CN1296096C - 含痘病毒制剂和制备稳定的含有痘病毒组合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种制剂尤其是一种含水制剂，包括：(i)从正痘病毒属，禽痘病毒属，副痘病毒属，羊痘病毒属和猪痘病毒属中挑选出接种病毒(ii)双糖(iii)药物可接受的聚合物和任选(iv)缓冲液。这种含水制剂尤其适合进行冷冻干燥过程，这样可以形成稳定的冷冻干燥的痘病毒。本申请还涉及制备冷冻干燥的含痘病毒组合物的方法和该方法获得的产品。

Description

含痘病毒制剂和制备稳定的含有痘病毒组合物的方法
本发明涉及一种制剂尤其是一种含水制剂，包括：(i)从正痘病毒属，禽痘病毒属，副痘病毒属，羊痘病毒属和猪痘病毒属中挑选出痘病毒，(ii)双糖，(iii)药物可接受的聚合物，和任选(iv)缓冲液。这种含水制剂尤其适合进行冷冻干燥过程，这样可以形成稳定的冷冻干燥的痘病毒。本申请还涉及制备冷冻干燥的含痘病毒组合物的方法和该方法获得的产品。
技术背景
痘病毒科包括复合DNA病毒的大科，这些病毒在脊椎动物和无脊椎动物细胞的胞浆里复制。对于人，天花是非常重要的痘病毒感染。形成天花的一个致病因素是正痘病毒属中的天花病毒。同样是痘病毒科正痘病毒属的牛痘苗病毒被用作活疫苗来对天花产生免疫。在全球范围内，通过成功的接种牛痘苗病毒，消灭了天花病毒(全球消灭了天花。全球消灭天花证实委员会的最后报告；公共卫生的历史，No.4，日内瓦：世界卫生组织，1980)。同时，大多数传染性的原种天花病毒都受到破坏。然而，并不能排除痘病毒类诱发天花或者类似天花疾病，这些疾病可能再次变成主要的健康问题。因此，生产稳定的疫苗来预防痘病毒感染是很有必要的，尤其预防天花感染，例如以牛痘苗病毒为基础的疫苗。
过去，人们曾经使用牛痘苗病毒作为重组基因表达和作为重组活疫苗潜在用途的工程病毒载体(Mackett，M.，Smith，G.L.and Moss，B.[1982]P.N.A.S.USA 79，7415-7419；Smith，G.L.，Mackett，M.and Moss，B.[1984]Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 2，383-407)。特别需要DNA序列(基因)，这些序列编码那些借助DNA重组技术导入到牛痘苗病毒基因组里面的外来抗原。如果把基因整合到那些对病毒生存期非必需的病毒DNA位点上，那么，新产生的重组牛痘苗病毒可能具有感染性，即病毒可能感染外来细胞，从而牛痘苗病毒表达整合的DNA序列(EP 83286 and EP110385)。可以以这种方法来制备重组牛痘苗病毒，一方面，它可以作为预防传染病的活疫苗，另一方面，它可以在真核细胞中制备异种蛋白的活疫苗。重组牛痘苗病毒的其它例子是隐藏治疗基因例如自杀基因，核酶基因或者反义基因的病毒，
已知改良Ankara牛痘苗病菌株(MVA)格外安全。在鸡胚胎纤维母细胞里，利用Ankara牛痘苗病菌株的长期连续传代(CVA)可以产生MVA。(综述见Mayr，A.，Hochstein-Mintzel，V.and Stickl，H.[1975]Infection 3，6-14；Swiss Patent No.568,392)。例如，按照《布达佩斯条约》要求保藏的MVA病菌株例子有保藏在位于英国索尔兹伯里的欧洲动物细胞培养物保藏中心(ECACC)的菌株MVA572，保藏号是ECACC V94012707，MVA575，保藏号是ECACCV00120707，MVA-BN，保藏号是ECACC V00083008。
因为MVA特别大的作用而与众不同，也就是说，它能降低毒性或感染性的同时还能保持好的免疫原性。曾经分析MVA病毒来测定相对野生型CVA菌株中基因组的变异性。Meyer等已经确定了基因组DNA中有6个主要缺失(缺失I，II，III，IV，V，和VI)，总计31,000个碱基对(Meyer，H.，Sutter，G.and Mayr A.[1991]J.Gen.Virol.72，1031-1038)。所形成的MVA病毒变成仅仅局限于禽细胞的宿主细胞。而且，MVA具有特别大的减毒作用。当在各种各样的动物模型中实验时，发现MVA有毒性，甚至在受免疫抑制的动物中也有毒性。更重要的是，在广泛的临床实验中，证实了MVA菌株的优良性质(Mayr等，Zbl.Bakt.Hyg.I，Abt.Org.B 167，375-390[1987]，Stickl等，Dtsch.med.Wschr.99，2386-2392[1974])。在关于包括高危病人在内的120,000人的这些研究中，使用MVA疫苗时没有发现任何副作用。已经有人构建了重组MVA作为疫苗(见，如WO97/02355)，并用于临床实验。WO98/13500揭示了一种重组MVA，它含有能够表达那些编码登革热病毒抗原的DNA序列。外源DNA序列重组到MVA基因组中天然存在缺失位点的病毒DNA上。
显示较强的减毒作用并增强安全性的MVA菌株是MVA-BN菌株，这个菌株保藏在英国索尔兹伯里的欧洲动物细胞培养物保藏中心(ECACC)，保藏号是V00083008。
除了牛痘苗病毒外，还把其它痘病毒作为载体把遗传信息传递给哺乳细胞。本文可以参考禽痘病毒，如鸡痘病毒。美国专利US5,736,368号和6,051,410号已经揭示了基因组中含有HIV基因的鸡痘病毒类。
本领域技术熟练者知道制备作为疫苗的含痘病毒组合物的方法(例如Joklik W.K.，Virology(1962)，18，9-18；Richter，K.H.，Abhandlungenaus dem Bundesgesundheitsamt(1970)，9，53-57)。已知的纯化方法可以得到含痘病毒的水溶液或含有痘病毒的沉淀物。痘病毒在这些溶液和沉淀物中是不稳定的，即病毒的感染性会迅速下降。无论如何，把疫苗贮藏并以稳定形式分散是很有必要的，特别是当需要在有限的分散条件下把疫苗转运到热带区域的时候。冷冻干燥产品可以在温度4℃-25℃保存。与那些需要在-20℃以下保存的液体制剂的标准保存条件相比，这是一个特别明显的优点(Cryopreservation and freeze-drying protocols″Day J，McLellan M；Methods in Molecular Biology，38，1995，Humana Press)。
已知冷冻干燥痘病毒类尤其牛痘苗病毒的方法，和含有该病毒的组合物以及适于该日的溶液(Burke等，Critical Reviews in Therapeutic DrugCarrier Systems(1999)，16，1-83)。总之，疫苗的冷冻干燥包括将适合于冷冻干燥的含疫苗的含水制剂冷冻，接下来是在减压和低温的条件下通过升华除去水，最后，在减压和高温的条件下通过解吸除去水。
含有已知痘病毒的冷冻干燥制剂有重要的缺点。冷冻干燥的许多含有已知牛痘苗病毒的组合物含有来自动物的蛋白胨或尿素交联明胶。然而，一些动物疾病如BSE疾病，可以通过动物产品如蛋白胨，明胶或者尿素交联明胶从动物传到人身上。而且，在冷冻干燥的含已知病毒的制剂中的痘病毒还没有纯化。因此，在现行技术水中已知的冷冻干燥的含痘病毒的组合物含有分别来自细胞或组织培养系统中细胞的大量蛋白和细胞培养过程中使用的牛血清中的大量蛋白。
本领域技术熟练者也知道不含附加的动物来源化合物(如蛋白胨或者尿素交联明胶)的冷冻干燥组合物。这种情况下，该组合物含有单独的或者一定组合的下列化合物：谷氨酸钠，山梨醇，乳糖，盐，氨基酸和甘油。但是，冷冻干燥后获得的产品常常相当不稳定，即在储存过程中病毒效价总损失太高以至于难以接受。而且，实验表明，在一些制剂中，痘病毒易于形成聚集体，并且在冷冻前或冷冻时其他化合物会发生沉淀。
美国专利US 3,577,526号揭示了天花疫苗，这种疫苗是由分散在蔗糖中疫苗的毛病毒物质组成的。蔗糖含量是20-40％。该制剂还可含有5％葡萄糖。术语毛病毒是由髓和脓疱衍生的病毒。基本上，将淋巴破碎成块，并把液体和死发以及死皮肤分开。因此，疫苗制剂的蛋白含量非常高，并且蛋白可以促进病毒的稳定。
发明目的
本发明的目的是提供一种包含痘病毒的制剂，尤其是含水含痘病毒的制剂，其进行冷冻干燥以形成一个稳定的冷冻干燥产品，其中，痘病毒优选纯化的或者部分纯化的病毒。本发明的另一个目的是提供一种含水含痘病毒的制剂，在这个制剂中痘病毒不易聚集，并且在冷冻前或冷冻中该制剂成分不会沉淀。此外，本发明的另一个目的是提供一种含痘病毒的制剂，尤其是含水含痘病毒的制剂，该制剂包括少量非痘病毒的相关蛋白。最后，本发明还一个目的就是提供一种稳定的，冷冻干燥的，含痘病毒的组合物。并且提供获得所说组合物的方法。
发明的详细描述
本发明提供了一种包含痘病毒的制剂，尤其是含水含痘病毒的制剂。该制剂尤其含水制剂可适合所述痘病毒的冷冻干燥。而且，本发明还提供了冷冻干燥的含痘病毒的产品。根据本发明，制剂尤其含水制剂包括痘病毒，双糖，药物可接受的聚合物和任选的缓冲液。
根据本发明，即使冷冻干燥制剂既不含有那些动物来源的稳定添加剂如蛋白胨，明胶以及尿素交联明胶，也不含有来自那些用来扩增病毒系统(例如细胞培养系统)的高含量蛋白，该制剂中的病毒意想不到地稳定，也就是说，即使在高温例如室温或者37℃这样的贮藏温度下，痘病毒在冷冻干燥组合物中也可以长期保持传染性。
如果不作特殊说明，本说明书中术语“室温”对应的温度为20℃-25℃。
要冷冻干燥的痘病毒可以从正痘病毒属，副痘病毒属，禽痘病毒属，羊痘病毒属和猪痘病毒属中挑选。这些病毒作为对人类或者动物的疫苗可能是有用的(Virology，3rd edition，1995，ed.-in-chief：Fields，B.N.)。特别优选的痘病毒是那些来自正痘病毒属或禽痘病毒属的病毒。属于禽痘病毒属的优选痘病毒是金丝雀痘病毒和鸡痘病毒。属于正痘病毒科的优选痘病毒是牛痘病毒和牛痘苗病毒。
根据本发明，包含在制剂中的痘病毒可以是一种天然存在的痘病毒，一种减毒痘病毒或者一种重组痘病毒。
为了给人类接种疫苗以防天花，制剂中的痘病毒优选牛痘苗病菌株。适合于此目的的牛痘苗病菌株的例子参见Temple of Heaven，Copenhagen，Paris，Budapest，Dairen，Gam，MRIVP，Per，Tashkent，TBK，Tom，Bern，Patwadangar，BIEM，B-15，Lister，EM-63，New York City Board of Health，Elstree，Ikeda and WR。最优选的牛痘苗病菌株是改良Ankara牛痘苗病菌株(MVA)和它的衍生物，特别是那些在ECACC保藏的保藏号为V00083008的菌株和Elstree菌株。
根据本发明，制剂中的痘病毒优选那些对动物或者将要接种的对象在本质上是一个病原体的痘病毒。为此目的，可以优选使用减毒病毒菌株，也可以使用在与接种的物种不同的宿主物种上自然复制的痘病毒，并且这个痘病毒对于异种宿主不是致病的。
“减毒病毒”是一种来自致病病毒的病毒，与非减毒母病毒相比，在感染宿主生物体时，会导致较低的死亡率和/或者发病率。本领域技术熟练者知道减毒痘病毒的例子。最优选的病毒是改良Ankara牛痘苗病毒菌株(MVA)。典型的MVA菌株是MVA 575菌株和MVA 572菌株，它们已经保藏在欧洲动物细胞培养物保藏中心，其保藏号分别为ECACC V00120707和ECACC V94012707。最优选的病毒是MVA-BN菌株或它的衍生物，WO02/42480(PCT/EP01/13628)对此病毒有描述。该申请的内容包含在本申请中作为参考。MVA-BN已经保藏在欧洲动物细胞培养物保藏中心，保藏号为ECACCV00083008。
对人是异种宿主，并且对人不是致病的痘病毒的例子是禽痘病毒或金丝雀痘病毒。
术语“重组病毒”指的是一种病毒，这种病毒是插入到病毒基因组里的一个异种基因，这个异种基因不是病毒基因组本身的一部分。异种基因可以是一种治疗基因，一种编码多肽的基因，这个多肽至少含有一种抗原决定簇以产生免疫应答，一种反义表达基团或者一种核酶基因。本领域技术熟练者知道构建重组病毒的方法。最优选的痘病毒载体是MVA，特别是MVA 575和MVA-BN(同上)。本领域技术熟练者知道痘病毒类怎样扩增，并知道怎样从已经感染的细胞培养物中回收。总之，首先，用本发明制剂一部分的痘病毒来感染真核细胞。真核细胞对相应的痘病毒的感染比较敏感，进行复制，并且产生感染性的病毒。本领域技术熟练者知道对所有痘病毒类适合的这些真核细胞。对于MVA，适合这种类型细胞的例子是鸡胚胎纤维母细胞(CEF)(DrexlerI.等，J.Gen.Virol.(1998)，79，347-352)。本领域技术熟练者知道在一定条件下培养CEF细胞。最好把CEF细胞培养在不含血清的介质中。培养时间在37℃±2℃为48小时至96小时比较好。以0.05到1TCID50(TCID：组织培养感染量)多重感染(MOI)来使用感染痘病毒，在同样温度培养48小时到72小时。
可以通过检查致细胞病变效应(CPE)来观察感染过程，典型的是感染细胞出现显著的环绕。
目前已知痘病毒以两种形式存在：一种是附着在感染细胞(细胞内成熟病毒体(IMV))的细胞浆的细胞膜上，一种是病毒被外化(细胞外包膜病毒体(EEV))(Vanderplasschen A.等，J.Gen.Virol.(1998)，79，877-887)。两种形式存在的病毒都可以在本发明中的制剂中使用。EEVs可以通过离心从上清液中简单的获得，并可以直接混悬在含有双糖和药物可接受聚合物的含水制剂中。但是，含病毒部分可能包含细胞碎片和其它的污染物。特别给人接种时，把病毒加入本发明制剂之前最好对病毒进行进一步的纯化。本领域技术熟练者知道纯化痘病毒的方法。纯化步骤可以是间接离心(例如使用蔗糖缓冲)，连续流动超速离心(蔗糖梯度)，超滤(例如使用孔径大于500kDa但是小于等于0.1μm的膜进行交叉流过滤)，柱色谱法(例如离子交换色谱，疏水作用色谱，粒度排阻色谱或者联合使用这些色谱)，或者联合使用上述几种方法(Masuda N.等，J Bacteriol(1981)147，1095-1104)。
为了得到IMVs，第一步必须获得细胞，第二步对细胞进行破坏。如果感染细胞是那些可以在悬浮培养物中培养的细胞，那么可以通过离心很容易的获得感染细胞。如果感染细胞是近乎完整的粘附细胞，那么在破坏细胞这一步之前可以得到细胞，例如通过从培养瓶中移去细胞。本领域技术熟练者知道获取细胞的方法。有用的技术是一些机械方法(例如使用一种橡胶细胞刮器)，物理方法(例如在-15℃以下进行冷冻，然后在15℃以上融解培养物)，生物化学方法(为了从培养容器分离细胞，进行酶例如胰蛋白酶处理)。为此目的如果使用酶，因为长时间培养后酶可能破坏病毒，所以，应该控制培养时间。
本领域技术熟练者知道破坏细胞的方法。上述的冷冻-融解方法已经导致细胞的部分破坏。破坏细胞的其它技术包括使用超声。细胞的超声处理可以形成含有病毒的匀浆。
对于给动物接种，含有痘病毒的匀浆也可以制成本发明的制剂。但是，还是优选使用那些至少部分纯化的痘病毒。就像上述描述的，本领域技术熟练者知道这些纯化方法。
痘病毒包含在制剂中，尤其在含水制剂中，其浓度为104-109TCID50/ml，优选105-5×108TCID50/ml，最优选106-108TCID50/ml。实际浓度取决于给人或者动物需要给药病毒的量，也取决于给药的病毒的类型。对于牛痘苗病毒Elstree菌株，人类典型的接种剂量是2.5×105TCID50。对于牛痘苗病毒菌株MVA-BN，人类典型的接种剂量是1×108TCID50。
正如上面指出的，本发明制剂中的痘病毒优选纯化的或者至少部分纯化的病毒。术语“纯化的或者至少部分纯化的病毒”指的是本发明制剂中使用病毒的纯度比直到根除天花在使用的疫苗中使用的那些未纯化的病毒(“毛病毒”)高(如US3,577,526所揭示的)。这些有较高纯度的病毒可以通过以下一种或多种方法获得：间歇离心(例如使用蔗糖缓冲)，连续超速离心(蔗糖梯度)，超滤(例如使用孔径大于500kDa但是小于等于0.1μm的膜进行交叉流过滤)，柱色谱法(例如离子交换色谱，疏水作用色谱，粒度排阻色谱或者联合使用这些色谱)。特别优选的方法是超滤法和或者使用蔗糖缓冲的间歇离心。总的来说，术语“纯化的或者至少部分纯化的病毒”指的是病毒制剂(例如含有MVA或者Elstree的制剂)，这种病毒制剂在总蛋白中的效价至少具有106TCID50/毫克，优选107TCID50/毫克，更优选108TCID50/毫克，最优选5×108TCID50/毫克。对于Elstree菌株，典型制剂在总蛋白中具有的效价是8×108TCID50/毫克。
本领域技术熟练者知道测定包含痘病毒制剂的效价的方法；在实例部分描述了其中一种方法。总蛋白含量的测定方法优选Kjeldahl法(Lynch，J.M.and Barbano，D.M.，Kjeldahl nitrogen analysis as a reference methodfor protein determination in dairy products.J AOACInt.1999 Nov-Dec；82(6)：1389-98.Review)。需要说明的是，总蛋白含量是病毒蛋白和细胞蛋白的总和。
出乎意料的是，包含纯化的或者部分纯化病毒，双糖和药物活性聚合物的制剂是稳定的，因为人们认为，未纯化病毒制剂中大量的非病毒蛋白对现有技术制剂的稳定性有帮助。
本发明的制剂尤其含水制剂包含双糖。与单糖例如葡萄糖相比，单糖可以在冷冻干燥过程中具有好的生物保护，但是，具有的崩溃温度低并且在冷冻干燥过程中常常崩溃。研究表明双糖比单糖的崩溃温度高，是有效的冷冻干燥保护剂，
在本发明制剂中包含的双糖是药物可接受的双糖，这种双糖具有的崩溃温度(Tc)约为-25℃--35℃。蔗糖典型的崩溃温度为-31℃，海藻糖为-28.5℃，乳糖为-30.5℃。本发明中全部制剂的典型崩溃温度优选-50℃--20℃。优选的温度范围如-37℃--30℃，-36℃--31℃，-35.7℃--31.2℃。
优选的双糖从海藻糖，乳糖和蔗糖中挑选。最优选的是蔗糖。本发明制剂尤其含水制剂包含的双糖，优选蔗糖的浓度为10-100g/l，更优选20-80g/l，最优选25-60g/l。蔗糖的典型浓度是45g/l。
本发明的制剂尤其含水制剂还含有药物可接受的聚合物。该聚合物优选右旋糖酐和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。使用的聚合物必须在本发明制剂中是可溶的。如果使用右旋糖酐，其分子量优选为20,000-100,000，更优选30,000-70,000，最优选36,000-44,000。最优选右旋糖酐的平均分子量为40,000。其浓度为1-50g/l，优选2-40g/l或者更优选3-30g/l。右旋糖酐的浓度为5-50g/l，5-40g/l或者5-30g/l时结果特别好。更优选浓度为8-30g/l。最优选浓度为10-27g/l。优选浓度的例子是如18.9g/l。右旋糖酐的优选浓度和浓度范围正如上述的，特别是浓度为5-50g/l和对应的小浓度范围具有特别的优点，就是制剂的崩溃温度比较高，这点使得进行工业规模生产得以可行。如果使用PVP，其分子量优选50,000-400,000，更优选70,000-360,000。PVP的浓度为5-200g/l，更优选5-100g/l，最优选10-40g/l。
本发明制剂尤其含水制剂还可包括缓冲液。正如上述的，本发明的目的之一就是提供一种含水含痘病毒的制剂，其中痘病毒不会聚集并且在干燥时没有沉淀析出。出乎意料的是，研究表明，这些不希望出现的现象与含水制剂含有的磷酸盐缓冲液的存在有关系。含磷酸盐的缓冲液例如PBS(磷酸盐缓冲盐水)和磷酸缓冲液。因此，本发明的这个特定目的可以通过使用不含有磷酸缓冲液的含水制剂进行冷冻干燥方法解决。至此，本发明制剂中含有的缓冲液优选从TRIS，TBS，MOPS，HEPES和碳酸盐(碳酸氢盐)缓冲液中选择。最优选的缓冲液是TRIS和TBS。
使用的缓冲液的浓度应该足够使其发挥所需的缓冲能力。对于TRIS缓冲液，优选浓度为1-50mM；最优选浓度是10mM。溶液的PH值应该调到一个合适值，一方面，给人或者动物使用时其是可以接收的，另一方面，不能对病毒有害。因此，PH值应该为6.0-9.0，优选7.2-7.8。最优选的PH值是7.4。
不管制剂中的病毒是未纯化的，完全纯化的或者部分纯化的，不使用磷酸盐缓冲液可以取得意想不到的好效果。优选纯化或者部分纯化的病毒。
本发明的制剂尤其含水制剂可能含有盐类如NaCL。NaCL的典型浓度为10-200mM。优选的NaCL的浓度如140mM。
本发明的制剂尤其含水制剂还可能包括L-谷氨酸盐。该盐优选一种单钾盐或者单钠盐。L-谷氨酸盐的浓度优选0.05-0.5g/l，优选0.1-0.15g/l。
本申请的一些特别优选含水制剂如表1所示。在表1所示的所有制剂中，缓冲液是10mM TRIS，pH7.4，140mM NaCL。
                                      表1
  改良Ankara牛痘苗病菌株(MVA)[TCID50/ml]   第一种添加剂[g/l]   第二种添加剂[g/l]   第三种添加剂[g/l]   见表6试验
  5×108   25(蔗糖)   10.5(右旋糖酐)   0.06(L-谷氨酸)   GT 8
  5×108   34.5(蔗糖)   14.5(右旋糖酐)   0.083(L-谷氨酸   GT 8
  5×108   45(蔗糖)   18.9(右旋糖酐)   0.108(L-谷氨酸   GT 9
  5×108   60(蔗糖)   25.2(右旋糖酐)   0.144(L-谷氨酸   GT 9
  1×108   45(蔗糖)   18.9(右旋糖酐)   0.108(L-谷氨酸
  1×108   45(蔗糖)   3.78(右旋糖酐)   0.108(L-谷氨酸
本发明的含水制剂适合冷冻干燥。给药的冷冻干燥产品必须使用合适的溶剂重新配制。根据一个实施方案，为了溶解化合物，在冷冻干燥产品里加入无菌水。加水量的多少，对应于冷冻干燥过程中消除的水量。因此，依据这个实施方案，重新配制产品的组成与初始的含水制剂的组成基本一致。因此，在本发明的范围内，本发明的含水制剂可以用作疫苗。根据另外一个实施方案，冷冻干燥产品也可以在其他药物可接受的稀释剂中重新配制，其中，这种稀释剂以合适的量使用。例如，稀释剂可以是含有一种或多种化合物如苯酚，甘油，缓冲液的水。重新配制产品中苯酚的浓度为例如0.5％。正如前文所述，缓冲液最好不用磷酸缓冲液。
总之，本发明的这方面特别涉及下列特别的优选实施方案：(I)制剂尤其是含水制剂含有从正痘病毒属，副痘病毒属，禽痘病毒属，羊痘病毒属和猪痘病毒属中挑选出的纯化的或者部分纯化的痘病毒，双糖，药物可接受的聚合物和任选的缓冲液，其中缓冲液最好不是磷酸盐缓冲液；或者该制剂由上述组分组成。(II)制剂尤其是含水制剂含有从正痘病毒属，副痘病毒属，禽痘病毒属，羊痘病毒属和猪痘病毒属中挑选出的纯化的或者部分纯化的痘病毒，双糖，药物可接受的聚合物和缓冲液，其中缓冲液不是磷酸盐缓冲液，痘病毒优选纯化的或者部分纯化的病毒；或者该制剂由上述组分组成。聚合物优选右旋糖酐，加入量优选按照前文所上述的。(III)制剂尤其是含水制剂含有或者甚至包括从正痘病毒属，副痘病毒属，禽痘病毒属，羊痘病毒属和猪痘病毒属中挑选出的纯化的或者部分纯化的痘病毒，双糖，药物可接受的聚合物和任选的缓冲液，其中聚合物是右旋糖酐，加入量按照上述的，优选量为5-40g/l；或者该制剂由上述组分组成。优选的缓冲液不是磷酸盐缓冲液。优选的痘病毒是纯化的或者部分纯化的病毒。
本文上述(I)，(II)和(III)中使用的术语“组成”指的是制剂只含有上面提到的化合物和制剂除含上述化合物外还含有一种或多种盐。可以加到由上述化合物组成的制剂(I)，(II)和(III)中的盐是KCL，NaCL，谷氨酸钠。因此，上述制剂(I)，(II)和(III)中定义的术语“组成”并不排除加入一种或者多种盐的可能。
作为例子本发明的具体实施方案包括含水制剂，含有从正痘病毒属，副痘病毒属，禽痘病毒属，羊痘病毒属和猪痘病毒属中挑选出的纯化的或者部分纯化的痘病毒，双糖，药物可接受的聚合物和缓冲液，其中，双糖是蔗糖，其量按照前文所述的量，聚合物选右旋糖酐，其量按照前文所述的量。缓冲液不是磷酸盐缓冲液。本发明的其他具体实施方案包括含水制剂，由下述组分组成：从正痘病毒属，副痘病毒属，禽痘病毒属，羊痘病毒属和猪痘病毒属中挑选出的纯化的或者部分纯化的痘病毒，双糖，药物可接受的聚合物和任选的缓冲液。痘病毒优选纯化或者部分纯化的痘病毒。双糖，聚合物和缓冲液的优选例子和加入量正如前文描述的。
医生知道如何给药这些含有痘病毒的制剂尤其含水制剂，并知道接种时使用病毒的量。正如前文指出的，疫苗可能用于对痘病毒本身产生免疫应答，特别是在使用减毒或非致病性非重组痘病时。如果痘病毒是重组痘病毒，还可以增强对痘病毒载体表达的重组蛋白或者多肽的免疫应答。
前文常常使用的术语“制剂”指的是液体制剂，如果没有特殊说明就是指含水制剂。如果浓度或者浓度范围定义以“mM”，“g/l”等为单位，这表明相应的制剂是一种液体乃至含水制剂。术语“含水制剂”涉及其中稀释剂是水的那些制剂。但是，本发明的范围还涉及了那些干燥制剂，不管除去液体的方法，本发明中通过从液体制剂乃至含水制剂中除去液体而得到固体制剂。因此，本发明同样也涉及到那些除了用冷冻干燥方法的其它方法得到的干燥制剂。
特别的是，本发明还涉及制备稳定的含痘病毒组合物的方法，其特征在于本发明的制剂，特别是含水制剂是经过冷冻干燥的。在本申请中，如果不作特殊说明，术语“稳定的含痘病毒的组合物”和“冷冻干燥的含痘病毒的组合物”可以互换使用。在本申请中，术语“稳定的含痘病毒的组合物”用来定义含痘病毒的组合物，其在37℃培养28天，病毒效价的总损失少于0.5logs，优选少于0.40logs。实施例部分给出了测定病毒效价和病毒效价的总丢失的详细方法。然而，也可以使用其它任何一种方法来测定病毒效价。
本领域技术熟练者普遍都知道冷冻干燥方法(Day，J.and McLellan，M.，Methods in Molecular Biology，Humana Press，(1995)vol.38)。
冷冻干燥过程经常包括以下步骤，下面有详细说明：
1.制备疫苗；
2.冷冻样品；
3.初次干燥(升华)；
4.二次干燥(解吸)；
5.密封产品并取出产品
6.贮藏疫苗；
7.重新配制
制备疫苗：上文已经详细阐述了用作疫苗的痘病毒的生产和扩增。任选把痘病毒进行纯化。把上文说明的双糖，聚合物，任选缓冲液，L-谷氨酸和任选的添加剂加到痘病毒制剂中以获得本申请的制剂。
冷冻样品：冷冻样品确实可以使各成分在溶液中得到固定，因此，当减压时，应防止产品起泡沫。冷冻是两步方法，起初是水核晶形成，接下来是冰晶的生长，最后形成冰和溶质浓缩物的混合物。降低温度和搅拌冷却的悬浮液可以增强冰的核晶形成。与核晶形成不同，升高温度以降低悬浮液的粘度可以促进冰的生长。不管多么精密的冷冻形式，冰在整个介质中的增生最终增高了溶质的浓度。由于暴露在这些不断增加的溶质浓度中，溶液或者悬浮液中的生物大分子遭到破坏或者失活。迅速冷却可以使生物产品暴露在浓缩物中的程度降到最低。在临界温度(玻璃化转换温度)以上，物质粘度下降足够大以至于玻璃状物软化且变形。在小瓶内干燥到形成无定形的粘稠残留物。变形的温度叫做崩溃温度。更具体地说，崩溃温度指的是水在基质中的空隙区域流动性很显著的温度。为了避免变形，冷冻温度必须比含水制剂的崩溃温度低。可根据本领域技术熟练者知道的方法如通过差热分析法测定崩溃温度(Jennings，T.A.，″Lyophilization，Introduction and BasicPrinciples″，Interpharm Press，Denver，CO，US，1999，ISBN1-57491-081-7，pages 132-134)。
如果该温度太低，可能会阻止水从病毒中的扩散，并且由于细胞内的冰可能会造成伤害。因此，本领域技术熟练者会用实验测定几个冷冻温度，这些冷冻温度都低于含水制剂的崩溃温度，并且，它们会测定哪个温度会形成具有最高效价感染痘病毒的冷冻干燥产品。
初次干燥(升华)：初次干燥是冷冻干燥方法的一部分，冷冻干燥方法可以使溶剂(冰)从冻结基质中升华。冻干器达到所需的冷凝温度和腔内压力后，初次干燥过程就开始。腔内压力一般都低于1mbar，优选低于0.2mbar。典型的压力范围是0.04-0.12mbar。在全说明书中，这些条件有时称为“低压”。
升高搁板温度直到冰在产品基质中升华，产品温度比制剂的崩溃温度低很多以确保在整个初次干燥过程中形成一个完全的冷冻基质，并确保冷冻干燥时不发生崩溃。在整个初次干燥过程中，温度可能保持不变。也可以在初次干燥过程中，可以连续升高搁板温度。但是，在整个初次干燥过程中，产品的温度必须比崩溃温度低。初次干燥结束后，干燥产品仍然可能包含5％(w/w)以上的水分。为了获得水分含量不再支持生物生长或者化学反应的产品，因此，很有必要进行二次干燥。
二次干燥(解吸)：在二次干燥过程中，水蒸气从初次干燥过程中形成的饼的表面进行解吸。这个可以通过升高温度同时腔内仍然保持低压来实现，保持低压可以使水从饼表面解吸。
二次干燥的搁板温度取决于产品的稳定性，温度范围为0℃-+30℃。产品温度一般在-5℃-30℃。优选温度范围为5℃-20℃。二次干燥分两步进行。第一步，产品温度在-5℃-+15℃，优选0℃-+10℃，更优选2℃-+7℃。第二步的温度比第一步的要高。温度范围为0℃-30℃，优选+5℃-+20℃。同样，制剂中残留水分含量取决于对产品的要求。一些产品需要高些，一些产品需要低些，以获得最好的产品稳定性。用实验测定最佳残留水分含量和达到该水分含量的时间。连续进行二次干燥过程直到获得所需的含水量。本领域技术熟练者知道测定产品含水量的方法。尤其可以使用库仑Karl-Fischer滴定法(Jennings，T.A.，″Lyophilization，Introductionand Basic Principles″，Interpharm Press，Denver，CO，US，1999，ISBN1-57491-081-7，pages 415-418)。残留水分含量低于5％优选，含水量在0.5％-4％更优选，1％-3％最优选。
密封产品并取出产品：按照本领域技术熟练者知道的方法，密封所有含有小瓶的产品。小瓶在冻干器里，可以直接在非常低的压力(如0.04-2.56mbar)下进行密封。也可以在大约常压通过使用化学惰性气体如氮气或者氦气来密封小瓶。典型的是在压力900mbar氮气下密封小瓶。使用丁基橡胶塞子来密封小瓶比较好。一旦产品被密封，系统可以回复至大气压，也可以卸下搁板。
然后，为了长期储藏，小瓶还应该用铝帽再密封一次。
贮藏疫苗：冷冻干燥产品可以在室温(25℃)贮藏并且保持稳定至少18周，在这个温度保持至少20周更优选，保持至少22周最优选。“在一定温度一段时间内保持稳定”意味着在这个温度这段时间病毒效价的损失少于0.5logs。然而，如果冷却是有用的，冷冻干燥产品优选在低温如4℃贮藏。产品优选在暗处贮藏。如果这种条件不可能，优选使用有色玻璃或者其它可以防止光破坏的其它小瓶来贮藏。
重新配制：为了重新配制冷冻干燥产品，需要向其中加入合适量的溶剂以形成药物可接受的剂型，从而可以给人或者动物使用。溶剂优选水。通常，加到制剂中的溶剂量大体上与冷冻干燥过程失去的溶剂量是相等的。
本发明还涉及按照本发明的方法获得的冷冻干燥产品。
因此，本发明的冷冻干燥产品包括(i)接种病毒，优选正痘病毒属或者禽痘病毒属的痘病毒，(ii)双糖，(iii)药物可接受的聚合物和(iv)任选的缓冲液，其中，痘病毒，双糖，聚合物和缓冲液，正如上文说明的。
冷冻干燥产品的典型组成如下表2所示。表2中的所有制剂中，病毒的量为5×108TCID50/ml。
                                        表2
  DSG在含水制剂中的含量[％]冷冻干燥前(DSG：63g/l，右旋糖酐MW36,000-44,000，150g/l，蔗糖，0.36g/l，一水L-谷氨酸钾盐)   20   30   40
  蔗糖在冷冻干燥产品中的含量[％]   54.7(36毫克)   58.7(54毫克)   58.4(72毫克)
  右旋糖酐在冷冻干燥产品中的含量[％]   23(15.12毫克)   24.7(22.68毫克)   24.6(30.24毫克)
  一水L-谷氨酸钾盐在冷冻干燥产品中的含量[％]   0.13(0.0864毫克)   0.14(0.1296毫克)   0.14(0.1728毫克)
  冷冻干燥饼的平均重量[毫克](填充1.2ml)   65.8   92   123.1
本发明的冷冻干燥产品用于制备疫苗。至此，正如上文阐述的，已经溶解或重新配制的冷冻干燥产品，并且根据本领域技术熟练者知道的方法给人或者动物使用。
附图的简要说明
图一表明含MVA的冷冻干燥制剂在温度31℃时的稳定性。实验制剂是GT23(见实例部分和表6)。在冷冻干燥之前，测定本发明含水制剂中的病毒效价。冷冻干燥正如GT23阐述的(见实例部分和表6)进行。冷冻干燥后，制剂在31℃贮藏。在标示时间点，重新配制冷冻干燥制剂并且再次测定病毒效价。
图二和图三表明与图1中图例说明的相同实验的结果，除了培养温度，图二是37℃和图三是45℃以外。
实施例
下列实施例将进一步说明本发明。本领域技术熟练者可以理解，提供的实施例无论如何不说明在某种程度上限定了本发明技术的实用性。
实例1：含改良Ankara牛痘苗病菌株制剂的冷冻干燥
在这个实施例中，本发明中含MVA的制剂在不同条件下进行了冷冻干燥。冷冻干燥产品在不同温度进行贮藏。制剂中MVA的稳定性通过冷冻干燥产品重新配制后测定MVA的效价来进行分析，并且与冷冻干燥前MVA的效价进行比较。测定不同贮藏时间对病毒效价的影响。实例2中给出了测定含MVA的制剂效价的方法。
1.实验设置
疫苗制剂/处方
为了试验本发明的冷冻干燥方法，使用了几种MVA制剂。对于冷冻干燥实验(表6 GT1-4，6-10和13-15行)，使用改良Ankara牛痘苗病菌株。通过在含36％和40％蔗糖缓冲离心来纯化病毒，然后把其悬浮在PH9的1mM Tris缓冲液里。
在冷冻干燥实验GT1-4中(表6)，没有使用任何添加剂。使用的缓冲液系统是PH7.4含140mM NaCL的10mM Tris缓冲液。对于实验GT6(表6)，冷冻干燥采用与实验GT1-4相同的缓冲液系统，却使用了不同的添加剂。
对两种不同的制剂选择不同的添加剂。利用加入稀释缓冲液，把添加剂加入到含病毒的溶液中。所用稀释缓冲液的组成在表3和表4说明。加入稀释缓冲液1(DSG)可以形成本发明的含水制剂。加入稀释缓冲液2(DGG)形成的制剂用作对比分析。
                     表4
  稀释缓冲液2(DGG)   贮备溶液浓度[g/l]
  右旋糖酐(分子量36000-44000)葡萄糖一水L-谷氨酸钾盐   631500.36
                    表3
  稀释缓冲液1(DSG)   贮备液浓度[g/l]
  右旋糖酐(分子量36000-44000)   63
  蔗糖一水L-谷氨酸钾盐   1500.36
在最终制剂中，使用这些不同浓度的稀释缓冲液。稀释缓冲液1(DSG)使用的浓度为16.7％，23％，30％和40％(v/v)，稀释缓冲液2(DGG)的浓度为20％(v/v)。使用生理Tris缓冲液(10mM Tris缓冲液；140mM NaCL；PH7.4)把制剂的TCID50/ml调到5×108TCID50/ml。
冷冻样品
在冻干器(Christ freeze dryer，Type Alpha 2-4)中冷冻样品。对于含有蔗糖的制剂(DSG)，比较不同的冷冻温度(-30℃--45℃)发现，混悬液必须冷冻到-40℃，该个温度低于制剂的崩溃温度，从而得到很好的饼结构。
当在冻干器中冷冻时，3.5小时-4.5小时内就可以达到-40℃(从20℃开始)。
初次干燥
对于含有蔗糖的制剂(DSG)，因为蔗糖的崩溃温度是-31℃，所以可以认为这种制剂的崩溃温度大约为-30℃--37℃。因此，产品温度应该调到-37℃--41℃，以确保形成完全的冷冻基质。使用的压力为0.04mbar和0.12mbar(在水的相图中分别为-50℃和-40℃)。
在初次干燥过程中，升华的动力是产品和冻干机冷凝器之间的温差而产生的压力差。有一条自然定律，就是指随着水温度的下降，水的压力也下降。水的比温度经常与比压有关。把冷凝器的温度设为-83℃--89℃。腔内压力和搁板温度都调到产品的温度。这表明不能很容易把初次干燥过程缩短，因为冷凝器的温度是固定不变的。当升高产品的温度时，制剂的Tc是一个限制因素。
二次干燥
二次干燥的温度取决于产品的稳定性。同样，制剂的残留含水量取决于对产品的要求。一些要求含水量高，一些要求含水量低以使产品最稳定。必需用实验测定最佳残留含水量和达到这个含水量的时间。当产品的温度达到0℃以上时，二次干燥就开始。二次干燥分为两步进行。第一步，调节搁板温度需要几个小时(4小时-7小时)，然后，使产品的温度达到0℃以上(4℃-6℃)。因此，初次干燥后所有可能残留的冰都融化了。通过使用这种温和的条件来进行二次干燥，对产品的损坏将降到最低。然后，通过升高产品的温度到18℃-21℃保持20小时-30小时开始进行第二步的干燥。第二步干燥的时间长短很大程度上取决于所希望的冷冻干燥产品的残留含水量。为了得到不同的残留含水量，可以使用不同的时间。
关于测定冷冻干燥物质的残留含水量的方法，可以使用库仑Karl-Fischer滴定法(Jennings，T.A.，″Lyophilization，Introductionand Basic Principles″，Interpharm Press，Denver，CO，US，1999，ISBN1-57491-081-7，pages 415-418)。
密封产品并取出产品
直接在冻干器中非常低的压力(0.04mbar-2.56mbar)下，对研制过程的所有产品进行密封。使用丁基橡胶塞子来密封小瓶。一旦停止冷冻干燥产品，把系统调到大气压下，并且卸下搁板。然后，用铝帽来密封小瓶进行长期贮藏。
贮藏疫苗
该制剂的一个重要方面就是制备的疫苗贮存稳定。影响制剂稳定性的因素包括残留含水量，密封大气组成和贮藏条件，贮藏条件包括温度，湿度和光照。
研制过程中制备的不同批的产品都在4℃和室温贮藏。而且，几批的产品也在31℃，37℃和45℃贮藏。
所有样品都在暗处贮藏。
重新配制
使用高压灭菌器灭过菌的Milli-Q水，重新配制冷冻干燥样品。更具体地说，使用注射器把1.2ml水加到样品中。通过温和的振摇来混合混悬液。这种再配制只需要几秒钟。测定再配制产品中病毒效价，并与冷冻干燥前的病毒效价进行比较。
加速稳定性实验
在31℃，37℃和45℃，评价了制剂GT23(见表6)的稳定性。对病毒效价进行有定期的测定。图1到图3表示实验结果。
2.实验结果和结论：
使用不同的添加剂或者不使用添加剂对MVA进行了冷冻干燥。
不含添加剂的制剂表明不稳定(见表6)。本文中，当病毒效价损失不高于0.5log时，认为样品是稳定的。因此，术语“在一定温度一段时间保持稳定”指的是在这个温度这段时间内病毒效价的损失小于0.5log。如果在所示温度所示时间段内，病毒效价的损失是0.5log或者大于0.5log，那么，这个制剂“失效”。含有右旋糖酐和葡萄糖的制剂在室温显示非常低的稳定性。含有不同浓度的蔗糖和右旋糖酐的本发明制剂证明是稳定的。本发明的制剂中MVA的稳定性是指在4℃和室温至少保持25周。
表6给出了单个实验的详细信息。6表明不含添加剂的制剂(表6，GT1-4)的稳定性非常差。仅仅几周后，病毒效价就损失了原有起始效价的0.5logs，这是不可以接受的。
由于在冷冻干燥过程中材料的崩溃(没有给出数据)，含20％(v/v)DGG的制剂是不能接受的。这种崩溃是因为葡萄糖的Tc值比较低，使用Tc值高(-11℃)的右旋糖酐后并不能显著的改善这种状况。初次干燥时，使用冷冻干燥设备能达到的最低温度(-45℃)。因此，降低温度至低于葡萄糖的Tc下是不可行的。含有30％(v/v)DGG的制剂不发生崩溃。这种现象可能是由于右旋糖酐较高的总含量，使Tc升高到比初次干燥的温度高的温度。
虽然材料不崩溃，稳定性尤其在室温的稳定性并不令人满意，这可能是因为葡萄糖固体的低Tc值(表6，GT 10)。
大多数实验都使用了稀释缓冲液1(DSG)。这种用添加剂的稳定化作用非常好。因为蔗糖有高的Tc(-31℃)，制剂的崩溃不成问题。冷冻干燥材料的稳定性始终比较好(表6)。在制剂中使用16.7％，20％，23％，28.6％，30％和40％(v/v)DSG，它们之间没有大的差别。所有6种制剂在4℃和室温证明是稳定的。含有30％和40％DSG的冷冻干燥产品具有较好的稳定性。
在加速稳定性实验中，详细分析了其中一种制剂(方法GT 23，见表6)。图1到图3表明实验结果，总结于下表5。
                                   表5
  温度[℃]   效价损失(实验数据)   效价损失0.5logs的天数[天](计算值)
  31   29天损失0.245logs   59
  37   35天损失0.321logs   54
  45   29天损失0.332logs   44
在31℃，疫苗可以贮藏大约1个月并且仍然满足技术要求(病毒效价损失低于0.5log)。但是，甚至在更高温度，也可以贮藏疫苗1个月以上，这特别对热带地区也许有意义。
对于老的天花疫苗，WHO推荐了一种评价稳定性的方法。如果这个疫苗在37℃4周内，病毒效价损失低于1log，那么认为当这个疫苗在4℃贮藏时，至少在1年内是稳定的(使用老疫苗的接受标准是病毒效价损失低于1log)。
正如本发明的制剂GT23所示，它实现了这个标准。
实例2：改良Ankara牛痘苗病菌株(MVA)的滴定
改良Ankara牛痘苗病菌株(MVA)的滴定是基于TCID50的检测法，在96孔板中使用10倍稀释剂进行。
在检测的终点，使用一种抗牛痘苗病毒抗体和一种合适的染色溶液来把感染细胞形象化。
把2-3天的初始CEF(鸡胚胎纤维母细胞)细胞在7％RPMI中稀释到1×105细胞/ml。每次稀释都形成重复8次用的10倍稀释液。随后的稀释，把100μl加到96孔板的每个孔中。
然后，在37℃和5％CO2条件下培养细胞过夜。
使用不含胎牛血清的RPMI，把含病毒溶液的稀释液制成10倍的等级(10-1-10-12合适)。然后，把每个病毒样品100μl加入到含细胞的孔中。把96孔板在37℃和5％CO2下培养5天使感染并且病毒复制。
用牛痘苗病毒特异性抗体感染5天后，对细胞进行染色。为了检测特异性抗体，使用偶合有二级抗体的辣根过氧化物酶(HRP)。MVA的特异性抗体是一种抗牛痘苗病毒抗体，兔多克隆的IgG片段(Quartett，Berlin，Germany&num；9503-2057)。二级抗体是抗兔IgG抗体，HRP偶合的羊多克隆(Promega，Mannheim，Germany，&num；W4011)。根据现有技术进行染色反应。
把那些在染色反应中阳性的含有细胞的每个孔标记为阳性，用来计算TCID50值。
利用公式Spearman[1]和Kaerber[2]计算效价。
因为所有的测定参数都保持恒定，所以，使用下述简化公式：
病毒效价 [ TCID 50 / ml ] = 10 [ a + 1.5 + x a 8 + x b 8 + x c 8 ]
a＝最后列稀释因子，其中，所有8孔都是阳性的
χa＝在a+1列，阳性孔的数量
χb＝在a+2列，阳性孔的数量
χc＝在a+3列，阳性孔的数量
表6：不同冷冻干燥制剂中的痘病毒的稳定性数据
  方法   辅料   冷冻温度   初次干燥   二次干燥  稳定性
  GT1   …   到-30℃   压力：0.37mbar搁板温度：2℃(20小时)   压力：0.37mbar搁板温度：5℃(2.5小时)8℃(1小时)10℃(2小时)  室温和37℃，一周后失效
  GT2   …   到-40℃   压力：0.12mbar产品温度：-13℃(24小时)   压力：2.56mbar产品温度：-4℃(3.5小时)12℃(4小时)  室温和37℃，11天后失效
  GT3   …   到-39℃   压力：0.07mbar产品温度：-16℃(24小时)   压力：0.07mbar产品温度：-1℃(2.75小时)7℃(3.5小时)  室温，23天后失效
  GT4   …   到-45℃   压力：0.04mbar产品温度：-37℃(25.5小时)   压力：0.04mbar产品温度：-3℃(6小时)14℃(26.5小时)  4℃和室温，2周后失效
  GT6   30％DSG   到-44℃   压力：0.04mbar产品温度：-42℃(23小时)   压力：0.04mbar产品温度：5℃(6小时)16℃(25小时)  制剂稳定→4℃，至少34周→室温，至少20周
  GT7   23％DSG   到-44℃   压力：0.04mbar产品温度：-37℃(22.5小时)   压力：0.04mbar产品温度：0℃(7小时)13℃(24小时)  4℃和室温，制剂稳定至少46周
  GT8   16.7％和23％DSG   到-42℃   压力：0.04mbar产品温度：-38℃(24小时)   压力：0.04mbar产品温度：4℃(8小时)17℃(21小时)   4℃和室温，制剂稳定至少45周
  GT9   30％和40％DSG   到-44℃   压力：0.04mbar产品温度：-37℃(25.5小时)   压力：0.04mbar产品温度：4℃(6.5小时)17℃(24小时)   含有30％DSG的制剂：稳定→4℃，至少57周→室温，至少43周含有40％DSG的制剂：4℃和室温，稳定至少43周
  GT10   30％DSG   到-35℃   压力：0.04mbar产品温度：-37℃(23小时)   压力：0.04mbar产品温度：6℃(6.5小时)19℃(24小时)   4℃，制剂稳定42周室温，10周后制剂失效
  GT11   20％DSG   到-45℃   压力：0.04mbar产品温度：-41℃(23小时)   压力：0.04mbar产品温度：5℃(4小时)19℃(25.5小时)   4℃，56周后制剂失效室温，14周后制剂失效
  GT12   30％DSG   到-40℃   压力：0.04mbar产品温度：-37℃(24小时)   压力：0.04mbar产品温度：4℃(6小时)17℃(24小时)   4℃，制剂稳定至少54周25℃，制剂稳定至少40周
  GT13   30％DSG   到-40℃   压力：0.04mbar产品温度：-38℃(19小时)-5℃(9小时)   压力：0.04mbar产品温度：4℃(15.5小时)17℃(26.5小时)   4℃，制剂稳定至少36周
  GT14   30％DSG   到-40℃   压力：0.04mbar产品温度：-38℃(21.5小时)-13℃(17.5小   压力：0.04mbar产品温度：15℃(6.5小时)18℃(26.5小时)   4℃，制剂稳定至少50周25℃，制剂稳定至少19周
  时)
  GT15   30％DSG   到-41℃   压力：0.04mbar产品温度：-37℃(20小时)   压力：0.04mbar产品温度：5℃(3小时)17℃(24.5小时)  4℃，49周后制剂失效25℃，制剂稳定至少18周
  GT23   30％DSG   到-40℃   压力：0.12mbar产品温度：-34℃(21小时)   压力：0.04mbar产品温度：7℃(18小时)17℃(28小时)  数据见→表1-3的加速稳定性实验
                       关于微生物保藏的说明
                           (细则13之二)
                       关于微生物保藏的说明
                           (细则13之二)
Figure C0282467800281
                       关于微生物保藏的说明
                           (细则13之二)

Claims (40)

1.一种制剂，包括：(i)正痘病毒，其病毒效价为每毫克总蛋白至少106TCID50，(ii)双糖，和(iii)药物可接受的聚合物，和(iv)缓冲液，其中缓冲液不是磷酸盐缓冲液。
2.根据权利要求1所述的制剂，其中痘病毒的病毒效价为每毫克总蛋白至少108TCID50。
3.根据权利要求2所述的制剂，其中正痘病毒为牛痘苗病毒，所述牛痘苗病毒选自El stree株和改良牛痘苗病毒Ankara株(MVA)。
4.根据权利要求1所述的制剂，其包括：(i)效价为每毫克总蛋白至少106TCID50的牛痘苗病毒，(ii)双糖，和(iii)药物可接受的聚合物，和(iv)缓冲液，其中缓冲液不是磷酸盐缓冲液。
5.根据权利要求4所述的制剂，其中病毒效价为每毫克总蛋白至少108TCID50。
6.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于痘病毒是重组痘病毒。
7.根据权利要求2所述的制剂，其特征在于痘病毒是重组痘病毒。
8.根据权利要求3所述的制剂，其特征在于痘病毒是重组痘病毒。
9.根据权利要求4所述的制剂，其特征在于痘病毒是重组痘病毒。
10.根据权利要求5所述的制剂，其特征在于痘病毒是重组痘病毒。
11.根据权利要求1-10任一项所述的制剂，其中缓冲液选自TRIS、TBS、MOPS、HEPES、碳酸盐和碳酸氢盐缓冲液。
12.根据权利要求1-10任一项所述的制剂，其特征在于双糖选自蔗糖，乳糖和海藻糖。
13.根据权利要求11所述的制剂，其特征在于双糖选自蔗糖，乳糖和海藻糖。
14.根据权利要求1-10任一项所述的制剂，其特征在于双糖的浓度为10g/l-100g/l。
15.根据权利要求13所述的制剂，其特征在于双糖的浓度为10g/l-100g/l。
16.根据权利要求1-10任一项所述的制剂，其特征在于药物可接受的聚合物选自右旋糖酐和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。
17.根据权利要求11所述的制剂，其特征在于药物可接受的聚合物选自右旋糖酐和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。
18.根据权利要求12所述的制剂，其特征在于药物可接受的聚合物选自右旋糖酐和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。
19.根据权利要求15所述的制剂，其特征在于药物可接受的聚合物选自右旋糖酐和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。
20.根据权利要求16所述的制剂，其特征在于右旋糖酐的分子量是30,000-70,000，浓度是1g/l-50g/l。
21.根据权利要求19所述的制剂，其特征在于右旋糖酐的分子量是30,000-70,000，浓度是1g/l-50g/l。
22.根据权利要求1-10任一项所述的制剂，其特征在于该制剂还包括谷氨酸。
23.根据权利要求12所述的制剂，其特征在于该制剂还包括谷氨酸。
24.根据权利要求21所述的制剂，其特征在于该制剂还包括谷氨酸。
25.根据权利要求1-10任一项所述的制剂，其特征在于该制剂的崩溃温度是-37℃-30℃。
26.根据权利要求14所述的制剂，其特征在于该制剂的崩溃温度是-37℃-30℃。
27.根据权利要求24所述的制剂，其特征在于该制剂的崩溃温度是-37℃-30℃。
28.根据权利要求1-10任一项所述的制剂，其特征在于痘病毒是MVA株或Elstree株，双糖是蔗糖，聚合物是右旋糖酐。
29.根据权利要求12所述的制剂，其特征在于痘病毒是MVA株或Elstree株，双糖是蔗糖，聚合物是右旋糖酐。
30.根据权利要求27所述的制剂，其特征在于痘病毒是MVA株或Elstree株，双糖是蔗糖，聚合物是右旋糖酐。
31.作为疫苗的根据权利要求1-30任一项所述的制剂。
32.根据权利要求1-30任一项所述的制剂在制备疫苗中的用途。
33.制备稳定的含有牛痘苗病毒的组合物的方法，其特征在于将权利要求1-30任一项所述的制剂冷冻干燥。
34.根据权利要求33所述的方法，其中冷冻干燥包括以下步骤：
(1)冷冻权利要求1-30任一项所述的制剂至温度比该制剂的崩溃温度低，得到冷冻产品基质。
(2)在低压和产品温度下，把冷冻制剂进行初次干燥，使产品基质中的冰升华，其中产品温度比制剂的崩溃温度低。
(3)在低压和产品温度0℃-30℃下进行二次干燥，直到产品的残留水含量低于5％。
35.冷冻干燥产品，包括(i)痘病毒，(ii)双糖，(iii)药物可接受的聚合物和(iv)缓冲液，其中痘病毒，双糖，聚合物和缓冲液如权利要求1-13，16-19和21-24任一项所述。
36.权利要求33所述方法得到的冷冻干燥产品，其中用于冷冻干燥的制剂包括如权利要求14或15中所述浓度的双糖和/或具有权利要求20或21中所述分子量和浓度的右旋糖酐。
37.权利要求34所述方法得到的冷冻干燥产品，其中用于冷冻干燥的制剂包括如权利要求14或15中所述浓度的双糖和/或具有权利要求20或21中所述分子量和浓度的右旋糖酐。
38.根据权利要求35-37任一项所述的冷冻干燥产品，其特征在于其残留水含量为1％-3％。
39.根据权利要求35-37任一项所述的冷冻干燥产品用于制备疫苗的用途。
40.根据权利要求35-37任一项所述的冷冻干燥产品重新配制的方法，其特征在于将该产品溶解在适量的药物可接受的溶剂中。
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