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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Pockenviren,
insbesondere modifiziertem Vacciniavirus Ankara (MVA), aus infizierten
Zellen. Der vorliegenden Erfindung gemäß werden die mit Pockenvirus
infizierten Zellen einer Hochdruckhomogenisierung unterworfen, um
ein pockenvirushaltiges Homogenisat zur erhalten. Das pockenvirushaltige
Homogenisat kann mindestens einem Reinigungsschritt unterworfen
werden, um eine mit Pockenvirus angereicherte Fraktion zu erhalten. Die
Erfindung betrifft des Weiteren die pockenvirushaltige Fraktion
und das pockenvirushaltige Homogenisat, die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhalten
werden.
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ALLGEMEINER
STAND DER TECHNIK
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Die
Poxviridae umfassen eine große
Familie komplexer DNA-Viren, die sich im Zytoplasma von Vertebraten-
und Invertebratenzellen replizieren. Die Familie der Poxviridae
kann in die zwei Unterfamilien der Chordopoxvirinae (Vertebratpockenviren)
und Entomopoxvirinae (Insektenpockenviren) unterteilt werden.
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Die
Chordopoxvirinae umfassen mehrere tierische Pockenviren (die in
verschieden Gattungen unterteilt sind) von beträchtlicher wirtschaftlicher
Bedeutung wie beispielsweise Kamelpockenviren, das Schafspockenvirus,
Ziegenpockenvirus oder die Vögelpockenviren,
insbesondere das Geflügelpockenvirus.
Zum Impfen von Zuchtvieh gegen Schafspocken und Ziegenpocken stehen
attenuierte Lebendviren- und inaktivierte Impfstoffe zur Verfügung. Zum
Impfen von Geflügel
sind rekombinante Impfstoffe unter Zuhilfenahme des Geflügelpockenvirus
als Vektor entwickelt worden.
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Da
das Geflügelpockenvirus
menschliche Zellen infiziert, wird angenommen, dass es auch als Vektor
zum Exprimieren heterologer Gene beim Menschen und zum Induzieren
einer entsprechenden Immunantwort verwendet werden kann. Geflügelpockenviren,
die HIV-Gene im Genom enthalten, sind in
US 5,736,368 und
US 6,051,410 offenbart.
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Beim
Menschen ist das Variolavirus, ein Mitglied der Gattung Orthopoxvirus,
bei Weitem das wichtigste Pockenvirus gewesen. Das Vacciniavirus, ebenfalls
ein Mitglied der Gattung Orthopoxvirus der Familien von Poxviridae,
ist als Lebendimpfstoff zum Immunisieren gegen Blattern verwendet
worden. Die erfolgreiche weltweite Impfung mit dem Vacciniavirus hat
zur Ausmerzung des Variolavirus geführt (The global eradication
of smallpox. Final report of the global commission for the certification
of smallpox eradication [Die globale Ausmerzung der Blattern. Endgültiger Bericht
der Globalkommission für
die Zertifizierung der Blatternausmerzung]; History of Public Health,
Nr. 4, Genf: Weltgesundheitsorganisation, 1980). Seit dieser WHO-Erklärung hat
man mit dem Impfen viele Jahre lang ausgesetzt, mit Ausnahme bei
Leuten, die einem hohen Risiko von Pockenvirusinfektionen (z. B.
Laborpersonal) ausgesetzt sind. Impfprogramme werden angesichts
des Risikos, dass das Variolavirus in biologischen Kampfmitteln oder
durch Bioterroristen verwendet wird, wieder von Interesse.
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In
letzterer Zeit sind Vacciniaviren auch zum genetischen Engineering
von Viralvektoren für
die rekombinante Genexpression und zur potentiellen Verwendung als
rekombinante Lebendimpfstoffe verwendet worden (Mackett, M., Smith,
G.L. und Moss, B. [1982] P.N.A.S. USA 79, 7415-7419; Smith, G.L., Mackett,
M. und Moss, B. [1984] Biotechnology and Genetic Engineering Reviews
2, 383-407). Das erfordert, dass DNA-Sequenzen (Gene), die für fremde Antigene
kodieren, mit Hilfe von DNA-Rekombinationstechniken in das Genom der
Vacciniaviren eingebaut werden. Wird das Gen an einer Stelle in
die virale DNA integriert, die für
den Lebenszyklus des Virus nicht wesentlich ist, so ist es möglich, dass
das neu hergestellte rekombinante Vacciniavirus infektiös, d.h.
in der Lage ist, fremde Zellen zu infizieren und dadurch die integrierte
DNA-Sequenz zu exprimieren
(EP-Patentanmeldungen Nr. 83,286 und Nr. 110,385). Die auf diese
Weise zubereiteten rekombinanten Vacciniaviren können einerseits als Lebendimpfstoffe
für die
Prophylaxe infektiöser
Krankheiten, andererseits für
die Zubereitung heterologer Proteine in eukaryotischen Zellen verwendet
werden.
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Die
Verwendung des Vacciniavirus als Vektor für die Entwicklung rekombinanter
Lebendimpfstoffe ist durch Sicherheitsbedenken und Vorschriften
beeinflusst worden. Die meisten der in der Literatur beschriebenen
rekombinanten Vacciniaviren basieren auf dem Western Reserve-Stamm
des Vacciniavirus. Es ist bekannt, dass dieser Stamm eine hohe Neurovirulenz
besitzt und daher zur Verwendung bei Menschen und Tieren schlecht
geeignet ist (Morita et al., Vaccine (Impfstoff) 5, 65-70 [1987]). Einerseits
ist das modifizierte Vacciniavirus Ankara (MVA) dafür bekannt,
dass es äußerst unbedenklich
ist. Das MVA ist durch Langzeit-Seriendurchgang
des Ankarastamms des Vacciniavirus (CVA) auf Hühnerembryofibroblasten gebildet
worden (bezüglich
der Literatur, vergleiche Mayr, A., Hochstein-Mintzel, V. und Stickl,
H. [1975] Infection (Infektion) 3, 6-14; Schweizer Patent Nr. 568,392).
Beispiele der MVA-Virusstämme,
die den Erfordernissen des Budapester Vertrags gemäß aufgebracht
worden sind, sind die Stämme
MVA 572, MVA 575 und MVA-BN, die bei der European Collection of
Animal Cell Cultures (ECACC), Salisbury (Vereinigtes Königreich)
unter den Hinterlegungsnummer ECACC V94012707, ECACC V00120707 bzw. ECACC
V00083008 hinterlegt worden sind. MVA zeichnet sich durch seine
starke Attenuierung, d.h. die reduzierte Virulenz oder Infektiosität aus, während es
eine gute Immunogenität
beibehält.
Das MVA-Virus ist analysiert worden, um Änderungen im Genom im Vergleich
mit dem CVA-Stammvom Wildtyp zu bestimmen. Sechs Hauptdeletionen
der genomischen DNA (Deletion I, II, III, IV, V und VI), die insgesamt
31.000 Basenpaare umfassen, sind identifiziert worden (Meyer, H.,
Sutter, G. und Mayr A. [1991] J. Gen. Virol. 72, 1031-1038). Das
dabei entstehende MVA-Virus wurde stark auf Vogelzellen wirtszellenbegrenzt.
Des Weiteren ist MVA durch seine extreme Attenuation gekennzeichnet.
Beim Prüfen
in einer Reihe verschiedener tierischer Modelle erwies sich MVA
selbst in immungeschwächten
Tieren als nicht virulent. Noch wichtiger ist, dass die ausgezeichneten
Eigenschaften des MVA-Stamms in ausgedehnten klinischen Versuchen
bewiesen worden sind (Mayr et al., Zbl. Bakt. Hyg. I, Abt. Org.
B 167, 375-390 [1987],
Stickl et al., Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392 [1974]). Während dieser Studien an mehr als
120.000 Personen, einschließlich
Patienten mit erhöhtem
Risiko, sind keine Nebenwirkungen mit der Verwendung von MVA-Impfstoff
in Verbindung gebracht worden. Rekombinantes MVA, das als Impfstoffe
nützlich
ist, ist schon konstruiert und in klinischen Versuchen verwendet
worden. WO 98/13500 offenbart ein rekombinantes MVA, das eine oder mehrere
DNA-Sequenzen enthält
und auszudrücken in
der Lage ist, die Dengue-Virusantigene kodieren. Die fremden DNA-Sequenzen
wurden in die virale DNA an Stellen einer natürlich vorkommenden Deletion
im MVA-Genom rekombiniert.
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Vor
Anwendung von Pockenviren oder rekombinanten Pockenviren für Impfzwecke
ist es notwendig, das Virus bis zu einem gewissen Grad zu reinigen,
um den Erfordernissen bezüglich
der Vorschriften zu entsprechen. Die traditionelle Art, Pockenviren,
insbesondere MVA und rekombinantes MVA zu reinigen, ist wie folgt:
in einem ersten Schritt werden Zellen, die für die Infektion mit dem jeweiligen Pockenvirus anfällig sind,
gezüchtet.
Im Falle von MVA sind die anfälligen
Zellen u.a. Hühnerembryofibroblaste.
Die anfälligen
Zellen werden mit dem Pockenvirus infiziert und für eine Zeitspanne
kultiviert, die ausreicht, um die Bildung von Virusabkömmlingen
zu erlauben. Die Zellen werden dann gefroren und aufgetaut, um die
Zellen von der Oberfläche
der Züchtungsphiole
abzulösen
und die Zellen teilweise zu stören.
Die Mischung intakter und gestörter
Zellen wird geschleudert. Ultraschall wird zum Herstellen eines
Homogenisats verwendet. Durch Saccharosedämpfzentrifugieren wird Virus
aus dem Homogenisat gereinigt (Joklik WK., "The purification of four strains of
poxvirus" – die Reinigung
von vier Pockenvirusstämmen – Virology
1962; 18:9-18). Der Schlüsselschritt
bei diesem Vorgang besteht aus dem Homogenisieren unter Anwendung
von Ultraschall (Hedström,
K.G und Lindberg, U., Z. Immun. Forsch. 1969, 137:421-430; Stickl,
H., Korb, W. und Hochstein-Mintzel, V., Zbl. Bakt., I. Abt. Orig.
(1970), 215, 38-50). Bei technischen Vorgängen wird es vorgezogen, wenn
alle Verfahrensschritte leicht zu steuern und reproduzierbar sind.
Jedoch besteht der Nachteil der Verwendung von Ultraschall zum Homogenisieren
der Viruszellensuspension darin, dass der Ultraschallschritt auf
identische Weise schwer zur reproduzieren, schwer einzustellen und
es schwierig ist, das Verfahren vom Labor- auf den technischen Maßstab vergrößern.
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GEGENSTAND
DER ERFINDUNG
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Es
ist daher ein Gegenstand der Erfindung, ein Verfahren zur Gewinnung
von Pockenviren, insbesondere der Vacciniaviren, wie beispielsweise
des Stamms MVA, aus mit Pockenvirus infizierten Zellen bereitzustellen,
wobei die Homogenisierung der infizierten Zellen reproduzierbar,
leicht zu steuern ist und ein leichtes Vergrößern vom Labor- auf den technischen
Maßstab
erlaubt.
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GENAUE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Pockenviren,
insbesondere Vacciniaviren, wie beispielsweise Elstree-Stamm- oder
modifiziertes Vacciniavirus Ankara (MVA) aus infizierten Zellen.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur
Gewinnung von Pockenvirus aus infizierten Zellen weist den Schritt
des Aussetzens der infizierten Zellen einer Hochdruckhomogenisierung
unter Erhalt eines pockenvirushaltigen Homogenisats auf.
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Es
war unerwartet, dass intakte und infektiöse Pockenviren durch das erfindungsgemäße Verfahren
gewonnen werden können.
Die Hochdruckhomogenisierung wird allgemein für die Zerstörung von Zell- und Subzellstrukturen
verwendet, um Proteine oder Lipide von eukaryotischen und prokaryotischen Zellen
zu isolieren.
US 3,983,008 offenbart
ein Verfahren für
das Extrahieren nützlicher
Komponenten aus mikrobiellen Zellen durch Anwendung von Hochdruckhomogenisierungen.
Die extrahierten Verbindungen waren Hefeproteine, Bakterienenzyme
und Hefelipide.
DE 19 918 619 offenbart
die Verwendung des Hochdruckhomogenisierens zum Isolieren von HbsAg
von Hefezellen.
US 4,255,521 beschreibt
ein Verfahren für
das Extrahieren von Glukoseisomerase aus Mikroorganismenzellen durch
Hochdruckfreigabe. Das Hochdruckhomogenisieren ist auch zum Isolieren
von virusähnlichen
Teilchen (VÄT)
aus rekombinantem Saccharomyces cerevisiae (Milburn und Dunnill
(1994) Biotechnology and Bioengineering 44, 736-744) und für die Herstellung
und Reinigung von Adenovirusvektoren (
US
6,194,191 ) verwendet worden. VÄT und Adenoviren sind nichtentwickelte
und ziemlich kleine und einfache Viren, die deshalb Zellproteinstrukturen
gleichen. Aus diesem Grund ist es nicht erstaunlich, dass das Hochdruckhomogenisieren,
das sich als für
das Isolieren von Proteinen von Zellen geeignet erwiesen hat, auch
für das
Isolieren von Adenoviren und VÄT
von eukaryotischen Zellen verwendet werden kann. Im Gegensatz dazu
weisen intrazelluläre
reife Pockenvirusvirionen (IRV, man vergleiche unten, vergleiche
Fields et al., Fields Virology, 1996, Lippincott-Raven Verlag, Philadelphia, USA,
ISBN 0-7817-0253-4,
Kapitel 83, Seite 2654-5) eine sehr komplexe Morphologie auf, die
unter anderem Lipidmembranen aufweist. Die Morphologie und physikalischen
Eigenschaften eines Pockenvirus-IRV sind in gewissen Beziehungen
mit der Morphologie und den physikalischen Eigenschaften einer Zelle
verwandter als mit denjenigen eines nichtumhüllten Virus. Deshalb war zu
erwarten, dass die Bedingungen, die zur Disruption von Zellen unter
Anwendung der Hochdruckhomogenisierung angewendet werden, auch zur
Disruption von Pockenviren führen
würden.
Es war daher ein überraschendes
Ergebnis, dass die Hochdruckhomogenisierung Zellen stört, jedoch
eine ausreichende Menge von Pockenviren intakt lässt, die noch weiter gereinigt
werden können.
Anders ausgedrückt
hätte man
nicht angenommen, dass die Hochdruckhomogenisierung bei einem Verfahren
zur Gewinnung von Pockenviren aus infizierten Zellen angewendet
werden könnte.
In der Tat wird bei dem bekannten Verfahre zur Gewinnung von Pockenviren
aus infizierten Zellen Ultraschall zum Homogenisieren verwendet,
wobei es sich um eine ziemlich sanfte Art der Homogenisierung handelt.
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Im
Gegensatz zu den Gewinnungsverfahren, bei denen Ultraschall verwendet
wird, erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren
eine reproduzierbare Homogenisierung infizierter Zellen; das Verfahren
ist leicht zu steuern und der Vorgang kann ohne Weiteres vom Labor-
auf den technischen Maßstab
vergrößert werden.
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Im
Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung betrifft der Begriff "Pockenvirus" irgendein Virus,
das zur Familie der Poxviridae gehört. Das erfindungsgemäße Verfahren
wird bevorzugt mit Poxviridae der Unterfamilie Chordopoxviridae,
noch bevorzugter der Gattung Orthopoxvirus, Avipoxvirus, Capripoxvirus
und Suipoxvirus durchgeführt.
Am bevorzugtesten betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung
und Reinigung von Pockenviren, ausgewählt aus der Gruppe bestehend
aus Vacciniavirus, Ziegenpockenvirus, Schafpockenvirus, Kanarienpockenvirus
und Geflügelpockenvirus.
Besonders bevorzugt ist das Vacciniavirus. Beispiele von Vacciniavirusstämmen, die
bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
verwendet werden, sind die Stämme
Elstree, Wyeth, Copenhagen, Temple of Heaven, NYCBH, Western Reserve.
Die Erfindung ist nicht auf diejenigen Vacciniavirusstämme, die
spezifisch erwähnt werden,
beschränkt,
sondern kann statt dessen bei irgendeinem Vacciniavirusstamm verwendet
werden. Ein bevorzugtes Beispiel eines Vacciniavirusstamms ist der
modifizierte Vacciniavirusstamm Ankara (MVA). Ein typischer MVA-Stamm ist MVA 575,
der bei der European Collection of Animal Cell Cultures unter der
Hinterlegungsnummer ECACC V00120707 hinterlegt worden ist. Am bevorzugtesten
ist MVA-BN oder ein Derivat desselben. MVA-BN ist in WO 02/42480
(PCT/EP01/13628) beschrieben worden. Diese internationale Anmeldung
offenbart biologische Assays, die es erlauben, zu beurteilen, ob
ein MVA-Stamm MVB-BN oder ein Derivat desselben ist, und Verfahren,
die es erlauben, MVA-BN oder ein Derivat desselben zu erhalten.
Der Inhalt dieser Anmeldung wird in die vorliegende Erfindung summarisch
eingefügt.
MVA-BN ist bei der
European Collection of Animal Cell Cultures mit der Hinterlegungsnummer
ECACC V00083008 hinterlegt worden.
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Die
zu gewinnenden Viren können
native Viren, attenuierte Viren oder rekombinante Viren sein.
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Der
Begriff "rekombinantes
Virus" betrifft
irgendein Virus, bei dem in das Virusgenom ein heterologes Gen insertiert
worden ist, das nicht auf natürliche
Weise Teil des Virusgenoms ist. Ein heterologes Gen kann ein therapeutisches
Gen, ein Gen, das ein Antigen kodiert, oder ein Pepsid, umfassend
mindestens einen Epitop zum Induzieren einer Immunantwort, eine
Antisense-Expressionskassette
oder ein Ribozymgen sein. Verfahren zum Erhalten rekombinanter Viren
sind einem mit dem Stand der Technik vertrauten Fachmann bekannt.
Das heterologe Gen wird bevorzugt in eine nichtwesentliche Region
des Virusgenoms insertiert. Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung wird die heterologe Nukleinsäuresequenz an einer natürlich vorkommenden
Deletionsstelle des MVA-Genoms insertiert (in PCT/EP96/02926 offenbart).
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Ein "attenuiertes Virus" ist ein Virus, das
auf die Infektion des Wirtsorganismuses hin, zu einer geringeren
Mortalität
und/oder Morbidität
im Vergleich mit dem nichattenuierten Muttervirus führt. Ein
Beispiel eines attenuierten Vacciniavirus ist der Stamm MVA, insbesondere
MVA-575 und MVA-BN.
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Von
Pockenviren, wie beispielsweise dem Vacciniavirus, ist bekannt,
dass sie in zwei verschiedenen Formen existieren: dem Pockenvirus,
das an Zellmembranen im Zytoplasma der infizierten Zellen (intrazelluläre reife
Virionen (IRV)) anhaften und Viren, die externalisiert worden sind
(extrazelluläre
eingehüllte
Virionen (EEV)) (Vanderplasschen A., Hollinshead M., Smith G.L. "Intracellular and
extracellular vaccinia virions enter cells by different mechanisms" (Intrazelluläre und extrazelluläre Vacciniavirionen
treten in Zellen durch verschiedene Mechanismen ein) J. Gen. Virol
(1998), 79, 877-887). IRV und EEV sind beide infektiös, jedoch
morphologisch verschieden, da EEV eine zusätzliche Lipoproteinumhüllung enthalten.
Unter normalen Bedingungen sind IRV-Teilchen weitverbreiteter als
EEV, bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
können
jedoch beide Teilchentypen erhalten werden.
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Die
Ausgangsmaterialien für
den erfindungsgemäßen Homogenisierungsschritt
sind Zellen, die mit dem jeweiligen Pockenvirus infiziert sind.
Der Begriff "infizierte
Zellen", der zum
Definieren des Ausgangsmaterials für die erfindungsgemäße Homogenisierung
verwendet wird, bezieht sich auf intakte Zellen, die mit dem jeweiligen
Virus infiziert sind, auf Teile und Fragmente infizierter Zellen,
an denen das jeweilige Pockenvirus anhaftet, oder auf eine Mischung
intakter Zellen und lysierter/gestörter Zellen. Beispiele eines
Teils oder eines Fragments infizierter Zellen, sind Zellmembranen,
gestörter/lysierter
Zellen, an denen das jeweilige Pockenvirus anhaftet. Das Ausgangsmaterial
kann auch freie Virusteilchen enthalten, die weder an der Zellmembran
anhaften noch intrazellulär
positioniert sind.
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Um
die infizierten Zellen, die das Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren
darstellen, zu erhalten, werden eukaryotische Zellen mit dem jeweiligen
Pockenvirus infiziert. Die eukaryotischen Zellen sind Zellen, die
für die
Infektion mit dem jeweiligen Pockenvirus anfällig sind und eine Replikation
und Bildung des infektiösen
Virus erlauben. Derartige Zellen sind dem mit dem Stand der Technik aller
Pockenviren vertrauten Fachmann bekannt. Für MVA und den Vacciniavirusstamm
Elstree ist ein Beispiel dieses Typs von Zellen die Hühnerembryofibroblaste
(HEF) (Drexler I., Heller K., Wahren B., Erfle V. und Sutter G. "Highly attenuated
modified vaccinia Ankara replicates in baby hamster kidney cells,
a potential host for virus propagation, but not in various human
transformed and primary cells" (Hochattenuierte
modifizierte Vaccinia-Ankara-Replikate in den Nierenzellen von Babyhamstern,
einem potentiellen Wirt für
die Viruspropagierung, jedoch nicht in verschiedenen menschlichen
transformierten und primären Zellen)
J. Gen. Virol. (1998), 79, 347-352). HEF-Zellen können unter
Bedingungen, die dem mit dem Stand der Technik vertrauten Fachmann
bekannt sind, gezüchtet
werden. Bevorzugt werden die HEF-Zellen in einem serumfreien Medium
in feststehenden Flaschen oder Rollflaschen gezüchtet. Bevorzugt findet die
Inkubation für
48 bis 96 Stunden bei 37°C
+ 2°C statt.
Für die
Infizierung werden Pockenviren bevorzugt in einer Infektionsvielzahl
(IV) von 0, 05 bis 1 IGKD50 verwendet und
die Inkubation findet bevorzugt für 48 bis 72 Stunden bei 37°C + 2°C statt.
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Der
Infektionsfortschritt kann durch Beobachten der zytopatischen Auswirkungen
(ZPA), die typischerweise durch signifikantes Abrunden der infizierten
Zellen ersichtlich sind, beobachtet werden.
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Die
vorliegende Erfindung gestattet die Gewinnung von Pockenviren, wie
beispielsweise Elstree oder MVA, aus infizierten Zellen. Mit dem
Ausdruck "Gewinnung" ist gemeint, dass
das erfindungsgemäße Verfahren
es gestattet, mit Pockenviren infizierte Zellen zu stören und/oder
die Pockenviren von den Zellmembranen, an die sie gewöhnlich anhaften,
derart loszulösen,
dass eine weitere Reinigung des Pockenvirus möglich wird. So ist das Produkt
des Gewinnens von Pockenviren aus infizierten Zellen (in der vorliegenden
Erfindung als "pockenvirushaltiges Homogenisat" bezeichnet) eine
homogene Mischung von freiem Pockenvirus und Zelltrümmern, die
nur geringe Mengen an intakten, nichtgestörten Zellen und an Zellmembranen
anhaftendes Virus enthalten.
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Wenn
es sich bei den infizierten Zellen um Zellen handelt, die in einer
Suspensionskultur gezüchtet
werden können,
so können
die infizierten Zellen leicht durch Zentrifugieren geerntet werden.
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Wenn
die infizierten Zellen mehr oder weniger intakte adhärente Zellen
sind, so sollten sie geerntet, d.h. von der Züchtungsphiole entfernt, werden,
bevor sie der Hochdruckhomogenisierung unterworfen werden. Derartige
Verfahren sind dem mit dem Stand der Technik vertrauten Fachmann
bekannt. Nützliche
Techniken sind mechanische Verfahren (z. B. unter Anwendung von
Gummizellkratzern), physikalische Methoden (z. B. Gefrieren unter – 15°C und Auftauen
der Züchtungsgefäße bei über +15°C) oder biochemische
Verfahren (Behandlung mit Enzymen, z. B. Trypsin, um die Zellen
von dem Züchtungsgefäß abzulösen). Werden
Enzyme zu diesem Zweck verwendet, so sollte die Inkubationszeit gesteuert
werden, da diese Enzyme das Virus während der Inkubation auch beschädigen können.
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Bei
dem erfindungsgemäßen Verfahren
werden die infizierten Zellen, noch spezifischer die geernteten
infizierten Zellen, einem Hochdruckhomogenisierungsschritt unterworfen.
In der vorliegenden Beschreibung wird der Ausdruck "Hochdruckhomogenisierung" manchmal auch als
HDH abgekürzt.
Die Hochdruckhomogenisierung hat eine doppelte Wirkung. Einerseits
führt die
Hochdruckhomogenisierung zur Disruption intakter Zellen. So werden
die IRV freigesetzt und für
eine weitere Reinigung verfügbar.
Andererseits bewirkt die Hochdruckhomogenisierung, dass die Pockenviren
von Zellmembranen losgelöst
werden oder zumindest, dass die Größe der Zellmembran-Virusansammlungen
reduziert wird. Dies vereinfacht wiederum die weitere Reinigung
des Pockenvirus.
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Der
mit dem Stand der Technik vertraute Fachmann ist mit dem allgemeinen
Prinzip der Hochdruckhomogenisierung vertraut (White MD, Marcus D., "Disintegration of
microorganisms" (Desintegrierung
von Mikroorganismen), Adv. Biotechnol. Processes 1988; 8:51-96).
HDH-Systeme basieren auf der Verwendung von Hochdruck, um eine Probe
durch eine kleine unveränderliche Öffnung mit
hoher Geschwindigkeit unter geregelten und wiederholbaren Bedingungen
hindurchzudrücken.
In der vorliegenden Beschreibung werden die Ausdrücke "Strahl", "Öffnung" und "Düse" miteinander austauschbar
verwendet.
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Das
Herzstück
jedes Zelldisruptors ist ein Disruptionskopf. Der Disruptionskopf
besteht bevorzugt aus (I) einer Hochdruckkammer bzw. einem Hochdruckzylinder,
(II) einem Hochdruckkolben, der sich in die Kammer bzw. den Zylinder
hineinbewegt und dadurch den Druck in der Kammer/dem Zylinder erhöht und (III)
einer Düse/einem
Strahl, durch die bzw. den Kammerinhalt herausgestoßen wird.
Der herausgestoßene
Kammerinhalt wird auf eine Zielfläche wie beispielsweise ein
Stück Metall
gerichtet, das bevorzugt eine Wärmeaustauschoberfläche ist,
die das Kühlen
erlaubt. Um den gestörten
Kammerinhalt aufzufangen, ist das System mit einer Vorrichtung zum
Auffangen der gestörten
Probe ausgestattet (was als "Kammerauffang" bezeichnet wird).
Eine typische Hochdruckhomogenisierungseinheit ist die Basic Z+
von Constant Cell Disruption Systems (Low March, Daventry, Northants,
NN11 4SD, Vereinigtes Königreich).
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Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
gibt es drei Stufen zum Ausführen
der Zelldisruption unter Zuhilfenahme des Hochdruckhomogenisierungssystems.
(I) Eine Probe wird in den Hochdruckzylinder bzw. die Hochdruckkammer
eingeführt.
Dann wird der Druck in dem Hochdruckzylinder bzw. der Hochdruckkammer
erhöht.
Zu diesem Zweck senkt sich der Hochdruckkolben. (II) Der Kolben
drückt
dann die Probe mit einer hohen Geschwindigkeit durch die Düse. Die
Schnellübertragung
der Probe von einer Hochdruckregion in eine von niedrigem Druck
führt zur
Zelldisruption. (III) Die Probe trifft auf das Ziel auf und wird
radial über
die gekühlte
Wärmeaustauscheroberfläche ausgebreitet.
Das Produkt fließt dann
in eine Kammer zum Auffangen. Die Hydraulik wird neu beladen und
der Zyklus fortgeführt.
Am Ende des Vorgangs wird das ausgestoßene Homogenisat in einer geeignete
Phiole, je nach dem Volumen, aufgefangen.
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Zur
Gewinnung von erfindungsgemäßen Pockenviren
sollte die Düse
einen Durchmessers im Bereich von 0,10 bis 0,6 mm, 0,15 bis 0,6
mm, 0,15 bis 0,50 mm, bevorzugt im Bereich von 0,15 bis 0,40 mm,
0,20 bis 0,50 mm, noch bevorzugter 0,20 bis 0,40 mm, am bevorzugtestens
0,25 mm bis 0,35 mm aufweisen. Beispiele der bevorzugtesten Durchmesser
sind 0,25 mm und 0,35 mm.
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Der
Druck in der Druckkammer bzw. dem Druckzylinder wird auf einen Wert
im Bereich von 200 bis 1000 bar, bevorzugt 400 bis 1000 bar, 200
bis 800 bar, noch bevorzugter 400 bis 800 bar, 600 bis 1000 bar,
selbst noch bevorzugter 600 bis 900 bar, am bevorzugtesten 700 bis
900 bar eingestellt. Der bevorzugteste Druck ist 800 bar.
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Die
Temperatur des Homogenisats am Auslass sollte bevorzugt + 25°C nicht übersteigen
und sollte bevorzugt unter 15°C,
am bevorzugtesten unter 10°C
sein.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
kann maßstabsmäßig fast
linear vergrößert und
entweder als diskontinuierliches oder kontinuierliches Verfahren
durchgeführt
werden.
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Bei
einem diskontinuierlichen Verfahren kann jede Charge von Zellen,
die homogenisiert werden sollen, einmal oder mehrere Male dem Hochdruckhomogenisierungsschritt
unterworfen werden. Bevorzugt wird jede Charge ein- bis dreimal,
am bevorzugtesten nur einmal dem Homogenisierungsschritt unterworfen.
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Der
Erfolg des Homogenisierungsschritts kann bevorzugt durch Bestimmen
des Virustiters (der der Anzahl infektiöser Virusteilchen entspricht,
gemessen entweder in infektiöser
Gewebekulturdosis (IGKD50) oder plaquebildenden
Einheiten (PBE)) des Ausgangsmaterials, wie oben definiert, und
des nach dem Homogenisierungsschritt erhaltenen Materials überprüft werden.
Anders ausgedrückt
wird der Virustiter vor und nach der Hochdruckhomogenisierung bestimmt.
Das Ausgangsmaterial weist mehr oder weniger intakte Zellen und
einen ziemlich hohen Prozentsatz an großen Ansammlungen, die Pockenvirusteilchen
aufweisen, die an Zellmembranen gebunden sind, auf. Wird ein derartiges
Material für
die Bestimmung des Virustiters verwendet, so ist der erhaltene Titer
niedriger als die tatsächliche
Anzahl infektiöser
Teilchen. Das ist der Tatsache zuzuschreiben, dass die Prüfsysteme,
die für
die Bestimmung des Virustiters verwendet werden, gewöhnliche
Zellkultursysteme (wie beispielsweise das in Beispiel 2 offenbarte
System) sind, bei denen die Anzahl infizierter Zellen oder die Anzahl
von Plaques gezählt
wird. Ein derartiges System ist nicht in der Lage, zwischen einem
positiven Ergebnis, das der Infektion einer Zelle durch nur ein
Virusteilchen zuzuschreiben ist, und der Infektion von Zellen beispielsweise
durch eine große
Ansammlung von Viren, die an Zellmembranen gebunden sind, zu unterscheiden.
Nach dem Hochdruckhomogenisieren werden die Pockenviren von den
Zellmembranen losgelöst
und/oder die Größe der Zellmembranvirusansammlungen
signifikant reduziert, was zu einer größeren Anzahl kleinerer Ansammlungen
führt.
wird dieses Material zur Bestimmung des Titers verwendet, so sind
die erhaltenen Ergebnisse höher,
selbst wenn die tatsächliche
Menge an infektiösen
Virusteilchen sich nicht geändert hat.
So wird der Erfolg der Homogenisierung bevorzugt durch mindestens
eine gleiche oder höhere IGKD50/ml widergespiegelt ("IGKD" ist
die Abkürzung infektiöse Gewebekulturdosis)
des Homogenisats im Vergleich mit dem Ausgangsmaterial. Im Abschnitt der
Beispiele wird im Einzelnen gezeigt, wie der IGKD50/ml
Wert bestimmt werden kann. Als Alternative können die Qualität und der
Erfolg der Hochdruckhomogenisierung durch Elektronenmikroskopie
bestimmt werden.
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Zur
weiteren Reinigung wird das erhaltene Homogenisat wenigstens einem
Reinigungsschritt unterworfen, um eine mit Pockenvirus angereicherte Fraktion
zu erhalten. Insbesondere können
diese Schritte bei einem Vacciniavirus enthaltenden Homogenisat
durchgeführt
werden, wenn es beabsichtigt ist, dass Vacciniavirus noch weiter
zu reinigen.
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Der
Reinigungsschritt kann unter anderem wie folgt sein:
- – chargenweises
Zentrifugieren (z. B. unter Anwendung von Saccharosedämpfung)
oder kontinuierliche Durchflussultrazentrifugierung (Saccharosegradienten)
(Hilfenhaus, J., Köhler,
R. und Gruschkau, H., J. Biol. Stand. (1976)4, 285-293; Madalinski,
W., Bankovski, A. und Korbecki, M., Acta Virol. (1977) 21, 104-108),
- – Ultrafiltrierung
(z. B. Querstromfiltration unter Zuhilfenahme einer Membran mit
einer Porengröße von größer als
500 kDa, aber gleich oder kleiner als 0,1 μm),
- – Säulenchromatographie
(z. B. Ionenaustausch, hydrophobe Wechselwirkung, Größenexklusion oder
eine Kombination) (Hedström,
K.G. und Lindberg, U., Z. Immun. Forsch. 1969 137:421-430; Stickl,
H., Korb, W. und Hochstein-Mintzel, V., Zbl. Bakt., I. Abt. Orig.
(1970), 215, 38-50) oder
- – eine
Kombination aller der obigen (Masuda, N., Ellen, R.P. und Grove,
D.A., J. Bacteriol. (1981), 147(3), 1095-1104).
-
Irgendwelche
anderen Reinigungsverfahren, die dem mit dem Stand der Technik vertrauten
Fachmann bekannt sind, liegen ebenfalls innerhalb des Umfangs der
vorliegenden Erfindung.
-
Bevorzugt
ist der Reinigungsschritt ein Ultrafiltrationsschritt. Am bevorzugtesten
ist die Ultrafiltration, eine Querstromfiltration. Das Prinzip der
Querstromfiltration ist dem mit dem Stand der Technik vertrauten
Fachmann bekannt. Man vergleiche z. B. Richards, G.P. und Goldmintz,
D., J. Virol. Methods (1982), 4(3), Seite 147-153. "Evaluation of a cross-flow
filtration technique for extraction of polioviruses from inoculated
oyster tissue Homogenates" (Beurteilung
einer Querstromfiltrationstechnik für das Extrahieren von Polioviren
aus geimpften Austerngewebe-Homogenisaten).
-
Obwohl
ein Reinigungsschritt eventuell ausreicht, um die Erfordernisse
der Vorschriften für
biopharmazeutische Produkte zu erfüllen, können zwei oder mehr der oben
erwähnten
Reinigungsschritte kombiniert werden, um ein noch reineres Produkt
zu erhalten.
-
Die
bevorzugteste Ausführungsform
des ersten Reinigungsschritts ist ein Querstromfiltrationsschritt,
gefolgt von wenigstens einem Säulenchromatographieschritt.
Am bevorzugtesten ist der Säulenchromatographieschritt
ein Ionenaustausch oder eine hydrophobe Wechselwirkung.
-
Die
so erhaltene mit Virus angereicherte Fraktion wird wahlweise gefriergetrocknet.
Verfahren zum Gefriertrocknen sind dem mit dem Stand der Technik
vertrauten Fachmann bekannt (Day J. und McLellan M., Methods in
Molecular Biology (Methoden der Molekularbiologie) (1995), 38, Humana Press, "Cryopreservation
and freeze-drying protocols" (Kältekonservierung
und Gefriertrocknungsprotokolle)).
-
Die
Erfindung betrifft des Weiteren die mit Pockenvirus angereicherte
Fraktion und/oder das pockenvirushaltige Homogenisat, das durch
das Verfahren zur Gewinnung von Pockenviren der vorliegenden Erfindung
entsprechend erhalten wird, d.h. das Verfahren, das den Schritt
des Unterwerfens der infizierten Zellen einer Hochdruckhomogenisierung aufweist.
Insbesondere betrifft die Erfindung die mit Pockenvirus angereicherte
Fraktion, die durch das erfindungsgemäße Gewinnungs/Reinigungsverfahren,
d.h. das Verfahren erhalten wird, bei dem das pockenvirushaltige
Homogenisat, das durch HDH erhalten, wenigstens einem Reinigungsschritt
unterworfen wird. Bei dem Pockenvirus kann es sich um ein Pockenvirus
wie oben definiert handeln. Insbesondere ist das erfindungsgemäße Pockenvirus
ein Vacciniavirus, wie beispielsweise einer der Stämme, die
für die
Imfung geeignet sind, insbesondere der Stamm Elstree oder das modifizierte
Vacciniavirus Ankara, am bevorzugtesten MVA-BN.
-
Das
pockenvirushaltige Homogenisat und/oder die mit Pockenvirus angereicherte
Fraktion, die durch ein erfindungsgemäßes Verfahren erhalten werden,
das einen HDH-Schritt aufweist, ist durch ein sehr hohes Verhältnis von
freiem IRV-Pockenvirus zu EEV-Pockenvirus
gekennzeichnet. Der Ausdruck "freies
IRV" wird für IRV verwendet,
die von den Zellmembranen nach, vor oder während der Disruption der infizierten
Zellen losgelöst
worden sind und die deshalb weiter gereinigt werden können. Bei
allen technischen Verfahren für
die Zubereitung von Pockenviren weist das Ausgangsmaterial die infizierten Zellen
sowie die überstehende
Kulturlösung
auf. So weist das Ausgangsmaterial IRV-Pockenviren, die in den infizierten
Zellen enthalten sind, sowie EEV-Pockenviren, die hauptsächlich in
der überstehenden Lösung zu
finden sind, auf. Die bekannten Verfahren zur Disruption von Zellen
und der darauffolgenden Homogenisierung (z. B. unter Anwendung von
Ultraschall) stören
die Zellen und/oder lösen
die IRV-Pockenviren von Zelltrümmern
nicht so effizient wie die Hochdruckhomogenisierung. Anders ausgedrückt bleiben
die meisten der IRV an die Zellmembranen und Trümmer gebunden. So ist das Verhältnis von freiem
IRV zu EEV geringer als bei dem erfindungsgemäßen Verfahren. Bei dem Verfahren
mit Hilfe von Ultraschall ändert
sich dieses Verhältnis
während
der weiteren Reinigungsschritte nicht signifikant, da die Zelltrümmer, an
die die IRV noch gebunden sind, gewöhnlich entfernt werden. Im
Gegensatz zu den bekannten Methoden zur Gewinnung von Pockenviren, führt das
erfindungsgemäße Gewinnungsverfahren zu
einer sehr wirksamen Disruption der infizierten Zellen und die IRV
werden wirksam von den Zellmembranen gelöst. So ist die Gesamtmenge
an freien IRV, die zur weiteren Reinigung verfügbar werden, höher als
bei den im Stand der Technik bekannten Verfahren und deshalb ist
auch das Verhältnis
von freien IRV- zu EEV-Pockenviren höher.
-
Das
pockenvirushaltige Homogenisat und/oder die mit Pockenvirus angereicherte
Fraktion, die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhalten werden,
sind als Impfstoffe nützlich.
-
Wenn
das pockenvirushaltige Homogenisat und/oder die mit Pockenvirus
angereicherte Fraktion unmodifizierte Pockenviren oder attenuierte
Pockenviren, wie beispielsweise die Vacciniavirusstämme Elstree
oder MVA aufweisen, so kann es bzw. sie für das Impfen gegen Pockenvirusinfektionen
angewendet werden. Beispielsweise kann ein virushaltiges Homogenisat
und/oder die mit Virus angereicherte Fraktion, die Vacciniaviren
wie beispielsweise den Elstree- oder MVA-, insbesondere den MVA-BN-Stamm
umfassen, als Impfstoff gegen Blatterninfektionen verwendet werden.
-
Wenn
das pockenvirushaltige Homogenisat und/oder die mit Pockenvirus
angereicherte Fraktion ein Pockenvirus aufweist, das ein oder mehrere
heterologe(s) Gen e) enthält
und exprimiert, so kann das pockenvirushaltige Homogenisat und/oder
die mit Pockenvirus angereicherte Fraktion des Weiteren zum Impfen
von Tieren, einschließlich
Menschen, gegen das durch das bzw. die heterologen Gen e) exprimierten
Protein verwendet werden.
-
Für die Zubereitung
eines Impfstoffs werden das pockenvirushaltige Homogenisat und/oder
die mit Pockenvirus angereicherte Fraktion, die durch das erfindungsgemäße Verfahren
erhalten werden, in eine physiologisch akzeptable Form umgewandelt. Das
kann auf der Basis der Erfahrung bei der Zubereitung von Pockenvirusimpfstoffen,
die für
das Impfen gegen Blattern verwendet werden, erfolgen (wie durch
Stickl, H. et al [1974] Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392 beschrieben).
Beispielsweise werden das pockenvirushaltige Homogenisat und/oder
die mit Pockenvirus angereicherte Fraktion bei – 80°C mit einem Titer von 5 × 108 IGKD50/ml formuliert
in ca. 10 mM Tris, 140 mM NaCl pH-Wert 7,4, gelagert. Für die Zubereitung
von Impfstoffspritzen werden z. B. 103-109 IGKD50 des Virus
in mit Phosphat gepufferter physiologischer Kochsalzlösung (PSB)
in Gegenwart von 2% Pepton und 1% menschlichem Albumin in einer
Ampulle, bevorzugt einer Glasampulle, lyophilisiert. Als Alternative
können
die Impfstoffspritzen durch schrittweises Gefriertrocknen des Virus
in einer Rezeptur hergestellt werden. Diese Rezeptur kann zusätzliche
Zusatzmittel wie beispielsweise Mannit, Dextran, Zucker, Glycin,
Lactose oder Polyvinylpyrrolidon oder andere Zusatzmittel wie beispielsweise Antioxidantien
oder inertes Gas, Stabilisiermittel oder rekombinante Proteine (z.
B. menschliches Serumalbumin), die für die Verabreichung in vivo
geeignet sind, enthalten. Eine typische virushaltige Rezeptur, die
für das
Gefriertrocknen geeignet ist, weist 10 mM Tris-Puffermittel, 140 mM NaCl, 18,9 g/l
Dextran (Molmasse 36.000 – 40.000),
45 g/l Saccharose, 0,108 g/l L-Glutaminsäuremonokaliumsalzmonohydrat,
pH-Wert 7,4 auf. Die Glasampulle wird daraufhin dicht geschlossen
und kann bei 4°C
bis Raumtemperatur mehrere Monate lang gelagert werden. Jedoch kann
die Ampulle, so lange sie nicht gebraucht wird, bevorzugt bei Temperaturen
von –20°C gelagert
werden.
-
Zum
Impfen kann das lyophilisierte oder gefriergetrocknetes Produkt
in 0,1 bis 0,5 ml einer wässrigen
Lösung,
bevorzugt einer physiologischen Kochsalzlösung oder Tris-Puffermittel
gelöst
und entweder systemisch oder lokal, d.h. parenteral, intramuskulär oder auf
irgendeinem anderen Verabreichungsweg, der dem Fachmann bekannt
ist, verabreicht werden. Die Verabreichungsweise, die Dosis und
die Anzahl von Verabreichungen können
durch mit dem Stand der Technik vertraute Fachleute optimiert werden.
Am bevorzugtesten für
Pockenvirusvektoren ist die subkutane oder intramuskuläre Verabreichung.
-
Das
Impfen von Tieren, einschließlich
Menschen, umfasst das Impfen eines Tiers, einschließlich eines
Menschen, der dies benötigt,
mit einem pockenvirushaltigen Homogenisat oder einer mit Pockenvirus
angereicherten Fraktion, das bzw. die durch das erfindungsgemäße Verfahren
erhalten worden.
-
Zusammenfassung
der Erfindung
-
Die
Erfindung umfasst unter anderem Folgendes, als solches oder in Kombination:
Ein
Verfahren zur Gewinnung von Pockenvirus aus infizierten Zellen,
bei dem man die infizierten Zellen einer Hochdruckhomogenisierung
unter Erhalt eines pockenvirushaltigen Homogenisats aussetzt.
-
Ein
Verfahren wie oben, dadurch gekennzeichnet, dass das Pockenvirus
ausgewählt
ist aus der Gruppe bestehend aus Orthopoxviren, Avipoxviren, Suipoxviren
und Capripoxviren.
-
Ein
Verfahren wie oben, dadurch gekennzeichnet, dass das Pockenvirus
ausgewählt
ist aus der Gruppe bestehend aus Vacciniavirus, Ziegenpockenvirus,
Schafpockenvirus, Kanarienpockenvirus und Geflügelpockenvirus.
-
Ein
Verfahren wie oben, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem
Vacciniavirus um den modifizierten Vacciniavirusstamm Ankara (MVA),
insbesondere um MVA-BN mit der Hinterlegungsnummer ECACC V00083008,
handelt.
-
Ein
Verfahren wie oben, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem
Pockenvirus um ein rekombinantes Pockenvirus handelt.
-
Ein
Verfahren wie oben, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Durchführung der
Hochdruckhomogenisierung die infizierten Zellen in eine Hochdruckkammer
gibt, den Druck in der Kammer erhöht und die infizierten Zellen
durch eine Düse
ausschleust.
-
Ein
Verfahren wie oben, dadurch gekennzeichnet, dass der Druck in der
Kammer auf einen Wert im Bereich von 200 bis 1000 bar erhöht wird.
-
Ein
Verfahren wie oben, dadurch gekennzeichnet, dass die Düse einen
Durchmesser im Bereich von 0, 10 bis 0, 6 mm aufweist.
-
Ein
Verfahren wie oben, dadurch gekennzeichnet, dass das pockenvirushaltige
Homogenisat wenigstens einem Reinigungsschritt zur Erhaltung einer
mit Pockenvirus angereicherten Fraktion unterworfen wird.
-
Ein
Verfahren wie oben, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem
wenigstens einen Reinigungsschritte um einen Ultrafiltrationsschritt
handelt.
-
Ein
Verfahren wie oben, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der
Ultrafiltration um eine Querstromfiltration handelt.
-
Ein
Verfahren wie oben, dadurch gekennzeichnet, dass im Querstromfiltrationsschritt
eine Membran verwendet wird, deren Porengröße größer als 500 kDa, aber gleich
oder kleiner als 0,1 μm
ist.
-
Ein
Verfahren wie oben, dadurch gekennzeichnet, dass nach der Ultrafiltration
wenigstens ein Säulenchromatographieschritt
durchgeführt
wird.
-
Ein
Verfahren wie oben, dadurch gekennzeichnet, dass das pockenvirushaltige
Homogenisat oder die mit Pockenvirus angereicherte Fraktion gefriergetrocknet
wird.
-
Eine
mit Pockenvirus angereicherte Fraktion oder ein pockenvirushaltiges
Homogenisat, erhalten durch ein wie oben definiertes Verfahren.
-
Eine
mit Pockenvirus angereicherte Fraktion oder ein pockenvirushaltiges
Homogenisat wie oben als Impfstoff.
-
Verwendung
des pockenvirushaltigen Homogenisats oder der mit Pockenvirus angereicherten Fraktion
wie oben zur Herstellung eines Impfstoffs.
-
Legende zu
den Figuren
-
1:
Mit MVA-BN infizierte HEF-Zellen wurden einem Gefrier-Tauzyklus
unterworfen, um eine Viruszellensuspension zu erhalten. Der Virustiter
der Suspension wurde wie in Beispiel 2 beschrieben ohne weitere
Reinigung der Zellvirussuspension ("O-Wert") bestimmt. Die Viruszellsuspension
wurde einem Homogenisierungsverfahren, das aus dem Stand der Technik
bekannt ist unter Anwendung von Ultraschall ("Sonifikator") oder dem erfindungsgemäßen Homogenisierungsverfahren
("HDH"), wie in Beispiel
1 beschrieben, unterworfen. Im HDH-Schritt betrug der Druck 800
bar und die Düse
hatte einen Durchmesser von 0,25 mm. Am Ende des Homogenisierungsschritts
wurde der Virustiter nochmals bestimmt.
-
BEISPIEL(E)
-
Das
bzw. die folgenden Beispiel (e) veranschaulicht bzw. veranschaulichen
die vorliegende Erfindung noch weiter. Ein mit dem Stand der Technik vertrauter
Fachmann wird sich im Klaren darüber sein,
dass das bzw. die aufgeführte(n)
Beispiel (e) in keiner Weise so interpretiert werden können, dass die
Anwendbarkeit der durch die vorliegende Erfindung bei diesem bzw.
diesen Beispiel(en) gebotenen Technologie begrenzt wird.
-
Beispiel 1: Homogenisierung
von Pockenviruszellsuspensionen unter Zuhilfenahme eines Hochdruckhomogenisators
-
Hühnerembryofibroblaste
(HEF), die in Rollflaschen kultiviert worden waren, sind mit MVA-BN (ECACC
V00083008) infiziert worden. Die infizierten Zellen wurden Gefriertrocknen
und Auftauen unterworfen, um eine Viruszellsuspension zu erhalten.
-
Ein
Basic Z+-Homogenisator von Constant Cell Disruption Systems (Low
March, Daventry, Northants, NN11 4SD, Vereinigtes Königreich)
wurde mit 50 ml der rohen Viruszellsuspension bei jedem Lauf beladen.
Um die optimalen Homogenisierungsbedingungen zu identifizieren,
wurden Düsendurchmesser
im Bereich von 0,18 bis 0,40 mm und Druckwerte von 200 bis 1000
bar getestet. Die rohe Suspension wurde der Hochdruckhomogenisierung
einmal, zweimal oder dreimal unterworfen. Der Homogenisator wurde
den Anweisungen des Herstellers entsprechend angewendet. Die Beurteilung
des Verfahrens wurde durch Überwachen
des Titers, wie in Beispiel 2 beschrieben, durchgeführt.
-
In
vorläufigen
Studien wurde festgestellt, dass Düsendurchmesser von mehr als
0,4 mm keinen positiven Einfluss auf die Homogenisierungsergebnisse
besitzen. Bei den Düsendurchmessern
von 0,18 mm, 0,25 mm und 0,35 mm wurden die besten Ergebnisse durch
einmaliges Unterwerfen der Viruszellsuspension einem Druck von 800
bar erzielt. Unter diesen Bedingungen ist kein wesentlicher Unterschied
bezüglich
des Titers beobachtet worden.
-
Das
erfindungsgemäße Verfahren
wurde mit der aus dem Stand der Technik bekannten Direktdurchfluss-Ultraschallbehandlung
verglichen. Die Ergebnisse sind in 1 zusammengestellt.
Im Vergleich mit der Ultraschallbehandlung führte das erfindungsgemäße Verfahren
zu einem höheren
Virustiter und einer besseren Homogenität der Suspension, so dass es
für das
weitere Verarbeiten stromabwärts
geeigneter ist.
-
Beispiel 2: Titration
von modifiziertem Vacciniavirus Ankara (MVA)
-
Die
Titration von modifiziertem Vacciniavirus Ankara (MVA) wird in einem
Assay auf IGKD50-Basis unter Anwendung von
10-fachen Verdünnungen
in einem Format von 96 Vertiefungen durchgeführt. Am Endpunkt des Assays
werden infizierte Zellen durch Anwendung eines Anti-Vacciniavirus-Antikörpers und einer
entsprechenden Färbelösung sichtbar
gemacht.
-
2-3
Tage alte primäre
HEF (Hühnerembryofibroblast)-Zellen werden in
7% RPMI auf 1 × 105 Zellen/ml verdünnt. 10-fache Verdünnungen
werden mit 8 Replikaten pro Verdünnung
hergestellt. Auf die Verdünnung
hin werden 100 μl
pro Vertiefung der Platten mit 96 Vertiefungen beimpft. Die Zellen
werden dann über
Nacht bei 37°C
und 5% CO2 inkubiert.
-
Verdünnungen
der virushaltigen Lösungen werden
in 10-fachen Schritten
(10-1 bis 10-12,
je nach Eignung) unter Anwendung von RPMI ohne fötales Kalbserum hergestellt.
Daraufhin werden 100 μl
jeder Virusprobe in die Zellen enthaltenden Vertiefungen eingegeben.
-
Die
Platten von 96 Vertiefungen werden bei 37°C mit 5% CO2 5
Tage inkubiert, um die Infektion und die Virusreplikation zu gestatten.
-
5
Tage nach der Infektion werden Zellen mit einem Vacciniavirus-spezifischen
Antikörper
gefärbt. Für das Erfassen
des spezifischen Antikörpers
wird ein mit Meerrettichperoxidase (MRP) gekoppelter sekundärer Antikörper verwendet.
Der MVA-spezifische Antikörper
ist ein Anti-Vacciniavirus-Antikörper,
eine klonale Kaninchen-IgG-Fraktion (Quartett, Berlin, Deutschland
#9503-2057). Der sekundäre
Antikörper ist
ein Antikaninchen-IgG-Antikörper,
MRP-gekoppeltes Ziegenpolyklonal (Promega, Mannheim, Deutschland,
#W4011). Die Farbreaktion wird bekannten Techniken entsprechend
durchgeführt.
-
Jede
Vertiefung mit Zellen, die eine positive Farbreaktion aufweisen,
wird zur Berechnung der IGKD50 als positiv
markiert.
-
Der
Titer wird unter Anwendung der Formel von Spearman [1] und Kaerber
[2] berechnet. Da alle Assayparameter konstant gehalten werden,
wird die folgende vereinfachte Formel verwendet:
Virustiter
[IGKD
50/ml] = 10
- a
- = Verdünnungsfaktor
der letzten Spalte, bei der alle acht Vertiefungen positiv sind
- xa
- = Anzahl positiver
Vertiefungen in Spalte a + 1
- xb
- = Anzahl positiver
Vertiefungen in Spalte a + 2
- xc
- = Anzahl positiver
Vertiefungen in Spalte a + 3