MXPA04005577A - Formulaciones que contienen poxvirus y proceso para la preparacion de composiciones estables que contienen poxvirus. - Google Patents
Formulaciones que contienen poxvirus y proceso para la preparacion de composiciones estables que contienen poxvirus.Info
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Abstract
La presente invencion se refiere a una formulacion, en particular una formulacion acuosa que comprende (i) un poxvirus de uno de los generos ortopoxvirus, avipoxvirus, parapoxvirus, capripoxvirus y suipoxvirus, (ii) un disacarido, (iii) un polimero farmaceuticamente y opcionalmente (iv) un amortiguador. La formulacion acuosa es particularmente adecuada para los procesos de liofilizacion que dan como resultado una composicion estable, que contiene poxvirus, liofilizada. La invencion se refiere ademas a un metodo para preparar una composicion liofilizada que contiene poxvirus y al producto obtenido de este modo.
Description
FORMULACIONES QUE CONTIENEN POXVIRUS Y PROCESO PARA LA PREPARACIÓN DE COMPOSICIONES ESTABLES QUE CONTIENEN
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a una i formulación, en particular a una formulación acuosa que comprende (i) uii poxvirus de uno de los géneros I orthopoxvirus , avipoxvirus, parapoxvirus , capr ipoxvi rus í y suipoxvirus, (ü) un disacérido, (iii) un polímero i farmacéuticamente aceptable y opcionalmente (iv) un amortiguador. La formulación acuosa es particularmente adecuada para los procesos de liofilización que dan como resultado una composición liofilizada estable que contiene poxvirus. La invención se refiere además a un método para preparar una composición liofilizada que contiene poxvirus,' y al producto obtenido de este modo.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Los poxviridae comprenden una gran familia de virus de ADN compiejo que se replican en el citoplasma de la célula de vertebrados e invertebrados. En los humanos la viruela fue por mucho tiempo la infección i por poxvirus más importante. El agente causante de la i viruela es el virus varióla, un miembro del género Orthopoxvirus. El virus de la Vaccinia también un miembro del género Orthopoxvirus en la familia de Poxviridae, se utilizó como vacuna viva para inmunizar contra la viruela1. La vacunación mundial exitosa con el virus de la Vaccinia culminó en la erradicación del virus varióla (La i radicación global de la viruela. El i reporte final de la comisión global para la certificación de lia erradicación de viruela; History of
Public Health, ! No. 4, Geneva; World Health
Organization, 1980) . En tiempos recientes, la mayoría de las reservas de virus infecciosas de la varióla han I sido destruidos. j o obstante, no se puede excluir que los poxvirus que ! inducen la viruela o enfermedades similares a la viruela puedan nuevamente volverse un problema de salud l mayor. De este modo, es necesario i estar en una posición para producir vacunas estables i contra las infecciones por poxvirus en particular infecciones por varióla, tales como las vacunas basadas I en el virus de la vaccinia. En el pasado, los virus de la vaccinia han sido utilizados para manipular por ingeniería genética vectores virales| para la expresión de genes recombinantes y para el uso potencial como vacunas vivas recombinantes (Mackett, M., Smit , G.L. y Moss, B.
[1982] P.N.A.S. EUA 79, 7415-7419; Smith, G.L.,
Mackett, M. y Moss, B.
[1984] Biotechnology and Genetic
Engineering Reviews 2, 383-407) . Esto involucra entre otras las secuencias de AND (genes) que codifican para i los antigenos ex¡traños que son introducidos en el i genoma de los virus de la vaccinia, con la ayuda de las técnicas de recombinación de ADN. Si el gen es integrado en un sitio en el ADN viral que es no esencial para el ¡ciclo de vida del virus, es posible que el virus d¿ la vaccinia recombinante recién producido sea infeccioso, por ejemplo, el virus sea capaz de infectar 'a células extrañas y de este modo de expresar la secuencia de ADN integrada (Patentes Europeas EP 8328é y EP 110385) . Los virus de la vaccinia recombinantes preparados de esta manera pueden ser utilizados, pór una parte, con vacunas vivas para ¡ la profilaxis de Enfermedades infecciosas y por otra parte, para la préparación de proteínas heterólogas en células eucar ióticás . Otros ejemplos para los virus de la vaccinia recombinantes son los virus que albergan genes terapéuticos tales como genes suicidas, genes de ribozima o genes antisentido. Es conocido el virus de la Vaccinia Modificado Ankara (MVA) el cual es excepcionalmente seguro. MVA I I ¦ 4 i i I
ha sido generado por pases en serie a largo plazo de la cepa Ankara del , virus de la Vaccinia (CVA) sobre fibroblastos de embriones de pollo (para una revisión ver Mayr, A., Hochstein-Mintzel , V. Y Stickl, H.
[1975] i Infection 3, 6-14; Patente Suiza No. 568,392) . Los ejemplos de cepes del virus MVA depositadas en I cumplimiento con i los requerimientos del Tratado de Budapest son las1 cepas MVA 572 depositada en la Colección Europea1 de Cultivos de Células Animales (ECACC) , Salisbury (Reino Unido) con el número de depósito ECACC V94012707, MVA 575 depositada bajo ECACC V00120707 y MVA-ÓN con el número de depósito ECACC V00083008. ¡ MVA es distinguido por su gran atenuación, es I decir por la virulencia disminuida o la infecciosidad i disminuida, al i tiempo que mantiene buena inmunogenicidad . ¡El virus MVA ha sido analizado para .1 determinar las alteraciones en el genoma con relación a I la cepa CVA de tipo silvestre. Seis supresiones i mayores del ADN geriómico (supresión I, II, III, IV, V y i VI) totalizando 31,000 pares de bases, han sido i identificadas (Meyér, H . , Sutter, G y Mayr A.
[1991] J. Gen. Virol. 72, 1031-1038) . El virus MVA resultante se volvió individualmente la célula hospedera restringida a las células de ¿ve. Además, MVA está caracterizado
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i i por su atenuación extrema. Cuando se prueban una variedad de modelos animales, se provoca MVA es avirulento, e incluso en animales inmunosuprimidos . De manera más importante, las excelentes propiedades de la cepa MVA han sido demostradas en pruebas clínicas extensas (Mayr et| al., Zbl . Bakt. Hyg . I, Abt . Org. B 167, 375-390
[1987], Stickl et al., Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392 [197^]) . Durante estos estudios en más de 120, 000 humanos incluyendo pacientes de alto riesgo, no estuvieron asociados efectos colaterales con el uso de la vacuna MVA. MVA recombinante , útil como vacunas, han sido ya construidos (ver por ejemplo WO 97/02355) y se utilizan en pruebas clínicas. El documento WO 98/13500 describe ¡ un MVA recombinante que contiene y que es capaz de expresar secuencias de ADN que i codifican para antígenos del virus del dengue. Las 1 secuencias extrañas de ADN fueron recombinadas en el i ADN viral en el ¦ sitio de una supresión de origen natural en el genoma del MVA. i Una cepa de MVA que muestra una atenuación aún I más fuerte y características de seguridad mejoradas en la cepa MVA-BN, depositada en la Colección Europea de Cultivos de Células Animales (ECACC) , Salisbury, Reino Unido, con el número de depósito V00083008.
Además del virus de la vaccinia han sido utilizados otros poxvirus como vectores para distribuir la información genética a las células de mamífero. En este contexto, se, hace referencia a los virus avipox tales como el poxvirus de aves de corral. Los poxvirus de aves de corral 'que contienen los genes del VIH en el genoma son descritos en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,736/368 y 6,051,410. Los procesos para la preparación de composiciones que contienen poxvirus, adecuadas como vacunas, son conocidos para las personas de experiencia en la técnica (ve'r por ejemplo Joklik W.K., Virology (1962), 18, 9 : 18; Richter, K.H., Abhandlungen aus dem Bundesgesundheltsamt (1970), 9, 53-57). La purificación conocida da como resultado soluciones acuosas que contienen poxvirus o sedimentos que contienen poxvirusí Los poxvirus en estas soluciones y los sedimentos no son estables, por ejemplo la infectividad de los virus disminuye rápidamente. No obstante, es necesario que una vacuna pueda ser almacenada y distribuida en una forma estabilizada, especialmente cua'ndo las vacunas necesitan ser transportadas én regiones tropicales con infraestructura de 1 distribución limitada. Un producto liofilizado puede ser almacenado a temperaturas en el intervalo de 4°C ,a 25°C. Esta es una clara ventaja comparada a las condiciones de almacenamiento estándares para formulaciones liquidas, las cuales tienen que ser almacenadas por debajo de -20°C (Protocolos de criopreservación y de liof ilización Day J. McLellan M; Methods in Molecular Biology, 38, 1995, Humana Press) . 1 Los pro sos para la liofilización de poxvirus, en particular el virus de la vaccinia, y composiciones y soluciones que contienen el virus, adecuadas para este propósito son conocidas (Burke et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems (1999), 16, 1-83) . En términos generales la liofilización de una vacuna involucra el congelamiento de la formulación acuosa que contiene la vacuna, adecuada para la liofilización, seguida por la eliminación del agua mediante sublimación mediante condiciones de pre!sion reducida y bajas temperaturas y seguido adicionalmente por la eliminación del agua mediante desorción ¡ baj o condiciones de presión reducida y temperaturas más ialtas. Las formulaciones conocidas que contienen el poxvirus para la | liofilización, tienen desventajas importantes. Muchos de los virus de la vaccinia conocidos que contienen composiciones para la
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liofilización contienen peptona o hemacel, que son frecuentemente de origen natural. No obstante, existen preocupaciones de1 que las enfermedades animales tales como BSE pudiera ser transmitidas de los animales a los humanos por medio de productos animales tales como peptona, gelatina ¡ o hemacel. Además, los poxvirus en las formulaciones iconocidas que contienen virus para la liofilización, no ihan sido purificados. De este modo, las composiciones! que contienen poxvirus para la 1 iofilización, cónocidas en la técnica anterior contiene entre otras grandes cantidades de proteínas derivadas de las ( células del sistema de cultivo de células o de tejidos y del suero bovino utilizado I durante el cultivoide células, respectivamente. La persona experta en la técnica también conoce las composiciones de liofilización que no contienen compuestas adicionales de origen animal (que son por ejemplo peptona o hemacel) . En este caso, las composiciones que contienen los siguientes compuestos solos o en ciertas combinaciones: glutamato de sodio, sorbitol, lactosa, , sales, aminoácidos y glicerina. No obstante, el producto obtenido después del proceso de ¦i liofilización es frecuentemente más bien inestable, por ejemplo la pérdida total en el título del virus es inaceptablemente alta durante el almacenamiento. i
Í I Además, se ha mostrado que el poxvirus tiende a formar agregados en algunas de estas formulaciones y que otros compuestos precipitan antes o durante el congelamiento. La Patente de los Estados Unidos No. 3,577,526 describe una vacuna de la viruela caracterizada por el hecho de que ésta ¡está constituida de un material viral triturado de la vacuna, disperso en sucrosa. La cantidad de sucrosa está en el intervalo de 20 a 40%. La formulación puede comprender además 5% de dextrano. El término virus triturado se refiere al virus derivado de pulpas y póstulas. Básicamente, la linfa es triturada para desintegrar los grumos y separar el liquido del pelo y la piel muerta. De este modo, la carga de la proteina de la preparación de vacuna es muy alta y contribuye á la estabilización el virus.
OBJETIVO DE LA INVENCIÓN
Un objetivo de la presente invención es proporcionar una fórmulación que contiene poxvirus, en particular una ¡formulación acuosa que contiene poxvirus, para la. liofilización, que conduce a un producto liofilizado estable, en donde el poxvirus es preferentemente un virus purificado o al menos parcialmente purificado. Un objetivo adicional de la I presente invención es proporcionar una formulación acuosa que contiene poxvirus en la cual los poxvírus no tienden a agregarse y en la cual los componentes no se precipitan antes o durante el congelamiento. Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar la formulación que contiene poxvirus, en particular una ' formulación acuosa que contiene poxvirus, que comprende bajas cantidades de proteínas no asociadas al poxvirus. Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar una composición estable que contiene poxvirus, liofilizada, y un método para obtener dicha ¡ composición .
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona la formulación que contiene poxvirus, en particular una formulación acuos'a que contiene poxvirus. La formulación, en particular la formulación acuosa puede ser adecuada para la liofilización del poxvirus. Además, la invención proporciona el producto liofilizado que contiene el poxvirus. La formulación de acuerdo a la presente invención, en particular, la formulación acuos,a, comprende el poxvirus, un disacárido, un polímero farmacéuticamente aceptable y opcionalmente además un amortiguador. Aunque la formulación liofílizada de acuerdo a la presente invención no contiene aditivos de estabilización de origen natural tales como peptona, gelatina, hemacel ni tampoco altas cantidades de proteina derivada del sistema utilizado para amplificar el virus (tales como sistemas de cultivo celular) , el virus en la formulación es sorprendentemente estable, por ejemplo el poxvirus en la composición liofílizada permanece infeccioso por largos periodos de tiempo, incluso a altas temperaturas ' de almacenamiento tales como la temperatura ambiente o 37°C. Si no se ^especifica de otro modo, el término "temperatura ambieíite" como se utiliza en la presente especificación, ésta corresponde a una temperatura de
20 a 25°C. Los poxvirus que van a ser liofilizados son cualesquiera poxvirus seleccionados del grupo que consiste de Orthopoxvirus, Parapoxvirus , Avioxivirus, Capripoxvirus y Suiproxvirus . Estos virus pueden ser útiles como una va|cuna para seres humanos o animales (Virology, 3a. Edición, 1995, ed. -in chief: Fields,
B.N.) . Los poxvirus particularmente preferidos son virus de los génerós Orthopoxvirus o Avipoxvirus. Los ejemplos preferidos de poxvirus que pertenecen al género avipoxvirus son el poxvirus de canario y el poxvirus de aves de corral. Los ejemplos preferidos que pertenecen a la familia Orthopoxvirus son el poxvirus de las vacas y el virus de la vaccinia. El poxvirus contenido en la formulación de acuerdo a la presente invención puede ser un poxvirus de origen natural,', un poxvirus atenuado o un poxvirus recombinante . Para la vacunación de seres humanos contra la viruela el po irus en la formulación es preferentemente una. cepa del virus de la vaccinia. Los ejemplos para cepas del virus de la vaccinia, adecuados para este propósito, son las cepas Temple o Heaven, Copenhagen, Paris,. Budapest, Dairen, Gam, MRIVP, Per, Tashkent, TBK, To,m, Bern, Patwadangar, BIEM, B-15, Lister, EM-63, New1, York City Board of Health, Elstree, Ikeda y WR . Las ! cepas de virus de la vaccinia más preferidas son el Virus de la vaccinia modificado cepa Ankara (MVA) y sus derivados, en particular la cepa que ha sido depositada en la ECACC con el número de depósito V00083008 y la cepa Elstree. El poxvirus en la formulación de acuerdo a la presente invención ' es preferentemente un poxvirus que es esencialmente apatógeno en el animal o en el sujeto que va a ser vacunado. Para este propósito, se prefiere ya sea utilizar cepas de virus atenuado o utilizar un poxvirus que se replica de manera natural en una especie hospedera diferente de las especies que van a ser vacunadas, y que no es patógeno en el hospedero heterologo. Un "virus- atenuado" es un virus que se origina de un virus patógeno pero que después de la infección del organismo hospedero conduce a una menor mortalidad y/o morbididad en comparación al virus progenitor no atenuado. Los ejemplos de poxvirus atenuados son conocidos para la persona de experiencia en la técnica. Más preferido es .el virus de la vaccinia modificado Ankara (MVA) . Las' cepas típicas de MVA son MVA 575 y MVA 572 que han | sido depositadas en la Colección Europea de Cultivos de Células Animales bajos los números de depósito ECACC V00120707 Y ECACC V 94012707, respectivamente. Más preferidos es el MVA-BN o un derivado del mismo,; que ha sido descrito en WO 02/42480 (PCT/EPOl/13628) . ?1 contenido de estas solicitudes es incluido en la presente solicitud por referencia. MVA-BN ha sido depositado en la Colección Europea de Cultivos de Células Animales con el número de depósito ECACC V00083008. Los ejemplos de poxvirus para los cuales los seres humanos son hospederos heterólogos, y los cuales no son patógenos jen seres humanos, son el poxvirus de aves de corral o e|l poxvirus de canario. El término "virus recombinante" se refiere a cualquier virus que tenga insertado dentro del genoma viral un gen heterólogo que no sea naturalmente parte del genoma viral. 1 Un gen heterólogo puede ser un gen terapéutico, un gen que codifica para un péptido que comprende al menos un hepitopo para inducir una respuesta inmune, un cásete de expresión antisentido o un gen de ribozima. Los métodos para construir los virus recombinantes son conocidos para una persona de experiencia en la técnica. El vector poxvirus más preferido es MVA, en particular MVA 575 y VA-BN (ver arriba) . Es conocido para la persona experta en la técnica cómo pueden ser amplificados los poxvirus y recuperados de los , cultivos de células infectadas. En general, en un primer paso, las células eucarióticas son infectadas con el poxvirus que se pretende sea parte de la formulación de acuerdo a la presente invención. Las células eucarióticas son células que son susceptibles a la infección con el poxvirus respectivo, y permiten la replicación y la producción de virus infecciosos. Tales células son conocidas para las personas de experiencia en la técnica para todos los poxvirus. Para MVA un ejemplo de este tipo de células son los fibroblastos de embrión de pollo (CEF) Drexler I, et al. J. Gen. Virol. (1998), 79, 347-352) . Las células CEF pueden ser cultivadas bajo condiciones conocidas para la persona de experiencia en la técnica. Preferentemente, las células CEF son cultivadas en medio libre de suero. El tiempo de incubación es preferentemente dei 8 a 96 horas a 37°C + 2°C. Para la infección los poxvirus son utilizados a una multiplicidad de infección (MOI) de 0.05 a 1 TCID50 (TCID = dosis infecciosa del cultivo tisular) y la incubación tiene lugar 48 a 72 horas a la misma temperatura. El progr'eso de la infección puede ser observado al observar los efectos citopáticos (CPE) , típicamente una ronda significativa de las células infectadas. Se sabe que los poxvirus existen en dos diferentes formas: , poxvirus adheridos a las membranas celulares en el citoplasma de las células infectadas (viriones maduros intracelulares (IMV) y virus que han sido externalizadoS (viriones envueltos extracelulares (EEV) Vanderplasschen A. et al., J. Gen. Virol. (1998), 79, 877-887) . Ambas formas virales pueden ser utilizadas en las formulaciones de acuerdo a la presente invención. Los EEVs pueden ser simplemente obtenidos a partir del sobrenadante mediante centrifugación y p'ueden ser directamente suspendidos en una formulación acuosa que incluye un disacárido y un polímero farmacéuticamente aceptable. No obstante, las fracciones que contienen el virus pueden comprender desechos celulares y otros contaminantes.
Especialmente paral la vacunación en seres humanos, se prefiere de este modo que el virus sea además purificado antes dé que éste sea incluido en una formulación de acuerdo a la presente invención. Los métodos para la purificación de poxvirus son conocidos para la persona de1 experiencia en la técnica. El paso de purificación puéde ser por ejemplo la centrifugación por lotes (por ejemplo utilizando cojines de sucrosa), o la ultracentrifugación de flujo continuo (gradientes de sucrosa), uítrafiltración (por ejemplo, la filtración de flujq transversal utilizando una membrana con un tamaño de poro mayor de 500 kDa, pero igual o menor de 0.1 µp?) , cromatografía en columna (por ejemplo de intercambio iónico, de interacción hidrofóbica, de exclusión de tamaño o una combinación) o una combinación de al'gunos o todos de los anteriores (Masuda N. et al., J Bacteriol (1981) 147, 1095-1104).
Con el fin de obtener IMVs las células tienen que ser cosechadas; en un primer paso y desintegradas en un segundo paso. Si las células infectadas son células que pueden ser cultivadas en cultivo en suspensión, las células infectadas pueden ser fácilmente cosechadas mediante centrifugación. Si las células infectadas son células adherentes más o menos intactas, es posible cosechar las células, por ejemplo, remover las células del frasco de cultivo, antes de someterlas al paso de desintegración. Los métodos de cosecha son conocidos para la persona de experiencia en la técnica. Las técnicas útiles son los métodos mecánicos (por ejemplo, mediante el uso de un raspador celular de caucho), métodos físicos (pbr ejemplo, congelamiento por debajo de -15°C y descongelamiento de los recipientes de cultivo por arriba de +15°C) o métodos bioquímicos (tratamiento con enzimas, por ejemplo, Tripsina, con el fin de desprender las células del recipiente de cultivo) . Si las1 enzimas son utilizadas para este propósito, el tiempo de incubación debe ser controlado, ya que las enzimás pueden también dañar al virus después de tiempos tie incubación prolongados. Los métodos para la desintegración de las células son también conocidos para la persona de experiencia en la técnica. El método de congelamiento-descongelamiento , descrito anteriormente da como resultado ya una desintegración parcial de las células. Otras técnicas conocidas a la desintegración de las células incluyen el uso de ultrasonido. El tratamiento de las células cón ultrasonido da como resultado un homogenei zado que contiene virus. Para la vacunación de animales el homogenei zado qué contiene poxvirus podría ser utilizado en las formulaciones de acuerdo a la presente invención. No obstante, se prefiere nuevamente utilizar poxvirus ,qüe hayan sido purificados al menos parcialmente. Como se describió anteriormente, tales métodos de purificación son conocidos por la persona de experiencia en la técnica. Los poxvirus están contenidos en la formulación, en particular en la formulación acuosa en un intervalo de concentración de 104 a 109 TCIDso/ml, preferentemente, en un intervalo de concentración por ejemplo de 105 a 5 x 10B TCID50/ml, más preferentemente en un intervalo de concentración por ejemplo de 10° a 108 TCID50/ml. La concentración efectiva depende de la cantidad del virus que va a ser administrado al ser humano o al animal, que a su vez depende del tipo de virus que va a ser administrado. Para la cepa del virus de la vaccinia Elstree, una dosis de vacunación típica para humanos comprende 2.5 x 10s TCID50- Para el virus de la vaccinia la cepa MVA-BN, una dosis de vacunación típica comprende 1 x 108 TCID50. Como se señaló anteriormente, el poxvirus en la formulación de acuerdo a la presente invención es preferentemente un virus purificado o al menos parcialmente purificado. El término "virus purificado o al menos parcialmente purificado" se refiere al hecho de que el virus utilizado en la formulación de acuerdo a la presente invención tiene una pureza que es mayor que aquella del virus no purificado ("virus triturado") como se utiliza en las vacunas como se utilizó en las vacunas usadas hasta la erradicación de la viruela (tal como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 3,577,526) . Tal pureza más alta puede ser obtenida por ejemplo uno ó más de los siguientes métodos: centrifugación por lotes (por ejemplo utilizando cojines de sucrosa), o ultracentifugación de flujo continuo (gradientes de sucrosa), ultrafiltración (por ejemplo, filtración de flujo cruzado utilizando una membrana con un tamaño de poro mayor de 500 kDa, pero igual o menor de 0.1 µp?) , cromatografía en columna (por ejemplo intercambio iónico, interacción hidrofóbica, exclusión de tamaño o una combinación) . Particularmente preferida es la ultrafiltración y/o la centrifugación por lotes mediante el uso de cojines de sucrosa. En términos más generales, el término "virus purificado o al menos parcialmente purificado" se refiere a las preparaciones de virus (tales como las preparaciones que ^comprenden MVA o Elstree) que tienen un titulo de al menos 10°, preferentemente de al menos 10', más preferentemente de al menos 108, aún más preferentemente de, al menos 5 x 10B TCID50 por mg de proteina total. Para la cepa Elstree las preparaciones típicas tienen un ' título de 8 x 10B TCID50 por mg de proteína total. Los métodos de cómo determinar el título de una preparación que contiene poxvirus, son conocidos para la persona de experiencia en la técnica; uno de estos métodos es descrito en la sección de ejemplos. El contenido de proteína total es preferentemente determinado de acuerdo al método de Kyeldahl (Lynch, J.M. y Barbano, D.M., Kjeldahl nitrogen análisis 'as a reference method for protein determination in d^iry productos, J AOAC Int. 1999 Nov-Dic; 82(6): 1389-98,, Review) . Se nota que el contenido de proteína es la suma de las proteínas virales y de las proteínas celulares. Fue inesperado que una formulación que comprende un virus purificado o parcialmente purificado, un disacárido y un polímero farmacéuticamente activo, sea estable, ya que se creía que las grandes cantidades de proteínas no virales en las preparaciones virales no purificadas, contribuía a la estabilidad de las formulaciones de la técnica anterior. La formulación de acuerdo a la presente invención, en particular la formulación acuosa, comprende un disacárido. En contraste a los monosacéridos tales como la glucosa que dan una buena bioprotección durante la liofilización pero que tienen una baja temperatura de colapso y frecuentemente liofilizan con colapso, se ha mostrado que los disacáridos son protectores de liofilización efectivos que muestran más altas temperaturas de colapso que los monosacáridos . Los disacéridos comprendidos en las formulaciones de acuerdo a la presente invención son disacáridos farmacéuticamente aceptables que tienen una temperatura de colapso (Te) en un intervalo de aproximadamente -25°C a -35°C. Las temperaturas de colapso típicas son de -30.5°C para la sucrosa, -28.5°C para la trehalosa y -30.5°C para la lactosa. Las temperaturas de colapso típicas para la formulación completa de acuerdo a la presente invención están preferentemente en el intervalo de -50°C a -20°C. Los subintervalos preferidos son, por ejemplo, -37°C a -30°C, -36°C a -31°C ó -35.7 a -31.2°C. Preferentemente, el disacárido se selecciona del grupo que consiste de trehalosa, lactosa y sucrosa. Más preferida es la sucrosa. El disacárido, preferentemente la sucrosa, está contenida en la formulación de acuerdo a la presente invención, en particular la formulación acuosa, preferentemente en un intervalo de concentración de 10-100 g/1, más preferentemente en', un intervalo de 20 - 80 g/1, lo más preferentemente en el intervalo de 25 - 60 g/1. Para la sucrosa, una concentración típica es de 45 g/1. La formulación de acuerdo a la invención, en particular la formulación acuosa, comprende además un polímero farmacéuticamente aceptable. El polímero es preferentemente seleccionado de un grupo que consiste de dextrano y poliyinilpirrolidona (PVP) . El polímero utilizado tiene que ser soluble en la formulación de acuerdo a la presente invención. Si se utiliza el dextrano, su peso molecular está preferentemente en el intervalo de 20,000 a 100,00, más preferentemente en el intervalo de 30, 000' a 70, 000, lo más preferentemente en el intervalo de 36,000 a 44,000. El dextrano más preferido tiene un peso molecular promedio de 40,000. La concentración del dextrano está en el intervalo de 1 a 50 g/1, preferentemente en un intervalo de 2 hasta 40 g/1 ó 3 hasta 30 g/1. Han sido observados resultados particularmente buénos en los intervalos de 5 a 50 g/1, 5 a 40 g/1 ó 0 a 30 g/1. Aún más preferido es el intervalo de 8 a 30 g/1. El intervalo más preferido es
10 a 27 g/1. Un ejemplo para una concentración preferida es 18.9 g/1. Las concentraciones preferidas y los intervalos de concentración del dextrano como se muestran anteriormente, en particular el intervalo de 5 a 50 g/1 y los subintervalos correspondientes, tienen la ventaja particular de que la temperatura de colapso de la formulación es relativamente alta, lo cual hace posible llevar a cabo el proceso a una escala industrial. Si se utiliza PVP su peso molecular está preferentemente en el intervalo de 50,000 a 400,00, más preferentemente en un intervalo de 70,000 a 360,000. La concentración de PVP está en el intervalo de 5 a 200 g/1, más preferentemente en un intervalo de 5 a 100 g/1, lo más preferentemente en un intervalo de 10 a 40 g/1. La formulación de acuerdo a la presente invención, en particular la formulación acuosa, puede comprender además un amortiguador. Como se señaló anteriormente, fue uno de los objetivos de la presente invención proporci onar una formulación acuosa que contiene poxvirus, en la cual los poxvirus no se agregan y en la cual no cubren la precipitación después del secado. Se ha mostrado inesperadamente que tales efectos no deseados están correlacionados con la presencia de un amortiguador que contiene fosfato en la formulación acuosa. Los ejemplos para el amortiguador que contiene fosfato son PBS (solución salina amortiguada con fpsfato) y amortiguador de fosfato. Consecuentemente, · este objetivo particular de la invención es resuelto por una formulación acuosa para la liofili zación, que no contiene un amortiguador de fosfato. De este modo, el amortiguador contenido en la formulación de acuerdo a la presente invención se selecciona preferentemente del grupo que consiste de TRIS, TBS, MOPS,; HEPES y (bi- } carbonato . Los amortiguadores más preferidos son TRIS y TBS. El amortiguador se utiliza en una concentración que ' es suficiente para ejercer la capacidad amortiguadora requerida. Para los amortiguadores de TRIS el intervalo de concentración preferido es de 1 - 50 mM; la concentración más preferida es de 10 mM. El pH es preferentemente ajustado a un valor que por una parte es farmacéuticamente aceptable para la administración en seres humanos o animales, y que por otra parte no es dañina para el virus. De este modo, el pH debe estar en el intervalo de 6.0 a 9.0, más preferentemente en el intervalo de 7.2 a 7.8. El pH más preferido es de 7.4. Los resultados inesperadamente buenos por el uso de un amortiguador libre de fosfato, son obtenidos independientemente de si el virus en la formulación es un virus no purificado, purificado o parcialmente purificado. Los virus purificados o parcialmente purificados son los preferidos. La formulación de acuerdo a la presente invención, en particular la formulación acuosa puede contener sales tales como cloruro de sodio. Las concentraciones típicas del cloruro de sodio están en el intervalo de 10 a 200 mM. Un ejemplo para una concentración preferida de cloruro de sodio es de 140 mM . La formulación de acuerdo a la presente invención, en particular la formulación acuosa puede comprender además sales de ácido L-glutámico. La sal es preferentemente! una sal monopotésica o una sal monosódica. La concentración de la sal del ácido glutámico está preferentemente en un intervalo de 0.05 0.5 g/1, más preferentemente en un intervalo de 0.1 -0.15 g (1.
Algunas formulaciones acuosas particularmente preferidas de acuerdo a la presente invención, se listan en la siguiente tabla. En todas las formulaciones listádas en la tabla 1 el amortiguador es TRIS 10 mM, pH 7.4, cloruro de sodio 140 mM .
Tabla 1:
Virus de Primer Segundo Tercer Corrida en la aditivo aditivo aditivo la tabla 6
Vaccinia [g/i] [g/i] [g/i] Modi ficado Ankara (MVA) [TCIDso/ml] 5xl0B 25 10.5 0.06 GT 8 ( sucrosa ) (dextrano) (ácido L- glutámico) 5xlOe 34.5 14.5 0.083 GT 8 (sucrosa1) (dextrano) (ácido L- glutámico ) 5x10a 45 18.9 0.108 GT 9 ( sucrosa) (dextrano) (ácido L- glutámico ) 5xl0B 60 25.2 0.144 GT 9 ( sucrosa ), (dextrano) (ácido L- glutámico) 1?10? 45 18.9 0.108 ( sucrosa) (dextrano) (ácido L- glutámico ) 1?10? 45 3.78 0.108 • (sucrosa ) ( dextrano ) (ácido L- glutámico)
La formulación acuosa de acuerdo a la presente invención es adecuada para la liofilización. Para la administración, el producto liofilizado tiene que ser reconstituido con un solvente apropiado. De acuerdo a una modalidad es 'agregada agua estéril al producto liofilizado, con el fin de poner los compuestos en solución. Preferentemente, la cantidad de agua agregada corresponde más o menos a la cantidad de agua que ha sido eliminada durante la liofilización . De este modo, de acuerdo a esta modalidad, la composición del producto reconstituido es más o menos idéntica a la formulación acuosa inicial. Está por lo tanto dentro del alcance de la presente invención que la formulación acuosa de acuerdo a1 la presente invención sea utilizada como una vacuna. De acuerdo a una modalidad alternativa, el producto liofilizado puede también ser reconstituido én cualquier otro diluyente farmacéuticamente aceptable que pueda ser utilizado en cantidades apropiadas. A manera de ejemplo, el diluyente puede ser agua que comprende uno o más de los compuestos seleccionados de fenol, glicerol y amortiguador. La concentración del fenol en el producto reconstituido es por ejemplo de 0.5%. Como se señaló anteriormente, el amortiguador es preferentemente no 'un amortiguador de fosfato. En resumen, este aspecto de la invención se refiere entre otras cosas a las siguientes modalidades particularmente preferidas: (I) Una formulación, en particular una formulación acuosa, que comprende o que consiste incluso de un poxvirus purificado o parcialmente purificado seleccionado del grupo que consiste de Orthopoxvirus, Parapoxvirus , Avipoxvirus, Capripoxvirus y Suipoxvirus, un disacárido, un polimero farmacéuticamente aceptable y opcionalmente un amortiguador, en donde el amortiguador es preferentemente no un amortiguador de fosfato. Preferentemente, el polimero es dextrano, preferentemente, en las cantidades como se especificaron anteriormente. (II) Una formulación, en particular una formulación acuosa que comprende o incluso que consiste de un poxvirus seleccionado del grupo que consiste de Orthopoxvirus , Parapoxvirus, Avipoxvirus, Capripoxvirus y Suipoxvirus, un disacárido, un polímero farmacéuticamente aceptable y un amortiguador, en donde el amortiguador no es un amortiguador de fosfato y en donde el poxvirus es preferentemente un virus purificado o parcialmente purificado. Preferentemente, el polímero es dextrano, preferentemente en c í as cantidades como se especificaron anteriormente. (III) Una formulación, en particular una formulación acuosa, que comprende o incluso que consiste de un poxvirus seleccionado del grupo que consiste de Orthopoxvirus, Parapoxvirus, Avipoxvirus, Capripoxvirus y Suipoxvirus, un disacárido, un polímero farmacéuticamente aceptable y opcionalmente un amortiguador, en donde el polímero es dextrano en las cantidades como se especificaron anteriormente, a manera de ejemplo, preferentemente en el intervalo de 5 a 4 0 g/1. Preferentemente, el amortiguador no es un amortiguador de fosfato. Preferentemente, el poxvirus es un virus purificado o parcialmente purificado. El término "que consiste de" como se utiliza en el contexto de las opciones (I), (II) y (III) anteriores, se refiere a las formulaciones que consisten de los compuestos anteriormente mencionados únicamente, y a las formulaciones que contienen además una o más sales. Los ejemplos de las sales que pueden ser agregadas a las formulaciones (I), (II) y (III) que consisten de los ¦ compuestos anteriormente definidos, son cloruro de potasio, cloruro de sodio, glutamato de sodio. De este modo, el término "que consiste de" en la definición de las formulaciones (I), (II) y (III) anteriormente definidas, no excluye la posibilidad de agregar una o más sales . A manera de ejemplo, una modalidad especifica de la presente invención comprende una formulación acuosa que consiste de un poxvirus purificado o parcialmente purificado seleccionado del grupo que consiste de Orthopoxvirus, Parapoxvirus, Avipoxvirus, Capripoxvirus y Suipoxvirus, un disacárido, un polímero farmacéuticamente aceptable y un amortiguador, en donde el disacárido és sucrosa en las cantidades anteriormente especificadas, en donde el polímero es dextrano en la cantidad anteriormente especificada, y en donde el amortiguador no es un amortiguador de fosfato. A manera de ejemplo, otra modalidad específica de la presente invención comprende una formulación acuosa que consiste de un poxvirus seleccionado del grupo que consiste de Orthopoxvirus, Parapoxvirus, Avipoxvirus, Capripoxvirus y Suipoxvirus, un disacárido, un polímero farmacéuticamente aceptable y opcionalmente jun amortiguador. El poxvirus es preferentemente un poxvirus purificado o parcialmente purificado. Las cantidades preferidas y los ejemplos del disacárido, el polímero y el amortiguador son como se detallaron anteriormente. Están dentro de las habilidades del practicante cómo pueden ser administradas tales formulaciones, en particular una formulación acuosa que contiene poxvirus, y qué cantidades de los virus son utilizadas para la vacunación. Como se señaló anteriormente, las vacunas pueden ser utilizadas para inducir una respuesta inmune contra los poxvirus mismos, en particular si se utilizan poxvirus atenuados o no patógenos, no recombinantes . Si los poxvirus son poxvirus recombinantes, es adicional ente producida una respuesta inmune contra la proteína/pépt ido recombinante expresada por el vector poxvirus. El término "formulación" como se utiliza anteriormente, sé refiere usualmente a las formulaciones Líquidas, preferentemente las formulaciones acuosas, si no se establece de otro modo. Si las concentraciones o los intervalos de concentración son definidos en "mM", "g/l" y así sucesivamente, ésta es una indicación de que la formulación respectiva es una formulación líquida o incluso acuosa. El término "formulación acuosa" se refiere a aquellas formulaciones en las cuales el diluyente es agua,. No obstante, el alcance de la presente invención también cubre aquellas formulaciones anhidras que pueden ser obtenidas a partir de una formulación líquida o incluso acuosa de acuerdo a la presente invención,, por la eliminación del liquido, independientemente del método que se utilice para dicha eliminación. De este modo, la invención también cubre aquellas formulaciones anhidras que son obtenidas mediante métodos diferentes de la liofilización . En particular, la presente invención se refiere además a un método para preparar una composición estable que contiene poxvirus, caracterizada porque la formulación de acuerdo a la presente invención, en particular la formulación acuosa es liofilizada. En la presente solicitud los términos "composición estable que contiene poxvirus" y "composición liofilizada que contiene poxvirus" se utilizan intercambiablemente si no se indica de otro modo. El término "composición estable que contiene poxvirus" se utiliza en la presente solicitud para definir las composiciones que contienen poxvirus en las cuales la pérdida total en el título del virus a una temperatura de incubación de 37°C durante 28 días es menor de 0.5 logs; preferentemente menos de 0.4 logs. Un protocolo detallado para determinar el título del virus y de este modo la pérdida total en el título del virus se da en la, sección de ejemplos. No obstante, puede ser también utilizado cualquier otro protocolo para determinar el título viral. Los métodos de liofilización son en general conocidos para la persona experta en la técnica (Day, J. y McLellan, M . , Methods in Molecular Biology, Humana Press, (1995) , vol . 38) . Un proceso de liofilización consiste usualmente de los siguientes pasos, los cuales son explicados con más detalle más adelante: 1. Preparación de la vacuna; 2. Congelamiento de la muestra; 3. Deshidratación primaria (sublimación); 4. Deshidratación secundaria (desorción); 5. Taponamiento del producto y retiro; 6. Almacenamiento de la vacuna; 7. Reconstitución.
Preparación de la vacuna: La producción y amplificación de los poxvirus que van a ser utilizados como vacunas, ha sido explicada en detalle anteriormente en la presente. Los poxvirus son opcionalmente purificados . La formulación de acuerdo a la presente invención, es obtenida mediante la adición de los disacáridos anteriormente definidos, polímeros y opcionalmente amortiguador, ácido L-glutámico y opcionalmente aditivos adicionales a la preparación del poxvirus.
Congelamiento de la muestra: El congelamiento de la muestra no inmoviliza los componentes en la solución, con lo cual se previene que el producto forme espuma cuando la presión es reducida. El congelamiento es un proceso o dos pasos durante el cual el agua inicialmente nuclea, seguido por el desarrollo de cristales de hielo, dando como resultado una mezcla.de hielo y concentrado de soluto. La nucleación del hielo es enfatizada por la reducción de las temperaturas y la agitación de la suspensión enfriada. En contraste a la nucleación, el crecimiento del hielo es prómovido por el incremento de la temperatura, con lo cual se disminuye la viscosidad de la suspensión. No obstante del patrón de congelamiento preciso, la proliferación del hielo a todo lo largo del medio da como resultado un incremento de la concentración del soluto. Los biopolímeros en solución o en suspensión son dañados o inactivados por la exposición a estas concentraciones cada vez mayores de soluto. El enfriamiento rápido reduce al mínimo la exposición del bioproducto al concentrado. Por arriba de una temperatura crítica (la temperatura de transición vitrea) la viscosidad de la masa puede disminuir suficientemente de modo que el vidrio se ablanda y se distorsiona. Esta se seca para formar un residuo pegajoso sin estructura dentro del frasco. La temperatura de la distorsión es denominada la temperatura de colapso. Más específicamente, la temperatura de colapso es definida como la temperatura a la cual la movilidad del agua en la región intersticial de la matriz se vuelve insignificativa . Para evitar la distorsión, la temperatura de congelamiento tiene que estar por debajo de la temperatura de colapso de la formulación acuosa. La temperatura de colapso puede ser determinada de acuerdo a los métodos conocidos por la persona experta en la técnica, por ejemplo mediante análisis térmico diferencial (Jennings, T.A., "Lyophilization, introduction and Basic Principies", Interpharm Press, Denver, CO, US, 1999, ISBN 1-5 91-981-7, páginas 132-134) . Si la temperatura es demasiado baja, la difusión del agua a partir del virus puede ser inhibida, y puede ocurrir el daño por hielo intracelular . En consecuencia, la persona de experiencia ordinaria en la técnica probará empíricamente varias temperaturas de congelamiento que están todas por debajo de la temperatura de colapso de la formulación acuosa y probará cuál temperatura conduce a un producto liofilizado que tiene el más alto título de poxvirus infecciosos.
Deshidratación primaria (sublimación) : La deshidratación primaria es aquella parte del proceso de liofilización que promueve la sublimación del solvente (hielo) a partir de la matriz congelada. El proceso de deshidratación primaria comienza después de que el liofilizador alcanza la temperatura requerida del condensador y la presión de la cámara. La presión de la cámara es usualmente menor de 1 mbar, preferentemente menos de 0.2 mbar. Típicamente, la presión está en el intervalo de 0.04 a 0.12 mbar. A todo lo largo de esta especificación, estas condiciones son algunas veces denominadas como "baja presión". La temperatura de anaquel es incrementada tal que ocurre la sublimación del hielo en la matriz del producto, y la temperatura del producto es significativamente menor que la temperatura de colapso de la formulación, para asegurar una matriz completamente congelada a todo lo largo del proceso completo de deshidratación primaria, y para asegurar la liofilización sin colapso. La temperatura puede permanecer constante durante el proceso completo de deshidratación primaria. Alternativamente, la temperatura de anaquel puede ser incrementada continuamente durante la deshidratación primaria. No obstante, la temperatura de producto tiene que estar por debajo de la temperatura de colapso durante el proceso completo de deshidratación primaria. Al final de la deshidratación primaria el producto deshidratado puede contener todavía más de 5% de humedad (peso/peso) . Con el fin de obtener un producto con un contenido de humedad que ya no apoye más el desarrollo biológico o las reacciones químicas, es necesario llevar a cabo un paso de deshidratación secundaria.
Deshidratación secundaria (desorción) : Durante la deshidratación secundaria, el vapor de agua es desorbido de la superficie de la torta que se forma durante la deshidratación primaria. Esto es logrado mediante el incremento de la temperatura mientras que la cámara está todavía a bajas presiones, de modo que el agua es desorbida de la superficie de la torta. Las temperaturas de anaquel para la deshidratación primaria son determinadas por la estabilidad del producto y pueden estar en el intervalo de 0°C a +30°C. La temperatura del producto está usualmente en el intervalo de -5°C a 30°C. Más preferida es una temperatura en el intervalo de 5°C a 20°C. La deshidratación secundaria puede ser realizada en dos pasos. En un primer paso, la temperatura del producto puede estar en el intervalo de -5°C a + 15°C, preferentemente en el intervalo de 0°C a +10°C, más preferentemente en el intervalo de 2°C a +7°C. El segundo paso es realizado a una temperatura más alta que la deshidratación secundaria en el primer paso. La temperatura puede estar en el intervalo de 0°C a 30°C, preferentemente en, el intervalo de +5°C a +20°C. También, el contenido de humedad residual de la formulación depende de los requerimientos del producto. Algunos productos necesitan mayor contenido de humedad, algunos productos menor contenido de humedad para lograr la mejor estabilidad del producto. El contenido óptimo de unidad residual, asi como el tiempo para alcanzar éste tiene que ser determinado empíricamente.
El proceso de deshidratación secundaria es continuado hasta 'que es lograda la humedad deseada. Los métodos para determinar la humedad de un producto son conocidos para la persona de experiencia en la técnica. En particular, puede ser utilizada la titulación coulometrica de Karl-Fischer (Jennings, T.A., "Lyophilization, Introduction and Basic Principies", Interpharm Press, Denver, CO, US, 1999, ISBN 1-57491-081-7; páginas 415-418). El contenido de humedad residual es preferentemente menor de 5%, más preferentemente en un intervalo de 0.5 a 4%, aún más preferentemente en un intervalo de 1 a 3%.
Taponamiento del producto en retiro: Todos los frascos que contienen productos son sellados de acuerdo a los métodos conocidos para la persona de experiencia en la técnica. Los frascos pueden ser sellados bajo una presión muy baja (por ejemplo, 0.04 - 2.56 mbar) directamente en el liofilizador . Es también posible llevar los frascos bajo una presión más o menos normal mediante el uso de un gas químicamente inerte tal como nitrógeno o helio. Típicamente, los frascos pueden ser sellados en una atmósfera de nitrógeno a una presión de 900 mbar. Los frascos son cerrados, preferentemente mediante el uso de tapones de caucho de butilo. Una vez que el producto es taponado el sistema puede ser devuelto a la presión atmosférica y el anaquel puede ser descargado. Después de esto, los frascos pueden ser adicionalmente sellados con tapas de aluminio para el almacenamiento a largo plazo.
Almacenamiento de la vacuna: El producto liofilizado puede ser almacenado a temperatura ambiente (25°C) y permanece estable por al menos 18 semanas, preferentemente al menos 20 semanas, más preferentemente al menos 22 semanas a esa temperatura. "Estable a una cierta temperatura por un cierto periodo de tiempo" significa que la pérdida del titulo viral a esa temperatura es menor de 0.5 logs durante este periodo de tiempo. No obstante, si el enfriamiento es disponible se prefiere que el producto liofilizado sea almacenado a temperaturas más bajas tales como 4°C. Preferentemente, el producto es almacenado en la oscuridad. Si esto no es posible, se prefiere utilizat vidrio coloreado para el almacenamiento o cualesquiera otros frascos, los cuales evitan una exposición1 dañina a la luz.
Reconstitución . Para la reconstitución del producto liofilizado, se agrega una cantidad apropiada de un solvente al producto liofilizado, dando como resultado una formulación farmacéuticamente aceptable permitiendo la administración a seres humanos o animales. El solvente es pref rentemente agua. Usualmente, el solvente es agregado a la formulación una cantidad que corresponde sustancialmente a la cantidad de solvente perdido durante el proceso de lio ilización . La invención se refiere también al producto liofilizado obtenido mediante el proceso de acuerdo a la presente invención. De este modo, el producto liofilizado de acuerdo a la presente invención comprende: (i) un poxvirus, preferentemente de los géneros orthopoxvi rus o Avipoxvirus, (ii) un disacárido, (iii) un polímero farmacéuticamente aceptable y opcionalmente (iv) un amortiguador, en donde el poxvirus, el disacárido, el polímero y el amortiguador son como se definieron anteriormente. Las composiciones típicas en el producto liofilizado se muestran en la tabla 2 siguiente. En todas las formulaciones mostradas en la tabla 2, la cantidad del virus és de 5 x 108 TCID5o/ml .
Tabla 2
Cantidad de 20 30 40 DSG [%] en la formul ación acuosa antes de la liofilización (DSG: 63 g/1 de dextrano PM 36,000 44,000, 150 g/1 de sucrosa, 0.36 g/1 de sal monopotásica del ácido L-glutámico monohidratada) Sucrosa [%] en 54.7 (36 mg) 58.7 (54 mg) 58.4 (72 mg) producto liofilizado Dextrano [%] 23 (15.12 24.7 (22.68 24.6 (30.24 en producto mg) mg) mg) liofilizado Sal 0.13 (0.0864 0.14 (0.1296 0.14 (0.1728 monopotásica mg) mg) de ácido L-glutámico monohidratada [ ] en producto liofilizado Valor medio de 65.8 92 123.1 la torta liofilizada [mg] (en el reí le o de 1.2 mi)
El producto liofilizado de acuerdo a la presente invención es utilizado para la preparación de una vacuna. Para éste fin, el producto liofilizado es resuelto/reconstituido como se describió anteriormente, y administrado a un ser humano o a un animal, de acuerdo a los métodos conocidos para la persona de experiencia en la técnica.
BREVES EXPLICACIONES DE LAS FIGURAS
La figura 1 muestra la estabilidad de la formulación liofilizada que contiene MVA a una temperatura de 31°C. La formulación probada es GT23 (ver sección de ejemplos, y tabla 6). El titulo del virus en la formulación acuosa de acuerdo a la presente invención es determinado antes de la liofilización . La liofilización fue realizada como se describe para GT23 (ver ejemplos y tabla 6) . Después de la liofilización, la formulación fue almacenada a 31°C. En los puntos de tiempo indicados, la formulación liofilizada fue reconstituida y el titulo viral fue nuevamente determinado . Las figuras 2 y 3 muestran los resultados del mismo experimento como se describe en la leyenda a la figura 1, con la excepción de que la temperatura de incubación fue de 37°C en la figura 2 y 45°C en la figura 3.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos ilustraran adicionalmente la presente invención. Podrá ser comprendido por una persona de experiencia ordinaria en la técnica que los ejemplos proporcionados de ninguna manera pueden ser ¡ interpretados en un sentido que limite la posibilidad de aplicación de la tecnología proporcionada por la presente invención para estos ejemplos.
Ejemplo 1: Liofilización de las formulaciones que contienen el Virus de la Vaccinia Modificado Cepa Ankara (MVA)
En este ejemplo, fueron liofilizadas bajo diferentes condiciones las formulaciones de acuerdo a la presente invención que contenían MVA. El producto liofilizado fue almacenado a diferentes temperaturas. La estabilidad de MVA en la preparación fue analizado mediante la determinación del título de MVA después de la reconstitución del producto liofilizado, y comparándolo con el título de MVA antes de la liof ilización . La influencia de los diferentes tiempos de almacenamiento sobre el título viral fue también determinada. El protocolo para la determinación del título de una formulación que contiene MVA, se da en el ejemplo 2.
1. Ajustes experimentales:
Preparación/Formulaciones de vacuna Para probar el proceso de liofilización de acuerdo a la presente invención, se utilizaron- varias preparaciones de MVA. Para los experimentos de liof ilización (hileras GT1-4, 6-10 y 13-15 en la tabla 6) se utilizó el virus de la vaccinia modificado cepa Ankara (MVA) . El virus fue verificado mediante centrifugación sobre cojines de sucrosa al 36% y al 40%, seguido por la resuspensión en amortiguador Tris 1 Mm, a pH 9. Los experimentos de 1 iof i li zación de GT1-4 (tabla 6) no utilizaron aditivos. El sistema amortiguador utilizado fue Tris 10 mM con cloruro de sodio 140 mM a pH 7.4. Para las liofilizaciones comenzando con el número GT6 (tabla 6) se utilizaron diferentes aditivos sin cambiar el sistema amortiguador. Se eligieron dos diferentes formulaciones con diferentes aditivos. Los aditivos fueron administrados al virus que contenia soluciones, mediante la adición de un amortiguador de dilución. La composición de los amortiguadores de dilución utilizados es mostrada en las siguientes tablas 3 y 4. La adición del amortiguador de dilución 1 (DSG) da como resultado una formulación acuosa de acuerdo a la presente invención. El uso del amortiguador de dilución 2 (DGG) da como resultado una formulación utilizada para el análisis comparativo.
Tabla 3
Amortiguador de dilución 1 (DSG) Concentración en la solución de reserva [g/1]
Dextrano (PM 36000 - 44000) 63 Sucrosa 150 Sal monopotásica de ácido L- 0.36 glutámico monohidratada
Tabla 4
Amortiguador de dilución 2 (DGG) Concentración en la solución de reserva [g/1]
Dextrano (PM 36000 - 44000) 63 Glucosa 150 Sal monopotásica de ácido L- 0.36 glutémico monohidratada Estos amortiguadores de dilución fueron utilizados a diferentes concentraciones en la formulación final. El amortiguador de dilución 1 (DSG) se utilizó a 16.7%, 23%, 30% y 40% (v/v) , el amortiguador de dilución 2 (DGG) a 20% (v/v) . La TCIDso/ml de la formulación final fue ajustada a 5 x 10e TCID50/nil con un amortiguador de Tris fisiológico (amortiguador de Tris 10 mM; cloruro de sodio 140 mM; pH 7.4) .
Congelamiento de la muestra Las muestras fueron congeladas dentro del liofilizador ( liofilizador Christ, tipo Alfa 2·4) . Para la formulación con sucrosa (DSG) la comparación de las diferentes temppraturas de congelamiento (-30°C a -45°C) mostró que la suspensión tiene que ser congelada a -40°C, lo cual está por debajo de la temperatura de colapso de la formulación, para obtener una estructura de torta perfecta. Cuando se congeló dentro del liofilizador, se alcanzaron los -40°C dentro de aproximadamente 3.5 a 4.5 horas (comenzando a aproximadamente 20°C) .
Secado pri ari o \ Para la formulación con sucrosa (DSG) se asumió una temperatura de colapso de aproximadamente -30 a -37°C tomando en cuenta la temperatura de colapso de la sucrosa (-31°C) . Por lo tanto, la temperatura del producto fue ajustada a valores en el intervalo de -37 a -41°C, para1 asegurar una matriz completamente congelada. Se utilizaron presiones de 0.04 y 0.12 mbar (-50°C y -40°C en el diagrama de fases del agua) . La fuerza de impulsión de la sublimación durante el secado primario es la diferencia de presión entre el producto y el condensador del liofilizador creado por su diferencial de temperatura. Una ley de la naturaleza es que conforme es disminuida la temperatura del agua, la presión sobre esa agua también disminuye. Una temperatura especifica del agua está siempre asociada con una presión especifica. El condensador fue ajustado a temperaturas en el intervalo de -83°C a -89°C. La presión en la cámara y la temperatura de anaquel regula la temperatura del producto. Esto indica que la longitud del secado primario no puede ser acortada muy fácilmente, ya que la temperatura del condensador es fija. Para incrementar la temperatura del producto, la Tc de la formulación es el factor limitante.
Secado secundario Las temperaturas para el secado secundario son determinadas por la estabilidad del producto. También el contenido de humedad residual de la formulación depende de los requerimientos del producto. Algunos necesitan contenidos de humedad más alto algunos más bajo para lograr la mejor estabilidad del producto. El contenido óptimo de humedad residual asi como el tiempo para alcanzar éste, han de ser determinados empíricamente. Ya que el secado secundario comienza con el producto alcanza una temperatura por arriba de 0°C, el secado secundario fue realizado en dos pasos. En el primer paso la temperatura de anaquel fue regulada por algunas horas (en el intervalo de 4 a 7 horas) de tal manera que la temperatura del producto estuviera por arriba de 0°C (en el intervalo de 4 a 6°C) . De esta manera todo el hielo posiblemente existente que permaneció después del secado primario se fundió. Mediante el uso de tales condiciones leves para comenzar el secado secundario, los daños al producto serán reducidos al mínimo. Posteriormente, se inició el segundo paso al incrementar la temperatura del producto a valores en el intervalo de 18 a 21°C por 20 a 30 horas. El tiempo para el segundo paso es fuertemente dependiente de la humedad residual deseada del producto liofilizado. Para obtener diferentes contenidos de humedad residual se utilizaron diferentes tiempos. Como un ensayo para medir el contenido de humedad residual del material liofilizado se llevó a cabo la titulación coulométrica de Karl-Fischer (Jennings, T.A., "Lyophilization, Introduction and Basic Principies", Interpharm Press, Denver, CO, US, 1999, ISN 1-57491-08-7, páginas 415-418) .
Taponado y retiro del producto Todos los productos elaborados durante el desarrollo del proceso fueron sellados bajo presión muy baja (0.04 - 2.56 mbar) directamente en el liofilizador . Los frascos fueron cerrados utilizando tapones de caucho de butilo. Una vez que el producto fue taponado el sistema fue devuelto a la presión atmosférica y el anaquel fue descargado. Después de esto, los frascos fueron sellados con capuchones de aluminio para el almacenamiento a largo plazo.
Almacenamiento de la vacuna Un aspecto importante del ejercicio de formulación es producir una vacuna que sea estable en anaquel. Los factores que incluyen la estabilidad incluyen el contenido de unidad residual, la composición de la atmósfera de selladura, y las condiciones de almacenamiento, incluyendo la temperatura, la humedad y la luz. Los diferentes lotes producidos durante el desarrollo del proceso fueron todos almacenados a 4°C y a temperatura ambiente. Además, unos pocos lotes fueron también almacenados a 31°C, 37°C y 45°C. Todas las muestras fueron almacenadas en la oscuridad .
Reconstitución Las muestras liofilizadas fueron reconstituidas con ¡agua Mili-Q calentada en autoclave. Más específicamente se agregaron 1.2 mi de agua a la muestra utilizando una jeringa. La suspensión se mezcló mediante agitación suave. La reconstitución toma únicamente unos pocos segundos. El título viral del producto reconstituido fue determinado y comparado al título del virus antes de la liof ilización .
Prueba de estabilidad acelerada La estabilidad de la formulación GT23 (ver tabla 6) fue evaluada a 31°C, 37°C y 45°C. El título viral fue monitorizado regularmente. Los resultados se muestran en las figuras 1 a 3.
Resultados y conclusión:
Se liofilizó MVA con y sin el uso de diferentes aditivos. Las formulaciones sin aditivos mostraron que eran inestables (ver tabla 6). En este contexto, las muestras fueron consideradas como estables cuando el titulo no disminuyó por más de 0.5 log. De este modo, el término "estable a una cierta temperatura por un cierto periodo de tiempo" significa que la pérdida del titulo viral a esta temperatura es menor de 0.5 logs durante este periodo de tiempo. Una formulación "falla" si la pérdida del titulo del virus durante el periodo de tiempo indicado a la temperatura indicada es de 0.5 logs o más. Las formulaciones que comprenden dextrano y glucosa mostraron una estabilidad muy baja a temperatura ambiente. Las formulaciones de acuerdo a la presente invención que comprenden diferentes concentraciones de sucrosa y dextrano probaron ser estables. La estabilidad de MVA en las formulaciones de acuerdo a la presente invención es al menos de 25 semanas a 4°C y a temperatura ambiente. La información detallada respecto a los experimentos individuales se da en la tabla 6:
En la tabla 6 se muestra que la estabilidad de las formulaciones sin aditivos (tablas 6, GT1-4) fue muy pobre. Después de únicamente unas pocas semanas éstas perdieron 0.5 logs de su título inicial original, lo cual no es aceptable. La formulación con 20% (v/v) de DGG no fue aceptable debido al colapso del material durante el proceso de liofilización (datos no mostrados) . Este colapso es explicable por la baja Tc de la glucosa, la cual no fue marcadamente incrementada por el uso de dextrano, que tiene una Tc alta (-11°C) . Para el secado primario la menor temperatura posible del equipo de liofilización (-45°C) fue utilizada. Por lo tanto, no fue posible disminuir la temperatura por debajo de la Tc de la glucosa. Las formulaciones con 30% (v/v) de DGG no colapsarón. Este fenómeno es probablemente debido a la mayor cantidad total de dextrano, que incrementa la a un valor mayor que la temperatura utilizada para el secado primario. Aunque el material no colapso, la estabilidad especialmente a temperatura ambiente no fue satisfactoria, lo cual puede ser debido a la baja Tc en estado sólido de la glucosa (tabla 6, GT 10) . Se utilizó el amortiguador de dilución 1 (DSG) en la mayoría de los experimentos. La estabilización con este aditivo es muy buena. Debido a la alta T (-31 °C) de la sucrosa, el colapso no fue un problema con esta formulación. La estabilidad del material liofilizado fue siempre buena (tabla 6) . No existieron grandes diferencias entre el uso de 16.7%, 20%, 23%, 28.6%, 30% y 40% (v/v) de DGS en la formulación. La estabilidad a 4°C y la temperatura ambiente es probada para las 6 formulaciones. Los productos liofilizados con 30% y 40% de DSG tuvieron una estabilidad ligeramente mejor. Una de las formulaciones (proceso GT 23, ver tabla 6) fue analizado con detalle en una prueba de estabilidad acelerada. Los resultados son mostrados en las figuras 1 a 3 y resumidos en la siguiente tabla 5.
Tabla 5
Temperatura Pérdida del titulo Pérdida de 0.5 [°C] ( datos logs después de experimentales ) [días] (calculado)
31 0.245 logs en 29 días 59 37 0.3¿1 logs en 35 días 54 45 0.332 logs en 29 días 44 A 31°C, la vacuna ha sido almacenada por aproximadamente 1 mes y todavía cumplió las especificaciones (la pérdida en el titulo del virus es menor de la mitad de un log) . Pero incluso a temperaturas más altas, podría ser posible almacenar una vacuna por más de un mes, lo cual puede ser interesante especialmente para regiones tropicales. Para las vacunas viejas de la viruela La Organización Mundial de la Salud recomendó un método para la estimación de la estabilidad. Si la vacuna perdía menos de 1 log dentro de 4 semanas a 37°C, se asumió que era estable por al menos un año cuando se almacenaba a 4°C (el criterio de la aceptación para el uso de la vacuna vieja se perdió en menos de 1 log) . Como se muestra la formulación GT23 de acuerdo a la presente invención cumple este criterio.
Ejemplo 2: Titulación del Virus de la Vaccinia Modificado Cepa Ankara (MVA)
La titulación del virus de la Vaccinia Modificada Cepa Ankara (MVA) se realiza en un ensayo basado en TCID50 utilizando diluciones a un décimo en un formato de 96 pozos. En el punto final del ensayo, las células infectadas son visualizadas utilizando un anticuerpo anti-virus de la vaccinia, y una solución de tinción apropiada. Células CEF (fibroblastos de embrión de pollo) primarios de 2-3 días de edad se diluyen a 1 x 105 células/ml en RPMI al 7%. Se realizan diluciones a un i décimo con 8 réplicas por dilución. Después de la dilución, se siembran 100 µ? por pozo de las placas de 96 pozos. Las células son luego incubadas toda la noche a 37°C y 5% de C02. Las diluciones de las soluciones que contienen virus se realizan en pasos de dilución a un décimo (10_1 a 10~12 como sea apropiado) utilizando RPMI sin suero fetal de ternera. Luego, se agregan 100 µ? de cada muestra del virus a los pozos que contienen células. Las placas de 96 pozos se incuban a 37°C con 5% de CO2 por 5 días para permitir la infección y la replicación viral . Las células son teñidas 5 días después de la infección con un anticuerpo especifico del virus de la vaccinia. Para la detección del anticuerpo especifico, se utiliza un anticuerpo secundario acoplado a peroxidasa de rábano (HRP) . El anticuerpo especifico de MVA es una fracción de IgG policlonal de conejo, anti-anticuerpo del virus de la vaccinia (Quartett, Berlín, Alemania #9503-2057) . El anticuerpo secundario es el anticuerpo policlonal de cabra acoplado a la HRP, anti-anticuerpo IgG de conejo (Promega, Mannheim, Alemania, #W4011). La reacción de color es llevada de acuerdo a las técnicas conocidas. Cada pozo con las células que son positivas en la reacción de color es marcado como positivo para el cálculo de la TCID50. El titulo es calculado mediante el uso de la fórmula de Spearman [1] y Kaerber [2]. Debido a que todos los parámetros de ensayo son mantenidos constantes, se utiliza la siguiente fórmula simplificada.
Título del Virus [TCID5o/ml] = 10
a= factor de dilución de la última columna, en la cual los ocho pozos son positivos xa = número de células positivas en la columna a + 1 xb = número de células positivas en la columna a + 2 xc = número de células positivas en la columna a + 3
Tabla 6 : Datos de estabilidad de los poxvirus en las diferentes formulaciones liofilizadas
Proceso Aditivos Congelami Secado primario Secado Estabilidad ento secundario GT1 — A -30°C Presión: 0.37 Presión: 0.37 Falla después de mbar mbar una semana a Temperatura del Temperatura temperatura anaquel: 2°C del anaquel: ambiente y a 37°C (por 20 horas) 5°C (por 2.5 horas) 8°C (por 1 hora) 10°C (por 2 horas) GT2 — A -40°C Presión: 0.12 Presión: 2.56 Falla después de mbar mbar 11 días a Temperatura del Temperatura temperatura producto: -13°C del producto: ambiente y a 37°C (por 24 horas) -4°C (por 3.5 horas) 12°C (por 4 hora) GT3 — A -39°C Presión: 0 07 Presión: 0.07 Falla después de mbar mbar 23 días a Temperatura del Temperatura temperatura producto: -16°C del producto: ambiente (por 24 horas) -1°C (por 2.75 horas) 7°C (por 3.5 hora) GT4 — A -45°C Presión: 0.04 Presión: 0.04 Falla después de mbar mbar dos semanas a Temperatura Temperatura 4°C y a del producto: - del producto: temperatura 37°C (por 25.5 -3°C (por 6 ambiente horas) horas) 14°C (por 26.5 hora) GT6 30% de A -44°C Presión: 0.04 Presión: 0.04 La formulación
DSG mbar mbar es estable — > a Temperatura Temperatura 4°C por al del producto: - del producto: menos 34 42°C (por 23 5°C (por 8 semanas horas) horas) 16°C (por 25 1 horas) GT7 23% de A -44°C Presión: 0.04 Presión: 0.04 La formulación
DSG mbar mbar es estable por al Temperatura Temperatura menos 46 del producto. - del producto: semanas y a 37°C (por 22.5 0°C (por 7 temperatura horas) horas) ambiente 13°C (por 24 horas) GT8 16.7% y A -42°C Presión: 0.04 Presión: 0.04 A 4°C y a
23% de mbar mbar temperatura DSG Temperatura Temperatura ambiente por al del producto: - del producto: menos 45 38°C (por 24 4°C (por 8 semanas horas) horas) 17°C (por 21 horas) GT9 30% y A -44°C Presión: 0.04 Presión: 0.04 La formulación
40% de mbar mbar con 30% de
DSG Temperatura Temperatura DSG: estable ? del producto: - del producto. a 4°C por al 37°C (por 25.5 4°C (por 6.5 menos 57 horas) horas) semanas 17°C (por 24 - a temperatura horas) ambiente por al menos 43 semanas
Formulación con 40% de DSG: estable a 4°C y a temperatura ambiente por al menos 43 semanas GT10 30% de A -35°C Presión: 0.04 Presión: 0.04 La formulación
DSG mbar mbar es estable a 4°C Temperatura Temperatura por 42 semanas del producto: - del producto: La formulación 37°C (por 23 6°C (por 6.5 falla después de horas) horas) 10 semanas a 19°C (por 24 temperatura horas) ambiente (TA)
GT1 1 20% de A -45ÓC Presión: 0.04 Presión: 0.04 Las DSG mbar mbar formulaciones Temperatura Temperatura fallaron a 4°C del producto: - del producto: después de 56 41°C (por 23 5°C (por 4 semanas; a TA horas) horas) después de 14 19°C (por semanas 25.5 horas) GT12 30% de A -40°C Presión: 0.04 Presión: 0.04 La formulación
DSG mbar mbar es estable por al Temperatura Temperatura menos 54 del producto: - del producto: semanas a 4°C 37°C (por 24 4°C (por 6 A 25°C estable horas) horas) por al menos 40 17°C (por 24 semanas horas) GT13 30% de A -40°C Presión: 0.04 Presión: 0.04 La formulación
DSG mbar mbar es estable por al Temperatura Temperatura menos 36 del producto: - del producto: semanas a 4°C 38°C (por 19 4°C (por 15.5 horas) horas) -15°C (por 9 17°C (por horas) 26.5 horas) GT14 30% de A -40°C Presión: 0.04 Presión: 0.04 La formulación
DSG mbar mbar estable por al Temperatura Temperatura menos 50 del producto: - del producto: semanas a 4°C 38°C (por 21.5 15°C (por 6.5 A 25°C estable horas) horas) por al menos 19 -13°C (por 18°C (por semanas 17.5 horas 26.5 horas) GT 1 |5 30% de A -41 °C Presión: 0.04 Presión: 0.04 La formulación
DSG mbar mbar falló después de Temperatura Temperatura 49 semanas a del producto: - del producto: 4°C; 1 37°C (por 20 5°C (por 3 A 25°C estable horas) horas) por al menos 18 17°C (por semanas 24.5 horas) GT23 30% de A -40°C Presión: 0. 12 Presión: 0.04 Ver datos — »
DSG mbar mbar Prueba de Temperatura Temperatura estabilidad del producto: - del producto: acelerado en la 34°C (por 21 7°C (por 18 figura 1-3 horas) horas) 17°C (por 28 horas)
Claims (1)
- REIVINDICACIONES [ 1. Una formulación, que comprende (i) un poxvirus purificado o parcialmente purificado seleccionado del grupo que consiste de Orthopoxivirus , Parapoxvirus , Avipoxvirus, Capripoxvirus y Suipoxvirus, (ii) un discárido y! (iii) un polímero farmacéuticamente aceptable. ¡ 2. Formulación de conformidad con la t reivindicación 1, que comprende además un amortiguador. I 3. Formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizada porque el poxvirus es un virus de la vaccinia. 4. Formulación de conformidad con cualquiera I de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el virus de la í vaccinia se selecciona de la cepa Elstree y el virus modificado de la vajccinia cepa Ankara (MVA) . 5. Formulación de conformidad con cualquiera I de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque el poxvirus es un poxyirus recombinante . 6. Formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque el disacárido se selecciona de un grupo que consiste de ^pz!^r&a, lactosa y tjrehalosa. I 7. Formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque la concentración del disacárido está en un intervalo de 10 a 100 g/1. ¡ í 8. Formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicacipnes 1 a 7, caracterizada porque el polímero farmacéuticamente aceptable se selecciona de dextrano y poliviniÍLpirrolidona (PVP) . í i I 9. Formulación de conformidad con la reivindicación 8, ¡ caracterizada porque el dextrano i tiene un peso molecular en el intervalo de 30, 000 a t 70, 000 y tiene una ¡concentración de 1 a 50 g/1. I t 10. Formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, caracterizada porque el I amortiguador de fosfato es excluido como amortiguador. I 11. Formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizada porque la formulación comprendé además ácido glutémico. I l 12. Formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizada porque la temperatura de colapso de la formulación está en el intervalo de -37°C á -30°C. 13. Formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizada porque el poxvirus es una pepa MVA o la cepa Elstree, el disacárido es sucrósa, el polímero es dextrano y el amortiguador no es Un amortiguador de fosfato. 14. Formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, como vacuna. i 15. Uso d;e una formulación de conformidad con cualquiera de las j reivindicaciones 1 a 13, para la j fabricación de una ¡vacuna. 16. Método para preparar una composición que contiene poxvirus/ estable, caracterizado porque la formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a! 13 se liofiliza. t í 17. Métodoi de conformidad con la i reivindicación 16, gue comprende los siguientes pasos: (i) el congelamiento, de una formulación como se define í de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, a una temperatura menor que la temperatura de colapso de la formulación, para obtener una matriz de í producto congelado; j (ii) deshidratación primaria de la i formulación congelaba bajo una presión baja y a una temperatura de producto que permite la sublimación del i hielo en la matlriz del producto, en donde la temperatura del producto es menor que la temperatura de colapso de la £ormul ación ; (iii) deshidratación secundaria a baja¡, presión y a una temperatura de producto en el intervalo de 0°C a 30°C hasta que la humedad residual dell producto es menor de 5%. i i i 18. Producto liofilizado obtenido mediante el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 161 a 17. 19. Producto liofilizado que comprende (i) un I poxvirus, (ii) ún disacárido, (iii) un polímero farmacéuticamente aceptable y opcionalmente (iv) un amortiguador, en donde el poxvirus, el disacárido, el polímero y el amortiguador son como se definen de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, 8 y 10 a 11. i 20. Producto liofilizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 19, caracterizado porque el contenido de humedad residual está en un intervalo1 de 1 a 3%. i 1 21. Uso del producto liofilizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, para la preparación de una vacuna. 22. Método para la reconstitución del producto liofilizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, caracterizado porque el producto es disuelto en una cantidad apropiada de un solvente farmacéuticamente aceptable.
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