ES2247404T3 - Metodo para la recuperacion y purificacion de poxvirus de celulas infectadas. - Google Patents
Metodo para la recuperacion y purificacion de poxvirus de celulas infectadas.Info
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Abstract
Método para la recuperación de poxvirus a partir de células infectadas que comprende el paso de someter las células infectadas a una homogeneización a alta presión a fin de obtener un homogeneizado que contiene poxvirus.
Description
Método para la recuperación y purificación de
poxvirus a partir de células infectadas.
La presente invención se refiere a un método para
la recuperación de poxvirus, en particular el virus Vaccinia
Ankara modificado (MVA), a partir de células infectadas. De
acuerdo con la presente invención, las células infectadas con
poxvirus se someten a una homogeneización a alta presión para
obtener un homogeneizado que contiene poxvirus. El homogeneizado
que contiene poxvirus puede someterse a al menos un paso de
purificación para obtener una fracción enriquecida de poxvirus. La
invención se refiere adicionalmente a la fracción que contiene
poxvirus y el homogeneizado que contiene poxvirus obtenidos por el
método de acuerdo con la presente invención.
Los poxviridae comprenden una gran familia
de virus de DNA complejos que se replican en el citoplasma de las
células de vertebrados e invertebrados. La familia de
poxviridae puede dividirse en las subfamilias
Chordopoxvirinae (poxvirus de vertebrados) y en tomo
Poxviridae (poxvirus de insectos).
Los chordopoxvirinae comprenden varios
poxvirus animales (clasificados en diferentes géneros) de gran
importancia económica, tales como poxvirus de camello, poxvirus de
oveja, poxvirus de cabra o poxvirus de aves, en particular poxvirus
de aves de corral. Para la vacunación del ganado contra los poxvirus
de oveja y de cabra están disponibles vacunas de virus vivos
atenuados y vacunas desactivadas. Para la vacunación de aves de
corral se han desarrollado vacunas recombinantes que utilizan
poxvirus de aves de corral como vector.
Dado que el poxvirus de aves de corral infecta
las células humanas, se supone que el mismo puede utilizarse
también como vector para expresar genes heterólogos en humanos e
inducir una respuesta inmunológica correspondiente. Poxvirus de aves
de corral que contienen genes HIV en el genoma se describen en los
documentos US 5.736.368 y US 6.051.410.
En humanos, el virus variola, un miembro
del género ortopoxvirus, era con mucho el poxvirus más importante.
El virus Vaccinia, que es también un miembro del género
ortopoxvirus en la familia de Poxviridae, se utilizó como
vacuna viva para inmunizar contra la viruela. La vacunación con
éxito a escala mundial con el virus Vaccinia culminó en la
erradicación del virus variola (la erradicación global de la
viruela. Informe final de la comisión global para la certificación
de la erradicación de la viruela; History of Public Health, No. 4,
Ginebra: Organización Mundial de la Salud, 1980). Desde dicha
declaración de la WHO, la vacunación se ha interrumpido durante
muchos años excepto para personas con alto riesgo de infecciones
por poxvirus (v.g. operarios de laboratorios). Los programas de
vacunación están alcanzando interés nuevamente a la vista del riesgo
de que el virus variola se utilice en guerra biológica o por
terroristas.
En fecha más reciente, los virus Vaccinia
han sido utilizados también para modificar por ingeniería genética
vectores víricos para la expresión de genes recombinantes y para el
uso potencial como vacunas recombinantes vivas (Mackett, M., Smith
G.L. y Moss B. [1982] P.N.A.S. USA 79, 7415-7419;
Smith, G.L., Mackett, M. y Moss, B. [1984] Biotechnology and Genetic
Engineering Reviews 2, 383-407). Esto implica
secuencias de DNA (genes), que codifican antígenos extraños que se
introducen, con ayuda de las técnicas de recombinación del DNA, en
el genoma de los virus Vaccinia. Si el gen está integrado en
un sitio del DNA vírico que no es esencial para el ciclo vital del
virus, es posible que el virus Vaccinia recombinante de
nueva producción sea infeccioso, es decir capaz de infectar células
extrañas y por consiguiente expresar la secuencia de DNA integrada
(Solicitudes de Patente EP No. 83.286 y No. 110.385). El virus
Vaccinia recombinante preparado de este modo puede
utilizarse, por una parte, como vacunas vivas para la profi-
laxis de enfermedades infecciosas, y por otra parte para la preparación de proteínas heterólogas en células eucariotas.
laxis de enfermedades infecciosas, y por otra parte para la preparación de proteínas heterólogas en células eucariotas.
El uso del virus Vaccinia como vector para
el desarrollo de vacunas recombinantes vivas se ha visto afectado
por problemas y normas de seguridad. La mayoría de los virus
Vaccinia recombinantes descritos en la bibliografía están
basados en la cepa Western Reserve del virus Vaccinia. Es
sabido que esta cepa tiene una neurovirulencia alta y es por tanto
poco adecuada para uso en humanos y animales (Morita et al.,
Vaccine 5, 65-70 [1987]). Por otra parte, se sabe
que el virus Vaccinia Ankara modificado (MVA) es
excepcionalmente seguro. MVA ha sido generado por pasos en serie de
larga duración de la cepa Ankara de virus Vaccinia
(CVA) en fibroblastos de embrión de pollo (para revisión, véase
Mayr, A., Hochstein-Mintzel, V. y Stickl, H. [1975]
Infection 3, 6-14; Patente Suiza No. 568.392).
Ejemplos de cepas del virus MVA depositadas en cumplimiento de las
exigencias del Tratado de Budapest son las cepas MVA 572, MVA 575 y
MVA-BN depositadas en la Colección Europea de
Cultivos de Células Animales (ECACC), Salisbury (Reino Unido) con
los números de depósito ECACC V94012707, ECACC V00120707 y ECACC
V00083008, respectivamente. El MVA se distingue por su gran
atenuación, es decir por la reducida virulencia o infectividad,
mientras que mantiene una inmunogenicidad satisfactoria. El virus
MVA se ha analizado para determinar alteraciones en el genoma con
relación a la cepa de CVA de tipo salvaje. Se han identificado seis
deleciones principales del DNA genómico (deleción I, II, II, IV, V
y VI) que totalizan 31.000 pares de bases (Meyer, H., Sutter, G. y
Mayr A. [1991] J. Gen. Virol. 72, 1031-1038). El
virus MVA resultante llegó a ser restringido severamente en cuanto
a células hospedadoras a células de ave.
Adicionalmente, el MVA se caracteriza por su
atenuación extremada. Cuando se ha ensayado en una diversidad de
modelos animales, el MVA demostró ser avirulento incluso en
animales inmunodeficientes. Y lo que es más importante, las
excelentes propiedades de la cepa MVA han sido demostradas en
pruebas clínicas extensas (Mayr et al., Zbl. Bakt. Hyg. I,
Abt. Org. B 167, 375-390 [1987], Stickl et
al., Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392
[1974]). Durante estos estudios en más de 120.000 humanos, con
inclusión de pacientes de alto riesgo, no se asoció efecto
secundario alguno con el uso de la vacuna MVA. MVA recombinantes
útiles como vacunas han sido ya construidos y utilizados en pruebas
clínicas.
El documento WO 98/13500 da a conocer un MVA
recombinante que contiene y es capaz de expresar una o más
secuencias de DNA que codifican antígenos del virus del dengue. Las
secuencias de DNA extraño se recombinaron en el DNA vírico en el
sitio de una deleción existente naturalmente en el genoma de
MVA.
Antes de utilizar poxvirus o poxvirus
recombinante para vacunación es necesario purificar el virus en
cierto grado a fin de cumplir los requisitos reglamentarios. La
manera tradicional de purificar poxvirus, en particular MVA y MVA
recombinante es como sigue: en un primer paso, se cultivan células
susceptibles de infección con el poxvirus respectivo. En el caso
de MVA, las células susceptibles son, entre otras, fibroblastos de
embrión de pollo. Las células susceptibles se infectan con el
poxvirus y se cultivan durante un periodo de tiempo suficiente para
permitir la generación de progenie del virus. Las células se
congelan y descongelan luego a fin de desprender las células de la
superficie del vial de cultivo y desintegrar parcialmente las
células. La mezcla de células intactas y desintegradas se
centrifuga. Se utilizan ultrasonidos para producir un
homogeneizado. Se purifica el virus a partir del homogeneizado por
centrifugación en colchón de sacarosa (Joklik WK. "The
purification of four strains of poxvirus", Virology 1962;
18:9-18). El paso fundamental en este proceso es la
homogeneización por utilización de ultrasonidos (Hedström, K.G. y
Lindberg, U., Z. Immun. Forsch. 1969, 137:421-430;
Stickl, H., Korb, W. y Hochstein-Mintzel, V., Zbl.
Bakt., I. Abt. Orig. (1970), 215, 38-50). En
procesos industriales se prefiere que todos los pasos del proceso
sean fáciles de controlar y reproducibles. Sin embargo, la
desventaja en la utilización de ultrasonidos para homogeneizar la
suspensión virus-células es que el paso de
ultrasonidos es difícil de reproducir de manera idéntica y difícil
de ajustar, y el proceso es difícil de escalar desde la escala de
laboratorio a la escala industrial.
Así pues, es un objeto de la invención
proporcionar un método para la recuperación de poxvirus, en
particular de virus Vaccinia, tales como la cepa MVA, a
partir de células infectadas con poxvirus, en el cual la
homogeneización de las células infectadas y es reproducible, fácil
de controlar y permite una escalación fácil desde la escala de
laboratorio a la industrial.
La presente invención se refiere a un método para
la recuperación de poxvirus, en particular virus Vaccinia,
tales como la cepa Elstree o el Virus Vaccinia Ankara
Modificado (MVA), a partir de células infectadas. El método de
acuerdo con la presente invención para la recuperación de poxvirus
a partir de células infectadas comprende el paso de someter las
células infectadas a una homogeneización a alta presión a fin de
obtener un homogeneizado que contiene poxvirus.
Resultó inesperado que puedan recuperarse
poxvirus intactos e infecciosos por el método de acuerdo con la
presente invención. La homogeneización a alta presión se utiliza
comúnmente para la destrucción de estructuras celulares y
subcelulares a fin de aislar proteínas o lípidos a partir de células
eucariotas y procariotas. El documento US 3.983.008 describe un
método de extracción de componente útiles a partir de células
microbianas por utilización de homogeneizaciones a alta presión. Los
compuestos extraídos eran proteínas de levadura, enzimas
bacterianas y lípidos de levadura. El documento DE 19918619
describe el uso de homogeneización a alta presión para aislar HbsAg
a partir de células de levadura. El documento US 4.255.521 describe
un proceso para extraer glucosa-isomerasa a partir
de células de microorganismos por desprendimiento a alta presión.
La homogeneización a alta presión ha sido utilizada también para el
aislamiento de partículas semejantes a virus (VLP) a partir de
Saccharomyces cerevisiae recombinante (Milburn y Dunnill
(1994) Biotechnology and Bioengineering 44, 736-744)
y para la producción y purificación de vectores adenovíricos
(documento US 6.194.191). los VLPs y los Adenovirus son virus sin
envoltura y más bien pequeños y simples que, por tanto, se asemejan
a las estructuras de proteínas celulares. Por esta razón, no es
sorprendente que la homogeneización a alta presión, que se ha
demostrado es adecuada para el aislamiento de proteínas a partir de
células, pueda utilizarse también para el aislamiento de Adenovirus
y VLPs a partir de células eucariotas. En contraste, los viriones
intracelulares de poxvirus maduros (IMV, véase más adelante, véase
Fields et al., Fields Virology, 1996, compiladores
Lippincott-Raven, Philadelphia, EE.UU., ISBN
0-7817-0253-4,
capítulo 83, páginas 2654-5) tienen una morfología
muy compleja que implica, entre otras cosas, membranas lipídicas.
La morfología y las propiedades físicas de un IMV de poxvirus están
más estrechamente relacionadas en algunos aspectos con la
morfología y las propiedades físicas de una célula que con las de
un virus sin envoltura. Por consiguiente, era de esperar que las
condiciones utilizadas para la desintegración de células por
utilización de homogeneización a alta presión condujera también a
la desintegración de los poxvirus. Por ello, fue un resultado
sorprendente el hecho de que la homogeneización a alta presión
desintegra las células pero deja intacta una cantidad suficiente de
poxvirus que pueden purificarse ulteriormente. Dicho de otro modo,
no podría haberse supuesto que pudiera utilizarse la
homogeneización a alta presión en un método para la recuperación de
poxvirus a partir de células infectadas. De hecho, el método
conocido para la recuperación de poxvirus a partir de células
infectadas utiliza ultrasonidos para la homogeneización, que es una
forma de homogeneización más bien suave.
En contraste con los métodos de recuperación que
utilizan ultrasonidos, el método de acuerdo con la presente
invención permite una homogeneización reproducible de las células
infectadas; el método es fácil de controlar y el proceso es fácil de
escalar desde una escala de laboratorio a la escala industrial.
En el contexto de la presente invención, el
término "poxvirus" hace referencia a cualquier virus
perteneciente a la familia poxviridae. El método de acuerdo
con la presente invención se lleva a cabo preferiblemente con
poxviridae de la subfamilia chordopoxvirinae, más
preferiblemente de los géneros ortopoxvirus, poxvirus de aves,
poxvirus de caprinos y poxvirus de suidos. Muy preferiblemente, la
invención concierne a un método para la recuperación y purificación
de poxvirus seleccionados del grupo constituido por virus
Vaccinia, poxvirus de cabra, poxvirus de oveja, poxvirus de
canario y poxvirus de aves de corral. Es particularmente preferido
el virus Vaccinia. Ejemplos de cepas de virus
vaccinia utilizadas en el método de acuerdo con la presente
invención son las cepas Elstree, Wyeth, Copenhagen, Temple of
Heaven, NYCBH, y Western Reserve. La invención no está limitada a
las cepas de virus Vaccinia mencionadas específicamente, sino
que puede utilizarse en lugar de ello con cualquier cepa de virus
Vaccinia. Un ejemplo preferido para una cepa de virus
Vaccinia es la cepa de virus Vaccinia Ankara
modificada (MVA). Una cepa MVA típica es MVA 575, que ha sido
depositada en la Colección Europea de Cultivo de Células Animales
bajo el número de depósito ECACC V00120707. Es muy preferida la
cepa MVA-BN o un derivado de la misma.
MVA-BN ha sido descrito en el documento WO 02/42480
(PCT/EP01/13628). Dicha solicitud internacional describe ensayos
biológicos que permiten evaluar si una cepa MVA es
MVA-BN o un derivado del mismo y métodos que
permiten obtener MVA-BN o un derivado del mismo. El
contenido de esta solicitud se incluye en la presente solicitud por
referencia. MVA-BN ha sido depositado en la
Colección Europea de Cultivo de Células Animales con el número de
depósito ECACC V00083008.
Los virus a recuperar pueden ser virus nativos,
virus atenuados o virus recombinantes.
La expresión "virus recombinante" hace
referencia a cualquier virus que tenga insertado en el genoma vírico
un gen heterólogo que no forma parte naturalmente del genoma
vírico. Un gen heterólogo puede ser un gen terapéutico, un gen
codificante de un antígeno o un péptido que comprende al menos un
epítope para inducir una respuesta inmunológica, una casete de
expresión antisentido o un gen de ribozima. Métodos para obtener
virus recombinantes son conocidos por las personas expertas en la
técnica. El gen heterólogo se inserta preferiblemente en una región
no esencial del genoma vírico. En otra realización preferida de la
invención, la secuencia de ácido nucleico heterólogo se inserta en
un sitio de deleción existente naturalmente del genoma de MVA
(descrito en el documento PCT/EP96/02926).
Un "virus atenuado" es un virus que después
de la infección del organismo hospedador da como resultado una
mortalidad y/o morbilidad más bajas en comparación con el virus
originario no atenuado. Un ejemplo de un virus Vaccinia
atenuado es la cepa MVA, en particular MVA-575 y
MVA-BN.
Se sabe que los poxvirus, tales como virus
Vaccinia, existen en dos formas diferentes: poxvirus fijados
a membranas celulares en el citoplasma de las células infectadas
(viriones intracelulares maduros (IMV)) y virus que se han
externalizado (viriones extracelulares con envoltura (EEV))
(Vanderplasschen A, Hollinshead M, Smith GL "Intracellular and
extracellular vaccinia virions enter cells by different
mechanisms" J. Gen. Virol. (1998), 79, 877-887).
IMVs y EEVs son ambos infecciosos pero morfológicamente diferentes,
dado que los EEV contienen una envoltura adicional de lipoproteína.
En circunstancias normales, las partículas de IMV son más abundantes
que las de EEV, pero en el método de acuerdo con la invención
pueden obtenerse ambos tipos de partículas.
Los materiales de partida para el paso de
homogeneización de acuerdo con la presente invención son células
infectadas con los poxvirus respectivos. El término "células
infectadas" utilizado para definir el material de partida para la
homogeneización de acuerdo con la presente invención hace
referencia a células intactas infectadas con el virus respectivo, a
partes y fragmentos de células infectadas a las que está fijado el
poxvirus respectivo, o a una mezcla de células intactas y células
lisadas/desintegradas. Ejemplos de una parte o un fragmento de
células infectadas son membranas celulares de células
desintegradas/lisadas a las que está fijado el poxvirus respectivo.
El material de partida puede contener también partículas de virus
libres que no están fijadas a la membrana celular ni localizadas
intracelularmente.
A fin de obtener las células infectadas que
constituyen el material de partida para el método de acuerdo con la
presente invención, se infectan células eucariotas con el poxvirus
respectivo. Las células eucariotas son células que son susceptibles
de infección con el poxvirus respectivo y permiten la replicación y
producción de virus infeccioso. Dichas células son conocidas por
las personas expertas en la técnica para todos los poxvirus. Para
MVA y la cepa del virus Vaccinia Elstree, un ejemplo de este
tipo de células son fibroblastos de embrión de pollo (CEF) (Drexler
I., Heller K., Wahren B., Erfle V. y Sutter G. "Highly attenuated
modified vaccinia Ankara replicates in baby hamster kidney cells, a
potential host for virus propagation, but not in various human
transformed and primary cells", J. Gen. Virol. (1998), 79,
347-352). Las células CEF pueden cultivarse en
condiciones conocidas por las personas expertas en la técnica.
Preferiblemente, las células CEF se cultivan en medio exento de
suero en matraces estacionarios o botellas rodantes. La incubación
tiene lugar preferiblemente durante 48 a 96 horas a 37ºC \pm 2ºC.
Para la infección, los poxvirus se utilizan preferiblemente a una
multiplicidad de infección (MOI) de 0,05 a 1 TCID_{50}, y la
incubación tiene lugar preferiblemente durante 48 a 72 horas a 37ºC
\pm 2ºC.
El progreso de la infección puede observarse por
examen de los efectos citopáticos (CPE), que se hacen evidentes
típicamente por un redondeo notable de las células infectadas.
La presente invención permite la recuperación de
poxvirus, tales como Elstree o MVA a partir de células infectadas.
Por el término "recuperación" se entiende que el método de la
presente invención permite desintegrar las células infectadas con
poxvirus y/o desprender los poxvirus de las membranas celulares a
las cuales están fijados usualmente, en tal grado que se hace
factible una purificación ulterior del poxvirus. Así, el producto
de la recuperación de los poxvirus a partir de las células
infectadas (a lo que se hace referencia en la presente solicitud
como "homogeneizado que contiene poxvirus") es una mezcla
homogénea de poxvirus libre y detritus celulares que contienen
solamente pequeñas cantidades de células intactas, no desintegradas
y virus fijado a membranas celulares.
Si las células infectadas son células que pueden
cultivarse en cultivo de suspensión, las células infectadas pueden
cosecharse fácilmente por centrifugación. Si las células infectadas
son células adherentes más o menos intactas, las mismas deben
cosecharse, es decir separarse del vial de cultivo, antes de
someterlas a la homogeneización a alta presión. Tales métodos son
conocidos por las personas expertas en la técnica. Técnicas útiles
son métodos mecánicos (v.g. por utilización de un rascador de
células de caucho), métodos físicos (v.g. congelación por debajo de
-15ºC y descongelación de los recipientes de cultivo por encima de
+15ºC) o métodos bioquímicos (tratamiento con enzimas, v.g.
tripsina, para separar las células del recipiente de cultivo). Si se
utilizan enzimas para este propósito, el tiempo de incubación
debería controlarse, dado que estas enzimas pueden deteriorar
también el virus durante la incubación.
En el método de acuerdo con la presente
invención, las células infectadas, más específicamente las células
infectadas cosechadas se someten luego a un paso de homogeneización
a alta presión. En la presente memoria descriptiva, el término
"homogeneización a alta presión" se abrevia a veces como
"HPH". La homogeneización a alta presión tiene un efecto
doble. Por una parte, la homogeneización a alta presión conduce a
la desintegración de las células intactas. Así, las IMVs se liberan
y quedan disponibles para una purificación ulterior. Por otra
parte, la homogeneización a alta presión tiene el efecto de que los
poxvirus se desprenden de las membranas celulares o al menos que el
tamaño de los agregados membrana celular-virus se
reduce. De nuevo, esto simplifica la purificación ulterior del
poxvirus.
Las personas expertas en la técnica están
familiarizadas con el principio general de la homogeneización a
alta presión (White MD, Marcus D., "Disintegration of
microorganisms", Adv. Biotechnol. Processes 1988;
8:51-96). Los sistemas HPH están basados en el uso
de alta presión para forzar una muestra a través de un pequeño
orificio fijo a alta velocidad en condiciones controladas y
repetibles. En la presente descripción, los términos
"boquilla", "orificio" y "tobera" se utilizan
intercambiablemente.
El núcleo de cada desintegrador de células es un
cabezal de desintegración. El cabezal de desintegración está
constituido preferiblemente por (I) una cámara/cilindro de alta
presión, (II) un pistón de alta presión que se desplaza en el
interior de la cámara/cilindro y aumenta con ello la presión en la
cámara/cilindro y (III) una tobera/boquilla a través de la cual se
expulsa el contenido de la cámara. El contenido de la cámara
expulsado está dirigido contra una superficie diana tal como una
pieza de metal que tiene preferiblemente una superficie de
intercambio de calor que permite el enfriamiento. Para recoger el
contenido desintegrado de la cámara, el sistema está provisto de
medios para la recogida de la muestra desintegrada (lo que se
conoce como "cámara de recogida"). Una unidad típica de
homogeneización a alta presión es Basic Z+ from Constant Cell
Disruption Systems (Low March, Daventry, Northants, NN114SD, Reino
Unido).
En una realización preferida existen tres etapas
para efectuar la desintegración de las células utilizando el
sistema de homogeneización a alta presión. (I) Se introduce una
muestra en el cilindro/cámara de alta presión. A continuación se
aumenta la presión en el cilindro/cámara. A este fin, se hace
descender el pistón de alta presión. (II) El pistón fuerza luego la
muestra a través de la tobera a alta velocidad. La rápida
transferencia de la muestra desde una región de alta presión a una
de baja presión causa la desintegración de las células. (III) La
muestra choca contra la diana y se esparce radialmente a través de
la superficie de intercambio de calor enfriada. El producto fluye
luego a una cámara para su recogida. El sistema hidráulico se
recarga y continúa el ciclo. Al final del proceso, el homogeneizado
expulsado se recoge en un vial apropiado, dependiendo del
volumen.
Para la recuperación de poxvirus de acuerdo con
la presente invención, la tobera debe tener un diámetro comprendido
en el intervalo de 0,10 a 0,6 mm, 0,15 a 0,6 mm, 0,15 a 0,50 mm,
preferiblemente en el intervalo de 0,15 a 0,40 mm, 0,20 a 0,50 mm,
más preferiblemente 0,20 a 0,40 mm, y muy preferiblemente 0,25 mm a
0,35 mm. Ejemplos de diámetros muy preferidos son 0,25 mm y 0,35
mm.
La presión en la cámara/cilindro de presión se
ajusta a un valor comprendido en el intervalo de 200 a 1000 bar,
preferiblemente 400 a 1000 bar, 200 a 800 bar, más preferiblemente
400 a 800 bar, 600 a 1000 bar, todavía más preferiblemente 600 a
900 bar, y muy preferiblemente 700 a 900 bar. La presión más
preferida es 800 bar.
La temperatura del homogeneizado a la salida no
debería sobrepasar preferiblemente +25ºC, y preferiblemente debería
ser inferior a 15ºC, muy preferiblemente inferior a 10ºC.
El método de acuerdo con la presente invención
puede escalarse de manera prácticamente lineal, y puede ejecutarse
como proceso por lotes o continuo.
En un proceso por lotes, cada lote de las células
a homogeneizar puede someterse al paso de homogeneización a alta
presión una o varias veces. Preferiblemente, cada lote se somete al
paso de homogeneización una a tres veces, muy preferiblemente una
sola vez.
El éxito del paso de homogeneización puede
comprobarse preferiblemente por determinación del título de virus
(equivalente al número de partículas infecciosas de virus, medido
en dosis infecciosa de cultivo de tejidos (TCID_{50}), o en
unidades formadoras de placas (pfu)) del material de partida como
se ha definido arriba y del material obtenido después del paso de
homogeneización. Dicho de otro modo, el título de virus se
determina antes y después de la homogeneización a alta presión. El
material de partida comprende células más o menos intactas y un
porcentaje bastante alto de grandes agregados que comprenden
partículas de poxvirus unidas a membranas celulares. Si se utiliza
dicho material para la determinación del título de virus, el título
obtenido es menor que el número real de partículas infecciosas.
Esto es debido al hecho de que los sistemas de ensayo utilizados
para la determinación del título de virus son usualmente sistemas de
cultivo de células (tales como el sistema que se describe en el
Ejemplo 2) en los cuales se somete a recuento el número de células
infectadas o el número de placas. Un sistema de este tipo no puede
distinguir entre un resultado positivo que es debido a la infección
de una célula por exactamente una partícula de virus y la infección
de células v.g. por un gran agregado de virus unidos a membranas
celulares. Después de la homogeneización a alta presión, los
poxvirus llegan a desprenderse de las membranas celulares y/o el
tamaño de los agregados membrana celular-virus se
reduce significativamente, lo que conduce a un mayor número de
agregados más pequeños. Si se utiliza este material para la
determinación del título, los resultados obtenidos son mayores, aun
cuando la cantidad real de partículas infecciosas de virus no ha
cambiado. Así pues, el éxito de la homogeneización se refleja
preferiblemente por al menos un valor TCID_{50}/ml ("TCID" es
la abreviatura de "dosis infecciosa de cultivo de tejidos")
igual o mayor del homogeneizado en comparación con el material de
partida. En la sección de ejemplos, se muestra en detalle de qué
modo puede determinarse el valor TCID_{50}/ml. Alternativamente,
la calidad y el éxito de la homogeneización a alta presión pueden
determinarse por microscopía electrónica.
Para la purificación ulterior, el homogeneizado
obtenido se somete a al menos un paso de purificación a fin de
obtener una fracción enriquecida en poxvirus. En particular, estos
pasos pueden llevarse a cabo para un homogeneizado que contiene
virus Vaccinia si se intenta purificar ulteriormente dicho
virus Vaccinia.
El paso de purificación puede ser, entre
otros,
- -
- centrifugación por lotes (v.g. utilizando colchones de sacarosa) o ultracentrifugación en flujo continuo (gradientes de sacarosa) (Hilfenhaus, J., Köhler, R. y Gruschkau, H., J. Biol. Stand. (1976), 285-293; Madalinski, W., Bankovski, A. y Korbecki, M., Acta Virol. (1977) 21, 104-108),
- -
- ultrafiltración (v.g. filtración en flujo cruzado utilizando una membrana con un tamaño de poro mayor que 500 kDa, pero igual o menor que 0,1 \mum),
- -
- cromatografía en columna (v.g. intercambio iónico, interacción hidrófoba, exclusión por tamaños o una combinación) (Hedström, K.G. y Lindberg, U., Z. Immun. Forsch. 1969, 137:421-430; Stickl, H., Korb, W. y Hochstein-Mintzel, V., Zbl. Bakt., I. Abt. Orig. (1970), 215, 38-50) o
- -
- una combinación de todos los anteriores (Masuda, N., Ellen, R.P. y Grove, D.A., J. Bacteriol. (1981), 147(3), 1095-1104).
Cualesquiera otros métodos de purificación
conocidos por las personas expertas en la técnica están también
dentro del alcance de la presente invención.
Preferiblemente, el paso de purificación es un
paso de ultrafiltración. Muy preferiblemente, la ultrafiltración es
una filtración en flujo cruzado. El principio de la filtración en
flujo cruzado es conocido por las personas expertas en la técnica.
Véase, v.g., Richards, G.P. y Goldmintz, D., J. Virol. Methods
(1982), 4(3), páginas 147-153. "Evaluation
of a cross-flow filtration technique for extraction
of polioviruses from inoculated oyster tissue homogena-
tes".
Aunque podría ser suficiente un solo paso de
purificación para satisfacer los requisitos reglamentarios para
productos biofarmacéuticos, pueden combinarse dos o más de los
pasos de purificación arriba mencionados a fin de obtener un
producto todavía más puro.
En la realización más preferida, el primer paso
de purificación es una filtración en flujo cruzado seguida por al
menos un paso de cromatografía en columna. Muy preferiblemente, el
paso de cromatografía en columna es intercambio iónico o
interacción hidrófoba.
La fracción enriquecida en virus obtenida se
liofiliza opcionalmente. Métodos de liofilización son conocidos por
las personas expertas en la técnica (Day J. y McLellan M., Methods
in Molecular Biology (1995), 38, Humana Press, "Cryopreservation
and freeze-drying protocols").
La invención concierne adicionalmente a la
fracción enriquecida en poxvirus y/o el homogeneizado que contiene
poxvirus obtenidos por el método de recuperación de poxvirus de
acuerdo con la presente invención, es decir el método que comprende
el paso de someter las células infectadas a homogeneización a alta
presión. En particular, la invención concierne a la fracción
enriquecida en poxvirus obtenida por el método
recuperación/purificación de acuerdo con la presente invención, es
decir, el método en el cual el homogeneizado que contiene poxvirus
obtenido por HPH se somete a al menos un paso de purificación. El
poxvirus puede ser cualquier poxvirus como se ha definido arriba. En
particular, el poxvirus de acuerdo con la presente invención es un
virus Vaccinia, como cualesquiera de tales cepas que son
adecuadas para vacunación, en particular la cepa Elstree o el virus
Vaccinia Ankara modificado, muy preferiblemente
MVA-BN.
El homogeneizado que contiene poxvirus y/o la
fracción enriquecida en poxvirus obtenida por un proceso de acuerdo
con la presente invención que comprende un paso HPH se caracteriza
por una relación muy alta de poxvirus IMV libre a poxvirus EEV. La
expresión "IMV libre" se utiliza para IMVs que se han
desprendido de las membranas celulares después, antes o durante la
desintegración de las células infectadas y que por tanto pueden
purificarse ulteriormente. En todos los procesos industriales para
la preparación de poxvirus, el material de partida comprende las
células infectadas así como el sobrenadante de cultivo. Así pues,
el material de partida comprende poxvirus IMV contenidos en las
células infectadas así como poxvirus EEV que se encuentran
principalmente en el sobrenadante. Los métodos conocidos para la
desintegración de células y la homogeneización subsiguiente (v.g.
por utilización de ultrasonidos) no desintegran tan eficientemente
las células y/o desprenden los poxvirus IMV de los residuos
celulares como la homogeneización a alta presión. Dicho de otro
modo, la mayoría de los IMV permanecen unidos a membranas celulares
y residuos. Así pues, la relación de IMV libre a EEV es menor que
en el método de acuerdo con la presente invención. El método que
utiliza ultrasonidos, esta relación no cambia significativamente
durante los pasos de purificación ulteriores, dado que los residuos
celulares a los cuales están todavía unidos los IMVs se separan
usualmente. En contraste con los métodos de recuperación conocidos
para poxvirus, el método de recuperación de acuerdo con la presente
invención da como resultado una desintegración muy eficaz de las
células infectadas y las IMVs se desprenden muy eficazmente de las
membranas celulares. Así, la cantidad global de IMVs libres que
llegan a estar disponibles para purificación ulterior es mayor que
para los métodos conocidos en la técnica anterior, y por
consiguiente es también mayor la relación de poxvirus IMV libres a
EEV.
El homogeneizado que contiene poxvirus y/o la
fracción enriquecida en poxvirus obtenida por el método de acuerdo
con la presente invención son útiles como vacunas.
Si el homogeneizado que contiene poxvirus y/o la
fracción enriquecida en poxvirus comprenden poxvirus no modificados
o poxvirus atenuados, tales como las cepas de virus Vaccinia
Elstree o MVA, el mismo puede utilizarse para vacunación contra
infecciones de poxvirus. V.g. un homogeneizado que contiene virus
y/o la fracción enriquecida en virus que comprende virus
Vaccinia tales como las cepas Elstree o MVA, en particular
MVA-BN, puede utilizarse como vacuna contra
infecciones de viruela.
Si el homogeneizado que contiene poxvirus y/o la
fracción enriquecida en poxvirus comprende un poxvirus que contiene
y expresa uno o más genes heterólogos, el homogeneizado que contiene
poxvirus y/o la fracción enriquecida en poxvirus pueden utilizarse
ulteriormente para vacunar animales con inclusión de seres humanos
contra la proteína expresada por el o los genes heterólogos.
Para la preparación de una vacuna, el
homogeneizado que contiene poxvirus y/o la fracción enriquecida en
poxvirus obtenida por el método de acuerdo con la presente
invención se convierten en una forma fisiológicamente aceptable.
Esto puede hacerse basándose en la experiencia en la preparación de
vacunas de poxvirus utilizadas para la vacunación contra la viruela
(como ha sido descrito por Stickl, H. et al., [1974] Dtsch.
med. Wschr. 99, 2386-2392). Por ejemplo, el
homogeneizado que contiene poxvirus y/o la fracción enriquecida en
poxvirus se guardan a -80ºC con un título de 5 x 10^{8}
TCID_{50}/ml formulado en Tris aproximadamente 10 mM, NaCl 140 mM,
pH 7,4. Para la preparación de dosis de vacuna, v.g.,
10^{3}-10^{9} TCID_{50} del virus se
liofilizan en solución salina tamponada con fosfato (PBS) en
presencia de 2% de peptona y 1% de albúmina humana en una ampolla,
preferiblemente una ampolla de vidrio. Alternativamente, las dosis
de vacuna pueden producirse por liofilización gradual del virus en
una formulación. Esta formulación puede contener aditivos
adicionales tales como manitol, dextrano, azúcar, glicina, lactosa
o polivinilpirrolidona u otros aditivos tales como antioxidantes o
gas inerte, estabilizadores o proteínas recombinantes (v.g.
seroalbúmina humana) adecuados para administración in vivo.
Una formulación típica que contiene virus adecuada para
liofilización comprende tampón Tris 10 mM, NaCl 140 mM, 18,9 g/l de
dextrano (PM 36000-40000), 45 g/l de sacarosa, 0,108
g/l de sal monopotásica del ácido L-glutámico
monohidratada de pH 7,4. La ampolla de vidrio se sella luego y
puede guardarse entre 4ºC y la temperatura ambiente durante varios
meses. Sin embargo, mientras no exista necesidad, la ampolla se
guarda preferiblemente a temperaturas inferiores a -20ºC.
Para la vacunación, el producto liofilizado o
secado por congelación puede disolverse en 0,1 a 0,5 ml de una
solución acuosa, preferiblemente solución salina fisiológica o
tampón Tris, y administrarse sistémica o localmente, es decir por
vía parenteral, intramuscular o por cualquier otra vía de
administración conocida por el técnico experto. El modo de
administración, la dosis y el número de administraciones pueden ser
optimizados por los expertos en la técnica de manera conocida. Es
muy preferida para los vectores poxvíricos la administración
subcutánea o intramuscu-
lar.
lar.
La vacunación de animales con inclusión de
humanos comprende inoculación de un animal, con inclusión de un
humano, que se encuentra en necesidad de ello con un homogeneizado
que contiene poxvirus o una fracción enriquecida en poxvirus
obtenida por el método de acuerdo con la presente invención.
La invención comprende, inter alia lo
siguiente, solo o en combinación:
Un método para la recuperación de poxvirus a
partir de células infectadas que comprende el paso de someter las
células infectadas a una homogeneización a alta presión para
obtener un homogeneizado que contiene poxvirus.
Un método como se ha indicado arriba,
caracterizado porque el poxvirus se selecciona del grupo constituido
por ortopoxvirus, poxvirus de aves, poxvirus de suidos y poxvirus
de caprinos.
Un método como se ha indicado arriba,
caracterizado porque el poxvirus se selecciona del grupo constituido
por virus Vaccinia, poxvirus de cabra, poxvirus de oveja,
poxvirus de canario y poxvirus de aves de corral.
Un método como se ha indicado arriba,
caracterizado porque el virus Vaccinia es la cepa de virus
Vaccinia Ankara modificada (MVA), en particular
MVA-BN con el número de depósito ECACC
V00083008.
Un método como se ha indicado arriba,
caracterizado porque el poxvirus es un poxvirus recombinante.
Un método como se ha indicado arriba,
caracterizado porque la homogeneización a alta presión se lleva a
cabo introduciendo las células infectadas en una cámara de alta
presión, aumentando la presión en la cámara y expulsando las células
infectadas a través de una tobera.
Un método como se ha indicado arriba,
caracterizado porque la presión en la cámara se aumenta hasta un
valor comprendido en el intervalo de 200 a 1000 bar.
Un método como se ha indicado arriba,
caracterizado porque la tobera tiene un diámetro comprendido en el
intervalo de 0,10 a 0,6 mm.
Un método como se ha indicado arriba,
caracterizado porque el homogeneizado que contiene poxvirus se
somete a al menos un paso de purificación a fin de obtener una
fracción enriquecida en poxvirus.
Un método como se ha indicado arriba,
caracterizado porque el al menos un paso de purificación es un paso
de ultrafiltración.
Un método como se ha indicado arriba,
caracterizado porque la ultrafiltración es una filtración en flujo
cruzado.
Un método como se ha indicado arriba,
caracterizado porque en el paso de filtración en flujo cruzado se
utiliza una membrana que tiene un tamaño de poro mayor que 500 kDa,
pero igual o menor que 0,1 \mum.
Un método como se ha indicado arriba,
caracterizado porque a continuación de la ultrafiltración se lleva a
cabo al menos un paso de cromatografía en columna.
Un método como se ha indicado arriba,
caracterizado porque el homogeneizado que contiene poxvirus o la
fracción enriquecida en poxvirus obtenida se liofiliza.
Un homogeneizado que contiene poxvirus o una
fracción enriquecida en poxvirus obtenido(a) por un método
como se ha definido arriba.
Un homogeneizado que contiene poxvirus o una
fracción enriquecida en poxvirus como se ha indicado arriba,
empleado como vacuna.
El uso del homogeneizado que contiene poxvirus o
la fracción enriquecida en poxvirus como se ha indicado arriba para
la preparación de una vacuna.
Figura 1: Células CEF infectadas con
MVA-BN se sometieron a un ciclo de
congelación-descongelación para obtener una
suspensión virus-células. El título de virus de la
suspensión se determinó como se describe en el Ejemplo 2 sin
purificación ulterior de la suspensión
células-virus ("valor O"). La suspensión
virus-células se sometió a un método de
homogeneización conocido por la técnica anterior utilizando
ultrasonidos ("Sonifier") o al método de homogeneización de
acuerdo con la presente invención ("HPH") como se describe en
el Ejemplo 1. En el paso HPH, la presión era 800 bar y la tobera
tenía un diámetro de 0,25 mm. Al final del paso de homogeneización,
se determinó de nuevo el título de virus.
El o los ejemplos siguientes ilustrarán
adicionalmente la presente invención. Quedará bien entendido por
las personas expertas en la técnica que el o los ejemplos
proporcionados no pueden interpretarse en modo alguno de una manera
que limite la aplicabilidad de la tecnología proporcionada por la
presente invención a este u estos ejemplos.
Fibroblastos de embrión de pollo (CEF) cultivados
en matraces rodantes se han infectado con MVA-BN
(ECACC V00083008). Las células infectadas se sometieron a
congelación y descongelación para obtener una suspensión
virus-células.
Un homogeneizador Basic Z+, de Constant Cell
Disruption Systems (Low March, Daventry, Northants, NN114SD, Reino
Unido) se cargó con 50 ml de la suspensión bruta
virus-células para cada operación. A fin de
identificar las condiciones óptimas de homogeneización, se
ensayaron diámetros de tobera comprendidos en el intervalo de 0,18
a 0,40 mm y presiones comprendidas en el intervalo de 200 a 1000
bar. La suspensión bruta se sometió a la homogeneización a alta
presión una, dos o tres veces. El homogeneizador se utilizó de
acuerdo con las instrucciones del fabricante. La evaluación del
método se realizó por observación del título como se describe en el
Ejemplo 2.
En estudios previos se encontró que los diámetros
de boquilla mayores que 0,4 mm no tienen influencia positiva alguna
sobre los resultados de la homogeneización. Con diámetros de tobera
de 0,18 mm, 0,25 mm y 0,35 mm, se obtuvieron los resultados óptimos
sometiendo la suspensión virus-células una sola vez
a una presión de 800 bar. En estas condiciones, no se ha observado
diferencia importante alguna en términos de título.
El método de acuerdo con la presente invención se
comparó con el tratamiento de ultrasonidos continuo de flujo directo
conocido por la técnica anterior. Los resultados se resumen en la
figura 1. Comparado con el tratamiento de ultrasonidos, el método
de acuerdo con la presente invención dio como resultado un título de
virus mayor y una mejor homogeneidad de la suspensión, por lo que
es más adecuado para procesamiento ulterior aguas abajo.
La titulación del virus Vaccinia Ankara
modificado (MVA) se realiza en un ensayo basado en TCID_{50}
utilizando diluciones al décuplo en un formato de 96 pocillos. En
el punto final del ensayo, las células infectadas se visualizan
utilizando un anticuerpo anti-virus Vaccinia
y una solución de tinción apropiada.
Células CEF (fibroblastos de embrión de pollo)
primarias de 2-3 días se diluyen hasta 1 x 10^{5}
células/ml en RPMI al 7%. Se realizan diluciones al décuplo con 8
réplicas por dilución. Después de la dilución, se siembran 100
\mul por pocillo de placas de 96 pocillos. Las células se incuban
luego durante una noche a 37ºC y 5% de CO_{2}.
Se realizan diluciones de las soluciones que
contienen virus en pasos al décuplo (10^{-1} a 10^{-12} según
sea apropiado) utilizando RPMI sin suero de ternero fetal. A
continuación se añaden 100 \mul de cada muestra de virus a los
pocillos que contienen células. Las placas de 96 pocillos se
incuban a 37ºC con 5% de CO_{2} durante 5 días para permitir la
infección y replicación vírica.
Las células se tiñen 5 días después de la
infección con un anticuerpo específico del virus Vaccinia.
Para la detección del anticuerpo específico, se utiliza un
anticuerpo secundario acoplado a peroxidasa de rábano picante,
(HRP). El anticuerpo específico de MVA es una fracción IgG
policlonal de conejo del anticuerpo anti-virus
Vaccinia (Quartett, Berlín, Alemania
#9503-2057). El anticuerpo secundario es un
anticuerpo anti-IgG de conejo, policlonal de cabra
acoplado a HRP (Promega, Mannheim, Alemania, # W4011). La reacción
de color se lleva a cabo de acuerdo con técnicas conocidas.
Cada pocillo que contiene células que son
positivas en la reacción de color se marca como positivo para el
cálculo del parámetro TCID_{50}.
El título se calcula utilizando la fórmula de
Spearman [1] y Kaerber [2]. Dado que todos los parámetros de ensayo
se mantienen constantes, se utiliza la fórmula simplificada
siguiente:
Título de virus
\hskip1cm[TCID_{50}/ml] = 10^{\left[a + 1,5 + \frac{x_{a}}{8} + \frac{x_{b}}{8} + \frac{x_{c}}{8}\right]}
a = factor de dilución de la última
columna, en la cual los ocho pocillos son
positivos
x_{a} = número de pocillos positivos en la
columna a+1
x_{b} = número de pocillos positivos en la
columna a+2
x_{c} = número de pocillos positivos en la
columna a+3
Claims (17)
1. Método para la recuperación de poxvirus a
partir de células infectadas que comprende el paso de someter las
células infectadas a una homogeneización a alta presión a fin de
obtener un homogeneizado que contiene poxvirus.
2. Método de acuerdo con la reivindicación 1,
caracterizado porque el poxvirus se selecciona del grupo
constituido por ortopoxvirus, poxvirus de aves, poxvirus de suidos,
y poxvirus de caprinos.
3. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque el poxvirus se
selecciona del grupo constituido por virus Vaccinia,
poxvirus de cabra, poxvirus de oveja, poxvirus de canario y poxvirus
de aves de corral.
4. Método de acuerdo con la reivindicación 3,
caracterizado porque el virus Vaccinia es Elstree o
la cepa de virus Vaccinia Ankara Modificada (MVA), en
particular MVA-BN con el número de depósito ECACC
V00083008.
5. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el poxvirus es
un poxvirus recombinante.
6. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la
homogeneización a alta presión se lleva a cabo poniendo las células
infectadas en una cámara de alta presión, aumentando la presión en
la cámara y expulsando las células infectadas a través de una
tobera.
7. Método de acuerdo con la reivindicación 6,
caracterizado porque la presión en la cámara se aumenta
hasta un valor comprendido en el intervalo de 200 a 1000 bar.
8. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 7, caracterizado porque la tobera tiene
un diámetro comprendido en el intervalo de 0,10 a 0,6 mm.
9. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el
homogeneizado que contiene poxvirus se somete a al menos un paso de
purificación para obtener una fracción enriquecida en poxvirus.
10. Método de acuerdo con la reivindicación 9,
caracterizado porque uno del al menos un paso de
purificación es un paso de ultrafiltración.
11. Método de acuerdo con la reivindicación 10,
caracterizado porque la ultrafiltración es una filtración en
flujo cruzado.
12. Método de acuerdo con la reivindicación 11,
caracterizado porque en el paso de filtración en flujo
cruzado se utiliza una membrana que tiene un tamaño de poro mayor
que 500 kDa pero igual o menor que 0,1 \mum.
13. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 12, caracterizado porque a
continuación de la ultrafiltración se lleva a cabo al menos un paso
de cromatografía en columna.
14. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque el
homogeneizado que contiene poxvirus o la fracción enriquecida en
poxvirus se liofiliza.
15. Fracción enriquecida en poxvirus u
homogeneizado que contiene poxvirus obtenido(a) por el método
de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.
16. Fracción enriquecida en poxvirus u
homogeneizado que contiene poxvirus de acuerdo con la reivindicación
15 empleada como vacuna.
17. Uso de la fracción enriquecida en poxvirus o
el homogeneizado que contiene poxvirus de acuerdo con la
reivindicación 15 para la preparación de una vacuna.
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