NO335975B1 - Fremgangsmåte til gjenvinning av poxvira, poxvirusanriket fraksjon eller poxvirusinneholdende homogenat oppnådd ved denne fremgangsmåten og anvendelser derav. - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte til gjenvinning av poxvira, særlig modifisert Vaccinia-virus Ankara (MVA), fra infiserte celler. I henhold til foreliggende oppfinnelse blir de poxvirusinfiserte cellene utsatt for en høytrykkshomogenisering for å oppnå et poxvirus-inneholdende homogenat. Det poxvirus-inneholdende homogenat kan utsettes for minst ett rensetrinn for å oppnå en poxvirusanriket fraksjon. Oppfinnelsen angår ytterligere den poxvirusinneholdende fraksjonen og det poxvirusinneholdende homogenat oppnådd ved fremgangsmåten i henhold til foreliggende oppfinnelse.

Poxvirida omfatter en stor familie av komplekse DNA-vira som replikerer i cytoplasma til vertebrat- og invertebratceller familien poxvirida kan oppdeles i subfamilien chordopoxvirinae (vertebrat poxvirus) og entomopoxvirina (insektpoxvira).

Chordopoxvirina omfatter flere dyrepoxvira (klassifisert i forskjellige slekter) av betydelig økonomisk viktighet, så som kamelpoxvira, sauepoxvira, geitpoxvira og avipoxvira, særlig hønsepoxvirus. For vaksinasjonen av besetning mot sauepox og geitepox er svekkede levende virus og inaktiverte vaksiner tilgjengelig. For vaksinering av fjærfe er rekombinante vaksiner blitt utviklet ved å bruke hønsepoxvirus som en vektor.

Siden hønsepoxvirus infiserer humane celler er det antatt at den også kan brukes som en vektor for å uttrykke heterologe gener hos mennesker og å indusere en korresponderende immunrespons. Hønsepoxvirus som inneholder HIV-gener i genomet er beskrevet i US 5 736 368 og US 6 051 410.

Hos mennesker var variolavirus, et medlem av slekten ortopoxvirus, det mest viktige poxvirus. Vaccinia-virus, også et medlem av slekten ortopoxvirus i familien poxvirida, ble brukt som en levende vaksine for å immunisere mot kopper. Vellykket verdensomspennende vaksinering med Vaccinia-virus kulminerte i utslettelse av variolavirus (The global eradication of smallpox. Final report of the global commission for the certification of smallpox eradication; History of Public Health, nr. 4, Geneva: World Health Organization, 1980). Siden den WHO-erklæringen er vaksinasjon blitt avbrutt i mange år unntagen når det gjelder folk med høy risiko for poxvirusinfeksjoner (f.eks. laboratorieansatte). Vaksinasjonsprogram er igjen blitt av interesse i lys av den risiko av variolavirus blir brukt i biologisk krigføring eller av bioterrorister.

Mer nylig er vacciniavira også blitt brukt til å konstruere virale vektorer for rekombinant genekspresjon og for den potensielle anvendelse som rekombinant levende vaksiner (Mackett, M., Smith, G.L. og Moss, B. [1982] P.N.A.S. USA 79, 7415-7419; Smith, G.L., Mackett, M. og Moss, B. [1984] Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 2, 383-407. Dette innbefatter DNA-sekvenser (gener) som koder for fremmede antigener som blir innført, ved hjelp av DNA-rekombineringsteknikk, inn i genomet til Vaccinia vira. Hvis genet er integrert på et sete i viralt DNA som ikke er essensielt for livssyklusen til virus, er det mulig for den nylig produserte rekombinante Vaccinia-virus å være infeksiøs, dvs. å være i stand til å infisere fremmede celler og således å uttrykke den integrerte DNA-sekvens (EP patentsøknader nr. 83 286 og nr. 110 385). De rekombinante Vaccinia vira fremstilt på denne måten kan anvendes på den ene side som levende vaksiner for profylakse mot infeksiøse sykdommer, på den andre side til fremstilling av heterologe proteiner i eukaryote celler.

Anvendelse av Vaccinia-virus som vektor for utvikling av rekombinante levende vaksiner er blitt påvirket av sikkerhetsvurderinger og reguleringer. De fleste rekombinante Vacciniavira beskrevet i litteraturen er basert på Western Reserve strain of Vaccinia-virus. Det er kjent at denne stammen har en høy nevrovirulens og er således dårlig egnet for anvendelse på mennesker og dyr (Morita et al., Vaccine 5, 65-70 [1987]). På den annen side er modifisert Vaccinia-virus Ankara (MVA) kjent for å være eksepsjonelt sikker. MVA er blitt dannet ved langtids seriepassasjer av Ankara-stammen av Vaccinia-virus (CVA) på kyllingembryofibroblaster (for oversikt se Mayr, A., Hochstein-Mintzel, V. og Stickl, H. [1975] Infection 3, 6-14; sveitsisk patent nr. 568 392). Eksempler på MVA-virusstammer deponert i overenstemmelse med kravene til Budapest-avtalen er stammer MVA 572, MVA 575 og MVA-BN deponert ved the European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Salisbury (UK) med deponeringsnumre ECACC V94012707, ECACC V00120707 og ECACC V00083008. MVA skiller seg ut ved sin store svekkelse, dvs. ved nedsatt virulens eller infektivitet mens den opprettholder god immunogenisitet. MVA-virus er blitt analysert for å bestemme forandringene i genomet i forhold til villtype CVA-stamme. Seks viktige delesjoner i genomisk DNA (delesjon I, II, III, IV, V og VI) som omfatter totalt 31000 basepar er blitt identifisert (Meyer, H„ Sutter, G. og Mayr A. [1991] J. Gen. Virol. 72, 1031-1038). Det resulterende MVA-virus ble alvorlig vertscellebegrenset til fugleceller. Videre er MVA kjennetegnet ved dens ekstreme svekkelse. Når den ble testet i et utvalg av dyremodeller viste MVA seg å være avirulent selv i immunundertrykkede dyr. Mer viktig har de utmerkede egenskapene til MVA-stammen blitt vist i utstrakte kliniske forsøk (Mayr et al., Zbl. Bakt. HYg. I, Abt. Org. B 167, 375-390 [1987], Stickl et al., Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392 [1974]. Under disse undersøkelsene av mer enn 120 000 mennesker inkludert høyrisikopasienter ble ingen bivirkninger assosiert med anvendelse av MVA-vaksine. Rekombinant MVA nyttig som vaksiner er allerede blitt konstruert og brukt i kliniske forsøk. WO 98/13500 beskriver en rekombinant MVA som inneholder og er i stand til å uttrykke én eller flere DNA-sekvenser som koder Dengvirus-antigener. De fremmede DNA-sekvensene ble rekombinert inn i det virale DNA på setet for en naturlig forekommende delesjon i MVA-genomet. WO 97/02355 beskriver også rekombinante vacciniavirus utledet fra MVA inneholdende fremmede gener som er innsatt i området av MVA genomet som har den naturlige delesjonen. Det er beskrevet at disse rekombinante MVA virusene kan brukes til fremstilling av polypeptider, f.eks. antigener eller terapeutiske midler.

Før bruk av poxvira eller rekombinante poxvira for vaksinasjon er det nødvendig å rense virus til en viss grad for å møte regulatoriske krav. Den tradisjonelle måten å rense poxvira på, særlig MVA og rekombinant MVA er som følger: i et første trinn blir cellene utsatt for infeksjon med de respektive poxvirus dyrket. I tilfelle av MVA er de utsatte cellene blant annet kyllingembryofibroblaster. De utsatte cellene blir infisert med poxvirus og dyrket over en tidsperiode tilstrekkelig til å tillate dannelse av virusetterkommere. Cellene blir deretter frosset og tint for å løsne cellene fra kulturampulleoverflaten og delvis ødelegge cellene. Blandingen av intakte og ødelagte celler blir sentrifugert ned. Ultralyd blir brukt for å fremstille et homogenat. Virus er renset fra homogenatet ved sukroseputesentrifugering (Joklik, WK. "The purification of four strains of poxvirus" Virology 1962M 18:9-18). Nøkkeltrinnet i denne prosessen er homogeniseringen ved å bruke ultralyd (Hedstrom, K.G. og Lindberg, U., Z. Immun. Forsch. 1969, 137: 421-430; Stickl, H., Korb, W. og Hochstein-Mitzel, V., Zbl. Bakt., I. Abt. Orig. (1970), 215, 38-50). I industrielle prosesser er det foretrukket at alle prosesstrinnene er lette å kontrollere og er reproduserbare. Ulempen ved å bruke ultralyd for å homogenisere viruscellesuspensjonen er imidlertid at ultralydtrinnet er vanskelig å reprodusere på en identisk måte, vanskelig å justere og er vanskelig å oppskalere fra en laboratorietest til industriell skala.

Det er således en hensikt med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en fremgangsmåte til gjenvinning av poxvira, spesielt Vacciniavira, så som stamme MVA fra poxvirusinfisere celler, hvori homogeniseringen av de infisere cellene er reproduserbar, lett å kontrollere og tillater en lett oppskalering fra laboratoriet til industriell skala.

Den foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte til gjenvinning av poxvira, særlig Vacciniavira, så som stammen Elstree eller modifisert Vaccinia-virus Ankara (MVA) fra infiserte celler. Fremgangsmåten i henhold til foreliggende oppfinnelse for gjenvinning av poxvirus fra infiserte celler omfatter trinnet å utsette de infiserte celler for en høytrykkshomogenisering for å oppnå et poxvirusinneholdende homogenat.

Det var uventet at intakte og infeksiøse postvira kan gjenvinnes ved fremgangsmåten i henhold til foreliggende oppfinnelse. Høytrykkshomogenisering er vanligvis brukt til destruksjon av cellulære og subcellulære strukturer for å isolere proteiner eller lipider fra eukaryote og prokaryote celler. US 3 983 008 beskriver en fremgangsmåte til å ekstrahere nyttige komponenter fra mikrobielle celler ved å bruke høytrykkshomogeniseringer. De ekstraherte forbindelser var gjærproteiner, bakterielle enzymer og gjærlipider. DE 19918619 beskriver anvendelse av høytrykkshomogenisering for å isolere HbsAg fra gjærceller. US 4 255 521 beskriver en fremgangsmåte til å ekstrahere glukoseisomerase fra mikroorganismeceller ved høytrykksfrigjøring. Høytrykkshomogenisering er også blitt brukt til isolering av viruslignende partikler (VLP) fra rekombinant Saccharomyces cerevisiae (Milburn og Dunnill (1994) Biotechnology and Bioengineering 44, 736-744) og til fremstilling og rensing av adenovirale vektorer (US 6 194 191). VLP og adenovirus uten kapper er heller små og enkle vira som således ligner cellulære proteinstrukturer. Derfor er det ikke overraskende at høytrykkshomogeniseringen som har vist seg å være egnet for isolering av proteiner fra celler også kan benyttes til isolasjon av adenovira og VLP fra eukaryote celler. I motsetning til dette har intracellulære modne poxvirusvirioner (IMV, se nedenfor, se Fields et al., Fields Virology, 1996, Lippincott-Raven publishers, Philadelphia, USA, ISBN 0-7817-0253-4, kapittel 83, sider 2654-5) en meget kompleks morfologi som blant annet innbefatter lipidmembraner. Morfologien og fysiske egenskaper til en poxvirus IMV er i noen henseende tettere beslektet til morfologien og de fysikalske egenskaper til en celle eller egenskapene til et virus uten kappe. Følgelig var det forventet at betingelsene brukt for oppriving av celler ved å bruke høytrykkshomogenisering også ville føre til oppriving av poxvira. Således var det et overraskende resultat at høytrykkshomogenisering river opp celler men lar en tilstrekkelig mengde poxvira være intakt slik at de ytterligere kan renses. Med andre ord ville man ikke ha antatt at høytrykkshomogenisering kunne anvendes i en fremgangsmåte for gjenvinning av poxvira fra infiserte celler. Den kjente fremgangsmåten for gjenvinning av poxvira fra infiserte celler bruker virkelig ultralyd for homogenisering som er en heller mild måte å homogenisere.

I motsetning til de gjenvinningsmetodene som bruker ultralyd tillater metoden i henhold til foreliggende oppfinnelse en reproduserbar homogenisering av infiserte celler, metoden er lett å kontrollere og er lett å oppskalere fra en laboratorietest til en industriell skala.

I sammenheng med foreliggende oppfinnelse betegner "poxvirus" ethvert virus som tilhører familien poxvirida. Fremgangsmåten i henhold til foreliggende oppfinnelse blir fortrinnsvis utført med poxvirida i underfamilien kordopoxvirina, mer fortrinnsvis i slekten ortopoxvirus, avipoxvirus, capripoxvirus og suipoxvirus. Mest fortrinnsvis angår oppfinnelsen en fremgangsmåte til gjenvinning og rensing av poxvira valgt fra gruppen som består av Vaccinia-virus, geitpoxvirus, saupoxvirus, kanaripoxvirus og hønsepoxvirus. Særlig foretrukket er Vaccinia-virus. Eksempler på Vaccinia-virusstammer brukt i fremgangsmåten i henhold til foreliggende oppfinnelse er stammene Elstree, Wyeth, Copenhagen, Temple of Heaven, NYCBH, Western Reserve. Oppfinnelsen er ikke begrenset til de spesifikt nevnte Vaccinia-virusstammene men kan isteden anvendes ved enhver Vaccinia-virusstamme. Et foretrukket eksempel på en Vaccinia-virusstamme er den modifiserte Vaccinia-virusstamme Ankara (MVA). EN typisk MVA-stamme er MVA 575 som er blitt deponert ved European Collection of Animal Cell Cultures under deponeringsnumret ECACC V00120707. Mest foretrukket re MVA-BN eller et derivat derav. MVA-BN er blitt beskrevet i WO 02/42480 (PCT/EP01/13628). Nevnte internasjonale søknad beskriver biologiske assay som tillater evaluering om en MVA-stamme er MVA-BN eller et derivat derav og fremgangsmåter som tillates å oppnå MVA-BN eller et derivat derav. Innholdet i denne søknad er inkludert i den foreliggende søknad ved referanse. MVA-BN er blitt deponert ved European Collection of Animal Cell Cultures med deponeringsnummer ECACC V00083008.

Viraene som skal gjenvinnes kan være native vira, svekkede vira eller rekombinante vira.

Betegnelsen "rekombinant virus" refererer seg til ethvert virus som har innskutt i det virale genom et heterologt gen som ikke er naturlig del av det virale genomet. Et heterologt gen kan være et terapeutisk gen, et gen som koder for et antigen eller et peptid som omfatter minst én epitop for å indusere en immunrespons, en antisense ekspresjonskassett eller et ribosymgen. Fremgangsmåter til å oppnå rekombinante vira er kjent for en person med kunnskap på området. Det heterologe gen er fortrinnsvis innskutt i en ikke-essensiell region i virusgenomet. I en annen foretrukket utforming av oppfinnelsen er den heterologe nukleinsyresekvens innskutt i et naturlig forekommende delesjonssete i MVA-genomet (beskrevet i PCT/EP96/02926).

En "svekket virus" er en virus som ved infeksjon av vertsorganismen resulterer i en lavere mortalitet og/eller morbiditet sammenlignet med den ikke-svekkede stamvirus. Et eksempel på en svekket Vaccinia-virus er stamme MVA, særlig MVA-575 og MVA-BN.

Poxvira så som Vaccinia-virus er kjent for å eksistere i to forskjellige former; poxvirus festet til cellulære membraner i cytoplasma til infiserte celler (intracellulær modne virioner (EEV) og vira som har blitt eksternalisert (ekstracellulære virioner med kappe (EEV)) (Vandreplasschen A, Hollinshead M, Smith GL "Intracellular and extracellular vaccinia virions enter cells by different mechanisms" J. Gen. Virol. (1998), 79, 877-887). IMV og EEV er begge infeksiøse men morfologisk forskjellige siden EEV inneholder en ytterligere lipoproteinkappe. Under normale omstendigheter er IMV-partikler rikeligere enn EEV, men i fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen kan begge typer av partikler oppnås.

Startmaterialet for homogeniseringstrinnet i henhold til den foreliggende oppfinnelse er celler infisert med de respektive poxvirus. Betegnelsen "infiserte celler" brukt for å definere utgangsmaterialet for homogeniseringen i henhold til foreliggende oppfinnelse refererer seg til intakte celler infisert med de respektive virus, til deler og fragmenter av infiserte celler til hvilke de respektive poxvirus er festet eller til en blanding av intakte celler og lyserte/opprevne celler. Eksempler for en del eller et fragment av infiserte celler er cellemembraner til opprevne/lys erte celler til hvilke den respektive poxvirus er festet. Utgangsmaterialet kan også inneholde fri viruspartikler som verken er festet til cellemembranen eller lokalisert intracellulært.

For å oppnå de infiserte celler som er utgangsmaterialet for fremgangsmåten i henhold til foreliggende oppfinnelse blir eukaryote celler infisert med den respektive poxvirus. De eukaryote cellene er celler som er utsatt for infeksjon med den respektive poxvirus og tillater replikasjon og produksjon av infeksiøs virus. Slike celler er kjent for en person med kunnskap på området for alle poxvira. For MVA og vacciniavirusstammen Elstree er et eksempel på denne type celle kyllingembryofibroblaster (CEF) (Drexler I., Heller K., Wahren B., Erfle V. og Sutter G. "Highly attenuated modified vaccinia Ankara replicates in baby hamster kidney cells, a potential host for virus propagation, but not in various human transformed andprimary cells" J. Gen. Virol. (1998), 79, 347-352). CEF-celler kan dyrkes under betingelser kjent for en person med kunnskap på området. Fortrinnsvis blir CEF-celler dyrket i serumfritt medium på stasjonære flasker eller rullefiasker. Inkubasjonen finner fortrinnsvis sted 48-96 timer ved 37°C + 2°C. For infeksjonen blir poxvira fortrinnsvis brukt i et infeksjonsflertall (MOI) på 0,05-1 TCID5oog inkubasjonen finner fortrinnsvis sted 48-72 timer ved 37°C + 2°C.

Utviklingen av infeksjonen kan observeres ved å se på cytopatiske virkninger (CPE), som typisk opptrer ved signifikant avrunding av de infiserte celler.

Den foreliggende oppfinnelse tillater gjenvinning av poxvira, så som Elstree eller MVA fra infiserte celler. Med betegnelsen "gjenvinning" er det ment at fremgangsmåten i henhold til foreliggende oppfinnelse tilsvarer å rive opp poxvirusinfiserte celler og/eller løsne poxvira fra de cellulære membraner som de vanligvis er bundet til, i en slik utstrekning at en ytterligere rensing av poxvirus blir mulig. Således er produktet fra gjenvinning av poxvira fra infiserte celler (referert til som "poxvirusinneholdende homogenat" i den foreliggende søknad) en homogen blanding av fri poxvirus og cellulært avfall som inneholder bare små mengder av intakte, uopprevne celler og virus bundet til cellulære membraner.

Hvis de infiserte celler er celler som kan dyrkes i suspensjonskultur kan de infiserte celler lett høstes ved sentrifugering. Hvis de infiserte celler er mer eller mindre intakte tilklebede celler bør de bli høstet, dvs. fjernet fra dyrkingsampullen før de utsettes for høytrykkshomogenisering. Slike fremgangsmåter er kjent for personen med kunnskap på området. Nyttige teknikker er mekaniske metoder (f.eks. ved å bruke en gummicelleskrape), fysikalske metoder (f.eks. frysing under -15°C og tining av kulturkarene over +15°C) eller biokjemiske fremgangsmåter (behandling med enzymer, f.eks. trypsin for å løsne cellene fra kulturkammeret). Hvis enzymene blir brukt med denne hensikt bør inkubasjonstiden kontrolleres siden disse enzymene også kan skade virus under inkubasjon.

I fremgangsmåten i henhold til foreliggende oppfinnelse blir de infiserte celler, mer spesifikt de høstede infiserte celler utsatt for et høytrykkshomogeniseringstrinn. I den foreliggende beskrivelse er betegnelsen "høytrykkshomogenisering" noen ganger forkortet som "HPH". Høytrykkshomogeniseringen har en dobbel virkning. På den ene side fører høytrykkshomogenisering til oppriving av intakte celler. Således blir IMV frigjort og blir tilgjengelig for ytterligere rensing. På den annen side har høytrykkshomogenisering den virkning at poxviraene løsnes fra cellemembranene eller i det minste at størrelsen av celle-membran-virusaggregatene blir redusert. Igjen forenkler dette ytterligere rensing av poxvirus.

Personen med kunnskap på området vil være kjent med det generelle prinsipp for høytrykkshomogenisering (White MD, Marcus D., "Disintegration of microorganisms", Adv. Biotechnol. Processes 1988; 8:51-96). HPH-systemer er basert på anvendelse av høyt trykk for å presse en prøve gjennom en liten fiksert åpning med høy hastighet under kontrollerte og repeterbare betingelser. I den foreliggende beskrivelsen er betegnelsene "munnstykke", "åpning" og "dyse" brukt om hverandre.

Hjertet i enhver celleoppriver er et opprivningshode. Opprivningshodet består fortrinnsvis av (I) et høytrykkskammer/sylinder, (II) et høytrykksstempel som beveges i kammeret/sylinderen og derved øker trykket i kammeret/sylinderen og (III) en dyse/munnstykke gjennom hvilke kammerinnholdet blir støtt ut. Det utstøtte kammerinnholdet blir rettet på en mål overflate så som et stykke metall som fortrinnsvis har en varmeutvekslingsoverflate som tillater avkjøling. For å oppsamle det opprevne kammerinnholdet er systemet tilveiebragt med midler for oppsamling av den opprevne prøve (betegnet "oppsamlingskammer"). En typisk høytrykkshomogeniseringsenhet er Basic Z+ fra Constant Cell Disruption Systems (Low March, Daventry, Northants, NN114SD, Storbritannia).

I en foretrukket utforming er det tre trinn for å utføre celleoppriving ved å bruke høytrykkshomogeniseringssystemet. (I) En prøve blir innført i høytrykkssylinderen/kammeret. Deretter blir trykket i sylinderen/kammeret bygget opp. Med dette formål skyves høytrykksstempelet nedover. (II) Stempelet tvinger deretter prøven gjennom dysen med høy hastighet. En hurtig overføring av prøven fra et område med høyt trykk til et med lavt trykk forårsaker celleoppriving. (III) Prøven treffer målet og blir spredt radielt på tvers av den avkjølende varmeutvekslingsoverflaten. Produktet flyter deretter inn i et kammer for oppsamling. Hydraulikken blir gjenoppladet og syklusen fortsetter. Ved avslutning av prosessen blir det utstøtte homogenatet oppsamlet i en egnet ampulle, avhengig av volumet.

For gjenvinning av poxvira i henhold til foreliggende oppfinnelse bør munnstykket ha en diameter i området fra 0,10-0,6 mm, 0,15-0,6 mm, 0,15-0,50 mm, fortrinnsvis i området fra 0,15 til 0,40 mm, 0,20-0,40 mm, mer fortrinnsvis 0,20-0,40 mm, mest fortrinnsvis 0,25-0,35 mm. Eksempler på de mest foretrukne diametere er 0,25 mm og 0,35 mm.

Trykket i trykkammeret/sylinderen er satt til en verdi i området fra 200-1000 bar, fortrinnsvis 400-1000 bar, 200-800 bar, mer fortrinnsvis 400-800 bar, 600-1000 bar, enda mer fortrinnsvis 600-900 bar, mest fortrinnsvis 700-900 bar. Det mest foretrukne trykket er 800 bar.

Temperaturen til homogenatet ved utløpet bør fortrinnsvis ikke overstige +25°C, og bør fortrinnsvis være under 15°C, mest fortrinnsvis under 10°C.

Fremgangsmåten i henhold til foreliggende oppfinnelse kan oppskaleres nesten lineært og kan kjøres enten som en porsjonsprosess eller en kontinuerlig prosess.

I en porsjonsprosess kan hver porsjon av cellene som skal homogeniseres utsettes for høytrykkshomogeniseringstrinn én eller flere ganger. Fortrinnsvis blir hver porsjon utsatt for homogeniseringstrinnet 1-3 ganger, mest fortrinnsvis bare én gang.

Utfallet av homogeniseringstrinnet kan fortrinnsvis kontrolleres ved å bestemme virustiter (ekvivalent til antall infeksiøse viruspartikler, målt enten i vevskulturinfeksiøs dose (TCID50) eller plakkformede enheter (pfu)) i utgangsmaterialet som definert ovenfor og i materialet oppnådd etter homogeniseringstrinnet. Med andre ord blir virustiter bestemt før og etter høytrykkshomogenisering. Startmaterialet omfatter mer eller mindre intakte celler og en heller høy prosentandel av store aggregater som omfatter poxviruspartikler bundet til cellulære membraner. Dersom et slikt materiale blir brukt for bestemmelse av virustiter er den oppnådde titer lavere enn det virkelige antall infeksiøse partikler. Dette skyldes det faktum at testsystemene brukt for bestemmelse av virustiter er vanligvis cellekultursystemer (så som systemet beskrevet i eksempel 2) i hvilke antall infiserte celler eller antall plakker blir telt. Et slikt system kan ikke skille mellom et positivt resultat som skyldes infeksjonen av en celle med bare én viruspartikkel og infeksjonen av celler f.eks. med et stort aggregat av vira bundet til cellulære membraner. Etter høytrykkshomogenisering blir poxvira løsnet fra cellemembranene og/eller størrelsen av cellemembran virusaggregatene blir signifikant redusert, noe som fører til et større antall mindre aggregater. Hvis dette materialet blir brukt for bestemmelsen av titer blir de oppnådde resultater høyere, selv om den aktuelle mengde av infeksiøse viruspartikler ikke er forandret. Således er utfallet av homogeniseringen fortrinnsvis reflektert ved minst en lik eller høyere TCID5o/ml ("TCID" er forkortelse for "vevskulturinfeksiøs dose") av homogenatet sammenlignet med utgangsmaterialet. I eksempelavsnittet er det vist i detalj hvordan TCID5o/ml verdien kan bestemmes. Alternativt kan kvaliteten og utfallet av høytrykkshomogenisering bestemmes ved elektronmikroskopi.

For ytterligere rensing blir det oppnådde homogenat utsatt for minst ett rensetrinn for å oppnå en poxvirusanriket fraksjon. Særlig kan disse trinn utføres for et

Vaccinia-virusinneholdende homogenat hvis meningen er ytterligere å rense nevnte Vaccinia-virus.

Rensetrinnet kan blant annet være:

- porsjonssentrifugering (f.eks. ved å bruke sukroseputer) eller kontinuerlig-gjennomstrømnings ultrasentrifugering (sukrosegradienter (Hilfenhaus, J., Kohler, R. og Gruschkau, H., J. Biol. Stand. (1976) 4, 285-293; Madalinski, W„ Bankovski, A. og Korbecki, M„ Acta Virol. (1977) 21, 104-108), - ultrafiltrering (f.eks. kryssgjennomstrømningsfiltrering ved å bruke et membran med en porestørrelse større enn 500 kDa, men lik eller mindre enn 1 u.m), - kolonnekromatografi (f.eks. ionebytte, hydrofob interaksjon, størrelseseksklusjon eller en kombinasjon) (Hedstrom, K.G. og Lindberg, U., Z. Immun. Forsch. 1969, 137:421-430; Stickl, H., Korb, W. og Hochstein-Mintzel, V., Zbl. Bakt., I. Abt. Orig. (1970), 215, 38-50) eller - en kombinasjon av alle ovenfor (Masuda, N., Ellen, R.P. og Grove, D.A., J. Bacteriol. (1981), 147(3), 1095-1104).

Enhver annen rensemetode kjent for personen med kunnskap på området er også innenfor foreliggende oppfinnelses område.

Fortrinnsvis er rensetrinnet et ultrafiltreringstrinn. Mest fortrinnsvis er ultrafiltreringen en tverrgjennomstrømningsfiltrasjon. Prinsippet for tverrgjennomstrømningsfiltrasjon er kjent for personen med kunnskap på området. Se f.eks. Richards, G.P. og Goldmintz, D., J. Virol. Methods (1982), 4(3), sider 147-153 "Evalutation of a cross-flow filtration technique for extraction of polioviruses from inoculated oyster tissue homogenates".

Skjønt ett rensetrinn kan være tilstrekkelig for å tilfredsstille reguleringskrav for biofarmasøytiske produkter kan to eller flere av ovennevnte rensetrinn kombineres for å oppnå et enda mer rent produkt.

I den mest foretrukne utforming er det første rensetrinn en

tverrgjennomstrømningsfiltrasjon etterfulgt av minst ett kolonnekromatografitrinn. Mest fortrinnsvis er kolonnekromatografitrinnet ionebytte eller hydrofob interaksjon.

Den oppnådde virusanrikede fraksjon blir eventuelt frysetørket. Fremgangsmåter for frysetørring er kjent for personen med kunnskap på området (Day J. og McLellan M., Methods in Molecular Biology (1995), 38, Humana Press, "Cryopreservation and freeze-drying protocols").

Oppfinnelsen angår videre poxvirusanriket fraksjon og/eller poxvirusinneholdende homogenat oppnådd ved fremgangsmåten for gjenvinning av poxvira i henhold til foreliggende oppfinnelse, dvs. fremgangsmåten som omfatter trinnet å utsette de infiserte cellene til høytrykkshomogenisering. Særlig angår oppfinnelsen den poxvirusanrikede fraksjon oppnådd ved gjenvinning/rensemetoden i henhold til den foreliggende oppfinnelse, dvs. fremgangsmåten i hvilke poxvirusinneholdende homogenatet oppnådd ved HPH blir utsatt for minst ett rensetrinn. Poxviruset kan være ethvert poxvirus som definert ovenfor. Særlig er poxvirus i henhold til foreliggende oppfinnelse en Vaccinia-virus, så som enhver stamme som er egnet for vaksinasjon, særlig stamme Elstree eller modifisert Vaccinia-virus Ankara, mest fortrinnsvis MVA-BN.

Poxvirusinneholdende homogenat og/eller poxvirusanrikede fraksjon oppnådd ved en fremgangsmåte i henhold til foreliggende oppfinnelse som omfatter et HPH-trinn er kjennetegnet ved et meget høyt fritt-IMV poxvirus til EEV-poxvirusforhold. Betegnelsen "fritt IMV" blir brukt for IMV som har blitt adskilt fra de cellulære membraner etter, før eller under oppriving av infiserte celler og som derfor kan renses ytterligere. I alle industrielle fremgangsmåter til fremstilling av poxvira omfatter utgangsmaterialet de infiserte cellene så vel som kultursupernatanten. Således omfatter utgangsmaterialet IMV-poxvira inneholdt i de infiserte celler så vel som EEV-poxvira som hovedsakelig er funnet i supernatanten. De kjente fremgangsmåtene for oppriving av celler og den påfølgende homogenisering (f.eks. ved å bruke ultralyd) er ikke så effektivt til å rive opp celler og/eller løsne IMV-poxvira fra cellulært avfall som høytrykkshomogenisering. Med andre ord forblir mesteparten av IMV bundet til cellulære membraner og cellulære rester. Således er forholdet mellom fritt IMV til EEV lavere enn i fremgangsmåten i henhold til foreliggende oppfinnelse. I fremgangsmåten som anvender ultralyd forandres ikke dette forholdet signifikant under de ytterligere rensetrinnene siden de cellulære restene som IMV fremdeles er bundet til vanligvis blir fjernet. I motsetning til kjente gjenvinningsfremgangsmåter for poxvira resulterer gjenvinningsfremgangsmåten i henhold til foreliggende oppfinnelse i en meget effektiv oppriving av de infisere celler og IMV blir meget effektivt løsnet fra cellemembranene. Således er den totale mengde av frie IMVer som blir tilgjengelig for ytterligere rensing høyere enn ved fremgangsmåter kjent i teknikken og følgelig er også forholdet mellom frie IMV- til EEV-poxvira høyere.

Det poxvirusinneholdende homogenat og/eller poxvirusanrikede fraksjon oppnådd ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er nyttig som vaksiner.

Hvis det poxvirusinneholdende homogenat og/eller den poxvirusinneholdende fraksjon omfatter umodifiserte poxvira eller svekkede poxvira, så som Vaccinia-virusstamme Elstree eller MVA, kan den anvendes for vaksinasjon mot poxvirusinfeksjoner. F.eks. kan et virusinneholdende homogenat og/eller den virusanrikede fraksjonen som omfatter Vaccinia-virus, så som stamme Elstree eller MVA, særlig MVA-BN, anvendes som en vaksine mot koppinfeksjoner.

Hvis det poxvirusinneholdende homogenat og/eller den poxvirusanrikede fraksjon omfatter et poxvirus som inneholder og uttrykker én eller flere heterologe gen(er) kan det poxvirusinneholdende homogenat og/eller den poxvirusanrikede fraksjon ytterligere anvendes til å vaksinere dyr inkludert mennesker mot protein uttrykt ved det (de) heterologe gen(er).

For fremstilling av en vaksine blir det poxvirusinneholdende homogenat og/eller den poxvirusanrikede fraksjon oppnådd ved fremgangsmåten i henhold til

foreliggende oppfinnelse konvertert til en fysiologisk akseptabel form. Dette kan bli gjort basert på erfaringen ved fremstilling av poxvirusvaksiner brukt for vaksinasjon mot kopper (som beskrevet av Stickl, H. et al. [1974] Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392). F.eks. blir det poxvirusinneholdende homogenat og/eller den poxvirusanrikede fraksjon lagret ved -80°C med en titer på 50 x 10<8>TCIDso/ml formulert i ca. 10 mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7,4. For fremstilling av vaksineinjeksjoner blir f.eks. 10<3->10<9>TCID5oav virus lyofilisert i fosfatbufret saltoppløsning (PBS) i nærvær av 2 % pepton og 1 % humant albumin i en ampulle, fortrinnsvis en glassampulle. Alternativt kan vaksine injeksjonene fremstilles ved trinnvis frysetørring av virus i en formulering. Denne formuleringen kan inneholde ytterligere tilsettinger så som mannitol, dekstran, sukker, glysin, laktose eller polyvinylpyrrolidon eller andre tilsetninger så som antioksidanter eller inert gass, stabilisatorer eller rekombinante proteiner (f.eks. humant serumalbumin) egnet for in vivo administrering. En typisk virusinneholdende formulering egnet for frysetørring omfatter 10 mM Tris-buffer, 140 mM NaCl, 18,9 g/l dekstran (molvekt 36000-40000), 45 g/l sukrose, 0,108 g/l L-glutaminsyre

monokaliumsaltmonohydrat, pH 7,4. Glassampullen blir deretter forseglet og kan lagres mellom 4°C og romtemperatur i flere måneder. Så lenge som intet behov eksisterer kan imidlertid ampullen lagres fortrinnsvis ved temperaturer under -20°C.

For vaksinasjon kan det lyofiliserte eller frysetørkede produkt oppløses i 0,1-0,5 ml av en vandig oppløsning, fortrinnsvis fysiologisk saltoppløsning eller Tris-buffer, og administreres enten systemisk eller lokalt, dvs. parenteralt, intramuskulært eller ved enhver annen administrasjons vei kjent for den praktiserende fagmann på området. Administrasjonsmåte, dose og antall administrasjoner kan optimaliseres av de med kunnskap på området, på en kjent måte. Mest foretrukket for poxvirusvektorer er subkutan eller intramuskulær administrering.

Vaksinasjon av dyr inkludert mennesker omfatter å inokulere et dyr, inkludert et menneske, med behov derav med et poxvirusinneholdende homogenat eller en poxvirusanriket fraksjon oppnådd ved fremgangsmåten i henhold til foreliggende oppfinnelse.

Oppfinnelsen omfatter blant annet følgende, alene eller i kombinasjon: Fremgangsmåte til å gjenvinne poxvirus fra infiserte celler som omfatter trinnet å utsette de infiserte cellene til en høytrykkshomogenisering for å oppnå et poxvirusinneholdende homogenat.

Fremgangsmåte som ovenfor kjennetegnet ved at poxvirus er valgt fra gruppen som består av ortopoxvira, avipoxvira, suipoxvira og kapripoxvira.

Fremgangsmåte som ovenfor kjennetegnet ved at poxvirus er valgt fra gruppen som består av Vaccinia-virus, geitepoxvirus, sauepoxvirus, kanaripoxvirus og hønsepoxvirus.

Fremgangsmåte som ovenfor kjennetegnet ved at Vaccinia-virus er modifiesrt Vaccinia-virus stamme Ankara (MVA), særlig MVA-BN med deponeringsnummer ECACC V00083008.

Fremgangsmåte som ovenfor kjennetegnet ved at poxvirus er en rekombinant poxvirus.

Fremgangsmåte som ovenfor kjennetegnet ved at høytrykkshomogeniseringen blir utført ved å plassere de infiserte celler i et høytrykkskammer, øke trykket i kammeret og sprøyte de infiserte cellene gjennom en dyse.

Fremgangsmåte som ovenfor kjennetegnet ved at trykket i kammeret økes til en verdi i området fra 200-1000 bar.

Fremgangsmåte som ovenfor kjennetegnet ved at dysen har en diameter i området fra 0,10-0,6 mm.

Fremgangsmåte som ovenfor kjennetegnet ved at det poxvirusinneholdende homogenat blir utsatt for ett rensetrinn for å oppnå en poxvirusanriket fraksjon.

Fremgangsmåte som ovenfor kjennetegnet ved at minst ett rensetrinn er et ultrafiltreringstrinn.

Fremgangsmåte som ovenfor kjennetegnet ved at ultrafiltreringen er en tverr gjennomstrømningsfiltrering.

Fremgangsmåte som ovenfor kjennetegnet ved at

tverrgjennomstrømningsfiltreringstrinnet blir det brukt en membran som har en porestørrelse større enn 500 kDa, men lik eller mindre enn 0,1 u.m.

Fremgangsmåte som ovenfor kjennetegnet ved at etter ultrafiltreringen blir minst ett kolonnekromatografitrinn utført.

Fremgangsmåte som ovenfor kjennetegnet ved at det oppnådde poxvirusinneholdende homogenat eller poxvirusanrikede fraksjon blir frysetørket.

Poxvirusinneholdende homogenat eller poxvirusanriket fraksjon oppnådd ved en fremgangsmåte som definert ovenfor.

Poxvirusinneholdende homogenat eller poxvirusanriket fraksjon som ovenfor som vaksine.

Anvendelse av det poxvirusinneholdende homogenat eller poxvirusanrikede fraksjon som ovenfor til fremstilling av en vaksine.

Figurtekster

Fig. 1: CEF-celler infisert med MVA-BN ble utsatt for en fryse-tine syklus for å oppnå en virus-cellesuspensjon. Virustiter til suspensjonen ble bestemt som beskrevet i eksempel 2 uten ytterligere rensing av celle-virus-suspensjonen ("0-verdi"). Virus-celle-suspensjonen ble utsatt for en

homogeniseringsfremgangsmåte kjent fra den kjente teknikk ved å bruke ultralyd ("Sonifer") eller til homogeniseringsfremgangsmåten i henhold til foreliggende oppfinnelse ("HPH") som beskrevet i eksempel 1.1 HPH-trinnet var trykket 800 bar og dysen hadde en diameter på 0,25 mm. Ved avslutning av homogeniseringstrinnet ble virustiter igjen bestemt.

Eksempler

De følgende eksempler vil ytterligere illustrere den foreliggende oppfinnelse. Det skal forstås av en person med kunnskap på området at de tilveiebragte eksempler på ingen måte skal fortolkes på en måte som begrenser anvendbarheten av teknologien tilveiebragt ved foreliggende oppfinnelse til disse eksempler.

Eksempel 1: Homogenisering av poxvirus-cellesuspensjoner ved å bruke en høytrykkshomogenisator

Kyllingembryofibroblaster (CEF) dyrket i rulleflasker er blitt infisert med MVA-BN (ECACC V00083008). De infiserte celler ble utsatt for frysing og tining for å oppnå en virus-celle-suspensjon.

En Basic Z+ homogenisator fra Constant Cell Disruption Systems (Low March, Daventryk, Northans, NN114SD, Storbritannia) ble opplastet med 50 ml av den ubearbeidede virus-celle-suspensjonen for hver kjøring. For å identifisere de optimale homogeniseringsbetingelser ble dysediametere i området fra 0,18-0,40 mm og trykk i området fra 200-1000 bar testet. Den ubearbeidede suspensjonen ble utsatt for høytrykkshomogenisering 1, 2 eller 3 ganger. Homogenisatoren ble brukt i henhold til instruksjoner fra produsenten. Evalueringen av fremgangsmåten ble utført ved å overvåke titer som beskrevet i eksempel 2.

I preliminære undersøkelser ble det funnet at munnstykkediametere større enn 0,4 mm ikke har noen positiv innflytelse på homogeniseringsresultatene. Med dysediametere på 0,18 mm, 0,25 mm og 0,35 mm ble de beste resultater oppnådd ved å utsette virus-cellesuspensjonen én gang til et trykk på 800 bar. Ved disse betingelser har ingen store forskjeller i form av titer blitt observert.

Fremgangsmåten i henhold til foreliggende oppfinnelse ble sammenlignet med direkte gjennomstrømnings ultralydbehandling kjent fra teknikken. Resultatene er oppsummert i fig. 1. Sammenlignet med ultralydbehandling resulterte fremgangsmåten i henhold til foreliggende oppfinnelse i en høyere virustiter og en bedre homogenitet av suspensjonen, slik at den er mer egnet for ytterligere nedstrøms prosessering.

Eksempel 2: Titrering av modifisert Vaccinia-virus Ankara (MVA)

Titrering av modifisert Vaccinia-virus Ankara (MVA) ble utført i et TCID50-basert assay ved å bruke ti ganger fortynninger i et 96-brønners format. Ved avslutningen av assayet ble infiserte celler visualisert ved å bruke et anti-Vaccinia-virus-antistoff og en egnet fargeoppløsning.

2-3 dager gamle primære CEF (kyllingembryofibroblaster) celler ble fortynnet til 1 x IO<5>celler/ml i 7 % RPMI. 10 ganger fortynninger ble gjort med 8 replikater pr. fortynning. Etter fortynning ble 100 ul sådd pr. brønn i 96-brønners plater. Cellene ble deretter inkubert natten over ved 37°C og 5 % CO2.

Fortynninger av de virusinneholdende oppløsninger ble gjort i 10-gangers trinn (IO1 til IO"12 som egnet) ved å bruke RPMI uten føtalt kalveserum. Deretter ble 100 u.1 av hver virusprøve tilsatt de celleinneholdende brønnene. 96-brønners plater ble inkubert ved 37°C med 5 % CO2i 5 dager for å tillate infeksjon og viral replikasjon.

Celler ble farget 5 dager etter infeksjonen med et Vaccinia-virus spesifikt antistoff. For deteksjonen av det spesifikke antistoffet ble et pepperrotperoksidase (HRP) koblet sekundært antistoff brukt. Det MVA-spesifikke antistoff er et anti-Vaccinia-virus-antistoff, kanin polyklonal, IgG-fraksjon (Quartett, Berlin, Tyskland # 9503-2057). Det sekundære antistoff er anti-kanin IgG-antistoff, HRP-koblet geitpolyklonal (Promega, Mannheim, Tyskland, # W4011). Fargereaksjonen ble utført i henhold til kjente teknikker.

Hver brønn med celler som var positive i fargereaksjonen ble markert som positive for beregning av TCID50. Titer ble utregnet ved å bruke formelen til Spearman [1] og Kaerber [2]. Fordi alle assayparametere ble holdt konstant ble den følgende forenklede formel anvendt:

Virustiter

a = fortynnings faktor for siste kolonne, i hvilke alle åtte brønner er positive.

xa= antall positive brønner i kolonne a+1

Xb= antall positive brønner i kolonne a+2

xc= antall positive brønner i kolonne a+3

Claims (17)

1. Fremgangsmåte til gjenvinning av poxvirus fra infiserte celler,karakterisert vedat den omfatter å utsette de infiserte cellene til en høytrykkshomogenisering for å oppnå et poxvirusinneholdende homogenat.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert vedat poxviruset er valgt fra gruppen som består av ortopoxvira, avipoxvira, suipoxvira og kapripoxvira.

3. Fremgangsmåte som angitt i ethvert av kravene 1-2, karakterisert vedat poxviruset er valgt fra gruppen som består av Vaccinia-virus, geitepoxvirus, sauepoxvirus, kanaripoxvirus og hønsepoxvirus.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 3, karakterisert vedat Vaccinia-virus er Elstree eller modifisert Vaccinia-virus stamme Ankara (MVA), særlig MVA-BN med deponeringsnummeret ECACC V00083008.

5. Fremgangsmåte som angitt i ethvert av kravene 1-4, karakterisert vedat poxvirus er en rekombinant poxvirus.

6. Fremgangsmåte som angitt i ethvert av kravene 1-5, karakterisert vedat høytrykkshomogeniseringen blir utført ved å plassere de infiserte celler i et høytrykkskammer, øke trykket i kammeret og sprøyte de infiserte cellene gjennom en dyse.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 6, karakterisert vedat trykket i kammeret blir øket til en verdi i området 200-1000 bar.

8. Fremgangsmåte som angitt i ethvert av kravene 6-7, karakterisert vedat dysen har en diameter i området fra 0,10-0,6 mm.

9. Fremgangsmåte som angitt i ethvert av kravene 1-8, karakterisert vedat det poxvirusinneholdende homogenat er utsatt for minst ett rensetrinn for å oppnå en poxvirusanriket fraksjon.

10. Fremgangsmåte som angitt i krav 9, karakterisert vedat ett av de minst ene rensetrinn er et ultrafiltreringstrinn.

11. Fremgangsmåte som angitt i krav 10, karakterisert vedat ultrafiltreringen er en tverr gjennomstrømningsfiltrering.

12. Fremgangsmåte som angitt i krav 11, karakterisert vedat i tverrgjennomstrømningsfiltreringstrinnet blir det brukt en membran som har en porestørrelse større enn 500 kDa, men lik eller mindre enn 1 u.m.

13. Fremgangsmåte som angitt i ethvert av kravene 10-12,karakterisert vedat etter ultrafiltreringen blir minst ett kolonnekromatografitrinn utført.

14. Fremgangsmåte som angitt i ethvert av kravene 1-13, karakterisert vedat det poxvirusinneholdende homogenat eller den poxvirusanrikede fraksjonen blir frysetørket.

15. Poxvirusanriket fraksjon eller poxvirusinneholdende homogenat,karakterisert vedat det er oppnådd ved fremgangsmåten i henhold til ethvert av kravene 1-14.

16. Poxvirusanriket fraksjon eller poxvirusinneholdende homogenat i henhold til krav 15, karakterisert vedat det er en vaksine.

17. Anvendelse av en poxvirusanriket fraksjon eller poxvirusinneholdende homogenat i henhold til krav 15, til fremstilling av en vaksine.