KR20040070263A - 감염된 세포로부터 폭스바이러스를 회수 및 정제하는 방법 - Google Patents
감염된 세포로부터 폭스바이러스를 회수 및 정제하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 감염된 세포로부터 폭스바이러스, 특히 변형된 백시니아 바이러스 앙카라(MVA)를 회수하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 상기 바이러스에 감염된 세포는 바이러스-함유 균질체를 얻기 위하여 고압 균질화를 거친다. 상기 바이러스-함유 균질체는 폭스바이러스-풍부 분획을 얻기 위하여 적어도 한가지 정제 단계를 거칠 수 있다. 또한, 본 발명은 본 발명에 따른 방법에 의해 얻어진 상기 바이러스-함유 분획 및 상기 바이러스-함유 균질체에 관한 것이다.
Description
폭스비리대(poxviridae)는 척추동물 및 무척추동물 세포의 세포질에서 복제하는 복잡한 DNA 바이러스의 큰 과(family)를 포함한다. 폭스비리대 과는 코르도폭스비리내(cordopoxvirinae)(척추동물 폭스바이러스) 및 엔토모폭스비리내(entomopoxvirinae)(곤충 폭스바이러스)의 아과(subfamily)로 나누어 질 수 있다.
코르도폭스비리내는 카멜폭스(camelpox) 바이러스, 쉽폭스(sheeppox) 바이러스, 고트폭스(goatpox) 바이러스 또는 아비폭스바이러스(avipoxvirus), 특히 파울폭스바이러스(fowlpoxvirus)와 같은 현저한 경제학적 중요성을 가지는 몇 가지 동물 폭스바이러스(다른 속으로 분류됨)를 포함한다. 쉽폭스 및 고트폭스에 대해 가축을 백신화시키기 위하여, 약독화 생(live)-바이러스 및 불활성화된 백신이 이용된다. 가금류의 백신화를 위하여, 파울폭스바이러스를 벡터로 사용한 재조합 백신이 개발되어 왔다.
파울폭스바이러스는 인간세포를 감염시키기 때문에, 이것은 또한 인간에서 이형 유전자를 발현시키고 상응하는 면역 반응을 유도하기 위한 벡터로 사용될 수 있다고 추정되었다. 게놈내에 HIV 유전자를 포함하는 파울폭스바이러스는 US5,736,368호 및 US6,051,410호에 개시되어 있다.
인간에 있어서, 오르쏘폭스바이러스(Orthopoxvirus) 속의 일원인 바리올라(variola) 바이러스는 단연코 가장 중요한 폭스바이러스였다. 또한, 폭스비리대 과의 오르쏘폭스바이러스 속의 일원인 백시니아 바이러스는 천연두에 대한 면역화를 위하여 생균 백신으로 사용되었다. 백시니아 바이러스를 이용한 성공적인 전세계적 백신화는 바리올라 바이러스의 박멸로 정점에 달하였다(천연두의 지구적 박멸. 천연두 박멸의 확인을 위한 지구 위원회의 최종 보고서. 공중보건의 역사, 제4권, 제네바, 세계 보건 기구, 1980). 상기와 같은 WHO의 선언 이후, 폭스바이러스 감염의 고위험군(예를 들면, 실험실 작업자) 집단을 제외하고 수년동안 백신화는 중단되어 왔다. 백신화 프로그램은 바리올라 바이러스가 생물학적 전쟁 또는 바이오테러리스트(bioterrorist)에 의해 사용될 가능성이 있다는 관점에서 관심의 대상이 되고 있다.
또한, 더욱 최근에는 재조합 유전자 발현 및 재조합 생균 백신으로서의 잠재적인 용도를 위한 바이러스 벡터를 조작(engineer)하기 위하여 백시니아 바이러스가 사용되어 왔다(Mackett, M., Smith, G.L. 및 Moss, B. [1982], P.N.A.S.USA, 79, 7415-7419; Smith, G.L., Mackett, M. and Moss, B. [1984], Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, 2, 383-407). 이것은 외래 항원을 코딩하는 DNA 서열(유전자)이 DNA 재조합 기술의 도움을 받아 백시니아 바이러스의 게놈속으로 도입되는 것을 가능하게 한다. 만일, 상기 유전자가 바이러스의 생명 순환(life cycle)에 비-필수적인 바이러스 DNA 부위에 삽입된다면, 새롭게 생산된 재조합 백시니아 바이러스가 감염성이 될 가능성이 있으며, 다시 말하면 외래 세포를 감염시켜서 삽입된 DNA 서열을 발현시킬 수 있게 된다(유럽 특허 출원 제83,286호 및 제110,385호). 이러한 방식으로 제조된 상기 재조합 백시니아 바이러스는 한편으로는 감염성 질환의 예방을 위한 생균 백신으로, 다른 한편으로는 진핵세포에서 이형(heterologous) 단백질을 제조하기 위하여 사용될 수 있다.
재조합 생균 백신의 개발을 위한 벡터로서의 백시니아 바이러스의 용도는 안전성 관계 및 규제에 의해 영향을 받는다. 문헌에 기재된 대부분의 재조합 백시니아 바이러스는 백시니아 바이러스의 서방 보관 균주(Western Reserve strain)에 기초하고 있다. 상기 균주는 높은 신경독성(neurovirulence)을 가지고 있는 것으로 알려져 있으며, 따라서 인간 및 동물에 사용하기에는 적합하지 않다(Morita et al., Vaccine, 5, 65-70, [1987]). 다른 한편으로, 변형된 백시니아 바이러스 앙카라(MVA)는 예외적으로 안전한 것으로 알려져 있다. MVA는 백시니아 바이러스의앙카라 균주(CVA)를 병아리 배아 섬유아세포에서 오랜 기간 순차적으로 계대배양함으로써 제조되었다(리뷰(review)를 위하여, Mayr, A., Hochstein-Mintzel, V. 및 Stickl, H. [1975], Infection, 3, 6-14; 스위스 특허 제568,392호 참조). 부다페스트 조약의 요구사항을 충족하는 기탁된 MVA 바이러스 균주의 예로는 영국 살리스베리(Salisbury)에 위치한 ECACC (European Collection of Animal Cell Cultures)에 각각 기탁번호 ECACC V94012707, ECACC V00120707 및 ECACC V00083008로 기탁된 MVA 572, MVA 575 및 MVA-BN 균주가 있다. MVA는 높은 약독화, 즉 좋은 면역원성을 유지하는 동안 감소된 독성 또는 감염성을 가지는 것에 의해 구별된다. 상기 MVA 바이러스는 야생형 CVA 균주에 대한 게놈상의 변형된 부위를 결정하기 위해 분석되어 왔다. 총 31,000 염기쌍의 게놈 DNA의 여섯 개의 주된 결실부위(결실부위 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ, Ⅴ 및 Ⅵ)가 동정되었다(Meyer, H., Sutter, G. 및 Mayr A. [1991], J. Gen. Virol., 72, 1031-1038). 결과물인 MVA 바이러스는 숙주 세포가 조류 세포로 크게 제한되었다. 아울러, MVA는 극도의 약독화를 특징으로 한다. 다양한 동물 모델에서 검사될 때, MVA는 면역억제된 동물에서조차도 비독성인 것으로 판명되었다. 더욱 중요하게는, MVA 균주의 뛰어난 특성이 광범위한 임상 시험에서 알려져 왔다(Mayr et al., Zbl. Bakt. Hyg. I, Abt. Org. B 167, 375-390, [1987], Stickl et al., Dtsch. Med. Wschr., 99, 2386-2392, [1974]). 고위험군 환자를 포함하는 120,000명 이상에 대한 상기 연구 동안, MVA 백신의 사용과 관련된 어떠한 부작용도 관찰되지 않았다. 백신으로 유용한 재조합 MVA는 이미 제조되었고 임상 시험에서 사용되고 있다. WO98/13500은 뎅기(dengue) 바이러스 항원을코딩하는 하나 또는 그 이상의 DNA 서열을 포함하고 발현할 수 있는 재조합 MVA를 개시하고 있다. 상기 외래 DNA 서열은 MVA 게놈의 자연 발생 결실부위에서 바이러스 DNA 속으로 재결합되었다.
백신화를 위한 폭스바이러스 또는 재조합 폭스바이러스를 사용하기 이전에, 규제 요구사항(regulatory requirement)을 충족시키기 위하여 상기 바이러스를 어느 정도 정제하는 것이 필요하다. 폭스바이러스, 특히 MVA 및 재조합 MVA를 정제하기 위한 전통적인 방법은 하기와 같다: 첫 번째 단계에서 각각의 폭스바이러스로 감염되기 민감한 세포가 배양된다. MVA의 경우, 민감한 세포는 예를 들면, 병아리 배아 섬유아세포이다. 상기 민감한 세포는 상기 폭스바이러스로 감염되고 바이러스 자손(progeny)이 생산될 수 있을 정도로 충분한 기간동안 배양된다. 이후, 상기 세포는 배양 바이알(vial) 표면으로부터 세포를 떼어내고 부분적으로 세포를 파쇄하기 위하여 동결 및 해동된다. 온전한(intact) 및 파쇄된 세포의 혼합물은 회전시켜 가라앉힌다(spin down). 균질체를 제조하기 위하여 초음파가 사용된다. 바이러스는 수크로스 쿠션(cushion) 원심분리에 의해 균질체로부터 정제된다(Joklik WK., "네가지 폭스바이러스 균주의 정제", Virology, 1962, 18, 9-18). 상기 공정의 핵심 단계는 초음파를 사용한 균질화이다(Hedstrom, K.G. 및 Lindberg, U., Z. Immun. Forsch., 1969, 137, 421-430; Stickl, H., Korb, W. 및 Hochstein-Mintzel, V., Zbl. Bakt, I. Abt. Orig. (1970), 215, 38-50). 산업 공정에서는 모든 공정 단계들이 조절 및 재현되기 쉬운 것이 바람직하다. 그러나, 상기 바이러스-세포 현탁액을 균질화하기 위하여 초음파를 사용하는 것은 상기 초음파 단계가 동일한 방식으로 재현되기 어렵고, 조정하기 어려우며, 아울러 실험실 규모에서 산업적 규모로 규모를 키우는 것이 어렵다는 점에서 불리하다.
본 발명은 감염된 세포로부터 폭스바이러스, 특히 변형된 백시니아 바이러스 앙카라(MVA)를 회수(recover)하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 상기 폭스바이러스에 감염된 세포는 폭스바이러스-함유 균질체(homogenate)를 얻기 위하여 고압 균질화(homogenization)를 거친다. 상기 폭스바이러스-함유 균질체는 폭스바이러스-풍부(enriched) 분획을 얻기 위하여 적어도 한가지 정제 단계를 거칠 수 있다. 또한, 본 발명은 본 발명에 따른 방법에 의해 얻어진 상기 폭스바이러스-함유 분획 및 상기 폭스바이러스-함유 균질체에 관한 것이다.
도 1은 바이러스-세포 현탁액을 얻기 위하여 동결-해동 순환을 거친 것으로서, MVA-BN에 감염된 CEF 세포를 도시한다. 상기 현탁액의 바이러스 타이터는 세포-바이러스 현탁액의 추가적인 정제 없이 실시예 2에서 기술된 바대로 결정되었다("0 값"). 상기 바이러스-세포 현탁액은 초음파("소니파이어(Sonifier)")를 사용하여 종래기술에서 공지된 균질화 방법을 거치거나 또는 실시예 1에서 기술된 바대로 본 발명에 따른 균질화 방법("HPH")을 거쳤다. HPH 단계에서, 압력은 800 바아 였으며, 노즐은 0.25 ㎜의 직경을 가졌다. 균질화 단계가 끝났을 때, 바이러스 타이터를 다시 측정하였다.
발명의 목적
따라서, 본 발명의 목적은 폭스바이러스로 감염된 세포로부터 폭스바이러스, 특히 MVA 균주와 같은 백시니아 바이러스를 회수하기 위한 방법을 제공하는 데 있으며, 상기에서 감염된 세포의 균질화는 재생산적이고, 조절하기 쉬우며, 아울러 실험실 규모에서 산업적 규모로 규모를 키우기가 용이하다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 감염된 세포로부터 폭스바이러스, 특히 엘스트리(Elstree) 또는 변형된 백시니아 바이러스 앙카라(MVA) 균주와 같은 백시니아 바이러스를 회수하기 위한 방법에 관한 것이다. 고압 균질화(high-pressure homogenization)는 진핵 및 원핵 세포로부터 단백질 또는 지질을 분리하기 위하여 세포 및 아세포(subcellular) 구조를 파괴하기 위해 종종 사용된다. US3,983,008호는 고압 균질화를 이용하여 미생물 세포로부터 유용한 성분들을 추출하는 방법에 관해 개시하고 있다. 추출된 성분들은 효모 단백질, 박테리아 효소 및 효모 지질이었다. DE19918619는 효모 세포로부터 HbsAG을 분리하기 위한 고압 균질화의 용도에 대해 개시하고 있다. US4,255,521호는 고압 방출에 의해 미생물 세포로부터 글루코스 아이소머라제(glucose isomerase)를 추출하기 위한 방법에 관해 개시하고 있다. 또한, 고압 균질화는 재조합 사카로마이세스 세르비지애(Sacccharomycescerevisiae)로부터 바이러스-유사 입자(VLP)를 분리하고(Milburn 및 Dunnill, (1994), Biotechnology and Bioengineering, 44, 736-744), 아데노바이러스 벡터를 생산 및 정제하기 위해(US6,194,191) 사용되어 왔다. VLP 및 아데노바이러스는 비막 구조(non-enveloped)이며, 따라서 세포내 단백질 구조를 닮은 작고 단순한 바이러스이다. 따라서, 세포로부터 단백질을 분리하기 위해 적합하다고 알려진 고압 균질화가 진핵 세포로부터 아데노바이러스 및 VLP를 분리하기 위해 사용될 수 있다는 점은 놀랄만한 일이 아니다. 반대로, 세포내의 성숙한 폭스바이러스 비리온(virion)(IMV, 하기 내용 참조, Fields 등, Fields Virology, 1996, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, USA, ISBN 0-7817-0253-4, 83장, 2654-5페이지 참조)은 특히 지질막을 포함하는 매우 복잡한 형태를 가지고 있다. 폭스바이러스 IMV의 형태 및 물리적 성질은 어떤 측면에서는 비막 구조인 바이러스보다는 세포의 형태 및 물리적 성질과 더 밀접한 관계가 있다. 결과적으로, 고압 균질화를 이용하여 세포를 파쇄하기 위해 사용된 조건들이 또한 폭스바이러스의 파쇄라는 결과를 가져올 것이라고 기대되었다. 따라서, 고압 균질화가 세포는 파쇄하지만 추가로 정제될 수 있는 충분한 양의 폭스바이러스를 온전히 남겨둔다는 점은 놀랄만한 결과였다. 달리 말하면, 사람들은 감염된 세포로부터 폭스바이러스를 회수하기 위한 방법에 고압 균질화가 사용될 수 있다는 것을 추측하지 못했다. 실제로, 감염된 세포로부터 폭스바이러스를 회수하기 위한 공지된 방법에서는 균질화를 위해 초음파를 사용하는데, 이것은 비교적 약한(gentle) 균질화 방법이다. 초음파를 사용하는 회수 방법과는 대조적으로, 본 발명에 따른 방법에서는 감염된 세포의 재생산적 균질화를 허용한다; 상기 방법은 조절하기 쉬우며, 실험실 규모에서 산업적 규모로 규모를 키우기가 용이하다.
본 발명의 명세서에 있어서, "폭스바이러스"라는 용어는 폭스비리대 과에 속하는 모든 바이러스를 의미한다. 본 발명에 따른 방법은 바람직하게는 코르도폭스비리내 아과, 더욱 바람직하게는 오르쏘폭스바이러스, 아비폭스바이러스, 카프리폭스바이러스 및 수이폭스바이러스 속의 폭스비리대를 사용하여 수행된다. 가장 바람직하게는 본 발명은 백시니아 바이러스, 고트폭스바이러스, 쉽폭스바이러스, 카나리폭스바이러스 및 파울폭스바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는 폭스바이러스를 회수 및 정제하는 방법에 관한 것이다. 특히 바람직한 것은 백시니아 바이러스이다. 본 발명에 따른 방법에서 사용된 백시니아 바이러스 균주의 예로는 엘스트리, 와이쓰(Wyeth), 코펜하겐(Copenhagen), 템플 오브 헤븐(Temple of Heaven), NYCBH, 웨스턴 리저브(Western Reserve) 균주가 있다. 본 발명은 상기 특정하게 언급된 백시니아 바이러스 균주에 한정되는 것이 아니라 어떤 백시니아 바이러스 균주라도 대신 사용될 수 있다. 백시니아 바이러스 균주의 바람직한 예로는 변형된 백시니아 바이러스 균주 앙카라(MVA)가 있다. 전형적인 MVA 균주는 동물 배양 세포의 유럽 콜렉션(ECACC, European Collection of Animal Cell Culture)에 기탁번호 ECACC V00120707로 기탁되어 있는 MVA 575이다. 가장 바람직한 것은 MVA-BN 또는 그의 유도체이다. MVA-BN은 WO02/42480 (PCT/EP01/13628)에 개시되어 있다. 상기 국제 출원은 MVA 균주가 MVA-BN 또는 그의 유도체인지 여부를 평가할 수 있게 하는 생물학적 분석 및 MVA-BN 또는 그의 유도체를 얻기 위한 방법에 관해 개시하고 있다. 상기 출원의 내용은 본 출원에서 참고문헌으로 포함되어 있다. MVA-BN은 ECACC에 기탁번호 ECACC V00083008로 기탁되어 있다.
회수되는 바이러스는 자연상태(native) 바이러스, 약독화된 바이러스 또는 재조합 바이러스일 수 있다.
"재조합 바이러스"라는 용어는 자연상태에서는 바이러스 게놈의 일부분이 아닌 이형 유전자가 바이러스 게놈으로 삽입된 모든 바이러스를 의미한다. 이형 유전자는 치료 유전자, 면역 반응을 유도하기 위한 적어도 하나의 에피토프(epitope)를 포함하는 항원 또는 펩타이드를 코딩하는 유전자, 안티센스(antisense) 발현 카세트(cassette) 또는 리보자임(ribozyme) 유전자가 될 수 있다. 재조합 바이러스를 얻기 위한 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 상기 이형 유전자는 바람직하게는 바이러스 게놈의 비-필수 영역으로 삽입된다. 본 발명의 다른 바람직한 실시예에서, 상기 이형 핵산 서열은 MVA 게놈의 자연 발생 결실 부위로 삽입된다(PCT/EP96/02926).
"약독화된 바이러스"는 숙주 생물체에 감염될 때 비-약독화 양친 바이러스와 비교할 때 낮은 치사율 및/또는 이환율을 보이는 바이러스이다. 약독화된 백시니아 바이러스의 예로는 MVA 균주, 특히 MVA-575 및 MVA-BN 균주가 있다.
백시니아 바이러스와 같은 폭스바이러스는 두 가지 다른 형태로 존재하는 것으로 알려져 있다: 감염된 세포의 세포질에 있는 세포막에 부착된 폭스바이러스(세포내 성숙 비리온, IMV) 및 외부로 나온 바이러스(세포외 막 비리온, EEV)(Vanderplasschen A, Hollinshead M, Smith GL, "세포내 및 세포외 백시니아비리온은 다른 메카니즘에 의해 세포에 들어간다", Gen, Virol. (1998), 79, 877-887). IMV 및 EEV는 모두 감염성이 있으나, EEV가 추가적인 지질단백질(lipoprotein) 막을 포함하고 있기 때문에 다른 형태를 보인다. 정상적인 환경에서는 IMV 입자가 EEV보다 더 풍부하지만, 본 발명에 따른 방법에서는 양쪽 타입의 입자 모두 얻을 수 있다.
본 발명에 따른 균질화 단계를 위한 출발 물질로는 각각의 폭스바이러스로 감염된 세포가 있다. 본 발명에 따른 균질화를 위한 출발 물질을 정의하기 위해 사용된 "감염된 세포"는 각각의 바이러스로 감염된 온전한 세포, 각각의 폭스바이러스가 부착된 감염된 세포의 부분 또는 절편, 또는 온전한 세포 및 용해된/분쇄된 세포의 혼합물을 의미한다. 또한, 출발 물질은 세포막에 부착되거나 또는 세포내에 위치하지 않은 자유(free) 바이러스 입자를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 방법을 위한 출발 물질이 되는 감염된 세포를 얻기 위하여, 진핵 세포가 각각의 폭스바이러스로 감염된다. 상기 진핵 세포는 각각의 폭스바이러스로 감염되기 쉽고, 감염된 바이러스의 복제 및 생산을 허용하는 세포이다. 상기 세포는 모든 폭스바이러스에 대하여 당업자에게 공지되어 있다. MVA 및 백시니아 바이러스 균주 엘스트리의 경우, 상기와 같은 타입의 세포의 예로는 병아리 배아 섬유아세포(CEF)가 있다(Drexler I., Heller K., Wahren B., Erfle V. 및 Sutter G. "매우 약독화된 변형된 백시니아 앙카라가 바이러스 증식을 위한 잠재적인 숙주인 어린 햄스터 신장 세포에서는 복제되지만 다양한 인간 형질전환 세포 또는 1차 세포에서는 복제되지 않는다", J. Gen. Virol. (1998), 79, 347-352). CEF세포는 당업자에게 공지된 조건하에서 배양될 수 있다. 바람직하게는 상기 CEF 세포는 정지상(stationary) 플라스크 또는 롤러(roller) 병에서 혈청-부재 배지로 배양된다. 상기 배양은 바람직하게는 37℃±2℃에서 48 내지 96시간동안 일어난다. 감염을 위하여, 폭스바이러스는 바람직하게는 0.05 내지 1 TCID50의 MOI (multiplicity of infection)에서 사용되며, 상기 배양은 바람직하게는 37℃±2℃에서 48 내지 72시간동안 일어난다.
감염의 진행은 세포손상 효과(cytopathic effect, CPE)를 살펴봄으로써 관찰될 수 있으며, 전형적으로는 감염된 세포가 현저하게 둥글게 되는 현상이 나타난다.
본 발명은 감염된 세포로부터 엘스트리 또는 MVA와 같은 폭스바이러스의 회수를 허용한다. "회수"라는 용어는, 본 발명의 방법이 폭스바이러스의 추가적인 정제가 가능할 정도로 폭스바이러스 감염 세포를 분쇄하거나 및/또는 보통 폭스바이러스가 부착되어 있는 세포막으로부터 상기 폭스바이러스를 떼어낼 수 있음을 뜻한다. 따라서, 감염된 세포로부터 회수된 폭스바이러스 생성물(본 명세서에서는 "폭스바이러스-함유 균질체"라 칭함)은 온전한, 비분쇄된 세포 및 세포막에 결합된 바이러스를 적은 양으로 포함하는 자유 폭스바이러스 및 세포 분쇄물의 균질한 혼합물이다.
만일 감염된 세포가 부유(suspension) 배양에서 배양될 수 있는 세포라면, 감염된 세포는 원심분리에 의해 쉽게 수확될 수 있다. 만일 상기 감염된 세포가어느 정도 부착되어 자라는 세포라면, 이들은 고압 균질화에 적용하기 이전에 배양 바이알(vial)로부터 수확, 즉 떼어질 수 있다. 상기 방법들은 당업자에게 공지되어 있다. 유용한 기술들로는 기계적 방법(예를 들면, 고무 세포 스크레이퍼(scarper)를 이용), 물리적 방법(예를 들면, -15℃ 이하에서 동결 및 15℃ 이상에서 배양 용기를 해동) 또는 생화학적 방법(예를 들면, 배양 용기로부터 세포를 떼어내기 위하여 트립신과 같은 효소를 처리)이 있다. 만일 효소가 상기 목적을 위해 사용된다면, 배양과정에서 상기 효소들이 바이러스를 손상시킬 수 있기 때문에 배양 시간이 조절되어야 한다.
본 발명에 따른 방법에서, 상기 감염된 세포, 더욱 구체적으로는 상기 수확된 감염된 세포는 고압 균질화 단계를 거친다. 본 명세서에 있어서, "고압 균질화"라는 용어는 때때로 "HPH"라 약칭된다. 상기 고압 균질화는 두 가지 효과를 가진다. 한편으로는 상기 고압 균질화는 온전한 세포를 분쇄하게 된다. 따라서, IMV는 자유롭게 되어서 추가적인 정제에 이용될 수 있다. 다른 한편으로는 상기 고압 균질화는 상기 폭스바이러스가 세포막으로부터 떨어지거나, 또는 적어도 세포막-바이러스 응집체(aggregate)의 크기가 감소되는 효과를 갖는다. 다시 말하면, 상기 과정은 폭스바이러스의 추가적인 정제를 간소화시킨다.
당업자는 고압 균질화의 일반적인 원리에 친숙하다(White MD, Marcus D., "미생물의 분해", Adv. Biotechnol. Processes, 1988, 8, 51-96). HPH 시스템은 조절되고 반복적인 조건하에서 작은 고정된 구멍(orifice)을 통하여 고속으로 샘플에 압력을 가하기 위해 고압을 사용하는데 기초하고 있다. 본 명세서에 있어서, "제트(jet)", "구멍" 및 "노즐(nozzle)"이라는 용어는 상호 교환가능하게 사용된다.
각각의 세포 분쇄기의 중심에는 분쇄 헤드(disruption head)가 있다. 상기 분쇄 헤드는 바람직하게는 (1) 고압 챔버(chamber)/실린더(cylinder), (2) 상기 챔버/실린더로 이동하여 상기 챔버/실린더의 압력을 증가시키는 고압 피스톤 및 (3) 챔버 내용물이 분출되는 노즐/제트로 구성되어 있다. 분출된 챔버 내용물은 바람직하게는 냉각을 허용하는 열교환 표면을 가지고 있는 금속 조각과 같은 표적의 표면을 향한다. 분쇄된 챔버 내용물을 수집하기 위하여, 상기 시스템은 분쇄된 샘플을 수집하기 위한 수단("수집 챔버"라 칭함)과 함께 제공된다. 전형적인 고압 균질화 장치는 콘스탄트 셀 디스럽션 시스템사(Constant Cell Disruption Systems, Low March, Daventry, Northants, NN114SD, 영국)의 베이직(basic) Z+이다.
바람직한 실시예에서, 고압 균질화 시스템을 사용하여 세포를 분쇄하는 효과를 보이기 위한 세 가지 단계가 있다. (1) 샘플이 고압 실린더/챔버로 도입된다. 이후, 상기 실린더/챔버 내의 압력이 증가한다. 마지막으로, 고압 피스톤이 하강한다. (2) 이후, 상기 피스톤이 노즐을 통하여 고속으로 샘플에 힘을 가한다. 고압 영역에서 저압 영역으로 샘플을 신속하게 이동시키는 것은 세포의 분쇄를 일으킨다. (3) 상기 샘플은 표적을 치고, 냉각된 열교환 표면을 가로질러 빠르게 전파된다. 이후, 상기 생성물은 수집을 위한 챔버속으로 흐른다. 유압(hydraulics)이 재충전되며, 상기 순환이 계속된다. 공정이 끝날 때쯤, 분출된 균질체는 부피에 따라 적당한 바이알에 수집된다.
본 발명에 따라 폭스바이러스를 회수하기 위하여, 상기 노즐은 0.10 내지0.6 ㎜, 0.15 내지 0.6 ㎜, 0.15 내지 0.50 ㎜, 바람직하게는 0.15 내지 0.40 ㎜, 0.20 내지 0.50 ㎜, 더욱 바람직하게는 0.20 내지 0.40 ㎜, 가장 바람직하게는 0.25 내지 0.35 ㎜ 범위의 직경을 가져야 한다. 가장 바람직한 직경의 예로는 0.25 ㎜ 및 0.35 ㎜가 있다.
압력 챔버/실린더 내에서의 압력은 200 내지 1,000 바아(bar), 바람직하게는 400 내지 1,000 바아, 200 내지 800 바아, 더욱 바람직하게는 400 내지 800 바아, 600 내지 1,000 바아, 훨씬 더 바람직하게는 600 내지 900 바아, 가장 바람직하게는 700 내지 900 바아 범위의 값을 가진다. 가장 바람직한 압력은 800 바아이다.
배출구에서의 균질체의 온도는 바람직하게는 25℃를 넘지 않아야 하며, 15℃ 이하인 것이 바람직하고, 10℃ 이하인 것이 가장 바람직하다.
본 발명에 따른 방법은 거의 비례적으로 규모를 키울 수 있으며, 배치(batch) 또는 연속 공정 모두에서 작동될 수 있다.
배치 공정에서, 균질화되기 위한 세포의 각각의 배치는 고압 균질화 단계를 한번 또는 여러번 거칠 수 있다. 바람직하게는 각각의 배치는 상기 균일화 단계를 한번 내지 세 번 거치며, 가장 바람직하게는 한번만 거친다.
균질화 단계의 성공은 바람직하게는 상기에서 정의된 출발 물질 및 균질화 단계 이후 얻어진 물질의 바이러스 타이터(titer, 조직 배양 감염 투여량(TCID50) 또는 플라크 형성 단위(pfu)로 측정된 감염된 바이러스 입자의 수와 동일함)를 결정함으로써 체크될 수 있다. 달리 말하면, 상기 바이러스 타이터는 고압 균질화이전 및 이후에 결정된다. 상기 출발 물질은 어느 정도의 온전한 세포 및 오히려 세포막에 부착되어 있는 폭스바이러스 입자를 포함하는 높은 퍼센트의 많은 응집체를 포함한다. 만일 상기 물질이 바이러스 타이터의 결정을 위해 사용된다면, 얻어진 타이터는 감염성 입자의 실제 수보다 낮다. 이것은 바이러스 타이터를 결정하기 위해 사용된 검사 시스템이 보통 감염된 세포 또는 플라크가 계수되는 세포 배양 시스템(예를 들면, 실시예 2에서 개시된 시스템)이라는 사실 때문이다. 상기 시스템은 하나의 바이러스 입자에 의한 세포의 감염에 의해 기인하는 양성 결과와, 예를 들면 세포막에 결합된 많은 바이러스 응집체에 의한 세포의 감염에 의해 기인하는 양성 결과 사이를 구분할 수 없다. 고압 균질화 이후, 상기 폭스바이러스는 세포막으로부터 떨어지게 되거나 및/또는 세포막-바이러스 응집체의 크기가 현저히 줄어들어서 많은 수의 더 작은 응집체가 생기게 된다. 만일, 상기 물질이 타이터의 결정을 위해 사용된다면, 감염된 바이러스 입자의 실질적인 양이 변하지 않을지라도 결과는 더 높아지게 된다. 따라서, 균질화의 성공은 바람직하게는 출발 물질과 비교할 때 적어도 동일하거나 또는 더 높은 균질체의 TCID50/㎖(TCID는 "세포 배양 감염성 투여량"의 약자이다)에 의해 반영된다. 실시예 부분에서, 어떻게 상기 TCID50/㎖ 값이 결정될 수 있는지 상세하게 나타나 있다. 다른 한편으로, 고압 균질화의 질(quality) 및 성공 여부는 전자 현미경에 의해 결정될 수 있다.
추가적인 정제를 위하여, 얻어진 균질체는 폭스바이러스-풍부 분획을 얻기 위해 적어도 한번의 정제 단계를 거친다. 특히, 만일 상기 백시니아 바이러스를추가로 정제할 의도라면, 상기 단계는 백시니아 바이러스를 포함하는 균질체에 대해 수행될 수 있다.
특히, 상기 정제 단계는
- 배치 원심분리(예를 들면, 수크로스 쿠션(cushion)을 이용) 또는 연속 유동 초원심분리(수크로스 기울기)(Hilfenhaus, J., Kohler, R. 및 Gruschkau, H., J. Biol. Stand. (1976), 4, 285-293; Madalinski, W., Bankovski, A. 및 Korbecki, M., Acta Virol., (1977), 21, 104-108),
- 한외여과(ultrafiltration)(예를 들면, 500 kDa보다 크고 0.1 ㎛보다 동일하거나 작은 세공 크기를 가지는 교차-유동(cross-flow) 여과),
- 칼럼 크로마토그래피(예를 들면, 이온 교환, 소수성 상호작용, 크기 배제 또는 조합 크로마토그래피)(Hedstrom, K.G. 및 Lindberg, U., Z. Immun. Forsch. 1969, 137, 421-430; Stickl, H., Korb, W. 및 Hochstein-mintzel, V., Zbl. Bakt., I. Abt. Orig. (1970), 215, 38-50) 또는
- 상기 모든 것들의 조합(Masuda, N., Ellen, R.P. 및 Grove, D.A., J. Bacteriol. (1981), 147(3), 1095-1104)일 수 있다.
당업자에게 공지된 다른 모든 정제 방법도 또한 본 발명의 범위내에 있다.
바람직하게는 상기 정제 단계는 한외여과 단계이다. 가장 바람직하게는 상기 한외여과는 교차-유동 여과이다. 교차-유동 여과의 원리는 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들면, 리차드(Richards), G.P. 및 골드민츠(Goldmintz) D., J. Virol. Methods (1982), 4(3), 147-153 페이지의 "접종된 굴 조직 균질체로부터 폴리오바이러스(poliovirus)를 추출하기 위한 교차-유동 여과 기술의 평가"를 참조할 수 있다.
한가지 정제 단계가 바이오약학적(biopharmaceutical) 생성물에 대한 규제 요구사항을 충족시키기 위해 충분할 수도 있지만, 훨씬 더 정제된 생성물을 얻기 위하여 상기에서 언급된 둘 또는 그 이상의 정제 단계가 결합될 수 있다.
가장 바람직한 실시예에서, 첫 번째 정제 단계는 적어도 하나의 칼럼 크로마토그래피 단계가 뒤따르는 교차-유동 여과이다. 가장 바람직하게는 상기 칼럼 크로마트그래피 단계는 이온 교환 또는 소수성 상호작용이다.
얻어진 바이러스 풍부 분획은 선택적으로는 동결건조된다. 동결건조의 방법은 당업자에게 공지되어 있다(Day J. 및 McLellan M., Methods in Molecular Biology (1995), 38, Humana Press, "Cryopreservation and freeze-drying protocols").
추가로, 본 발명은 본 발명에 따른 폭스바이러스를 회수하기 위한 방법, 즉 감염된 세포를 고압 균질화에 적용시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 얻어진 상기 폭스바이러스-풍부 분획 및/또는 상기 폭스바이러스-함유 균질체에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 본 발명에 따른 회수/정제 방법, 즉 HPH에 의해 얻어진 폭스바이러스-함유 균질체가 적어도 하나의 정제 단계를 거치는 방법에 의해 얻어진 폭스바이러스-풍부 분획에 관한 것이다. 상기 폭스바이러스는 상기에서 정의된 어떤 폭스바이러스도 될 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 상기 폭스바이러스는 백시니아 바이러스로서 백신화에 적합한 모든 균주이며, 특히 엘스트리 또는 변형된 백시니아 앙카라 균주이고, 가장 바람직하게는 MVA-BN이다.
HPH 단계를 포함하는 본 발명에 따른 방법에 의해 얻어진 상기 폭스바이러스-함유 균질체 및/또는 상기 폭스바이러스-풍부 분획은 매우 높은 자유-IMV 폭스바이러스 대 EEV 폭스바이러스 비율에 의해 특정된다. "자유 IMV"라는 용어는 감염된 세포의 분쇄 후, 분쇄 전 및 분쇄 과정에서 세포막으로부터 떨어지고, 따라서 추가로 정제될 수 있는 IMV에 대해 사용된다. 폭스바이러스를 제조하기 위한 모든 산업 공정에서, 출발 물질은 세포 상등액(supernatant) 뿐만 아니라 감염된 세포도 포함한다. 따라서, 상기 출발 물질은 감염된 세포에 포함된 IMV 폭스바이러스 뿐만 아니라 상등액에서 주로 발견되는 EEV 폭스바이러스도 포함한다. 세포를 분쇄하고 순차적으로 균질화시키기 위한 공지된 방법들(예를 들면, 초음파의 사용)은 고압 균질화와 같은 정도로 효과적으로 세포를 분쇄하거나 및/또는 세포 부스러기(debris)로부터 IMV 폭스바이러스를 떼어내지 못한다. 달리 말하면, 대부분의 IMV는 세포막 및 부스러기에 결합된 채로 남아 있다. 따라서, 자유 IMV 대 EEV의 비율은 본 발명에 따른 방법에서 더 낮다. 초음파를 사용하는 방법에서는 추가적인 정제 단계 동안에 IMV가 여전히 결합되어 있는 세포 부스러기가 대개 제거되기 때문에 상기 비율은 현저히 변화되지는 않는다. 공지된 폭스바이러스 회수 방법과 비교할 때, 본 발명에 따른 회수 방법은 감염된 세포의 분쇄 효율이 크고, 상기 IMV는 세포막으로부터 매우 효과적으로 떨어진다. 따라서, 추가적인 정제를 위해 사용가능한 자유 IMV의 총량은 종래기술에서 공지된 방법보다 더 높으며, 결과적으로 자유 IMV 대 EEV 폭스바이러스의 비율도 더 높다.
본 발명의 방법에 의해 얻어진 상기 폭스바이러스-함유 균질체 및/또는 상기 폭스바이러스-풍부 분획은 백신으로서 유용하다.
만일 상기 폭스바이러스-함유 균질체 및/또는 상기 폭스바이러스-풍부 분획이 변형되지 않은 폭스바이러스 또는 백시니아 바이러스 균주 엘스트리 또는 MVA와 같은 약독화된 폭스바이러스를 포함한다면, 폭스바이러스 감염에 대한 백신으로 사용될 수 있다. 예를 들면, 엘스트리 또는 MVA 균주, 특히 MVA-BN과 같은 백시니아 바이러스를 포함하는 바이러스를 포함하는 균질체 및/또는 바이러스-풍부 분획은 천연두 감염에 대한 백신으로 사용될 수 있다.
만일 상기 폭스바이러스-함유 균질체 및/또는 상기 폭스바이러스-풍부 분획이 하나 또는 그 이상의 이형 유전자(들)를 포함하는 폭스바이러스를 포함한다면, 상기 폭스바이러스-함유 균질체 및/또는 상기 폭스바이러스-풍부 분획은 상기 이형 유전자(들)에 의해 발현된 단백질에 대해 인간을 포함하는 동물을 백신화시키기 위하여 추가로 사용될 수 있다.
백신의 제조를 위하여, 본 발명에 따른 방법에 의해 얻어진 상기 폭스바이러스-함유 균질체 및/또는 상기 폭스바이러스-풍부 분획은 생리학적으로 허용되는 형태로 변환된다. 이것은 천연두에 대한 백신화를 위해 사용된 폭스바이러스 백신의 제조에 있어서의 경험에 기초하여 수행될 수 있다(Stickl, H. 등, [1974], Dtsch, Med. Wschr., 99, 2386-2392에서 기재된 내용 참조). 예를 들면, 상기 폭스바이러스-함유 균질체 및/또는 상기 폭스바이러스-풍부 분획은 약 10 mM Tris, 140 mMNaCl pH 7.4에서 제형화된 5×108TCID50/㎖의 타이터로 -80℃에서 보관된다. 백신 샷(shot)의 제조를 위하여, 예를 들면 103내지 109TCID50의 바이러스가 앰플, 바람직하게는 유리 앰플에서 2% 펩톤(peptone) 및 1% 인간 알부민을 포함하는 PBS (phosphate-buffered saline)로 동결건조된다. 다른 한편으로는, 상기 백신 샷은 제형에 있는 바이러스의 단계적인 동결건조에 의해 생산될 수 있다. 상기 제형은 만니톨, 덱스트란, 설탕, 글리신, 락토스 또는 폴리비닐피롤리돈, 또는 항산화제 또는 불활성 가스, 안정제 또는 재조합 단백질(예를 들면, 인간 혈청 알부민)과 같은 다른 첨가제와 같은 생체내 투여에 적합한 추가적인 첨가제를 포함할 수 있다. 동결건조에 적합한 전형적인 바이러스를 포함하는 제형은 10 mM Tris 완충액(buffer), 140 mM NaCl, 18.9 g/ℓ 덱스트란 (MW 36,000 내지 40,000), 45 g/ℓ 수크로스, 0.108 g/ℓ L-글루탐산 모노칼륨염 일수화물(monohydrate) pH 7.4를 포함한다. 이후, 상기 유리 앰플은 밀봉되고 4℃ 내지 실온에서 수개월동안 보관될 수 있다. 그러나, 필요하지 않는 한, 상기 앰플은 바람직하게는 -20℃ 이하의 온도에서 보관된다.
백신화를 위하여, 동결건조된 생산물은 0.1 내지 0.5 ㎖의 수용액, 바람직하게는 생리식염수 또는 Tris 완충액에 용해될 수 있고, 전신 또는 국소적, 예를 들면 비경구, 근육내 또는 숙련자에게 공지된 다른 어떤 투여경로에 의해서도 투여될 수 있다. 투여 형태, 투여량 및 투여 횟수는 당업자에게 공지된 방식에 의해 최적화될 수 있다. 폭스바이러스 벡터의 경우 가장 바람직한 것은 피하 또는 근육내 투여이다.
아울러, 본 발명은 본 발명에 따른 방법에 의해 얻어진 폭스바이러스-함유 균질체 또는 폭스바이러스-풍부 분획을 인간을 포함하는 동물에게 접종하는 단계를 포함하는 이를 필요로 하는 인간을 포함하는 동물의 백신화 방법에 관한 것이다.
발명의 요약
본 발명은 특히 하기 내용을 단독 또는 조합하여 포함한다:
폭스바이러스-함유 균질체를 얻기 위하여 감염된 세포에 고압 균질화를 적용시키는 단계를 포함하는 감염된 세포로부터 폭스바이러스를 회수하기 위한 방법.
상기에서, 상기 폭스바이러스는 오르쏘폭스바이러스, 아비폭스바이러스, 수이폭스바이러스 및 카프리폭스바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
상기에서, 상기 폭스바이러스는 백시니아 바이러스, 고트폭스바이러스, 쉽폭스바이러스, 카나리폭스바이러스 및 파울폭스바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
상기에서, 상기 백시니아 바이러스는 변형된 백시니아 바이러스 균주 앙카라(MVA), 특히 기탁번호 ECACC V00083008인 MVA-BN인 것을 특징으로 하는 방법.
상기에서, 상기 폭스바이러스는 재조합 폭스바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
상기에서, 상기 고압 균질화는 감염된 세포를 고압 챔버에 넣는 단계; 챔버내 압력을 증가시키는 단계; 및 노즐을 통하여 감염된 세포를 분출시키는 단계에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
상기에서, 상기 챔버내의 압력은 200 내지 1,000 바아 범위의 값까지 증가되는 것을 특징으로 하는 방법.
상기에서, 상기 노즐은 0.10 내지 0.6 ㎜ 범위의 직경을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
상기에서, 상기 폭스바이러스-함유 균질체는 폭스바이러스-풍부 분획을 얻기 위하여 적어도 하나의 정제 단계를 거치는 것을 특징으로 하는 방법.
상기에서, 상기 적어도 하나의 정제 단계는 한외여과 단계인 것을 특징으로 하는 방법.
상기에서, 상기 한외여과는 교차-유동 여과인 것을 특징으로 하는 방법.
상기에서, 상기 교차-유동 여과 단계에서 막(membrane)은 500 kDa보다 크고 0.1 ㎛과 동일하거나 이보다 작은 세공 크기를 가지는 것이 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
상기에서, 상기 한외여과 이후 순차적으로 적어도 하나의 칼럼 크로마토그래피 단계가 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
상기에서, 상기 얻어진 폭스바이러스-함유 균질체 또는 폭스바이러스-풍부 분획은 동결건조되는 것을 특징으로 하는 방법.
상기에서 정의된 방법에 의해 얻어진 폭스바이러스-함유 균질체 또는 폭스바이러스-풍부 분획.
백신으로서의 상기 폭스바이러스-함유 균질체 또는 폭스바이러스-풍부 분획.
백신의 제조를 위한 상기 폭스바이러스-함유 균질체 또는 폭스바이러스-풍부 분획의 용도.
상기에서 정의된 폭스바이러스-함유 균질체 또는 폭스바이러스-풍부 분획 또는 백신을 동물 신체에 투여하는 것을 특징으로 하는, 이를 필요로 하는 인간을 포함하는 동물의 백신화 방법.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 고압 균질기를 사용한 폭스바이러스-세포 현탁액의 균질화
롤러 플라스크에서 배양된 병아리 배아 섬유아세포(CEF)가 MVA-BN(ECACC V00083008)로 감염되었다. 감염된 세포는 바이러스-세포 현탁액을 얻기 위하여 동결 및 해동시켰다.
콘스탄트 셀 디스럽션 시스템사(Low march, Daventry, Northants, NN114SD, 영국)의 베이직 Z+ 균질기에 매 가동때마다 50 ㎖의 조(crude) 바이러스-세포 현탁액이 로딩되었다. 최적 균질화 조건을 확인하기 위하여, 0.18 내지 0.40 ㎜ 범위의 노즐 직경과 200 내지 1,000 바아 범위의 압력을 검사하였다. 조 현탁액은 고압 균질화를 1회, 2회 또는 3회 거쳤다. 상기 균질기는 제조사의 지침에 따라 사용되었다. 상기 방법의 평가는 실시예 2에 기술된 타이터를 관찰함으로써 수행되었다.
예비 연구에서, 0.4 ㎜보다 큰 제트 직경은 균질화 결과에 대하여 긍정적인 영향이 없는 것으로 나타났다. 0.18 ㎜, 0.25 ㎜ 및 0.35 ㎜의 노즐 직경을 사용하였을 때, 바이러스-세포 현탁액을 800 바아의 압력에 1회 적용함으로써 최적의 결과가 얻어졌다. 상기 조건에서는 타이터의 관점에서 어떤 주된 차이도 관찰되지 않았다.
본 발명에 따른 방법을 종래에 공지된 직접 플로우-쓰루(flow-through) 초음파 처리법과 비교하였다. 결과는 도 1에 요약되어 있다. 초음파 처리법과 비교할 때, 본 발명에 따른 방법은 더 높은 바이러스 타이터 및 더 나은 현탁액의 균질화를 보였으며, 따라서 추가적인 후속 공정을 위해 더 적합한 것으로 나타났다.
실시예 2 : 변형된 백시니아 바이러스 앙카라(MVA)의 적정(titration)
변형된 백시니아 바이러스 앙카라(MVA)의 적정은 96-웰(well) 형태로 10배의 희석을 사용하여 TCID50에 기초한 분석으로 수행되었다. 분석의 마지막 시점에서, 감염된 세포는 항-백시니아 바이러스 항체 및 적당한 염색 용액을 이용하여 시각화된다.
2 내지 3일령의 일차 CEF(primary chicken embryo fibroblast) 세포는 1×105세포/㎖로 7% RPMI에서 희석된다. 10배의 희석은 희석당 8 반복으로 수행된다. 희석에 따라, 96-웰 플레이트의 각 웰마다 100 ㎕씩 접종된다. 이후, 세포는 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 배양된다.
바이러스를 포함하는 용액의 희석은 우태아혈청(fetal calf serum)이 포함되지 않은 RPMI를 사용하여 10배 단계(10-1내지 10-12에서 적절히)로 이루어진다. 이후, 100 ㎕의 각각의 바이러스 샘플이 세포를 포함하는 웰에 첨가된다. 상기 96-웰 플레이트는 감염 및 바이러스 복제를 위하여 37℃, 5% CO2에서 5일동안 배양된다.
세포는 감염 5일 후 백시니아 바이러스 특이적 항체로 염색된다. 특이적 항체를 검출하기 위하여, 이차(secondary) 항체와 결합된 양고추냉이 퍼옥시다제(horseradish peroxidase, HRP)가 사용된다. 상기 MVA 특이적 항체는 토끼 폴리클로날 항-백시니아 바이러스 항체의 IgG 분획(Quartett, Berlin,Gernamy, #9503-2057)이다. 상기 이차 항체는 HRP와 결합된 염소 폴리클로날 항-토끼 IgG 항체(Promega, Mannheim, Germany, #4011)이다. 상기 발색 반응은 공지된 기술에 따라 수행된다.
상기 발색 반응에서 양성인 세포를 포함하는 모든 웰은 TCID50을 계산함에 있어서 양성으로 표시된다. 상기 타이터는 스피어만(Spearman, [1]) 및 캐르버(Kaerber, [2])의 식을 사용하여 계산된다. 모든 분석 변수들이 상수이기 때문에, 하기와 같은 간소화된 식이 사용된다:
a = 모든 8개의 웰이 양성인 마지막 칼럼의 희석 인자
xa= 칼럼 a+1에서 양성인 웰의 수
xb= 칼럼 a+2에서 양성인 웰의 수
xc= 칼럼 a+3에서 양성인 웰의 수
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 폭스바이러스를 회수 및 정제하는 방법은 감염된 세포로부터 폭스바이러스를 회수 및 정제하기 위해 유용하게 사용될 수 있다.
Claims (18)
- 폭스바이러스-함유 균질체를 얻기 위하여 감염된 세포에 고압 균질화를 적용시키는 단계를 포함하는 감염된 세포로부터 폭스바이러스를 회수하기 위한 방법.
- 제 1항에 있어서,상기 폭스바이러스는 오르쏘폭스바이러스, 아비폭스바이러스, 수이폭스바이러스 및 카프리폭스바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서,상기 폭스바이러스는 백시니아 바이러스, 고트폭스바이러스, 쉽폭스바이러스, 카나리폭스바이러스 및 파울폭스바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 3항에 있어서,상기 백시니아 바이러스는 엘스트리(Elstree) 또는 변형된 백시니아 바이러스 균주 앙카라(MVA), 특히 기탁번호 ECACC V00083008인 MVA-BN인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,상기 폭스바이러스는 재조합 폭스바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,상기 고압 균질화는 감염된 세포를 고압 챔버에 넣는 단계; 챔버내 압력을 증가시키는 단계; 및 노즐을 통하여 감염된 세포를 분출시키는 단계에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 6항에 있어서,상기 챔버내의 압력은 200 내지 1,000 바아 범위의 값까지 증가되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 6항 또는 제 7항에 있어서,상기 노즐은 0.10 내지 0.6 ㎜ 범위의 직경을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서,상기 폭스바이러스-함유 균질체는 폭스바이러스-풍부 분획을 얻기 위하여 적어도 하나의 정제 단계를 거치는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 9항에 있어서,상기 적어도 하나의 정제 단계 중 하나는 한외여과(ultrafiltration) 단계인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 10항에 있어서,상기 한외여과는 교차-유동 여과(cross-flow filtration)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 11항에 있어서,상기 교차-유동 여과 단계에서 막(membrane)은 500 kDa보다 크고 0.1 ㎛과 동일하거나 이보다 작은 세공 크기를 가지는 것이 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 10항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서,상기 한외여과 이후 적어도 하나의 칼럼 크로마토그래피 단계가 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서,상기 폭스바이러스-함유 균질체 또는 폭스바이러스-풍부 분획은 동결건조되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 얻어진 폭스바이러스-함유 균질체 또는 폭스바이러스-풍부 분획.
- 제 15항에 있어서,백신으로서의 상기 폭스바이러스-함유 균질체 또는 폭스바이러스-풍부 분획.
- 백신의 제조를 위한 제 15항에 따른 폭스바이러스-풍부 분획 또는 폭스바이러스-함유 균질체의 사용 방법.
- 제 15항에 따른 폭스바이러스-풍부 분획 또는 폭스바이러스-함유 균질체 또는 제 16항에 따른 백신을 동물 신체에 투여하는 것을 특징으로 하는, 이를 필요로 하는 인간을 포함하는 동물의 백신화 방법.
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| NZ299720A (en) * | 1996-11-08 | 1999-07-29 | Howick Engineering Ltd | Epicyclic input/output annuli of same pcd, with planetary input/output gear sets, and with only one set having aligned teeth |
| EP0968284B1 (en) * | 1996-11-20 | 2006-12-13 | Introgen Therapeutics, Inc. | An improved method for the production and purification of adenoviral vectors |
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| FR2787465A1 (fr) * | 1998-12-21 | 2000-06-23 | Transgene Sa | Procede d'inactivation des virus enveloppes dans une preparation virale de virus non enveloppes |
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