DE60205388T2

DE60205388T2 - Poxvirus-enthaltende zusammensetzungen und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE60205388T2
Application number: DE60205388T
Authority: DE
Inventors: Paul Howley; Karl Heller; Ingmar Räthe
Original assignee: Bavarian Nordic AS
Current assignee: Bavarian Nordic AS
Priority date: 2001-12-10
Filing date: 2002-11-28
Publication date: 2006-03-30
Anticipated expiration: 2022-11-29
Also published as: CA2467365A1; KR20040074067A; IL161590A0; WO2003053463A2; CA2467365C; PL213326B1; PL369954A1; UA78738C2; JP4439263B2; DK1418942T3; CN1296096C; AU2002361962A1; US7094412B2; EP1418942A2; CN1602205A; HK1071295A1; HUP0402179A2; DE60205388D1; IL161590A; EP1418942B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Formulierung, insbesondere eine wäßrige Formulierung, umfassend (i) ein Poxvirus der Gattungen Orthopoxvirus, Avipoxvirus, Parapoxvirus, Capripoxvirus und Suipoxvirus, (ii) ein Disaccharid, (iii) ein pharmazeutisch unbedenkliches Polymer und gegebenenfalls (iv) einen Puffer. Die wäßrige Formulierung eignet sich insbesondere für Gefriertrocknungsprozesse, wobei eine stabile, gefriergetrocknete, poxvirushaltige Zusammensetzung erhalten wird. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung einer gefriergetrockneten, poxvirushaltigen Zusammensetzung sowie das so erhaltene Produkt.
Technischer Hintergrund der Erfindung
Die Poxviridae umfassen eine große Familie komplexer DNA-Viren, die im Zytoplasma von Vertebraten- und Invertebratenzellen replizieren. Die weitaus wichtigste Poxvirusinfektion beim Menschen war die Pockenkrankheit. Das verursachende Agens der Pockenkrankheit ist das Variolavirus, ein Mitglied der Gattung Orthopoxvirus. Das Vaccinia-Virus, bei dem es sich ebenso um ein Mitglied der Gattung Orthopoxvirus innerhalb der Familie Poxviridae handelt, wurde als Lebendimpfstoff zur Immunisierung gegen die Pockenkrankheit verwendet. Die erfolgreiche weltweite Impfung mit Vaccinia-Virus fand ihren Höhepunkt in der Ausrottung des Variolavirus („The global eradication of smallpox. Final report of the global commission for the certification of smallpox eradication"; History of Public Health, Nr. 4, Genf: Weltgesundheitsorganisation, 1980). Mittlerweile wurden die meisten Bestände an infektiösen Variolaviren vernichtet. Es läßt sich jedoch nicht ausschließen, daß die Pockenkrankheit oder ähnliche Erkrankungen induzierende Poxviren wieder zu einem größeren Gesundheitsproblem werden könnten. Somit ist es notwendig, dazu in der Lage zu sein, stabile Impfstoffe gegen Poxvirusinfektionen, insbesondere Variolainfektionen, wie beispielsweise auf Vaccinia-Virus basierende Impfstoffe, herzustellen.
In der Vergangenheit wurden Vaccinia-Viren auch dazu verwendet, virale Vektoren für die rekombinante Genexpression und eine mögliche Verwendung als rekombinante Lebendimpfstoffe gentechnisch herzustellen (Mackett, M., Smith, G. L. und Moss, B. [1982] P. N. A. S. USA 79, 7415–7419; Smith, G. L., Mackett, M. und Moss, B. [1984] Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 2, 383–407). Dabei werden unter anderem DNA-Sequenzen (Gene), die für Fremdantigene codieren, mit Hilfe von DNA-Rekombinationstechniken in das Genom der Vaccinia-Viren eingeführt. Wird das Gen an einer Stelle in der Virus-DNA, die für den Lebenszyklus des Virus nicht wesentlich ist, integriert, besteht die Möglichkeit, daß die neu produzierten rekombinanten Vaccinia-Viren infektiös sind, d.h. das Virus ist imstande, fremde Zellen zu infizieren und somit die integrierte DNA-Sequenz zu exprimieren ( EP 83286 und EP 110385 ). Die auf diese Weise hergestellten rekombinanten Vaccinia-Viren lassen sich einerseits als Lebendimpfstoffe zur Vorbeugung von Infektionskrankheiten und andererseits zur Herstellung heterologer Proteine in eukaryontischen Zellen verwenden. Zu weiteren Beispielen für rekombinante Vaccinia-Viren zählen Viren, die therapeutische Gene, wie beispielsweise Suizidgene, Ribozymgene oder Antisense-Gene, tragen.
Das modifizierte Vaccinia-Virus Ankara (MVA) ist dafür bekannt, daß es außergewöhnlich sicher ist. MVA wurde durch Langzeitpassagierungsreihen des Vaccinia-Virus-Stamms Ankara (CVA) auf Hühnerembryofibroblasten erzeugt (für eine Übersicht siehe Mayr, A., Hochstein-Mintzel, V. und Stickl, H. [1975] Infection 3, 6–14; Schweizer Patent Nr. 568, 392). Beispiele für gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags hinterlegte MVA-Virusstämme sind die Stämme MVA 572, hinterlegt bei der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Salisbury (UK) unter der Hinterlegungsnummer ECACC V94012707, MVA 575, hinterlegt unter ECACC V00120707, sowie MVA-BN mit der Hinterlegungsnummer ECACC V00083008.
MVA zeichnet sich durch seine starke Abschwächung, das heißt durch verminderte Virulenz oder Infektiosität, unter Beibehaltung einer guten Immunogenität aus. Das MVA-Virus wurde zur Bestimmung von Änderungen im Genom relativ zum CVA-Wildtypstamm analysiert. Dabei wurden sechs größere Deletionen genomischer DNA (Deletion I, II, III, IV, V und VI) mit insgesamt 31000 Basenpaaren identifiziert (Meyer, H., Sutter, G. und Mayr, A. [1991] J. Gen. Virol. 72, 1031–1038). Das daraus resultierende MVA-Virus war hinsichtlich der Wirtszelle stark eingeschränkt und auf Vogelzellen beschränkt. MVA ist weiterhin durch seine extreme Abschwächung gekennzeichnet. Beim Testen in verschiedenen Tiermodellen stellte sich das MVA selbst in immunsupprimierten Tieren als avirulent heraus. Wichtiger ist, daß die ausgezeichneten Eigenschaften des MVA-Stamms in umfangreichen klinischen Tests demonstriert werden konnten (Mayr et al., Zbl. Bakt. Hyg. I, Abt. Org. B 167, 375–390 [1987], Stickl et al., Dtsch. med. Wschr. 99, 2386–2392 [1974]). Während dieser Untersuchungen an über 120000 Menschen, einschließlich Hochrisikopatienten, traten keine Nebenwirkungen in Zusammenhang mit der Verwendung des MVA-Impfstoffs auf. Es wurden bereits als Impfstoffe geeignete rekombinante MVA konstruiert (siehe z.B. WO 97/02355), die in klinischen Tests verwendet werden. Aus der WO 98/13500 ist ein rekombinantes MVA bekannt, das für Denguevirus-Antigene codierende DNA-Sequenzen enthält und diese exprimieren kann. Die Fremd-DNA-Sequenzen wurden in die Virus-DNA an der Stelle einer natürlich vorkommenden Deletion im MVA-Genom rekombiniert.
Ein MVA-Stamm, der eine noch stärkere Abschwächung sowie verbesserte Sicherheitseigenschaften zeigt, ist der bei der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Salisbury, UK, unter der Hinterlegungsnummer V00083008 hinterlegte Stamm MVA-BN.
Neben Vaccinia-Virus wurden andere Poxviren als Vektoren zur Zuführung genetischer Informationen in Säugerzellen verwendet. In diesem Zusammenhang wird auf Avipoxviren, wie beispielsweise das Geflügelpockenvirus, verwiesen. Aus der US 5,736,368 und der US 6,051,410 sind Geflügelpockenviren bekannt, deren Genom HIV-Gene enthält.
Verfahren zur Herstellung von als Impfstoffe geeigneten poxvirushaltigen Zusammensetzungen sind dem Fachmann bekannt (siehe beispielsweise Joklik, W. K., Virology (1962), 18, 9–18; Richter, K. H., Abhandlungen aus dem Bundesgesundheitsamt (1970), 9, 53–57). Die bekannte Aufreinigung führt zu wäßrigen, poxvirushaltigen Lösungen oder zu poxvirushaltigen Sedimenten. Die Poxviren in diesen Lösungen bzw. Sedimenten sind nicht stabil, d.h. die Infektiosität der Viren nimmt rasch ab. Es ist jedoch notwendig, daß sich ein Impfstoff in stabilisierter Form lagern und verteilen läßt, vor allem, wenn die Impfstoffe in Tropenregionen mit begrenzter Verteilungsinfrastruktur transportiert werden müssen. Ein gefriergetrocknetes Produkt läßt sich bei Temperaturen im Bereich von 4°C bis 25°C lagern. Dies ist, verglichen mit den Standardlagerungsbedingungen für Flüssigformulierungen, die unterhalb –20°C gelagert werden müssen, ein deutlicher Vorteil („Cryopreservation and freeze-drying protocols", Day, J., McLellan, M.; Methods in Molecular Biology, 38, 1995, Humana Press).
Verfahren zur Gefriertrocknung von Poxviren, insbesondere Vaccinia-Virus, sowie für diesen Zweck geeignete virushaltige Zusammensetzungen und Lösungen sind bekannt (Burke et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems (1999), 16, 1–83). Allgemein gesagt wird beim Gefriertrocknen eines Impfstoffs die zur Gefriertrocknung geeignete impfstoffhaltige wäßrige Formulierung gefroren und anschließend Wasser durch Sublimierung unter Bedingungen mit vermindertem Druck und niedrigen Temperaturen und daran anschließend durch Desorption unter Bedingungen mit vermindertem Druck und höheren Temperaturen entfernt.
Die bekannten poxvirushaltigen Formulierungen zur Gefriertrocknung weisen bedeutende Nachteile auf. Viele der Vaccinia-Virus-haltigen Zusammensetzungen zur Gefriertrocknung enthalten Pepton oder Haemaccel, die häufig tierischen Ursprungs sind. Es gibt jedoch Bedenken, daß Tierkrankheiten, wie etwa BSE, über tierische Produkte, wie z.B. Pepton, Gelatine oder Haemaccel, vom Tier auf den Menschen übertragen werden könnten. Zudem wurden die Poxviren in den bekannten virushaltigen Formulierungen zur Gefriertrocknung nicht aufgereinigt. Somit enthalten die im Stand der Technik bekannten poxvirushaltigen Formulierungen zur Gefriertrocknung unter anderem große Mengen an aus den Zellen des Zell- oder Gewebekultursystems bzw. aus dem während der Zellkultivierung verwendeten Rinderserum stammenden Proteinen.
Dem Fachmann sind ebenso Gefriertrocknungszusammensetzungen bekannt, die keine zusätzlichen Verbindungen tierischen Ursprungs (bei denen es sich z.B. um Pepton oder Haemaccel handelt) enthalten. In diesem Fall enthalten die Zusammensetzungen die folgenden Verbindungen allein oder in bestimmten Kombinationen: Natriumglutamat, Sorbit, Lactose, Salze, Aminosäuren und Glycerin. Allerdings ist das nach dem Gefriertrocknungsprozeß erhaltene Produkt häufig ziemlich instabil, d.h. der Gesamtverlust an Virustiter während der Lagerung ist unzumutbar hoch. Zudem konnte gezeigt werden, daß das Poxvirus in einigen dieser Formulierungen zur Aggregatbildung neigt und daß andere Verbindungen vor oder während des Einfrierens ausfallen.
Aus der US 3,577,526 sowie der FR 7.773 M ist ein Pockenimpfstoff bekannt, der dadurch gekennzeichnet ist, daß er sich aus einem in Saccharose dispergierten zerkleinerten Virusmaterial des Impfstoffs zusammensetzt. Die Menge an Saccharose liegt im Bereich von 20 bis 40%. Die Formulierung kann ferner 5% Dextran enthalten. Der Ausdruck zerkleinertes Virus bezieht sich auf aus Pulpagewebe und Pusteln stammendes Virus. Im wesentlichen wird dabei die Lymphe zerkleinert, um Klümpchen aufzubrechen und die Flüssigkeit von toten Haaren und Haut zu trennen. Somit ist die Impfstoffpräparation sehr stark mit Protein beladen, was zur Stabilisierung des Virus beiträgt.
Aus der US 6,258,362 B1 ist eine in wäßriger Lösung dispergierbare stabilisierte getrocknete pharmazeutische Zusammensetzung bekannt, die (i) ein Virus, vorzugsweise ein Herpesvirus, (ii) ein Polysaccharid, (iii) einen Puffer und (iv) ein Mono- oder Oligosaccharid oder Derivat davon umfaßt.
Aufgabe der Erfindung
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung einer poxvirushaltigen Formulierung, insbesondere einer wäßrigen poxvirushaltigen Formulierung, zur Gefriertrocknung, die zu einem stabilen gefriergetrockneten Produkt führt, wobei es sich bei dem Poxvirus vorzugsweise um ein gereinigtes oder wenigstens teilgereinigtes Virus handelt. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung einer wäßrigen poxvirushaltigen Formulierung, in der die Poxviren nicht zur Aggregation neigen und in der die Komponenten nicht vor oder während des Einfrierens ausfallen. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung einer poxvirushaltigen Formulierung, insbesondere einer wäßrigen poxvirushaltigen Formulierung, die geringe Mengen an nicht mit Poxvirus assoziierten Proteinen umfaßt. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung einer stabilen, gefriergetrockneten, poxvirushaltigen Zusammensetzung sowie eines Verfahrens zur Gewinnung der Zusammensetzung.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Durch die vorliegende Erfindung wird eine poxvirushaltige Formulierung, insbesondere eine wäßrige poxvirushaltige Formulierung, bereitgestellt. Die Formulierung, insbesondere die wäßrige Formulierung, kann sich zum Gefriertrocknen des Poxvirus eignen. Weiterhin wird durch die Erfindung das gefriergetrocknete, poxvirushaltige Produkt bereitgestellt. Die erfindungsgemäße Formulierung, insbesondere die wäßrige Formulierung, umfaßt das Poxvirus, ein Disaccharid, ein pharmazeutisch unbedenkliches Polymer und einen Puffer, wobei es sich bei letzterem nicht um einen Phosphatpuffer handelt. Obwohl die erfindungsgemäße gefriergetrocknete Formulierung weder stabilisierende Zusatzstoffe tierischen Ursprungs, wie beispielsweise Pepton, Gelatine, Haemaccel, noch große Mengen an aus dem zur Amplifikation des Virus verwendeten System (wie z.B. Zellkultursystemen) stammenden Proteinen enthält, ist das Virus in der Formulierung überraschend stabil, d.h. das Poxvirus in der gefriergetrockneten Zusammensetzung bleibt über lange Zeiträume infektiös, selbst bei hohen Lagertemperaturen, wie etwa Raumtemperatur oder 37°C.
Falls nicht anders angegeben, entspricht der Begriff „Raumtemperatur", wie er in der vorliegenden Beschreibung verwendet wird, einer Temperatur von 20 bis 25°C.
Bei dem in der erfindungsgemäßen Formulierung zu gefriertrocknenden Poxvirus handelt es sich um Vaccinia-Virus. Weitere Poxviren sind alle aus der Gruppe bestehend aus Orthopoxviren, Parapoxviren, Avipoxviren, Capripoxviren und Suipoxviren ausgewählte Poxviren. Diese Viren könnten sich als Impfstoff für Menschen oder Tiere eignen (Virology, 3. Auflage, 1995, Herausgeber: Fields, B. N.). Zur Gattung Avipoxvirus gehörende Poxviren sind beispielsweise das Kanarienvogelpockenvirus und das Geflügelpockenvirus. Zur Familie Orthopoxvirus gehören beispielsweise das Kuhpockenvirus und das Vaccinia-Virus.
Bei dem in der erfindungsgemäßen Formulierung enthaltenen Poxvirus kann es sich um ein natürlich vorkommendes Poxvirus, ein abgeschwächtes Poxvirus oder ein rekombinantes Poxvirus handeln.
Für die Impfung von Menschen gegen Pockenkrankheit handelt es sich bei dem Poxvirus in der Formulierung vorzugsweise um einen Vaccinia-Virusstamm. Für diesen Zweck geeignete Vaccinia-Virusstämme sind beispielsweise die Stämme Temple of Heaven, Copenhagen, Paris, Budapest, Dairen, Gam, MRIVP, Per, Tashkent, TBK, Tom, Bern, Patwadangar, BIEM, B-15, Lister, EM-63, New York City Board of Health, Elstree, Ikeda und WR. Die am stärksten bevorzugten Vaccinia-Virusstämme sind das modifizierte Vaccinia-Virus Ankara (MVA) und seine Derivate, insbesondere der bei der ECACC unter der Hinterlegungsnummer V00083008 hinterlegte Stamm und der Stamm Elstree.
Bei dem Poxvirus in der erfindungsgemäßen Formulierung handelt es sich vorzugsweise um ein Poxvirus, das in dem zu impfenden Tier oder Individuum im wesentlichen apathogen ist. Es ist bevorzugt, für diesen Zweck entweder abgeschwächte Virusstämme oder ein Poxvirus, das natürlicherweise in einer von der zu impfenden Spezies verschiedenen Wirtsspezies repliziert und in dem heterologen Wirt nicht pathogen ist, einzusetzen.
Bei einem „abgeschwächten Virus" handelt es sich um ein von einem pathogenen Virus abstammendes Virus, das jedoch bei einer Infektion des Wirtsorganismus im Vergleich mit dem nicht abgeschwächten Ausgangsvirus zu einer geringeren Mortalität und/oder Morbidität führt. Beispiele für abgeschwächte Poxviren sind dem Fachmann bekannt. Dabei ist das modifizierte Vaccinia-Virus Ankara (MVA) am stärksten bevorzugt. Typische MVA-Stämme sind die bei der European Collection of Animal Cell Cultures unter den Hinterlegungsnummern ECACC V00120707 bzw. ECACC V94012707 hinterlegten Stämme MVA 575 und MVA 572. Am stärksten bevorzugt ist das in der WO 02/42480 (PCT/EP01/13628) beschriebene MVA-BN oder ein Derivat davon. MVA-BN wurde bei der European Collection of Animal Cell Cultures unter der Hinterlegungsnummer ECACC V00083008 hinterlegt.
Poxviren, für die Menschen heterologe Wirte darstellen und die beim Menschen nicht krankheitsverursachend sind, sind beispielsweise das Geflügelpockenvirus bzw. das Kanarienvogelpockenvirus.
Der Begriff „rekombinantes Virus" bezieht sich auf alle Viren, in deren Virusgenom ein heterologes Gen, das nicht natürlicherweise Teil des Virusgenoms ist, inseriert wurde. Bei einem heterologen Gen kann es sich um ein therapeutisches Gen, ein für ein mindestens ein Epitop zur Induktion einer Immunantwort umfassendes Peptid codierendes Gen, eine Antisense-Expressionskassette oder ein Ribozymgen handeln. Verfahren zur Konstruktion rekombinanter Viren sind dem Fachmann bekannt. Als Poxvirusvektor am stärksten bevorzugt ist MVA, insbesondere MVA 575 und MVA-BN (siehe oben).
Dem Fachmann ist bekannt, wie sich Poxviren amplifizieren und aus infizierten Zellkulturen gewinnen lassen. Im allgemeinen werden in einem ersten Schritt eukaryontische Zellen mit dem Poxvirus, das als Teil der erfindungsgemäßen Formulierung vorgesehen ist, infiziert. Dabei handelt es sich bei den eukaryontischen Zellen um Zellen, die für eine Infektion mit dem jeweiligen Poxvirus empfänglich sind und die Replikation und Produktion von infektiösem Virus gestatten. Für alle Poxviren sind derartige Zellen dem Fachmann bekannt. Ein Beispiel für diese Art von Zellen sind für MVA die Hühnerembryofibroblasten (CEF [= chicken embryo fibroblasts]) (Drexler, I. et al, J. Gen. Virol. (1998), 79, 347–352). CEF-Zellen lassen sich unter dem Fachmann bekannten Bedingungen kultivieren. Vorzugsweise werden die CEF-Zellen in serumfreiem Medium kultiviert. Die Inkubationszeit beträgt vorzugsweise 48 bis 96 Stunden bei 37°C ± 2°C. Zur Infektion werden die Poxviren mit einer MOI [= multiplicity of infection] von 0,05 bis 1 TCID₅₀ (TCID = tissue culture infectious dose) eingesetzt, wobei die Inkubation 48 bis 72 Stunden lang bei der gleichen Temperatur erfolgt.
Das Fortschreiten der Infektion läßt sich über das Betrachten zytopathischer Effekte (CPE), typischerweise einer signifikanten Abrundung der infizierten Zellen, verfolgen.
Bekanntlich existieren Poxviren in zwei unterschiedlichen Formen: im Zytoplasma der infizierten Zellen an Zellmembranen gebundenes Poxvirus (intrazelluläre reife Virionen (intracellular mature virions, IMV)) sowie Viren, die externalisiert wurden (extrazelluläre umhüllte Virionen (extracellular enveloped virions, EEV)) (Vanderplasschen, A. et al., J. Gen. Virol. (1998), 79, 877–887). Beide Virusformen können in den erfindungsgemäßen Formulierungen verwendet werden. Die EEVs lassen sich einfach durch Zentrifugation aus dem Überstand gewinnen und können direkt in einer ein Disaccharid sowie ein pharmazeutisch unbedenkliches Polymer umfassenden wäßrigen Formulierung suspendiert werden. Die virushaltigen Fraktionen können allerdings Zelltrümmer und andere Verunreinigungen umfassen. Somit ist vor allem bei der Impfung von Menschen bevorzugt, daß das Virus vor seiner Aufnahme in eine erfindungsgemäße Formulierung weiter aufgereinigt wird. Verfahren zur Aufreinigung von Poxviren sind dem Fachmann bekannt. Bei dem Aufreinigungsschritt kann es sich beispielsweise um eine diskontinuierliche Zentrifugation (z.B. unter Verwendung von Saccharosekissen) oder Ultrazentrifugation mit kontinuierlichem Fluß (Saccharosegradienten), Ultrafiltration (z.B. Querstromfiltration unter Verwendung einer Membran mit einer Porengröße von mehr als 500 kDa, aber gleich oder kleiner als 0,1 μm), Säulenchromatographie (z.B. Ionenaustausch, hydrophobe Wechselwirkung, Größenausschluß oder eine Kombination) oder eine Kombination aus einigen oder allen oben aufgeführten Verfahren handeln (Masuda, N. et al., J. Bacteriol. (1981) 147, 1095–1104).
Zur Gewinnung der IMVs müssen die Zellen in einem ersten Schritt geerntet und in einem zweiten Schritt aufgeschlossen werden. Falls es sich bei den infizierten Zellen um Zellen handelt, die in Suspensionskultur kultiviert werden können, so lassen sich die infizierten Zellen leicht durch Zentrifugation ernten. Falls es sich bei den infizierten Zellen um mehr oder weniger intakte adhärente Zellen handelt, besteht die Möglichkeit, die Zellen zu ernten, d.h. die Zellen dem Kulturfläschchen zu entnehmen, bevor sie dem Aufschlußschritt unterzogen werden. Ernteverfahren sind dem Fachmann bekannt. Als Techniken geeignet sind mechanische Verfahren (z.B. unter Verwendung eines Gummizellschabers), physikalische Verfahren (z.B. Einfrieren der Kulturgefäße unterhalb von –15°C und Auftauen derselben oberhalb von +15°C) oder biochemische Verfahren (Behandlung mit Enzymen, z.B. Trypsin, um die Zellen von dem Kulturgefäß abzulösen). Falls Enzyme für diesen Zweck verwendet werden, so sollte die Inkubationszeit kontrolliert werden, da die Enzyme nach langen Inkubationszeiten das Virus auch schädigen könnten.
Verfahren zum Aufschluß von Zellen sind dem Fachmann ebenso bekannt. Das oben beschriebene Verfahren aus Einfrieren und Auftauen führt bereits zu einem Teilaufschluß der Zellen. Zu weiteren bekannten Techniken zum Aufschluß von Zellen gehört die Verwendung von Ultraschall. Die Ultraschallbehandlung von Zellen ergibt ein virushaltiges Homogenisat.
Zur Impfung von Tieren könnte das poxvirushaltige Homogenisat in den erfindungsgemäßen Formulierungen verwendet werden. Es ist allerdings wiederum bevorzugt, Poxviren zu verwenden, die wenigstens teilweise aufgereinigt wurden. Wie oben umrissen, sind derartige Aufreinigungsverfahren dem Fachmann bekannt.
Die Poxviren sind in einem Konzentrationsbereich von 10⁴ bis 10⁹ TCID₅₀/ml, vorzugsweise in einem Konzentrationsbereich von beispielsweise 10⁵ bis 5 × 10⁸ TCID₅₀/ml, am stärksten bevorzugt in einem Konzentrationsbereich von beispielsweise 10⁶ bis 10⁸ TCID₅₀/ml, in der Formulierung, insbesondere in der wäßrigen Formulierung, enthalten. Die tatsächliche Konzentration hängt von der an den Menschen oder das Tier zu verabreichenden Virusmenge ab, die wiederum von der Art des zu verabreichenden Virus abhängt. Bei dem Vaccinia-Virusstamm Elstree umfaßt eine typische Impfdosis für Menschen 2,5 × 10⁵ TCID₅₀. Bei dem Vaccinia-Virusstamm MVA-BN umfaßt eine typische Impfdosis für Menschen 1 × 10⁸ TCID₅₀.
Bei dem Poxvirus in der erfindungsgemäßen Formulierung handelt es sich um ein gereinigtes oder wenigstens teilgereinigtes Virus. Der Begriff „gereinigtes oder wenigstens teilgereinigtes Virus" bezieht sich darauf, daß das in der erfindungsgemäßen Formulierung verwendete Virus eine höhere Reinheit aufweist als das ungereinigte Virus („zerkleinerte Virus"), wie es in den bis zur Ausrottung der Pockenkrankheit verwendeten Impfstoffen (wie beispielsweise aus der US 3,577,526 bekannt) verwendet wurde. Eine solche höhere Reinheit läßt sich beispielsweise mit einem oder mehreren der folgenden Verfahren erreichen: diskontinuierliche Zentrifugation (z.B. unter Verwendung von Saccharosekissen) oder Ultrazentrifugation mit kontinuierlichem Fluß (Saccharosegradienten), Ultrafiltration (z.B. Querstromfiltration unter Verwendung einer Membran mit einer Porengröße von mehr als 500 kDa, aber gleich oder kleiner als 0,1 μm), Säulenchromatographie (z.B. Ionenaustausch, hydrophobe Wechselwirkung, Größenausschluß oder eine Kombination). Besonders bevorzugt ist die Ultrafiltration und/oder die diskontinuierliche Zentrifugation unter Verwendung von Saccharosekissen. Allgemeiner ausgedrückt bezieht sich der Begriff „gereinigtes oder wenigstens teilgereinigtes Virus" auf Viruspräparationen (wie z.B. MVA oder Elstree umfassende Präparationen) mit einem Titer von mindestens 10⁶, vorzugsweise von mindestens 10⁷, stärker bevorzugt von mindestens 10⁸, noch stärker bevorzugt von mindestens 5 × 10⁸ TCID₅₀ pro mg Gesamtprotein. Bei dem Stamm Elstree weisen typische Präparationen einen Titer von 8 × 10⁸ TCID₅₀ pro mg Gesamtprotein auf. Verfahren dazu, wie man den Titer einer poxvirushaltigen Präparation bestimmt, sind dem Fachmann bekannt; eines dieser Verfahren ist im Beispielteil umrissen. Der Gesamtproteingehalt wird vorzugsweise nach dem Verfahren von Kjeldahl bestimmt (Lynch, J. M. und Barbano, D. M., „Kjeldahl nitrogen analysis as a reference method for protein determination in dairy products". J. AOAC Int. 1999 Nov./Dez.; 82(6): 1389–98. Review). Es sollte dabei zur Kenntnis genommen werden, daß es sich bei dem Gesamtproteingehalt um die Summe aus Virus- und Zellproteinen handelt.
Daß eine ein gereinigtes oder wenigstens teilgereinigtes Virus, ein Disaccharid und ein pharmazeutisch aktives Polymer umfassende Formulierung stabil ist, kam unerwartet, da anzunehmen war, daß die großen Mengen an Nichtvirusprotein in den ungereinigten Viruspräparationen zur Stabilität der Formulierungen des Standes der Technik beitrugen.
Die erfindungsgemäße Formulierung, insbesondere die wäßrige Formulierung, umfaßt ein Disaccharid. Es konnte gezeigt werden, daß im Gegensatz zu Monosacchariden, wie beispielsweise Glucose, die während des Einfrierens/Auftauens einen guten Bioschutz geben, jedoch eine niedrige Kollaps-Temperatur aufweisen und häufig unter Kollaps gefriertrocknen, Disaccharide wirksame Schutzmittel bei der Gefriertrocknung sind, die eine höhere Kollaps-Temperatur als Monosaccharide zeigen.
Bei den in den erfindungsgemäßen Formulierungen enthaltenen Disacchariden handelt es sich um pharmazeutisch unbedenkliche Disaccharide mit einer Kollaps-Temperatur (Tc) in einem Bereich von etwa –25°C bis –35°C. Typische Kollaps-Temperaturen sind –31°C für Saccharose, –28,5°C für Trehalose und –30,5°C für Lactose. Typische Kollaps-Temperaturen für die gesamte erfindungsgemäße Formulierung liegen vorzugsweise im Bereich von –50°C bis –20°C. Bevorzugte Teilbereiche sind beispielsweise –37°C bis –30°C, –36°C bis –31°C oder –35,7°C bis –31,2°C.
Vorzugsweise ist das Disaccharid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Trehalose, Lactose und Saccharose. Am stärksten bevorzugt ist Saccharose. Das Disaccharid, vorzugsweise Saccharose, ist vorzugsweise in einem Konzentrationsbereich von 10–100 g/l, stärker bevorzugt in einem Bereich von 20–80 g/l, am stärksten bevorzugt in einem Bereich von 25–60 g/l, in der erfindungsgemäßen Formulierung, insbesondere der wäßrigen Formulierung, enthalten. Eine für Saccharose typische Konzentration ist 45 g/l.
Die erfindungsgemäße Formulierung, insbesondere die wäßrige Formulierung, umfaßt ferner ein pharmazeutisch unbedenkliches Polymer. Das Polymer ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Dextran und Polyvinylpyrrolidon (PVP). Das verwendete Polymer muß in der erfindungsgemäßen Formulierung löslich sein. Falls Dextran verwendet wird, so liegt dessen Molekulargewicht vorzugsweise im Bereich von 20000 bis 100000, stärker bevorzugt im Bereich von 30000 bis 70000, am stärksten bevorzugt im Bereich von 36000 bis 44000. Das am stärksten bevorzugte Dextran weist ein durchschnittliches Molekulargewicht von 40000 auf. Die Dextrankonzentration liegt im Bereich von 1 bis 50 g/l, vorzugsweise in einem Bereich von 2 bis 40 g/l oder 3 bis 30 g/l. Besonders gute Ergebnisse wurden bei den Bereichen von 5 bis 50 g/l, 5 bis 40 g/l bzw. 5 bis 30 g/l beobachtet. Noch stärker bevorzugt ist der Bereich von 8 bis 30 g/l. Der am stärksten bevorzugte Bereich ist 10 bis 27 g/l. Eine bevorzugte Konzentration ist beispielsweise 18,9 g/l. Die bevorzugten Konzentrationen und Konzentrationsbereiche für Dextran, wie sie oben aufgeführt sind, insbesondere der Bereich von 5 bis 50 g/l und die entsprechenden Teilbereiche, weisen den besonderen Vorteil auf, daß die Kollaps-Temperatur der Formulierung relativ hoch ist, wodurch es möglich ist, das Verfahren im Großmaßstab durchzuführen. Falls PVP verwendet wird, so liegt dessen Molekulargewicht vorzugsweise im Bereich von 50000 bis 400000, stärker bevorzugt in einem Bereich von 70000 bis 360000. Die PVP-Konzentration liegt im Bereich von 5 bis 200 g/l, stärker bevorzugt in einem Bereich von 5 bis 100 g/l, am stärksten bevorzugt in einem Bereich von 10 bis 40 g/l.
Die erfindungsgemäße Formulierung, insbesondere die wäßrige Formulierung, umfaßt ferner einen Puffer. Wie oben erläutert, bestand eine der Aufgaben der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung einer wäßrigen poxvirushaltigen Formulierung, in der die Poxviren keine Aggregate bilden und nach dem Trocknen keine Ausfällung auftritt. Unerwarteterweise konnte gezeigt werden, daß derartige unerwünschte Effekte mit dem Vorhandensein eines phosphathaltigen Puffers in der wäßrigen Formulierung korrelieren. Phosphathaltige Puffer sind beispielsweise PBS (phosphate buffered saline [= phosphatgepufferte Kochsalzlösung]) sowie Phosphatpuffer. Infolgedessen wird diese bestimmte erfindungsgemäße Aufgabe durch eine wäßrige Formulierung zur Gefriertrocknung, die keinen Phosphatpuffer enthält, gelöst. Somit ist der in der erfindungsgemäßen Formulierung enthaltene Puffer vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus TRIS-, TBS-, MOPS-, HEPES- und (Hydrogen-) Carbonatpuffern. Die am stärksten bevorzugten Puffer sind TRIS und TBS.
Der Puffer wird in einer Konzentration verwendet, die zur Ausübung der benötigten Pufferkapazität ausreicht. Bei TRIS-Puffern liegt der bevorzugte Konzentrationsbereich bei 1–50 mM; die am stärksten bevorzugte Konzentration beträgt 10 mM. Der pH-Wert wird vorzugsweise auf einen Wert eingestellt, der einerseits für die Verabreichung an Menschen oder Tiere pharmazeutisch unbedenklich ist und andererseits nicht schädlich für das Virus ist. Somit sollte der pH-Wert im Bereich von 6,0 bis 9,0, stärker bevorzugt im Bereich von 7,2 bis 7,8, liegen. Am stärksten bevorzugt ist ein pH-Wert von 7,4.
Die unerwartet guten Ergebnisse bei Verwendung eines phosphatfreien Puffers werden unabhängig davon, ob es sich bei dem Virus in der Formulierung um ein ungereinigtes, gereinigtes oder teilgereinigtes Virus handelt, erzielt. Gereinigte oder teilgereinigte Viren sind bevorzugt.
Die erfindungsgemäße Formulierung, insbesondere die wäßrige Formulierung, kann Salze, wie beispielsweise NaCl, enthalten. Für NaCl typische Konzentrationen liegen im Bereich von 10 bis 200 mM. Eine bevorzugte NaCl-Konzentration beträgt beispielsweise 140 mM.
Die erfindungsgemäße Formulierung, insbesondere die wäßrige Formulierung, kann ferner L-Glutaminsäuresalze umfassen. Bei dem Salz handelt es sich vorzugsweise um ein Monokaliumsalz oder ein Mononatriumsalz. Die Konzentration des L-Glutaminsäuresalzes liegt vorzugsweise in einem Bereich von 0,05–0,5 g/l, stärker bevorzugt in einem Bereich von 0,1–0,15 g/l.
Einige besonders bevorzugte wäßrige Formulierungen gemäß der vorliegenden Erfindung sind in der nachfolgenden Tabelle 1 aufgeführt. In allen in Tabelle 1 aufgeführten Formulierungen handelt es sich bei dem Puffer um 10 mM TRIS, pH 7,4, 140 mM NaCl.
Tabelle 1:
Die erfindungsgemäße wäßrige Formulierung eignet sich zur Gefriertrocknung. Zur Verabreichung muß das gefriergetrocknete Produkt mit einem entsprechenden Lösungsmittel rekonstituiert werden. Gemäß einer Ausführungsform wird das gefriergetrocknete Produkt mit sterilem Wasser versetzt, um die Verbindungen in Lösung zu bringen. Dabei entspricht die Menge an zugesetztem Wasser mehr oder weniger der Wassermenge, die während des Gefriertrocknens eliminiert wurde. Somit ist gemäß dieser Ausführungsform die Zusammensetzung des rekonstituierten Produkts mit der ursprünglichen wäßrigen Formulierung mehr oder weniger identisch. Daher liegt es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, daß die erfindungsgemäße wäßrige Formulierung als Impfstoff verwendet wird. Gemäß einer alternativen Ausführungsform kann das gefriergetrocknete Produkt auch in einem beliebigen anderen pharmazeutisch unbedenklichen Verdünnungsmittel, das in entsprechenden Mengen verwendbar ist, rekonstituiert werden. Beispielhaft kann es sich bei dem Verdünnungsmittel um Wasser handeln, das eine oder mehrere der Verbindungen, ausgewählt aus Phenol, Glycerin und Puffer, enthält. Die Phenolkonzentration im rekonstituierten Produkt beträgt beispielsweise 0,5%. Wie oben erläutert, handelt es sich bei dem Puffer vorzugsweise nicht um einen Phosphatpuffer.
Zusammenfassend betrifft die Erfindung unter anderem die folgende Ausführungsform: eine Formulierung, insbesondere eine wäßrige Formulierung, die ein Vaccinia-Virus, ein Disaccharid, ein pharmazeutisch unbedenkliches Polymer und einen Puffer umfaßt oder sogar daraus besteht, wobei es sich bei dem Puffer nicht um einen Phosphatpuffer handelt und wobei es sich bei dem Vaccinia-Virus vorzugsweise um ein gereinigtes oder teilgereinigtes Virus handelt. Bei dem Polymer handelt es sich vorzugsweise um Dextran, und zwar vorzugsweise in den oben angegebenen Mengen.
Der Begriff „besteht", wie er oben verwendet wird, bezieht sich auf Formulierungen, die lediglich aus den oben erwähnten Verbindungen bestehen, sowie auf Formulierungen, die zusätzlich ein oder mehrere Salze enthalten. Zu den Salzen, mit denen die aus den oben definierten Verbindungen bestehende Formulierung versetzt werden kann, gehören KCl, NaCl, Natriumglutamat. Somit schließt der Begriff „besteht" in der Definition der oben definierten Formulierung die Möglichkeit der Zugabe eines oder mehrerer Salze nicht aus.
Beispielhaft umfaßt eine spezifische Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eine wäßrige Formulierung, die ein gereinigtes oder teilgereinigtes Vaccinia- Virus, ein Disaccharid, ein pharmazeutisch unbedenkliches Polymer und einen Puffer umfaßt, wobei es sich bei dem Disaccharid um Saccharose in den oben angegebenen Mengen, bei dem Polymer um Dextran in der oben angegebenen Menge und bei dem Puffer nicht um einen Phosphatpuffer handelt.
Es liegt im Rahmen der Fähigkeiten des Fachmanns, wie sich solche Formulierungen, insbesondere eine Poxviren enthaltende wäßrige Formulierung, verabreichen lassen bzw. läßt und welche Virusmengen zur Impfung eingesetzt werden. Wie oben erläutert, könnten die Impfstoffe zur Induktion einer Immunantwort gegen die Poxviren selbst eingesetzt werden, insbesondere wenn abgeschwächte oder nichtpathogene, nichtrekombinante Poxviren verwendet werden. Falls es sich bei den Poxviren um rekombinante Poxviren handelt, so wird zusätzlich eine Immunantwort gegen das von dem Poxvirusvektor exprimierte Protein/Peptid ausgelöst.
Der Begriff „Formulierung", wie er oben verwendet wird, bezieht sich, falls nicht anders angegeben, normalerweise auf flüssige Formulierungen, vorzugsweise auf wäßrige Formulierungen. Sind die Konzentrationen oder Konzentrationsbereiche in „mM", „g/l" und so weiter angegeben, so ist dies ein Hinweis darauf, daß es sich bei der jeweiligen Formulierung um eine flüssige oder sogar wäßrige Formulierung handelt. Der Begriff „wäßrige Formulierung" betrifft solche Formulierungen, in denen das Verdünnungsmittel Wasser ist. Allerdings sind auch diejenigen Trockenformulierungen, die sich aus einer flüssigen oder sogar wäßrigen Formulierung gemäß der vorliegenden Erfindung durch Abtrennen der Flüssigkeit erhalten lassen, vom Umfang der vorliegenden Erfindung umfaßt, und zwar unabhängig von dem für das Abtrennen verwendeten Verfahren. Somit umfaßt die Erfindung auch diejenigen Trockenformulierungen, die mit anderen Verfahren als der Gefrier trocknung erhalten werden.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ferner ein Verfahren zur Herstellung einer stabilen, poxvirushaltigen Zusammensetzung, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die erfindungsgemäße Formulierung, insbesondere die wäßrige Formulierung, gefriergetrocknet wird. Falls nicht anders angegeben, werden die Begriffe „stabile, poxvirushaltige Zusammensetzung" und „gefriergetrocknete poxvirushaltige Zusammensetzung" in der vorliegenden Anmeldung gegeneinander austauschbar verwendet. Der Begriff „stabile, poxvirushaltige Zusammensetzung" wird in der vorliegenden Anmeldung zur Definition poxvirushaltiger Zusammensetzungen, bei denen der Gesamtverlust an Virustiter bei einer Inkubationstemperatur von 37°C über 28 Tage weniger als 0,5 log, vorzugsweise weniger als 0,4 log beträgt, verwendet. Eine ausführliche Vorschrift zur Bestimmung des Virustiters und somit des Gesamtverlusts an Virustiter ist im Beispielteil angegeben. Allerdings läßt sich auch jede andere Vorschrift zur Bestimmung des Virustiters verwenden.
Verfahren zur Gefriertrocknung sind dem Fachmann allgemein bekannt (Day, J. und McLellan, M., Methods in Molecular Biology, Humana Press, Bd. 38 (1995)).
Ein Gefriertrocknungsprozeß besteht normalerweise aus den folgenden Schritten, die nachfolgend ausführlicher erläutert werden:

1. Impfstoffherstellung;
2. Einfrieren der Probe;
3. erstes Trocknen (Sublimierung);
4. zweites Trocknen (Desorption);
5. Verstöpseln und Entnahme;
6. Impfstofflagerung;
7. Rekonstituierung.

Impfstoffherstellung:
Die Produktion und Amplifikation von als Impfstoffe zu verwendenden Poxviren wurde oben bereits ausführlich erläutert. Die Poxviren werden gegebenenfalls aufgereinigt. Die erfindungsgemäße Formulierung erhält man durch Zugabe der oben definierten Disaccharide, Polymere und – gegebenenfalls – Puffer, L-Glutaminsäure und gegebenenfalls weiterer Zusätze zu der Poxviruspräparation.
Einfrieren der Probe:
Durch das Einfrieren der Probe werden die Bestandteile in der Lösung immobilisiert, wodurch das Aufschäumen des Produkts bei Verringerung des Drucks verhindert wird. Beim Einfrieren handelt es sich um einen zweistufigen Vorgang, bei dem das Wasser zunächst Kristallisationskeime bildet, woraufhin das Wachstum von Eiskristallen erfolgt, wobei ein Gemisch aus Eis und einem Konzentrat gelöster Stoffe entsteht. Die Bildung von Eiskeimen wird durch Erniedrigen der Temperaturen und Bewegen der gekühlten Suspension gefördert. Im Gegensatz zur Keimbildung wird das Eiswachstum durch Erhöhen der Temperatur gefördert, wodurch die Viskosität der Suspension abnimmt. Die Ausbreitung des Eises über das Medium führt unabhängig vom genauen Einfriermuster zu einem Anstieg der Konzentration gelöster Stoffe. In Lösung oder Suspension befindliche Biopolymere werden geschädigt oder inaktiviert, wenn sie diesen erhöhten Konzentrationen gelöster Stoffe ausgesetzt werden. Durch schnelles Abkühlen wird der Zeitraum, in dem das Bioprodukt dem Konzentrat ausgesetzt ist, minimiert. Oberhalb einer kritischen Temperatur (der Glasübergangstemperatur) kann die Massenviskosität hinreichend abnehmen, so daß das Glas weich wird und sich verzerrt. Es trocknet unter Bildung eines strukturlosen klebrigen Rückstands im Fläschchen. Die Temperatur der Verzerrung wird als Kollaps-Temperatur bezeichnet. Insbesondere ist die Kollaps-Temperatur als diejenige Temperatur definiert, bei der die Mobilität des Wassers im interstitiellen Bereich der Matrix signifikant wird. Um die Verzerrung zu vermeiden, muß die Einfriertemperatur unterhalb der Kollaps-Temperatur der wäßrigen Formulierung liegen. Die Kollaps-Temperatur läßt sich nach dem Fachmann bekannten Verfahren, beispielsweise durch differentielle thermische Analyse, bestimmen (Jennings, T. A., „Lyophilization, Introduction and Basic Principles", Interpharm Press, Denver, CO, USA, 1999, ISBN 1-57491-081-7, Seite 132–134).
Ist die Temperatur zu niedrig, kann die Wasserdiffusion aus dem Virus gehemmt sein, und es könnte eine Verletzung durch intrazelluläres Eis eintreten. Infolgedessen werden vom Fachmann mehrere Einfriertemperaturen getestet, die allesamt unterhalb der Kollaps-Temperatur der wäßrigen Formulierung liegen, wobei geprüft wird, welche Temperatur zu einem gefriergetrockneten Produkt mit dem höchsten Titer infektiöser Poxviren führt.
Erstes Trocknen (Sublimierung):
Der erste Trocknungsvorgang (Haupttrocknung) ist derjenige Teil des Gefriertrocknungsprozesses, der die Sublimierung des Lösungsmittels (Eis) aus der gefrorenen Matrix antreibt. Der erste Trocknungsprozeß beginnt, nachdem der Gefriertrockner die erforderliche Kondensatortemperatur und den erforderlichen Kammerdruck erreicht hat. Der Druck in der Kammer beträgt normalerweise weniger als 1 mbar, vorzugsweise weniger als 0,2 mbar. Typischerweise liegt der Druck im Bereich von 0,04 bis 0,12 mbar. Diese Bedingungen werden in der gesamten vorliegenden Beschreibung manchmal als „niedriger Druck" bezeichnet.
Die Stellplattentemperatur wird erhöht, so daß die Sublimierung des Eises in der Produktmatrix erfolgt, wobei die Produkttemperatur deutlich unterhalb der Kollaps-Temperatur der Formulierung liegt, um sicherzustellen, daß die Matrix während des gesamten ersten Trocknungsprozesses gefroren ist und daß die Gefriertrocknung ohne Kollaps abläuft. Die Temperatur kann während des ganzen ersten Trocknungsprozesses konstant bleiben. Als Alternative läßt sich die Stellplattentemperatur während des ersten Trocknungsvorgangs kontinuierlich erhöhen. Dabei muß die Temperatur des Produkts allerdings während des ganzen ersten Trocknungsprozesses unterhalb der Kollaps-Temperatur liegen. Am Ende des ersten Trocknungsvorgangs kann das getrocknete Produkt noch mehr als 5% (w/w) Feuchtigkeit enthalten. Um ein Produkt mit einem Feuchtigkeitsgehalt, bei dem biologisches Wachstum bzw. chemische Reaktionen nicht mehr unterstützt werden, zu erhalten, ist es notwendig, einen zweiten Trocknungsschritt durchzuführen.
Zweites Trocknen (Desorption):
Während des zweiten Trocknungsvorgangs wird Wasserdampf von der Oberfläche des während des ersten Trocknungsvorgangs gebildeten Kuchens desorbiert. Dies wird durch Erhöhen der Temperatur bewerkstelligt, während in der Kammer noch niedrige Drücke vorliegen, so daß Wasser von der Kuchenoberfläche desorbiert wird.
Die Stellplattentemperaturen für den zweiten Trocknungsvorgang werden von der Stabilität des Produkts bestimmt und können im Bereich von 0°C bis +30°C liegen. Die Temperatur liegt normalerweise im Bereich von –5°C bis 30°C. Stärker bevorzugt ist eine Temperatur im Bereich von 5°C bis 20°C. Der zweite Trocknungsvorgang läßt sich in zwei Schritten ausführen. In einem ersten Schritt kann die Produkttemperatur im Bereich von –5°C bis +15°C, vorzugsweise im Bereich von 0°C bis +10°C, stärker bevorzugt im Bereich von 2°C bis +7°C liegen. Der zweite Schritt wird bei einer höheren Temperatur als der zweite Trocknungsvorgang im ersten Schritt aus geführt. Die Temperatur kann im Bereich von 0°C bis 30°C, vorzugsweise im Bereich von +5°C bis +20°C liegen. Ebenso hängt der Restfeuchtigkeitsgehalt der Formulierung von den Erfordernissen des Produkts ab. Manche Produkte benötigen einen höheren, manche Produkte einen geringeren Restfeuchtigkeitsgehalt, um die beste Produktstabilität zu erzielen. Der optimale Restfeuchtigkeitsgehalt muß ebenso wie die Zeit zur Erreichung desselben empirisch bestimmt werden.
Der zweite Trocknungsprozeß wird solange fortgesetzt, bis die gewünschte Feuchtigkeit erreicht ist. Verfahren zur Bestimmung der Feuchtigkeit eines Produkts sind dem Fachmann bekannt. Insbesondere kann die kolorimetrische Karl-Fischer-Titration eingesetzt werden (Jennings, T. A., „Lyophilization, Introduction and Basic Principles", Interpharm Press, Denver, CO, USA, 1999, ISBN 1-57491-081-7, Seite 415–418). Der Restfeuchtigkeitsgehalt liegt vorzugsweise unterhalb von 5%, stärker bevorzugt in einem Bereich von 0,5 bis 4%, noch stärker bevorzugt in einem Bereich von 1 bis 3%.
Verstöpseln und Entnahme:
Alle produkthaltigen Fläschchen werden nach dem Fachmann bekannten Verfahren verschlossen. Die Fläschchen lassen sich unter sehr niedrigem Druck (z.B. 0,04–2,56 mbar) direkt im Gefriertrockner verschließen. Ebenso können die Fläschchen mehr oder weniger unter Normaldruck unter Verwendung eines chemisch reaktionsträgen Gases, wie beispielsweise Stickstoff oder Helium, verschlossen werden. Typischerweise können die Fläschchen in einer Stickstoffatmosphäre bei einem Druck von 900 mbar verschlossen werden. Die Fläschchen werden vorzugsweise mit Butylgummistopfen geschlossen. Sobald das Produkt verstöpselt ist, kann das System wieder auf Atmosphärendruck gebracht und die Stellplatte entladen werden. Anschließend können die Fläschchen ferner zur Langzeitlagerung mit Aluminiumkappen verschlossen werden.
Impfstofflagerung:
Das gefriergetrocknete Produkt läßt sich bei Raumtemperatur (25°C) lagern und bleibt bei dieser Temperatur mindestens 18 Wochen, vorzugsweise mindestens 20 Wochen, stärker bevorzugt mindestens 22 Wochen stabil. Unter „stabil bei einer bestimmten Temperatur über einen bestimmten Zeitraum" wird verstanden, daß der Verlust an Virustiter bei dieser Temperatur über diesen Zeitraum weniger als 0,5 log beträgt. Besteht allerdings die Möglichkeit zur Kühlung, so ist es bevorzugt, daß das gefriergetrocknete Produkt bei einer niedrigeren Temperatur, wie beispielsweise 4°C, gelagert wird. Vorzugsweise wird das Produkt dunkel gelagert. Falls dies nicht möglich ist, ist die Verwendung von gefärbtem Glas zur Lagerung oder aller anderen Fläschchen, mit denen ein schädlicher Lichtkontakt vermieden werden kann, bevorzugt.
Rekonstituierung:
Zu Rekonstituierung des gefriergetrockneten Produkts wird dieses mit einer entsprechenden Menge eines Lösungsmittels versetzt, wobei eine pharmazeutisch unbedenkliche Formulierung erhalten wird, die die Verabreichung an Menschen oder Tiere gestattet. Dabei handelt es sich bei dem Lösungsmittel vorzugsweise um Wasser. Normalerweise wird die Formulierung mit einer Lösungsmittelmenge versetzt, die weitgehend der während des Gefriertrocknungsprozesses verlorenen Lösungsmittelmenge entspricht.
Die Erfindung betrifft ebenso das durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltene gefriergetrocknete Produkt.
Somit umfaßt das erfindungsgemäße gefriergetrocknete Produkt (i) ein Poxvirus, vorzugsweise aus der Gattung Orthopoxvirus oder Avipoxvirus, (ii) ein Disaccharid, (iii) ein pharmazeutisch unbedenkliches Polymer und gegebenenfalls (iv) einen Puffer, wobei das Poxvirus, das Disaccharid, das Polymer und der Puffer die oben angegebene Bedeutung aufweisen.
Typische Zusammensetzungen im gefriergetrockneten Produkt sind in der folgenden Tabelle 2 dargestellt. Die Virusmenge beträgt in allen in Tabelle 2 gezeigten Formulierungen 5 × 10⁸ TCID₅₀/ml.
Tabelle 2:
Das erfindungsgemäße gefriergetrocknete Produkt wird zur Herstellung eines Impfstoffs verwendet. Hierzu wird das gefriergetrocknete Produkt wie oben beschrieben gelöst/rekonstituiert und einem Menschen oder einem Tier nach dem Fachmann bekannten Verfahren verabreicht.
Kurze Erläuterung zu den Figuren
In 1 ist die Stabilität einer MVA-haltigen gefriergetrockneten Formulierung bei einer Temperatur von 31°C gezeigt. Bei der getesteten Formulierung handelt es sich um GT23 (siehe Beispielteil und Tabelle 6). Der Virustiter in der erfindungsgemäßen wäßrigen Formulierung wird vor der Gefriertrocknung bestimmt. Die Gefriertrocknung wurde wie für GT23 beschrieben ausgeführt (siehe Beispiele und Tabelle 6). Nach der Gefriertrocknung wurde die Formulierung bei 31°C gelagert. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurde die gefriergetrocknete Formulierung rekonstituiert und der Virustiter erneut bestimmt.
In den 2 und 3 sind die Ergebnisse des gleichen Experiments dargestellt, wie es in der Beschreibung zu 1 beschrieben ist, mit der Ausnahme, daß die Inkubationstemperatur in 2 37°C und in 3 45°C betrug.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele weiter veranschaulicht. Dabei ist dem Fachmann allgemein ersichtlich, daß das bzw. die hier vorgelegte(n) Beispiel(e) auf keinen Fall so interpretiert werden darf bzw. dürfen, daß dadurch die Anwendbarkeit der durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten Technologie auf dieses Beispiel bzw. diese Beispiele beschränkt wird.
Beispiel 1: Gefriertrocknung von den modifizierten Vaccinia-Virusstamm Ankara (MVA) enthaltenden Formulierungen
In diesem Beispiel wurden MVA enthaltende erfindungs gemäße Formulierungen unter unterschiedlichen Bedingungen gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Produkt wurde bei unterschiedlichen Temperaturen gelagert. Die Stabilität des MVA in der Präparation wurde analysiert, indem der MVR-Titer nach Rekonstituierung des gefriergetrockneten Produkts bestimmt und mit dem MVA-Titer vor dem Gefriertrocknen verglichen wurde. Dabei wurde der Einfluß unterschiedlicher Lagerungszeiten auf den Virustiter bestimmt. Die Vorschrift zur Bestimmung des Titers einer MVA-haltigen Formulierung ist in Beispiel 2 angegeben.
1. Experimenteller Aufbau:
Impfstoffherstellung/Formulierungen
Für das Austesten des erfindungsgemäßen Gefriertrocknungsprozesses wurden mehrere MVA-Präparationen verwendet. Für die Gefriertrocknungsexperimente (Zeilen GTZ-4, 6-10 und Z3-15 in Tabelle 6) wurde der modifizierte Vaccinia-Virusstamm Ankara (MVA) verwendet. Das Virus wurde mittels Zentrifugation mit 36%- und 40%-Saccharosekissen gereinigt und anschließend in 1 mM Tris-Puffer bei pH 9 resuspendiert.
In den Gefriertrocknungsexperimenten GT1-4 (Tabelle 6) wurden keine Zusätze verwendet. Als Puffersystem wurde 10 mM Tris mit 140 mM NaCl bei pH 7,4 verwendet. Bei den Gefriertrocknungen ab Nummer GT6 (Tabelle 6) wurden unterschiedliche Zusätze verwendet, ohne daß dabei das Puffersystem geändert wurde.
Es wurden zwei verschiedene Formulierungen mit unterschiedlichen Zusätzen gewählt. Die virushaltigen Lösungen wurden mit den Zusätzen durch Zugabe eines Verdünnungspuffers versetzt. Die Zusammensetzung der verwendeten Verdünnugspuffer ist in den Tabellen 3 und 4 unten dargestellt. Die Zugabe von Verdünnungspuffer 1 (DSG) führt zu einer erfindungsgemäßen wäßrigen Formulierung. Die Verwendung von Verdünnungspuffer 2 (DGG) führt zu einer für die vergleichende Analyse ver wendeten Formulierung.
Tabelle 3:
Tabelle 4:
Diese Verdünnungspuffer wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen in der endgültigen Formulierung verwendet. Verdünnungspuffer 1 (DSG) wurde mit 16,7%, 23%, 30% und 40% (v/v), Verdünnungspuffer 2 (DGG) mit 20% (v/v) eingesetzt. Der TCID₅₀/ml-Wert für die endgültige Formulierung wurde mit einem physiologischen Tris-Puffer (10 mM Tris-Puffer; 140 mM NaCl; pH 7,4) auf 5 × 10⁸ TCID₅₀/ml eingestellt.
Einfrieren der Proben
Die Proben wurden im Gefriertrockner (Gefriertockner vom Typ Alpha 2–4 der Firma Christ) eingefroren. Bei der Formulierung mit Saccharose (DSG) zeigte der Vergleich unterschiedlicher Einfriertemperaturen (–30°C bis –45°C), daß, um eine perfekte Kuchenstruktur zu erhalten, die Suspension bei –40°C, also unter die Kollaps-Temperatur der Formulierung, eingefroren werden muß. Beim Einfrieren im Gefriertrockner wurden –40°C innerhalb von etwa 3,5 bis 4,5 Stunden erreicht (ausgehend von etwa 20°C).
Erstes Trocknen
Für die Formulierung mit Saccharose (DSG) wurde aufgrund der Kollaps-Temperatur von Saccharose (–31°C) eine Kollaps-Temperatur von etwa –30 bis –37°C angenommen. Daher wurde die Produkttemperatur auf Werte im Bereich von –37 bis –41°C eingestellt, um eine vollständig gefrorene Matrix zu gewährleisten. Es wurden Drücke von 0,04 und 0,12 mbar (–50°C und –40°C im Phasendiagramm für Wasser) verwendet.
Die treibende Kraft für die Sublimierung während des ersten Trocknungsvorgangs ist der Druckunterschied zwischen dem Produkt und dem Kondensator des Gefriertrockners, der durch deren Temperaturdifferenz erzeugt wird. Es ist ein Naturgesetz, daß bei der Temperaturabnahme von Wasser der Druck über diesem Wasser gleichfalls abnimmt. Eine spezifische Wassertemperatur ist immer mit einem spezifischen Druck assoziiert. Der Kondensator wurde auf Temperaturen im Bereich von –83°C bis –89°C eingestellt. Die Produkttemperatur wird durch den Druck in der Kammer und die Stellplattentemperatur reguliert. Dies deutet darauf hin, daß sich die Länge des ersten Trocknungsvorgangs nicht sehr einfach abkürzen läßt, da die Kondensatortemperatur festgelegt ist. Der limitierende Faktor bei der Erhöhung der Produkttemperatur ist der T_C-Wert der Formulierung.
Zweites Trocknen
Die Temperaturen für den zweiten Trocknungsvorgang werden durch die Stabilität des Produkts bestimmt. Ebenso hängt der Restfeuchtigkeitsgehalt der Formulierung von den Erfordernissen des Produkts ab. Um ihre beste Stabilität zu erzielen, benötigen manche Produkte einen höheren, manche einen geringeren Feuchtigkeitsgehalt. Der optimale Restfeuchtigkeitsgehalt muß ebenso wie die Zeit zur Erreichung desselben empirisch bestimmt werden. Da der zweite Trocknungsvorgang beginnt, wenn das Produkt eine Temperatur oberhalb von 0°C erreicht, wurde der zweite Trocknungsvorgang in zwei Schritten durchgeführt. Im ersten Schritt wurde die Stellplattentemperatur einige Stunden (um die 4 bis 7 Stunden) so reguliert, daß die Produkttemperatur über 0°C (im Bereich von 4 bis 6°C) lag. Auf diese Weise wurde das gesamte eventuell vorhandene, nach dem ersten Trocknen verbliebene Eis geschmolzen. Durch den Einsatz solcher milder Bedingungen zu Beginn des zweiten Trocknungsvorgangs werden Produktschäden minimiert. Anschließend wurde der zweite Schritt gestartet, indem die Produkttemperatur über 20–30 Stunden auf Werte im Bereich von 18 bis 21°C erhöht wurde. Die Dauer des zweiten Schritts hängt stark von der gewünschten Restfeuchtigkeit des gefriergetrockneten Produkts ab. Um unterschiedliche Restfeuchtigkeitsgehalte zu erhalten, wurden unterschiedliche Zeitdauern verwendet. Als Test zur Messung des Restfeuchtigkeitsgehalts des gefriergetrockneten Materials wurde die kolorimetrische Karl-Fischer-Titration (Jennings, T. A., „Lyophilization, Introduction and Basic Principles", Interpharm Press, Denver, CO, USA, 1999, ISBN 1-57491-081-7, Seite 415–418).
Verstöpseln und Entnahme
Alle während der Verfahrensentwicklung hergestellten Produkte wurden unter sehr niedrigem Druck (0,04–2,56 mbar) direkt im Gefriertrockner verschlossen. Die Fläschchen wurden mit Butylgummistopfen geschlossen. Sobald das Produkt verstöpselt war, wurde das System wieder auf Atmosphärendruck gebracht und die Stellplatte entladen. Anschließend wurden die Fläschchen zur Langzeitlagerung mit Aluminiumkappen verschlossen.
Impfstofflagerung
Ein wichtiger Aspekt der Formulierungsaufgabe besteht in der Produktion eines Impfstoffs, der lagerstabil ist. Zu den die Stabilität beeinflussenden Faktoren gehören Restfeuchtigkeitsgehalt, Luftzusammensetzung beim Verschließen sowie Lagerungsbedingungen, einschließlich Temperatur, Luftfeuchtigkeit und Licht.
Die unterschiedlichen während der Verfahrensentwicklung produzierten Chargen wurden allesamt bei 4°C sowie bei Raumtemperatur gelagert. Weiterhin wurden einige Chargen auch bei 31°C, 37°C und 45°C gelagert.
Alle Proben wurden dunkel gelagert.
Rekonstituierung
Die gefriergetrocketen Proben wurden mit autoklaviertem Milli-Q-Wasser rekonstituiert. Insbesondere wurde das Wasser (1,2 ml) mit einer Spritze zu der Probe gegeben. Die Suspension wurde durch leichtes Schütteln gemischt. Die Rekonstituierung braucht nur einige Sekunden. Der Virustiter des rekonstituierten Produkts wurde bestimmt und mit dem Virustiter vor der Gefriertrocknung verglichen.
Beschleunigter Stabilitätstest
Die Stabilität der Formulierung GT23 (siehe Tabelle 6) wurde bei 31°C, 37°C und 45°C beurteilt. Dabei wurde der Virustiter regelmäßig überprüft. Die Ergebnisse sind in den 1 bis 3 dargestellt.
2. Ergebnisse und Schlußfolgerung:
MVA wurde mit und ohne Verwendung unterschiedlicher Zusätze gefriergetrocknet. Es konnte gezeigt werden, daß Formulierungen ohne Zusätze instabil waren (siehe Tabelle 6). In diesem Zusammenhang wurden Proben als stabil angesehen, wenn der Titer nicht um mehr als 0,5 log absank. Somit wird unter dem Ausdruck „stabil bei einer bestimmten Temperatur über einen bestimmten Zeitraum" verstanden, daß der Verlust an Virustiter bei dieser Temperatur über diesen Zeitraum weniger als 0,5 log beträgt. Eine Formulierung „versagt", wenn der Verlust an Virustiter über den angegebenen Zeitraum bei der angegebenen Temperatur 0,5 log oder mehr beträgt. Dextran und Glucose umfassende Formulierungen zeigten eine sehr geringe Stabilität bei Raumtemperatur. Die unterschiedliche Konzentrationen an Saccharose und Dextran umfassenden erfindungsgemäßen Formulierungen erwiesen sich als stabil. Die Stabilität von MVA in den erfindungsgemäßen Formulierungen beträgt mindestens 25 Wochen bei 4°C und Raumtemperatur.
Ausführliche Angaben bezüglich einzelner Experimente sind in Tabelle 6 aufgeführt:
In Tabelle 6 wird gezeigt, daß die Stabilität der Formulierungen ohne Zusätze (Tabelle 6, GT1-4) sehr schlecht war. Sie verloren nach nur einigen Wochen 0,5 log ihres ursprünglichen Ausgangstiters, was nicht akzeptabel ist.
Die Formulierung mit 20% (v/v) DGG war wegen eines Kollapses des Materials während des Gefriertrocknungsprozesses nicht akzeptabel (Daten nicht gezeigt). Dieser Kollaps läßt sich mit dem niedrigen T_C-Wert für Glucose erklären, der durch die Verwendung von Dextran, das einen hohen T_C-Wert (–11°C) aufweist, nicht signifikant erhöht wurde. Beim ersten Trocknungsvorgang wurde die niedrigstmögliche Temperatur der Gefriertrocknungsapparatur (–45°C) verwendet. Daher war es nicht möglich, Temperaturen auf Werte unterhalb des T_C-Werts für Glucose zu erniedrigen. Bei den Formulierungen mit 30% (v/v) DGG fand kein Kollaps statt. Dieses Phänomen liegt möglicherweise an der größeren Gesamtmenge an Dextran, wodurch der T_C-Wert auf einen Wert, der oberhalb der für den ersten Trocknungsvorgang verwendeten Temperatur liegt, erhöht wird. Obwohl das Material nicht kollabierte, war die Stabilität, vor allem bei Raumtemperatur, nicht zufriedenstellend, was an dem niedrigen T_C-Wert für Glucose im festen Zustand liegen könnte (Tabelle 6, GT 10).
In den meisten Experimenten wurde der Verdünnungspuffer 1 (DSG) verwendet. Die Stabilisierung mit diesem Zusatz ist sehr gut. Aufgrund des hohen T_C-Werts für Saccharose (–31°C) stellte der Kollaps bei dieser Formulierung kein Problem dar. Die Stabilität des gefriergetrockneten Materials war jederzeit gut (Tabelle 6). Es gab keine großen Unterschiede zwischen der Verwendung von 16,7%, 20%, 23%, 28,6%, 30% und 40% (v/v) DSG in der Formulierung. Die Stabilität bei 4°C und Raumtemperatur ist für alle 6 Formulierungen erwiesen. Die gefriergetrockneten Produkte mit 30% und 40% DSG wiesen eine geringfügig bessere Stabilität auf.
Eine der Formulierungen (Prozeß GT 23, siehe Tabelle 6) wurde in einem beschleunigten Stabilitätstest ausführlich analysiert. Die Ergebnisse sind in den 1 bis 3 dargestellt sowie in der nachfolgenden Tabelle 5 zusammengefaßt.
Tabelle 5:
Bei 31°C wurde der Impfstoff etwa 1 Monat lang gelagert und erfüllte danach immer noch die technischen Werte (Verlust an Virustiter beträgt weniger als 0,5 log). Aber es wäre auch bei höheren Temperaturen möglich, den Impfstoff mehr als einen Monat lang zu lagern, was vor allem für Tropenregionen interessant sein könnte.
Für die alten Pockenimpfstoffe wurde von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) ein Verfahren zur Abschätzung der Stabilität empfohlen. Falls der Impfstoff innerhalb von 4 Wochen bei 37°C weniger als 1 log verlor, wurde angenommen, daß er bei einer Lagerung bei 4°C mindestens ein Jahr lang stabil war (Akzeptanzkriterium für die Verwendung des alten Impfstoffs war der Verlust von weniger als 1 log). Wie gezeigt, erfüllt die erfindungsgemäße Formulierung GT23 dieses Kriterium.
Beispiel 2: Titration des modifizierten Vaccinia-Virus Ankara (MVA)
Die Titration des modifizierten Vaccinia-Virus Ankara (MVA) wird in einem auf TCID₅₀/ml beruhenden Test unter Verwendung 10facher Verdünnungen in einem 96-Loch-Format durchgeführt.
Am Endpunkt des Tests werden infizierte Zellen unter Verwendung eines Anti-Vaccinia-Virus-Antikörpers sowie einer entsprechenden Färbelösung sichtbar gemacht.
2–3 Tage alte primäre CEF-Zellen (chicken embryo fibroblasts) werden auf 1 × 10⁵ Zellen/ml in 7% RPMI verdünnt. Die 10fachen Verdünnungen werden mit 8 Replikaten pro Verdünnung durchgeführt. Nach der Verdünnung werden jeweils 100 μl pro Loch in 96-Loch-Platten ausgesät. Die Zellen werden dann über Nacht bei 37°C und 5% CO₂ inkubiert.
Verdünnungen der virushaltigen Lösungen werden in 10er-Schritten (10^–1 bis 10^–12, wie benötigt) hergestellt, wobei RPMI ohne fötales Kälberserum verwendet wird. Danach werden von jeder Virusprobe jeweils 100 μl in die Zellen enthaltenden Löcher gegeben. Die 96-Loch-Platten werden bei 37°C mit 5% CO₂ 5 Tage inkubiert, um die Infektion und Virusreplikation zu gestatten.
Die Zellen werden 5 Tage nach der Infektion mit einem Vaccinia-Virus-spezifischen Antikörper angefärbt. Für den Nachweis des spezifischen Antikörpers wird ein mit Meerrettich-Peroxidase (HRP [= horseradish peroxidase]) gekoppelter sekundärer Antikörper verwendet. Bei dem MVA-spezifischen Antikörper handelt es sich um die IgG-Fraktion eines polyklonalen Kaninchen-Anti-Vaccinia-Virus-Antikörpers (Quartett, Berlin, Nr. 9503-2507). Bei dem sekundären Antikörper handelt es sich um einen HRP-gekoppelten polyklonalen Ziege-Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper (Promega, Mannheim, Nr. W4011). Die Farbreaktion wird nach bekannten Techniken durchgeführt.
Jedes Loch mit Zellen, die eine positive Farbreaktion ergeben, wird zur Berechnung des TCID₅₀/ml-Werts als positiv markiert.
Der Titer wird unter Verwendung der Formel von Spearman [1] und Kaerber [2] berechnet. Da alle Testparameter konstant gehalten werden, wird die folgende vereinfachte Formel verwendet:

a: = Verdünnungsfaktor der letzten Spalte, in der alle acht Löcher positiv sind
x_a: = Anzahl positiver Löcher in Spalte a + 1
x_b: = Anzahl positiver Löcher in Spalte a + 2
x_c: = Anzahl positiver Löcher in Spalte a + 3

Claims

Formulierung, umfassend (i) ein Vaccinia-Virus mit einem Titer von wenigstens 10⁶ TCID₅₀ pro mg Gesamtprotein, (ii) ein Disaccharid, (iii) ein pharmazeutisch unbedenkliches Polymer und (iv) einen Puffer, wobei es sich bei dem Puffer nicht um einen Phosphatpuffer handelt.
Formulierung nach Anspruch 1, wobei das Vaccinia-Virus einen Titer von wenigstens 10⁸ TCID₅₀ pro mg Gesamtprotein aufweist.
Formulierung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Vaccinia-Virus ausgewählt ist aus dem Stamm Elstree und dem modifizierten Vaccinia-Virusstamm Ankara (MVA).
Formulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Vaccinia-Virus um ein rekombinantes Vaccinia-Virus handelt.
Formulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Puffer ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus TRIS-, TBS-, MOPS-, HEPES- und (Hydrogen-)Carbonat-Puffer.
Formulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Disaccharid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Saccharose, Lactose und Trehalose.
Formulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des Disaccharids in einem Bereich von 10 bis 100 g/l liegt.
Formulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das pharmazeutisch unbedenkliche Polymer ausgewählt ist aus Dextran und Polyvinylpyrrolidon (PVP).
Formulierung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Dextran ein Molekulargewicht im Bereich von 30000 bis 70000 und eine Konzentration von 1 bis 50 g/l aufweist.
Formulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Formulierung weiterhin Glutaminsäure umfaßt.
Formulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Kollaps-Temperatur der Formulierung im Bereich von –37°C bis 30°C liegt.
Formulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Vaccinia-Virus um einen MVA-Stamm oder um den Stamm Elstree, bei dem Disaccharid um Saccharose und bei dem Polymer um Dextran handelt.
Formulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 12 als Impfstoff.
Verwendung einer Formulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Herstellung eines Impfstoffs.
Verfahren zur Herstellung einer stabilen, Vaccinia-Virus enthaltenden Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß die Formulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 13 gefriergetrocknet wird.
Verfahren nach Anspruch 15, umfassend die folgenden Schritte: (i) Einfrieren einer Formulierung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 bei einer niedrigeren Temperatur als die Kollaps-Temperatur der Formulierung, so daß eine gefrorene Produktmatrix erhalten wird; (ii) erstes Trocknen der gefrorenen Formulierung unter niedrigem Druck und bei einer Produkttemperatur, die die Sublimierung des Eises in der Produktmatrix gestattet, wobei die Produkttemperatur unterhalb der Kollaps-Temperatur der Formulierung liegt; (iii) zweites Trocknen bei niedrigem Druck und bei einer Produkttemperatur im Bereich von 0°C bis 30°C, bis die Restfeuchte des Produkts weniger als 5% beträgt.
Gefriergetrocknetes Produkt, umfassend (i) ein Vaccinia-Virus mit einem Titer von wenigstens 10⁶ TCID₅₀ pro mg Gesamtprotein, (ii) ein Disaccharid, (iii) ein pharmazeutisch unbedenkliches Polymer und (iv) einen Puffer, wobei das Vaccinia-Virus, das Disaccharid, das Polymer und der Puffer die in einem der Ansprüche 1 bis 6, 8 und 10 angegebene Bedeutung aufweisen.
Gefriergetrocknetes Produkt, erhältlich mit dem Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, wobei die zum Gefriertrocknen verwendete Formulierung das Disaccharid in der Konzentration gemäß Anspruch 7 und/oder Dextran mit dem Molekulargewicht und der Konzentration gemäß Anspruch 9 umfaßt.
Gefriergetrocknetes Produkt nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß der Restfeuchtigkeitsgehalt im Bereich von 1 bis 3% liegt.
Verwendung des gefriergetrockneten Produkts nach einem der Ansprüche 17 bis 19 zur Herstellung eines Impfstoffs.
Verfahren zur Rekonstituierung des gefriergetrockneten Produkts nach einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß das Produkt in einer angemessenen Menge eines pharmazeutisch unbedenklichen Lösungsmittels gelöst wird.