochodzenia niewirusowego. Innym celem niniejszego wynalazku jest zapewnienie stabilnej, suszonej sublimacyjnie kompozycji zawierającej wirus ospy i sposobu uzyskania wspomnianej kompozycji.
Istota wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest formulacja charakteryzująca się tym, że zawiera (i) wirus ospy wybrany z grupy obejmującej wirusy Orthopoxvirus, Parapoxvirus, Avipoxvirus, Capropoxvirus i Suipoxvirus, przy czym wirus ospy posiada miano wynoszące co najmniej 106TCID50 na mg białka całkowitego (ii) disacharyd i (iii) dopuszczalny farmaceutycznie polimer, przy czym nie zawiera ona buforu fosforanowego.
Korzystnie, wirus ospy posiada miano wynoszące co najmniej 108TCID50 na mg białka całkowitego. Równie korzystnie formulacja według wynalazku zawiera ponadto bufor, przy czym szczególnie korzystnie bufor został wybrany z grupy obejmującej: TRIS, TBS, MOPS, HEPES i bufor (dwu)węglanowy. Korzystnie wirus ospy jest wirusem krowianki, przy czym szczególnie korzystnie wirus krowianki wybrany jest spośród szczepu Elstree i zmodyfikowanego szczepu wirusa krowianki Ankara (MVA). Korzystnie, wirus ospy jest rekombinowanym wirusem ospy. Korzystnie, disacharyd wybrany jest z grupy obejmują cej sacharozę , laktozę i trehalozę . Korzystnie, stężenie disacharydu mieś ci się w zakresie 10 do 100 g/l. Korzystnie, farmaceutycznie dopuszczalny polimer wybrany jest spoś ród dekstranu i poliwinylopirolidonu (PVP), przy czym szczególnie korzystnie dekstran posiada masę cząsteczkową w zakresie 30,000 do 70,000 i stężenie od 1 do 50 g/l. Korzystnie formulacja według wynalazku zawiera ponadto kwas glutaminowy. Korzystnie, temperatura załamania formulacji mieści się w zakresie od -37°C do -30°C. Korzystnie, wirus ospy należ y do szczepu MVA albo szczepu Elstree, disacharyd jest sacharozą, polimer jest dekstranem a bufor nie jest buforem fosforanowym. Korzystnie formulacja według wynalazku jest szczepionką.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie formulacji według wynalazku zdefiniowanej powyżej do otrzymania szczepionki.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania stabilnej, zawierającej wirus ospy kompozycji charakteryzujący się tym, że formulacja według wynalazku określona powyżej jest suszona sublimacyjnie.
Korzystnie, sposób według wynalazku obejmuje następujące etapy:
(i) zamrażanie formulacji według wynalazku określonej powyżej do temperatury niższej niż temperatura załamania (zniszczenia struktury) formulacji, w celu uzyskania matrycy zamrożonego produktu, (ii) pierwsze suszenie zamrożonej formulacji w warunkach niskiego ciśnienia i w temperaturze produktu, umożliwiających sublimację lodu w matrycy produktu, przy czym temperatura produktu jest niższa niż temperatura załamania formulacji, (iii) drugie suszenie w warunkach niskiego ciśnienia i w temperaturze produktu w przedziale 0°C do 30°C, trwające do momentu uzyskania pozostałej wilgotności produktu niższej niż 5%.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest produkt liofilizowany charakteryzujący się tym, że może być otrzymany sposobem według wynalazku określonym powyżej.
Produkt liofilizowany według wynalazku zawiera (i) wirus ospy, (ii) disacharyd, (iii) dopuszczalny farmaceutycznie polimer i, dowolnie, (iv) bufor inny niż bufor fosforanowy; przy czym wirus ospy, disacharyd, polimer i bufor zdefiniowane są powyżej.
Korzystnie produkt liofilizowany według wynalazku charakteryzuje się tym, że pozostała zawartość wilgoci mieści się w zakresie 1 do 3%.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie liofilizowanego produktu według wynalazku, jak określono powyżej, do otrzymywania szczepionki.
PL 213 326 B1
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób odtworzenia liofilizowanego produktu według wynalazku zdefiniowanego powyżej, charakteryzujący się tym, że produkt rozpuszczany jest w odpowiedniej ilości dopuszczalnego farmaceutycznie rozpuszczalnika.
Szczegółowy opis wynalazku
Niniejszy wynalazek dotyczy formulacji zawierającej wirus ospy, w szczególności formulacji wodnej zawierającej wirus ospy. Formulacja, w szczególności formulacja wodna może być odpowiednia do suszenia sublimacyjnego wspomnianego wirusa ospy. Ponadto, wynalazek związany jest z liofilizowanym produktem zawierają cym wirus ospy. Formulacja wedł ug niniejszego wynalazku, w szczególnoś ci formulacja wodna, obejmuje wirus ospy, disacharyd, dopuszczalny farmaceutycznie polimer i ponadto, dowolnie, bufor.
Mimo że suszona sublimacyjnie formulacja według wynalazku nie zawiera dodatków stabilizujących pochodzenia zwierzęcego, takich jak pepton, żelatyna, preparat hemowy, ani wysokich ilości białek pochodzących z układu zastosowanego do amplifikacji wirusa (takiego jak systemy kultur komórkowych), wirus w formulacji pozostaje zaskakująco stabilny, tj., wirus ospy w suszonej sublimacyjnie kompozycji zachowuje infekcyjność przez dłuższy okres czasu, nawet przechowywany w wysokich temperaturach, takich jak temperatura pokojowa lub 37°C.
Jeżeli nie zaznaczono inaczej, stosowany w niniejszym opisie termin „temperatura pokojowa odpowiada temperaturze 20 do 25°C.
Wirusy ospy. odpowiednie do suszenia sublimacyjnego są jakimikolwiek wirusami ospy wybranymi z grupy obejmującej rodzaj Orthopoxvirus, Avipoxvirus, Parapoxvirus, Capropoxvirus i Suipoxvirus. Wirusy te mogą być użyteczne jako szczepionka dla ludzi lub zwierząt (Virology, wyd.3, 1995. wyd. Fields, B.N.). Szczególnie korzystnymi wirusami są wirusy rodzaju Orthopoxvirus lub Avipoxvirus. Korzystnymi przykładami wirusów ospy, należących do rodzaju Avipoxvirus są wirusy ospy kanarków i wirusy ospy drobiu. Korzystnymi przykł adami należącymi do rodziny Orthopoxvirus są wirusy ospy krów i wirusy krowianki.
Wirus ospy zawarty w formulacji według niniejszego wynalazku może być naturalnie występującym wirusem ospy, atenuowanym wirusem ospy lub rekombinowanym wirusem ospy.
Wirusem ospy w formulacji użytecznej do szczepienia ludzi przeciwko ospie jest korzystnie wirus szczepu krowianki. Przykładami szczepów wirusa krowianki odpowiednimi do tego celu są szczepy Temple of Heaven, Copenhagen. Paris, Budapest, Dairen, Gam. MRIVP, Per. Tashkent. TBK. Tom. Bern, Patwadangar, BIEM, B-15. Lister, EM-63. New York City Board of Health. Elstree. Ikeda i WR. Najkorzystniejszymi szczepami wirusa krowianki s ą zmodyfikowany wirus krowianki szczepu Ankara (MVA) i jego pochodne, w szczególności szczep, zdeponowany w ECACC o numerze V00083008 i szczep Elstree.
Wirus ospy w; formulacji według niniejszego wynalazku jest korzystnie wirusem ospy, który jest istotnie niepatogenny wobec zwierząt lub innych szczepionych podmiotów. W tym celu korzystne jest użycie atenuowanych szczepów wirusa lub zastosowanie wirusa ospy, naturalnie replikującego w gatunkach gospodarza róż nych od gatunków podlegają cych szczepieniu i niepatogennego wobec heterologicznego gospodarza.
„Wirus atenuowany” jest wirusem pochodzącym od wirusa patogennego, który jednak na skutek infekcji organizmu gospodarza, prowadzi do obniżonej śmiertelności i/lub chorobowości w porównaniu z nieatenuowanym wirusem rodzicielskim. Przykłady atenuowanych wirusów ospy są znane specjalistom w dziedzinie. Najkorzystniejszym jest zmodyfikowany wirus krowianki Ankara (MVA). Typowymi szczepami MVA są MVA 575 i MVA 572, zdeponowane w Europejskiej Kolekcji Zwierzęcych Kultur Komórkowych (ECACC). Salisbury (UK), odpowiednio pod numerem depozytu ECACC V00120707 i ECACC V 94012707. Najkorzystniejszym wirusem jest MVA-BN lub jego pochodna, opisane w WO 02/42480 (PCT/EP01/13628). Treść powyższego zgłoszenia została włączona do niniejszego opisu tytułem referencji. MVA-BN zdeponowano w Europejskiej Kolekcji Zwierzęcych Kultur Komórkowych (ECACC), Salisbury (UK), pod numerem depozytu ECACC V00083008.
Przykładami wirusów ospy, dla których ludzie są heterologicznymi gospodarzami i które nie są patogenne wobec ludzi są wirusy ospy drobiu lub wirusy ospy kanarków.
Termin „wirus rekombinowany odnosi się do jakiegokolwiek wirusa, który posiada wstawiony do genomu wirusowego gen heterologiczny, który nie jest naturalną częścią wspomnianego genomu wirusa. Gen heterologiczny może być genem terapeutycznym, genem kodującym peptyd obejmujący przynajmniej jeden epitop do indukcji odpowiedzi immunologicznej, antysensowną kasetę ekspresji lub gen rybozymu. Sposoby otrzymywania rekombinowanych wirusów są znane specjalistom w dzie6
PL 213 326 B1 dzinie. Najkorzystniejszym wektorem wirusa ospy jest MVA, w szczególności MVA 575 i MVA-BN (patrz jak wyżej).
Specjalistom w dziedzinie wiadomo, w jaki sposób wirusy mogą ulegać amplifikacji i jak można otrzymać je z zainfekowanych kultur komórkowych. Ogólnie, w pierwszym etapie, komórki eukariotyczne infekowane są wirusem ospy, przy czym przyjmuje się, że wirus ten jest częścią formulacji według niniejszego wynalazku. Komórki eukariotyczne są komórkami, wrażliwymi na infekcję odpowiednim wirusem ospy i pozwalają na replikację i produkcję zakaźnego wirusa. Specjalistom w dziedzinie znane są komórki odpowiednie dla wszystkich wirusów ospy. Dla MVA przykładem tego typu komórek są fibroblasty embrionu kurcząt (CEF) (Drexler I. i wsp., J.Gen.Virol.)(1998), 79, 347-352). Komórki CEF mogą być hodowane w warunkach znanych specjalistom w dziedzinie. Korzystnie, komórki CEF hodowane są w podłożu nie zawierającym surowicy. Czas inkubacji wynosi korzystnie 48 do 96 godzin w 37°C ± 2°C. Do infekcji stosowane są wirusy ospy na poziomie multiplikacji infekcji (MOI) 0,05 do 1 TCID50 (TCID=dawka infekcyjna kultury tkankowej), inkubacja przebiega w ciągu 48 do 72 godzin w tej samej temperaturze.
Postęp infekcji można śledzić poprzez obserwację efektów cytopatycznych (CPE), zazwyczaj znaczne zaokrąglenie zainfekowanych komórek.
Wirusy ospy znane są z występowania w dwóch różnych formach: wirus ospy przyłączony do błon komórkowych w cytoplazmie zainfekowanych komórek (wewnątrzkomórkowe dojrzałe wiriony (IMV) i wirusy, które uległy wydaleniu (zewnątrzkomórkowe opłaszczone wiriony (EEV)) (Vanderplasschen A. i wsp., J.Gen.Viriol. (1998), 79, 877-887). Obie formy wirusów mogą być zastosowane w formulacjach według niniejszego wynalazku. EEV mogą zostać w prosty sposób uzyskane z supernatantu (płynu znad osadu) po wirowaniu i bezpośrednio zawieszone w formulacji wodnej, zawierającej disacharyd i farmaceutycznie dopuszczalny polimer. Jednakże, frakcje zawierające wirus mogą zawierać szczątki rozpadłych komórek i inne zanieczyszczenia. Korzystne jest, zatem, szczególnie w przypadku szczepienia ludzi, uprzednie oczyszczenie wirusa, przed włączeniem go do formulacji według niniejszego wynalazku. Sposoby oczyszczania wirusów ospy znane są specjalistom w dziedzinie. Etap oczyszczania może obejmować, np.. wirowanie porcji hodowli (np., przy użyciu przeciwwstrząsowo sacharozy) lub ultrawirowanie w przepływie ciągłym (w gradiencie sacharozy), ultrafiltrację (np.. filtrację w przepływie poprzecznym przy użyciu błony o rozmiarach porów większych niż
500 kDa, jednakże równych lub mniejszych niż 0,1 μm), kolumnę chromatograficzną (np., jonowymienną, oddziaływań hydrofobowych, sączenia molekularnego lub ich kombinację) czy też połączenie kilku lub wszystkich powyższych technik (Masuda N. i wsp., J. Bacteriol (1981) 147, 1095-1104).
W celu uzyskania IMV komórki, są zbierane w pierwszym etapie, a następnie w drugim etapie rozbijane. Jeżeli zainfekowane komórki są komórkami, które mogą być hodowane w zawiesinie hodowlanej, komórki te mogą łatwo być zgromadzone w wyniku wirowania. Jeżeli zainfekowane komórki są w większym lub mniejszym stopniu nienaruszonymi, przylegającymi komórkami, możliwe jest ich zebranie, tj. usunięcie komórek z naczynia hodowlanego, przed poddaniem komórek etapowi rozbicia. Metody zbierania komórek są znane specjalistom w dziedzinie. Użyteczne techniki są sposobami mechanicznymi (np.. przy użyciu gumowego skrobacza do komórek), sposobami fizycznymi (np., zamrażanie w temperaturze poniżej -15°C i rozmrożenie hodowli w naczyniu hodowlanym w temperaturze powyżej +15°C) lub sposobami biochemicznymi (działanie enzymami, np., trypsyną, w celu odczepienia komórek ze ścian naczynia hodowlanego). Jeżeli do tego celu zastosowane są enzymy, czas inkubacji powinien być kontrolowany, ze względu na to, że na skutek przedłużonej inkubacji, enzymy mogą również zniszczyć strukturę wirusa.
Specjalistom w dziedzinie znane są również sposoby rozbijania komórek. Opisany powyżej sposób zamrażania i rozmrażania daje w wyniku już częściowo rozbite komórki. Inne znane techniki uszkadzania komórek obejmują zastosowanie ultradźwięków. Traktowanie komórek ultradźwiękami pozwala na otrzymanie homogenatu zawierającego wirusy.
Formulację według niniejszego wynalazku mogą być zastosowane do szczepienia zwierząt homogenatem zawierającym wirus ospy. Jednakże, również w tym wypadku, korzystne jest użycie wirusów ospy, które były uprzednio, przynajmniej częściowo, oczyszczone. Jak podkreślono powyżej, takie sposoby oczyszczania są znane specjalistom w dziedzinie. Wirusy ospy zawarte są w formulacji, w szczególności w formulacji wodnej w stężeniu 104 do 109 TCID50/ml, korzystnie w zakresie stężenia np., 105 do 5x108 TCID50/ml, korzystniej w zakresie stężeń np., 106 do 108 TCID50/ml. Rzeczywiste stężenie zależy od ilości wirusa, który ma być podany ludziom lub zwierzętom, co z kolei zależy od typu podawanego wirusa. W przypadku wirusa krowianki szczepu Elstree, typowa dawka szczepionki
PL 213 326 B1 dla ludzi obejmuje 2,5x105 TCID50. Dla szczepu MVA-BN wirusa krowianki, typowa dawka dla ludzi wynosi 1x108 TCID50.
Jak wspomniano powyżej, wirus ospy w formulacji według niniejszego wynalazku jest korzystnie oczyszczonym lub przynajmniej częściowo oczyszczonym wirusem. Termin „oczyszczony lub częściowo oczyszczony wirus dotyczy faktu, że wirus stosowany w formulacjach według wynalazku posiada czystość wyższą niż wirus nieoczyszczony („wirus podstawowy”) stosowany w szczepionkach przed wytępieniem ospy (tak, jak wirus ujawniony w US 3,577,526). Tego stopnia wyższa czystość może być uzyskana np., w wyniku jednej lub więcej z następujących metod: wirowanie porcji hodowli (np., przy użyciu przeciwwstrząsowo sacharozy) lub ultrawirowanie w przepływie ciągłym (w gradiencie sacharozy), ultrafiltracja (np., filtracja w przepływie poprzecznym przy zastosowaniu membrany o porach większych niż 500 kDa. jednakże równych lub mniejszych niż 0,1 μm), kolumna chromatograficzna (np., jonowymienna oddziaływań hydrofobowych, filtracji żelowej lub będąca ich kombinacją). Szczególnie korzystna jest ultrafiltracja i/lub wirowanie porcji hodowli z użyciem przeciwwstrząsowo sacharozy. W bardziej ogólnym znaczeniu, termin „oczyszczony lub częściowo oczyszczony wirus dotyczy preparatów wirusowych (takich jak preparaty zawierające MVA lub Elstree), posiadających miano przynajmniej 106, korzystnie przynajmniej 107, jeszcze korzystniej przynajmniej 108, nawet korzystniej przynajmniej 5x108 TCID50 na mg całkowitego białka.
Sposoby określania miana preparatu zawierającego wirus ospy są znane specjalistom w dziedzinie, jedna z tych metod przedstawiona została w części zawierającej przykłady. Całkowita zawartość białka określana jest korzystnie według metody Kjeldahl'a (Lynch, J.M. i Barbano. D.M., Kjeldahl nitrogen analysis as a reference method for protein determination in dairy products. J AOAC Int. 1999 List.-Grudz.; 82(6): 1389-98. Praca przeglądowa). Należy zauważyć, że całkowita zawartość białka jest sumą białek wirusowych i białek komórkowych.
Nieoczekiwanie, formulacja zawierająca oczyszczony lub częściowo oczyszczony wirus, disacharyd i farmaceutycznie aktywny polimer okazała się stabilna, mimo że dotychczas uważano, że duże ilości białka niewirusowego w preparatach nieoczyszczonego wirusa wpływają na stabilność dotychczasowych formulacji.
Formulacja zgodna z niniejszym wynalazkiem, w szczególności formułacja wodna, obejmuje disacharyd. W przeciwieństwie do monosacharydów, takich jak glukoza, która daje dobrą ochronę biologiczną podczas suszenia sublimacyjnego, lecz posiada niską temperaturę załamania i często suszenie sublimacyjne obejmuje tą temperaturę, wykazano, że disacharyd) są skuteczniejsze jako ochrona podczas suszenia sublimacyjnego wykazując wyższe temperatury załamania niż monosacharydy.
Zawarte w formulacjach według wynalazku disacharydy są farmaceutycznie dopuszczalnymi disacharydami o temperaturze załamania (zniszczenia struktury) (Tc) w przedziale około -25°C do -35°C. Typowe temperatury to -31°C dla sacharozy, -28,5°C dla trehalozy i -30,5°C dla laktozy. Typowe temperatury załamania dla całej formulacji według niniejszego wynalazku mieszczą się korzystnie w zakresie -50°C do -20°C. Korzystnie podzakres temperatury obejmuje np., -37°C do -30°C, -36°C do -31°C lub -35,7°C do -31,2°C.
Korzystnie, disacharyd wybrany jest z grupy obejmującej trehalozę, laktozę i sacharozę. Najkorzystniejsza jest sacharoza. Disacharyd. korzystnie sacharoza, zawarty jest w formulacji według wynalazku, w szczególności w formulacji wodnej, korzystnie w zakresie stężenia 10-100 g/l, korzystniej w zakresie 20-80 g/l. najkorzystniej w zakresie 25-60 g/l. Dla sacharozy typowym stężeniem jest 45 g/l.
Formulacja według niniejszego wynalazku, w szczególności formulacja wodna, obejmuje ponadto dopuszczalny farmaceutycznie polimer. Polimer korzystnie wybrany jest z grupy obejmującej dekstran i poliwinylopirolidon (PVP). Zastosowany polimer musi być rozpuszczalny w formulacji zgodnej z niniejszym wynalazkiem. Jeżeli stosuje się dekstran, jego masa cząsteczkowa powinna mieścić się korzystnie w zakresie 20,000 do 100,000, korzystniej w zakresie 30,000 do 70,000, najkorzystniej w zakresie 36,000 do 44,000. Najkorzystniejszy dekstran posiada masę cząsteczkową 40,000. Stężenie dekstranu mieści się w zakresie 2 do 50 g/l. korzystnie w zakresie 2 do 40 g/l lub 3 do 30 g/l. Szczególnie dobre wyniki odnotowano w zakresie 5 do 50 g/l, 5 do 40 g/l lub 5 do 30 g/l. Korzystniej, w zakresie 8 do 30 g/l. Najkorzystniejszy zakres to 10 do 27 g/l. Przykładem korzystnego stężenia jest 18,9 g/l. Wymienione powyżej korzystne stężenia i zakresy stężeń dekstranu, w szczególności zakres 5 do 50 g/l i odpowiednie podprzedziały, są szczególnie korzystne, ze względu na to, że temperatura załamania formulacji jest względnie wysoka, co umożliwia przeprowadzenie procesu w skali przemysłowej. Jeżeli stosuje się PVP, jego masa cząsteczkowa mieści się korzystnie w zakresie 50,000 do
PL 213 326 B1
400,000. korzystniej w zakresie 70,000 do 360,000. Stężenie PVP mieści się w zakresie 5 do 200 g/l, korzystniej w zakresie 5 do 100 g/l, najkorzystniej w zakresie 10 do 40 g/l.
Formulacja zgodna z wynalazkiem, w szczególności formulacja wodna, może ponadto obejmować bufor. Jak wspomniano wyżej, jednym z celów niniejszego wynalazku jest zapewnienie formulacji wodnej zawierającej wirus ospy, w której wirusy ospy nie ulegają agregacji i w której nie następuje zjawisko wytrącania podczas suszenia. Nieoczekiwanie wykazano, że takie niepożądane efekty związane są z obecnością buforu zawierającego fosforan w formulacji wodnej. Przykłady buforu zawierającego fosforan to PBS (roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanem) i bufor fosforanowy. W związku z tym, realizacją tego szczególnego celu wynalazku jest formulacja wodna do suszenia sublimacyjnego, która nie zawiera buforu fosforanowego. Zatem, zawarty w formulacji według wynalazku bufor jest korzystnie wybrany z grupy obejmującej TRIS, TBS, MOPS, HEPES i bufory (bi-)-węglanowe. Najkorzystniejszymi buforami są TRIS i TBS.
Bufor stosowany jest w stężeniu, wystarczającym do nadania zdolności buforowania. Dla buforów TRIS korzystny zakres stężenia to 1-50 mM; najkorzystniejsze stężenie to 10 mM. pH jest korzystnie doprowadzane do wartości, która z jednej strony jest dopuszczalna farmaceutycznie do podawania ludziom lub zwierzętom, a z drugiej strony nie jest szkodliwa dla wirusa. Zatem, pH powinno mieścić się w zakresie 6.0 do 9.0, korzystniej w zakresie 7.2 do 7.8. Najkorzystniejsza wartość pH to 7.4.
Uzyskano nieoczekiwanie dobre wyniki stosując bufor nie zawierający fosforanu, niezależnie od tego czy wirus w formulacji był nieoczyszczony, oczyszczony lub częściowo oczyszczony. Korzystne są oczyszczone lub częściowo oczyszczone wirusy.
Formulacja według niniejszego wynalazku, szczególnie formulacja wodna może zawierać sole, takie jak NaCl. Typowe stężenia NaCl mieszczą się w zakresie 10-200 mM. Przykładem korzystnego stężenia NaCl jest 140 mM.
Formulacja według niniejszego wynalazku, szczególnie formulacja wodna może zawierać sole kwasu L-glutaminowego. Sól ta jest korzystnie solą potasową lub solą sodową. Stężenie soli kwasu L-glutaminowego zawiera się korzystnie w zakresie 0.05-0.5 g/l, korzystniej w zakresie 0.1-0.15 g/l.
Pewne szczególnie korzystne formulacje wodne według niniejszego wynalazku wymieniono w poniż szej tabeli 1. We wszystkich formulacjach zawartych w tabeli 1 buforem jest 10 mM TRIS, pH 7.4, 140 mM NaCl.
T a b e l a 1:
Zmodyfikowany wirus krowianki Ankara (MVA) [TCiDso/mi] Pierwszy dodatkowy składnik [g/i] Drugi dodatkowy składnik [g/i] Trzeci dodatkowy składnik [g/i] Odwoianie do tabeii 6
5x108 25 (sacharoza) 10.5 (dekstran) 0.06 (kwas L-giutaminowy) GT 8
5x108 34.5 (sacharoza) 14.5 (dekstran) 0.083 (kwas L-giutaminowy) GT 8
5x108 45 (sacharoza) 18.9 (dekstran) 0.108 (kwas L-giutaminowy) GT 9
5x108 60 (sacharoza) 25.2 (dekstran) 0.144 (kwras L-giutaminowy) GT 9
1x108 45 (sacharoza) 18.9 (dekstran) 0.108 (kwas L-giutaminowy) -
1x108 45 (sacharoza) 3.78 (dekstran) 0.108 (kwas L-giutaminowy) -
Formulacja wodna według niniejszego wynalazku jest odpowiednia do suszenia sublimacyjnego. Przed podaniem, liofilizowany produkt musi być odtworzony w odpowiednim rozpuszczalniku. Zgodnie z jedną z realizacji, w celu przeniesienia składników do roztworu, do zliofilizowanego produktu dodawana jest sterylna woda. Korzystnie, ilość dodanej wody odpowiada więcej lub mniej ilości wody, która została usunięta podczas suszenia sublimacyjnego. Zatem, zgodnie z tą realizacją, skład odtworzonego produktu jest więcej lub mniej identyczny ze składem wyjściowej formulacji wodnej. W zwią zku z tym, zrealizowany jest cel niniejszego wynalazku, którym jest zastosowanie jako szczepionki formulacji wodnej według wynalazku. Zgodnie z alternatywną realizacją, liofilizowany produkt może również być odtworzony w jakimkolwiek innym, dopuszczalnym farmaceutycznie rozpuszczalniku, który może być zastosowany w odpowiednich ilościach. Przykładowo, rozcieńczalnik może być wodą zawierającą jeden lub więcej związków, wybranych spośród fenolu, glicerolu i buforu. Stężenie fenolu w odtworzonym produkcie wynosi np., 0.5%. Jak wspomniano wyżej, bufor jest korzystnie buforem niefosforanowym.
PL 213 326 B1
Podsumowując, omawiane zagadnienie wynalazku dotyczy między innymi następujących, szczególnie korzystnych realizacji: (I) Formulacji, w szczególności formulacji wodnej, obejmującej lub nawet składającej się z oczyszczonego lub częściowo oczyszczonego wirusa ospy wybranego z grupy obejmującej Orthopoxvirus, Avipoxvirus, Parapoxvirus, Capropoxvirus i Suipoxvirus; disacharydu. dopuszczalnego farmaceutycznie polimeru i, dowolnie, buforu, przy czym buforem jest korzystnie bufor niefosforanowy. Korzystnie, polimer jest dekstranem, korzystnie w ilości określonej wyżej. (II) Formulacji, w szczególności formulacji wodnej, obejmującej lub nawet składającej się z wirusa ospy, wybranego z grupy obejmującej Orthopoxvirus, Avipoxvirus, Parapoxvirus, Capropoxvirus i Suipoxvirus; disacharydu, dopuszczalnego farmaceutycznie polimeru i buforu, przy czym buforem jest korzystnie bufor niefosforanowy i wirus ospy jest korzystnie oczyszczonym lub częściowo oczyszczonym wirusem. Korzystnie, polimer jest dekstranem, korzystnie w ilości określonej wyżej. (III) Formulacji, w szczególnoś ci formulacji wodnej, obejmują cej lub nawet skł adają cej się z wirusa ospy wybranego z grupy obejmującej Orthopoxvirus, Avipoxvirus, Parapoxvirus, Capropoxvirus i Suipoxvirus: disacharydu, dopuszczalnego farmaceutycznie polimeru i, dowolnie, buforu, przy czym polimer jest dekstranem w ilości określonej wyżej, na przykład korzystnie w zakresie 5 do 40 g/l. Korzystnie, bufor nie jest buforem fosforanowym. Korzystnie, wirus ospy jest oczyszczonym lub częściowo oczyszczonym wirusem.
Termin. „składająca się stosowany w odniesieniu do powyższych opcji (I), (II) i (III), dotyczy formulacji składających się jedynie z wyżej wymienionych składników i formulacji składających się ponadto z jednej lub więcej soli. Przykładami soli, które mogą być dodane do formulacji (I), (II) i (III) składających się z wyżej zdefiniowanych związków, są KCl, NaCl, glutaminian sodu. Zatem, termin „składająca się” użyty w definicji wyżej wymienionych formulacji (I), (III) i (III) nie wyklucza możliwości dodania jednej lub więcej soli.
Dla przykładu, korzystna realizacja niniejszego wynalazku obejmuje formulację wodną zawierającą oczyszczony lub częściowo oczyszczony wirus ospy wybrany z grupy obejmującej Orthopoxvirus, Avipoxvirus, Parapoxvirus, Capropoxvirus i Suipoxvirus; disacharyd i dopuszczalny farmaceutycznie polimer i bufor, przy czym disacharydem jest sacharoza w wyżej określonej ilości, polimerem jest dekstran w wyżej określonej ilości i buforem jest bufor niefosforanowy. Przykładem innej korzystnej realizacji niniejszego wynalazku jest formulacja wodna składająca się z wirusa ospy wybranego z grupy obejmującej Orthopoxvirus, Avipoxvirus, Parapoxvirus, Capropoxvirus i Suipoxvirus; disacharydu. dopuszczalnego farmaceutycznie polimeru i, dowolnie, buforu. Wirus ospy jest korzystnie oczyszczonym lub częściowo oczyszczonym wirusem ospy. Powyżej przedstawiono korzystne ilości i przykłady disacharydu, polimeru i buforu.
W zakresie wiedzy specjalistów w dziedzinie leży podawanie takich formulacji, w szczególności formulacji wodnych zawierających wirusy ospy i określenie ilości wirusa zastosowanej w szczepieniu. Jak zaznaczono wyżej, szczepionki mogą być użyte do indukowania odpowiedzi immunologicznej przeciwko samym wirusom ospy, w szczególności jeśli zastosowano atenuowane lub niepatogenne. nierekombinowane wirusy ospy. Jeżeli wirusy ospy są rekombinowanymi wirusami ospy, odpowiedź immunologiczna jest wywoływana dodatkowo wobec rekombinowanego białka/peptydu ekspresjonowanego przez wektor wirusowy.
Zastosowany powyżej termin „formulacja zazwyczaj odnosi się do formulacji wodnych, chyba, że zaznaczono inaczej. Jeżeli zakres stężeń lub stężenia zdefiniowany został w „mM”, g/l itp., wskazuje to na to, że wspomniana formulacja jest ciekłą lub nawet wodną formulacją. Termin „formulacja wodna dotyczy tych formulacji, w których rozcieńczalnikiem jest woda. Jednakże, celem niniejszego wynalazku objęte są również te suche formulacje, które mogą być uzyskane z ciekłych lub nawet wodnych formulacji według niniejszego wynalazku, na drodze usunięcia cieczy, niezależnie od zastosowanej metody tego usunięcia. Zatem, wynalazek obejmuje również te suche formulacje, które zostały uzyskane sposobami innymi niż suszenie sublimacyjne.
W szczególności, niniejszy wynalazek dotyczy również sposobu przygotowywania stabilnej, zawierającej wirus ospy kompozycji znamiennej tym, że formulacja według wynalazku, w szczególności formulacja wodna, jest liofilizowana. W niniejszym zgłoszeniu, terminy „stabilna kompozycja zawierająca wirus ospy i „suszona liofilizowana kompozycja zawierająca wirus ospy„ stosowane są zamiennie, chyba, że zaznaczono inaczej. Termin „stabilna kompozycja zawierająca wirus ospy zastosowany jest w powyższym zgłoszeniu do zdefiniowania kompozycji zawierających wirus, w których całkowita utrata miana wirusa w warunkach inkubacji w 37°C, w ciągu 28 dni, jest mniejsza niż 0.5 log, korzystnie mniejsza niż 0.4 log. Szczegółowy protokół określania miana wirusa, a przez to całkowitej utraty
PL 213 326 B1 miana wirusa podano w rozdziale opisującym przykłady. Jednakże, może być również zastosowany jakikolwiek inny protokół określający miano wirusa.
Sposoby suszenia sublimacyjnego są ogólnie znane specjalistom w dziedzinie (Day. J. i McLellan. M.Methods in Molecular Biology, Humana Press. (1995) tom 38).
Proces suszenia sublimacyjnego zazwyczaj obejmuje następujące etapy, które w dalszej części opisu zostaną wyjaśnione bardziej szczegółowo:
1. Przygotowanie szczepionki;
2. Zamrażanie próby;
3. Pierwsze suszenie (sublimacja);
4. Drugie suszenie (desorpcja);
5. Zamknięcie produktu i usunięcie;
6. Przechowywanie szczepionki;
7. Odtworzenie.
Przygotowywanie szczepionki:
Produkcja i powielanie wirusów ospy mających znaleźć zastosowanie jako szczepionki została szczegółowo wyjaśniona powyżej. Wirusy ospy są dowolnie oczyszczane. Formulacja według niniejszego wynalazku uzyskiwana jest poprzez dodanie wyżej zdefiniowanych disacharydów, polimerów i, dowolnie, buforu, kwasu L-glutaminowego i, dowolnie, innych składników do preparatu wirusa ospy.
Zamrażanie próbki:
Zamrażanie próbki powoduje unieruchomienie składników roztworu, a zatem zapobiega tworzeniu piany przy obniżonym ciśnieniu. Zamrażanie jest dwuetapowym procesem podczas, którego woda początkowo tworzy zarodki krystalizacji, które następnie przyrastają w postaci kryształów lodu, co daje w wyniku mieszaninę lodu i roztworu o wysokim stężeniu. Powstawaniu zarodków kryształów lodu sprzyja obniżenie temperatury i wytrząsanie oziębionej zawiesiny. Inaczej niż przy zarodkowaniu, przyrost lodu wspomagany jest przez wzrost temperatury, a tym samym zmniejszenie lepkości zawiesiny. Niezależnie od dokładnego przebiegu zamrażania, proliferacja lodu w podłożu powoduje wzrost stężenia solutu (substancji rozpuszczonej). Biopolimery w roztworze lub zawiesinie ulegają zniszczeniu lub inaktywacji na skutek wzrastającego stężenia solutu. Szybkie oziębienie minimalizuje oddziaływanie stężenia na produkt biologiczny. Powyżej temperatury krytycznej (temperatury przejścia szkliwa) lepkość masowa może zmaleć do tego stopnia, że spowoduje to zmiękczenie szkliwa i jego zniekształcenie. Suszenie doprowadza do uzyskania skrytokrystalicznej, lepkiej pozostałości w fiolkach. Temperatura odkształcenia nazywana jest temperaturą załamania (zniszczenia struktury).
Bardziej szczegółowo, temperatura załamania definiowana jest jako temperatura, w której ruchliwość wody w międzywęzłowym obszarze matrycy osiąga znaczną wartość. W celu uniknięcia odkształcenia, temperatura zamrażania musi być niższa od temperatury załamania formulacji wodnej. Temperatura załamania może być określona według sposobów znanych specjalistom w dziedzinie, np., na postawie różnicowej analizy termicznej (Jennings. T.A., „Lyophilization. Introduction and Basic Principles, Interpharm Press, Denver, CO, US. 1999, ISBN 1-57491-081-7, strona 132-134).
W przypadku zastosowania zbyt niskiej temperatury, może ulec zahamowaniu dyfuzja wody z wirusa a wewnątrzkomórkowy lód moż e spowodować uszkodzenia. Zgodnie z powyższym, specjaliści w dziedzinie mogą sprawdzić empirycznie kilka temperatur zamrażania, przy czym wszystkie poniżej temperatury załamania formulacji wodnej i sprawdzić, która temperatura pozwala na otrzymanie liofilizowanego produktu o najwyższym mianie zakaźnych wirusów ospy.
Pierwsze suszenie (sublimacja):
Pierwsze suszenie stanowi część procesu suszenia sublimacyjnego, który doprowadza do sublimacji rozpuszczalnika (lód) z zamrożonej matrycy. Proces pierwszego suszenia rozpoczyna w momencie, gdy aparat do liofilizacji osiągnie wymaganą temperaturę kondensacji i odpowiednie ciśnienie komory. Ciśnienie w komorze jest zazwyczaj niższe, niż 1 mbar. korzystnie niższe niż 0.2 mbar. Zazwyczaj ciśnienie mieści się w zakresie 0.04 do 0.12 mbar. W niniejszym opisie określone wyżej warunki nazywane są czasem warunkami „niskiego ciśnienia.
Temperatura półki wzrasta, umożliwiając przebieg procesu sublimacji lodu w matrycy produktu. Temperatura produktu pozostaje znacznie niższa niż temperatura załamania formulacji, co pomaga zachować całkowicie zamrożoną matrycę podczas całego procesu suszenia i zapewnienia przebieg suszenia sublimacyjnego bez załamania. Temperatura może pozostać stała podczas całego procesu pierwszego suszenia. Alternatywnie, temperatura półki może wzrastać w sposób ciągły podczas pierwszego suszenia. Jednakże, podczas całego procesu pierwszego suszenia, temperatura produktu
PL 213 326 B1 musi być niższa, niż temperatura załamania. Pod koniec pierwszego suszenia wysuszony produkt ciągle zawiera ponad 5% wilgotności (wag./wag.). W celu uzyskania produktu o zawartości wilgoci, która nie pozwoli już na wzrost biologiczny lub reakcje chemiczne, niezbędne jest wykonanie drugiego etapu suszenia.
Drugie suszenie (desorpcja):
Podczas drugiego suszenia para wodna ulega desorpcji z powierzchni masy uformowanej w pierwszym etapie suszenia. Proces przebiega przy wzrastającej temperaturze, natomiast ci śnienie komory pozostaje wciąż niskie, co sprawia, że woda ulega desorpcji z powierzchni masy.
Temperatura półki dla drugiego suszenia określana jest na podstawie stabilności produktu i może mieścić się w zakresie 0°C do +30°C. Temperatura produktu zawiera się zazwyczaj w zakresie -5°C do 30°C. Bardziej korzystna temperatura leży w zakresie -5°C do 20°C. Drugie suszenie może przebiegać w dwóch etapach. W pierwszym, temperatura produktu może mieścić się w przedziale -5°C do +15°C, korzystnie w zakresie 0°C do +10°C, korzystniej w zakresie 2°C do +7°C. Drugi etap przebiega w wyższej temperaturze, niż pierwszy etap drugiego suszenia. Temperatura może mieścić się w zakresie 0°C do 30°C, korzystnie w przedziale +5°C do +20°C. Również pozostała zawartość wilgoci w formulacji zależy od wymagań stawianych produktowi. Do osiągnięcia najlepszej stabilności produktu, dla pewnych produktów wymagana jest wyższa, dla innych niższa zawartość wilgoci. Optymalna pozostała zawartość wilgoci, jak również czas do jej osiągnięcia, muszą zostać określone empirycznie.
Drugi proces suszenia kontynuowany jest do momentu, gdy zostanie osiągnięta pożądana zawartość wilgoci. Sposoby określania wilgotności produktu są znane specjalistom w dziedzinie. W szczególności, może być zastosowane kolorymetryczne miareczkowanie Karl'a-Fischer'a (Jennings, T.A., „Lyophilization. Introduction and Basic Principles”, Interpharm Press, Denver, CO, US, 1999, ISBN 1-57491-081-7, strony 415-418). Pozostała zawartość wilgoci jest korzystnie niższa niż 5%, korzystniej mieści się w zakresie 0.5 do 4%, jeszcze korzystniej w zakresie 1 do 3%.
Zamknięcie produktu i usunięcie z aparatu:
Wszystkie fiolki zawierające produkt były zamykane szczelnie według sposobów znanych specjalistom w dziedzinie. Fiolki zamykano pod bardzo niskim ciśnieniem (np., 0.04-2.56 mbar), bezpośrednio w aparacie do liofilizacji. Możliwe jest również zamknięcie fiolek pod mniej lub bardziej normalnym ciśnieniem przy zastosowaniu chemicznie obojętnego gazu, takiego jak azot lub hel. Zazwyczaj fiolki mogą być zamykane w atmosferze azotu, pod ciśnieniem 900 mbar. Fiolki są zamykane, korzystnie, przy użyciu korków z kauczuku butylowego. Po szczelnym zamknięciu produktu, możliwy jest powrót układu do ciśnienia atmosferycznego i opróżnienie półki aparatu.
W celu długoterminowego przechowywania, fiolki mogą być następnie uszczelnione aluminiowymi nakrywkami.
Przechowywanie szczepionki:
Liofilizowany produkt może być przechowywany w temperaturze pokojowej (25°C) i pozostaje stabilny przez przynajmniej 18 tygodni, korzystnie przez przynajmniej 20 tygodni, korzystniej przez przynajmniej 22 tygodnie w tej temperaturze. „Stabilny w pewnej temperaturze przez pewien okres czasu oznacza, że utrata miana wirusowego w tej temperaturze jest mniejsza, niż 0.5 log podczas tego okresu czasu. Jednakże, jeżeli istnieje możliwość chłodzenia, korzystnie, gdy liofilizowany produkt przechowywany jest w niższych temperaturach, takich jak 4°C. Korzystnie, produkt przechowywany jest w ciemności. Jeśli nie jest to możliwe, korzystne jest zastosowanie do przechowywania szkła kolorowego lub innych naczyń, które uniemożliwią wystawienie na szkodliwe działanie światła.
Odtworzenie:
W celu odtworzenia liofilizowanego produktu, dodawana jest do niego odpowiednia ilość rozpuszczalnika, co pozwala na ponowne uzyskanie farmaceutycznie dopuszczalnej formulacji. odpowiedniej do podawania ludziom i zwierzętom. Rozpuszczalnikiem jest korzystnie woda. Zazwyczaj rozpuszczalnik dodawany jest do formulacji w ilości, która istotnie odpowiada ilości rozpuszczalnika utraconego podczas procesu suszenia sublimacyjnego.
Wynalazek dotyczy również liofilizowanego produktu, otrzymanego w wyniku procesu według niniejszego wynalazku.
Zatem, liofilizowany produkt według niniejszego wynalazku obejmuje (i) wirus ospy, korzystnie rodzaju Orthopoxvirus lub Avipoxvirus, (ii) disacharyd, (iii) dopuszczalny farmaceutycznie polimer i, dowolnie, (iv) bufor, przy czym wirus ospy, disacharyd, polimer i bufor są zdefiniowane jak wyżej.
PL 213 326 B1
Typowy skład liofilizowanego produktu zamieszczono w poniższej tabeli 2. We wszystkich formulacjach przedstawionych w tabeli 2 ilość wirusa wynosi 5x108 TCID50/ml.
T a b e l a 2:
Ilość DSG [%] w formulacji wodnej przed suszeniem sublimacyjnym (DSG: 63g/l dekstran Mw 36.000-44.000, 150 g/l sacharozy, 0.36 g/l jednowodzian soli potasowej kwasu L-glutaminowego 20 30 40
Sacharoza [%] w liofilizowanym produkcie 54.7 (36 mg) 58.7 (54 mg) 58.4 (72 mg)
Dekstran [%] w liofilizowanym produkcie 23 (15.12 mg) 24.7 (22.68 mg) 24.6 (30.24 mg)
Jednowodzian soli potasowej kwasu L-glutaminowego 0.13 0.14 0.14
[%] w liofilizowanym produkcie (0.0864 mg) (0.1296 mg) (0.1728 mg)
Wartość średnia liofilizowanej masy [mg] (przy wypełnieniu 1.2 ml) 65.8 92 123.1
Liofilizowany produkt według niniejszego wynalazku stosowany jest do otrzymywania szczepionki. W tym celu, liofilizowany produkt jest ponownie rozpuszczany/odtwarzany, według powyższego opisu, i podawany ludziom lub zwierzętom zgodnie ze sposobami znanymi specjalistom w dziedzinie.
Krótki opis Figur
Na fig. 1 przedstawiono stabilność liofilizowanej formulacji zawierającej MVA w temperaturze 31°C. Testowaną formulacją jest GT23 (patrz, rozdział przykłady i tabela 6). Miano wirusa w formulacji wodnej według wynalazku określano przed suszeniem sublimacyjnym. Proces suszenia sublimacyjnego przebiegał zgodnie z opisem dla GT23 (patrz przykłady i tabela 6). Po suszeniu sublimacyjnym, formulację przechowywano w 31°C. W wyznaczonych punktach czasowych, liofilizowaną formulację odtwarzano i ponownie oznaczano miano wirusa.
Na fig. 2 i 3 przedstawiono taki sam eksperyment, jak opisany w legendzie do fig. 1, z wyjątkiem tego, że temperatura inkubacji wynosiła 37°C na fig. 2 i 45°C na fig. 3.
Przykłady
Poniżej zamieszczone przykłady obrazują niniejszy wynalazek. Dla specjalistów w dziedzinie pozostaje jasne, że w żaden sposób nie ograniczają one zastosowalności technologii ujawnionej w niniejszym wynalazku w podanych przyk ł adzie(-ach).
P r z y k ł a d 1: Suszenie sublimacyjne formulacji zawierających zmodyfikowany wirus krowianki szczepu Ankara (MVA)
W przykładzie tym, formulację według wynalazku zawierając ą MVA, poddawano suszeniu sublimacyjnemu w różnych warunkach. Liofilizowany produkt przechowywano w różnych temperaturach. Stabilność MVA w preparacie analizowano poprzez określenie miana MVA po odtworzeniu liofilizowanego produktu i porównanie z mianem MVA przed suszeniem sublimacyjnym. Określano wpływ różnych czasów przechowywania na miano wirusa. Protokół określania miana formulacji zawierającej MVA podano w przykładzie 2.
1. Przebieg eksperymentu:
Przygotowanie szczepionki/formulacji
W celu zbadania procesu suszenia sublimacyjnego wedł ug niniejszego wynalazku, zastosowano kilka preparatów MVA. W eksperymentach suszenia sublimacyjnego (wiersze GT1-4. 6-10 i 13-15 w tabeli 6) wykorzystano szczep Ankara zmodyfikowanego wirusa krowianki (MVA). Wirus oczyszczano stosując wirowanie przeciwwstrząsowe w 36% i 40% sacharozy, a następnie zawieszając ponownie osad w 1 mM buforze Tris o pH 9.
W eksperymentach suszenia sublimacyjnego GT1-4 (tabela 6) nie zastosowano ż adnych dodatków. Użyto układ buforowy 10 mM Tris z 140 mM NaCl o pFI 7.4. W procesach suszenia sublimacyjnego poczynając od numeru GT6 (tabela 6) wykorzystano różne dodatki, nie zmieniając układu buforowego.
Wybrano dwie różne formulację z różnymi dodatkami. Dodatki były dołączane do roztworów zawierających wirus poprzez dodanie buforu rozcieńczającego. Skład zastosowanych buforów rozcieńczających przedstawiono w poniższych tabelach 3 i 4. Dodatek buforu rozcieńczającego 1 (DSG)
PL 213 326 B1 prowadził do formulacji wodnej według wynalazku. Zastosowanie buforu rozcieńczającego 2 (DGG) pozwalało na otrzymanie formulacji wykorzystanej w analizie porównawczej.
T a b e l a 3:
Bufor rozcieńczeniowy I (DSG) Stężenie w wyjściowym roztworze [g/l]
Dekstran (MW 36000-44000) 63
Sacharoza 150
Jednowodzian soli potasowej kwasu 0.36
L-glutaminowego
T a b e l a 4:
Bufor rozcieńczeniowy 2 (DGG) Stężenie w wyjściowym roztworze [g/l]
Dekstran (MW 36000-44000) 63
Glukoza 150
Jednowodzian soli potasowej kwasu 0.36
L-glutaminowego
Wspomniane wyżej bufory rozcieńczeniowe zastosowano w różnych stężeniach w końcowej formulacji. Bufor rozcieńczeniowy 1 (DSG) użyto w 16.7%. 23%, 30% i 40% (obj./obj.). bufor rozcieńczający 2 (DGG) o stężeniu 20% (obj./obj.). Wartość TCID50/ml końcowej formulacji doprowadzano do 5x108 TCID50/ml stosując płyn fizjologiczny Tris (10 mM bufor Tris; 140 mM NaCl; pH 7.4).
Zamrażanie próby
Próby zamrażano w aparacie do liofilizacji (Christ feeze dryer, typ Alpha 2-4). W przypadku formulacji z sacharozą (DSG), porównanie kilku temperatur zamrażania (-30°C do -45°C) wykazało, że. w celu uzyskania idealnej struktury masy, zawiesina musi być zamrażana do temperatury -40°C, która jest niższa, niż temperatura załamania formulacji.
Podczas zamrażania w aparacie do liofilizacji, temperaturę -40°C osiągano w ciągu około 3.5 do 4.5 godziny (zaczynając od temperatury około 20°C).
Pierwsze suszenie
W przypadku formulacji z sacharozą (DSG) temperatura załamania, około -30°C do -37°C, zawierała temperaturę załamania sacharozy (-31°C). Zatem, w celu zapewnienia całkowitego zamrożenia matrycy, doprowadzano temperaturę produktu do wartości w przedziale -37°C do -41°C. Zastosowano ciśnienie 0.04 i 0.12 mbar (-50°C i -40°C na wykresie fazowym wody).
Głównym czynnikiem wpływającym na sublimację w pierwszym suszeniu jest różnica ciśnień między produktem a chłodnicą aparatu do liofilizacji, powstała na skutek ich zróżnicowania temperaturowego. Zgodnie z prawami natury, jeżeli temperatura wody maleje, maleje również ciśnienie panujące nad tą wodą. Określona temperatura wody jest zawsze związana z określonym ciśnieniem. Chłodnica działała w zakresie temperatur od - 83°C do -89°C. Wartość ciśnienia w; komorze i temperatury półkowej wpływały na temperaturę produktu. Ze względu na to, że temperatura chłodnicy pozostaje ustalona, czas trwania pierwszego suszenia nie może uleć w prosty sposób skróceniu. W procesie zwiększenia temperatury produktu, czynnikiem limitującym jest Tc formulacji.
Drugie suszenie
Temperatury w drugim suszeniu uwarunkowane są stabilnością produktu. Również pozostała zawartość wilgoci w formulacji jest uzależniona od wymagań produktu. Dla osiągnięcia najlepszej stabilności produktu, pewne z nich wymagają wysokiej, inne niskiej zawartości wilgoci. Optymalna pozostała zawartość wilgoci, jak również czas do jej osiągnięcia, muszą zostać określone empirycznie. Ze względu na to, że drugie suszenie rozpoczyna się, gdy produkt osiągnie temperaturę powyżej 0°C. suszenie to dokonywane jest w dwóch etapach. W pierwszym etapie, temperatura półki regulowana jest przez kilka godzin (w przedziale 4 do 7 godzin), tak, by temperatura produktu była wyższa niż 0°C (w zakresie 4 do 6°C). W ten sposób, cały możliwy istniejący lód, który pozostał po pierwszym suszeniu ulega stopieniu. Zastosowanie tak łagodnych warunków w początkowym etapie drugiego suszenia pozwala na zminimalizowanie uszkodzeń produktu. Następnie, drugi etap zapoczątkowany jest po14
PL 213 326 B1 przez wzrost temperatury produktu, przez 20-30 godzin, do wartości w przedziale 18 do 21°C. Czas trwania drugiego etapu zależy silnie od pożądanej pozostałej zawartości wilgoci w zliofilizowanym produkcie. W celu uzyskania różnej zawartości pozostałej wilgoci, stosuje się różny czas. Do pomiaru pozostałej zawartości wilgoci w zliofilizowanym materiale zastosowano analizę miareczkowania kolorymetrycznego Karl-Fischer (Jennings, T.A.. „Lyophilization, Introduction and Basic Principles, Interpharm Press, Denver. CO, US, 1999, ISBN 1-57491-081-7, strony 415-418).
Zamknięcie produktu i usunięcie z aparatu
Wszystkie produkty otrzymane w wyniku przeprowadzonego procesu były zamykane szczelnie pod bardzo niskim ciśnieniem (0.04-2.56 mbar), bezpośrednio w aparacie do liofilizacji. Fiolki zamykano stosując korki z kauczuku butylowego. Po zamknięciu produktu, układ przenoszono do ciśnienia atmosferycznego i opróżniano półkę. Następnie, fiolki były zamykane szczelnie nakrętkami aluminiowymi, odpowiednimi do długoterminowego przechowywania.
Przechowywanie szczepionki
Istotnym elementem w przygotowywaniu formulacji jest wyprodukowanie stabilnej podczas przechowywania szczepionki. Czynniki wpływające na stabilność obejmują pozostałą zawartość wilgoci, ustalenie składu atmosfery i warunki przechowywania, włączając temperaturę, wilgotność i światło.
Wszystkie partie otrzymane podczas procesu suszenia przechowywane były w 4°C i w temperaturze pokojowej. Ponadto, kilka rodzajów partii produktu było również przechowywanych w 31°C. 37°C i 45°C. Wszystkie próby przechowywano w ciemności.
Odtworzenie
Liofilizowane próby odtwarzano przy użyciu autoklawowanej wody Milli-Q. Bardziej szczegółowo, wodę (1.2 ml) dodawano do próby przy pomocy strzykawki. Zawiesinę mieszano łagodnie wytrząsając. Odtworzenie wymagało tylko kilku sekund. W odtworzonym produkcie określano miano wirusa i porównywano z mianem wirusa uzyskanym przed suszeniem sublimacyjnym.
Przyspieszony test stabilności
Stabilność formulacji GT23 (patrz tabela 6) mierzono w 31°C, 37°C i 45°C. Regularnie monitorowano miano wirusa. Wyniki przedstawiono na fig. 1-3.
2. Wyniki i wnioski:
MVA poddawany był suszeniu sublimacyjnemu wraz z i bez różnych dodatków.
Wykazano, że formulację bez dodatków okazały się niestabilne (patrz tabela 6). Przyjęto, że próby są stabilne, gdy miano ich nie ulegało obniżeniu o więcej niż 0.5 log. Zatem, termin „stabilna w określonej temperaturze przez określony okres czasu oznacza, że strata miana wirusowego we wskazanej temperaturze jest mniejsza niż 0.5 log. we wskazanym okresie czasu. Formulacja „traci'', jeżeli strata miana wirusowego w określonym okresie czasu, we wskazanej temperaturze, wynosi 0.5 log lub więcej. Formulacje zawierające dekstran i glukozę wykazywały bardzo niską stabilność w temperaturze pokojowej. Formulacje według niniejszego wynalazku, zawierające różne stężenia sacharozy i dekstranu okazały się stabilne. Stabilność MVA w formulacjach według niniejszego wynalazku utrzymywała się przez przynajmniej 25 tygodni w 4°C i w temperaturze pokojowej.
Szczegółowe informacje dotyczące poszczególnych eksperymentów zamieszczono w tabeli 6:
W tabeli 6 wykazano, że stabilność formulacji bez dodatków (tabela 6. GT1-4) była bardzo niska. Już po kilku tygodniach traciły 0.5 log pierwotnego, wyjściowego miana i tym samym nie spełniając wymaganych warunków.
Formulację z 20% (v/v) DGG nie zostały ocenione pozytywnie, ze względu na zniszczenie struktury materiału podczas procesu suszenia sublimacyjnego (dane nieprzedstawione). Załamanie to wynika z niskiej Tc glukozy, która nieznacznie wzrosła na skutek zastosowania dekstranu, posiadającego wysoką Tc (-11 °C). W pierwszym suszeniu zastosowano najniższą z możliwych temperaturę aparatu do liofilizacji (-45°C). Zatem, nie było możliwe obniżenie temperatury poniżej Tc glukozy. Formulacje z 30% (v/v) DGG nie ulegały załamaniu. Zjawisko to wynika prawdopodobnie z wyższej całkowitej ilości dekstranu, który zwiększał Tc do wartości wyższej niż temperatura zastosowana podczas pierwszego suszenia. Mimo że struktura materiału nie uległa załamaniu, stabilność, szczególnie w; temperaturze pokojowej, nie była satysfakcjonująca, co mogło być wynikiem niskiej wartości temperatury stanu stałego Tc glukozy (tabela 6. GT 10).
W większości eksperymentów zastosowano bufor rozcieńczeniowy 1 (DSG). Stabilizacja osiągnięta z udziałem tego dodatku była bardzo dobra. Ze względu na wysoką temperaturę załamania Tc (-31°C) sacharozy, nie odnotowano problemu z tego rodzaju formulacją.
PL 213 326 B1
Stabilność suszonego sublimacyjnie materiału była zawsze dobra (tabela 6). Nie stwierdzono znacznych różnic między zastosowanym 16.7%. 20%, 23%. 28.6%, 30% i 40% (v/v) DSG w formulacjach. Stabilność w 4°C i w temperaturze pokojowej sprawdzana była dla wszystkich 6 formulacji.
Produkty suszone przez zamrażanie z 30% i 40% DSG wykazywały nieco wyższą stabilność.
Jedną z formulacji (proces GT 23. patrz tabela 6) poddano szczegółowej analizie w przyspieszonym teście stabilności. Wyniki przedstawiono na fig. 1 do 3 i podsumowano w poniższej tabeli 5.
T a b e l a 5:
Temperatura [°C] Utrata miana (dane eksperymentalne) Utrata 0.5 log po [dni] (dane obliczone)
31 0.245 log w 29 dni 59
37 0.321 log w 35 dni 54
45 0.332 log w 29 dni 44
Szczepionkę przechowywano przez około 1 miesiąc w 31°C i przez cały ten okres zachowywała ona swoje właściwości (strata miana wirusa mniejsza niż połowa log). Nawet w wyższych temperaturach, było by możliwe przechowywanie szczepionki przez ponad miesiąc, co mogłoby okazać się szczególnie interesujące w przypadku szczepień w regionach tropikalnych.
W przypadku stosowanych wcześ niej szczepionek przeciwko ospie, WHO zalecał a sposób oszacowania stabilności. Jeżeli szczepionka traciła mniej niż 1 log w ciągu 4 tygodni w 37°C. oceniana była jako stabilna przez co najmniej jeden rok, przy przechowywaniu w 4°C (kryterium przyzwalającym na stosowanie w przypadku starych szczepionek była utrata mniej niż 1 log). Jak wykazano, formulacja GT23 według niniejszego wynalazku spełnia to kryterium.
P r z y k ł a d 2: Miareczkowanie zmodyfikowanego wirusa krowianki Ankara (MVA)
Miareczkowanie zmodyfikowanego wirusa krowianki Ankara (MVA) wykonano przeprowadzając opartą na TCID50 analizę, stosując 10-krotne rozcieńczenia na płytce 96-studzienkowej. Pod koniec analizy, zainfekowane komórki uwidaczniano przy użyciu przeciwciała swoistego wobec wirusa krowianki i odpowiedniego roztworu barwiącego. 2-3 dniowe komórki podstawowe CEF (fibroblasty embrionów kurcząt) rozcieńczano do 1x105 kom./ml w 7% RPMI. 10-krotne rozcieńczenia uzyskano dzięki 8 powtórzeniom danego rozcieńczenia. Następnie, nakładano 100 μΐ do studzienek na 96-studzienkowej płytkach. W kolejnym etapie, komórki inkubowano przez noc w 37°C i w atmosferze 5% CO2.
Rozcieńczenia roztworów zawierających wirus przygotowano w 10 etapach (stosownie 10-1 do
10- ) stosując RPMI nie zawierający płodowej surowicy cielęcej. Następnie, 100 μl każdej próbki wirusa dodawano do studzienek zawierających komórki, 96-studzienkowe płytki inkubowano w 37°C i w atmosferze 5% CO2 przez 5 dni, podczas których miała miejsce infekcja i replikacja wirusa.
Komórki barwiono 5 dni po infekcji, stosując przeciwciało swoiste wobec wirusa krowianki. Do wykrycia swoistego przeciwciała zastosowano peroksydazę chrzanową (HRP) sprzęgniętą z drugim przeciwciałem. Przeciwciałem swoistym wobec MVA było poliklonalne przeciwciało królicze przeciwko wirusowi krowianki, frakcja IgG (Quartett, Berlin, Niemcy #9503-2057). Jako drugie przeciwciało zastosowano poliklonalne przeciwciało kozie swoiste wobec króliczego IgG, sprzęgnięte z HRP (Promega, Mannheim, Niemcy. # W4011). Reakcje barwne przeprowadzano zgodnie ze znanymi technikami.
Każdą studzienkę, dla której odnotowano pozytywny wynik reakcji barwnej rozpatrywano jako pozytywną w obliczeniach TCID50.
Miano wyliczano stosując wzór Spearman'a [1] i Kaerber'a [2].
Ze względu na to, że wszystkie parametry analizy były ustalone, zastosowano następujący, uproszczony wzór:
Miano wirusa [TCID50/ml] = 10 [a+1,5 + Xa/8 + Xc/8] a = czynnik rozcieńczenia z ostatniej kolumny, w przypadku której wszystkich osiem studzienek jest pozytywnych xa = liczba pozytywnych studzienek w kolumnie a+1 xb = liczba pozytywnych studzienek w kolumnie a+2 xc = liczba pozytywnych studzienek w kolumnie a+3
PL 213 326 B1
T a b e i a 6:
Dane stabiiności wirusów ospy zawartych w różnych formuiacjach suszonych subiimacyjnie
Proces Dodatki Zamraża- nie Pierwsze suszenie Drugie suszenie Stabiiność
1 2 3 4 5 6
GT 1 Do -30°C Ciśnienie: 0.37 mbar Temperatura półki: 2°C (przez 20 godz.) Ciśnienie: 0.37 mbar Temperatura półki: 5°C (przez 2.5 godz.) 8°C (przez 1 godz.) 10°C (przez 2 godz.) Formuiacja traci stabiiność po tygodniu przechowywania w temperaturze pokojowej i w 37°C
GT 2 Do -40°C Ciśnienie: 0.12 mbar Temperatura produktu: -13°C (przez 24 godz.) Ciśnienie: 2.56 mbar Temperatura produktu: -4°C (przez 3.5 godz.) 12°C (przez 4 godz.) Formuiacja traci stabiiność po 11 dniach przechowywania w temperaturze pokojowej i w 37°C
GT 3 Do -39°C Ciśnienie: 0.07 mbar Temperatura produktu: -16°C (przez 24 godz.) Ciśnienie: 0.07 mbar Temperatura produktu: -1°C (przez 2.75 godz.) 7°C (przez 3.5 godz.) Formuiacja traci stabiiność po 23 dniach przechowywania w temperaturze pokojowej
GT 4 Do -45°C Ciśnienie: 0.04 mbar Temperatura produktu: -37°C (przez 25.5 godz.) Ciśnienie: 0.04 mbar Temperatura produktu: -3°C (przez 6 godz.) 14°C (przez 26.5 godz.) Formuiacja traci stabiiność po 2 tygodniach przechowywania w 4°C i w temperaturze pokojowej
GT 6 30% DSG Do -44°C Ciśnienie: 0.04 mbar Temperatura produktu: -42°C (przez 23 godz.) Ciśnienie: 0.04 mbar Temperatura produktu: 5°C (przez 6 godz.) 16°C (przez 25 godz.) Formuiacja jest stabiina - w 4°C przez przynajmniej 34 tygodnie - w temperaturze pokojowej przez przynajmniej 20 tygodni
GT 7 23% DSG Do -44°C Ciśnienie: 0.04 mbar Temperatura produktu: -37°C (przez 22.5 godz.) Ciśnienie: 0.04 mbar Temperatura produktu: 0°C (przez 7 godz.) 13°C (przez 24 godz.) Formuiacja jest stabiina przez przynajmniej 46 tygodni w 4°C i w temperaturze pokojowej
GT 8 16.7% i 23% DSG Do -42°C Ciśnienie: 0.04 mbar Temperatura produktu: -38°C (przez 24 godz.) Ciśnienie: 0.04 mbar Temperatura produktu: 4°C (przez 8 godz.) 17°C (przez 21 godz.) Stabiina w 4°C i w temperaturze pokojowej przez przynajmniej 35 tygodni
GT 9 30% i 40% DSG Do -44°C Ciśnienie: 0.04 mbar Temperatura produktu: -37°C (przez 25.5 godz.) Ciśnienie: 0.04 mbar Temperatura produktu: 4°C (przez 6.5 godz.) 17°C (przez 24 godz.) Formuiacja z 30% DSG: jest stabiina: - w 4°C przez przynajmniej 57 tygodni - w temperaturze pokojowej przez przynajmniej 43 tygodnie Formułacja z 40% DSG: jest stabiina: - w 4°C i w temperaturze pokojowej przez przynajmniej 43 tygodnie
GT 10 30% DGG Do-35°C Ciśnienie: 0.04 mbar Temperatura produktu: -37°C (przez 23 godz.) Ciśnienie: 0.04 mbar Temperatura produktu: 6°C (przez 6.5 godz.) 19°C (przez 24 godz.) Formuiacja stabiina w 4°C przez 42 tygodnie Formuiacja traci stabiiność po 10 tygodniach w temperaturze pokojowej (RT)
GT 11 20% DGG Do -45°C Ciśnienie: 0.04 mbar Temperatura produktu: -41 °C (przez 23 godz.) Ciśnienie: 0.04 mbar Temperatura produktu: 5°C (przez 4 godz.) 19°C (przez 25.5 godz.) Formuiacja traci stabiiność w 4°C po 56 tygodniach; w RT po 14 tygodniach
PL 213 326 B1 cd. tabeli 6
1 2 3 4 5 6
GT 12 30% DSG Do -40°C Ciśnienie: 0.04 mbar Temperatura produktu: 37°C (przez 24 godz.) Ciśnienie: 0.04 mbar Temperatura produktu: 4°C (przez 6 godz.) 17°C (przez 24 godz.) Formulacja jest stabilna przez przynajmniej 54 tygodnie w 4°C. W 25°C pozostaje stabilna przez przynajmniej 40 tygodni
GT 13 30% DSG Do -40°C Ciśnienie: 0.04 mbar Temperatura produktu: 38°C (przez 19 godz.) - 15°C (przez 9 godz.) Ciśnienie: 0.04 mbar Temperatura produktu: 4°C (przez 15.5 godz.) 17°C (przez 26.5 godz.) Formulacja jest stabilna przez przynajmniej 36 tygodni w 4°C.
GT 14 30% DSG Do -40°C Ciśnienie: 0.04 mbar Temperatura produktu: -38°C (przez 21.5 godz.) 13°C (przez 17.5 godz.) Ciśnienie: 0.04 mbar Temperatura produktu: 15°C (przez 6.5 godz.) 18°C (przez 26.5 godz.) Formulacja jest stabilna przez przynajmniej 50 tygodni w 4°C. W 25°C pozostaje stabilna przez przynajmniej 19 tygodni.
GT 15 30% DSG Do -41°C Ciśnienie: 0.04 mbar Temperatura produktu: 37°C (przez 20 godz.) Ciśnienie: 0.04 mbar Temperatura produktu: 5°C (przez 3 godz.) 17°C (przez 24.5 godz.) Formulacja traci stabilność po 49 tygodniach w 4°C. W 25°C pozostaje stabilna przez przynajmniej 18 tygodni.
GT 23 30% DSG Do -40°C Ciśnienie: 0.04 mbar Temperatura produktu: -34°C (przez 21 godz.) Ciśnienie: 0.04 mbar Temperatura produktu: 7°C (przez 18 godz.) 17°C (przez 28 godz.) Patrz dane Przyspieszony test stabilności na fig. 1-3
PL 213 326 B1
Wskazania odnośnie zdeponowanego mikroorganizmu (PCT Reg.13bis)
A. Uwagi poniżej dotyczą mikroorganizmu wzmiankowanego w opisie patentowym na stronie 8, linia 13-15 (wersja oryginalna)
B. IDENTYFIKACJA DROBNOUSTROJÓW Dodatkowe depozyty zidentyfikowano na dodatkowej stronie
Nazwa Instytucji Depozytowej ECACC. CAMR European Collection of Cell Cultures
Adres Instytucji Depozytowej (wraz z kodem i krajem) Centre for Applied Microbiology & Research Porton Down, Salisbury, SP4 OJG, UK
Data złożenia depozytu 27 stycznia 1994 Numer dostępu 94012707
C. UWAGI DODATKOWE (nie wypełniać, gdy nie dotyczy) Dodatkowe depozyty zidentyfikowano na dodatkowej stronie
Odnośnie wszystkich krajów wyznaczonych, w których jest to możliwe i w zakresie dopuszczalnym zgodnie prawem tych krajów, wnioskuje się udostępnienie zdeponowanych mikroorganizmów niezależnym rzeczoznawcom, zgodnie z odpowiednim prawem patentowym, np. EPC Reg. 28(4); Prawo Patentowe UK 1995. Rozdział 2, Paragraf 3; Australijskie Prawo 3.25(3); Duńskie Prawo Patentowe Sekcja 22 i 33(3) i zasadniczo podobne przepisy mutatis mutandis w dowolnym innym kraju wyznaczonym.
D. KRAJE WYZNACZONE, KTÓRYCH DOTYCZĄ UWAGI (gdy uwagi nie odnoszą się do wszystkich krajów wyznaczonych)
E. UWAGI DOSTARCZONE OSOBNO (nie wypełniać, gdy nie dotyczy)
Poniższe uwagi zostaną dostarczone do Biura Międzynarodowego później (wskaż rodzaj uwag np. „numer dostępu depozytu)
Wypełnia Urząd Otrzymujący Ξ Ta strona została otrzymana wraz ze zgłoszeniem międzynarodowym Wypełnia Biuro Międzynarodowe □ Ta strona została otrzymana przez Biuro Międzynarodowe dnia:
Podpis Urzędnika Podpis Urzędnika
PL 213 326 B1
Wskazania odnośnie zdeponowanego mikroorganizmu (PCT Reg.13bis)
A. Uwagi poniżej dotyczą mikroorganizmu wzmiankowanego w opisie patentowym na stronie 8, linia 18-20 (wersja oryginalna)
B. IDENTYFIKACJA DROBNOUSTROJÓW Dodatkowe depozyty zidentyfikowano na dodatkowej stronie
Nazwa Instytucji Depozytowej ECACC European Collection of Cell Cultures
Adres Instytucji Depozytowej (wraz z kodem i krajem) Centre for Applied Microbiology & Research Salisbury. SP4 OJG. UK Wiltshire SP4 OJG, UK
Data złożenia depozytu 30 sierpnia 2000 Numer dostępu 00083008
C. UWAGI DODATKOWE (nie wypełniać, gdy nie dotyczy) Dodatkowe depozyty zidentyfikowano na dodatkowej stronie □
Odnośnie wszystkich krajów wyznaczonych, w których jest to możliwe i w zakresie dopuszczalnym zgodnie prawem tych krajów, wnioskuje się udostępnienie zdeponowanych mikroorganizmów niezależnym rzeczoznawcom, zgodnie z odpowiednim prawem patentowym, np. EPC Reg. 28(4); Prawo Patentowe UK 1995. Rozdział 2, Paragraf 3; Australijskie Prawo 3.25(3); Duńskie Prawo Patentowe Sekcja 22 i 33(3) i zasadniczo podobne przepisy mutatis mutandis w dowolnym innym kraju wyznaczonym.
D. KRAJE WYZNACZONE, KTÓRYCH DOTYCZĄ UWAGI (gdy uwagi nie odnoszą się do wszystkich krajów wyznaczonych)
E. UWAGI DOSTARCZONE OSOBNO (nie wypełniać, gdy nie dotyczy)
Poniższe uwagi zostaną dostarczone do Biura Międzynarodowego później (wskaż rodzaj uwag np. „numer dostępu depozytu)
Wypełnia Urząd Otrzymujący Ξ Ta strona została otrzymana wraz ze zgłoszeniem międzynarodowym Wypełnia Biuro Międzynarodowe □ Ta strona została otrzymana przez Biuro Międzynarodowe dnia:
Podpis Urzędnika Podpis Urzędnika
PL 213 326 B1
Wskazania odnośnie zdeponowanego mikroorganizmu (PCT Reg.13bis)
A. Uwagi poniżej dotyczą mikroorganizmu wzmiankowanego w opisie patentowym na stronie 8, linia 13-15 (wersja oryginalna)
B. IDENTYFIKACJA DROBNOUSTROJÓW Dodatkowe depozyty zidentyfikowano na dodatkowej stronie □
Nazwa Instytucji Depozytowej ECACC, CAMR European Collection of Cell Cultures
Adres Instytucji Depozytowej (wraz zkodem i krajem) Centre for Applied Microbiology & Research Salisbury Wiltshire SP4 OJG, UK
Data złożenia depozytu 7 stycznia 2000 Numer dostępu 00120707
C. UWAGI DODATKOWE (nie wypełniać, gdy nie dotyczy) Dodatkowe depozyty zidentyfikowano na dodatkowej stronie □
Odnośnie wszystkich krajów wyznaczonych, w których jest to możliwe i w zakresie dopuszczalnym zgodnie prawem tych krajów, wnioskuje się udostępnienie zdeponowanych mikroorganizmów niezależnym rzeczoznawcom, zgodnie z odpowiednim prawem patentowym, np. EPC Reg. 28(4); Prawo Patentowe UK 1995. Rozdział 2, Paragraf 3; Australijskie Prawo 3.25(3); Duńskie Prawo Patentowe Sekcja 22 i 33(3) i zasadniczo podobne przepisy mutatis mutandis w dowolnym innym kraju wyznaczonym.
D. KRAJE WYZNACZONE, KTÓRYCH DOTYCZĄ UWAGI (gdy uwagi nie odnoszą się do wszystkich krajów wyznaczonych)
E. UWAGI DOSTARCZONE OSOBNO (nie wypełniać, gdy nie dotyczy)
Poniższe uwagi zostaną dostarczone do Biura Międzynarodowego później (wskaż rodzaj uwag np. „numer dostępu depozytu)
Wypełnia Urząd Otrzymujący Ξ Ta strona została otrzymana wraz ze zgłoszeniem międzynarodowym Wypełnia Biuro Międzynarodowe □ Ta strona została otrzymana przez Biuro Międzynarodowe dnia:
Podpis Urzędnika Podpis Urzędnika
PL 213 326 B1

Claims (22)

1. Formulacja, znamienna tym, ż e zawiera (i) wirus ospy wybrany z grupy obejmują cej wirusy Orthopoxvirus, Parapoxvirus, Avipoxvirus, Capropoxvirus i Suipoxvirus, przy czym wirus ospy posiada miano wynoszące co najmniej 106TCID50 na mg białka całkowitego (ii) disacharyd i (iii) dopuszczalny farmaceutycznie polimer, przy czym nie zawiera ona buforu fosforanowego.
2. Formulacja według zastrz. 1, znamienna tym, ż e wirus ospy posiada miano wynoszące co najmniej 108 TCID50 na mg białka całkowitego.
3. Formulacja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że zawiera ponadto bufor.
4. Formulacja według zastrz. 3, znamienna tym, że bufor został wybrany z grupy obejmującej: TRIS, TBS, MOPS, HEPES i bufor (dwu)węglanowy.
5. Formulacja według jakiegokolwiek z zastrz. od 1 do 4, znamienna tym, ż e wirus ospy jest wirusem krowianki.
6. Formulacja według jakiegokolwiek z zastrz. od 1 do 5, znamienna tym, że wirus krowianki wybrany jest spośród szczepu Elstree i zmodyfikowanego szczepu wirusa krowianki Ankara (MVA).
7. Formulacja wedł ug jakiegokolwiek z zastrz. od 1 do 6, znamienna tym, ż e wirus ospy jest rekombinowanym wirusem ospy.
8. Formulacja wedł ug jakiegokolwiek z zastrz. od 1 do 7, znamienna tym, ż e disacharyd wybrany jest z grupy obejmującej sacharozę, laktozę i trehalozę.
9. Formulacja wedł ug jakiegokolwiek z zastrz. od 1 do 8, znamienna tym, ż e stężenie disacharydu mieści się w zakresie 10 do 100 g/l.
10. Formulacja według jakiegokolwiek z zastrz. od 1 do 9, znamienna tym, że farmaceutycznie dopuszczalny polimer wybrany jest spośród dekstranu i poliwinylopirolidonu (PVP).
11. Formulacja według zastrz. 10, znamienna tym, że dekstran posiada masę cząsteczkową w zakresie 30,000 do 70,000 i stężenie od 1 do 50 g/l.
12. Formulacja według jakiegokolwiek z zastrz. od 1 do 10, znamienna tym, że formulacja ta zawiera ponadto kwas glutaminowy.
13. Formulacja według jakiegokolwiek z zastrz. od 1 do 12, znamienna tym, że temperatura załamania formulacji mieści się w zakresie od -37°C do -30°C.
14. Formulacja według jakiegokolwiek z zastrz. od 1 do 13, znamienna tym, że wirus ospy należy do szczepu MVA albo szczepu Elstree, disacharyd jest sacharozą, polimer jest dekstranem a bufor nie jest buforem fosforanowym.
15. Formulacja według jakiegokolwiek z zastrz. od 1 do 14, znamienna tym, że jest szczepionką.
16. Zastosowanie formulacji określonej w jakimkolwiek z zastrz. od 1 do 14 do otrzymywania szczepionki.
17. Sposób otrzymywania stabilnej, zawierającej wirus ospy kompozycji, znamienny tym, że formułacja określona w jakimkolwiek z zastrz. od 1 do 15 jest suszona sublimacyjnie.
18. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:
(i) zamrażanie formulacji zgodnej z definicją według jakiegokolwiek z zastrz. od 1 do 15 do temperatury niższej niż temperatura załamania (zniszczenia struktury) formulacji, w celu uzyskania matrycy zamrożonego produktu, (ii) pierwsze suszenie zamrożonej formulacji w warunkach niskiego ciśnienia i w temperaturze produktu, umożliwiających sublimację lodu w matrycy produktu, przy czym temperatura produktu jest niższa niż temperatura załamania formulacji, (iii) drugie suszenie w warunkach niskiego ciśnienia i w temperaturze produktu w przedziale 0°C do 30°C, trwające do momentu uzyskania pozostałej wilgotności produktu niższej niż 5%.
19. Produkt liofilizowany, znamienny tym, że może być otrzymany sposobem określonym w zastrz. 17 albo 18.
20. Produkt liofilizowany, znamienny tym, że zawiera (i) wirus ospy, (ii) disacharyd, (iii) dopuszczalny farmaceutycznie polimer i, dowolnie, (iv) bufor inny niż bufor fosforanowy; przy czym wirus ospy, disacharyd, polimer i bufor zdefiniowane są według jakiegokolwiek z zastrz. od 1 do 8, 10 i 12.
21. Produkt liofilizowany według jakiegokolwiek z zastrz. od 19 do 20, znamienny tym, że pozostała zawartość wilgoci mieści się w zakresie 1 do 3%.
PL 213 326 B1
22. Zastosowanie liofilizowanego produktu według jakiegokolwiek z zastrz. od 19 do 21 do otrzymania szczepionki.
22. Sposób odtworzenia liofilizowanego produktu według jakiegokolwiek z zastrz. od 19 do 22, znamienny tym, że produkt rozpuszczany jest w odpowiedniej ilości dopuszczalnego farmaceutycznie rozpuszczalnika.
PL369954A 2001-12-10 2002-11-28 Formulacja zawierajaca wirus ospy, sposób jej otrzymywania i zastosowanie PL213326B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA200101831 2001-12-10

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL369954A1 PL369954A1 (pl) 2005-05-02
PL213326B1 true PL213326B1 (pl) 2013-02-28

Family

ID=8160885

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL369954A PL213326B1 (pl) 2001-12-10 2002-11-28 Formulacja zawierajaca wirus ospy, sposób jej otrzymywania i zastosowanie

Country Status (22)

Country Link
US (1) US7094412B2 (pl)
EP (1) EP1418942B1 (pl)
JP (1) JP4439263B2 (pl)
KR (1) KR20040074067A (pl)
CN (1) CN1296096C (pl)
AT (1) ATE300954T1 (pl)
AU (1) AU2002361962A1 (pl)
BR (1) BR0214822A (pl)
CA (1) CA2467365C (pl)
DE (1) DE60205388T2 (pl)
DK (1) DK1418942T3 (pl)
EA (1) EA006880B1 (pl)
ES (1) ES2247414T3 (pl)
HK (1) HK1071295A1 (pl)
HU (1) HUP0402179A3 (pl)
IL (2) IL161590A0 (pl)
MX (1) MXPA04005577A (pl)
NO (1) NO20042958L (pl)
NZ (1) NZ533302A (pl)
PL (1) PL213326B1 (pl)
UA (1) UA78738C2 (pl)
WO (1) WO2003053463A2 (pl)

Families Citing this family (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7501127B2 (en) 2002-05-16 2009-03-10 Bavarian Nordic A/S Intergenic regions as novel sites for insertion of HIV DNA sequences in the genome of Modified Vaccinia virus Ankara
ATE393212T2 (de) 2002-09-05 2008-05-15 Bavarian Nordic As Verfahren zur amplifikation von einem poxvirus in serumfreien verhältnissen
CN1207005C (zh) * 2002-10-31 2005-06-22 威世药业（如皋）有限公司 含生物活性物质的兔皮和其用途
WO2006029467A1 (en) * 2004-09-16 2006-03-23 Btf Pty Ltd Rapid freeze drying process
CN101360821A (zh) * 2005-11-21 2009-02-04 圣诺菲·帕斯图尔有限公司 重组病毒的稳定制剂
AU2008250596C1 (en) 2007-05-14 2010-11-25 Bavarian Nordic A/S Purification of Vaccinia virus- and recombinant Vaccinia virus-based vaccines
BRPI0811161A2 (pt) * 2007-05-18 2014-10-07 Medimmune Llc Conservação de materiais bioativos por espuma liofilizada.
US8394385B2 (en) 2009-03-13 2013-03-12 Bavarian Nordic A/S Optimized early-late promoter combined with repeated vaccination favors cytotoxic T cell response against recombinant antigen in MVA vaccines
WO2011042180A1 (en) 2009-10-08 2011-04-14 Bavarian Nordic A/S Generation of a broad t-cell response in humans against hiv
CA2798055C (en) 2010-05-21 2015-11-24 Ah Usa 42 Llc Parapoxvirus vectors containing rabies virus antigen
US10087423B2 (en) 2010-07-20 2018-10-02 Bavarian Nordic A/S Method for harvesting expression products
JP2013537409A (ja) 2010-07-20 2013-10-03 ゾエティス・エルエルシー パラポックスウイルスベクター
DK2788021T3 (en) 2011-12-09 2017-04-10 Bavarian Nordic As POXVIRUS VECTOR FOR EXPRESSION OF BACTERIAL ANTIGENES CONNECTED TO TETANANOX INFRAGMENT C
EA029492B1 (ru) 2012-07-10 2018-04-30 Трансген Са Вакцина на основе микобактериальных антигенов
WO2014009433A1 (en) 2012-07-10 2014-01-16 Transgene Sa Mycobacterium resuscitation promoting factor for use as adjuvant
TWI690322B (zh) 2012-10-02 2020-04-11 法商傳斯堅公司 含病毒的調配物及其使用
DE102013004595A1 (de) 2013-03-15 2014-09-18 Emergent Product Development Germany Gmbh RSV-Impfstoffe
EP3092000A1 (en) 2014-01-09 2016-11-16 Transgene SA Fusion of heterooligomeric mycobacterial antigens
US10653766B2 (en) 2014-03-12 2020-05-19 Bavarian Nordic A/S Use of oil and water emulsions for increasing B cell responses with modified Vaccinia Ankara virus
PT3169341T (pt) 2014-07-16 2019-09-09 Transgene Sa Vírus oncolítico para a expressão de moduladores de pontos de controlo imunitário
EP3226894B1 (en) 2014-12-01 2019-08-07 Transgene SA Stable liquid vaccinia virus formulations
WO2016131945A1 (en) 2015-02-20 2016-08-25 Transgene Sa Combination product with autophagy modulator
FR3042121A1 (fr) 2015-10-08 2017-04-14 Jean-Marc Limacher Composition anti-tumorale
US20190134190A1 (en) 2016-05-04 2019-05-09 Transgene Sa Combination therapy with cpg tlr9 ligand
TW201825511A (zh) 2016-09-09 2018-07-16 美商艾斯合顧問有限公司 表現免疫檢查點調節子的溶瘤病毒
WO2018069316A2 (en) 2016-10-10 2018-04-19 Transgene Sa Immunotherapeutic product and mdsc modulator combination therapy
WO2018091680A1 (en) 2016-11-18 2018-05-24 Transgene Sa Cowpox-based oncolytic vectors
CA3045228C (en) 2016-12-28 2024-01-02 Transgene Sa Oncolytic viruses and therapeutic molecules
EP3624845A1 (en) 2017-05-15 2020-03-25 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stable virus-containing composition
CA3061678A1 (en) 2017-05-15 2018-11-22 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stable virus-containing composition
CN110958887B (zh) 2017-06-15 2023-10-31 扬森疫苗与预防公司 编码hiv抗原的痘病毒载体及其使用方法
CN111065406A (zh) 2017-06-21 2020-04-24 特兰斯吉恩股份有限公司 个性化疫苗
WO2019020543A1 (en) 2017-07-28 2019-01-31 Transgene Sa ONCOLYTIC VIRUSES EXPRESSING AGENTS TARGETING METABOLIC IMMUNE MODULATORS
JP2021516957A (ja) 2018-03-07 2021-07-15 トランジェーヌＴｒａｎｓｇｅｎｅ パラポックスウイルスベクター
WO2020011754A1 (en) 2018-07-09 2020-01-16 Transgene Chimeric vaccinia viruses
WO2020049151A1 (en) 2018-09-06 2020-03-12 Bavarian Nordic A/S Storage improved poxvirus compositions
EP3875119A4 (en) 2018-10-30 2022-08-31 The University of Tokyo ONCOLYTIC VIRUS FOR THE TREATMENT OF CANCER
WO2020136232A1 (en) 2018-12-28 2020-07-02 Transgene Sa Immunosuppressive m2 protein
CA3124773A1 (en) 2018-12-28 2020-07-02 Transgene M2-defective poxvirus
JP2023516201A (ja) 2020-03-12 2023-04-18 バヴァリアン・ノルディック・アクティーゼルスカブ ポックスウイルスの安定性を改善する組成物
KR20230038496A (ko) 2020-07-13 2023-03-20 트랜스진 면역 억제의 치료
WO2023025899A2 (en) 2021-08-26 2023-03-02 Transgene Delivery system for targeting genes of the interferon pathway
WO2023213764A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Transgene Fusion polypeptide comprising an anti-pd-l1 sdab and a member of the tnfsf
WO2023213763A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Transgene Poxvirus encoding a binding agent comprising an anti- pd-l1 sdab
WO2024003239A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Bavarian Nordic A/S RECOMBINANT MODIFIED saRNA (VRP) AND VACCINIA VIRUS ANKARA (MVA) PRIME-BOOST REGIMEN
WO2024003238A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Bavarian Nordic A/S Epstein-barr-virus vaccine
WO2024003353A1 (en) 2022-07-01 2024-01-04 Transgene Fusion protein comprising a surfactant-protein-d and a member of the tnfsf
WO2024038175A1 (en) 2022-08-18 2024-02-22 Transgene Chimeric poxviruses

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE299213C (pl)
US4380582A (en) * 1965-07-09 1983-04-19 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Preparation of dry variola virus
FR7773M (pl) * 1968-06-14 1970-03-23
US3577526A (en) * 1969-06-13 1971-05-04 Merieux Inst Stabilized smallpox vaccine
US3915794A (en) * 1973-02-09 1975-10-28 Rit Rech Ind Therapeut Stabilizing compositions for cell-free viruses and cell-free virus preparations containing them
CA1341245C (en) * 1988-01-12 2001-06-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Recombinant vaccinia virus mva
DD299213A7 (de) * 1988-05-04 1992-04-09 Saechsische Landesgewerbefoerderungsgesellschaft M.B.H.,De Verfahren zur stabilisierung eines lebendvirusimpfstoffes gegen temperatureinwirkung
CA2158935A1 (en) * 1993-10-12 1995-04-20 Chiron Viagene, Inc. Methods for preserving recombinant viruses
AU4556597A (en) * 1996-09-24 1998-04-17 Bavarian Nordic Research Institute A/S Recombinant mva virus expressing dengue virus antigens, and the use thereof in vaccines
GB9808922D0 (en) * 1998-04-24 1998-06-24 Cantab Pharmaceuticals Res Ltd Virus preparations
US6225289B1 (en) 1998-12-10 2001-05-01 Genvec, Inc. Methods and compositions for preserving adenoviral vectors

Also Published As

Publication number Publication date
DK1418942T3 (da) 2005-11-28
PL369954A1 (pl) 2005-05-02
MXPA04005577A (es) 2005-04-19
IL161590A (en) 2009-06-15
WO2003053463A2 (en) 2003-07-03
IL161590A0 (en) 2004-09-27
AU2002361962A1 (en) 2003-07-09
BR0214822A (pt) 2004-12-14
US7094412B2 (en) 2006-08-22
EP1418942B1 (en) 2005-08-03
DE60205388D1 (de) 2005-09-08
WO2003053463A3 (en) 2004-03-04
CN1602205A (zh) 2005-03-30
ES2247414T3 (es) 2006-03-01
HK1071295A1 (en) 2005-07-15
JP2005513109A (ja) 2005-05-12
EA200400796A1 (ru) 2004-12-30
DE60205388T2 (de) 2006-03-30
ATE300954T1 (de) 2005-08-15
HUP0402179A3 (en) 2012-09-28
UA78738C2 (en) 2007-04-25
CA2467365C (en) 2012-11-20
NO20042958L (no) 2004-07-09
KR20040074067A (ko) 2004-08-21
EP1418942A2 (en) 2004-05-19
CA2467365A1 (en) 2003-07-03
CN1296096C (zh) 2007-01-24
HUP0402179A2 (hu) 2005-01-28
US20050019349A1 (en) 2005-01-27
EA006880B1 (ru) 2006-04-28
NZ533302A (en) 2005-11-25
JP4439263B2 (ja) 2010-03-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL213326B1 (pl) Formulacja zawierajaca wirus ospy, sposób jej otrzymywania i zastosowanie
JP2005513109A6 (ja) ポックスウイルス含有調合物およびその調製方法
EP3226894B1 (en) Stable liquid vaccinia virus formulations
EP1407006B1 (en) Method for the recovery and purification of poxviruses from infected cells
KR20110129954A (ko) 반복된 백신접종과 조합한 최적화된 초기-후기 프로모터에 의한 복제 결함 재조합 바이러스 백신에서의 항원에 대한 세포독성 ｔ 세포 반응의 촉진
JP2015531387A (ja) ウイルス含有製剤およびその使用
JP7406377B2 (ja) 安定なウイルス含有組成物
AU2008201215B2 (en) Poxvirus containing formulations and process for preparing stable, poxvirus containing compositions